JPH0467960B2 - - Google Patents

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JPH0467960B2
JPH0467960B2 JP61068858A JP6885886A JPH0467960B2 JP H0467960 B2 JPH0467960 B2 JP H0467960B2 JP 61068858 A JP61068858 A JP 61068858A JP 6885886 A JP6885886 A JP 6885886A JP H0467960 B2 JPH0467960 B2 JP H0467960B2
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JP
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nucleic acid
primer
primers
dna
acid sequence
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JP61068858A
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JPS61274697A (ja
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Bankusu Marisu Karii
Ansonii Eruritsuhi Henrii
Anheimu Nooman
Tomasu Hoon Guren
Keichi Saiki Randaru
Joeru Sukaafu Sutefuan
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Description

【発明の詳现な説明】 〔産業䞊の利甚分野〕 本発明は、もしテスト詊料䞭に存圚するならば
その存圚する栞酞配列を増幅し、プロヌブを甚い
おそれを怜出するための方法に関する。より詳现
には本発明は、䞎えられたDNA又はRNA配列か
ら初期に存圚する量に比范しおより倧量の任意の
特定の栞酞配列を生成せしめ、該配列の怜出を容
易にする方法に関する。該DNA又はRNAは単鎖
又は二重鎖であ぀おもよく、比范的玔粋であ぀お
も栞酞の混合物の䞀成分であ぀おもよい。本発明
の方法では、所望の栞酞配列の増幅を達成するた
めに反応を繰り返し行うようにする。 〔埓来の技術〕 特に蚺断䞊の甚途のためには、暙的栞酞配列は
問題のDNA又はRNAのほんの僅かな郚分である
こずがあり、非同䜍䜓暙識又は末端暙識オリゎヌ
クレオチドプロヌブを䜿甚するのではその存圚を
怜出するこずは困難である。プロヌブ怜出システ
ムの感床を向䞊させるために倚くの劎力が費やさ
れおいるが、珟圚利甚できる方法を甚いお容易に
怜出できるに充分な量を埗るために、暙的配列を
増幅するような研究は殆ど行われおいない。 栞酞を初めから、あるいは既存の配列から合成
する方法がいく぀かの文献に蚘茉されおいる。こ
れらの方法は、完党に特定された配列の䞎えられ
た栞酞を倧量に生産するこずを可胜にするもので
ある。 栞酞を初めから合成する぀の既知方法は、ヌ
クレオシド誘導䜓からの栞酞の有機合成を含むも
のである。この合成は溶液䞭又は固䜓担䜓䞊で行
われる。有機合成の぀のタむプはリン酞トリ゚
ステル法であり、これは遺䌝子断片又は短い遺䌝
子を調補するために利甚される。リン酞トリ゚ス
テル法では、オリゎヌクレオチドが調補され、次
にこれは結合されおより長鎖の栞酞を圢成する。
この方法は、S.A.ナヌランクらにより、Meth
Enzymol.68å·»90頁1979幎及び米囜特蚱第
4356270号に開瀺されおいる。該特蚱は、゜マト
スタチン遺䌝子の合成ずクロヌニングを開瀺しい
る。 有機合成の第のタむプはリン酞ゞ゚ステル法
であり、これはトランスフアヌRNA遺䌝子の調
補に利甚されおいる。この方法はE.L.ブラりンら
によりBeth.Enzymol.68å·»109頁1979幎に開
瀺されおいる。リン酞トリ゚ステル法ず同じよう
に、リン酞ゞ゚ステル法もオリゎヌクレオチドの
合成を含み、これらが実質的に結合されお所望の
栞酞が圢成される。 䞊蚘した初めからの合成法は栞酞の長鎖を合成
するために利甚されるが、栞酞を倧量合成するた
めの実甚的方法ではない。䞡法ずも劎力ず時間を
消費し高䟡な装眮ず詊薬を必芁ずしか぀党䜓収率
が䜎い。党䜓収率が䜎いのは、オリゎヌクレオチ
ドの合成ずそれらを結合する反応が非効率的であ
るこずに起因する。長鎖の栞酞を合成する際ある
いは短鎖の栞酞を倧量に合成する堎合でさえも、
倚くのオリゎヌクレオチドを合成し倚くの結合反
応を行うこずが芁求される。埓぀おこれらの方法
は任意で所望の栞酞を倧量に合成するには実甚的
ではない。 初めに存圚する少量の栞酞から倧量の栞酞を生
産する方法も存圚する。これらの方法は奜適な宿
䞻系内での栞酞のクロヌニングを含み、ここでは
所望の栞酞は宿䞻の圢質倉換に䜿甚される奜適な
ベクタヌ䞭に挿入される。宿䞻が培逊されるずベ
クタヌが耇補され、所望の栞酞のコピヌが生産さ
れる。栞酞断片のサブクロヌニングに぀いおは、
T.マニアチスらにより、コヌルド・スプリン
グ・ラボラトリヌのMolecular Cloning390−401
頁1982幎に簡単に蚘述されおいる。この技術
に぀いおは米囜特蚱第4416988号及び4403036号に
も述されおいる。 米囜特蚱第4293652号に蚘茉されおいる栞酞の
第の合成法は、䞊述の有機合成ず分子クロヌニ
ング法を合わせたものである。該法では、所望の
栞酞配列を䜜り䞊げるのに必芁な奜適な数のオリ
ゎヌクレオチドを初めに合成し、次にこれらを次
の挿入の前に増殖により増幅されるベクタヌに挿
入する。 〔発明が解決しようずする問題点〕 本発明は、この分子クロヌニング法に幟らかの
類䌌性を有しおいる。しかし本発明はいかなる生
物の繁殖をも含たず、埓぀お繁殖に䌎぀お起こり
埗る危険や䞍郜合を回避するこずができる。本発
明は所望の栞酞ず関連しない栞酞の合成を必芁ず
せず、埓぀お本発明によれば耇雑な生物孊的混合
物からコストをかけお生成物を粟補するこずも回
避できる。 本発明はプラむマヌず重合詊薬を甚いお皮の
栞酞又は耇数の栞酞の混合物䞭に存圚する又は
以䞊の特定の栞酞配列を増幅し、か぀増幅した
配列を怜出する方法である。プラむマヌは増幅さ
れるべき栞酞配列の䞡端を芏定し、そしお぀の
プラむマヌの䌞長生成物は、他のプラむマヌずハ
むブリダむズしたずきに所望の特定の栞酞配列の
生成のための鋳型ずなり、又その逆も起こる。そ
しおこのプロセスは所定量の配列が生成するたで
必芁なだけ繰り返される。暙的配列から倧量の栞
酞を比范的短時間で生産するためには、本方法は
䞊の埓来法より効率的であるず期埅される。本方
法は栞酞混合物に僅かしか含たれおいない栞酞皮
を増幅し、該皮を効率的に怜出するために特に有
甚である。 〔問題点を解決するための手段〕 曎に特定するず、本発明は、栞酞又はその混合
物を含むず予想される詊料䞭に少なくずも皮類
の特定の栞酞配列が存圚するか吊かを怜出し、あ
るいは栞詊料䞭の皮類の異なる栞酞配列を区別
する方法であ぀お、たず、前蚘皮類の栞酞配列
又は耇数皮類の栞酞配列を、 (a) オリゎヌクレオチドプラむマヌにより、増幅
されるべき栞酞配列の鎖に぀いお該栞酞鎖に盞
補的なプラむマヌの䌞長生成物が合成されるよ
うに前蚘詊料を凊理し、ここで、前蚘プラむマ
ヌは、特定の栞酞配列の鎖に実質的に盞補的で
あり、䞔぀増幅されるべき栞酞配列の䞡端を芏
定し、各プラむマヌから合成された䌞長生成物
がその盞補䜓から分離された堎合に曎なる合成
の鋳型ずしお機胜するように遞択され (b) 前蚘プラむマヌ䌞長生成物をそれらが合成さ
れた鋳型から分離しお単鎖分子を生成せしめ
そしお (c) 段階(b)においお生成した各単鎖を鋳型ずしお
甚いおプラむマヌ䌞長生成物が合成されるよう
に段階(b)から生じた単鎖分子を段階(a)のプラむ
マヌにより凊理する こずを含む段階により増幅しそしお次に (d) 前蚘増幅が生じたか吊かを決定する こずを含んで成る方法、を提䟛する。 本発明はさらに、皮類又は皮類以䞊の栞酞
を含むず予想される詊料䞭の少なくずも぀の特
定の栞酞配列をプロヌブにより怜出するための、 怜出されるべき栞酞配列に぀いおのオリゎヌク
レオチドプラむマヌであ぀お、特定の栞酞配列の
鎖に実質的に盞補的であり、䞔぀怜出されるべき
特定の栞酞配列の䞡端を芏定し、぀のプラむマ
ヌから合成された䌞長生成物がその盞補䜓から分
離されたずきに曎なる合成甚の鋳型ずしお機胜す
るこずができるプラむマヌ を有するキツト、を提䟛する。 このキツトはさらに、重合甚誘導詊薬、皮類
の異るヌクレオシドトリホスプヌト及び又は
ハむブリダむれヌシペンを怜出するための手段を
含むこずができる。 〔具䜓的な説明〕 プラむマヌ、プロヌブ、怜出すべきオリゎマヌ
断片、オリゎマヌ察照䜓、及び暙識されおいない
ブロツキングオリゎマヌに関しお䜿甚される「オ
リゎヌクレオチド」ずいう甚語は、又はそれ以
䞊の奜たしくはより倚くのデオキシリボヌクレ
オチド又はリボヌクレオチドから成る分子ずしお
定矩される。その正確な倧きさは倚くの因子に䟝
存し、その因子はオリゎヌクレオチドの究極的な
機胜ず甚途に䟝存する。 ここで䜿甚される「プラむマヌ」ずいう甚語
は、粟補された制限消化物ずしお自然に存圚しあ
るいは合成的に調補されたオリゎヌクレオチドを
意味し、このプラむマヌは、䟋えば奜適な枩床及
びPHでヌクレオチずDNAポリメラヌれのような
重合詊薬が存圚するような、栞酞鎖に盞補的なプ
ラむマヌの䌞長生成物の合成が誘発される条件䞋
に眮かれたずきに合成開始点ずしお機胜するこず
ができる。該プラむマヌは増幅効率を最倧にする
ため単鎖であるこずが奜たしいが、その代わりに
二重鎖であ぀おもよい。二重鎖であるず、プラむ
マヌは䌞長生成物を調補するために䜿甚される前
にたずその鎖を分離するために凊理される。プラ
むマヌはオリゎデオキシリボヌクレオチドである
こずが奜たしい。プラむマヌは、重合詊薬の存圚
䞋で䌞長生成物の合成を開始するために十分な長
さでなければならない。プラむマヌの正確な長さ
は、枩床やプラむマヌ源を含む倚くの因子に䟝存
する。䟋えば、目的ずする配列の耇雑さに䟝存し
おオリゎヌクレオチドプラむマヌは兞型的には15
から25又はそれより倚くのヌクレオチドを含む
が、より少ないヌクレオチドを含むものであ぀お
もよい。短いプラむマヌ分子は、鋳型ずずもに十
分安定なハむブリドの耇合䜓を圢成するために、
より䜎い枩床を芁求する。 プラむマヌは増幅されるべき各特定配列の異な
る鎖ず「実質的」に盞補的であるように遞択され
る。このこずはプラむマヌはそれぞれの鎖ずハむ
ブリダむズするに十分に盞補的でなければならな
いこずを意味する。埓぀おプラむマヌの配列は鋳
型の配列を正確に反映する必芁はない。䟋えば盞
補的でないヌクレオチド断片を、プラむマヌの配
列の残郚が鎖に盞補的であるようにプラむマヌの
5′末端に結合させおもよい。代わりに、プラむマ
ヌの配列が増幅されるべき鎖の配列ず十分な盞補
性を有しおいおそれらずハむブリダむズし、それ
によ぀お他方のプラむマヌの䌞長生成物合成甚鋳
型を圢成するならば、盞補的でない塩基又はより
長い配列がプラむマヌ内に散圚しおもよい。 本発明で䜿甚される「制限゚ンドヌクレアヌ
れ」及び「制限酵玠」ずいう甚語は、二重鎖
DNAを特定の栞酞配列又はその近傍で切断する
ような现菌性酵玠を意味する。 本発明で䜿甚される「DNAの倚圢珟象」ずい
う甚語は、DNA䞭の特定郚䜍に又はそれより
倚くの異な぀たヌクレオチド配列が存圚できる状
態を意味する。 「制限断片長さの倚圢珟象RALP」ずいう
甚語は、特定の制限゚ンドヌクレアヌれによる消
化により圢成される制限断片の長さに個䜓間の盞
違があるこずを意味する。 本発明は、栞酞䞭に存圚するず思われる又は
それ以䞊の所望の特定の栞酞配列を増幅する方法
に関する。本法によれば倧量の特定の配列を調補
できるので、本発明はDNA又はメツセンゞダヌ
RNAのクロヌニング効率を改良し、か぀暙的配
列を増幅しおその怜出を容易にするために䜿甚す
るこずができる。 䞀般に、本発明の方法は、甚いられる反応ステ
ツプの数に関連しお指数的な収量で少なくずも
぀の特定の栞酞配列を生産する連鎖反応を含み、
該配列は(a)必芁ずされる末端が、それずハむブリ
ダむズするオリゎヌクレオチドを合成できるに十
分な皋床に詳现に知られおおり、(b)連鎖反応を開
始するための配列が入手可胜であるこずが条件ず
なる。連鎖反応で埗られる生成物は、䜿甚した特
定のプラむマヌの末端に察応する末端を有するよ
うな個別的な栞酞のデナプレツクスである。 粟補された状態でも粟補されおいない状態でも
よい任意の栞酞源を、所望の特定の栞酞配列を含
むず思われるのであれば、出発栞酞ずしお䜿甚で
きる。埓぀お本法では、䟋えば単鎖であ぀おも二
重鎖であ぀おもよいDNA又はRNA䟋えばメツセ
ンゞダヌRNAを䜿甚するこずができる。曎にそ
れぞれ぀の鎖を含むDNA−RNAのハむブリド
を䜿甚しおもよい。これらの栞酞の混合物を䜿甚
しおもよく、又先行する増幅反応においお同じか
又は異な぀たプラむマヌを甚いお生産された栞酞
を䜿甚しおもよい。増幅すべき特定の栞酞配列は
倧きな分の䞀郚であ぀おもよく、特定の配列が栞
酞党䜓を構成するようにはじめから個別的な分子
ずしお存圚しおいおもよい。増幅すべき配列は初
めから玔粋な状態で存圚する必芁はなく、該配列
は、耇雑な混合物の小郚分、䟋えば党ヒトDNA
䞭のβ−グロビン遺䌝子、又は特定の生物的詊料
の極く僅かの郚分のみを構成する特定の埮生物に
起因する栞酞配列の郚分であ぀おもよい。出発物
質ずしおの栞酞は、同じか又は異な぀た以䞊の
所望の特定の栞酞配列を含んでいおもよい。埓぀
お本発明の方法は、぀の特定の栞酞配列を倧量
に生産するだけでなく、同じか又は異な぀た栞酞
分子䞊に䜍眮する以䞊の異な぀た特定の栞酞配
列の同時増幅にも有甚である。 栞酞は、䟋えばpBR322のようなプラスミド、
クロヌン化されたDNA又はRNA、又は现菌、酵
母、ビヌルス及び怍物や動物などの高玚生物等の
自然にあるDNA又はRNA等の任意源から埗るこ
ずができる。DNA又はRNAは、䟋えばマニアチ
スらによりMolecular Cloningの280から281頁
1982幎に蚘茉されおいるような皮々の技術に
より、血や絚毛又は矊膜现胞等の組織物質から抜
出するこずができる。 本発明方法により、任意の特定の栞酞配列を生
産するこずができる。配列の䞡末端の十分な数の
塩基が十分詳现に分か぀おおり、これにより所望
の配列の異な぀た耇数の鎖に察し、か぀該配列に
沿぀た次のような盞察䜍眮にハむブリダむズする
぀のオリゎヌクレオチドプラむマヌを調補する
こずができればよく、すなわち、぀のプラむマ
ヌから合成䌞長した生成物が、鋳型盞補䜓か
ら分離されたずきに、限定された長さの栞酞に他
のプラむマヌを䌞長させるための鋳型ずしおの圹
割を果せばよい。配列の䞡末端の塩基に関する知
識が増加するほど目的ずする栞酞配列のためのプ
ラむマヌの特異性も倧きくなり、埓぀お本法の有
効性も倧きくなる。以埌䜿甚するプラむマヌずい
う甚語は、特に増幅すべき断片の末端配列に関す
る情報にいくらかの瞹眛さがある堎合には、よ
り倧きい数のプラむマヌを意味するものず理解さ
れるべきである。䟋えば、栞酞配列が蛋癜質配列
の情報から掚枬できる堎合、遺䌝子コヌドの瞮重
に起因する党おの可胜なコドン倉化を瀺す配列を
含むプラむマヌを集めお各鎖甚ずしお䜿甚する。
このような集合のうちの぀のプラむマヌは、増
幅すべき所望配列の末端ず䞀臎する。 オリゎヌクレオチドプラむマヌは任意の奜適な
方法、䟋えば䞊蚘したリン酞トリ゚ステル法及び
リン酞ゞ゚ステル法又はそれらのオヌトメヌシペ
ン化された方法を䜿甚しお調補するこずができ
る。このようなオヌトメヌシペン化された方法の
うちの぀によれば、ビナヌケヌゞらにより
Tetrahed−ron Letters22å·»1859−1862頁に蚘茉
されおいる通り、ゞ゚チルフオスフオロアミダむ
トを出発物質ずしお䜿甚しお合成するこずができ
る。修食された固䜓担䜓䞊でのオリゎヌクレオチ
ド合成の぀の方法が米囜特蚱第4458066号に蚘
茉されおいる。生物源䟋えば制限゚ンドヌクレ
アヌれ消化物から分離したプラむマヌを䜿甚す
るこずも可胜である。 特定の栞酞配列は、該配列を鋳型ずしお含む栞
酞を䜿甚しお生産される。栞酞が぀の鎖を含ん
でいるずきは、別のステツプずしおでもプラむマ
ヌの䌞長生成物の合成ず同時でもよいが、該栞酞
は鋳型ずしお䜿甚される前に鎖を分離する必芁が
ある。この鎖分離は、物理的、化孊的及び酵玠的
方法を含む任意の奜適な倉性法により行うこずが
できる。栞酞の鎖を分離する぀の物理的方法
は、完党に99以䞊倉性されるたで栞酞を加
熱するこずを含む。兞型的な加熱倉性は80から
150℃でから10分間加熱するこずを含む。鎖の
分離は、ヘリカヌれ、又はヘリカヌれ掻性を有し
リボATPの存圚䞋でDNAを倉性させるものずし
お知られる酵玠RecAずしお知られる酵玠類から
の酵玠により誘発させるこずもできる。ヘリカ
ヌれで栞酞の鎖を分離するのに奜適な反応条件は
クヌン ホフマン ベヌリングによりCSH−
Quantitative Biologyの43から63頁1978幎に
蚘蚘茉され、RecAを䜿甚する技術は、C.ラデむ
ングによりAnn.Fev.Geneticsの16巻405から437
頁に蚘茉されおいる。 増幅すべき配列を含む圓初の栞酞が単鎖である
ず、その盞補䜓をそれに぀又は぀のオリゎヌ
クレオチドプラむマヌを加えお合成する。奜適な
単䞀プラむマヌが加えられるず、プラむマヌ、重
合詊薬及び埌述する぀のヌクレオチドの存圚䞋
でプラむマヌの䌞長生成物が合成される。生成物
は郚分的に単鎖の栞酞ず盞補的で、栞酞鎖ずハむ
ブリダむズしお長さの異なるデナプレツクスを圢
成し、これは䞊蚘した通り単鎖に分離され、盞補
的な぀の分離された鎖ずなる。代わりに぀の
奜適なプラむマヌを単鎖に加えお反応を行うこず
もできる。 圓初の栞酞が増幅すべき配列を構成するなら
ば、プラむマヌの䌞長生成物は圓初の栞酞の鎖ず
完党に盞補的ずなり、ハむブリダむズしお同じ長
さの鎖から成るデナプレツクスを圢成し、これは
分離されお単鎖の分子ずなる。 栞酞の盞補的な鎖が分離するず、圓初の栞酞が
二重鎖であ぀おも単鎖であ぀おも、その鎖は他の
栞酞鎖の合成甚鋳型ずしお容易に䜿甚するこずが
できる。この合成は任意の奜適な方法を甚いお行
うこずができる。通垞それは奜たしくはPHがか
ら、最も奜たしくはである緩衝氎溶液䞭で起
こる。奜たしくは過剰のモル比クロヌン化され
た栞酞に぀いおは、通垞プラむマヌ察鋳型が
1000、そしおゲノムの栞酞に぀いおは通垞プ
ラむマヌ察鋳型が106の぀のオリゎヌク
レオチドプラむマヌを分離された鋳型鎖を含む緩
衝氎溶液䞭に加える。しかし本法を蚺断的甚途に
䜿甚する堎合には盞補的な鎖の量は既知ではない
こずを理解すべきであり、埓぀お盞補的な鎖の量
に関連するプラむマヌの量を確信をも぀お決定す
るこずはできない。しかし実際には、増幅すべき
配列が耇雑な長鎖の栞酞鎖の混合物䞭に含たれる
堎合には、加えられるプラむマヌの量は盞補的な
鎖鋳型の量よりも通垞モル過剰ずする。本法
の効率を改良するためには、倧きな過剰モル比ず
するこずが奜たしい。 デオキシリボヌクレオシド䞉リン酞であるデオ
キシATP、デオキシCTP、デオキシGTP及び
TTPの十分な量も合成混合物に加え、生成する
溶液を玄90−100℃で玄から10分、奜たしくは
から分間加熱する。この加熱時間の埌、溶液
の枩床をプラむマヌのハむブリダむれヌシペンに
奜適な20−40℃たで䞋げる。この冷华した混合物
に重合詊薬を加え、埓来知られおいる条件䞋で反
応を行わせる。この合成反応は、宀枩からそれを
越えるず重合詊薬が効率的に機胜しない枩床たで
の間で行わせるこずができる。埓぀お䟋えば
DNAポリメラヌれを重合詊薬ずしお䜿甚するず
きは、枩床を通垞45℃以䞊に䞊昇させない。シグ
ナルを怜出するのに有効な量のゞメチルスルフオ
キシドDMSOを存圚させ、又は枩床を35〜
40℃ずするこずが奜たしい。最も奜たしいのは、
−10容量のDMSOを存圚させ、枩床を35−
40℃ずするこずである。増幅すべき配列がHLA
DQ−α又は−β遺䌝子のような110を越える塩
基察断片であるような甚途の堎合には、有効量
䟋えば10容量のDMSOを増幅甚混合物に加
えか぀反応を35−40℃で行぀お、怜出できる結果
を埗るか又はクロヌニングを可胜にする。 重合詊薬は、プラむマヌの䌞長生成物の合成を
達成できるものならば、酵玠を含むどのような化
合物でも系でもよい。この目的のための奜適な酵
玠は、䟋えばE.コヌリヌDNAポリメラヌれ、
E.コヌリヌDNAポリメラヌれのクレノヌ断片、
T4DNAポリメラヌれ、他の入手できるDNAポ
リメラヌれ、逆転写酵玠及び耐熱性酵玠を含む他
の酵玠を含み、これらは奜適な態様でヌクレオチ
ドの結合を促進し、各栞酞鎖ず盞補的であるプラ
むマヌの䌞長生成物を圢成する。䞀般に合成は各
プラむマヌの3′末端から始たり、合成が終了する
たで鋳型鎖に沿぀お5′末端方向に向か぀お進行
し、異な぀た長さの分子を生成する。しかし䞊述
の方法ず同じ方法を甚いお5′末端で合成を始め、
他の方向に向か぀お反応を進行させる詊薬があ
る。 新たに合成された鎖ずそれず盞補性を有する栞
酞鎖は、本法のその埌のステツプにおいお䜿甚さ
れる二重鎖分子を圢成する。次のステツプでは、
二重鎖分子の鎖は䞊述の任意の手順を甚いお分離
され、単鎖分子を提䟛する。 新たな栞酞が該単鎖分子䞊で合成される。远加
の誘導詊薬、ヌクレオチド及びプラむマヌを、䞊
蚘に芏定した条件䞋で反応を進行させるために必
芁ならば加えおもよい。オリゎヌクレオチドプラ
むマヌの䞀末端から再床合成が始たり、そしお鋳
型の単鎖に沿぀お進行しお他の栞酞を生成する。
このステツプの埌における䌞長生成物の半分は
぀のプラむマヌが結合した特定の栞酞配列から成
぀おいる。 鎖分離ず䌞長生成物合成のステツプは、特定の
栞酞配列を所定量生産するたで必芁なだけの回数
繰り返すこずができる。埌により詳现に蚘茉する
ように、特定の栞酞配列は指数的に蓄積する。 最初の栞酞又は栞酞の混合物から以䞊の特定
の栞酞配列を生産するこずが望たしい堎合は、奜
適な数の異な぀たオリゎヌクレオチドプラむマヌ
を䜿甚する。䟋えば぀の異な぀た特定の栞酞配
列を生成する堎合には、぀のプラむマヌを䜿甚
する。プラむマヌのうちの぀は特定の栞酞配列
のうちの぀に関するもので、他の぀のプラむ
マヌは第の特定の栞酞配列に関するものであ
る。これにより、぀の異な぀た特定の配列が本
法を甚いお指数的に生産され埗る。本発明は、各
ステツプ埌に新しい詊薬を加える段階的方法、又
は党おの詊薬を初期のステツプで加える同時的方
法、又はある䞎えられた数のステツプの埌に新し
い詊薬を加える䞀郚段階的で䞀郚同時的である方
法のいずれによ぀おも行うこずができる。熱凊理
のように重合詊薬を䞍掻性化する鎖分離方法を採
甚した堎合には、熱に察しお䞍安定である酵玠の
堎合がそうであるように、各鎖分離ステツプ埌に
重合詊薬を補充するこずが必芁である。ヘリカヌ
れのような酵玠的手段を含む倚数の粟補された成
分を鎖分離ステツプで䜿甚する堎合は、同時的方
法を䜿甚するこずができる。同時的方法では、反
応混合物は、所望の配列を含む栞酞鎖の他に、鎖
分離酵玠䟋えばヘリカヌれ、rATPのような
鎖分離酵玠ぞの適切な゚ネルギヌ䟛絊源、぀の
ヌクレオチド、モル過剰のオリゎヌクレオチドプ
ラむマヌ及びE.コヌリヌDNAポリメラヌれの
クレノヌ断片のような誘導詊薬を含むこずができ
る。同時的方法で倉性のために熱を䜿甚するずき
は、誘導詊薬に䟝存するが奜たしくは65−90℃の
高枩で機胜する熱安定性ポリメラヌれ等の熱安定
性誘導詊薬を䜿甚し、この枩床で栞酞は平衡状態
にある単鎖ず二重鎖から成぀おいる。長さの短い
栞酞には、玄50℃皋床の䜎枩が採甚される。どの
皋床の高枩が䜿甚できるかは、その枩床で酵玠が
倱掻するかあるいはプラむマヌのハむブリダむれ
ヌシペンが䞍十分な皋床しか起こらないかどうか
に䟝存する。このような熱安定性酵玠は、䟋えば
A.S.カレデむンらによりBiokhimiya45å·»644−
651頁1980幎 に蚘茉されおいる。本法の各ステツプは、党おの
詊薬が始めから存圚するにもかかわらず、続いお
起こる。必芁ならば远加の詊薬を加えおもよい。
適切な長さの時間が経過しお所望量の特定の栞酞
配列が生成した埌、任意の公知方法で酵玠を倱掻
させるか反応成分を分離するかしお反応を停止さ
せる。 本発明方法は連続的に行぀おもよい。オヌトメ
ヌシペン化された方法の䞀態様ずしお、反応を、
倉性区域、詊薬添加区域及び反応区域を通぀おサ
むクルさせるような方法がある。他の態様では、
プラむマヌの䌞長生成物の合成に䜿甚する酵玠を
カラム䞭で固定化するこずができる。他の反応成
分は連続するカラムず加熱甚コむルを通るように
ポンプを䜿぀お連続的に埪環され、これにより、
生成した栞酞が酵玠を倱掻させるこずなく繰り返
し倉性される。 本発明の抂略が䞋蚘に瀺され、ここでは盞補的
な鎖〔S+〕ず〔S-〕から成る所望配列〔〕を
含む二重鎖DNAが栞酞ずしお䜿甚されおいる。
第の及び匕き続いお起こる反応サむクルでは、
圓初の鋳型䞊の各オリゎヌクレオチドプラむマヌ
の䌞長は、プラむマヌの぀ずずもにのみ終了す
る制限のない長さの、぀の新しいssDNA分子
生成物を生成する。以埌「長鎖生成物」ず呌ぶこ
れらの生成物は盎線的に蓄積し、぀たり任意数の
サむクルの埌に存圚する量はサむクル数に比䟋す
る。 このように生産される長鎖生成物は、匕き続い
お起こるサむクルの間䞀方又は他方のオリゎヌク
レオチドプラむマヌの鋳型ずしお機胜し、所望配
列〔S+〕又は〔S-〕の分子を生成する。これら
の分子も䞀方又は他方のオリゎヌクレオチドプラ
むマヌの鋳型ずしお機胜し、曎に他の〔S+〕及
び〔S-〕を生成し、埓぀おサむクル数に関連し
お指数的に〔〕の蓄積を生じさせる連鎖反応が
維持される。 オリゎヌクレオチドのハむブリダむれヌシペン
により圢成される意図されない副生成物は、それ
自身觊媒掻性がなく皀な䟋を陀く、埓぀お盎
線的に蓄積する。 【衚】 【衚】 新しく合成された長い生成物

【衚】 第サむクルで合成された長い
生成物
䞀方のプラむマヌのオリゎヌクレオチド配列ず
共に終る鎖及び他方の盞補的配列の各鎖は、生産
するこずが望たれおいる特定の栞酞配列〔〕で
あるこずが分かる。 本法のステツプは、プラむマヌ及び、重合
詊薬及び存圚するヌクレオチドの量によ぀おのみ
限定される以倖、無限に繰り返すこずができる。
怜出のためには、䟋えば詊料の特性に䟝存する量
である怜出できるシグナルを発生させるために芁
求される回数のサむクルを実斜する。䟋えば詊料
が玔粋か垌釈されたものならば、耇雑な混合物で
あるものよりも、少ない回数しか芁求されない。
詊料がヒトのゲノムDNAであるず、サむクルの
回数は、玄10−15回が奜たしい。 最初の栞酞は耇補されないので、その量は党工
皋䞭䞀定である。長鎖生成物は最初の栞酞からの
み生産されるので、その量は盎線的に増加する。
特定の配列の量は指数的に増加する。埓぀お特定
の配列はその量が増加しお優勢な成分ずなる。こ
のこずは次衚に瀺され、該衚は各サむクルの効率
が100であるずした堎合のサむクル埌の理論
的に存圚する成分量を比范したものである。 【衚】 単鎖の栞酞を鋳型ずしお䜿甚するず、サむクル
あたり぀の長鎖生成物が生成する。 本法は奜適な発珟ベクタヌに特定の栞酞配列を
挿入するためにクロヌン化するのに䜿甚できる。
該ベクタヌは適切な宿䞻生物を圢質転換しお暙準
的な組み換え䜓DNA技術により遺䌝子生成物を
生産する際に䜿甚できる。 通垞このようなクロヌニングはベクタヌぞの盎
接の連結反応又はオリゎヌクレオチドリンカヌの
付加ずそれに匕き続く制限酵玠による開裂を含ん
でいる。しかし䞡法ずも反応性が䞍十分である平
滑末端の連結反応を含んでいる。曎に䞡法ずもク
ロヌニングベクタヌぞの増幅された生成物を挿入
する際の䜍眮ずその数を制埡するこずができな
い。 本増幅工皋では、最初の鋳型栞酞、期埅される
暙的増幅生成物及び皮々のバツクラりンド非暙的
生成物に由来する栞酞の混合物が埗られる。最初
の鋳型DNAが、䟋えばヘテロ接合二量䜓遺䌝子
䞭におけるような倚数の暙的配列を含むか、又は
䞀連の関連した遺䌝子矀がある堎合にも、増幅さ
れた生成物は混合物ずなる。 本法のプラむマヌを、増幅反応で生産される
DNA混合物の迅速か぀特異的なクロヌニングを
補助するために修食しおもよい。このような修食
では、同じか又は異な぀た制限郚䜍がプラむマヌ
の5′末端に導入されお増幅された生成物の぀の
末端に制限郚䜍が生じる。奜適な酵玠で切断する
ず、増幅された生成物は容易にプラスミド又はベ
クタヌ䞭に挿入されクロヌニングされる。このク
ロヌニングは、混合物ではなく、個々の増幅され
た生成物の分析又は発珟を可胜にする。 同じ制限郚䜍を䞡プラむマヌに䜿甚するこずが
できるが、異な぀た制限郚䜍を䜿甚するず生成物
を特定の方向にベクタヌに挿入するこずができ、
か぀぀のプラむマヌのうちの぀のみに起因す
る増幅から生ずる挿入だけでなく倚数の挿入も抑
制するこずができる。単鎖配列決定甚ベクタヌぞ
クロヌニングする堎合、単鎖ハむブリダむれヌシ
ペンプロヌブが䜿甚される堎合、及びクロヌン化
された生成物が発珟されるべき堎合には、特定方
向ぞ挿入するこずが有甚である。 プラむマヌを調補する぀の方法は、暙的配列
ず僅かしか異ならないプラむマヌ配列を遞択する
こずである。各プラむマヌが䜍眮すべき領域は、
所望のベクタヌに奜適な制限郚䜍に盞同であるよ
うにスクリヌニングされる。䟋えば
“CAGTATCCGA  ”ずいう暙的配列は、
BamHI郚䜍を含む配列 ず僅かに䞀塩基が異な
るにすぎない。プラむマヌ配列はその3′末端にお
いお目的物に正確にマツチしか぀その5′末端の近
傍に倉圢した配列ず制限郚䜍を有するように遞択
される䟋えば“CAGgATCCGA ”の小文字
は暙的配列ずマツチしおいないこずを意味する。
この僅かに倉化した配列は最初の暙的配列ずハむ
ブリダむズし重合を開始するプラむマヌの胜力を
劚げるものではない。第の増幅サむクルの埌、
プラむマヌはコピヌされ、暙的ずなり、か぀新し
いプラむマヌず正確にマツチする。増幅工皋埌、
生成物は適切な制限酵玠で開裂され、そしお必芁
ならば脱塩カラム又は分子量クロマトグラフむヌ
カラムを通しおヌクレオチド䞉リン酞や塩等の連
結阻害剀を分離され、そしお連結反応によりバク
テリオフアヌゞM13のようなクロヌニングベクタ
ヌに挿入される。遺䌝子は、呚知の技術を甚いお
配列決定され、そしお又は発珟される。 プラむマヌを調補する第の方法は、プラむマ
ヌの3′末端を暙的配列から採甚し、そしおプラむ
マヌの5′末端に所望の制限郚䜍を付加するこずを
含む。この䟋ずしおHind郚䜍が配列
“cgaagctt CAGTATCCGA  ”を圢成するこ
ずにより付加され、ここで小文字の意味は䞊蚘の
通りである。加えられた塩基は増幅の第サむク
ルのハむブリダむれヌシペンには寄䞎しないが、
その埌のサむクルにおいおマツチする。増幅され
た最終生成物は制限酵玠で切断され、䞊蚘の通り
クロヌニングされ、そしお発珟される。増幅され
る遺䌝子は、䟋えばヒトのβ−グロビン、又はヒ
トのHLA DQ、DRもしくはDP−α及び−β遺
䌝子である。 曎に本法はむンビトロの突然倉異甚ずしお䜿甚
するこずができる。オリゎデオキシリボヌクレオ
チドは増幅されるべきDNA配列ず正確に盞補的
である必芁はない。これらは、ポリメラヌれ酵玠
や他に䜿甚されるいずれかの誘導詊薬によ぀お䌞
長されるために十分な皋床に、鎖ずハむブリダむ
ズするこずができればよい。䜿甚するプラむマヌ
が最初の鋳型ず正確に盞補的でない堎合のポリメ
ラヌれ連鎖反応の生成物は鋳型よりむしろプラむ
マヌ配列を有し、これによりむンビトロの突然倉
異を可胜にする。匕き続くサむクルでは、より以
䞊のミスペアヌプラむミングが必芁ずされないの
で、この突然倉異が枛るこずのない効率䞋で増幅
される。このように生産された突然倉異䜓は暙準
的な分子生物孊的技術により適切なベクタヌ䞭ぞ
挿入され、倉化した蛋癜質を生産する胜力等の倉
化した特質をこのベクタヌに䞎える。 䞊述した倉化したDNA配列を圢成する方法は、
より以䞊の配列倉化を誘発させるために異な぀た
プラむマヌを䜿甚しお該倉化したDNAに察しお
繰り返すこずができる。この方法では、䞀連の突
然倉異配列が埐々に生成され、ここでこの䞀連の
ものに新しく加えられるものは、最埌のものず僅
かに異なるこずがができるが、最初のDNA源配
列ずは非垞に倧きく異なるこずができる。この方
法では、非垞に倧きなミスマツチの堎合にプラむ
マヌが機胜しないために単䞀ステツプでは行うこ
ずのできない倉化を、最終的には䜜り出すこずが
できる。 曎に、十分な量のプラむマヌが増幅される鎖に
盞補的である配列を含むのであれば、プラむマヌ
はその配列の䞀郚ずしお盞補的でない配列を含む
こずができる。䟋えば鋳型配列に盞補的でない栞
酞配列䟋えばプロモヌタヌ、リンカヌ、コヌド
配列等を、぀又は䞡方のプラむマヌの5′末端
に結合させるこずができ、これにより増幅工皋の
生成物にこれを付加するこずができる。䌞長プラ
むマヌを添加した埌、盞補的でない栞酞挿入郚を
含む新しい鋳型の所望量を埗るために十分な数の
サむクルを実斜する。これにより簡単な技術を甚
いお比范的短時間䟋えば時間又はそれ以䞋
内に組合わされた断片を倧量に生産するこずが可
胜になる。 曎に本法においおは、最初の短い栞酞断片の鎖
を分離するこずにより生成する単鎖の3′末端に盞
補的かあるいは実質的に盞補的である3′末端を有
し、か぀5′末端が䞭倮切片に付加されるべき配列
の情報を含むものであるプラむマヌを䜿甚しお、
生成物より短鎖である既存の栞酞断片これを䞭
倮セグメントずいうから栞酞断片を合成するこ
ずができる。この方法は、 (a) 各栞酞鎖に盞補的である、各プラむマヌの䌞
長生成物が合成される条件䞋で、該既存の断片
の鎖を぀のオリゎヌクレオチドプラむマヌで
凊理し、ここで該぀のプラむマヌは、䞀方の
プラむマヌから合成される䌞長生成物がその盞
補䜓から分離されたずきに他方のプラむマヌの
䌞長生成物の合成のための鋳型ずしおの圹割を
果たすこずができるように、前蚘既存断片の各
鎖の3′末端ず実質的に盞補的であるように遞択
され、そしお各プラむマヌはその5′末端におい
お前蚘既存断片ず盞補的でなくか぀合成される
栞酞断片の぀の末端に察応するヌクレオチド
配列を含むものであり (b) その䞊でプラむマヌの䌞長生成物が合成され
た鋳型からプラむマヌの䌞長生成物を分離しお
単鎖分子を生成せしめ (c) ステツプ(b)から生じた単鎖分子をステツプ(a)
のプラむマヌにより、ステツプ(b)においお生成
した各単鎖をプラむマヌずしお甚いおプラむマ
ヌ䌞長生成物が合成される条件䞋で凊理し、こ
うしお぀の䞭間二重鎖栞酞分子このそれぞ
れには、オリゎヌクレオチド鋳型の䞀方の5′末
端に存圚する栞酞配列が導入されおいるず
぀の十分に長い二重鎖栞酞分子このそれぞれ
に、オリゎヌクレオチドプラむマヌの䞡者の
5′末端に存圚するヌクレオチド配列が導入され
おいるを生成せしめ (d) 前蚘十分な長さの二重鎖分子の有効量を生産
するのに十分な回数ステツプ(b)ずステツプ(c)を
繰り返し (e) ステツプ(d)の生成物の鎖を぀のプラむマヌ
で凊理しお、ステツプ(d)の生成物が䞡末端にお
いお䌞びるようにしそしお (f) 䞭倮セグメントずしおのステツプ(d)の生成物
及びステツプ(d)の生成物の鎖を分離するこずに
より生成する単鎖の3′末端ず盞補的か実質的に
盞補的である぀のオリゎヌクレオチドプラむ
マヌをしお䜿甚しながらステツプ(a)からステツ
プ(d)たでを繰り返す こずから成る方法である。 ステツプ(b)ずステツプ(c)は必芁なだけ通垞少な
くずも回繰り返しお、最終生成物を合成するた
めに必芁な量すなわち、有効量の十分に長い
二重鎖生成物を生産する。曎に䞭倮のセグメント
を、先行する増幅サむクルの生成物ずしお埗るこ
ずができる。ステツプ(d)の生成物は䌞長又は増幅
の新たなサむクルの前に粟補され、又は生成物を
含む反応混合物ずし盎接䜿甚する。 プラむマヌの3′末端が最初の䞀局短い鎖の栞酞
の単鎖の3′末端ず正確に盞補的でないずきは、生
成物の䞭倮のセグメントは該最初の䞀局短い鎖の
栞酞にある配列情報ず正確に同じではない。埓぀
お最初の栞酞の倉異䜓を、その3′末端が最初の䞀
局短い鎖の栞酞の単鎖の3′末端ず実質的に盞補的
であるプラむマヌを甚いお䜜り出すこずができ
る。 制限郚䜍リンカヌがプラむマヌに導入される
ず、増幅された二重鎖生成物が適切な制限酵玠で
消化され、迅速なクロヌニング及び配列決定のた
めにM13ベクタヌ䞭に盎接連結される。特定の増
幅された暙的配列を有するM13溶菌斑は、暙的配
列に特異的なプロヌブず溶菌斑のリフトフむルタ
ヌをハむブリダむズせしめるこずにより同定する
こずができる。 本法は、䌝染性疟患、遺䌝子性疟患又は现胞性
疟患、䟋えば癌、ず関連する特定の栞酞配列、䟋
えば発癌遺䌝子、の怜出及び又は特城付けを可
胜にするために䜿甚される。増幅は、䟋えば胎児
现胞から埗られるDNAを甚いる鎌状赀血球貧血
の胎児蚺断等、分析に利甚できる栞酞の量が非垞
に小さい堎合に有甚である。増幅は、本来的に感
床の良くない非攟射性怜出技術を甚いお少量の詊
料を分析する堎合、又は攟射性技術を甚いるが迅
速な怜出が望たしい堎合に特に有甚である。 本発明の目的のためには、遺䌝子性疟患は、䟋
えば鎌状赀血球貧血、嚢胞性繊維症、α−サラセ
ミア、β−サラセミア等の、任意の生物䜓からの
ゲノムDNA䞭の特定の欠損及び又は倉異を含
む。鎌状赀血球貧血は本法による奜適なDNA配
列の増幅の埌のオリゎマヌ制限分析又はRFLP状
分析を経お容易に怜出するこずができる。α−サ
ラセミアは配列が存圚しないこずにより怜出する
こずができ、β−サラセミアは疟患を起こさせる
倉異に近接しおリンクする倚圢性
polymorplic制限郚䜍の存圚により怜出する
こずができる。 これら党おの遺䌝子性疟患は適切な配列を増幅
し、それを攟射性プロヌブを䜿甚せずにサザンプ
ロツト法により分析しお怜出するこずができる。
このような方法では、䟋えば非垞に少量の所望配
列を含む矊氎からのDNAの少量の詊料を増幅し、
制限酵玠で切断し、そしおサザンプロツト法で分
析する。増幅シグナルをハむレベルずするこずに
より、非攟射性暙䜓を䜿甚するこずが容易にな
る。 他の態様では、少量のDNAを䟿利なレベルた
で増幅し、次に曎に䌞長反応を行うが、この堎合
容易に怜出できるヌクレオチド誘導䜓䟋えば
32P又はビオチンでラベルしたヌクレオチド䞉リ
ン酞を盎接最終のDNA生成物に導入し、これ
を制限分析及び電気泳動分析あるいは任意の他の
奜適な方法を甚いお分析する。この技術のモデル
系の䟋を第図に瀺しおある。 第図のモデル系に瀺した曎に他の態様では、
栞酞は増幅の前に特定の制限゚ンドヌクレアヌれ
に暎露する。切断された配列は増幅できないの
で、予め制限酵玠で凊理したDNA詊料の存圚に
もかかわらず増幅された断片が珟れるこずは増幅
された配列䞭に゚ンドヌクレアヌれの郚䜍がない
こずを意味する。増幅された配列が存圚するか吊
かは適圓な方法で怜出するこずができる。 この技術の実際的な適甚方法は、本明现曞ずサ
むキらによるBiotechnology巻1008−1012頁に
蚘茉されおいるオリゎマヌ制限技術を甚いお鎌状
赀血球貧血の怜出を容易にする䜿甚により䟋瀺す
るこずができる。鎌状赀血球貧血はβ−グロビン
遺䌝子の第コドンの぀の塩基察の倉化により
生ずるヘモグロビンの疟患である。第図は倚血
珟象polymorphish領域䞭の正垞及び鎌状赀
血球貧血のβ−グロビン遺䌝子の配列を瀺すもの
で、䞀本線は正垞遺䌝子にのみ存圚するDde郚
䜍の䜍眮を瀺し、二本線は正垞及び鎌状赀血球貧
血察立遺䌝子の䞡方に存圚する非倚圢性のHinf
郚䜍の䜍眮を瀺す。第図は䞡制限郚䜍郚䜍間
にわたり星印で瀺された郚分がラベルされおいる
プロヌブを甚いお正垞のβ−クロビンDNAをオ
リゎマヌ制限開裂する方法を瀺すものであるプ
ロヌブは、制限郚䜍からの塩基察の数が、制限郚
䜍から他の末端たでの塩基察の数より少なくなる
方の末端にラベルするこずが奜たしい。前に蚘
茉したようにしお増幅されたDNAが倉性され、
ラベルされたプロヌブずアニヌルされる。増幅
は、次構造の圢成を最小に抑えるためにゞメチ
ルスルフオキシドの存圚䞋枩床を䞊げお435−40
℃実斜する。酵玠DdeはDNAを再構成され
たDde郚䜍で開裂させ、ラベルされたオクタマ
ヌを生じさせる。テストに䜿甚した条件䞋では、
オクタマヌはデナプレツクスから離れるのに十分
な短さである。匕き続く酵玠Hinfの添加は今
や単鎖であるオクタマヌに䜕の圱響も䞎えない。
第図はβ−グロビンDNAの鎌状赀血球察立遺
䌝子に適甚した前蚘ず同じ方法を瀺す。酵玠Dde
は、−の塩基察がミスマツチしたものであ
るため、増幅されたDNAずラベルされたプロヌ
ブずで圢成されたデナプレツクスを開裂させるこ
ずはできない。しかし酵玠Hinfはハむブリツ
ド制限開裂せしめ、ラベルされたトリマヌが生成
される。実際にはこの方法は、特定のシグナルが
いずれかの察立遺䌝子の存圚ず関連するので、個
䜓のDNAが野性型のホモ接合䜓か、鎌状赀血球
貧血型のホモ接合䜓か又は鎌状赀血球貧血圢質を
有するヘテロ接合䜓であるかを怜蚺するこずがで
きる。䞊述の方法を䜿甚しお適切な配列を増幅さ
せるこずにより぀の32Pラベルのみを有するプ
ロヌブを甚いお単コピヌ遺䌝子性を迅速に分析す
るこずができる。 皮々の䌝染性疟患は、原因ずなる埮生物に特異
的でである特定のDNA配合の臚床詊料䞭での存
圚により蚺断するこずができる。これらはサルモ
ネラ、クラミゞア、ネむセリア等の现菌、肝炎ビ
ヌルス等のビヌルス、マラリアの原因ずなるプラ
スモゞりムPlasmodium等の奇生䜓を含む。
フアルコヌに䞎えられた米囜特蚱第4358535号は、
䌝染性疟患の蚺断甚の特別なDNAハむブリダむ
れヌシペンプロヌブの䜿甚に぀き蚘述しおいる。
フアルコヌ法に固有の問題は、感染した患者から
の臚床詊料䞭には比范的少ない数の病原生物しか
存圚せず、これらから抜出されたDNAは詊料䞭
の党DNAの非垞に小さな郚分を構成するのみで
あるずいうこずである。DNA詊料を固定化しハ
むブリダむれヌシペン怜出する前に問題ずな぀お
いる配列を特異的に増幅するこずは、これらの方
法の感床ず特異性を倧きく改良する。 䌝染性疟患の蚺断甚にDNAプロヌブを臚床的
にルヌチン化しお䜿甚するこずは、ワヌドのペヌ
ロツパ特蚱第63879号に茉されおいるように非攟
射的にラベルされたプロヌブを䜿甚するのなら
ば、倧いに簡略化される。この方法では、ビオチ
ンを含むDNAプロヌブがアビゞン又はビオチン
に特異的な抗䜓に結合した色玠䜓
chromogenic酵玠により怜出される。この型
の怜出は䟿利であるが、比范的䜎感床である。本
法による特異的なDNA増幅ず安定にラベルされ
たプロヌブを組み合わせるこずにより、フアルコ
ヌ及びワヌドの方法をルヌチン化した臚床におけ
る有甚な方法に実斜するのに芁求される䟿利さず
感床を提䟛するこずができる。 曎にプロヌブは、ビオチンが次匏のスペヌサヌ
アヌム に結合したビオチン化したプロヌブずしおもよ
く、ここでは、、NH又は−CHO、は
からたでの数、そしおはからたでの数
である。そしお次にスペヌサヌアヌムは次匏のプ
゜ラレン成分に結合しおいる。 プ゜ラレン成分は、クラヌゞ・テツベによる
Biocm.Biophys.Acta.697巻−頁1982幎
に蚘茉されおいるように“ギダツプのある環状”
のプロヌブに挿入しか぀架橋し、ここでギダツプ
のある環の単鎖ハむブリダむれヌシペン領域はプ
ラむマヌに含たれる領域にわたる。 この増幅工皋は単䞀コピヌのヒト遺䌝子から十
分な量のDNAを調補するのに利甚するこずもで
き、これにより臭化゚チゞりムのような簡単な非
特異的なDNA染色によりそれを怜出でき、盎接
DNA蚺断を行うこずができる。 䌝染性疟患及び生物䜓のゲノム䞭の病原的異垞
性を怜出するほか、本法は任意の病原状態ず関連
しないDNA倚圢珟象ボルモルフむズムを怜
出するために䜿甚するこずもできる。 次の実斜䟋は䟋瀺のために提瀺するもので、ど
のようにも本発明を限定するこずを意図するもの
ではない。これらの実斜䟋で党おのパヌセントは
固䜓の堎合は重量で、液䜓の堎合は容量であり、
他に指定がない限り枩床は摂氏枩床である。 実斜䟋  次のヌクレオチド配列を有する25塩基察配列 5′CCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCT3′ 3′GGAGCCGTGGCAGTGGGACCTACGA5′ ATCCから埗られるpBR322の47塩基察Fok
制限断片䞊に含たれるを次のように調補し
た。47塩基察断片を含むpBR322のFok消化物
を䟛絊者であるニナヌむングランド瀟の指瀺によ
る条件に埓぀おpBR322をFokで消化するこず
により調補した。䜿甚したプラむマヌは、5′d
CCTCGGCACCG3′ず5′d
AGCATCCAGGGTG3′であり、通垞の技術
により調補した。25mMのリン酞カリりムず
10mMの塩化マグネシりム、及び100mMの塩化
ナトリりムから成る緩衝液PH7.533Όに2433
ピコモルの䞊述の各プラむマヌ、2.4ピコモルの
pBR322のFok消化物、22ナノモルのデオキシ
ATP、22ナノモルのデオキシCTP19ナノモル
のデオキシGTP及び10ナノモルのTTPを加え
た。 混合物を85℃で分間加熱し、宀枩たで冷华し
た。E.コヌリヌDNAポリメラヌれのクレノヌ
断片の単䜍を加え、枩床を15分間維持した。そ
の埌再床85℃で分間加熱し、冷华した。クレノ
ヌ断片の単䜍を再床加え、15分間反応を行぀
た。加熱、冷华及び反応の各ステツプを曎に11回
繰り返した。 最埌の繰り返しの埌、5Όを反応混合物から
取り出した。これを85℃で分間加熱し、宀枩に
冷华した。12.5ピコモルのα−P32−デオキシシ
チゞン䞉リン酞ず単䜍のクレノヌ断片を加え反
応を15分間進行させた。ラベルされた生成物をポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動で確認した。13
サむクル埌に芋える匷くラベルされたバンドのみ
が、意図する25塩基察配列であ぀た。 実斜䟋  増幅されるべき所望の配列は、ヒトのβ−グロ
ビン遺䌝子に含たれか぀鎌状赀血球貧血に関する
Mst郚䜍を含む94塩基察の配列であ぀た。該配
列は第図に瀺すヌクレオチド配列を有しおい
る。 プラむマヌの合成 次の぀のオリゎデオキシヌクレオチドプラむ
マヌを䞋蚘する方法を甚いお調補した。 5′CACAGGGCAGTAACG3′プラむマヌ、及
び 5′TTTGCTTCTGACACA3′プラむマヌ オヌトメヌシペン化された合成法 ビナヌケヌゞずカルサヌス法Tetrahedron
Letters22å·»1859−1862頁11981幎に埓぀お合
成したゞ゚チルフオスフオロアミダむトを、バむ
オサヌチSAM−を䜿甚しお制埡した倚孔ガラ
ス担䜓から誘導したヌクレオシドぞ次々ず濃瞮し
た。この方法は、ゞクロルメタン䞭でのトリクロ
ル酢酞による脱トリチル化ず掻性のある氎玠䟛䞎
䜓ずしおベンゟトリアゟヌルを䜿甚する瞮合、及
びテトラハむドロフラン及びピリゞン䞭での無氎
酢酞ずゞメチルアミノピリゞンによるキダツピン
グを含んでいた。サむクルの時間は玄30分であ
぀た。各ステツプの収率は実質的に圓量的であ
り、脱トリチル化の間に解離するゞメトキシトリ
チルアルコヌルを集めた分光噚による怜査で決定
した。 オリゎデオキシリボヌクレオシドを脱保護化し、
粟補する方法 固䜓担䜓をカラムから取り出し、mlの濃氎酞
化アンモニりムに閉鎖管䞭宀枩で時間曝した。
担䜓を濟過で取り陀き、䞀郚が保護されたオリゎ
デオキシリボヌクレオチドを含む溶液の枩床を55
℃に䞊昇させ、時間維持した。アンモニアを取
り陀き、残枣を調補甚ポリアクリルアミドゲルに
適甚した。30ボルトcmで90分間電気泳動を行
い、生成物を含むバンドを螢光プレヌト䞊のUV
シダドりむングで同定した。該バンドを切り取
り、mlの蒞留氎で䞀晩かけお℃で溶出した。
この溶液をアルテツクPR18カラムにかけ、PH6.0
の酢酞アンモニりム緩衝液䞭−13のアセ
トニトリルで溶出した。この溶出液は260nmの玫
倖吞収でモニタヌし、適切なフラクシペンを集
め、固定した量での玫倖吞収で定量分析し、か぀
宀枩䞋で枛圧遠心機䞭で蒞発させ也燥した。 オリゎデオキシリボヌクレオチドの特城付け 粟補したオリゎヌクレオチドのテスト溶液をポ
リヌクレオチドキナヌれ及びγ32P−ATPで32Pラ
ベルした。このラベルした化合物を50ボルトcm
で45分間電気泳動にかけた埌、14−20のポリア
クリルアミドゲルのオヌトラゞオグラフむヌで確
認した。この方法では分子量を確認するこずがで
きる。ヘビ毒ゞ゚ステラヌれず现菌性アルカリフ
オスタヌれを䜿甚しおオリゎデオキシリボヌクレ
オチドをヌクレオシドに消化し、そしお次に、逆
盾HPLCカラム、䞊びに10アクリロニトル及び
酢酞アンモニりム移動盞を䜿甚しお、誘導さ
れたヌクレオシドを分離し定量するこずにより塩
基組成を決定した。 DNA源  党ヒト野性型DNAの抜出 正垞のβ−グロビンのヒトゲノムDNAホモ接
合䜓を、ステツトラヌらによりProc.Nat.Acad.
Sci.の72å·»5966−5970頁に蚘茉された技術を甚い
おセルラむンMolt4ヒナヌマン・ゞ゚ネテむツ
ク・ミナヌタント・セル・レポゞトリヌから入手
し、CM2219cず同定したから抜出した。  クロヌン化したグロビン遺䌝子の造成 正垞のβ−グロビン遺䌝子の1.9kbのBamHI断
片をコスミドpFC11から分離し、pBA322のBam
HI郚䜍に挿入した゜ベロンらのGene巻287
−305頁1980幎。合成40塩基察プロヌブずハ
むブリダむズする領域を含むこの断片は、第及
び第の゚ク゜ン、第のむントロン、䞊びに遺
䌝子の5′のフランキングflanking配列を含む
ロヌンらのCell15å·»1157−1174頁。このクロヌ
ンはpBR328HbAず名付けられ、ATCC第
39698号ずしお1984幎月25日に寄蚗された。 β−グロビンの鎌状赀血球貧血察立遺䌝子の察
応する1.9kbのBamHI断片はコスミドpF12から
分離され、䞊述の通りクロヌン化された。このク
ロヌンはpBR328Hbsず名付けられ、ATCC第
39699号ずしお1984幎月25日に寄蚗された。 各組み換えプラスミドをE.コヌリヌMM294
ATCC第39607号ぞ圢質倉換し、そしお増殖せ
しめた。  クロヌン化されたグロピン遺䌝子のMstに
よる消化 それぞれの党量が100ÎŒgであるpBR328HbA
ずPbr328Hbsを単独で20単䜍のMstニナヌ
むングランドバむオラブ瀟ずずもに16時間37
℃、150mMNaCl、12mMのTris HC1PH7.5、
12mMのMgCl2、1mMのゞチオスレむトヌル
DTT及び100ÎŒgmlのりシ血枅アルブミン
BSA䞭で消化した。生成物はそれぞれ
pBR328HbAMst及びpBR328HbS
Mstず名付ける。 ポリメラヌれの連鎖反応 60mM酢酞ナトリりム、30mMトリス−アセテ
ヌト及び10mM酢酞マグネシりムを含むPH8.0の
緩衝液100Όぞ100ピコモルのプラむマヌ
CACAGGGCACTAACGの配列、100ピコモ
ルのプラむマヌ
TTTGCTTCTGACACAの配列及び1000
ピコモルのデオキシATP、デオキシCTP、デオ
キシGTP及びTTPを含む2Όの溶液を加えた。
曎に䞊述した、䞋蚘のDNA源の぀を加えた。 10ÎŒgの党ヒト野性型DNA反応 0.1ピコモルのpBR328HbA反応 0.1ピコモルのpBR328HbS反応 0.1ピコモルのpBR328HbAMst反応
 0.1ピコモルのpBR328HbBMst反応
 非暙的DNA反応 埗られる各溶液を100℃で分間加熱し分間
で宀枩たで冷华し、その埌E.コヌリヌDNAポリ
メラヌれのクレノヌ断片の単䜍を含む1Όを
加えた。各反応は10分間行い、その埌プラむマ
ヌ、ヌクレオチド及びDNAを加え、加熱し、冷
华し、ポリメラヌれを加え、そしお反応させるサ
むクルを反応に぀いおは19回、反応−に぀
いおは回繰り返した。 第サむクルの前及び各反応の最埌のサむクル
の埌で取り出された反応及びのアリコヌト
マむクロリツトルを、PH8.3の0.089Mトリス硌酞
塩緩衝液䞭で、2.5mMEDTA䞭で、12ポリア
クリルアミドゲルに加えた。このゲルを25ボル
トcm、時間電気泳動させ、固盞担䜓ずしお機
胜するナむロン膜ぞ移し、そしお、PH7.4で30
のフオルムアミド、3xSSPE、5xデンハルツ及び
のドデシル硫酞ナトリりム䞭で、暙準的技術
を甚いお調補した次匏 5′dTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCA
AG3′ の32Pでラベルされた40塩基察の合成断片で怜知
した。第図は、反応及び甚の怜知されたナ
むロン膜のオヌトラゞオグラフである。レヌン
は0.1ピコモルの58塩基察の察照合成断片で、そ
のうちの぀の鎖は䞊蚘プロヌブず盞補的であ
る。レヌンは第の増幅サむクルの前の4ÎŒ
の反応の液である。レヌンは20回の増幅サむ
クル埌の4Όの反応の液である。レヌンは
回の増幅サむクル埌の4Όの反応の液であ
る。レヌンはα−32P−デオキシNTP及びポリ
メラヌれでラベルされたpBR322ニナヌむング
ランドバむオラブ瀟のFokニナヌむング
ランドバむオラブ瀟から成る分子量暙準であ
る。レヌンは、20サむクル埌反応混合物は適
切な分子量を有する特定の配列を倧量に含み、他
の怜出できる生成物がないこずを瀺しおいる。
サむクル埌の反応混合物もレヌンに瀺す通り
出発物質である栞酞ず他の生成物の他にこの生成
物も含んでいる。 サむクル埌の反応からの液5.0Όに䞊述
の各プラむマヌピコモルを加えた。溶液を分
間100℃に加熱し宀枩ぞ戻した。それぞれピコ
モルのα−32P−デオキシATP、α−32P−デオ
キシCTP、α−32PデオキシGTP及びα−32P−
TTP、䞊びに単䜍のクレノヌ断片を加えた。
最終的な容積が10Όであり塩濃床が䞊した通り
である反応を10分間行わせた。ポリメラヌれ掻性
は60℃で20分間加熱するず倱われた。反応−
の反応液4Όを、0.089Mトリス硌酞塩緩衝液、
2.5mMEDTA䞭で12ポリアクリルアミドゲル
に加えた。このゲルを25ボルトcm、時間電気
泳動させ、その埌オヌトラゞオグラフ凊理した。 第図は、電気泳動のオヌトラゞオグラフであ
る。レヌンは分子量暙準、レヌンは反応、
レヌンは反応、レヌンは反応及びレヌン
は反応である。察照ずしおのDNAを䌎なわ
ない反応のレヌンはレヌンのどこにもむメヌゞ
を有さない。図から、暙的DNAから予想される
94塩基察断片は、無傷のβ−グロブリンDNA配
列が増幅甚に䜿甚できるずきのみ存圚できるこず
が分かる぀たりレヌンのpBR328HbA、レ
ヌンのpBR328HbS及びレヌンの
pBR328HbSMst。Mstによる消化は
pBR328HbAを94塩基察配列䞭で切断し、それ
を増幅できないようにし、94塩基察のバンドはレ
ヌンに珟れない。これに察し、pBR328HbS
の94塩基察配列はプラスミドがMstで消化され
おも切断せず、埓぀お第図に瀺すように増幅に
利甚できる。 第図は94塩基察配列を増幅するサむクルの
連鎖反応を瀺すものである。PCOずPCOは
プラむマヌ及びである。右の数はサむクルを
瀺し、巊の数は特定の分子が生産されたサむクル
数を瀺す。 実斜䟋  本実斜䟋は、ヒトヘモグロビン遺䌝子䞭の察立
遺䌝子Mst郚䜍を含む110塩基察配列の増幅を
瀺すものである。 プラむマヌは実斜䟋の技術で調補されたもの
である。1.0マむクログラムの党ヒトDNA、100
ピコモルの
ACACAACTGTGTTCACTAGC及び100ピ
コモルのCAACTTCATCCACGTTCACC
を以䞋のような100Όの溶液に溶解させた。 1.5mM各぀のデオキシリボヌクレオシド䞉
リン酞 30mMPH7.9のトリスアセテヌト緩衝液 60mM酢酞ナトリりム 10mM酢酞マグネシりム 25mMゞチオスレむトヌル この溶液を100℃で分間加熱し、迅速に25℃
に䞋げお分間加熱し、その埌DNAポリメラヌ
れのクレノヌ断片2.5単䜍を加えた。ポリメラヌ
れの反応が25℃で分間行い、その埌加熱、冷
华、クレノヌ断片の添加及び反応を望むだけ繰り
返した。 各サむクルの効率が70℃で、15サむクル行぀
お、β−グロビン遺䌝子の所望の110塩基察断片
1.4プトモルを合成した。 実斜䟋  本実斜䟋は、ヒトヘモグロビン遺䌝子の察立遺
䌝子䞭のMst郚䜍を含む240塩基察配列の増幅
を瀺すものである。この配列は、Nco、Hinf
及びMst制限郚䜍を含んでいる。 PHが8.0で、60mM酢酞ナトリりム、30mMト
リスアセテヌト及び10mM酢酞マグネシりムの混
合物0.1ピコモルのpBR328HbAを含むに、 100ピコモルの
GGTTGGCCAATCTACTCCCAGGプラむ
マヌ、 100ピコモルの
TAACCTTGATACCAACCTGCCCプラむ
マヌ、 各1000ピコモルのデオキシATP、デオキシCTP、
デオキシGTP及びTTP を含む2Όの溶液を加えた。 ぀のプラむマヌは実斜䟋に蚘茉した技術で
調補した。溶液を100℃で分間加熱し、空気䞭
で分間冷华し、その埌E.コヌリヌDNAポリメ
ラヌれのクレノヌ断片単䜍を含む液1Όを加
えた。反応を10分間進行させ、その埌溶液の添
加、加熱、冷华、ポリメラヌれの添加及び反応か
らなるサむクルを回繰り返した。反応液5.0ÎŒ
に、䞊蚘の各オリゎヌクレオチドプラむマヌピ
コモルを加えた。溶液を100℃で分間加熱し、
宀枩たで䞋げ、その埌それぞれピコモルのα−
32P−ラベルされたデオキシリボヌクレオシド䞉
リン酞及び単䜍のクレノヌ断片を加えた。最終
的な容量が10Όで塩濃床が䞊蚘の通りである反
応を10分間進行させる。ポリメラヌれ掻性は60℃
で20分間加熱するず倱掻した。2Όのアリコヌ
トをNco、Hinf及びMstで消化し、PH8.3
の0.089Mトリスアセテヌト緩衝液、
0.25mMEDTA䞭で12ポリアクリルアミドゲル
に加えた。ゲルを25ボルトcmで時間電気泳動
させ、オヌトラゞオグラフ凊理した。第図は電
気泳動のオヌトラゞオグラフを瀺し、ここでレヌ
ンは分子量暙準、レヌンは酵玠の消化を䌎わ
ないもの無傷の240塩基察、レヌンはNco
による消化131及び109塩基察、レヌンは
Mstによる消化149及び91塩基察、そしおレ
ヌンはHinfによる消化144及び96塩基察
である。オヌトラゞオグラフは240塩基察反応の
増幅したものず䞀臎する。 実斜䟋  本実斜䟋は、逐次的消化による鎌状赀血球貧血
を怜出するための本発明の方法の䜿甚を瀺すもの
である。 オリゎデオキシリボヌクレオチドの合成及びリン
酞化 5′*
CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTA
′ の配列のラベルされたDNAプロヌブ*がラベル
を意味するRS06、及びRS06ず぀の塩基察が
ミスマツチしおいる。
3′GACAGAGGTCACCTCTTCAGACGGCAA
′ の配列のラベルされおいないブロツクオリゎマヌ
RS10を、実斜䟋の方法に埓぀お合成し
た。プロヌブRS06は、そのピコモルを、
70mMトリス緩衝液PH7.6、10mM MgCl2、
1.5mMスペルミン及び2.5mMゞチオスレむトヌ
ルを含む反応容量40Ό䞭の単䜍のT4ポリヌク
レオチドキナヌれニナヌむングランドバむオラ
ブ瀟及び50ピコモルのγ−32P−ATPニナヌ
むングランドニナヌクレア瀟、玄7200Ciミリモ
ルず接觊させるこずによりラベルした。党容量
を25mMEDTAで100Όに調節し、トリス−
EDTATE緩衝液10mMトリス緩衝液、
0.1mMEDTA、PH8.0により平衡化されたバむ
オラツド補のmlのBio Gel −スピン透析
カラム䞊でマニアテむスらがMolecular Cloning
464−465頁1982幎に蚘茉しおいる方法に埓぀
お粟補した。ラベルされたプロヌブは、トリス−
硌酞−EDTATBE緩衝液89mMトリス、
89mM硌酞、2.5mMEDTA、PH8.3䞭18のポ
リアクリルアミドゲル19のアクリルアミ
ドBISずバむオラツド䞊で500vhrにお電気泳
動しおさらに粟補した。オヌトラゞオグラフによ
る䜍眮きめの埌、ラベルされたプロヌブを含む郚
分を切り取り、粉砕し、0.2mlのTE緩衝液䞭ぞ䞀
晩かけお℃で溶出させた。反応生成物のTCA
沈柱は比掻性が4.9Ciミリモルであり、最終的
濃床が20ピコモルmlであるこずを瀺しおいる。 ラベルされないRS10ブロツキングオリゎマヌ
は200ピコモルmlの濃床で䜿甚した。 现胞系からのヒトゲノムDNAの分離 実質的にステツトラヌらのPNAS79å·»5966−
5970頁1982幎、Molt4に぀いおに蚘茉の方法
及びマニアテむスらのMolecular Cloning280−
281頁1982幎に蚘茉の方法を䜿甚しお、
Molt4、SC−及びGM2064のリンパ球系から高
分子のゲノムDNAを分離した。 Molt4ヒナヌマン・ミナヌタント・セル・デ
ポゞトリヌGM2219Cは正垞のβ−グロビン
に぀いおホモ接合䜓の现胞系であり、そしお
ATCCに1985幎月19日に寄蚗されたSC−は
鎌状赀血球貧血察立遺䌝子に぀いおホモ接合䜓の
EBVで圢質倉換された现胞系である。
GM2064ヒナヌスマン・ミナヌタント・セル・
デポゞトリ−GM2064は胎児ヘモグロビンの
遺䌝的な氞続性HPFHに぀いおホモ接合䜓
である個䜓から最初単離され、β−又はΎ−グロ
ピン遺䌝子配列を含んでいない。党おの现胞系は
10の牛胎児血枅を含むRPMI−1640䞭に維持さ
れた。 臚床血液詊料からのヒトゲノムDNAの単離 既知の鎌状现胞キダリダヌASからのCH12
ず名付けられた臚床血液詊料をカルフオルニア州
オヌクランドの小児病院のベルトラム・ルビン博
士から埗た。ヌンベルグらのProc.Nat.Acad.Sci.
75å·»5553−5556頁1978幎に蚘茉されおいる方
法の倉法を䜿甚しお、䞻に末梢の血液リンパ球か
ら成るバフむヌコヌト郚分からゲノムDNAを調
補した。 现胞を、mlのトリス−EDTA−NaClTEN
緩衝液PHの10mMトリス、PH、
1mMEDTA、10mMNaCl䞭に再懞濁し、0.2
mgmlのプロテむナヌれ、0.5のSDSに調節し、
そしお37℃で䞀晩むンキナベヌトした。過塩玠酞
ナトリりムを0.7Mに加え、そしお现胞溶解物を
宀枩で−時間穏やかに振ずうした。现胞溶解
物をプノヌルずクロロフオルムの混合物
30mlで抜出し、続いおクロロフオルム30mlで抜出
し、次に゚タノヌルで栞酞を沈柱させた。ペレツ
トをmlのTE緩衝液に再懞濁させ、RNaseを
0.005mgmlに加えた。37℃で時間消化させた
埌、DNAを同量のプノノヌル、プノヌル
クロロフオルム、及びクロロフオルムでそれぞれ
䞀床ず぀抜出し、゚タノヌルで沈柱させた。
DNAを0.5mlのTE緩衝液に再懞濁させ、260nm
の吞収により濃床を決定した。 β−グロビン配列を遞択的に増幅するためのポリ
メラヌれ連鎖反応 マむクログラムのゲノムDNAを、10mMト
リス緩衝剀PH7.5、50mMNaCl、
10mMMgCl2、150ピコモルの配列 CACAGGGCACTAACGのプラむマヌ、
及び配列 CTTTGCTTCTGACACAのプラむマヌ
を含む反応容量100Όの圓初溶液䞭で増幅し、
か぀蒞発を防ぐため玄100Ό厚の鉱油で被芆し
た。 各DNA詊料に぀き、サむクルが次のステ
ツプから成る増幅のための15サむクルを行぀た。 (1) 分間95℃で熱ブロツクセツト䞭で倉性す
る。 (2) 熱ブロツクセツトを盎ちに30℃に移し分間
プラむマヌずゲノムDNAがアニヌリングする
ようにする。 (3) E.コヌリヌDNAポリメラヌれのクレノヌ
断片ニナヌむングランドバむオラブ単䜍
ずデオキシATP、デオキシCTP、デオキシ
GTP及びTTPそれぞれナノモルを含む2ÎŒ
の溶液10mMトリスPH7.5、50mMNaCl、
10mMMgCll2、及び4mMゞチオスレむトヌル
から成る緩衝液䞭を加える。この䌞長反応を
30℃にお10分間行぀た。 最埌のサむクルの埌、95℃に分間維持しお反
応を停止させた。鉱油は0.2mlのクロロフオルム
で抜出しお廃棄した。最埌の反応液の容量は
130Όであ぀た。 プロヌブ及びDdeHinfによる増幅したゲノ
ムDNAのハむブリダむれヌシペン消化 25マむクロリツトルの増幅されたゲノムDNA
を゚タノヌルで沈柱させ、同量のTE緩衝液䞭に
再懞濁した。10マむクロリツトル154ngのゲノ
ムDNAず同等の前増幅䜓を含むを1.5mlのマむ
クロフナヌゞ管に入れ、そしお20ΌのTE緩衝
液により最埌の容量を30Όずした。詊料を鉱油
で被芆しお95℃で10分間倉性した。ラベルされた
RS06プロヌブ0.02ピコモルを含む0.6MNaCl10マ
むクロリツトルを管に加え、穏やかに混合し、盎
ちに56℃の熱ブロツクに移しお時間おいた。ラ
ベルしおいないRS10ブロツキングオリゎマヌ
マむクロリツトル0.8ピコモルを加え、曎に
10分間同じ枩床でハむブリダむれヌシペンを続け
た。マむクロリツトルの60mMMgCl20.1
BSA及び1ΌのDel10単䜍、ニナヌむングラ
ンドバむオラブを加え、再アニヌリングされた
DNAを56℃で30分間消化した。マむクロリツ
トルのHinf10単䜍、ニナヌむングランドバ
むオラブを加え、曎に30分むンキナベヌトし
た。4Όの75mMEDTAず6Όのトラツキング
染料を最終容積が61Όになるように反応混合物
に加えお反応を終了した。 鉱油を0.2mlのクロロフオルムで抜出し、18ÎŒ
の反応混合物45nmのゲノムDNAをヘヌフア
ヌSE200装眮䞭の30ポリアクリルアミドのミニ
ゲル19、バむオラドに負荷した。このゲ
ルをブロモプノヌルブルヌ染料の前端が圓初の
䜍眮から3.0cm動くたで玄300ボルトで時間電気
泳動させた。該ゲルの前端の1.5cmは取り陀かれ、
残残りのゲルは日間−70℃で匷化スクリヌンに
曝される。 写真の怜蚎第図 各レヌンは45ngの増幅されたゲノムDNAを含
んでいる。レヌンはMolt4DNAを、レヌン
はCH12を、レヌンはSC−を、又レヌンは
GM2064を含んでいる。Molt4は、现胞圓たり
コピヌのβA遺䌝子を有する正垞の個䜓の遺䌝子型
CAAであり、CH12は、现胞圓たり個のβAず
個のβS遺䌝子を有する鎌状现胞キダリアからの臚
床甚詊料ASであり、そしおSC−は现胞圓
たりコピヌのβSを有する鎌状血球血貧血個䜓の
遺䌝子型を意味する。CM2064はβ−又はΎ−グ
ロビン配列を含有せず、ネガテむブ察照ずしお存
圚する。 写真から分かるようにDdeで開裂された、βA
特異的であるオクタマヌはβA遺䌝子を含むDNA
にのみ存圚しレヌン及び、Hinfで開裂
された、βS特異性を有するトリマヌは、βS遺䌝子
を含むDNAにのみ存圚するレヌン及び。
トリマヌ及びオクタマヌの䞡者の存圚レヌン
は鎌状赀血球貧血キダリアを瀺すものであ
り、オクタマヌのみを生ずる正垞の個䜓レヌン
及びトリマヌのみを瀺す鎌状赀血球貧血にか
か぀おいる個䜓レヌンから区別される。 比范のため、䞊蚘実隓を増幅されおいないゲノ
ムDNAを甚いお繰り返し行い、増幅を行うず怜
出感床が少なくずも1000倍増加するこずが分か぀
た。 実斜䟋  本実斜䟋は、ラベルされたプロヌブを䜿甚する
こずなく党ヒトDNA䞭の党く粟補されおいない
単䞀コピヌ遺䌝子をゲル䞊で盎接怜出する方法を
瀺すものである。 実斜䟋に蚘茉した技術を甚い、β−グロブリ
ン遺䌝子の第゚ク゜ン䞭の配列からの110塩基
察断片を、党ヒトDNA10マむクログラムから20
サむクルで増幅した。この20サむクル埌に生産さ
れる110塩基察断片は、臭化゚チゞりムにより容
易に染色されおゲル䞊で芋るこずができる。 配列は、最初に制限酵玠Ddeにより切断され
るず、配列がβ−グロビンの察立遺䌝子䞭にお
ける堎合のように酵玠により認識される制限郚䜍
を含たないものでない限り、増幅されなか぀た。 実斜䟋   ヒトβ−グロビン察立遺䌝子からの1.9kb
挿入郚を含有する合蚈100プムトモルの
pBR328、500Ciモルである各α−32P−デオ
キシNTPを50ナノモルず぀、及び実斜䟋で
䜿甚した各プラむマヌナノモルを、100ÎŒ
の30mMトリス−アセテヌトPH7.9、60mM
酢酞ナトリりム、100mMゞチオスレむトヌル
及び10mM酢酞マグネシりムを含む溶液䞭に溶
かした。この溶液を100℃にしお分加熱し、
25℃にお分冷华した。4.5単䜍のE.コヌリヌ
DNAポリメラヌれ及び0.09単䜍の無機ピロ
フオスフアタヌれを加えお反応混合物䞭でピロ
リン酞が生ずるのを防止し、その埌反応を25℃
で分間進行させ、曎に加熱、冷华、酵玠の添
加及び反応のサむクルを回繰り返した。各合
成サむクルの埌、10Όのアリコヌトを取り出
し1Όの600mMEDTAに加えた。それぞれ
を、90mMのトリスボレヌト及び
2.5mMEDTA䞭、PH8.3で14のポリアクリル
アミドゲル䞊で24ボルトcm、2.5時間で分析
した。操䜜の終了したゲルは、0.5ÎŒgmlの臭
化゚チゞりムを加えた同じ緩衝液に20分浞し、
圓初の緩衝液で掗浄し、赀フむルタヌを甚いお
玫倖線䞭で写真を撮圱した。 生産された110塩基察断片は玫倖線でゲルか
ら切り出し、そしおクレンコフ攟射により蚈数
した。がサむクル数を意味し、がサむクル
毎の郚分的収率である匏 pmoles10Ό0.01N−yN−、 にデヌタを䞀臎させようずする詊みは、が
0.619であずきに楜芳的なものずなる。これは、
十分な増幅が起こ぀おいるこずを暗瀺しおい
る。  各デオキシNTPを100ナノモルず぀100Όの
反応溶液に加え、攟射性ラベルを行わず、各サ
むクル毎に液を取り出さなか぀た以倖は、䞊蚘
実隓を繰り返した。10サむクル埌に反応物を
分間沞隰させお反応を停止させ、57℃、時間
で再ハむブリダむれヌシペンを行぀た。110å¡©
基察生成物の配列を、その8Όのアリコヌト
を、1Όの血枅アルブミン25mgmlず1ÎŒ
の奜適な制限酵玠Hinf、Mnl、Mst
、Ncoを加えお制限分析し、37℃で15時
間反応させお確認した。DAGEは、䞊述の通
り行぀た。 実斜䟋  本実斜䟋は、pBR328ずpBR322の皮々の断片
を増幅するために異な぀たプラむマヌを䜿甚する
䟋を瀺す。  次のプラむマヌを䜿いpBR328の130塩基察
断片を調補するこず以倖は実斜䟋7Aず同じよ
うに実隓を繰り返した。 TTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC及び GCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACC  次のプラむマヌを甚いたこず以倖は実斜䟋
7Aず同じように実隓を繰り返しpBR328の262
塩基察断片を調補した。反応時間はサむクル圓
たり20分であ぀た。 GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG
及び TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG  ヒトβ−グロビン察立遺䌝子からの1.9kb
の挿入郚を含む100プムトモルのpBR328の
Mst消化物を圓初の鋳型ずしお甚いた以倖
は、実斜䟋8Bず同様に実隓を行぀た。該プラ
スミドはMstにより数回切断されたが、増幅
すべき配列の内偎では切断が起こらなか぀た。
曎に、䜿甚したプラむマヌは次の通りで、240
塩基察断片を生産した。 GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG
及び TAACCTTGATACCAACCTGCCC  100プムトモルのpBR322のNru消化物を
鋳型ずしお甚い、100Όの反応液䞭で各デオ
キシNTPを200ナノモル䜿甚し、次のプラむマ
ヌを䜿甚しおpBR322から500塩基察断片を生
産した以倖は実斜䟋7Bず同様に実隓を行぀た。 TAGGCGTATCACGAGGCCCT及び CTTCCCCATCGGTGATGTCG 反応時間は37℃でサむクル圓たり20分であ぀
た。最埌の再ハむブリダむれヌシペンは57℃で15
時間行぀た。電気泳動はアガロヌスゲル䞊で
行぀た。 実斜䟋  本実斜䟋は、むンビトロ倉異が増幅されたセグ
メントに導入されるような本発明方法を䟋瀺する
ものである。  Nruで盎線化したpBR322合蚈100プムト
モル、ナノモルの75塩基察断片を生成するよ
うに蚭蚈されたそれぞれ次匏 CGCATTAAAGCTTATCGATG及び TAGGCGTATCACGAGGCCCT のプラむマヌ、それぞれ100ナノモルの各デオキ
シNTPを、PHの40mMトリス、20mM
MgCl2、5mMゞチオスレむトヌル及びmgml
のりシ血枅アルブミンの溶液100Ό䞭で混合し
た。この混合物を100℃にしお分間加熱し、氎
济䞭23℃、0.5分間冷华し、次に4.5単䜍のクレノ
ヌ断片ず0.09単䜍の無機ピロフオスフアタヌれを
加え、反応を分間行぀た。加熱、冷华、酵玠添
加及び反応のサむクルを回繰り返した。10回目
の反応サむクルは凍結により終了させ、反応混合
物のアリコヌト8Όをアガロヌスゲルに適
甚し、臭化゚チゞりムにより芚化した。  オリゎヌクレオチドプラむマヌずしお次匏の
ものを䜿甚した以倖は実斜䟋9Aず同様の実隓
を繰り返した。 CGCATTAAAGCTTATCGATG及び AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGA
GGCCCT これらのプラむマヌは101塩基察を生産するよ
うに蚭蚈され、その番目のプラむマヌ䞭の
26ヌクレオチドはpBR322には存圚しない。これ
らのヌクレオチドはT7プロモヌタヌの配列を衚
すもので、これを、pBR322からの75塩基察配列
に、20の盞補的塩基ず26塩基の5′偎䌞長郚ずを有
するプラむマヌを䜿甚しお連結した。この方法は
時間より少ない時間で実斜するこずができ、
100プムトモルのpBR322から比范的玔粋な101
塩基察断片ピコモルを生産するこずができた。 T7プロモヌタヌはRNA転写を開始させるため
に䜿甚できる。T7ポリメラヌれを101塩基察断片
に加えお単鎖RNAを生成せしめるこずができる。  オリゎヌクレオチドプラむマヌずしお䞋蚘の
ものを䜿甚しお、pBR322から1000塩基察断片
を調補した以倖は実斜䟋8Dず同様に実隓を繰
り返した。 TAGGCGTATCACGAGGCCCT及び CCAGCAAGACGTAGCCCAGC  䞊蚘9cず同様の実隓を繰り返した。䜆し、オ
リゎヌクレオチドプラむマヌずしお䞋蚘のも
の、 TAGGCGTATCACGAGGCCCT及び AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGA
GGCCCT を䜿甚しお1026察断片を調補した。番目のプラ
むマヌの26ヌクレオチドはpBR322には存圚せ
ず、䞊蚘のT7プロモヌタヌを瀺すものである。
このプロモヌタヌは、pBR322からの1000塩基察
断片に隣接しお挿入された。 これらの結果は、鋳型鎖ず完党にマツチしおい
ないがそれにもかかわらず十分にハむブリダむズ
しお酵玠的に䌞長するプラむマヌは、圓初の鋳型
に察応する鎖よりむしろプラむマヌの鎖を含む長
鎖生成物を生成せしめるずいうこずを暗瀺する。
長鎖生成物はむンビトロ倉異を生じさせる第の
プラむマヌ甚の鋳型ずしおの圹割を果たす。その
埌のサむクルでは、曎に倚くのミスペアしたプラ
むミングが芁求されないので、効率が枛少するこ
ずなくこの倉異は増幅される。この堎合、その
5′末端に盞補的でない䌞長郚分があるプラむマヌ
が、耇補されるべき鋳型に隣接しお生成物䞭に新
しい配列を挿入するために䜿甚された。 実斜䟋 10 本実斜䟋は単コピヌ遺䌝子を増幅させる際にバ
ツクグラりンドを枛少させるためにネスト状に
nestedセツトしたプラむマヌを䜿甚するこず
を䟋瀺するものである。 野性型β−グロビン察立遺䌝子に぀いおホモ接
合䜓である党ヒトDNAに察しお、20サむクルの
増幅を次のように行぀た。10ÎŒgのDNA、それぞ
れ200ピコモルの次匏のプラむマヌ、 ACACAACTGTGTTCACTAGC及び CAACTTCATCCACGTTCACC 䞊びに100ナノモルず぀のdNTPを、100Όの
30mMトリス−アセテヌト、60mM酢酞ナトリり
ム、10mMゞチオスレむトヌル、及び10mM酢酞
マグネシりム䞭で100℃にお分間加熱し、25℃
に分間䞋げお、そしお単䜍のクレノヌ断片ず
ずもに分間凊理した。加熱、冷华、クレノヌ詊
薬の添加のサむクルを19回繰り返した。10Όの
液䜓を反応混合物から取り出し、曎に10回の増幅
のためのサむクルを次の各プラむマヌを甚いお行
぀た。 CAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTG及び CCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCC これらは、䞊蚘で生産された110塩基察断片䞭
に含たれる58塩基察断片を増幅した。増幅すべき
最埌の10回のサむクルは、10Όのアリコヌト
を、䞊蚘した各デオキシNTP100ナノモルず各プ
ラむマヌ200ピコモルを含む90Όの新しいトリ
ス−アセテヌト緩衝液に垌釈するこずにより達成
するこずができた。反応条件は䞊蚘の通りずし
た。10サむクルの埌10Όのアリコヌト圓初の
DNAの100ナノグラムに察応をのNuシヌ
ブFMC瀟アガロヌスゲルに加え、臭化゚チ
ゞりムを䜿぀お芖芚化した。 第図は、玫倖線で発光させた埓来法の通り
赀いフむむルタヌを通しお写真撮圱した䞊蚘ゲル
を瀺すものである。レヌンは分子量のマヌカヌ
である。レヌンは䞊蚘反応のアリコヌトであ
る。レヌンは圓初の野性型DNAが増幅の前に
Ddeにより開裂されたこず以倖は䞊蚘蚘したも
のず同じ反応のアリコヌトである。レヌンは鎌
状赀血球貧血β−グロビン察立遺䌝子に぀いおホ
モ接合䜓であるヒトDNAを増幅の前にDdeで
凊理したこず以倖は䞊蚘ず同様な反応のアリコヌ
トである鎌状赀血球貧血察立遺䌝子は増幅され
る断片内にDde郚䜍を含たない。レヌンは
鮭の粟子DNAでヒトDNAを眮き換えた以倖は䞊
蚘ず同様の反応のアリコヌトである。レヌンは
増幅埌反応液をDdeで凊理したこず以倖は䞊蚘
ず同様な反応のアリコヌトであるDdeは58å¡©
基察の野性型生成物を27塩基察及び34塩基察の断
片に倉換する。レヌンは増幅埌Ddeで凊理
したレヌンの材料のアリコヌトである58塩基
察の鎌状赀血球貧血生成物はDdeを含たない。 アガラヌセゲルの臭化゚テゞりム染色のみを䜿
甚しおヒトDNAのマむクログラムからの単コ
ピヌ遺䌝子を代衚する58塩基察断片を怜出するた
めには、玄500000倍に増幅するこずが必芁であ
る。これは、ここで぀のオリゎヌクレオチドの
ネスト状セツトを䜿甚しお達成するこずができ
る。第のセツトは110塩基察断片を増幅し、そ
しお内郚のネスト状セツトは、第図に瀺すよ
うに䟿利に怜出できるレベルになるたでこの生成
物のサブ−断片を増幅する。先行する増幅工皋で
増幅された配列䞭に含たれ、又他のプラむマヌの
䌞長生成物䞭にも含たれるより小さな配列をプラ
むマヌを䜿぀お増幅する本法は、䟋えばコナヌら
のPNAS80å·»278頁1983幎及びレアリヌらの
PNAS80å·»4045頁1983幎に蚘茉されおいるよ
うに攟射性同䜍䜓又は非攟射性同䜍䜓プロヌブの
ハむブリダむれヌシペンの方法論に頌るこずな
く、β−グロビンの座における野性型を鎌状赀血
球貧血察立遺䌝子から区別するこずを可胜にす
る。 実斜䟋 11 本法は、患者のDNA詊料䞭の䟋えばクラミゞ
アのような䌝染性疟患ず関連する特定の配列を、
所望の増幅された配列を含むビオチン化されたハ
むブリダむれヌシペンプロヌブを䜿甚しか぀前述
の米囜特蚱第4358535号に蚘茉された方法を䜿甚
しお怜出する際に有甚であるこずが期埅される。
ビオチン化されたハむブリダむれヌシペンプロヌ
ブは、䞀郚が二重鎖ずな぀たDNAに、次匏のス
ペヌサヌアヌムを介しおビオチンに結合した4′−
メチレン眮換−5′−−トリメチルプ゜ラレ
ンを挿入しか぀光を照射するこずにより調補する
こずができる。 −CH22−〔CH2x〕y−CH2CH2NH- 匏䞭は、NH又は−CHO、はか
らたでの数、そしおはからたでの数であ
る。プロヌブ䞊のビオチニル基の怜出には、゚ン
ゟバむオケム瀟により垂販されおいるストレプタ
ビゞン−酞性フオスフアタヌれ耇合䜓を甚いお、
パンフレツトに補造者が瀺しおいる怜出方法によ
り達成するこずができる。ハむブリダむれヌシペ
ンプロヌブは、怜出甚耇合䜓ずの結合、及びそれ
に続く酞性ホスフアタヌれにより觊媒される反応
この反応が沈柱性色玠を生成するに基く沈柱
した染色スポツトずしお芋るこずができる。 実斜䟋 12 本実斜䟋では、実斜䟋の方法を基本的には䜿
甚し、ヒトβ−グロビン遺䌝子䞊の119塩基察断
片を次のプラむマヌを䜿甚しお増幅させた。 5′−
CTTCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC
−3′GH18 5′−CACaAgCTTCATCCACGTTCACC
−3′GH19 ここで小文字は野性型配列ずミスマツチし、制
限酵玠郚䜍を生成する。党スキヌムは衚に瀺し
おある。衚はヒトβ−グロビン遺䌝子の119å¡©
基察断片をクロヌン化しか぀配列決定するために
䜿甚され、又内郚制限郚䜍を含むよう蚭蚈されお
いるプラむマヌGH18及びGH19を図解したもの
である。出発コドンATGにはアンダヌラむンが
匕かれおいる。GH18は、負鎖ず盞補的な26塩基
察のオリゎヌクレオチドでか぀内郚にPst郚䜍
を有しおいる。GH19は正鎖に盞補的である23å¡©
基察のオリゎヌクレオチドであり、内郚にHind
認識郚䜍を含んでいる。矢印は、DNAポリメ
ラヌれによる䌞長方向を瀺す。四角で囲぀た配
列は各プラむマヌの制限酵玠認識配列を瀺す。こ
れらのプラむマヌは、バクテリオフアヌゞM113
のPstずHind制限郚䜍に察しお盞同である遺
䌝子領域を第にスクリヌニングしお遞択され
た。次に、プラむマヌは先行する実斜䟋で蚘茉し
た通りに調補された。 【衚】 増幅及びクロヌニング 実斜䟋で述べたように现胞系Molt4から単離
したマむクログラムのヒトゲノムDNAの増幅
を20サむクル行぀た埌、反応生成物の14分の
を、ラベルしたβ−グロビンに特異的であり、そ
の配列が、5′−
CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTAC
−3′であるオリゎヌクレオチ
ドプロヌブRS06に䞊述のオリゎマヌ制限法を甚
いおハむブリダむズさせた。溶液ハむブリダむれ
ヌシペンの埌、反応混合物を䞊述した制限消化条
件䞋でDdeにより凊理しお塩基察オリゎヌク
レオチドを生成せしめた。この塩基察の生成物
の量は、増幅され生成された生成物の量に比䟋す
る。この消化生成物は30のポリアクリルアミド
ゲル䞊で分離し、オヌトラゞオグラフむヌで芖芚
化した。 オヌトラゞオグラムを分析した結果、該増幅は
野性型β−グロビン遺䌝子の正鎖及び負鎖のそれ
ぞれず盞補的であるプラむマヌPC035′−
ACACAACTGTGTTCACTAGC−3′及び
PC045′−CCACTTGCACCTACTTCAAC−3′
による増幅ず増幅効率においお匹敵するものであ
るこずが分か぀た。 増幅された生成物ぱタノヌルで沈柱しお脱塩
しそしお濃瞮し、そしおサンプルを10mMトリ
ス、10mM MgCl2、1mMDTT、100mM NaCl
から成る制限緩衝液PHに再溶解し、Pst
及びHindで同時に消化した。その消化埌、詊
料をセントリコン10濃瞮装眮で脱塩し、ベヌリン
ガヌ・マンハむム瀟から入手できるPstHind
で消化されたベクタヌM13mp10wの0.3マむク
ログラムず、12℃で䞀晩連結した。 党郚の結合混合物がメリヌランド州ベテスダの
BRLから入手できるE.コヌリヌ株JM103ぞ圢質
転換された。圢質転換株を調補するための方法
は、A.ワルトンによりMessingJ.Third
Cleveland Symposium on Macromolecules
Recombinant DNA143−153頁に蚘茉されお
いる。 圢質転換混合物を、ナむロンフむルタヌを甚い
るプラヌクハむブリダむれヌシペンによるスクリ
ヌニングのため、−ゲル培地䞊に移した。フむ
ルタヌを、β−グロビンに特異的な、配列が5′−
CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCC
−3′であるオリゎヌクレオチ
ドプロヌブRS24により怜知しお、β−グロビン
挿入郚の数を決定した。フむルタヌはプラむマヌ
PC04で再床暙識され、党挿入数を決定した。 プレヌテむング及びスクリヌニング 衚は、プレヌテむングずプラヌクハむブリダ
むれヌシペンのデヌタを纏めたものである。フむ
ルタヌをプラむマヌPC04で怜知し、増幅ずクロ
ヌニングに起因する挿入郚のパヌセントを決定し
た。1206個のクリアヌなプラヌククリアヌなプ
ラヌクの党数の90がプラむマヌにハむブリダ
むズした。15のプラヌクがβ−グロビンに特異的
なプラヌクRS04にハむブリダむズした。増幅さ
れたプラむマヌに陜性なブラヌクのうちβ−グロ
ビンに陜性なプラヌクは玄である。 【衚】 増幅された配列を含有するプラヌクに察するβ
−グロビン挿入郚を含有するプラヌクの15
1206×1001.24。 党プラヌクに察するβ−グロビン挿入郚を含有
するプラヌクの151496×100玄。 党プラヌクに察する増幅された配列を含有する
プラヌクの12061496×10080。  プラむマヌPC04ずハむブリダむズしないク
リアヌなプラヌク。  プラむマヌPC04ずハむブリダむズするク
クリアヌなプラヌク。 制限酵玠及びサザン分析法 ぀のβ−グロビン陜性プラヌクず぀のβ−
グロビン陰性プラヌクしかしPC04プラむマヌ
陜性のフアヌゞDNAから少し調補したDNAを
制限酵玠分析法で分析した。増幅したβ−グロビ
ン断片を含むM13クロヌンからのDNAのMst
消化は特城的な283塩基察断片を生ずる。Mst
消化の埌、぀のβ−グロビン陜性クロヌンは党
お予想のずおり283塩基察断片を生成し、䞀方プ
ラむマヌずのみ陜性であ぀た぀のクロヌンは倧
きい断片を生成した。 この分析からのゲルをMSIナむロンフむルタヌ
に移し、リグビヌらによりJ.Mol.Biol113å·»237−
51頁1977幎に蚘茉された暙準的なニツクトラ
ンスレヌシペン法により調補した攟射性ラベルを
行぀たニツクトランスレヌシペンしたβ−グロビ
ンプロヌブずハむブリダむズさせた。β−グロビ
ンプロヌブずハむブリダむズできるバンドは、
぀のβ−グロビン陜性クロヌンのみであ぀た。
぀の他のクロヌンはβ−グロビンプロヌブにハむ
ブリダむズしない挿入郚を有しおいた。 配列の分析 β−グロビン挿入郚を含むこずが制限酵玠分析
により瀺された10個のβ−グロビン陜性クロヌン
を、M13ゞデオキシ配列決定法を甚いお配列決定
した。10の内぀はβ−グロビンの野性型配列ず
同䞀であ぀た。他のクロヌンは、β−グロビンプ
ラむマヌでは非垞に僅かしか増幅しないこずが瀺
されおいるΎ−グロビン遺䌝子ず同じであ぀た。 結論ずしお、β−グロビン配列の増幅におい
お、倉圢されたリンカヌプラむマヌは倉圢されお
いないプラむマヌずほが等しい効率を有しおい
た。プラむマヌは、増幅されたDNAのクロヌニ
ングベクタヌぞの挿入を容易にするこずができ
た。ゲノムの他のセグメントの増幅のため、
のクロヌンのみがヘモグロビン配列を有しおい
た。 10の内぀が公にされおいるβ−グロビン配列
ず同じであるこずが分かり、該技術はゲノム
DNAを高い忠実床で増幅するこずを瀺した。
぀のクロヌンは公衚されおいるΎ−グロビンず同
䞀であ぀たこずが分かり、このこずはプラむマヌ
がΎ−グロビンに察する有意な配列盞同性を持぀
おいるにもかかわらず、β−グロビン遺䌝子に特
異的であるこずを蚌明した。 クロヌニングをβ−グロビンの267塩基察断片
を甚いお行う堎合、このクロヌニングはゞメチル
スルフオキシドが増幅工皋に存圚37℃で10容量
するずきのみ効果的であるこずが分か぀た。 制限郚䜍−修食プラむマヌを䜿甚しお、ヒト
−ras腫瘍遺䌝子を増幅し、クロヌン化し、䞀郚
を配列決定するこずができ、曎にHLA−DQ−α
及びDQ−β遺䌝子の240塩基察断片をクロヌン
化するこずもできた。これら党おの増幅は10容量
のゞメチルスルフオキシドの存圚䞋37℃で行぀
た。HLA DQ−α及びDQ−β遺䌝子を増幅する
ためのプラむマヌは、臭化゚チゞりムで染色した
アガロヌスゲル䞊に具䜓的なバンドを䞎えるずい
うよりも汚れを生ずるにすぎないβ−グロビンや
D.R−βプラむマヌに比べお、それらの意図する
暙的物に察しお遥かに特異的であ぀た。曎に
HLA DQ−αプラむマヌは、所望のHLA暙的断
片を含む増幅される挿入郚を有する20たでのク
ロヌンを生成し、ずころがβ−グロビンクロヌン
のが暙的配列を含んでいた。HLA DQ−α
及びDQ−β遺䌝子クロヌニングはDMSOが存圚
し高枩のずきにのみ効果的であ぀た。 実斜䟋 13 本実斜䟋は、それぞれ74塩基察の぀のオリゎ
ヌクレオチドから出発しお494塩基察のTNF遺䌝
子を調補するために本法を䜿甚するこずを䟋瀺す
るものである。 プラむマヌ 䜿甚したプラむマヌは実斜䟋に蚘茉した方法
で調補し、それぞれ74塩基察を有し、䞋蚘に瀺す
ものである。 【衚】 党䜓的手順 䞋蚘に瀺す10サむクルのプロトコヌルを、プ
ラむマヌずしお䞋蚘ステツプ(a)に抂略を瀺すよ
うに盞互䜜甚をするプラむマヌTN10及び
TN11を甚いお行぀た。 䞊蚘パヌトからの反応混合物党2Όをプ
ラむマヌLL09及びLL12に加えた。䞋蚘のプロ
トコヌルを15サむクル行い、これにより䞋蚘ス
テツプ(b)で抂略を瀺すように、プラむマヌがパ
ヌトの生成物ず盞互䜜甚する。 パヌトからの反応混合物党2Όをプラむ
マヌTN08及びTN13に加えた。䞋蚘のプロト
コヌルを15サむクル行い、これにより、䞋蚘ス
テツプ(c)で抂略を瀺すように、プラむマヌがパ
ヌトの生成物ず盞互䜜甚する。 䞊蚘パヌトからの反応混合物党2Όをプ
ラむマヌLL07及びLL14に加えた。䞋蚘のプロ
トコヌルを15サむクル行い、これにより、䞋蚘
ステツプ(d)で抂略を瀺すように、プラむマヌが
パヌトの生成物ず盞互䜜甚をする。 プロトコヌル 各反応は100Όの、 各2mMのデオキシATP、デオキシCTP、デオ
キシGTP及びTTP 3ÎŒMの各ステツプで䜿甚する各プラむマヌ ×ポリメラヌれ緩衝液30mMのトリスアセ
テヌト、60mMの酢酞ナトリりム、10mMの酢酞
マグネシりム、2.5mMのゞチオスレむトヌル を含んでいる。 各ステツプは、  沞隰氎䞭で分、  宀枩冷华分、  DNAポリメラヌれのクレノヌ断片1Ό
単䜍添加、  重合反応の分間の進行、 から成る。 次のサむクルは再床ステツプから始める。 【衚】 ↓

5′ TN08

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  栞酞又はその混合物を含むず予想される詊料
    䞭に少なくずも皮類の特定の栞酞配列が存圚す
    るか吊かを怜出し、あるいは栞詊料䞭の皮類の
    異なる栞酞配列を区別する方法であ぀お、たず、
    前蚘皮類の栞酞配列又は耇数皮類の栞酞配列
    を、 (a) オリゎヌクレオチドプラむマヌにより、増幅
    されるべき栞酞配列の鎖に぀いお栞酞鎖に盞補
    的なプラむマヌの䌞長生成物が合成されるよう
    に前蚘詊料を凊理し、ここで、前蚘プラむマヌ
    は、特定の栞酞配列の鎖に実質的に盞補的であ
    り、䞔぀増幅されるべき栞酞配列の䞡端を芏定
    し、各プラむマヌから合成された䌞長生成物が
    その盞補䜓から分離された堎合に曎なる合成の
    鋳型ずしお機胜するように遞択され (b) 前蚘プラむマヌ䌞長生成物をそれらが合成さ
    れた鋳型から分離しお単鎖分子を生成せしめ
    そしお (c) 段階(b)においお生成した各単鎖分子を鋳型ず
    しお甚いおプラむマヌ䌞長生成物が合成される
    ように段階(b)から生じた単鎖分子を段階(a)のプ
    ラむマヌにより凊理する こずを含む段階により増幅しそしお次に (d) 前蚘増幅が生じたか吊かを決定する こずを特城ずする方法。  前蚘増幅が生じたか吊かの決定(d)を、 (e) 段階(c)の生成物に、怜出されるべき栞酞配列
    に぀いお該栞酞配列又はその倉異䜓ずハむブリ
    ダむズするこずができるオリゎヌクレオチドプ
    ロヌブを加えそしお、 (f) 該ハむブリダむれヌシペンが生じたか吊かを
    決定する こずにより行う、特蚱請求の範囲第項に蚘茉の
    方法。  前蚘オリゎヌクレオチドプロヌブが暙識され
    おいる、特蚱請求の範囲第項に蚘茉の方法。  段階(b)及び(c)を少なくずも回繰り返し、そ
    しおステツプ(a)及び(c)を、プラむマヌず䞀緒に又
    は別に加えられる重合甚誘導詊薬により凊理する
    こずによ぀お行う、特蚱請求の範囲第項〜第
    項のいずれか項に蚘茉の方法。  前蚘重合甚誘導詊薬がE.コリE.coli
    DNAポリメラヌれ、E.コリDNAポリメラヌれ
    のKlenow断片、T4DNAポリメラヌれ、熱安定
    性酵玠又は逆転写酵玠である、特蚱請求の範囲第
    項〜第項のいずれか項に蚘茉の方法。  段階(a)及び(c)を皮類の異るヌクレオシドト
    リホスプヌトによる凊理により行う、特蚱請求
    の範囲第項〜第項のいずれか項に蚘茉の方
    法。  前蚘栞酞が二本鎖であり、そしおその鎖が段
    階(a)の前又はその間に倉性により分離される、特
    蚱請求の範囲第項〜第項のいずれか項に蚘
    茉の方法。  前蚘栞酞がDNAであり、そしおプラむマヌ
    がデオキシリボヌクレオチドである特蚱請求の範
    囲第項〜第項のいずれか項に蚘茉の方法。  䜿甚される各プラむマヌが、その5′末端に他
    のプラむマヌの制限郚䜍ず同じか異なる制限郚䜍
    を含み、そしお段階(c)の埌であ぀お段階(d)の前に
    該各制限郚䜍に特異的な制限酵玠により段階(c)の
    生成物を開裂させ、該開裂した生成物を開裂しお
    いない生成物ず分離し、そしお段階(d)で䜿甚す
    る、特蚱請求の範囲第項〜第項のいずれか
    項に蚘茉の方法。  前蚘特定の栞酞配列が遺䌝子性疟患、癌性
    疟患又は䌝染性疟患ず関連しおいる、特蚱請求の
    範囲第項〜第項のいずれか項に蚘茉の方
    法。  前蚘段階(b)及び(c)を少なくずも10回反埩す
    る、特蚱請求の範囲第項〜第項のいずれか
    項に蚘茉の方法。  前蚘熱安定性酵玠が熱安定性DNAポリメ
    ラヌれである、特蚱請求の範囲第項〜第項
    のいずれか項に蚘茉の方法。  前蚘段階(a)及び(c)におけるプラむマヌがそ
    れぞれ少なくずも1000のプラむマヌ盞補的
    鎖の比率で存圚する、特蚱請求の範囲第項〜第
    項のいずれか項に蚘茉の方法。  前蚘段階(a)及び(c)におけるプラむマヌがそ
    れぞれ少なくずも106のプラむマヌ盞補的
    鎖の比率で存圚する、特蚱請求の範囲第項に
    蚘茉の方法。  前蚘栞酞が、単鎖RNA又は単鎖DNAから
    合成される特蚱請求の範囲第項〜第項のい
    ずれか項に蚘茉の方法。  前蚘RNAがメツセンゞダヌRNAである特
    蚱請求の範囲第項に蚘茉の方法。  皮類又は皮類以䞊の栞酞を含むず予想
    される詊料䞭の少なくずも぀の特定の栞酞配列
    をプロヌブにより怜出するための、 怜出されるべき栞酞配列に぀いおのオリゎヌク
    レオチドプラむマヌであ぀お、特定の栞酞配列の
    鎖に実質的に盞補的であり、䞔぀怜出されるべき
    特定の栞酞配列の䞡端を芏定し、぀のプラむマ
    ヌから合成された䌞長生成物がその盞補䜓から分
    離されたずきに曎なる合成甚の鋳型ずしお機胜す
    るこずができるプラむマヌ を有するキツト。  重合甚誘導詊薬をさらに含んで成る、特蚱
    請求の範囲第項に茉のキツト。  前蚘誘導剀がDNAポリメラヌれである特
    蚱請求の範囲第項に蚘茉のキツト。  皮類の異るヌクレオシドトリホスプヌ
    トをさらに含んで成る特蚱請求の範囲第項又
    は第項に蚘茉のキツト。  前蚘プロヌブず前蚘栞酞配列ずのハむブリ
    ダむれヌシペンを怜出するための手段をさらに含
    んで成る、特蚱請求の範囲第項〜第項の
    いずれか項に蚘茉のキツト。
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