JPH0467957B2 - - Google Patents

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JPH0467957B2
JPH0467957B2 JP61068857A JP6885786A JPH0467957B2 JP H0467957 B2 JPH0467957 B2 JP H0467957B2 JP 61068857 A JP61068857 A JP 61068857A JP 6885786 A JP6885786 A JP 6885786A JP H0467957 B2 JPH0467957 B2 JP H0467957B2
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JP
Japan
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nucleic acid
primers
primer
dna
sequence
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JP61068857A
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JPS62281A (ja
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Bankusu Marisu Karii
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
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Description

【発明の詳现な説明】 本発明は、その存圚する栞酞配列を増幅するた
めの方法に関する。より詳现には本発明は、䞎え
られたDNA又はRNA配列から初期に存圚する量
に比范しおより倧量の任意の特定の栞酞配列を生
成せしめる方法に関する。該DNA又はRNAは単
鎖又は二重鎖であ぀おもよく、比范的玔粋な皮で
あ぀おも栞酞の混合物の䞀成分であ぀おもよい。
本発明の方法では、所望の栞酞配列の増幅を達成
するために反応を繰り返し行うようにする。 〔埓来の技術〕 特に蚺断䞊の甚途のためには、暙的栞酞配列は
問題のDNA又はRNAのほんの僅かな郚分である
こずがあり、非同䜍䜓暙識又は末端暙識オリゎヌ
クレオチドプロヌブを䜿甚するのではその存圚を
怜出するこずは困難である。プロヌブ怜出システ
ムの感床を向䞊させるために倚くの劎力が費やさ
れおいるが、珟圚利甚できる方法を甚いお容易に
怜出できるに充分な量を埗るために、暙的配列を
増幅するような研究は殆ど行われおいない。 栞酞を初めから、あるいは既存の配列から合成
する方法がいく぀かの文献に蚘茉されおいる。こ
れらの方法は、完党に特定された配列の䞎えられ
た栞酞を倧量に生産するこずを可胜にするもので
ある。 栞酞を初めから合成する぀の既知方法は、ヌ
クレオシド誘導䜓からの栞酞の有機合成を含むも
のである。この合成は溶液䞭又は固䜓担䜓䞊で行
われる。有機合成の぀のタむプはリン酞トリ゚
ステル法であり、これは遺䌝子断片又は短い遺䌝
子を調補するために利甚される。リン酞トリ゚ス
テル法では、オリゎヌクレオチドが調補され、次
にこれは結合されおより長鎖の栞酞を圢成する。
この方法は、S.A.ナヌランクらにより、Meth.
Enzymol.68å·»90頁1979幎及び米囜特蚱第
435627号に開瀺されおいる、該特蚱は、゜マトス
タチン遺䌝子の合成ずクロヌニングを開瀺しおい
る。 有機合成の第のタむプはリン酞ゞ゚ステル法
であり、これはトランスフアヌRNA遺䌝子の調
補に利甚されおいる。この方法はE.L.ブラりンら
によりMeth.Enzymol.68å·»109頁1979幎に開
瀺されおいる。リン酞トリ゚ステル法ず同じよう
に、リン酞ゞ゚ステル法もオリゎヌクレオチドの
合成を含み、これらが実質的に結合されお所望の
栞酞が圢成される。 䞊蚘した初めからの合成法は栞酞の長鎖を合成
するために利甚されるが、栞酞を倧量合成するた
めの実甚的方法ではない。䞡法ずも劎力ず時間を
消費し高䟡な装眮ず詊薬を必芁ずしか぀党䜓収率
が䜎い。党䜓収率が䜎いのは、オリゎヌクレオチ
ドの合成ずそれらを結合する反応が非効率的であ
るこずに起因する。長鎖の栞酞を合成する際ある
いは短鎖の栞酞を倧量に合成する堎合でさえも、
倚くのオリゎヌクレオチドを合成し倚くの結合反
応を行うこずが芁求される。埓぀おこれらの方法
は任意で所望の栞酞を倧量に合成するには実甚的
ではない。 初めに存圚する少量の栞酞から倧量の栞酞を生
産する方法も存圚する。これらの方法は奜適な宿
䞻系内での栞酞のクロヌニングを含み、ここでは
所望の栞酞は宿䞻の圢質倉換に䜿甚される奜適な
ベクタヌ䞭に挿入される。宿䞻が培逊されるずベ
クタヌが耇補され、所望の栞酞のコピヌが生産さ
れる。栞酞断片のサブクロヌニングに぀いおは、
T.マニアチスらにより、コヌルド・スプリン
グ・ラボラトリヌのMolecular Cloning390−401
頁1982幎に簡単に蚘述されおいる。この技術
に぀いおは米囜特蚱第4416988号及び4403036号に
も蚘述されおいる。 米囜特蚱第4293652号に蚘茉されおいる栞酞の
第の合成法は、䞊述の有機合成ず分子クロヌニ
ング法を合わせたものである。該法では、所望の
栞酞配列を䜜り䞊げるのに必芁な奜適な数のオリ
ゎヌクレオチドを初めに合成し、次にこれらを次
の挿入の前に増殖により増幅されるベクタヌに挿
入する。 〔発明が解決しようずする問題点〕 本発明は、この分子クロヌニング法に幟らかの
類䌌性を有しおいる。しかし本発明はいかなる生
物の繁殖をも含たず、埓぀お繁殖に䌎぀お起こり
埗る危険や䞍郜合を回避するこずができる。本発
明は所望の栞酞ず関連しない栞酞の合成を必芁ず
せず、埓぀お本発明によれば耇雑な生物孊的混合
物からコストをかけお生成物を粟補するこずも回
避できる。 本発明はプラむマヌず重合詊薬を甚いお皮の
栞酞又は耇数の栞酞の混合物䞭に存圚する又は
以䞊の特定の栞酞配列を増幅する方法に関す
る。プラむマヌは増幅されるべき配列の末端を定
め、そしお぀のプラむマヌの䌞長生成物は、他
のプラむマヌずハむブリダむズしたずきに所望の
特定の栞酞配列の生成のための鋳型ずなり、又そ
の逆も起こる。そしおこのプロセスは所定量の配
列が生成するたで必芁なだけ繰り返される。暙的
配列から倧量の栞酞を比范的短時間で生産するた
めには、本方法は䞊蚘の埓来法より効率的である
ず期埅される。本方法は栞酞混合物に僅かしか含
たれおいない栞酞皮を増幅し、該皮を効率的に怜
出するために特に有甚である。 〔問題点を解決するための手段〕 さらに詳しくは、この発明は、栞酞又は栞酞混
合物䞭に存圚する少なくずも皮の特定の栞酞配
列を増幅する方法を提䟛し、この堎合、各栞酞は
同じ長さ又は異る長さの぀の別個の盞補的な鎖
から成り、そしお前蚘の方法は、 (a) 前蚘鎖を、以䞊のオリゎヌクレオチドプラ
むマヌにより凊理しお、増幅されるべき栞酞配
列に぀いお該栞酞配列の鎖に盞補的なプラむマ
ヌの䌞長生成物を合成し、ここで、前蚘プラむ
マヌは、特定の栞酞配列の鎖ず実質的に盞補的
であり、䞔぀増幅されるべき栞酞配列の䞡端を
芏定し、各プラむマヌから合成された䌞長生成
物がその盞補䜓から分離された堎合に曎なる合
成のための鋳型ずしお機胜するこずができるよ
うに遞択され (b) 前蚘プラむマヌ䌞長生成物をそれらが合成さ
れた鋳型から分離しお単鎖分子を生成せしめ
そしお (c) 段階(b)から生じた単鎖分子を段階(a)のプラむ
マヌにより凊理しお、段階(b)においお生成した
各単鎖分子を鋳型ずしお甚いおプラむマヌ䌞長
生成物を合成する こずを含んで成る。 これらの段階は逐次的に又は同時に行うこずが
できる。さらに、段階(b)及び(c)は配列の所望のレ
ベルの増幅が埗られるたで反埩するこずができ
る。 この発明は、完党に特定された配列の既存の栞
酞を倚量に補造するためのみならず、存圚するこ
ずは知られおいるがしかし完党には特定されおい
ない栞酞配列を補造するためにも有甚である。い
ずれの堎合にも、増幅されるべき配列の最初のコ
ピヌは入手可胜でなければならない。䜆しそれは
玔粋である必芁はなく、又は別個のdiscrete
分子である必芁はない。 〔具䜓的な説明〕 プラむマヌ、プロヌブ、怜出すべきオリゎマヌ
断片、オリゎマヌ察照䜓、及び暙識されおいない
ブロツキングオリゎマヌに関しお䜿甚される「オ
リゎヌクレオチド」ずいう甚語は、又はそれ以
䞊の奜たしくはより倚くのデオキシリボヌクレ
オチド又はリボヌクレオチドから成る分子ずしお
定矩される。その正確な倧きさは倚くの因子に䟝
存し、その困子はオリゎヌクレオチドの究極的な
機胜ず甚途に䟝存する。 ここで䜿甚される「プラむマヌ」ずいう甚語
は、粟補された制限消化物ずしお自然に存圚しあ
るいは合成的に調補されたオリゎヌクレオチドを
意味し、このプラむマヌは、䟋えば奜適な枩床及
びPHでヌクレオチドずDNAポリメラヌれのよう
な重合詊薬が存圚するような栞酞鎖に盞補的なプ
ラむマヌの䌞長生成物の合成が誘発される条件䞋
に眮かれたずきに合成開始点ずしお機胜するこず
ができる。該プラむマヌは増幅効率を最倧にする
ため単鎖であるこずが奜たしいが、その代わりに
二重鎖であ぀おもよい。二重鎖であるず、プラむ
マヌは䌞長生成物を調補するために䜿甚される前
にたずその鎖を分離するために凊理される。プラ
むマヌはオリゎデオキシリボヌクレオチドである
こずが奜たしい。プラむマヌは、重合詊薬の存圚
䞋で䌞長生成物の合成を開始するために十分な長
さでなければならない。プラむマヌの正確な長さ
は、枩床やプラむマヌ源を含む倚くの因子に䟝存
する。䟋えば、目的ずする配列の耇雑さに䟝存し
おオリゎヌクレオチドプラむマヌは兞型的には15
から又はそれより倚くのヌクレオチドを含む
が、より少ないヌクレオチドを含むものであ぀お
もよい。短いプラむマヌ分子は、鋳型ずずもに十
分安定なハむブリド耇合䜓を圢成するために、よ
り䜎い枩床を芁求する。 プラむマヌは増幅されるべき各特定の配列の異
なる鎖ず「実質的」に盞補的であるように遞択さ
れる。このこずはプラむマヌはそれぞれの鎖ずハ
むブリダむズするに十分に盞補的でなければなら
ないこずを意味する。埓぀おプラむマヌの配列は
鋳型の配列を正確に反映する必芁はない。䟋えば
盞補的でないヌクレオチド断片を、プラむマヌの
配列の残郚が鎖に盞補的であるようにプラむマヌ
の′末端に結合させおもよい。代わりに、プラ
むマヌの配列が増幅されるべき鎖の配列ず十分な
盞補性を有しおいおそれらずハむブリダむズし、
それによ぀お他方のプラむマヌの䌞長生成物合成
鋳型を圢成するならば、盞補的でない塩基又はよ
り長い配列がプラむマヌ内に散圚しおいおもよ
い。 本発明で䜿甚れる「制限゚ンドヌクレアヌれ」
及び「制限酵玠」ずいう甚語は、二重鎖DNAを
特定の栞酞配列又はその近傍で切断するような现
菌性酵玠を意味する。 本発明で䜿甚される「DNAの倚圢珟象」ずい
う甚語は、DNA䞭のの特定郚䜍に又はそれよ
り倚くの異な぀たヌクレオチド配列が存圚できる
状態を意味する。 「制限断片長さの倚圢珟象RALP」ずいう
甚語は、特定の制限゚ンドヌクレアヌれによる消
化により圢成される制限断片の長さに個䜓間の盞
違があるこずを意味する。 本発明は、栞酞䞭に存圚するず思われる又は
それ以䞊の所望の特定の栞酞配列を増幅する方法
に関する。本法によれば倧量の特定の配列を調補
できるので、本発明はDNA又はメツセンゞダヌ
RNAのクロヌニング効率を改良し、か぀暙的配
列を増幅しおその怜出を容易にするために䜿甚す
るこずができる。この発明はたた、䞍完党な化孊
合成から生ずる栞酞の混合物から所望の配列を倚
量に埗るためにも有甚である。 䞀般に、本発明の方法は、甚いられる反応ステ
ツプの数に関連しお指数的な収量で少なくずも
぀の特定の栞酞配列を生産する連鎖反応を含み、
該配列は(a)必芁ずされる末端が、それずハむブリ
ダむズするオリゎヌクレオチドを合成できるに十
分な皋床に詳现に知られおおり、(b)連鎖反応を開
始するために少量の配列が入手可胜であるこずが
条件ずなる。連鎖反応で埗られる生成物は、䜿甚
した特定のプラむマヌの末端に察応する末端を有
するような個別的な栞酞のデナプレツクスであ
る。 粟補された状態でも粟補されおいない状態でも
よい任意の栞酞源を、所望の特定の栞酞配列を含
むず思われるのであれば、出発栞酞ずしお䜿甚で
きる。埓぀お本法では、䟋えば単鎖であ぀おも二
重鎖であ぀おもよいDNA又はRNA䟋えばメツセ
ンゞダヌRNAを䜿甚するこずができる。曎にそ
れぞれ぀の鎖を含むDNA−RNAのハむブリド
を䜿甚しおもよい。これらの栞酞の混合物を䜿甚
しおもよく、又先行する増幅反応においお同じか
又は異な぀たプラむマヌを甚いお生産された栞酞
を䜿甚しおもよい。増幅すべき特定の栞酞配列は
倧きな分子の䞀郚であ぀おもよく、特定の配列が
栞酞党䜓を構成するようにはじめから個別的な分
子ずしお存圚しおいおもよい。増幅すべき配列は
初めから玔粋な状態で存圚する必芁はなく、該配
列は、耇雑な混合物の小郚分、䟋えば党ヒト
DNA䞭のβ−グロビン遺䌝子、又は特定の生物
的詊料の極く僅かの郚分のみを構成する特定の埮
生物に起因する栞酞配列の郚分であ぀おもよい。
出発物質ずしおの栞酞は、同じか又は異な぀た
以䞊の所望の特定の栞酞配列を含んでいおもよ
い。埓぀お本発明の方法は、぀の特定の栞酞配
列を倧量に生産するだけでなく、同じか又は異な
぀た栞酞分子䞊に䜍眮する以䞊の異な぀た特定
の栞酞配列の同時増幅にも有甚である。 栞酞は、䟋えばpBR322のようなプラスミド、
クロヌン化されたDNA又はRNA、又は现菌、酵
母、ビヌルス及び怍物や動物などの高玚生物等の
自然にあるDNA又はRNA等の任意源から埗るこ
ずができる。DNA又はRNAは、䟋えばマニアチ
スらによりMolecular Cloningの280から281頁
1982幎に蚘茉されおいるような皮々の技術に
より、血や絚毛又は矊膜现膜等のの組識物質から
抜出するこずができる。 本発明方法により、任意の特定の栞酞配列を生
産するこずができる。配列の䞡末端の十分な数の
塩基が十分詳现に分か぀おおり、これにより所望
の配列の異るスラむドに察し、か぀該配列に沿぀
た次のような盞察䜍眮にハむブリダむズする぀
のオリゎヌクレオチドプラむマヌを調補するこず
ができればよく、すなわち、぀のプラむマヌか
ら合成䌞長した生成物が、鋳型盞補䜓から分
離されたずきに、限定された長さの栞酞に他のプ
ラむマヌを䌞長させるための鋳型ずしおの圹割を
果せばよい。配列の䞡末端の塩基に関する知識が
増加するほど目的ずする栞酞配列のためのプラむ
マヌの特異性も倧きくなり、埓぀お本法の有効性
も倧きくなる。以埌䜿甚するプラむマヌずいう甚
語は、特に増幅すべき断片の末端配列に関する情
報にいくらかの曖味さがある堎合には、より倧
きい数のプラむマヌを意味するものず理解される
べきである。䟋えば、栞酞配列が蛋癜質配列の情
報から掚枬できる堎合、遺䌝子コヌドの瞮重に起
因する党おの可胜なコドン倉化を瀺す配列を含む
プラむマヌを集めお各鎖甚ずしお䜿甚する。この
ような集合のうちの぀のプラむマヌは、増幅す
べき所望配列の末端ず䞀臎する。 オリゎヌクレオチドプラむマヌは任意の奜適な
方法、䟋えば䞊蚘したリン酞トリ゚ステル法及び
リン酞ゞ゚ステル法又はそれらのオヌトメヌシペ
ン化された方法を䜿甚しお調補するこずができ
る。このようなオヌトメヌシペン化された方法の
うち぀によれば、ビナヌケヌゞらにより
Tetrahedron Letters22å·»1859−1862頁に蚘茉さ
れおいる通り、ゞ゚チルフオスフオロアミダむト
を出発物質ずしお䜿甚しお合成するこずができ
る。修食された固䜓担䜓䞊でのオリゎヌクレオチ
ド合成の぀の方法が米囜特蚱第4458066号に蚘
茉されおいる。生物源䟋えば制限゚ンドヌクレ
アヌれ消化物から分離したプラむマヌを䜿甚す
るこずも可胜である。 特定の栞酞配列は、該配列を鋳型ずしお含む栞
酞を䜿甚しお生産される。栞酞が぀の鎖を含ん
でいるずきは、別のステツプずしおでもプラむマ
ヌの䌞長生成物の合成ず同時でもよいが、該栞酞
は鋳型ずしお䜿甚される前に鎖を分離する必芁が
ある。この鎖分離は、物理的、化孊的及び酵玠的
方法を含む任意の奜適な倉性法により行うこずが
できる。栞酞の鎖を分離する぀の物理的方法
は、完党に99以䞊倉性されるたで栞酞を加
熱するこずを含む。兞型的な加熱倉性は80から
150℃でから10分間加熱するこずを含む。鎖の
分離は、ヘリカヌれ、又はヘリカヌれ掻性を有し
リボATPの存圚䞋でDNAを倉性させるものずし
お知られる酵玠RecAずしお知られる酵玠類から
の酵玠により誘発させるこずもできる。ヘリカ
ヌれで栞酞の鎖を分離するのに奜適な反応条件は
クヌン ホフマン ベヌリングにより
CSHQuantitative Biologyの43から63頁1978
幎に蚘茉され、RecAを䜿甚する技術は、C.ラ
デむングによりAnn.Rev.Geneticsの16å·»405から
437頁に蚘茉されおいる。 増幅すべき配列を含む圓初の栞酞が単鎖である
ず、その盞補䜓をそれに぀又は぀のオリゎヌク
レオチドプラむマヌを加えお合成する。奜適な単
䞀プラむマヌが加えられるず、プラむマヌ、重合
詊薬及び埌述する぀のヌクレオチドの存圚䞋で
プラむマヌ䌞長生成物が合成される。生成物は郚
分的に単鎖栞酞ず盞補的で、栞酞鎖ずハむブリダ
むズしお長さの異なるデナプレツクスを圢成し、
これは䞊蚘した通り単鎖に分離され、盞補的な
぀の分離された鎖ずなる。代わりに぀の奜適な
プラむマヌを単鎖に加えお反応を行うこずもでき
る。 圓初の栞酞が増幅すべき配列を構成するなら
ば、プラむマヌの䌞長生成物は圓初の栞酞の鎖ず
完党に盞補的ずなり、ハむブリダむズしお同じ長
さの鎖から成るデナブレツクスを圢成し、これは
分離されお単鎖の分子ずなる。 栞酞の盞補的な鎖が分離するず、圓初の栞酞が
二重鎖であ぀おも単鎖であ぀おも、その鎖は他の
栞酞鎖の合成甚鋳型ずしお容易に䜿甚するこずが
できる。この合成は任意の奜適な方法を甚いお行
うこずができる。通垞それは奜たしくはPHがか
ら、最も奜たしくはである緩衝氎溶液䞭で起
こる。奜たしくは過剰のモル比クロヌン化され
た栞酞に぀いおは、通垞プラむマヌ察鋳型が
1000、そしおゲノムの栞酞に぀いおは通垞プ
ラむマヌ察鋳型が106の぀のオリゎヌク
レオチドプラむマヌを分離された鋳型鎖を含む緩
衝氎溶液䞭に加える。しかし本法を蚺断的甚途に
䜿甚する堎合には盞補的な鎖の量は既知ではない
こずを理解すべきであり、埓぀お盞補的な鎖の量
に関連するプラむマヌの量を確信をも぀お決定す
るこずはできない。しかし実際には、増幅すべき
配列が耇雑な長鎖の栞酞鎖の混合物䞭に含たれる
堎合には、加えられるプラむマヌの量は盞補的な
鎖鋳型の量よりも通垞モル過剰ずする。本法
の効率を改良するためには、倧きな過剰モル比ず
するこずが奜たしい。 デオキシリボヌクレオシド䞉リン酞であるデオ
キシATP、デオキシCTP、デオキシGTP及び
TTPの十分な量も合成混合物に加え、生成する
溶液を玄90−10℃で玄から10分、奜たしくは
から分間加熱する。この加熱時間の埌、溶液の
枩床をプラむマヌのハむブリダむれヌシペンに奜
適な宀枩たで䞋げる。この冷华した混合物にプラ
むマヌ䌞長反応を誘導し又は觊媒するための適圓
な薬剀誘導詊薬又は重合詊薬ず称するを加
え、埓来知られおいる条件䞋で反応を行わせる。
このの合成反応は、宀枩からそれを越えるず重合
詊薬が効率的に機胜しない枩床たでの間で行わせ
るこずができる。埓぀お䟋えばDNAポリメラヌ
れを重合詊薬ずしお䜿甚するずきは、枩床を通垞
40℃以䞊に䞊昇させない。最も奜たしくは反応は
宀枩においお起こる。 重合詊薬誘導詊薬は、プラむマヌの䌞長生
成物の合成を達成できるものならば、酵玠を含む
どのような化合物でも系でもよい。この目的のた
めの奜適な酵玠は、䟋えばE.コヌリヌDNAポリ
メラヌれ、E.コヌリヌDNAポリメラヌれの
クレノヌ断片、T4DNAポリメラヌれ、他の入手
できるDNAポリメラヌれ、逆転写酵玠及び耐熱
性酵玠を含む他の酵玠を含み、これらは奜適な態
様でのヌクレオチドの結合を促進し、各栞酞鎖ず
盞補的であるプラむマヌの䌞長生成物を圢成す
る。䞀般に合成は各プラむマヌの′末端から始
たり、合成が終了するたで鋳型鎖に沿぀お5′末端
方法に向か぀お進行し、異な぀た長さの分子を生
成する。しかし䞊述の方法ず同じ方法を甚いお
5′末端で合成を始め、他の方法に向か぀お反応を
進行させる詊薬がある。 新たに合成された鎖ずそれず盞補性を有する栞
酞鎖は、本法のその埌のステツプにおいお䜿甚さ
れる二重鎖分子を圢成する。次のステツプでは、
二重鎖分子の鎖は䞊述の任意の手順を甚いお分離
され、単鎖分子を提䟛する。 新たな栞酞が該単鎖分子䞊で合成される。远加
の誘導詊薬、ヌクレオチド及びプラむマヌを、䞊
蚘に芏定した条件䞋で反応を進行させるために必
芁ならば加えおもよい。オリゎヌクレオチドプラ
むマヌの䞀末端から再床合成が始たり、そしお鋳
型の単鎖に沿぀お進行しお他の栞酞を生成する。
このステツプの埌における䌞長生成物の半分は
぀のプラむマヌが結合した特定の栞酞配列から成
぀おいる。 鎖分離ず䌞長生成物合成のステツプは、特定の
栞酞配列を所定量生産するたで必芁なだけの回数
繰り返すこずができる。埌により詳现に蚘茉する
ように、特定の栞酞配列は指数的に蓄積する。最
初の栞酞又は栞酞の混合物から以䞊の特定の栞
酞配列を生産するこずが望たしい堎合は、奜適な
数の異な぀たオリゎヌクレオチドプラむマヌを䜿
甚する。䟋えば぀の異な぀た特定の栞酞配列を
生成する堎合には、぀のプラむマヌを䜿甚す
る。プラむマヌのうちの぀は特定の栞酞配列の
うちの぀に関するもので、他の぀のプラむマ
ヌは第の特定の栞酞配列に関するものである。
これにより、぀の異な぀た特定の配列が本法を
甚いお指数的に生産され埗る。本発明は、各ステ
ツプ埌に新しい詊薬を加える段階的方法、又は党
おの詊薬を初期のステツプで加える同時的方法、
又はある䞎えられた数のステツプの埌に新しい詊
薬を加える䞀郚段階的で䞀郚同時的である方法の
いずれによ぀おも行うこずができる。熱凊理のよ
うに重合詊薬を䞍掻性化する鎖分離方法を採甚し
た堎合には、熱に察しお䞍安定である酵玠の堎合
がそうであるように、各鎖分離ステツプ埌に重合
詊薬を補充するこずが必芁である。ヘリカヌれの
ような酵玠的手段を含む倚数の粟補された成分を
鎖分離ステツプで䜿甚する堎合は、同時的方法を
䜿甚するこずができる。同時的方法では、反応混
合物は、所望の配列を含む栞酞鎖の他に、鎖分離
酵玠䟋えばヘリカヌれ、rATPのような鎖分
離酵玠ぞの適切な゚ネルギヌ䟛絊源、぀のヌク
レオチド、モル過剰のオリゎヌクレオチドプラむ
マヌ及びE.コヌリヌDNAポリメラヌれのクレ
ノヌ断片のような誘導詊薬を含むこずができる。
同時的方法で倉性のために熱を䜿甚するずきは、
誘導詊薬に䟝存するが奜たしく65−90℃の高枩で
機胜する熱安定性ポリメラヌれ等の熱安定性誘導
詊薬を䜿甚し、この枩床で栞酞は平衝状態にある
単鎖ず二重鎖から成぀おいる。長さの短い栞酞に
は、玄50℃皋床の䜎枩が採甚される。どの皋床の
高枩が䜿甚できるかは、その枩床で酵玠が倱掻す
るかあるいはプラむマヌのハむブリダむれヌシペ
ンが䞍十分な皋床しか起こらないかどうかに䟝存
する。このような熱安定性酵玠は、䟋えばA.S.カ
レデむンらによりBiokhimiya45å·»644−651頁
1980幎に蚘茉されおいる。本法の各ステツプ
は、党おの詊薬が始めから存圚するにもかかわら
ず、続いお起こる。必芁ならば远加の詊薬を加え
おもよい。適切な長さの時間が経過しお所望量の
特定の栞酞配列が生成した埌、任意の公知方法で
酵玠を倱掻させるか反応成分を分離するかしお反
応を停止させる。 本発明方法は連続的に行぀おもよい。オヌトメ
ヌシペン化された方法の䞀態様ずしお、反応を、
倉性区域、詊薬添加区域及び反応区域を通぀おサ
むクルさせるような方法がある。他の態様では、
プラむマヌの䌞長生成物の合成に䜿甚する酵玠を
カラム䞭で固定化するこずができる。他の反応成
分は連続するカラムず加熱甚コむルを通るように
ポンプを䜿぀お連続的に埪環され、これにより、
生成した栞酞が酵玠を倱掻させるこずなく繰り返
し倉性される。 本発明のの抂略が䞋蚘に瀺され、ここでは盞補
的な鎖〔S+〕ず〔S-〕から成る所望配列〔〕
を含む二重鎖DNAが栞酞ずしお䜿甚されおいる。
第の及び匕き続いお起こる反応サむクルでは、
圓初の鋳型䞊の各オリゎヌクレオチドプラむマヌ
の䌞長は、プラむマヌの぀ずずもにのみ終了す
る制限のない長さの、぀の新しいssDNA分子
生成物を生成する。以埌「長鎖生成物」ず呌ぶこ
れらの生成物は盎線的に蓄積し、぀たり任意数の
サむクルの埌に存圚する量はサむクル数に比䟋す
る。 このように生産される長鎖生成物は、匕き続い
お起こるサむクルの間䞀方又は他方のオリゎヌク
レオチドプラむマヌの鋳型ずしお機胜し、所望配
列〔S+〕又は〔S-〕の分子を生成する。これら
の分子も䞀方又は他方のオリゎヌクレオチドプラ
むマヌの鋳型ずしお機胜し、曎に他の〔S+〕及
び〔S-〕を生成し、埓぀おサむクル数に関連し
お指数的に〔〕の蓄積を生じさせる連鎖反応が
維持される。 オリゎヌクレオチドのハむブリダむれヌシペン
により圢成される意図されない副生成物は、それ
自身觊媒掻性がなく皀な䟋を陀く、埓぀お盎
線的に蓄積する。 【衚】 新しく合成された長い生成物
【衚】 䞀方のプラむマヌのオリゎヌクレオチド配列ず
共に終る鎖及び他方の盞補的配列の各鎖は、生産
するこずが望たれおいる特定の栞酞配列〔〕で
あるこずが分かる。 本法のステツプは、プラむマヌ及び、重合
詊薬及び存圚するヌクレオチドの量によ぀おのみ
限定される以倖、無限に繰り返すこずができる。
最初の栞酞は耇補されないので、その量は党工皋
䞭䞀定である。長鎖生成物は最初の栞酞からのみ
生産されるので、その量は盎線的に増加する。特
定の配列の量は指数的に増加する。埓぀お特定の
配列はその量が増加しお優勢な成分ずなる。この
こずは次衚に瀺され、該衚はサむクルの効率が
100であるずした堎合のサむクル埌の理論的
に存圚する成分量を比范したものである。 【衚】 【衚】 単鎖の栞酞を鋳型ずしお䜿甚するず、サむクル
あたり぀の長鎖生成物が生成する。 本法は奜適な発珟ベクタヌに特定の栞酞配列を
挿入するためにクロヌン化するのに䜿甚できる。
該ベクタヌは適切な宿䞻生物を圢質転換しお暙準
的な組み換え䜓DNA技術により遺䌝子生成物を
生産する際に䜿甚できる。 曎に本法はむンビトロの突然倉異甚ずしお䜿甚
するこずができる。オリゎデオキシリボヌクレオ
チドは増幅されるべきDNA配列ず正確に盞補的
である必芁はない。これらは、ポリメラヌれ酵玠
や他に䜿甚されるいずれかの誘導詊薬によ぀お䌞
長されるために十分な皋床に、鎖ずハむブリダむ
ズするこずができればよい。䜿甚するプラむマヌ
が最初の鋳型ず正確に盞補的でない堎合のポリメ
ラヌれ連鎖反応の生成物は鋳型よりむしろプラむ
マヌ配列を有し、これによりむンビトロの突然倉
異を可胜にする。匕き続くサむクルでは、より䌌
䞊のミスペア−プラむミングが必芁ずされないの
で、この突然倉異が枛るこずのない効率䞋で増幅
される。このように生産された突然倉異䜓は暙準
的な分子生物孊的技術により適切なベクタヌ䞭ぞ
挿入され、倉化した蛋癜質を生産する胜力等の倉
化した特質をこのベクタヌに䞎える。 䞊述した倉化したDNA配列を圢成する方法は、
より以䞊の配列倉化を誘発させるために異な぀た
プラむマヌを䜿甚しお該倉化したDNAに察しお
繰り返すこずができる。この方法では、䞀連の突
然倉異配列が埐々に生成され、ここで、この䞀連
のものに新しく加えられるものでは、最埌のもの
ず僅かに異なるこずができるが、最初のDNA源
配列ずは非垞に倧きく異なるこずができる。この
方法では、非垞に倧きなミスマツチの堎合にプラ
むマヌが機胜しないために単䞀ステツプでは行う
こずのできない倉化を、最終的には䜜り出すこず
ができる。 曎に、十分な量のプラむマヌが増幅される鎖に
盞補的である配列を含むのであれば、プラむマヌ
はその配列の䞀郚ずしお盞補的でない配列を含む
こずができる。䟋えば鋳型配列に盞補的でない栞
酞配列䟋えばプロモヌタヌ、リンカヌ、コヌド
配列等を、぀又は䞡方のプラむマヌの5′末端
に結合させるこずができ、これにより増幅工皋の
生成物にこれを付加するこずができる。䌞長プラ
むマヌを添加した埌、盞補的でない栞酞挿入郚を
含む新しい鋳型の所望量を埗るために十分な数の
サむクルを実斜する。これにより簡単な技術を甚
いお比范的短時間䟋えば時間又はそれ以䞋
内に組合わされた断片を倧量に生産するこずが可
胜になる。 本法は、䌝染性疟患、遺䌝子性疟患又は现胞性
の疟患、䟋えば癌、ず関連する特定の栞酞配列、
䟋えば発癌遺䌝子、の怜出及び又は特城付けを
可胜にするために䜿甚される。増幅は、䟋えば胎
児现胞から埗られるDNAを甚いる鎌状赀血球貧
血の胎児蚺断等、分析に利甚できる栞酞の量が非
垞に小さい堎合に有甚である。増幅は、本来的に
感床の良くない非攟射性怜出技術を甚いお少量の
詊料を分析する堎合、又は攟射性技術を甚いるが
迅速な怜出が望たしい堎合に特に有甚である。 本発明の目的のためには、遺䌝子性疟患は、䟋
えば鎌状赀血球貧血、嚢胞性繊維症、α−サラセ
ミア、β−サラセミア等の、任意の生物䜓からの
ゲノムDNA䞭の特定の欠損及び又は倉異を含
む。鎌状赀血球貧血は、本法による奜適なDNA
配列の増幅の埌のオリゎマヌ制限分析又はRFLP
状分析を経お容易に怜出するこずができる。α−
サラセミアは配列が存圚しないこずにより怜出す
るこずができ、β−サラセミアは疟患を起こさせ
る倉異に近接しおリンクする倚圢性
polymorplic制限郚䜍の存圚により怜出する
こずができる。 これら党おの遺䌝子性疟患は適切な配列を増幅
し、それを攟射性プロヌブを䜿甚せずにサザンプ
ロツト法により分析しお怜出するこずができる。
このような方法では、䟋えば非垞に少量の所望配
列を含む矊氎からのDNAの少量の詊料を増幅し、
制限酵玠で切断し、そしおサザンブロツト法で分
析する。増幅シグナルをハむレベルずするこずに
より、非攟射性暙䜓を䜿甚するこずが容易にな
る。 他の態様では、少量のDNAを䟿利なレベルた
で増幅し、次に曎に䌞長反応を行うが、この堎合
容易に怜出できるヌクレオチド誘導䜓䟋えば
32P又はビオチンでラベルしたヌクレオチド䞉リ
ン酞を盎接最終のDNA生成物に導入し、これ
を制限分析及び電気泳動分析あるいは任意の他の
奜適な方法を甚いお分析する。この技術のモデル
系の䟋を第図に瀺しおある。 第図のモデム系に瀺した曎に他の態様では、
栞酞は増幅の前に特定の制限゚ンドヌクレアヌれ
に暎露する。切断された配列は増幅できないの
で、予め制限酵玠で凊理したDNA詊料の存圚に
もかかわらず増幅された断片が珟れるこずは、増
幅された配列䞭に゚ンドヌクレアヌれの郚䜍がな
いこずを暗瀺する。増幅された配列が存圚するか
吊かは適圓な方法で怜出するこずができる。 この技術の実際的な適甚方法は、本明现曞ずサ
むキらによるBiotechnology3å·»1008−1012頁に
蚘茉されおいるオリゎマヌ制限技術を甚いお鎌状
赀血球貧血の怜出を容易にする䜿甚により䟋瀺す
るこずができる。鎌状赀血球貧血はβ−グロビン
遺䌝子の第コドンの぀の塩基察の倉化により
生ずるヘモグロビンの疟患である。第図は倚圢
珟象polymorphisn領域䞭の正垞及び鎌状赀
血球貧血のβ−グロビン遺䌝子の配列を瀺すもの
で、䞀本線は正垞遺䌝子にのみ存圚するDde郚
䜍の䜍眮を瀺し、二本線は正垞及び鎌状赀血球貧
血察立遺䌝子、の䞡方に存圚する非倚圢性の
Hinf郚䜍の䜍眮を瀺す。第図は䞡制限郚䜍
郚䜍間にわたり星印で瀺された郚分がラベルされ
おいるプロヌブを甚いお正垞のβ−グロビン
DNAをオリゎマヌ制限開裂する方法を瀺すもの
である。前に蚘茉したようにしお増幅された
DNAが倉性され、ラベルされたプロヌブずアニ
ヌルされる。酵玠DdeはDNAを再構成された
Dde郚䜍で開裂させ、ラベルされたオクタマヌ
を生じさせる。テストに䜿甚した条件䞋では、オ
クタマヌはデナプレツクスから離れるのに十分な
短さである。匕き続く酵玠Hinfの添加は今や
単鎖であるオクタマヌに䜕の圱響も䞎えない。第
図はβ−グロビンDNAの鎌状赀血球察立遺䌝
子に適甚した前蚘ず同じ方法を瀺す。酵玠Dde
は、−の塩基察がミスマツチしたものである
ため、増幅されたDNAずラベルされたプロヌブ
ずで圢成されたデナプレツクスを開裂させるこず
はできない。しかし酵玠Hinfはハむブリツド
制限開裂せしめ、ラベルされたトリマヌが生成さ
れる。実際にはこの方法は、特定のシグナルがい
ずれかの察立遺䌝子の存圚ず関連するので、個䜓
のDNAが野性型のホモ接合䜓か、鎌状赀血球貧
血型のホモ接合䜓か又は鎌状赀血球貧血圢質を有
するヘテロ接合䜓であるかを怜蚺するこずができ
る。䞊述の方法を䜿甚しお適切な配列を増幅させ
るこずにより぀の32Pラベルのみを有するプロ
ヌブを甚いお単コピヌ遺䌝子を迅速に分析するこ
ずができる。 皮々の䌝染性疟患は、原因ずなる埮生物に特異
的である特定のDNA配列の臚床詊料䞭で存圚に
より蚺断するこずができる。これらはサルモネ
ラ、クラミゞア、ネむセリア等の现菌、肝炎ビヌ
ルス等のビヌルス、マラリアの原因ずなるプラス
モゞりムPlasmodium等の寄生䜓を含む。フ
アルコヌに䞎えられた米囜特蚱第4358535号は、
䌝染性疟患の蚺断甚の特別なDNAハむブリダむ
れヌシペンプロヌブの䜿甚に぀き蚘述しおいる。
フアルコヌ法に固有の問題は、感染した患者から
の臚床詊料䞭には比范的少ない数の病原生物しか
存圚せず、これらから抜出されたDNAは詊料䞭
の党DNAの非垞に小さな郚分を構成するのみで
あるずいうこずである。DNA詊料を固定化しハ
むブリダむれヌシペン怜出する前に問題ずな぀お
いる配列を特異的に増幅するこずは、これらの方
法の感床ず特異性を倧きく改良する。 䌝染性疟患の蚺断甚にDNAプロヌブを臚床的
にルヌチン化しお䜿甚するこずは、ワヌドのペヌ
ロツパ特蚱第63879号に蚘茉されおいるように非
攟射的にラベルされたプロヌブを䜿甚するのなら
ば、倧いに簡略化される。この方法では、ビオチ
ンを含むDNAプロヌブがアビゞン又はビオチン
に特異的な抗䜓に結合した色玠䜓
chromogenic酵玠により怜出される。この型
の怜出は䟿利であるが、比范的䜎感床である。本
法による特異的なDNA増幅ず安定にラベルされ
たプロヌブを組み合わせるこずにより、フアルコ
ヌ及びワヌドの方法をルヌチン化した臚床におけ
る有甚な方法にするのに芁求される䟿利さず感床
を提䟛するこずができる。 この増幅工皋は単䞀コピヌのヒト遺䌝子から十
分な量のDNAを調補するのに利甚するこずもで
き、これにより臭化゚チゞりムのような簡単な非
特異的なDNA染色によりそれを怜出でき、盎接
DNA蚺断を行うこずができる。 䌝染性疟患及び生物䜓のゲノム䞭の病原的異垞
性を怜出するほか、本法は任意の病原状態ず関連
しないDNA倚圢珟象ポリモルフむズムを怜
出するために䜿甚するこずもできる。 次の実斜䟋は䟋瀺のために提瀺するもので、ど
のようにも本発明を限定するこずを意図するもの
ではない。これらの実斜䟋で党おのパヌセントは
固䜓の堎合は重量で、液䜓の堎合は容量であり、
他に指定がない限り枩床は摂氏枩床である。 実斜䟋  次のヌクレオチド配列を有する25塩基察配列 5′CCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCT3′ 3′GGAGCCGTGGCAGTGGGACCTACGA5′ ATCCから埗られるpBR322の47塩基察Fok
制限断片に含たれるを次のように調補した。
47塩基察断片を含むpBR322のFOk消化物を、
䟛絊者であるニナヌむグランド瀟の指瀺による条
件に埓぀おpBR322Fokで消化するこずにより
調補した。䜿甚したプラむマヌは、5′d
CCTCGGCACCG3′ず5′d
AGCATCCAGGGTG3′であり、通垞の技術
により調補した。25mMのリン酞カリりムず
10mMの塩化マグネシりム、及び100mMの塩化
ナトリりムから成る緩衝液PH7.533Όに2433
ピコモルの䞊述の各プラむマヌ、2.4ピコモルの
pBR322のFok消化物、22ナノモルのデオキシ
ATP、22ナノモルのデオキシCTP、19ナノモル
のデオキシGTP及び10ナノモルのTTPを加え
た。 混合物を85℃で分間加熱し、宀枩たで冷华し
た。E.コヌリヌDNAポリメラヌれのクレノヌ
断片の単䜍を加え、枩床を15分間維持した。そ
の埌再床85℃で分間加熱し、冷华した。クレノ
ヌ断片の単䜍を再床加え、15分間反応を行぀
た。加熱、冷华及び反応の各ステツプを曎に11回
繰り返した。 最埌の繰り返しの埌、5Όを反応混合物から
取り出した。これを85℃で分間加熱し、宀枩に
冷华した。12.5ピコモルのα−P32デオキシシチ
ゞン䞉リン酞ず単䜍のクレノヌ断片を加え反応
を15分間進行させた。ラベルされた生成物をポリ
アクリルアミドゲルの電気泳動で確認した。13サ
むクル埌に芋える匷くラベルされたバンドのみ
が、意図する25塩基察配列であ぀た。 実斜䟋  増幅されるべき所望の配列は、ヒトのβ−グロ
ビン遺䌝子に含たれか぀鎌状赀血球貧血に関する
MstII郚䜍に䌞びる94塩基察の配列であ぀た。該
配列は第図に瀺すヌクレオチド配列を有しおい
る。 プラむマヌの合成 次の぀のオリゎデオキシリボヌクレオチドプ
ラむマヌを䞋蚘する方法を甚いお調補した。 5′CACAGGGCAGTAACG3′プラむマヌ、及
び 5′TTTGCTTCTGACACA3′プラむマヌ オヌトメヌシペン化された合成法 ビナヌケヌゞずカルサヌス法Tetrahedron
Letters22å·»1859−1862頁1981幎に埓぀お合
成したゞ゚チルフオスフオロアミダむトを、バむ
オサヌチSAM−を䜿甚しお制埡した倚孔ガラ
ス担䜓から誘導したヌクレオシドぞ次々ず濃瞮し
た。この方法は、ゞクロルメタン䞭でのトリクロ
ル酢酞による脱トリチル化ず掻性のある氎玠䟛䞎
䜓ずしおベンゟトリアゟヌルを䜿甚する瞮合及び
テトラハむドロフラン及びピリゞン䞭での無氎酢
酞ずゞメチルアミノピリゞンによるキダツピング
を含んでいた。サむクルの時間は玄30分であ぀
た。各ステツプの収率は実質的に圓量的であり、
脱トリチル化の間に解離するゞメトキシトリチル
アルコヌルを集め分光噚による怜査で決定した。 オリゎデオキシリボヌクレオシドを脱保護化
し、粟補する方法 固䜓担䜓をカラムから取り出し、1mlの濃氎酞
化アンモニりムに閉鎖管䞭宀枩で時間曝した。
担䜓を濟過で取り陀き、䞀郚が保護されたオリゎ
デオキシリボヌクレオチドを含む溶液の枩床を55
℃に䞊昇させ、時間維持した。アンモニアを取
り陀き、残枣を調補甚ポリアクリルアミドゲルに
適甚した。30ボルトcmで90分間電気泳動を行
い、生成物を含むバンドを螢光プレヌト䞊のUV
シダドりむングで同定した。該バンドを切り取
り、1mlの蒞留氎で䞀晩かけお℃で溶出した。
この溶液をアルテツクRP18カラムにかけ、PH6.0
の酢酞アンモニりム緩衝液䞭−13のアセ
トニトリルで溶出した。この溶出液は260nmの玫
倖吞収でモニタヌし、適切なフラクシペンを集
め、固定した量での玫倖吞収で定量分析し、か぀
宀枩䞋で枛圧遠心機䞭で蒞発させ也燥した。 オリゎデオキシリボヌクレオチドの特城付け 粟補したオリゎヌクレオチドのテスト溶液をポ
リヌクレオチドキナヌれ及びγ32P−ATPで32Pラ
ベルした。このラベルした化合物を50ボルトcm
で45分間電気泳動にかけた埌、14−20のポリア
クリルアミドゲルのオヌトラゞオグラフむヌで確
認した。この方法では分子量を確認するこずがで
きる。ヘビ毒ゞ゚ステラヌれず现菌性アルカリフ
オスフアタヌれを䜿甚しおオリゎデオキシリボヌ
クレオチドをヌクレオシドに消化し、そしお次は
逆盾HPLCカラム、䞊びに10アクリロニトリル
及び酢酞アンモニりム移動盞を䜿甚しお、誘
導されたヌクレオシドを分離し定量するこずによ
り塩基組成を決定した。 DNA源  党ヒト野性型DNAの抜出 正垞のβ−グロビンのヒトゲノムDNAホモ接
合䜓を、ステツトラヌらによりProc.Nat.Acad.
Sci.の72å·»5966−5970頁に蚘茉された技術を甚い
おセルラむンMolt4ヒナヌマン・ゞ゚ネテむツ
ク・ミナヌタント・セル・レポゞトリヌから入手
し、GM2219cず同定したから抜出した。  クロヌン化したグロビン遺䌝子の造成 正垞のβ−グロビン遺䌝子の1.9kbのBamHI断
片をコスミドpECllから分離し、pBR322のBam
HI郚䜍に挿入した゜ベロンらのGene巻287
−305頁1980幎。合成40塩基察プロヌブずハ
むブリダむズする領域を含むこの断片は、第及
び第の゚ク゜ン、第のむントロン、䞊びに遺
䌝子の5′のフランキングflanking配列を含む
ロヌンらのCell15å·»1157−1174頁。このクロヌ
ンはpBR328HbAず名付けられ、ATCC第
39698号ずしお1984幎月25日に寄蚗された。 β−グロビンの鎌状赀血球貧血察立遺䌝子の察
応する1.9kbのBamHI断片はコスミドpF12から
分離され、䞊述の通りクロヌン化された。このク
ロヌンはpBR328HbSず名付けられ、ATCC第
39699号ずしお1984幎月25日に寄蚗された。 各組み換えプラスミドをE.コヌリヌMM294
ATCC第39607号ぞ圢質倉換し、そしお増殖せ
しめた。  クロヌン化されたグロビン遺䌝子のMstIIに
よる消化 それぞれの党量が100ÎŒgであるpBR328HbA
ずpBR328HbSを単独で20単䜍のMstIIニナヌ
むングランドバむオラブ瀟ずずもに16時間37
℃、150mMのNaCl、12mMのTris HClPH7.5、
12mMのMgCl2、1mMのゞチオスレむトヌス
DTT及び100ÎŒgmlのりシ血枅アルブミン
BSA䞭で消化した。生成物はそれぞれ
pBR328HbAMstII及びpBR328HbSMst
IIず名付ける。 ポリメラヌれの連鎖反応 60mM酢酞ナトリりム、30mMトリス−アセテ
ヌト及び10mM酢酞マグネシりムを含むPH8.0の
緩衝液100Όぞ100ピコモルのプラむマヌ
CACAGGGCACTAACGの配列、100ピコモ
ルのプラむマヌ
TTTGCTTCTGACACAの配列及び1000
ピコモルのデオキシATP、デオキシCTP、デオ
キシGTP及びTTPを含む2Όの溶液を加えた。
䞊述した、䞋蚘のDNA源を加えた。 10ÎŒgの党ヒト野性型DNA反応 0.1ピコモルのpBR328HbA反応 0.1ピコモルのpBR328HbS反応 0.1ピコモルのpBR328HbAMstLL反応
 0.1ピコモルのpBR328HbBMstII反応 非暙的DNA反応 埗られる各溶液を100℃で分間加熱し分間
で宀枩たで冷华し、その埌E.コヌリヌDNAポリ
メラヌれのクレノヌ断片の単䜍を含む1Όを
加えた。各反応は10分間行い、その埌プラむマ
ヌ、ヌクレオチド及びDNAを加え、加熱し、冷
华し、ポリメラヌれを加え、そしお反応させるサ
むクルを反応に぀いおは19回、反応−に぀
いおは回繰り返した。 第サむクルの前、及び各反応の最埌のサむク
ルの埌で取り出された反応及びのアリコヌト
マむクロリツトルを、PH8.3の0.089Mトリス硌
酞塩緩衝液䞭で、2.5mMEDTA䞭で、12ポリ
アクリルアミドゲルに加えた。このゲルを25ボル
トcm、時間電気泳動させ、固盞担䜓ずしお機
胜するナむロン膜ぞ移し、そしお、PH7.4で30
のフオルムアミド、3xSSPE、5xデンハルツ及び
のドデシル硫酞ナトリりム䞭で、暙準的技術
を甚いお調補した次匏 5′dTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCA
AG3′ の32Pでラベルされた40塩基察の合成断片で怜知
した。第図は、反応及び甚の怜知されたナ
むロン膜のオヌトラゞオグラフである。レヌン
は0.1ピコモルの58塩基察の察照合成断片で、そ
のうちの぀の鎖は䞊蚘プロヌブず盞補的であ
る。レヌンは第の増幅サむクルの前の4ÎŒ
の反応の液である。レヌンは20回の増幅サむ
クル埌の4Όの反応の液である。レヌンは
回の増幅サむクル埌の4ÎŒlの反応の液である。
レヌンはΌ−32P−デオキシNTP及びポリメラ
ヌれでラベルされたpBR322ニナヌむングラン
ドバむオラブ瀟のFokニナヌむングランド
バむオラブ瀟から成る分子量暙準である。レヌ
ンは、20サむクル埌反応混合物は適切な分子
量を有する特定の配列を倧量に含み、他の怜出で
きる生成物がないこずを瀺しおいる。サむクル
埌の反応混合物もレヌンに瀺す通り出発物質
である栞酞ず他の生成物の他にこの生成物も含ん
でいる。 サむクル埌の反応からの液5.0Όに䞊述
の各プラむマヌピコモルを加えた。溶液を分
間100℃に加熱し宀枩ぞ戻した。それぞれピコ
モルのα−32P−デオキシATP、α−32P−デオ
キシCTP、α−32PデオキシGTP及びα−32P−
TTP、䞊びに単䜍のクレノ−断片を加えた。
最終的な容積が10Όであり塩濃床が䞊蚘した通
りである反応を10分間行わせた。ポリメラヌれ掻
性は60℃で20分間加熱するず倱われた。反応−
の反応液4Όを、0.089Mトリス硌酞塩緩衝液、
2.5mMEDTA䞭で12ポリアクリルアミドゲル
に加えた。このゲルを25ボルトcm、時間電気
泳動させ、その埌オヌトラゞオグラフ凊理した。 第図は、電気泳動のオヌトラゞオグラフであ
る。レヌンは分子量暙準、レヌンは反応、
レヌンは反応、レヌンは反応及びレヌン
は反応である。察照ずしおのDNAを䌎なわ
ない反応のレヌンはレヌンのどこにもむメヌゞ
を有さない。図から、暙的DNAから予想される
94塩基察断片は、無傷のβ−グロブリンDNA配
列が増幅甚に䜿甚できるずきのみ存圚できるこず
が分かる぀たりレヌンのpBR328HbA、レ
ヌンのpBR328HbS及びレヌンの
pBR328HbSMstII。MstIIによる消化は
pBR328HbAを94塩基察配列䞭で切断し、それ
を増幅できないようにし、94塩基察のバンドはレ
ヌンに珟れない。これに察し、pBR328HbS
の94塩基察配列はプラスミドがMstIIで消化され
おも切断せず、埓぀お第図に瀺すように増幅に
利甚できる。 第図は94塩基察配列を増幅するサむクルの
連鎖反応を瀺すものである。PCO1ずPCO2はプ
ラむマヌ及びである。右の数はサむクルを瀺
し、巊の数は特定の分子が生産されたサむクル数
を瀺す。 実斜䟋  本実斜䟋は、ヒトヘモグロビン遺䌝子䞭の察立
遺䌝子MstII郚䜍を含む110塩基察配列の増幅を
瀺ものである。 プラむマヌは実斜䟋の技術で調補されたもの
である。1.0マむクログラムの党ヒトDNA、100
ピコモルの
ACACAACTGTGTTCACTAGC及び100ピ
コモルのCAACTTCATCCACGTTCACC
を以䞋のような100ÎŒlの溶液に溶解させた。 1.5mM各぀のデオキシリボヌクレオシド䞉
リン酞 30mMPH7.9のトリスアセテヌト緩衝液 60mM酢酞ナトリりム 10mM酢酞マグネシりム 25mMゞチオスレむトヌル この溶液を100℃で分間加熱し、迅速に25℃
に䞋げお分間加熱し、その埌DNAポリメラヌ
れのクレノヌ断片2.5単䜍を加えた。ポリメラヌ
れの反応が25℃で分間行い、その埌加熱、冷
华、クレノヌ断片の添加及び反応を望むだけ繰り
返した。 各サむクルの効率が70℃で、15サむクル行぀
お、β−グロビン遺䌝子の所望の110塩基察断片
1.4プトモルを合成した。 実斜䟋  本実斜䟋は、ヒトヘモグロビン遺䌝子の察立遺
䌝子䞭のMstII郚䜍を含む240塩基察配列の増幅
を瀺すものである。この配列は、Mco、Hinf
及びMstII制限郚䜍を含んでいる。 PHが8.0で、60mM酢酞ナトリりム、30mMト
リスアセテヌト及び10mM酢酞マグネシりムの混
合物0.1ピコモルのpBR328HbAを含むに、 100ピコモルの
GGTTGGCCAATCTACTCCCAGGプラむ
マヌ、 100ピコモルの
TAACCTTGATACCAACCTGCCCプラむ
マヌ、 各1000ピコモルのデオキシATP、デオキシ CTP、デオキシGTP及びTTP を含む2Όの溶液を加えた。 ぀のプラむマヌは実斜䟋に蚘茉した技術で
調補した。溶液を100℃で分間加熱し、空気䞭
で分間冷华し、その埌E.コヌリヌDNAポリメ
ラヌれのクレノヌ断片単䜍を含む液1Όを加
えた。反応を10分間進行させ、その埌溶液の添
加、加熱、冷华、ポリメラヌれの添加及び反応か
らなるサむクルを回繰り返した。反応液5.0ÎŒ
に、䞊蚘の各オリゎヌクレオチドプラむマヌピ
コモルを加えた。溶液を10℃で分間加熱し、宀
枩たで䞋げ、その埌それぞれピコモルのα−
32P−ラベルされたデオキシリボヌクレオシド䞉
リン酞及び単䜍のクレノヌ断片を加えた。最終
的な容量が10Όで塩濃床が䞊蚘の通りである反
応を10分間進行させる。ポリメラヌれ掻性は60℃
で20分間加熱するず倱掻した。2Όのアリコヌ
トをNco、Hinf及びMstIIで消化し、PH8.3の
0.089Mトリスアセテヌト緩衝液、0.25mMEDTA
䞭で12ポリアクリルアミドゲルに加えた。ゲル
を25ボルトcmで時間電気泳動させ、オヌトラ
ゞオグラフ凊理した。第図は電気泳動のオヌト
ラゞオグラフを瀺し、ここでレヌンは分子量暙
準、レヌンは酵玠の消化を䌎わないもの無傷
の240塩基察、レヌンはNcoによる消化
131及び109塩基察、レヌンはMstIIによる消
化149及び91塩基察、そしおレヌンはHinf
による消化144及び96塩基察である。オヌ
トラゞオグラフは240塩基察反応の増幅したもの
ず䞀臎する。 実斜䟋  本実斜䟋は、逐次的消化による鎌状赀血球貧血
を怜出するための本発明の方法の䜿甚を瀺すもの
である。 オリゎデオキシリボヌクレオチドの合成及び
リン酞化 5′*
CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTA
′の配列のラベルされた
DNAプロヌブ*がラベルを意味するRS06、
及びRS06ず぀の塩基察がミスマツチしおいる。
3′GACAGAGGTCACCTCTTCAGACGGCAA
′の配列のラベルされお
い
ないブロツクオリゎマヌRS10を、実斜䟋
の方法に埓぀お合成した。プロヌブRS06は、そ
のピコモルを、70mMトリス緩衝液PH7.6、
10mM MgCl2、1.5mMスペルミン及び2.5mMã‚ž
チオスレむトヌルを含む反応容量40Ό䞭の単
䜍のT4ポリヌクレオチドキナヌれニナヌむン
グラドバむオラブ及び50ピコモルのγ−32P−
ATPニナヌむングランドニナヌクレア、玄
7200CimMず接觊させるこずによりラベルし
た。党容量を25mMEDTAで100Όに調節し、
トリス−EDTATE緩衝液10mMトリス緩衝
液、0.1mMEDTA、PH8.0により平衡化された
バむオラツド補の1mlのBio Gel −スピン透
析カラム䞊でマニアテむスらがMolecular
Cloning464−465頁1982幎に蚘茉しおいる方
法に埓぀お粟補した。ラベルされたプロヌブは、
トリス−硌酞−EDTATBE緩衝液89mMト
リス、89mM硌酞、2.5mMEDTA、PH8.3䞭18
のポリアクリルアミドゲル19のアクリル
アミドBISずバむオラツド䞊で500vhrにお電
気泳動しおさらに粟補した。オヌトラゞオグラフ
による䜍眮きめの埌、ラベルされたプロヌブを含
む郚分を切り取り、粉砕し、0.2mlのTE緩衝液䞭
ぞ䞀晩かけお℃で溶出させた。反応生成物の
TCA沈柱は比掻性が4.9Ciミリモルであり、最
終的濃床が20ピコモルmlであるこずを瀺しお
いる。 ラベルされないRS10ブロツキングオリゎマヌ
は、200ピコモルmlの濃床で䜿甚した。 现胞系からのヒトゲノムDNAの分離 実質的にステツトラヌらのPNAS79å·»5966−
5970頁1982幎、Molt4に぀いおに蚘茉の方法
及びマニアテむスらのMolecular Cloning280−
281頁1982幎に蚘茉の方法を䜿甚しお、
Molt4、SC−及びGM2064のリンパ球系から高
分子のゲノムDNAを分離した。 Molt4ヒナヌマン・ミナヌタント・セル・デ
ポゞトリヌGM2219Cは正垞のβ−グロビン
に぀いおホモ接合䜓の现胞系であり、そしお
ATCC1985幎月19日に寄蚗されたSC−は鎌
状赀血球貧血察立遺䌝子に぀いおホモ接合䜓の
EBVで圢質倉換された现胞系である。
GM2064ヒナヌマン・ミナヌタント・セル・デ
ポゞトリヌGM2064は胎児ヘモグロビンの遺
䌝的な氞続性HPFHに぀いおホモ接合䜓で
ある個䜓圓初単離され、β−又はΎ−グロビン遺
䌝子配列を含んでいない。党お现胞系は10の牛
胎児血枅を含むRPMI−1640䞭に維持された。 臚床血液詊料からのヒトゲノムDNAの単離 既知の鎌状现胞キダリダヌASからのCH12
ず名付けられた臚床血液詊料をカルフオルニア州
オヌクランドの小児病院のベルトラム・ルビン博
士から埗た。ヌンベルグらのPrc.Nat.Acad.Sci.
75å·»5553−5556頁1978幎に蚘茉されおいる方
法の倉法を䜿甚しお、䞻に末梢の血液リンパ球か
ら成るバフむヌコヌト郚分からゲノムDNAを調
補した。 现胞を、5mlのトリス−EDTA−NaCl
TENN緩衝液PHの10mMトリス、PH、
1mMMEDTA、10mMNaCl䞭に再懞濁し、
0.2mgmlのプロテむナヌれ、0.5のSDSに調節
し、そしお37℃で䞀晩むンキナベヌトした。過塩
玠酞ナトリりムを0.7Mに加え、そしお现胞溶解
物を宀枩で−時間穏やかに振ずうした。现胞
溶解物をプノヌルずクロロフオルムの混
合物30mlで抜出し、続いおクロロフオルム30ml
で抜出し、次に゚タノヌルで栞酞を沈柱させた。
ペレツトを2mlのTE緩衝液に再懞濁させ、
RNaseを0.005mgmlに加えた。37℃で時間消
化させた埌、DNAを同量のプノヌル、プノ
ヌルクロロフオルム、及びクロロフオルムでそ
れぞれ䞀床ず぀抜出し、゚タノヌルで沈柱させ
た。DNAを0.5mlのTE緩衝液に再懞濁させ、
260nmの吞収により濃床を決定した。 β−グロビン配列を遞択的に増幅するための
ポリメラヌれ連鎖反応 マむクログラムのゲノムDNAを、10mMト
リス緩衝剀PH7.5、50mMNaCl、
10mMMgCl2、150ピコモルの配列 CACAGGGCACTAACGのプラむマヌ、
及び配列 CTTTGCTTCTGCACAのプラむマヌを
含む反応容量100Όの圓初溶液䞭で増幅し、か
぀蒞発を防ぐため玄100Ό厚の鉱油で被芆した。 各DNA詊料に぀き、サむクルが次のステ
ツプから成る増幅のための15サむクルを行぀た。 (1) 分間95℃で熱ブロツクセツト䞭で倉性す
る。 (2) 熱ブロツクセツトを盎ちに30℃に移し分間
プラむマヌずゲノムDNAがアニヌリングする
ようにする。 (3) E.コヌリヌDNAポリメラヌれのクレノヌ
断片ニナヌむングランドバむオラブ単䜍
ずデオキシATP、デオキシCTP、デオキシ
GTP及びTTPそれぞれナノモルを含むΌ
の溶液10mMトリスPH7.5、50mMNaCl、
10mMMgCl2、及び4mMゞチオスレむトヌル
から成る緩衝液䞭を加える。この䌞長反応を
30℃にお10分間行぀た。 最埌のサむクルの埌、95℃に分間維持しお
反応を停止させた。鉱油は0.2mlのクロロフオ
ルムで抜出しお廃棄した。最埌の反応液の容量
は130Όであ぀た。 プロヌブ及びDdeLHinfIによる増幅した
ゲノムDNAのハむブリダむれヌシペン消化 25マむクロリツトルの増幅されたゲノムDNA
を゚タノヌルで沈柱させ、同量のTE緩衝液䞭に
再懞濁した。10マむクロリツトル154ngのゲノ
ムDNAず同等の前増幅䜓を含むを1.5mlのマむ
クロフナヌゞ管に入れ、そしお20ΌのTE緩衝
液により最埌の容量を30Όずした。詊料を鉱油
で被芆しお95℃で10分間倉性した。ラベルされた
RS06プロヌブ0.02ピコモルを含む0.6MMaCI10
マむクロリツトルを管に加え、穏やかに混合し、
盎ちに56℃の熱ブロツクに移しお時間おいた。
ラベルしおいないRS10ブロツキングオリゎマヌ
マむクロリツトル0.8ピコモルを加え、曎
に10分間同じ枩床でハむブリダむれヌシペンを続
けた。マむクロリツトルの60mMMgCl20.1
BSA及び1ΌのDel10単䜍、ニナヌむング
ランドバむオラブを加え、再アニヌリングされ
たDNAを56℃で30分間消化した。マむクロリ
ツトルのHinf10単䜍、ニナヌむングランドバ
むオラブを加え、曎に30分むンキナベヌトし
た。4Όの75mMEDTAず6Όのトラツキング
染料を最終容積が61Όになるように反応混合物
に加えお反応を終了した。 鉱油を2mlのクロロフオルムで抜出し、18ÎŒ
の反応混合物45nmのゲノムDNAをヘヌフ
アヌSE200装眮䞭の30ポリアクリルアミドのミ
ニゲル19、バむオラドに負荷した。この
ゲルをブロモプノヌルブルヌ染料の前端が圓初
の䜍眮から3.0cm動くたで玄300ボルトで時間電
気泳動させた。該ゲルの前端の1.5cmは取り陀か
れ、残りのゲルは日間−70℃で匷化スクリヌン
は曝される。 写真の怜蚎第図 各レヌンは45ngの増幅されたゲノムDNAを含
んでいる。レヌンはMol4DNAを、レヌンは
CH12を、レヌンはSC−を、又レヌンは
GM2064を含んでいる。Molt4は、现胞圓たり
コピヌのβA遺䌝子を有する正垞の個䜓の遺䌝子型
CAAであり、CH12は、现胞圓たり個のβAず
個のβS遺䌝子を有する鎌状现胞キダリアからの臚
床甚詊料ASであり、そしおSC−は现胞圓
たりコピヌのβSを有する鎌状血球血貧血個䜓の遺
䌝子型を意味する。GM2064はβ−又はΎ−グロ
ビン配列を含有せず、ネガテむブ察照ずしお存圚
する。 写真から分かるようにDdeで開裂された、βA
特異的であるオクタマヌはβA遺䌝子を含むDNA
にのみ存圚しレヌン及び、HinfLで開裂
された、βS特異性を有するトリマヌは、βS遺䌝子
を含むDNAにのみ存圚するレヌン及び。
トリマヌ及びオクタマヌの䞡者の存圚レヌン
は鎌状赀血球貧血キダリアを瀺すものであ
り、オクタマヌのみを生ずる正垞の個䜓レヌン
及びトリマヌのみを瀺す鎌状赀血球貧血にか
か぀おいる個䜓レヌンから区別される。 比范のため、䞊蚘実隓を増幅されおいないゲノ
ムDNAを甚いお繰り返し行い、増幅を行うず怜
出感床が少なくずも1000倍増加するこずが分か぀
た。 実斜䟋  本実斜䟋は、ラベルされたブロヌブを䜿甚する
こずなく党ヒトDNA䞭の党く粟補されおない単
䞀コピヌ遺䌝子をゲル䞊で盎接怜出する方法を瀺
すものである。 実斜䟋に蚘茉した技術を甚い、β−グロブリ
ン遺䌝子の第゚ク゜ン䞭の配列からの110塩基
察断片を、党ヒトDNA10マむクログラムから20
サむクルで増幅した。この20サむクル埌に生産さ
れる110塩基察断片は、臭化゚チゞりムにより容
易に染色されおゲル䞊で芋るこずができた。 配列は、最初に制限酵玠Ddeにより切断され
るず、配列がβ−グロビンの察立遺䌝子䞭にお
ける堎合のように酵玠により認識される制限郚䜍
を含たないものでない限り、増幅されなか぀た。 実斜䟋  A.ヒトβ−グロビン察立遺䌝子からの1.9kb
挿入郚を含有する合蚈100プムトモルの
pBR328、500Ciモルである各α−32P−デオキ
シNTPを50ナノモルず぀、及び実斜䟋で䜿甚
した各プラむマヌナノモルを、100Όの30mM
トリス−アセテヌトPH7.9、60mM酢酞ナトリ
りム、100mMゞチオスレむトヌル及び10mM酢
酞マグネシりムを含む溶液䞭に溶かした。この溶
液を100℃にしお分加熱し、25℃にお分冷华
した。4.5単䜍のE.コヌリヌDNAポリメラヌれ
及び0.09単䜍の無機ピロフオスフアタヌれを加え
お反応混合物䞭でピロリン酞が生ずるのを防止
し、その埌反応を25℃で分間進行させ、曎に加
熱、冷华、酵玠の添加及び反応のサむクルを回
繰り返した。各合成サむクルの埌、10Όのアリ
コヌトを取り出し1Όの600mMEDTAに加え
た。それぞれを、90mMのトリスボレヌト及び
2.5mMのEDTA䞭、PH8.3で14のポリアクリル
アミドゲル䞊で24ボルトcm、2.5時間で分析し
た。操䜜の終了したゲルは、0.5ÎŒgmlの臭化゚
チゞりムを加えた同じ緩衝液に20分浞し、圓初の
緩衝液で掗浄し、赀フむルタヌを甚いお玫倖線䞭
で写真を撮圱する。 生産された110塩基察断片は玫倖線ブゲルから
切り出し、そしおクレンコフ攟射により係数し
た。がサむクル数を意味し、がサむクル毎の
郚分的収率である匏 pmoles10Ό0.01N−yN−、 にデヌタを䞀臎させようずする詊みは、が
0.619であるずきに楜芳的なものずなる。これは、
十分な増幅が起こ぀おいるこずを暗瀺しおいる。 B.各デオキシNTPを100ナノモルず぀100Όの
反応溶液に加え、攟射性ラベルを行わず、各サむ
クル毎に液を取り出さなか぀た以倖は、䞊蚘ず同
じ実隓を繰り返した。10サむクル埌に反応物を
分間沞隰させお反応を停止させ、57℃、時間で
再ハむブリダむれヌシペンを行぀た。 110塩基察生成物の配列を、その8ÎŒlのアリコヌト
を、1Όのりシ血枅アルブミンmgmlず
1Όの奜適な制限酵玠HinfI、Mnl、MstII、
Ncoを加えお制限分析し、37℃で15時間反応
させお確認した。PAGEは、䞊述の通り行぀た。 実斜䟋  本実斜䟋は、pBR328ずpBR322の皮々の断片
を増幅するために異な぀たプラむマヌを䜿甚する
䟋を瀺す。  次のプラむマヌを䜿いpBR328の130塩基察
断片を調補するこず以倖は実斜䟋7Aず同じよ
うに実隓を繰り返した。 TTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC及び GCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACC  次のプラむマヌを甚いたこず以倖は実斜䟋
7Aず同じように実隓を繰り返しpBR328の262
塩基察断片を調補した。反応時間はサむクル圓
たり20分であ぀た。 GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG
及び TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG  ヒトβ−グロビン察立遺䌝子からの1.9kb
の挿入郚を含む、100プムトモルのpBR328
のMstII消化物を圓初の鋳型ずしお甚いた以倖
は、実斜䟋8Bず同様に実隓を行぀た。該プラ
スミドはMstIIにより数回切断されたが、増幅
すべき配列の内偎では切断が起こらなか぀た。
曎に、䜿甚したプラむマヌは次の通りで、240
塩基察断片を生産した。 GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG
及び TAACCTTGATACCAACCTGCCC  100プムトモルのpBR322のNru消化物を
鋳型ずしお甚い、100Όの反応液䞭で各デオ
キシNTPを200ナノモル䜿甚し、次のプラむマ
ヌを䜿甚しおpBR322から500塩基察断片を生
産した以倖は実斜䟋7Bず同様に実隓を行぀た。 TAGGCGTATCACGAGGCCCT及び CTTCCCCATCGGTGATGTCG 反応時間は37℃でサむクル圓たり20分であ぀
た。最埌の再ハむブリダむれヌシペンは57℃で15
時間行぀た。電気泳動はアガロヌスゲル䞊で
行぀た。 実斜䟋  本実斜䟋は、むンヒドロ倉異が増幅されたセグ
メントに導入されるような本発明方法を䟋瀺する
ものである。  Nruで盎線化したpBR322合蚈100プムト
モル、ナノモルの75塩基察断片を生成するよ
うに蚭蚈されたそれぞれ次匏 CGCATTAAAGCTTATCGATG及び TAGGCGTATCACGAGGCCCT のプラむマヌ、それぞれ100ナノモルの各デオ
キシNTPを、PHの40mMのトリス、
20mMMgCl2、5mMのゞチオスレむトヌル及
びmgmlのりシ血枅アルブミンの溶液100ÎŒ
䞭で混合した。この混合物を100℃にしお
分間加熱し、氎济䞭23℃、0.5分間冷华し、次
に4.5単䜍のクレノヌ断片ず0.09単䜍の無機ピ
ロフオスフアタヌれを加え、反応を分間行぀
た。加熱、冷华、酵玠添加及び反応サむクルを
回繰り返した。10回目の反応サむクルは凍結
により終了させ、反応混合物のアリコヌト8ÎŒ
をアガロヌスゲルに適甚し、臭化゚チゞ
りムにより芖芚化した。  オリゎヌクレオチドプラむマヌずしお次匏の
ものを䜿甚した以倖は実斜䟋9Aず同様の実隓
を繰り返した。 CGCATTAAAGCTTATCGATG及び AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGA
GGCCCT これらのプラむマヌは101塩基察を生産するよ
うに蚭蚈され、その番目のプラむマヌ䞭
の26ヌクレオチドはpBR322には存圚しな
い。これらのヌクレオチドはT7プロモヌタヌ
の配列を衚すもので、これを、pBR322からの
75塩基察配列に、20の盞補的塩基ず26塩基の
5′偎䌞長郚ずを有するプラむマヌを䜿甚しお連
結した。この方法は時間より少ない時間で実
斜するこずができ、100プムトモルの
pBR322から比范的玔粋な101塩基察断片ピ
コモルを生産するこずができた。 T7プロモヌタヌはRNA転写を開始させるた
めに䜿甚できる。T7ポリメラヌれを101塩基察
断片に加えお単鎖RNAを生成せしめるこずが
できる。  オリゎヌクレオチドプラむマヌずしお䞋蚘の
ものを䜿甚しお、pBR322から1000塩基察断片
を調補した以倖は実斜䟋8Dず同様に実隓を繰
り返した。 TAGGCGTATCACGAGGCCCT及び CCAGCAAGACGTAGCCCAGC  䞊蚘9Cず同様の実隓を繰り返した。䜆し、
オリゎヌクレオチドプラむマヌずしお䞋蚘のも
の、 TAGGCGTATCACGAGGCCCT及び AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGA
GGCCCT 䜿甚しお1026察断片を調補した。番目のプラ
むマヌ26ヌクレオチドはpBR322には存圚せず、
䞊蚘のT7プロモヌタヌを瀺すものである。この
プロモヌタヌは、pBR322からの1000塩基察断片
に隣接しお挿入された。 これらの結果は、鋳型鎖ず完党にマツチしおい
ないがそれにもかかわらず十分にハむブリダむズ
しお酵玠的に䌞長するプラむマヌは、圓初の鋳型
に察応する鎖よりむしろプラむマヌの鎖を含む長
鎖生成物を生成せしめるずいうこずを暗瀺する。
長鎖生成物はむンビトロ倉異を生じさせる第の
プラむマヌ甚の鋳型ずしおの圹割を果たす。その
埌のサむクルでは、曎に倚くのミスペアしたプラ
むミングが芁求されないので、効率が枛少するこ
ずなくこの倉異は増幅される。この堎合その5′末
端に盞補的でない䌞長郚分があるプラむマヌが、
耇補されるべき鋳型に隣接しお生成物に新しい配
列を挿入するために䜿甚された。 実斜䟋 10 本実斜䟋は単コピヌ遺䌝子を増幅させる際にバ
ツクグラりンドを枛少させるためにネスト状に
nestedセツトしたプラむマヌを䜿甚するこず
を䟋瀺するものである。 野性型β−グロビン察立遺䌝子に぀いおホモ接
合䜓である党ヒトDNAに察しお、20サむクルの
増幅を次のように行぀た。10ÎŒgのDNA、それぞ
れ200ピコモルの次匏のプラむマヌ、 ACACAACTGTGTTCACTAGC及び CAACTTCATCCACGTTCACC 䞊びに100ナノモルず぀のdNTPを、100Όの
30mMトリス−アセテヌト、60mMの酢酞ナトリ
りム、10mMのゞチオスレむトヌル、及び10mM
の酢酞マグネシりム䞭で100℃にお分間加熱し、
25℃に分間䞋げお、そしお単䜍のクレノヌ断
片ずずもに分間凊理した。加熱、冷华、クレノ
ヌ詊薬の添加のサむクルを19回繰り返した。10ÎŒ
の液䜓を反応混合物から取り出し、曎に10回の
増幅のためのサむクルを次の各プラむマヌを甚い
お行぀た。 
CAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTG
及び CCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCC これらは、䞊蚘で生産された110塩基察断片䞭に
含たれる58塩基察断片を増幅した。増幅すべき最
埌の10回のサむクルは、10Όのアリコヌトを、
䞊蚘した各デオキシNTP100ナノモルず各プラむ
マヌ200ピコモルを含む90Όの新しいトリス−
アセテヌト緩衝液に垌釈するこずにより達成する
こずができる。反応条件は䞊蚘の通りずした。10
サむクルの埌10Όのアリコヌト圓初のDNA
の100ナノグラムに察応をのNuシヌブ
FMC瀟アガロヌスゲルに加え、臭化゚チゞり
ムを䜿぀お芖芚化した。 第図は、玫倖線で発光させた埓来法の通り
赀いフむルタヌを通しお写真撮圱した䞊蚘ゲルを
瀺すものである。レヌンは分子量のマヌカヌで
ある。レヌンは䞊蚘反応のアリコヌトである。
レヌンは圓初の野性型DNAが増幅の前にDde
により開裂されたこず以倖は䞊蚘したものず同
じ反応のアリコヌトである。レヌンは鎌状赀血
球貧血β−グロビン察立遺䌝子に぀いおホモ接合
䜓であるヒトDNAを増幅の前にDdeで凊理し
たこず以倖は䞊蚘ず同様な反応のアリコヌトであ
る鎌状赀血球貧血察立遺䌝子は増幅される断片
内にDde郚䜍を含たない。レヌンは鮭の粟
子DNAでヒトDNAを眮き換えた以倖は䞊蚘ず同
様の反応のアリコヌトである。レヌンは増幅埌
反応液をDdeで凊理したこず以倖は䞊蚘ず同様
な反応のアリコヌトであるDdeは58塩基察の
野性型生成物を27塩基䜓及び34塩基䜓の断片に倉
換する。レヌンは増幅埌Ddeで凊理したレ
ヌンの材料のアリコヌトである58塩基察の鎌
状赀血球貧血生成物はDdeを含たない。 アガロヌスゲルの臭化゚チゞりム染色のみを䜿
甚しおヒトDNAのマむクログラムからの単コ
ピヌ遺䌝子を代衚する58塩基察断片を怜出するた
めには、玄500000倍に増幅するこずか必芁であ
る。これは、ここで぀のオリゎヌクレオチドの
ネスト状セツトを䜿甚しお達成するこずができ
る。第のセツトは110塩基察断片を増幅し、内
郚のネスト状セツトは、第図に瀺すように䟿
利に怜出できるレベルになるたでこの生成物のサ
ブヌ断片を増幅する。先行する増幅工皋で増幅さ
れた配列䞭に含たれ、又他のプラむマヌの䌞長生
成物䞭にも含たれるより小さな配列をプラむマヌ
を䜿぀お増幅する本法は、䟋えばコナヌらの
PNAS80å·»278頁1983幎及びレアリヌらの
PNAS80å·»4045頁1983幎に蚘茉されおいるよ
うに攟射性同䜍䜓又は非攟射性同䜍䜓プロヌブの
ハむブリダむれヌシペンの方法論に頌るこずな
く、β−グロビンの座における野性型を鎌状赀血
球貧血察立遺䌝子から区別するこずを可胜にす
る。 実斜䟋 11 本法は患者のDNA詊料䞭の䟋えばクラミゞア
のような䌝染性疟患ず関連する特定の配列を、所
望の増幅された配列を含むビオチン化されたハむ
ブリダむれヌシペンプロヌブを䜿甚しか぀前述の
米囜特蚱第4358535号に蚘茉された方法を䜿甚し
お怜出する際に有甚であるこずが期埅される。ビ
オチン化されたハむブリダむれヌシペンプロヌブ
は、䞀郚が二重鎖ずな぀たDNAに、次匏のスペ
ヌサヌアヌムを介しおビオチンに結合した4′−メ
チレン眮換−−−トリメチルプ゜ラレ
ンを挿入しか぀光を照射するこずにより調補する
こずができる。 匏䞭は−又はCHO基であり、R″は−で
あり、は〜の数であり、そしおは〜
の数である。プロヌブ䞊のビオチニル基の怜出
は、゚ンゟバむオケム瀟により垂販されおいるス
トレプタビゞン−酞性フオスフアタヌれ耇合䜓を
甚いお、パンフレツトに補造者が瀺しおいる怜出
方法により達成するこずができる。ハむブリダむ
れヌシペンプロヌブは、怜出甚耇合䜓ずの結合、
及びそれに続く酞性ホスフアタヌれにより觊媒さ
れる反応この反応が沈柱性色玠を生成するに
基く沈柱した染色スポツトずしお芋るこずができ
る。 材料の寄蚗 现胞系SC−CTCC0082は、1985幎月
19日、米囜、20852、メリヌランド州ロツクビル
パヌクロヌンドラむブ12301に所圚するアメリカ
ン・タむプ・カルチダヌ・コレクシペン
ATCCにATTT受理番号第CRL8756号ずしお
寄蚗された。SC−の寄蚗は、ATCCず本特蚱
出願人のシヌタス・コヌポレヌシペンずの間の契
玄に埓぀お行われた。ATCCずの契玄は、本寄蚗
を蚘茉しか぀特定する米囜特蚱が発行された堎合
又は米囜又は倖囜特蚱出願が公衆に公告された堎
合又は公開された堎合のいずれか早い方が来たず
きにこの现胞系の子孫を公衆がそれを氞続的に利
甚できるようにするために提䟛し、曎に本现胞系
を利甚させるこずに぀いおは、米囜特蚱商暙局長
官が米囜特蚱法第122条及びそれに関する長官の
ルヌル37CFR1、14条も特に886OG638に関連
しお含むに埓぀お暩限を持぀お決定した人間に
察しおも行う。本出願の護受人はもし寄蚗した现
胞系が奜適な条件䞋で培逊したにもかかわらず、
死滅し、倱われ、損傷したずきは通知を受けおか
ら迅速に同じ现胞系の育成培逊基ず眮き換えるこ
ずに同意する。 纒めるず、本発明はたず぀又はそれ以䞊の特
定の栞酞を、プラむマヌの䌞長により生産される
生成物が匕き続き次のプラむマヌの䌞長反応の鋳
型ずしおの圹割を果たすような連鎖反応を甚いお
増幅させるこずにより栞酞䞭の配列を怜出するよ
うにした方法を提䟛する。本法は圓初にほんの僅
かの量しか含たれおいない栞酞配列を怜出するた
めに特に有甚である。曎に増幅法は分子クロヌニ
ングにも䜿甚するこずができる。
【図面の簡単な説明】
第図は、増幅されるこずが望たれるヒトβ−
グロビンの94塩基察長の配列を瀺すものであり、
鎌状赀血球貧血に䌎う単䞀塩基察倉化を94merの
䞋方に描いおある。第図は、ヒトの野性型
DNA䞭、及び正垞のβ−グロビン遺䌝子の1.9kb
のAamHI断片を含むプラスミドpBR328
HbAず瀺される䞭に含たれる䞊蚘94merの増
幅を瀺す臭化゚チゞりムで染色されたポリアクリ
ルアミドのゲルの写真である。第図は、
pBR328BbA、及びβ−グロビンの鎌状赀血球
貧血察立遺䌝子の1.9kbのBamHI断片を含有する
プラスミドpBR328HbSず称する䞭に存圚
する特定の暙的94mer配列のいずれかの増幅を瀺
すポリアクリルアミドゲル電気泳動のオヌトラゞ
オグラフを瀺し、pBR328HbAでは増幅される
べき配列がMstにより開裂され、そしお
pBR328HbSでは増幅されるべき配列が凊理さ
れたMstにより開裂されなか぀た。第図は、
぀のオリゎヌクレオチドプラむマヌを甚いる
サむクルに぀いお、ヒトβ−グロビンの所望の
94mer、配列の増幅のためのポリメラヌれ連鎖反
応のステツプず生成物の詳现を瀺すものである。
第図は、pBR328HbA䞭の240mer配列の
サむクル埌の増幅を瀺す臭化゚チゞりムで染色さ
れたポリアクリルアミドのゲルを瀺す写真であ
り、ここはアリコヌトがNCoレヌン、Mst
IIレヌン又はHinfIレヌンにより消化
される。レヌンは分子量の基準で、レヌンは
無傷の240bpの生成物を含んでいる。第図は、
Pde及びHinfI制限郚䜍間にある正垞なβA
β−グロビン遺䌝子及び鎌状赀血球βSβ−グ
ロビン遺䌝子の配列を瀺すもので、βAに぀いおの
本線はDde郚䜍CTGAGの䜍眮を瀺し、
βA及びβSに぀いおの重線はHinfI郚䜍
GACTCの䜍眮を瀺しおいる。第図は、
40merプロヌブ、䞊びDde及びこれに続くHin
fI制限酵玠を甚いる正垞β−グロビンの逐次的な
消化の結果を瀺すものである。第図は、第図
ず同じ40merプロヌブ䞊びにDde及びこれに続
くHinfI制限酵玠を䜿甚する鎌状β−グロビンの
逐次的な消化の結果を瀺すものである。第図
は、この発明の増幅にかけられた党ヒトDNAの
詊料䞭に存圚するβ−グロビン察立遺䌝子を特異
的に特城付けるための、第図ず同じ40merプロ
ヌブの䜿甚を瀺す、臭化゚チゞりムで染色された
ポリアクリルアミドのゲルを瀺す写真である。第
図は、臭化゚チゞりムを玫倖線を甚いお芖芚
化したのNuシヌブアガロヌスゲルの写真を
瀺すものである。この写真は、110−bp増幅生成
物のサブ−フラグメントの増幅を瀺し、このサブ
−フラグメントは110bp断片内の内郚ネストであ
る。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  同䞀の長さ又は異る長さの぀の別個の盞補
    的鎖から成る栞酞又はその混合物䞭に含たれる少
    なくずも皮類の特定の栞酞配列の増幅方法であ
    ぀お、 (a) 前蚘鎖を、以䞊のオリゎヌクレオチドプラ
    むマヌにより凊理しお、増幅されるべき栞酞配
    列に぀いお該栞酞配列の鎖に盞補的なプラむマ
    ヌの䌞長生成物を合成し、ここで、前蚘プラむ
    マヌは、特定の栞酞配列の鎖ず実質的に盞補的
    であり、䞔぀増幅されるべき栞酞配列の䞡端を
    芏定し、各プラむマヌから合成された䌞長生成
    物がその盞補䜓から分離された堎合に曎なる合
    成のための鋳型ずしお機胜するこずができるよ
    うに遞択され (b) 前蚘プラむマヌ䌞長生成物をそれらが合成さ
    れた鋳型から分離しお単鎖分子を生成せしめ
    そしお (c) 段階(b)から生じた単鎖分子を段階(a)のプラむ
    マヌにより凊理しお、段階(b)においお生成した
    各単鎖分子を鋳型ずしお甚いおプラむマヌ䌞長
    生成物を合成する こずを含んで成る方法。  段階(b)及び(c)を少なくずも回反埩するこず
    を特城ずする特蚱請求の範囲第項に蚘茉の方
    法。  段階(b)を倉性により、又は酵玠ヘリカヌれを
    䜿甚しお行うこずを特城ずする特蚱請求の範囲第
    項又は第項に蚘茉の方法。  段階(b)及び(c)を重合誘導剀を䜿甚しお行なう
    こずを特城ずする特蚱請求の範囲第項〜第項
    のいずれかに蚘茉の方法。  段階(a)及び又は(c)を、E.コリE.coli
    DNAポリメラヌれ、E.コリDNAポリメラヌれ
    のKlenow断片、T4DNAポリメラヌれ、熱安
    定酵玠又は逆転写酵玠から遞択された重合誘導剀
    を䜿甚しお行うこずを特城ずする特蚱請求の範囲
    第項〜第項のいずれか項に蚘茉の方法。  段階(a)及び(c)を皮類の異なるヌクレオシド
    トリホスプヌトを甚いお行うこずを特城ずする
    特蚱請求の範囲第〜第項のいずれか項に蚘
    茉の方法。  前蚘栞酞がDNAであるこずを特城ずする特
    蚱請求の範囲第項〜第項のいずれか項に蚘
    茉の方法。  前蚘栞酞がDNAであり、そしお前蚘プラむ
    マヌがオリゎデオキシリボヌクレオチド類である
    こずを特城ずする特蚱請求の範囲第項〜第項
    のいずれか項に蚘茉の方法。  プラむマヌの集合を各盞補的鎖のために䜿甚
    し、それらプラむマヌの぀は前蚘鎖ず実質的に
    盞補的であるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第
    項〜第項のいずれか項に蚘茉の方法。  段階(a)においお䜿甚される栞酞の混合物が
    段階(c)においお定矩されるように生成される先行
    する増幅工皋の生成物であるこずを特城ずする特
    蚱請求の範囲第項〜第項のいずれか項に蚘
    茉の方法。  䜿甚されるプラむマヌが先行する増幅工皋
    で䜿甚されたプラむマヌず異るこずを特城ずする
    特蚱請求の範囲第項〜第項のいずれか項
    に蚘茉の方法。  のプラむマヌが、増幅されるべき特定の
    配列ず盞補的でない少なくずも個のヌクレオチ
    ドを含有するこずを特城ずする特蚱請求の範囲第
    項〜第項のいずれか項に蚘茉の方法。  段階(a)及び(c)におけるプラむマヌがそれぞ
    れ少なくずも1000のプラむマヌ盞補的鎖の
    モル比で存圚するこずを特城ずする特蚱請求の範
    囲第項〜第項のいずれか項に蚘茉の方
    法。  前蚘栞酞が単鎖RNAたたは単鎖DNAから
    合成されるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第
    項〜第項のいずれか項に蚘茉の方法。  前蚘RNAがメツセンゞダヌRNAであるこ
    ずを特城ずする特蚱請求の範囲第項に蚘茉の
    方法。  前蚘増幅されるべき特定の栞酞配列が耇数
    の栞酞の混合物䞭に含たれるこずを特城ずする特
    蚱請求の範囲第項〜第項のいずれか項に
    蚘茉の方法。  前蚘増幅されるべき栞酞配列が、最初によ
    り倧きな栞酞䞭に含有されおいるこずを特城ずす
    る特蚱請求の範囲第項〜第項のいずれか
    項に蚘茉の方法。  前蚘プラむマヌの′−末端が盞補的でな
    いこずを特城ずする特蚱請求の範囲第項〜第
    項のいずれか項に蚘茉の方法。  前蚘段階(a)及び(b)を熱安定性DNAポリメ
    ラヌれ酵玠を甚いお行うこずを特城ずする特蚱請
    求の範囲第項〜第項のいずれか項に蚘茉
    の方法。  前蚘段階(a)及び(c)におけるプラむマヌがそ
    れぞれ少なくずも106のプラむマヌ盞補鎖
    のモル比で存圚するこずを特城ずする特蚱請求の
    範囲第項〜第項のいずれか項に蚘茉の方
    法。  前蚘段階(b)及び(c)を少なくずも10回反埩す
    るこずを特城ずする特蚱請求の範囲第項〜第
    項のいずれか項に蚘茉の方法。  前蚘特定の栞酞配列が本のRNA鎖ず
    本のcDNA鎖から成るこずを特城ずする特蚱請求
    の範囲第項〜第項及び第項〜第項のい
    ずれか項に蚘茉の方法。  前蚘プラむマヌの䞀方がプロモヌタヌをコ
    ヌドしおいるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第
    項〜第項のいずれか項に蚘茉の方法。
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