JPS61274697A - 核酸配列の増幅及び検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、もしテスト試料中に存在するならばその存在
する核酸配列を増幅し、プローブを用いてそれを検出す
るための方法に関する。より詳細には本発明は、与えら
れたＤＮＡ又はＲＮＡ配列から初期に存在する量に比較
してより大量の任意の特定の核酸配列を生成せしめ、該
配列の検出を容易にする方法に関する。該ＤＮＡ又はＲ
ＮＡは単鎖又は二重鎖であってもよく、比較的純粋であ
っても核酸の混合物の一成分であってもよい、本発明の
方法では、所望の核酸配列の増幅を達成するために反応
を繰り返し行うようにする。

〔従来の技術〕

特に診断上の用途のためには、標的核酸配列は問題のＤ
ＮＡ又はＲＮＡのほんの僅かな部分であることがあり、
非同位体！ＸＩｗｉ又は末端４Ｕａオリゴヌクレオチド
プローブを使用するのではその存在を検出することは困
難である。プローブ検出システムの感度を向上させるた
めに多くの労力が費やされているが、現在利用できる方
法を用いて容易に検出できるに充分な量を得るために、
標的配列を増幅するような研究は殆ど行われていない。

核酸を初めから、あるいは既存の配列から合成する方法
がいくつかの文献に記載されている。これらの方法は、
完全に特定された配列の与えられた核酸を大量に生産す
ることを可能にするものである。

核酸を初めから合成する１つの既知方法は、ヌクレオシ
ド誘導体からの核酸の有機合成を含むものである、この
合成は溶液中又は固体担体上で行われる。有機合成の１
つのタイプはリン酸トリエステル法であり、これは遺伝
子断片又は短い遺伝子を調製するために利用され゛る。

リン酸トリエステル法では、オリゴヌクレオチドが調製
され、次にこれは結合されてより長鎖の核酸を形成する
。

この方法は、Ｓ、Ａ、ナーランクらにより、抛旦。

且鉦駐１．６８＠９０頁（１９７９年）及び米国特許第
４．３５６，２７０号に開示されている。該特許は、ソ
マトスタチン遺伝子の合成とクローニングを開示しいる
。

有機合成の第２のタイプはリン酸ジエステル法であり、
これはトランスファーＲＮＡ遺伝子の調製に利用されて
いる。この方法はＥ、Ｌ、ブラウンらによりハ止、ハ■
懸１．６８巻１０９頁（１９７９年）に開示されている
。リン酸トリエステル法と同じように、リン酸ジエステ
ル法もオリゴヌクレオチドの合成を含み、これらが実質
的に結合されて所望の核酸が形成される。

上記した初めからの合成法は核酸の長鎖を合成するため
に利用されるが、核酸を大量合成するための実用的方法
ではない０両法とも労力と時間を消費し高価な装置と試
薬を必要としかつ全体収率が低い、全体収率が低いのは
、オリゴヌクレオチドの合成とそれらを結合する反応が
非効率的であることに起因する。長鎖の核酸を合成する
際あるいは短鎖の核酸を大量に合成する場合でさえも、
多くのオリゴヌクレオチドを合成し多くの結合反応を行
うことが要求される。従ってこれらの方法は任意で所望
の核酸を大量に合成するには実用的ではない。

初めに存在する少量の核酸から大量の核酸を生産する方
法も存在する。これらの方法は好適な宿主系内での核酸
のクローニングを含み、ここでは所望の核酸は宿主の形
質変換に使用される好適なベクター中に挿入される。宿
主が培養されるとベクターが複製され、所望の核酸のコ
ピーが生産される。核酸断片のサブクローニングについ
ては、Ｔ、マニアチスらにより、コールド・スプリング
・ラボラトリ−のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　
　３９０−４０１頁（１９８２年）に節単に記述されて
いる。この技術については米国特許第４，４１６，９８
８号及び４　、４０３　、０３６号にも記述されている
。

米国特許第４．２９３．６５２号に記載されている核酸
の第３の合成法は、上述の有機合成と分子クローニング
法を合わせたものである。咳法では、所望の核酸配列を
作り上げるのに必要な好適な数のオリゴヌクレオチドを
初めに合成し、次にこれらを次の挿入の前に増殖により
増幅されるベクターに挿入する。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、この分子クローニング法に幾らかの類似性を
をしている。しかし本発明はいかなる生物の繁殖をも含
まず、従って繁殖に伴って起こり得る危険や不都合を回
避することができる０本発明は所望の核酸と関連しない
核酸の合成を必要とせず、従って本発明によれば禎雑な
生物学的混合物からコストをかけて生成物を精製するこ
とも回避できる。

本発明はプライマーと重合試薬を用いて１種の核酸又は
複数の核酸の混合物中に存在する１又は２以上の特定の
核酸配列を増幅し、かつ増幅した配列を検出する方法で
ある。１つのプライマーの伸長生成物は、他のプライマ
ーとハイブリダイズしたときに所望の特定の核酸配列の
生成のための鋳型となり、又その逆も起こる。そしてこ
のプロセスは所定量の配列が生成するまで必要なだけ繰
り返される。標的配列から大量の核酸を比較的短時間で
生産するためには、本方法は上記の従来法より効率的で
あると期待される。本方法は核酸混合物に僅かしか含ま
れていない核酸種を増幅し、核種を効率的に検出するた
めに特に有用である。

〔問題点を解決するための手段〕

更に特定すると、本発明は、１種の核酸又は複数の核酸
の混合物を含む試料中の少なくとも１種の特定の核酸配
列が存在するか否かを検出し、あるいは試料中の２個の
異なった配列を区別する方法であって、該試料は該配列
を含むと思われるものであり、 （ａ）前記試料を、試料中に存在すると思ｆ）れるそれ
ぞれの異なった特定の配列の各ストランド用のオリゴヌ
クレオチドプライマーにより・専食出されるべきそれぞ
れの異なった特定の配列の各ストランドについて各核酸
ストランドに相補的な各プライマーの伸長生成物が合成
されるようなハイブリダイゼーション条件下で処理し、
ここで前記プライマーは、実質的に各特定の配列のスト
ランドに相補的であるように選択され、１つのプライマ
ーから合成された伸長生成物が、それが相補体から分離
されたときに他のプライマーの伸長生成物の合成のため
の鋳型としての役割を果たし；（ｂ）検出すべき配列が
存在すれば、変性条件下で前記試料を処理して鋳型から
プライマーの伸長生成物を分離し； （ｃ）前記試料をオリゴヌクレオチドプライマーにより
、ステップ（ｂ）で生成した各単鎖を鋳型として使用し
てプライマーの伸長生成物が合成されるように処理し、
もし存在するならば前記特定の配列の増幅を生じさせる
； （ｄ）ステップ（ｃ）の生成物に、検出されるべき配列
又はその変異体にハイブリダイズすることができる！！
識されたプローブを加え；（ｅ）　該ハイブリダイゼー
シヨンが生じたかを否かを決定する： ことから成る方法を提供する。

ステップ（ａ）から（ｃ）は、逐次的に行っても同時に
行ってもよい、更にステップ（ｂ）と（ｃ）は配列の増
幅が所望のレベルに達するまで繰り返してもよい。

他の態様では本発明は、ｌ又は２以上の核酸を含む試料
中の少なくとも１つの特定の核酸配列（該核酸の少なく
とも１つがこの配列を含有すると思われる）を検出する
ためのキットであって、（ａ）検出されるべきそれぞれ
異なった配列の各ストランド用の１又は複数のプライマ
ーのためのコンテナー；　（このプライマーは各特定の
核酸配列の各ストランドに実質的に相補的であって、１
つのプライマーから合成された伸長生成物がその相補体
から分離されたときに、他のプライマーの伸長生成物合
成用の鋳型としての役割を果たすことができる） （ｂ）重合試薬を収容するコンテナー；（ｃ）４つの異
なったヌクレオシド三リン酸用のコンテナー； （ｄ）前記試料中の前記配列の存在を検出できるプロー
ブを収容するコンテナー；及び（ｅ）該プローブと該配
列のバイブリドを検出する手段を収容するコンテナー； を有するパフケージタイプの多コンテナー型ユニットか
ら成る診断用キットに関する。

本発明の更に他の態様によれば、１種の積数又は複数の
核酸の混合物中に含まれる特定の核酸配列をベクター中
へクローニングする方法であって、（ａ）増幅されるべ
きそれぞれの異なった特定の配列の各ストランド用のオ
リゴヌクレオチドプライマーにより、増幅されるべきそ
れぞれの異なった特定の配列の各ストランドについて各
核酸螺旋に相補的な各プライマーの伸長生成物が合成さ
れるような条件下、前記核酸を処理し、かつここで前記
プライマーは、各特定の配列のストランドに実質的に相
補的であるように選択され、１つのプライマーから合成
された伸長生成物が、それが相補体から分離されたとき
に他のプライマーの伸長生成物合成の鋳型としての役割
を果たすものであり、更に該プライマーはそれぞれその
５”末端に、他のプライマーの制限部位と同じが異なっ
た制限部位を有するものであり； （ｂ）その上で単鎖分子が合成された鋳型からプライマ
ーの伸長生成物を分離するし；（ｃ）オリゴヌクレオチ
ドにより、ステップ（ｂ）で生産された単鎖分子を、ス
テップ（ｂ）で生成された各ｓ鎖を鋳型として使用して
プライマーの伸長生成物が合成されるように処理し、こ
こで増幅されるべき特定の配列に依存してステップ（ａ
）と（ｃ）をＯから有効量までのジメチルスルフオキシ
ドの存在下、あるいは約４５℃までの温度のもとで行い
； （ｄ）ステップ（ｃ）の生成物に各制限部位用の制限酵
素を加えて、制限消化中に開裂した生成物を得る；そし
て （ｅ）開裂した生成物を１又は２以上のクローニングベ
クターに連結する°； ことから成る方法に関する。

更に他の態様では、本発明は、合成すべき核酸断片より
少ないヌクレオチドを有する既存の核酸断片と２つのオ
リゴヌクレオチドとから核酸断片を合成する方法であっ
て、該合成すべき核酸は左方のセグメント、中央のセグ
メント及び右方のセグメントから成り、該中央のセグメ
ントは少なくとも実質的に前記既存の核酸断片のヌクレ
オチド配列を意味し、左右のセグメントは２つのプライ
マーの５°末端に存在するヌクレオチド配列を意味し、
これらの３°末端は前記既存の核酸のストランドを分離
することにより生ずる単鎖の３°末端に相補的かあるい
は実質的に相補的であり；そして （ａ）各核酸のストランドに相補的である各プライマー
の伸長生成物が合成されるような条件下で、前記既存断
片のストランドを２つのオリゴヌクレオチドプライマー
で処理し、ここで、該２つのプライマーは、一方のプラ
イマーから合成される伸長生成物が相補体から分離され
たときに他のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳
型としての役割を果たすように、前記既存断片の各スト
ランドの３°末端と実質的に相補的であるように選択さ
れ、そして各プライマーはその５°末端において前記既
存断片と相補的でなく、合成すべき核酸断片の２つの末
端に対応するヌクレオチドの配列を含むものであり； （ｂ）その上でプライマー伸長生成物が生産された鋳型
からプライマー伸長生成物を分離して単鎖分子を生成せ
しめ；そして （ｃ）ステップ（ｂ）において生成した各単鎖をプライ
マーとして用いてプライマー伸長生成物が合成される条
件下で、ステップ（ｂ）から生じた単鎖分子をスンテプ
（ａ）のプライマーにより処理し、こうして２つの中間
二重鎖核酸分子（このそれぞれにはオリゴヌクレオチド
プライマーの一方の５°末端の核酸配列が導入されてい
る）と２つの十分な長さの二重鎖核酸分子（このそれぞ
れには、オリゴヌクレオチドプライマーの両方の５°末
端の核酸配列が導入されている）とを生成せしめ； （ｄ）前記十分な長さの二重鎖分子の有効量を生産する
のに十分な回数ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）を操り
返し； （ｅ）ステップ（ｄ）の生成物のストランドを２つのプ
ライマーで処理して、ステップ（ｄ）の生成物が両末端
において伸びるように処理し；そして （ｆ）中央セグメントとしてのステップ（ｄ）の生成物
及び、ステップ（ｄ）の生成物の鎖を分離することによ
り生産される単鎖の３°末端と相補的か実質的に相補的
である２つのオリゴヌクレオチドプライマーをして使用
しながらステップ（ａ）からステップ（ｄ）までを繰り
返す；ことから成る方法に関する。

前記中央断片は、 （ａ）他方のオリゴヌクレオチドの３°末端と相補的で
ある核酸配列を３°末端に有し、かつ両５°末端は相互
に相補的でない２つのオリゴヌクレオチドを、重合試薬
及び４つのヌクレオチド三リン酸と、各核酸ストランド
と相補的である各オリゴヌクレオチドの伸長生成物が合
成されるような条件下で反応させる； （ｂ）該伸長生成物を、それらがその上で合成された鋳
型から分離して、単鎖分子を得；（ｃ）ステップ（ｂ）
で生じた単鎖分子を、ステップ（ｂ）で生成された単鎖
を鋳型として使用することによりプライマーの伸長生成
物が合成されるような条件下で、ステップ（ａ）のオリ
ゴヌクレオチドで処理して中央断片の増幅を行う；こと
から成るステップにより得ることができる。

〔具体的な説明〕

プライマー、プローブ、検出すべきオリゴマー断片、オ
リゴマ一対照体、及び標識されていないブロッキングオ
リゴマーに関して使用される「オリボヌクレオチド」と
いう用語は、２又はそし以上の好ましくは３より多くの
デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから成
る分子として定義される。その正確な太き・さは多くの
因子ニ依存し、その因子はオリゴヌクレオチドの究極的
な機能と用途に依存する。

ここで使用される「プライマー」という用語は、精製さ
れた制限消化物として自然に存在しあるいは合成的に調
製されたオリゴヌクレオチドを意味し、このプライマー
は、例えば好適な温度及びｐＨでヌクレオチドとＤＮＡ
ポリメラーゼのような重合試薬が存在するような、核酸
ストランドに相補的なプライマーの伸長生成物の合成が
誘発される条件下に置かれたときに合成開始点として機
能することができる。該プライマーは増幅効率を最大に
するため単鎖であることが好ましいが、その代わりに二
重鎖であってもよい、二重鎖であると、プライマーは伸
長生成物を調製するために使用される前にまずその鎖を
分離するために処理される。プライマーはオリゴデオキ
シリボヌクレオチドであることが好ましい、プライマー
は、重合試薬の存在下で伸長生成物の合成を開始するた
めに十分な長さでなければならない、プライマーの正確
な長さは、温度やプライマー源を含む多くの因子に依存
する０例えば、目的とする配列の複雑さに依存してオリ
ゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５から２５又
はそれより多くのヌクレオチドを含むが、より少ないヌ
クレオチドを含むものであってもよい、短いプライマー
分子は、鋳型とともに十分安定なバイブリドの複合体を
形成するために、より低い温度を要求する。

プライマーは増幅されるべき各特定配列の異なるストラ
ンドと「実質的」に相補的であるように選択される。こ
のことはプライマーはそれぞれのストランドとハイブリ
ダイズするに十分に相補的でなければならないことを意
味する。従ってプライマーの配列は鋳型の配列を正確に
反映する必要はない０例えば相補的でないヌクレオチド
断片を、プライマーの配列の残部がストランドに相補的
であるようにプライマーの５°末端に結合させてもよい
０代わりに、プライマーの配列が増幅されるべきストラ
ンドの配列と十分な相補性を有していてそれらとハイブ
リダイズし、それによって他方のプライマーの伸長生成
物合成用鋳型を形成するならば、相補的でない塩基又は
より長い配列がプライマー内に散在してもよい。

本発明で使用される「制限エンドヌクレアーゼ」及び「
制限酵素」という用語は、二重ｔ）Ｗ　Ｄ　Ｎ　Ａを特
定の核酸配列又はその近傍で切断するような細菌性酵素
を意味する。

本発明で使用されるｒＤＮＡの多形現象」という用語は
、ＤＮＡ中の特定部位に２又はそれより多くの異なった
ヌクレオチド配列が存在できる状態を意味する。

［制限断片長さの多形現象（ＲＡＬＰ）Ｊという用語は
、特定の制限エンドヌクレアーゼによる消化により形成
される制限断片の長さに個体間の相違があることを意味
する。

本発明は、核酸中に存在すると思われる１又はそれ以上
の所望の特定の核酸配列を増幅する方法に関する０本法
によれば大量の特定の配列を調製できるので、本発明は
ＤＮＡ又はメツセンジャーＲＮＡのクローニング効率を
改良し、かつ標的配列を増幅してその検出を容易にする
ために使用することができる。

−ａに、本発明の方法は、用いられる反応ステップの数
に比較して指数的な収量で少なくとも１つの特定の核酸
配列を生産する連鎖反応を含み、該配列は（ａ）必要と
される末端が、それとハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドを合成できるに十分な程度に詳細に知られており
、（ｂ）連鎖反応を開始するための配列が入手可能であ
ることが条件となる。連鎖反応で得られる生成物は、使
用した特定のプライマーの末端に対応する末端を有する
ような個別的な核酸のデュプレツクスである。

精製された状態でも精製されていない状態でもよい任意
の核酸源を、所望の特定の核酸配列を含むと思われるの
であれば、出発核酸として使用できる。従って末法では
、例えば単鎖であっても二重鎮であってもよいＤＮＡ又
はＲＮＡ例えばメツセンジャーＲＮＡを使用することが
できる。更にそれぞれ１つの鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡの
バイブリドを使用してもよい、これらの核酸の混合物を
使用してもよく、又先行する増幅反応において同じか又
は異なったプライマーを用いて生産された核酸を使用し
てもよい、増幅すべき特定の核酸配列は大きな分子の一
部であってもよく、特定の配列が核酸全体を構成するよ
うにはじめから個別的な分子として存在していてもよい
、増幅すべき配列は初めから純粋な状態で存在する必要
はな（、該配列は、複雑な混合物の小部分、例えば全ヒ
トＤＮＡ中のβ−グロビン遺伝子、又は特定の生物的試
料の掻く僅かの部分のみを構成する特定の微生物に起因
する核酸配列の部分であってもよい。

出発物質としての核酸は、同じか又は異なった２以上の
所望の特定の核酸配列を含んでいてもよい。

従って本発明の方法は、１つの特定の核酸配列を大量に
生産するだけでなく、同じか又は異なった核酸分子上に
位置する２以上の異なった特定の核酸配列の同時増幅に
も有用である。

核酸は、例えばｐＢＲ３２２のようなプラスミド、クロ
ーン化されたＤＮＡ又はＲＮＡ、又は細菌、酵母、ビー
ルス及び植物や動物などの高級生物等の自然にあるＤＮ
Ａ又はＲＮＡ等の任意源から得ることができる。ＤＮＡ
又はＲＮＡは、例えばマニアチスらによりＭｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　の２８０から２８１頁（１９
８２年）に記載されているような種々の技術により、血
や絨毛又は羊膜細胞等の組織物質から抽出することがで
きる。

本発明方法により、任意の特定の核酸配列を生産するこ
とができる。配列の両末端の十分な数の塩基が十分詳細
に分かっており、これにより所望の配列の異なった複数
のストランドに対し、かつ該配列に沿った次のような相
対位置にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチド
プライマーを調製する゛ことができればよく、すなわち
、１つのプライマーから合成伸長した生成物が、鋳型（
相補体）から分離されたときに、限定された長さの核酸
中へ他のプライマーを伸長させるための鋳型としての役
割を果せばよい、配列の両末端の塩基に関する知識が増
加するほど目的とする核酸配列のためのプライマーの特
異性も大きくなり、従って末法の有効性も大きくなる。

以後使用するブラ゛イマーという用語は、特に増幅すべ
き断片の末端配列に関する情報にいくらかの曖昧さがあ
る場合には、１より大きい数のプライマーを意味するも
のと理解されるべきである０例えば、核酸配列が蛋白質
配列の情報から推測できる場合、遺伝子コードの縮重に
起因する全ての可能なコドン変化を示す配列を含むプラ
イマーを集めて各鎖用として使用する。このような集合
のうちの１つのプライマーは、増幅すべき所望配列の末
端と一敗する。

オリゴヌクレオチドプライマーは任意の好適な方法、例
えば上記したリン酸トリエステル法及びリン酸ジエステ
ル法又はそれらのオートメーション化された方法を使用
して調製することができる。

このようなオートメーション化された方法のうちの１つ
によれば、ビューケージらによりＴｅｔｒａｈｅｄ−ｒ
ｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ２２巻１８５９−１８６２頁に記
載されている１ｌｌｌす、ジエチルフォスフォロアミダ
イトを出発物質として使用して合成することができる。

修飾された固体担体上でのオリゴ・ヌクレオチド合成の
１つの方法が米国特許第４，４５８．０６６号に記載さ
れている。生物源（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化
物）から分離したプライマーを使用することも可能であ
る。

特定の核酸配列は、該配列を鋳型として含む核酸を使用
して生産される。核酸が２つの鎖を含んでいるときは、
別のステップとしてでもプライマーの伸長生成物の合成
と同時でもよいが、該核酸は鋳型として使用される前に
鎖を分離する必要がある。この鎖分離は、物理的、化学
的及び酵素的方法を含む任意の好適な変性法により行う
ことができる。核酸の鎖を分離する１つの物理的方法は
、完全に（９９％以上）変性されるまで核酸を加熱する
ことを含む、典型的な加熱変性は８０から１５０℃で１
から１０分間加熱することを含む、鎖の分離は、ヘリカ
ーゼ、又はヘリカーゼ活性を有しリボＡＴＰの存在下で
ＤＮＡを変性させるものとして知られる酵素ＲｅｃＡと
して知られる酵素類からの１酵素により誘発させること
もできる・ヘリカーゼで核酸の鎖を分離するのに好適な
反応条件はターン　ホフマン　→−リングにより並ＬＱ
ｕａｎｔｉ田ｔｉｖａ　Ｂｉｏｉｏ　　（７）’４３　
カラ６３　’Ｒ（１９７８年）ニ記載すレ・Ｒｅ　ｃＡ
を使用する技術は、Ｃ，ラディングによりＡｎｎ、Ｒｅ
ｖ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓの１６巻４０５から４３７頁に
記載されている。

増幅すべき配列を含む当初の核酸が単鎖であると・その
相補体をそれに１つ又は２つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーを加えて合成する。好適な単一プライマーが加え
られると、プライマー、重合試薬及び後述する４つのヌ
クレオチドの存在下でプライマー、の伸長生成物が合成
される。生成物は部分的に単鎖の核酸と相補的で、核酸
鎖とハイブリダイズして長さの異なるデュプレックスを
形成し、これは上記した通り単鎖に分離され、相補的な
２つの分離された鎖となる０代わりに２つの好適なプラ
イマーを単鎖に加えて反応を行うこともできる。

当初の核酸が増幅すべき配列を構成するならば、プライ
マーの伸長生成物は当初の核酸の鎖と完全に相補的とな
り、ハイブリダイズして同じ長さの鎖から成るデュプレ
ックスを形成し、これは分離されて単鎖の分子となる。

核酸の相補的な鎖が分離すると、当初の核酸が二重鎖で
あっても単鎖であっても、その鎖は他の核酸鎖の合成用
鋳型として容易に使用することができる。この合成は任
意の好適な方法を用いて行うことができる０通常それは
好ましくはｐＨが７から９、最も好ましくは８である緩
衝水溶液中で起こる。好ましくは過剰のモル比（クロー
ン化された核酸については、通常ブライマ一対鋳型が１
０００：１、モしてゲノムの核酸については通常プライ
マ一対鋳型が１０’：１）の２つのオリゴヌクレオチド
プライマーを分離された鋳型頷を含む緩衝水溶液中に加
える。しかし末法を診断的用途に使用する場合には相補
的な鎖の量は既知ではないことを理解すべきであり、従
って相補的な鎖の量に関連するプライマーの量を確信を
もって決定することはできない、しかし実際には、増幅
すべき配列が複雑な長鎖の核酸鎖の混合物中に含まれる
場合には、加えられるプライマーの量は相補的な鎖（鋳
型）の量よりも通常モル過剰とする０本法の効率を改良
するためには、大きな過剰モル比とすることが好ましい
。

デオキシリボヌクレオシド三リン酸であるデオキシＡＴ
Ｐ、デオキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ及びＴＴＰの十分
な量も合成混合物に加え、生成する溶液を約９０−１０
０℃で約１から１０分、好ましくは１から４分間加熱す
る。この加熱時間の後、溶液の温度をプライマーのハイ
ブリダイゼーションに好適な２０−４０℃まで下げる。

この冷却した混合物に重合試薬を加え、従来知られてい
る条件下で反応を行わせる。この合成反応は、室温から
それを越えると重合試薬が効率的に機能しない温度まで
の間で行わせることができる。従って例えばＤＮＡボリ
メ、ラーゼを重合試薬として使用するときは、温度を通
常４５℃以上に上昇させない。

シグナルを検出するのに有効な同のジメチルスルフオキ
シド（ＤＭＳＯ）を存在させ、又は温度を３５〜４０℃
とすることが好ましい、最も好ましいのは、５−１０容
量％のＤＭＳＯを存在させ、温度を３５−４０℃とする
ことである。増幅すべき配列がＨＬＡ　　ＤＱ−α又は
−β遺伝子のような１１０を越える塩基対断片であるよ
うな用途の場合には、有効Ｍ（例えば１０容量％）のＤ
ＭＳＯを増幅用混合物に加えかつ反応を３５−４０℃で
行って、検出できる結果を得るか又はクローニングを可
能にする。

重合試薬は、プライマーの伸長生成物の合成を達成でき
るものならば、酵素を含むどのような化合物でも系でも
よい、この目的のための好適な酵素は、例えばＥ、コー
リーＤＮＡポリメラーゼ１１Ｅ、コーリーＤＮＡポリメ
ラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他
の入手できるＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素及び耐熱
性酵素を含む他の酵素を含み、これらは好適な方法でヌ
クレオチドの結合を容易にし、各核酸鎖と相補的である
プライマーの伸長生成物を形成する。一般に合成は各プ
ライマーの３°末端から始まり、合成が終了するまで鋳
型鎖に沿って５′末端方向に向かって進行し、異なった
長さの分子を生成する。

しかし上述の方法と同じ方言を用いて５′末端で合成を
始め、他の方向に向かって反応を進行させる試薬がある
。

新たに合成された鎖とそれと相補性を存する核酸鎖は、
末法のその後のステップにおいて使用される二重鎖分子
を形成する０次のステップでは、二重鎖分子の鎖は上述
の任意の手順を用いて分離され、単鎖分子を提供する。

新たな核酸が該単鎖分子上で合成される。追加の誘導試
薬、ヌクレオチド及びプライマーを、上記に規定した条
件下で反応を進行させるために必要ならば加えてもよい
、オリゴヌクレオチドプライマーの一末端から再度合成
が始まり、そして鋳型の単鎖に沿って進行して他の核酸
を生成する。

このステップの後における伸長生成物の半分は２つのプ
ライマーが結合した特定の核酸配列から成うている。

鎖分離と伸長生成物合成のステップは、特定の核酸配列
を所定量生産するまで必要なだけの回数繰り返すことが
できる。後により詳細に記載するように、特定の核酸配
列は指数的に蓄積する。

最初の核酸又は核酸の混合物から２以上の特定の核酸配
列を生産することが望ましい場合は、好適な数の異なっ
たオリゴヌクレオチドプライマーを使用する０例えば２
つの異なった特定の核酸配列を生成する場合には、４つ
のプライマーを使用する。プライマーのうちの２つは特
定の核酸配列のうちの１つに関するもので、他の２つの
プライマーは第２の特定の核酸配列に関するものである
。

これにより、２つの異なった特定の配列が末法を用いて
指数的に生産され得る０本発明は、各ステップ後に新し
い試薬を加える段階的方法、又は全ての試薬を初期のス
テップで加える同時的方法、又はある与えられた数のス
テップの後に新しい試薬を加える一部段階的で一部同時
的である方法のいずれによっても行うことができる。熱
処理のように重合試薬を不活性化する鎖分離方法を採用
した場合には、熱に対して不安定である酵素の場合がそ
うであるように、各鎖分離ステップ後に重合試薬を補充
することが必要である。へりカーゼのような酵素的手段
を含む多数の精製された成分を鎖分離ステップで使用す
る場合は、同時的方法を使用することができる。同時的
方法では、反応混合物は、所望の配列を含む核酸鎖の他
に、鎖分離酵素（例えばヘリカーゼ）、ｒＡＴＰのよう
な鎖分離酵素への適切なエネルギー供給源、４つのヌク
レオチド、モル過剰のオリゴヌクレオチドプライマー及
びＥ、コーリーＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片の
ような誘導試薬を含むことができる。同時的方法で変性
のために熱を使用するときは、誘導試薬に依存するが好
ましくは　６５−９０℃の高温で機能する熱安定性ポリ
メラーゼ等の熱安定性誘導試薬を使用し、この温度で核
酸は平衡状態にある単鎖と二重鎖から成っている。長さ
の短い核酸には、約５０℃程度の低温が採用される。ど
の程度の高温が使用できるかは、その温度で酵素が失活
するかあるいはプライマーのハイブリダイゼーションが
不十分な程度しか起こらないかどうかに依存する。この
ような熱安定性酵素は、例えばＡ、Ｓ、カレディンらに
よりＢｉｏｋｈｉｍｉハ４５ｍ！　６４４−６５１頁（
１９８０年）に記載されている０本法の各ステップは、
全ての試薬が始めから存在するにもかかわらず、続いて
起こる。必要ならば追加の試薬を加えてもよい。

適切な長さの時間が経過して所望量の特定の核酸配列が
生成した後、任意の公知方法で酵素を失活させるか反応
成分を分離するかして反応を停止させる。

本発明方法は連続的に行ってもよい、オートメーション
化された方法の一態様として、反応を、変性区域、試薬
添加区域及び反応区域を通ってサイクルさせるような方
法がある。他のＢ様では、プライマーの伸長生成物の合
成に使用する酵素をカラム中で固定化することができる
。他の反応成分は連続するカラムと加熱用コイルを通る
ようにポンプを使って連続的に循環され、これにより、
生成した核酸が酵素を失活させることなく繰り返し変性
される。

本発明の概略が下記に示され、ここでは相補的な鎖〔Ｓ
゛〕と〔Ｓ−〕から成る所望配列（Ｓ）を含む二重量Ｄ
ＮＡが核酸として使用されてイル。

第１の及び引き続いて起こる反応サイクルでは・当初の
鋳型上の各オリゴヌクレオチドプライマーの伸長は・プ
ライマーの１つとともにのみ終了する制限のない長さの
、１つの新しい５ｓＤＮＡ分子生成物を生成する。以後
「長鎖生成物」と呼ぶこれらの生成物は直線的に蓄積し
、つまり任意数のサイクルの後に存在する量はサイクル
数に比例する。

このように生産される長鎖生成物は、引き続いて起こる
サイクルの間一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライ
マーの鋳型として機能し、所望配列〔Ｓ０〕又は〔Ｓ−
〕の分子を生成する。これらの分子も一方又は他方のオ
リゴヌクレオチドプライマーの鋳型として機能し、更に
他の〔Ｓ０〕及び（Ｓ−）を生成し、従ってサイクル数
に関連して指数的に（Ｓ）の蓄積を生じさせる連鎖反応
が維持される。

オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより形
成される意図されない副生成物は、それ自身触媒活性が
なく　（稀な例を除り）、従って直線的に蓄積する。

以下余白 増幅される特定の配列（Ｓ）は、次のように図示さく　
Ｓ　’　）　　５’　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ３’（Ｓ−）３″ＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧ　５’好適なオリゴヌクレオチドプライマーは、
プライマー１　：　　ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧプライマー
２　：　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡであり、もしくＳ）を
含むＤＮＡ　： 、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ
ｚ；、、、、ＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＴＴＴ
ＴＴＴＴ丁ＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＺ；が分離されて単鎖になり、その単鎖がプライマ
ー１又はブが４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン
酸の存在下で３°　　　５” 伸長方向　　　　　　　　　　　　ＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
Ｇ、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣ
Ｃｚ；最初の鋳型鎖゛ 最初の鋳型鎖− 、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ｚ；ブライ　マー　２　　へＡＡＡＡへへＡＡＡ　　　
　　　　　　　　　　　　　　イ申顎、ＺＺＺＺＺ２Ｚ
ＺＺＺＺＺＺＺ、、、。

、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、、、。

ライマー２とハイブリダイズすると、次の伸長反応ＤＮ
Ａポリメラーゼで触媒され得る。

プライマー１ ＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺ２ＺＺ、、、。

２２２２２ｚ２２２２２２２２．、、。

方向 上記４つのデエプレソクスが分離されると：５’　ＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸ＋新しく合成された ３’　、　、　、　、　ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚＴＴτＴＴＴＴＴτＴＹＹＹ’第１サイクル
で合成された長い生成′！ＩｙＪ１３’　、、、、ｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＹＹＹ’新しく合成された長い生成物１ ５　’　、　、　、　、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸ：最初の鎖鋳型
゛ ５°　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＩ新
しく合成された ３’　、　、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹ’最初の鋳型鎖− ３’　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹ’新しく
合成された〔 ５’　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸ。

第１サイクルで合成 以下余白 欠の鎖が生ずる。

ＦＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ３’ 〔Ｓ゛〕 ＩＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ　５’！ＹＹＹＹ
ＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ　５’！ＸＸＸＸＸＸＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、、、、　３’：Ｃ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺ、
、、　３’艮い生成物２ （ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚ、、、５’ＪＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ　５’ ＩＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚ、、、　３’された長い生成物２ 一方のプライマーのオリゴヌクレオチド配列と共に終る
鎖及び他方の相補的配列の各類は・生産することが望ま
れている特定の核酸配列（Ｓ）　であることが分かる。

末法のステップは、プライマーｌ及び２、ｆｆｉ合試薬
及び存在するヌクレオチドの量によってのみ限定される
以外、無限に繰り返すことができる。

検出のためには、例えば試料の特性に依存する量である
検出できるシグナルを発生させるために要求される回数
のサイクルを実施する０例えば試料が純粋か希釈された
ものならば、複雑な混合物であるものよりも、少ない回
数しか要求されない。

試料がヒトのゲノムＤＮＡであると、サイクルの回数は
、約１０−５０回が好ましい。

最初の核酸は複製されないので、その量は全工程中一定
である。長鎖生成物は最初の核酸からのみ生産されるの
で、その量は直線的に増加する。

特定の配列の量は指数的に増加する。従って特定の配列
はその量が増加して優勢な成分となる。このことは次表
に示され、該表は各サイクルの効率が１００％であると
した場合のｎサイクル後の理論的に存在する成分量を比
較したものである。

０からｎサイクル′の二重鎖の数 土工り土斂隻！　五亘土底立豊足父凰ユ主Ｌ３　　　　
ｌ　　　　　３　　　　４ １５　　　　１　　　　１５　　　３２．７５２２０　
　　　１　　　　２０　１．０４８．５５５ｎｌｎ２”
−ｎ−１ 単鎖の核酸を鋳型として使用すると、サイクルあたり１
つの長１１住成物が生成する。

末法は好適な発現ベクターに特定の核酸配列を挿入する
ためにクローン化するのに使用できる。

該ベクターは適切な宿主生物を形質転換して標準的な組
み換え体ＤＮＡ技術により遺伝子生成物を生産する際に
使用できる。

通常コのようなりローニングはベクターへの直接の連結
反応又はオリゴヌクレオチドリンカーの付加とそれに引
き続く制限酵素による開裂を含んでいる。しかし画法と
も反応性が不十分である平滑末端の連結反応を含んでい
る。更に画法ともクローニングベクターへの増幅された
生成物を挿入する際の位置とその数を制御することがで
きない。

本増幅工程では、最初の鋳型核酸、期待される標的増幅
生成物及び種々のバックラウンド非標的生成物に由来す
る核酸の混合物が得られる。最初の鋳型ＤＮＡが、例え
ばヘテロ接合二量体遺伝子中におけるような多数の標的
配列を含むか、又は一連の関連した遺伝子群がある場合
にも、増幅された生成物は混合物となる。

末法のプライマーを、増幅反応で生産されるＤＮＡ混合
物の迅速かつ特異的なりローニングを補助するために修
飾してもよい、このような修飾では、同じか又は異なっ
た制限部位がプライマーの５°末端に導入されて増幅さ
れた生成物の２つの末端に制限部位が生じる。好適な酵
素で切断°すると、増幅された生成物は容易にプラスミ
ド又はベクター中に挿入されクローニングされる。この
クローニングは、混合物ではなく、個々の増幅された生
成物分析又は発現を可能にする。

同じ制限部位を両プライマーに使用することができるが
、異なった制限部位を使用すると生成物を特定の方向に
ベクターに挿入することができ、かつ２つのプライマー
のうちの１つのみに起因する増幅から生ずる挿入だけで
なく多数の挿入も抑制することができる。単鎖配列決定
用ベクターへクローニングする場合、単鎖ハイブリダイ
ゼーシヨンプローブが使用される場合、及びクローン化
された生成物が発現されるべき場合には、特定方向へ挿
入することが有用である。

プライマーを調製する１つの方法は、標的配列と僅かし
か異ならないプライマー配列を選択することである。各
プライマーが位置すべき領域は、所望のベクターに好適
な制限部位に相同であるようにスクリーニングされる０
例えば“ＣＡＧＴＡＴＣＣＧＡ０８．°という標的配列
は、Ｂａｇ旧部位を含む配と僅かに一塩基が異なるにす
ぎない、プライマー配列はその３“末端において目的物
に正確に７７チしかつその５゛末端の近傍に変形した配
列と制限部位を有するように選択される（例えば”　Ｃ
ＡＧｇＡＴＣＣＧＡ、、”の小文字は標的配列とマツチ
していないことを意味する）、この僅かに変化した配列
は最初の標的配列とハイブリダイズし重合を開始するプ
ライマーの能力を妨げるものではない、第１の増幅サイ
クルの後、プライマーはコピーされ、標的となり、かつ
新しいプライマーと正確に７７チする。増幅工程後、生
成物は適切な制限酵素でｒＮ１裂され、そして必要なら
ば脱塩カラム又は分子量クロマトグラフィーカラムを通
してヌクレオチド三リン酸や塩等の連結阻害剤を分離さ
れ、そして連結反応によりバクテリオファージＭ１３の
ようなりローニングベクターに挿入される。遺伝子は、
周知の技術を用いて配列決定され、そして／又は発現さ
れる。

プライマーを調製する第２の方法は、プライマーの３°
末端を標的配列から採用し、そしてプライマーの５′末
端に所望の制限部位を付加することを含む、この例とし
てＨｉｎｄｌｌｌが配列“ｃｇａａｇｃｔｔＣＡＧＴＡ
ＴＣＣＧＡ、、、　　”を形成するために付加され、こ
こで小文字の意味は上記の通りである。加えられた塩基
は増幅の第１サイクルのハイブリダイゼーションには寄
与しないが、その後のサイクルにおいてマツチする。増
幅された最終生成物は制限酵素で切断され、上記の通り
クローニングされ、そして発現される。増幅される遺伝
子は、例えばヒトのβ−グロＶシン、又はヒトのＨＬＡ
　　ＤＱ。

ＤＲもしくはＤＰ−α及び−β遺伝子である。

更に末法はインビトロの突然変異用として使用すること
ができる。オリゴデオキシリボヌクレオチドは増幅され
るべきＤＮＡ配列と正確に相補的である必要はない、こ
れらは、ポリメラーゼ酵素や他に使用されるいずれかの
誘導試薬によって伸長されるために十分な程度に、鎖と
ハイブリダイズすることができればよい、使用するプラ
イマーが最初の鋳型と正確に相補的でない場合のポリメ
ラーゼ連鎖反応の生成物は鋳型よりむしろプライマー配
列を有し、これによりインビトロの突然変異を可能にす
る。引き続くサイクルでは、より以上のミスペアーブラ
イミングが必要とされないので、この突然変異が減るこ
とのない効率下で増幅される。このように生産された突
然変異体は標準的な分子生物学的技術により適切なベク
ター中へ挿入され、変化した蛋白質を生産する能力等の
変化した特質をこのベクターに与える。

上述した変化したＤＮＡ配列を形成する方法は、より以
上の配列変化を誘発させるために異なったプライマーを
使用して該変化したＤＮＡに対して繰り返すことができ
る。この方法では、一連の突然変異配列が徐々に生成さ
れ、ここでこの一連のものに新しく加えられるものは、
最後のものと僅かに異なることができるが、最初のＤＮ
Ａ源配列とは非常に大きく異なることができる。この方
法では、非常に大きなミスマツチの場合にプライマーが
機能しないために単一ステップでは行うことのできない
変化を、最終的には作り出すことができる。

更に、十分な量のプライマーが増幅される鎖に相補的で
ある配列を含むのであれば、プライマーはその配列の一
部として相補的でない配列を含むことができる０例えば
鋳型配列に相補的でない核酸配列（例えばプロモーター
、リンカ−、コード配列等）を、１つ又は両方のプライ
マーの５”末端に結合させることができ、これにより増
幅工程の生成物にこれを付加することができる。伸長プ
ライマーを添加した後、相補的でない核酸挿入部を含む
新しい鋳型の所望量を得るために十分な数のサイクルを
実施する。これにより日車な技術を用いて比較的短時間
（例えば２時間又はそれ以下）内に組合わされた断片を
大量に生産することが可能になる。

更に末法においては、最初の短い核酸断片の鎖を分離す
ることにより生成するＪａ鎖の３°末端に相補的かある
いは実質的に相補的である３′末端を有し、かつ５°末
端が中央切片に付加されるべき配列の情報を含むもので
あるプライマーを使用して、生成物より短鎖である既存
の核酸断片（これを中央セグメントという）から核Ｍｕ
片を合成スルコとができる。この方法は、 （ａ）各核酸鎖に相補的である、各プライマーの伸長生
成物が合成される条件下で、該既存の断片の鎖を２つの
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ここで該２つ
のプライマーは一一方のプライマーから合成される伸長
生成物がその相補体から分離されたときに他方のプライ
マーの伸長生成物の合成のための鋳型としての役割を果
たすことができるように、前記既存断片の各饋の３°末
端と実質的に相補的であるように選択され、そして各プ
ライマーはその５゛末端において前記既存断片と相補的
でなくかつ合成される核酸断片の２つの末端に対応する
ヌクレオチド配列を含むものであり； （ｂ）その上でプライマーの伸長生成物が合成された鋳
型からプライマーの伸長生成物を分離して単鎖分子を生
成せしめ； （ｃ）スッテブ（ｂ）から生じた単鎖分子をステップ（
ａ）のプライマーにより、スンテブ（ｂ）において生成
した各単鎖をプライマーとして用いてプライマー伸長生
成物が合成される条件下で処一方の５°末端に存在する
核酸配列が導入されている）と２つの十分に長い二重鎖
核酸分子（このそれぞれには、オリゴヌクレオチドプラ
イマーの両者の５“末端に存在するヌクレオチド配列が
導入されている）を生成せしめ； （ｄ）前記十分な長さの二重鎖分子の有効量を生産する
のに十分な回数ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）を繰り
返し； （ｅ）ステップ（ｄ）の生成物の鎖を２つのプライマー
で処理して、ステップ（ｄ）の生成物が両末端において
伸びるようにし；そして（ｆ）中央セグメントとしての
ステップ（ｄ）の生成物及びステップ（ｄ）の生成物の
鎖を分離することにより生成する単鎖の３°末端と相補
的か実質的に相補的である２つのオリゴヌクレオチドプ
ライマーをして使用しながらステップ（ａ）からステッ
プ（ｄ）までを繰り返す； ことから成る方法である。

ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）は必要なだけ通常少な
くとも５回繰り返して、最終生成物を合成するために必
要なＮ（すなわち、有効ｆｆ１）の十分に長い二重鎖生
成物を生産する。更に中央のセグメントを、先行する増
幅サイクルの生成物として得ることができる。ステップ
（ｄ）の生成物は伸長又は増幅の新たなサイクルの前に
精製され、又は生成物を含む反応混合物とし直接使用す
る。

プライマーの３゛末端が最初の一層短い鎖の核酸の単鎖
の３゛末端と正確に相補的でないときは、生成物の中央
のセグメントは該最初の一層短い鎖の核酸にある配列情
報と正確に同じではない、従って最初の核酸の変異体を
、その３゛末端が最初の一層短い鎖の核酸の単鎖の３°
末端と実質的に相補的であるプライマーを用いて作り出
すことができる。

制限部位リンカ−がプライマーに導入されると、増幅さ
れた二重鎖生成物が適切な制限酵素で消化され、迅速な
りローニング及び配列決定のためにＭ１３ベクター中に
直接連結される。特定の増幅された標的配列を有するＭ
１３溶菌斑は、標的配列に特異的なプローブと溶菌斑の
リフトフィルターをハイブリダイズせしめることにより
同定することができる。

末法は、伝染性疾患、遺伝子性疾患又は細胞性疾患、例
えば癌、と関連する特定の核酸配列、例えば発癌遺伝子
、の検出及び／又は特徴付けを可能にするために使用さ
れる。増幅は、例えば胎児細胞から得られるＤＮＡを用
いる鎌状赤血球貧血の胎児診断等、分析に利用できる核
酸の量が非常に小さい場合に有用である。増幅は、本来
的に感度の良くない非放射性検出技術を用いて少量の試
料を分析する場合、又は放射性技術を用いるが迅速な検
出が望ましい場合に特に有用である。

本発明の目的のためには、遺伝子性疾患は、例えば鎌状
赤血球貧血、嚢胞性繊維症、α−サラセミア、β−サラ
セミア等の、任意の生物体からのゲノムＤＮＡ中の特定
の欠ｔｉ及び／又は変異を含む、譲状赤血球貧血は本性
による好適なりＮＡ配列の増幅の後のオリゴマー制限分
析又はＲＦＬＰ状分析全分析容易に検出する・ことがで
きる、α−サラセミアは配列が存在しないことにより検
出することができ、β−サラセミアは疾患を起こさせる
変異に近接してリンクする多形性（ｐｏｌｙｗ＋ｏｒｐ
ｌ　ｉｃ）制限部位の存在により検出することができる
。

これら全ての遺伝子性疾患は適切な配列を増幅し、それ
を放射性プローブを使用せずにサチンプロット法により
分析して検出することができる。

このような方法では、例えば非常に少量の所望配列を含
む羊水からのＤＮＡの少量の試料を増幅し、制限酵素で
切断し、そしてサチンプロット法で分析する。増幅シグ
ナルをハイレベルとすることにより、非放射性標体を使
用することが容易になる。

他の態様では、少量のＤＮＡを便利なレベルまで増幅し
、次に更に伸長反応を行うが、この場合容易に検出でき
るヌクレオチド誘導体（例えば！ｔｐ又はビオチンでラ
ベルしたヌクレオチド三リン酸）を直接Ｒ終のＤＮＡ生
成物に導入し、これを制限分析及び電気泳動分析あるい
は任意の他の好適な方法を用いて分析する。この技術の
モデル系の例を第５図に示しである。

第３図のモデル系に示した更に他のｃ、様では、核酸は
増幅の前に特定の制限エンドヌクレアーゼに暴露する。

切断された配列は増幅できないので、予め制限酵素で処
理したＤＮＡ試料の存在にもかかわらず増幅された断片
が現れることは増幅された配列中にエンドヌクレアーゼ
の部位がないことを暗示する。増幅された配列が存在す
るか否かは適当な方法で検出することができる。

この技術の実際的な適用方法は、本明細書とサイキらに
よるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　　３巻１００Ｂ　−１０
１２頁に記載されているオリゴマー制限技術を用いて譲
状赤血球貧血の検出を容易にする使用により例示するこ
とができる。譲状赤血球貧血はβ−グロビン遺伝子の第
６コドンの１つの塩基対の変化により生ずるヘモグロビ
ンの疾患である。第６図は多形現象（ｐｏｌｙ＋ｗｏｒ
ｐｈｉｓｎ）　ｆ＋ｌ城中の正常及び譲状赤血球貧血の
β−グロビン遺伝子の配列を示すもので、一本線は正常
遺伝子にのみ存在する図！部位の位置を示し、二本線は
正常及び鎌状赤血球貧血対立遺伝子の両方に存在する非
多形性の…ｎｆ１部位の位置を示す、第７図は両制限部
位部位間にわたり星印で示された部分がラベルされてい
るプローブを用いて正常のβ−グロビンＤＮＡをオリゴ
マー制限開裂する方法を示すものである（プローブは、
制限部位からの塩基対の数が、制限部位から他の末端ま
での塩基対の数より少なくなる方の末端にラベルするこ
とが好ましい）、前に記載したようにして増幅されたＤ
ＮＡが変性され、ラベルされたプローブとアニールされ
る。増幅は、２次構造の形成を最小に抑えるためにジメ
チルスルフオキシドの存在下温度を上げて（３５−４０
℃）実施する。酵素因見」はＤＮＡを再構成されたＤｄ
ｅ　　１部位で開裂させ、ラベルされたオクタマーを生
じさせる。テストに使用した条件下では、オクタマーは
デュプレックスから離れるのに十分な短さである。引き
続く酵素旧ｎｆｌの添加は今や単鎖であるオクタマーに
何の影響も与えない、第８図はβ−グロビンＤＮＡの鎌
状赤血球対立遺伝子に適用した前記と同じ方法を示す、
酵素Ｄｄｅ　　Ｉは、Ａ−Ａの塩基対がミスマツチした
ものであるため、増幅されたＤＮＡとラベルされたプロ
ーブとで形成されたデュプレックスを開裂させることは
できない、しかし酵ｆｉＨｊｎｆｌはハイブリッド制限
開裂せしめ、ラベルされたトリマーが生成される。実際
にはこの方法は、特定のシグナルがいずれかの対立遺伝
子の存在と関連するので、個体のＤＮＡが野性型のホモ
接合体か、譲状赤血球貧血型のホモ接合体か又は鎌状赤
血球貧血形質を有するペテロ接合体であるかを検診する
ことができる。上述の方法を使用して適切な配列を増幅
させることにより１つのｓｔｐラベルのみを有するプロ
ーブを用いて単コピー遺伝子を迅速に分析することがで
きる。

種々の伝染性疾患は、原因となる微生物に特異的である
特定のＤＮＡ配列のＲ床試料中での存在により診断する
ことができる。これらはサルモネラ、クラミジア、ネイ
セリア等の細菌、肝炎ビー／ｌ／　ス等（７）　ヒ−／
Ｌ／ス、マラリアの原因となるプラスモジウム（Ｐｌａ
ｓｍｏｄｉｕｍ）等の奇生体を含む、ファルコーに与え
られた米国特距第４　、３５８・５３５号は・伝染性疾
患の診断用の特別なりＮＡハイプリダイゼーシッンプロ
ープの使用につき記述している。

ファルコー法に固有の問題は、感染した患者からの臨床
試料中には比較的少ない数の病原生物しか存在せず、こ
れらから抽出されたＤＮＡは試料中の全ＤＮＡの非常に
小さな部分を構成するのみであるということである。Ｄ
ＮＡ試料を固定化しパイプリダイゼーション検出する前
に問題となっている配列を特異的に増幅することは、こ
れらの方法の感度と特異性を太き（改良する。

伝染性疾患の診断用にＤＮＡプローブを臨床的にルーチ
ン化して使用することは、ワードのヨーロッパ特許第６
３，８７９号に記載されているように非放射的にラベル
されたプローブを使用するのならば、大いに簡略化され
る。この方法では、ビオチンを含むＤＮＡプローブがア
ビジン又はビオチンに特異的な抗体に結合した色素体（
ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）酵素により検出される。この
型の検出は便利であるが、比較的低感度である０本法に
よる特異的なりＮＡ増幅と安定にラベルされたプローブ
を組み合わせることにより、ファルコー及びワードの方
法をルーチン化した臨床における有用な方法に実施する
のに要求される便利さと感度を提供することができる。

更にプローブは、ビオチンが次式のスペーサーアーム −Ｙ　−（ｃＨｔ）よ−０−　　（（ｃＨｚ）−０）　
ｙ　　−Ｃ）ｌ！　ＣＨｘ　　−Ｎ　−に結合したビオ
チン化したプローブとしてもよく、ここでＹは、０、Ｎ
Ｈ又はＮ−ＣＨｏｌＸは１から４までの数、そしてｙは
２から４までの数である。そして次にスペーサーアーム
は次式のプソラレン成分に結合している。

しＨツ プソラレン成分は、クラージ・テッペにより匡−ｍ、　
Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｃｔａ＋　６９７巻１−５頁（１
９８２年）に記載されているように“ギャップのある環
状”のプローブに挿入しかつ架橋し、ここでギャップの
ある環の単鎖ハイブリダイゼーシッン領域はプライマー
に含まれる領域にわたる。

この増幅工程は単一コピーのヒト遺伝子から十分な量の
ＤＮＡを調製するのに利用することもでき、これにより
臭化エチジウムのような簡単な非特異的なりＮＡ染色に
よりそれを検出でき、直接ＤＮＡ診断を行うことができ
る。

伝染性疾患及び生物体のゲノム中の病原的異常性を検出
するほか、末法は任意の病原状態と関連しないＤＮＡ多
形現象（ボルモルフイズム）を検出するために使用する
こともできる。

次の実施例は例示のために提示するもので、どのように
も本発明を限定することを意図するものではない、これ
らの実施例で全てのパーセントは固体の場合は重量で、
液体の場合は容量であり、他に指定がない限り温度は摂
氏温度である。

去ｍ 次のヌクレオチド配列を有する２５塩基対配列５”ＣＣ
ＴＣＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴ　３
’３”ＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＡＣＣＴＡ
ＣＧＡ　５’（ＡＴＣＣから得られるｐＢＲ３２２の４
７塩基対Ｆｏｋｌ制限断片上に含まれる）を次のように
調製した。

４７塩基対断片を含むｐＢＲ３２２のＦｏｋ　　Ｉ消化
物を供給者であるニューイングランド社の指示による条
件に従ってｐＢＲ３２２をＦｏｋ　　Ｉで消化すること
により調製した。使用したプライマーは、５°ｄ　（ｃ
ＣＴＣＧＧＣＡＣＣＧ）　３′と５’ｄ（ＡＧＣＡＴＣ
ＣＡＧＧＧＴＧ）３’であり、通常の技術により調製し
た。２５ｍＭのリン酸カリウムと１０ｍＭの塩化マグネ
シウム、及び１００ｍＭの塩化ナトリウムから成る緩衝
液（ｐＨ７，５）３３μｌに２４３３ピコモルの上述の
各プライマー、２．４ピコモルのｐＢＲ３２２のＦｏｋ
　　Ｉ消化物、２２ナノモルのデオキシＡＴＰ、２２ナ
ノモルのデオキシＣＴＰ：１９ナノモルのデオキシＧＴ
Ｐ及び１０ナノモルのＴＴＰを加えた。

混合物を８５℃で５分間加熱し、室温まで冷却した。Ｅ
、コーリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片の５単
位を加え、温度を１５分間維持した。その後再度８５℃
で５分間加熱し、冷却した。

クレノー断片の５単位を再度加え、１５分間反応を行っ
た。加熱、冷却及び反応の各ステップを更に１１回操り
返した。

最後の繰り返しの後、５μｌを反応混合物から取り出し
た。これを８５℃で３分間加熱し、室温に冷却した。　
１２．５ピコモルのα−ｐ！ｆｆｉ　　ｑオキシシチジ
ン三リン酸と５単位のクレノー断片を加え反応を１５分
間進行させた。ラベルされた生成物をポリアクリルアミ
ドゲルの電気泳動で確認した。

１３サイクル後に見える強くラベルされたバンドのみが
、意図する２５塩基対配列であった。

るＭｓｔ　１１部位に伸びる９４塩基対の配列であった
。

該配列は第１図に示すヌクレオチド配列を有している。

■、クシ！仁ヱ：！ヒＥ収 次の２つのオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
を下記する方法を用いて調製した。

５’　ＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＣＧ　３”プライマ
ーＡ１及び５’　ＴＴＴＧＣＴ丁ＣＴＧＡＣＡＣＡ　３
’　　プライマーＢオートメーシッン　　れたム　′ ビューケージとカルナース法　（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎＬｅｔｔｅｒｓ　２２ｊＪ！１８５９−１８６２頁（
１９８１年）に従って合成したジエチルフォスフォロア
ミダイトを、バイオサーチＳＡＭ−１を使用して制御し
た多孔ガラス担体から誘導したヌクレオシドへ次々と濃
縮した。この方法は、ジクロルメタン中でのトリクロル
酢酸による脱トリチル化と活性のある水素供与体として
ベンゾトリアゾールを使用する縮合、及びテトラハイド
ロフラン及びピリジン中での無水酢酸とジメチルアミノ
ピリジンによるキャッピングを含んでいた。１サイクル
の時間は約３０分であった。各ステップの収率は実質的
に当量的であり、脱トリチル化の間に解離するジメトキ
シトリチルアルコールを集め分光器による検査で決定し
た。

固体担体をカラムから取り出し、１ｍｌの濃水酸化アン
モニウムに閉鎖管中室温で４時間曝した。

担体を濾過で取り除き、一部が保護されたオリゴデオキ
シリボヌクレオチドを含む溶液の温度を５５℃に上昇さ
せ、５時間維持した。アンモニアを取り除き、残渣を調
製用ポリアクリルアミドゲルに適用した。３０ポル）／
ａｍで９０分間電気泳動を行い、生成物を含むバンドを
螢光プレート上のＵ■シャドウィングで同定した。該バ
ンドを切り取り、１ｍｌの蒸留水で一晩かけて４℃で溶
出した。この溶液をアルチックＲＰ１Ｂカラムにかけ、
ｐＨ６，０の１％酢酸アンモニウム緩衝液中７−１３％
のア七ト二トリルで溶出した。この溶出液は２６０ｎ＋
Ｉｌの紫外吸収でモニターし、適切なフラクシッンを集
め、固定した量での紫外吸収で定量分析し、かつ室温下
で減圧遠心機中で蒸発させ乾燥した。

オリゴデオキシリボヌクレオチドの　　・け精製したオ
リゴヌクレオチドのテスト溶液をポリヌクレオチドキナ
ーゼ及びｒ”Ｐ−ＡＴＰでｘｔｐラベルした。このラベ
ルした化合物を５０ポル）／ａｍで４５分間電気泳動に
かけた後、１４−２０％のポリアクリルアミドゲルのオ
ートラジオグラフィーで確認した。この方法では分子量
を確認することができる。ヘビ毒ジェステラーゼと細菌
性アルカリフォスファターゼを使用してオリゴデオキシ
リボヌクレオチドをヌクレオシドに消化し、そして次に
、逆相ＨＰＬＣカラム、並びに１０％アクリロニトリル
及び１％酢酸アンモニウム移動相を使用して、誘導され
たヌクレオシドを分離し定量することにより塩基組成を
決定した。

以下余白 ■、退公し転源 Ａ、　ヒト　　　ＤＮＡの 正常のβ−グロビンのヒトゲノムＤＮＡホモ接合体を、
ステラトラ−らによりＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ
。

Ｓｃｉ、の７２巻５９６６−５９７０頁に記載された技
術を用いてセルラインＭｏ１ｔ４　（ヒユーマン・ジェ
ネティツク°ミュータント・セル・レボジトリ−から入
手し、Ｇ　Ｍ２２１９　Ｃと同定した）から抽出した。

Ｂ、クローン　したグロビン゛　云　の゛６正常のβ−
グロビン遺伝子の１．９　ｋ　ｂのＢａｇ　Ｈ１断片を
コスミドｐＰｃ１１から分離し、ｐＢＡ３２２のＢａｓ
＋工旧部位に挿入した（ソベロンらの蝕憇９巻２８７−
３０５頁（１９８０年））０合成４０塩基対プローブと
ハイブリダイズする領域を含むこの断片は、第１及び第
２のエクソン、第２のイントロン、並びに遺伝子の５”
のフランキング（ｆｌｉｎｋｉｎｇ）配列を含む（ロー
ンらの皿１５巻１１５７−１１７４頁）、このクローン
はｐＢＲ３２８：　ＨｂＡと名付けられ、ＡＴＣＣ第３
９、６９８号として１９８４年５月２５日に寄託された
。

β−グロビンの鎌状赤血球貧血対立遺伝子の対応する１
、　９　ｋ　ｂのＢａｇ　ＨＩ断片はコスミドｐＦ１２
から分離され、上述の通りクローン化された。このクロ
ーンはｐＢＲ３２８：　Ｈｂｓと名付けられ、ＡＴＣＣ
第３９．６９９号として１９８４年５月２５日に寄託さ
れた。

各組み換えプラスミドをＥ、コーリーＭＭ２９４（ＡＴ
ＣＣ第３９．６０７号）へ形質変換し、そして増殖せし
めた。

それぞれの全量が１００μｇであるｐＢＲ３２８：　Ｈ
ｂＡとＰｂｒ３２８　：　ＨｂＳを単独で２０単位のＭ
ｓｔ　ＩＩ　（＝ニーイングランドバイオラブ社）とと
もに１６時間３７℃、１５０ｍＭＮａＣ１，１２ｍＭの
Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　（ｐｔ！７．５）、１２ｍＭのＭｇ
Ｃ１ｇ　、１　ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）及
び１００μｇ／鵬ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中
で消化した。生成物はそれぞれｐＢＲ３２８：　ＨｂＡ
　／Ｍｓｔ　ＩＩ及びｐＢＲ３２８：　ＨｂＳ　／ハｔ
　Ｉｔと名付ける。

■、ポリメラーゼの゛丁゛　応 ６０ｍＭ酢酸ナトリウム、３０ｍＭトリス−アセテート
及び１０ｍＭ酢酸マグネシウムを含むｐ　Ｈ８，０の緩
衝液１００μｌへ１００ピコモルのプライマーＡ　（ｄ
（ｃＡＣＡＧＧＧＣＡＣＴＡＡＣＧ）の配列）、１００
ピコモルのプライマーＢ　（ｄ（ＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧ
ＡＣＡＣＡ）の配列）及び１０００ピコモルのデオキシ
ＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ及びＴＴＰを
含む２μｌの溶液を加えた。更に上述した、下記のＤＮ
Ａ源の１つを加えた。

１０μｇの全ヒト野性型ＤＮＡ　（反応Ｉ）０、１ピコ
モルのｐＢＲ３２８：１ＩｂＡ　（反応■）０．１ピコ
モル（ＤｐＢＲ３２８：ＨｂＳ　（反応ｍ）０．１ピコ
モルのｐＢＲ３２８：ＨｂＡ／Ｍｓｔｌｌ　（反応■）
０、１ピコモルのＩ）ＢＲ３２８：ＨｂＢ／ＭｓｔＩＩ
　（反応■）非標的ＤＮＡ　（反応■） 得られる各溶液を１００℃で４分間加熱し２分間で室温
まで冷却し、その後Ｅ、コーリーＤＮＡポリメラーゼの
クレノー断片の４単位を含む１μｌを加えた。各反応は
１０分間行い、その後プライマー、ヌクレオチド及びＤ
ＮＡを加え、加熱し、冷却し、ポリメラーゼを加え、そ
して反応させるサイクルを反応■については１９回、反
応■−■については４回繰り返した。

第１サイクルの前及び各反応の最後のサイクルの後で取
り出された反応！及び■のアリコート４マイクロリツト
ルを、ｐＨ８，３の０．０８９Ｍ　）リス硼酸塩緩衝液
中で、２．５ｍＭＥＤＴＡ中で、１２％ポリアクリルア
ミドゲルに加えた。このゲルを２５ボルト／ｃ！ｌ、４
時間電気泳動させ、固相担体として機能するナイロン膜
へ移し、そして、ｐＨ７，４で３０％のフォルムアミド
、３　ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハルツ及び５％のドデシル
硫酸ナトリウム中で、標準的技術を用いて調製した次式
：％式％） の３！Ｐでラベルされた４０塩基対の合成断片で検知し
た。第２図は、反応Ｉ及び■用の検知されたナイロン膜
のオートラジオグラフである。レーン１は０．１ピコモ
ルの５８塩基対の対照合成断片で、そのうちの１つの鎖
は上記プローブと相補的である。レーン２は第１の増幅
サイクルの前の４μｌの反応ｌの液である。レーン３は
２０回の増幅サイクル後の４μｌの反応１の液である。

レーン４は５回の増幅サイクル後の４μｌの反応■の液
である。レーン５はα−１Ｐ−デオキシＮＴＰ及びポリ
メラーゼでラベルされたｐＢＲ３２２にューイングラン
ドバイオラブ社）の二■！にューイングランドバイオラ
ブ社）から成る分子量標準である。

レーン３は、２０サイクル後反応混合物Ｉは適切な分子
量を有する特定の配列を大量に含み、他の検出できる生
成物がないことを示している。５サイクル後の反応混合
物■もレーン４に示す通り出発物質である核酸と他の生
成物の他にこの生成物も含んでいる。

５サイクル後の反応■から■の液５．　Ｏｐ　１に上述
の各プライマ−５ピコモルを加えた。溶液を４分間１０
０℃に加熱し室温へ戻した。それぞれ３ピコモルのα−
３富Ｐ−デオキシＡＴＰ、α−２ｔｐ−デオキシＣＴＰ
、α−２２ｐデオキシＧＴＰ及びα−３１Ｐ−ＴＴＰ、
並びに４単位のクレノー断片を加えた。最終的な容積が
１０μｌであり塩濃度が上記した通りである反応を１０
分間行わせた。ポリメラーゼ活性は６０℃で２０分間加
熱すると失われた０反応１ｌ−Ｖｌの反応液４μ！を、
０．０８９Ｍトリス硼酸塩緩衝液、２．５　ｍ　Ｍ　Ｅ
　Ｄ　Ｔ　Ａ中で１２％ポリアクリルアミドゲルに加え
た。このゲルを２５ボルト／ｃｓ、４時間電気泳動させ
、その後オートラジオグラフ処理した。

第３図は、電気泳動のオートラジオグラフである。レー
ン１は分子量標準、レーン２は反応■、レーン３は反応
ｍル−ン４は反応■及びレーン５は反応■である。対照
としてのＤＮＡを伴なわない反応■のレーンはレーンの
どこにもイメージを有さない８図から、標的ＤＮＡから
予想される９４塩基対断片は、無傷のβ−グロブリンＤ
ＮＡ配列が増幅用に使用できるときのみ存在できること
が分かる（つまりレーン２のｐＢＲ３２８：　ＨｂＡ　
、レーン３のｐＢＲ３２Ｂ　：　ＨｂＳ及びレーン５の
ｐＢＲ３２８：ＨｂＳ／紐！■）、笠■ＩＩによる消化
はｐＢＲ３２８：　ＨｂＡを９４塩基対配列中で切断し
、それを増幅できないようにし、９４塩基対のバンドは
レーン４に現れない、これに対し、ｐＢＲ３２８：　Ｈ
ｂＳの９４塩基対配列はプラスミドが笠■ＩＩで消化さ
れても切断せず、従って第５図に示すように増幅に利用
できる。

第４図は９４塩基対配列を増幅する３サイクルの連鎖反
応を示すものである。　ＰＣＯＩとＰＣＯ２はプライマ
ーＡ及びＢである。右の数はサイクルを示し、左の数は
特定の分子が生産されたサイクル数を示す。

スｍ 本実施例は、ヒトヘモグロビン遺伝子中の対立遺伝子Ｍ
　ｓ　ｔ　１１部位を含む１１０塩基対配列の増幅を示
すものである。

プライマーは実施例２の技術で調製されたものである。

１．０マイクログラムの全ヒトＤＮＡ。

１００ピコモルのｄ　（ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣ
ＡＣＴＡＧＣ）及び１００ピコモルのｄ　（ｃＡＡＣＴ
ＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）を以下のような１０
０μｌの溶液に溶解させた。

１．５ｍＭ各４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸 ３０ｍＭｐＨ７，９のトリスアセテート緩衝液６０ｍＭ
酢酸ナトリウム １０ｍＭ酢酸マグネシウム ２５ｍＭジチオスレイトール この溶液を１００℃で１分間加熱し、迅速に２５℃に下
げて１分間加熱し、その後ＤＮＡポリメラーゼのクレノ
ー断片２．５単位を加えた。ポリメラーゼの反応が２５
℃で２分間行い、その後加熱、冷却、クレノー断片の添
加及び反応を望むだけ繰り返した。

各サイクルの効率が７０℃で、１５サイクル行って、β
−グロビン遺伝子の所望の１１０塩基対断片１．４フェ
トモルを合成した。

失窪五土 本実施例は、ヒトヘモグロビン遺伝子の対立遺伝子中の
笠■１１部位を含む２４０塩基対配列の増幅を示すもの
である。この配列は、Ｎｃｏ　Ｉ　、Ｈｉｎｆ　Ｉ及び
ＭｓｔｌＩ制限部位を含んでいろ。

ｐＨが８．０で、６０ｍＭ酢酸ナトリウム、３０ｍＭ）
リスアセテート及び１０ｍＭ酢酸マグネシウムの混合物
（０，１ピコモルのｐＢＲ３２８：　ＨｂＡを含む）に
、 １００ピコモルのｄ　（ＧＧＴＴＧＧＣＣＡＡＴＣＴＡ
ＣＴＣＣＣＡＧＧ）プライマー・１００ピコモルのｄ　
（ＴＡＡＣＣＴＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＣ丁ＧＣＣＣ）プ
ライマーー・各１０００ピコモルのデオキシＡＴＰ、デ
オキシＣＴＰ１デオキシＧＴＰ及びＴＴＰ を含む２μｌの溶液Ａを加えた。

２つのプライマーは実施例２に記載した技術で調製した
。溶液を１００℃で４分間加熱し、空気中で２分間冷却
し、その後Ｅ、コーリーＤＮＡポリメラーゼのクレノー
断片４単位を含む液１μｌを加えた０反応を１０分間進
行させ、その後溶液Ａの添加、加熱、冷却、ポリメラー
ゼの添加及び反応からなるサイクルを３回繰り返した０
反応液５．０μｌに、上記の各オリゴヌクレオチドプラ
イマ−５ピコモルを加えた。溶液を１００℃で４分間加
熱し、室温まで下げ、その後それぞれ３ピコモルのα−
２２ｐ−ラベルされたデオキシリボヌクレオシド三リン
酸及び４単位のクレノー断片を加えた。最終的な容量が
１０μｌで塩濃度が上記の通りである反応をｌＯ分間進
行させる。ポリメラーゼ活性は６０℃で２０分間加熱す
ると失活した。

２μｌのアリコートをヱ臼■、肚肛■及びｙユリ！で消
化し、ｐ　Ｈ８，３の０．０８９Ｍ　）リスアセテート
緩衝液、０．２５ｍＭＥＤＴＡ中で１２％ポリアクリル
アミドゲルに加えた。ゲルを２５ポル）／ｅｌｌで４時
間電気泳動させ、オートラジオグラフ処理した。第５図
は電気泳動のオートラジオグラフを示し、ここでレーン
１は分子Ｍ標準、レーン２は酵素の消化を伴わないもの
（無傷の２４０塩基対）、レーン３はＮｃｏｌによる消
化（１３１及び１０９塩基対）、レーン４はＭｓｔｌｌ
による消化（１４９及び９１塩基対）、そしてレーン５
はＨｉｎｆ　Ｉによる消化（１４４及び９６塩基対）で
ある、オートラジオグラフは２４０塩基対反応の増幅し
たものと一致する。

以下余白 去止皿１ 本実施例は、逐次的消化による譲状赤血球貧血を検出す
るための本発明の方法の使用を示すものである。

オリゴ−゛オキシｉボヌクレオチドのム　　び１ン叔■ ５°”　ＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴ
ＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＧ　３’の配列
のラベルされたＤＮＡプローブびがラベルを意味する）
Ｒ３Ｏ６、及びＲ３０６と３つの塩基対がミスマツチし
ている ３’　ＧＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＣ
ＧＧＣＡＡＴＧＡＣＧＧＧＡＣＡＣＣＣ５’の配列のラ
ベルされていないブロックオリゴマーＲ３ｌ０を、実施
例２　（Ｉ）の方法に従って合成した。プローブＲ３０
６は、その５ピコモルを、７ＱｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ
７，６）　、１０ｍＭＭｇＣｈ　、１．５　ｍＭスペル
ミン及び２．５　ｍ　Ｍジチオスレイトールを含む反応
容量４０μ！中の４単位のＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼにューイングランドバイオラブ社）及び５０ピコモル
のγ−”Ｐ−ＡＴＰ　にューイングランドニュークレア
社、約７２００Ｃｉ　／ミリモル）と接触させることに
よりラベルした。全容量を２５ｍＭＥＤＴＡで１００μ
ｌに調節し、トリス−ＥＤＴＡ　（ＴＥ）！１街液（１
０ｍＭ）リス緩衝液、０．１ｍＭＥＤＴＡ。

ｐ　Ｈ８，０）により平衡化されたバイオランド製の１
ｍｌのＢｉｏ　Ｇｅｌ　Ｐ　−４スピン透析カラム上で
マニアティスらがルリ！εｄ４二旦す通力ＬＬ　４６４
−４６５頁（１９８２年）に記載している方法に従って
精製した。

ラベルされたプローブは、トリス−硼酸−ＥＤＴＡ　（
ＴＢＥ）　緩衝液（８９ｍＭトリス、８９ｍＭ硼酸、２
．５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，３）中１８％のポリアクリ
ルアミドゲル（１９：１のアクリルアミド：ＢＩＳとバ
イオランド）上で５００νｈｒにて電気泳動してさらに
精製した。オートラジオグラフによる位置きめの後、ラ
ベルされたプローブを含む部分を切り取り、粉砕し、０
．２１１１のＴＥ１１衝液中へ一晩かけて４℃で溶出さ
せた０反応生成物のＴＣＡ？ｉ：澱は比活性が４．９Ｃ
ｉ／ミリモルであり、最終的濃度が２０ピコモル／ｍ＋
であることを示している。

ラベルされないＲ３ｌ０ブロツキングオリゴマーは２０
０ピコモル／　Ｍ　１のｔ；度で使用した。

か゛のヒトツムＤＮＡの 実質的にステラトラ−らのハ於７９巻５９６６−５９７
０頁（１９８２年、Ｍｏ１ｔ４について）に記載の方法
及びマニアティスらのＭｏ　１ｅｃｕ　ｊａｒ　　且匹
旦Ｌ　２８０−２８１頁（１９８２年）に記載の方法を
使用して、Ｍｏ１ｔ４．５Ｃ−１及び０Ｍ２０６４のリ
ンパ球系から高分子のゲノムＤＮＡを分離した。

ＭｏＩｔ４　（ヒエ−マン・ミュータント・セル・デポ
ジトリ−、ＧＭ２２１９Ｃ）は正常のβ−グロビンにつ
いてホモ接合体のＴ細胞系であり、そしてＡＴＣＣに１
９８５年３月１９日に寄託された５Ｃ−１は鎌状赤血球
貧血対立遺伝子についてホモ接合体のＥＢＶで形質変換
されたＢ細胞系である。　Ｇ？Ｉ２０６４（ヒエ−マン
・ミュータント・セル・デポジトリ−、０Ｍ２０６４）
は胎児ヘモグロビンの遺伝的な永続性（ＨＰＦＨ）につ
いてホモ接合体である個体当初単離され、β−又はδ−
グロビン遺伝子配列を含んでいない、全ての細胞系は１
０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中に維持さ
れた。

、床底゛試ＳからのヒトゲノムＤＮＡの単離既知の鐘状
細胞キャリヤー（ＡＳ）からのＣＨ１２と名付けられた
臨床血液試料をカルフォルニア州オークランドの小児病
院のベルドラム・ルピン博士から得た。ヌンベルグらの
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

とし７５巻５５５３−５５５６頁（１９７８年）に記載
されている方法の変法を使用して、主に末梢の血液１７
２８球から成るバフィーコート部分からゲノムＤＮＡを
調製した。

細胞を、５１のトリス−ＥＤＴＡ　−ＮａＣ１（ＴＥＮ
）ｆｆｌ衝液（ｐ　Ｈ８の１０ｍＭトリス、ｐＨ８，１
ｍＭＥ　ＤＴＡ、　１０　ｍＭＮａｃｌ）中に再懸濁し
、０．２１１Ｉｒ／１１１ノフロテイナーセ、０．５％
（７）ＳＤＳに調節し、そして３７℃で一晩インキエベ
ートした。

過塩素酸ナトリウムを０．７　Ｍに加え、そして細胞溶
解物を室温で１−２時間穏やかに振とうした。

細胞溶解物をフェノールとクロロフォルムの１：１混合
物３（１＋１で抽出し、続いてクロロフォルム３０ｍ１
で抽出し、次にエタノールで核酸を沈澱させた。ペレフ
トを２ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁させ、ＲＮａ　ｓ　ｅ
を０．Ｏ０５ａｗ／＋＊１に加えた。３７℃で１時間消
化させた後、ＤＮＡを同量のフェノール、フェノール／
クロロフォルム、及びクロロフォルムでそれぞれ一度ず
つ抽出し、エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを０．５ｍ
ｌのＴＥ緩衝液に再懸濁させ、２６０ｎｍの吸収により
濃度を決定した。

２マイクログラムのゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリス緩
衝剤（ｐ　Ｈ７，５）　、５０　ｍＭＮａｃｌ、１０ｍ
ＭＭｇＣｈ　−１５０ピコモルの配列ｄ　（ｃＡＣＡＧ
ＧＧＣＡＣＴＡＡＣＧ）のプライマーＡ１及び配列ｄ　
（ｃＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣ八）のプライマーＢ
を含む反応容量１００μｌの当初溶液中で増幅し、かつ
蒸発を防ぐため約１００μｌ厚の鉱油で被覆した。

各ＤＮＡ試料につき、■サイクルが次の３ステツプから
成る増幅のための１５サイクルを行った。

（１）２分間９５℃で熱ブロツクセット中で変性する。

（２）熱ブロツクセットを直ちに３０’Ｃに移し２分間
プライマーとゲノムＤＮＡがアニーリングするようにす
る。

（３）Ｅ、コーリーＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断
片にューイングランドバイオラブ）５単位とデオキシＡ
ＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ及びＴＴＰそれ
ぞれ１ナノモルを含む２ｐｉの溶液（１０ｍＭｌ−リス
（ｐＨ７，５）、５０　ｍ　ＭＮａＣｌ、１０　ｍＭＭ
ｇｃｌｚ　、及び４　ｍ　Ｍジチオスレイトールから成
る緩衝液中）を加える。この伸長反応を３０℃にて１０
分間行った。

最後のサイクルの後、９５℃に２分間維持して反応を停
止させた。ＦＬ油は０．２ｍｌのクロロフォルムで抽出
して廃棄した。ＦＸ後の反応液の容量は１３０μｉであ
った。

以下余白 プローブ　びＤｄｅｌ／旧ｎｆｌによる　　した°ノ２
５マイクロリットルの増幅されたゲノムＤＮ４を１タノ
ールで沈澱させ、　同量のＴＥＩＩ衝液中に再！！ＡＳ
した。１０マイクロリツトル（１５４ｎｇのゲノムＤＮ
Ａと同等の前増幅体を含む）を１・５■ｌのフイクロフ
エージ管に入れ、そして２０μ！（７）Ｔ　Ｅｌｌ衝液
により最後の容量を３０μｌとした・試料を鉱油で被覆
して９５℃で１０分間変性した。

ラベルされたＲ３０６プローブ０．０２ピコモルを含む
０．６　ＭＮａＣｌ　１０マイクロリツトルを管に加え
、穏やかに混合し、直ちに５６℃の熱ブロックに移して
１時間おいた。ラベルしていないＲ３ｌ０プロフキング
オリゴマ−４マイクロリツトル（０，８ピコモル）を加
え、更に１０分間同じ温度でハイブリダイゼーシッンを
続けた。５マイクロリツトルの６０　ｍＭＭｇｃｌｇｌ
ｏ、　１％ＢＳＡ及びＬｃｒｌのＤｅｌｌ（１０単位、
ニューイングランドバイオラブ）を加え、再アニーリン
グされたＤＮＡを５６℃で３０分間消化した。１マイク
ロリツトルの肚旦１（１０単位、ニューイングランドバ
イオラブ）を加え、更に３０分インキエベートした。４
μｌの７５ｍＭＥＤＴＡと６μ！のトラッキング染料を
最終容積が６Ｌｐｌになるように反応混合物に加えて反
応を終了した。

鉱油を０．２１のクロロフォルムで抽出し、１８μｌの
反応混合物（４５ｎｓのゲノムＤＮＡ）をヘーファー５
Ｅ２００装置中の３０％ポリアクリルアミドのミニゲル
（Ｉｌｌ、バイオラド）に負荷した。このゲルをブロモ
フェノールブルー染料の前端が当初の位置から３．０　
ｃｍ動くまで約３００ボルトで１時間電気泳動させた。

該ゲルの前端の１．５３は取り除かれ、残りのゲルは４
日間−７０”Ｃで強化スクリーンに曝される。

の−（９゛ 各レーンは４５ｎｇの増幅されたゲノムＤＮＡを含んで
いる。レーンＡは珂ｏ１ｔ４　ＤＮＡを、レーンＢはＣ
Ｈ１２を、レーンＣは５Ｃ−１を、又レーンＤはＧＭ２
０６４を含んでいる０Ｍｏｌｔ４は、細胞当たり２コピ
ーのβ＾遺伝子を有する正常の個体の遺伝子型ＣＡＡで
あり、ＣＨ１２は、細胞当たり１個のβ１と１個のβ３
遺伝子を存する鎌状細胞キャリアからの臨床用試料（Ａ
Ｓ）であり、そして５Ｃ−１は細胞当たり２コピーのＲ
３を有する譲状血球血貧血個体の遺伝子型を意味する。

　ＧＭ２０６４はβ−又はδ−グロビン配列を含有せず
、ネガティブ対照として存在する。

写真から分かるように旦ｄｅｌで開裂された、β＾特異
的であるオクタマーはβＡ遺伝子を含むＤＮＡにのみ存
在しくレーンＡ及びＢ）、立ｆｌで開裂された、β３特
異性を有するトリマーは、β３遺伝子を含むＤＮＡにの
み存在する（レーンＢ及びＣ）、トリマー及びオクタマ
ーの両者の存在（レーンＢ）は譲状赤血球貧血キャリア
を示すものであり、オクタマーのみを生ずる正常の個体
（レーンＡ）及びトリマーのみを示す鎌状赤血球貧血に
かかっている個体（レーンＣ）から区別される。

比較のため、上記実験を増幅されていないゲノムＤＮＡ
を用いて繰り返し行い、増幅を行うと検出感度が少なく
とも１０００倍増加することが分かった。

大施五ｉ 本実施例は、ラベルされたプローブを使用することなく
全ヒトＤＮＡ中の全く精製されていない単一コピー遺伝
子をゲル上で直接検出する方法を示すものである。

実施例３に記載した技術を用い、β−グロブリン遺伝子
の第１エクソン中の配列からの１１０塩基対断片を、全
ヒトＤＮＡｌ０マイクログラムから２０サイクルで増幅
した。この２ｏサイクル後に生産される１１０塩基対断
片は、臭化エチジウムにより容易に染色されてゲル上で
見ることができた。

配列は、最初に制限酵素旦ｄｅｌにより切断されると、
配列がβ−グロビンのＳ対立遺伝子中における場合のよ
うに酵素により認識される制限部位を含まないものでな
い限り、増幅されなかった。

スｌ已ＩＬ Ａ、　ヒトβ−グロビンＡ対立遺伝子からの１．９ｋｂ
挿入部を含有する合計１００フェムトモルのｐＢＲ３２
８，５０００ｉ　１モルである各α−３ｔｐ−デオキシ
ＮＴＰを５０ナノモルずつ、及び実施例３で使用した各
プライマー１ナノモルを、１００μ１０３０ｍＭトリス
−アセテート（ｐＨ７，９）、６０ｍＭ＃Ｍナトリウム
、１００ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭ酢酸マグ
ネシウムを含む溶液中に溶かした。この溶液を１００℃
にして２分加熱し、２５℃にて１分冷却した。４．５単
位のＥ、コーリーＤＮＡポリメラーゼ■及び０．０９単
位の無機ピロフォスファターゼを加えて反応混合物中で
ビロリン酸が生ずるのを防止し、その後反応を２５℃で
２分間進行させ、更に加熱、冷却、酵素の添加及び反応
のサイクルを９回繰り返した。各合成サイクルの後、１
０μｌのアリコートを取り出し１ｕｌの６００ｍＭＥＤ
ＴＡに加えた。それぞれを、９０ｍＭのトリスボレート
及び２．５ｍＭＥＤＴＡ中、ｐＨ８，３で１４％のポリ
アクリルアミドゲル上で２４ボルト／（Ｊ、２．５時間
で分析した。

操作の終了したゲルは、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジ
ウムを加えた同じ緩衝液に２０分浸し、当初の緩衝液で
洗浄し、赤フィルターを用いて紫外線中で写真を逼影し
た。

生産された１１０塩基対断片は紫外線でゲルから切り出
し、そしてクレンコフ放射によす計数した。

Ｎがサイクル数を意味し、ｙがサイクル毎の部分的収率
である式 ％式％） にデータを一致させようとする試みは、ｙが０．６１９
であるときに楽観的なものとなる。これは、十分な増幅
が起こっていることを暗示している。

Ｂ、　各デオキシＮＴＰを１００ナノモルずつ１００μ
ｌの反応溶液に加え、放射性ラベルを行わず、各サイク
ル毎に液を取り出さなかった以外は、上記実験を繰り返
した。１０サイクル後に反応物を２分間沸騰させて反応
を停止させ、５７℃、１時間で再ハイプリダイゼーシッ
ンを行った。　　１１０塩基対生成物の配列を、その８
μｌのアリコートを、１μｌのウシ血清アルブミン（２
５■ｇ／＋ｓｌ）と１μｌの好適な制限酵素（並立ｆｌ
、　Ｍｎｌ　Ｉ　、Ｍ■■！、Ｎｃｏｌ）を加えて制限
分析し、３７℃で１５時間反応させてＶα認した。ＰＡ
ＧＥは、上述の通り行った。

大立桝主 本実施例は、ｐＢＲ３２８とｐ［１Ｒ３２２の種々の断
片を増幅するために異なったプライマーを使用する例を
示す。

Ａ１次のプライマーを使いｐＢＲ３２８の１３０塩基対
断片を調製すること以外は実施例７Ａと同じように実験
を繰り返した。

ｄ　（ＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴ
ＴＣＡＣＴＡＧＣ）及びｄ　（ＧＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣ
ＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）８０次のプ
ライマーを用いたこと以外は実施例７Ａと同じように実
験を繰り返しｐＢＲ３２８の２６２塩基対断片を調製し
た０反応時間はサイクル当たり２０分であった。

以下余白 ｄ　（ＧＧＴＴＧＧＣＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧ
）及びｄ（丁ＧＧＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴ
ＴＧ）Ｃ，ヒトβ−グロビンＳ対立遺伝子からの１．９
ｋｂの挿入部を含む１００フェムトモルのｐＢＲ３２８
のＭｓｔｌｌ消化物を当初の鋳型として用いた以外は、
実施例８Ｂと同様に実験を行った。咳プラスミドはＭ　
ｓ　ｔ　Ｉ　Ｉにより数回切断されたが、増幅すべき配
列の内側では切断が起こらなかった。更に、使用したプ
ライマーは次の通りで、２４０塩基対断片を生産した。

ｄ　（ＧＧＴＴＧＧＣＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧ
）及びｄ（丁ＡＡＣＣＴＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣ
ＣＣ）Ｄ、　　１００フェムトモルのｐＢＲ３２２のＮ
ｒｕｌ消化物を鋳型として用い、１００μｌの反応液中
で各デオキシＮＴＰを２００ナノモル使用し、次のプラ
イマーを使用してｐＢＲ３２２から５００塩基対断片を
生産した以外は実施例７Ｂと同様に実験を行った。

ｄ（丁ＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴ）及び
ｄ　（ｃＴＴＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧ）反
応時間は３７℃でサイクル当たり２０分であった、最後
の再ハイブリダイゼーシッンは５７℃で１５時間行った
。電気泳動は４％アガロースゲル上で行った。

スｍ 本実施例は、インビトロ変異が増幅されたセグメントに
導入されるような本発明方法を例示するものである。

Ａ、Ｎｒｕｌで直線化したｐＢＲ３２２合計１０（ｌフ
ェムトモル、１ナノモルの７５塩基対断片を生成するよ
うに設計されたそれぞれ次式 ％式％） のプライマー、それぞれ１００ナノモルの各デオキシＮ
ＴＰを、ｐＨ８の４０ｍＭ）リス、２０ｍＭＭｇＣｈ　
、５ｍＭジチオスレイトール及びＳａｎｇ／ｍｌのウシ
血清アルブミンの溶液１００μｌ中で混合した。この混
合物を１００℃にして１分間加熱し、水浴中２３℃、０
．５分間冷却し、次に４．５単位のクレノー断片と０．
０９単位の無機ピロフォスファターゼを加え、反応を３
分間行った。加熱、冷却、酵素添加及び反応のサイクル
を９回繰り返した。

１０回目の反応サイクルは凍結により終了させ、反応混
合物のアリコート８μｌを４％アガロースゲルに通用し
、臭化エチジウムにより視覚化した。

Ｂ、オリゴヌクレオチドプライマーとして次式のものを
使用した以外は実施例９Ａと同様の実験を繰り返した。

ｄ（ｃＧＣＡＴＴＡＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧ）　　
及びｄ　（ＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ
ＧＧＧＡＧＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ
Ｔ）これらのプライマーは１０１塩基対を生産するよう
に設計され、その（２番目のプライマー中の）２６ヌク
レオチドはｐＢＲ３２２には存在しない、これらのヌク
、レオチドはＴ７プロモーターの配列を表すもので、こ
れを、ｐＩＩＲ３２２からの７５塩基対配列に、２０の
相補的塩基と２６塩基の５゛側伸長部とを有するプライ
マーを使用して連結した。この方法は２時間より少ない
時間で実施することができ、１００フェムトモルのｐＢ
Ｒ３２２から比較的純粋な１０１塩基対断片２ピコモル
を生産することができた。

Ｔ７プロモーターはＲＮＡ転写を開始させるために使用
できる。Ｔ７ポリメラーゼを１０１塩基対断片に加えて
単１ｉＲＮＡを生成せしめることができる。

Ｃ，オリゴヌクレオチドプライマーとして下記のものを
使用して、ｐＢＲ３２２から１０００塩基対断片を調製
した以外は実施例８Ｄと同様に実験を繰り返した。

ｄ　（ＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴ）及
びｄ　（ｃＣＡＧＣＡＡＧＡＣＧＴＡＧＣＣＣＡＧＣ）
Ｄ、上記９Ｃと同様の実験を繰り返した。但し、オリゴ
ヌクレオチドプライマーとして下記のもの、ｄ　（ＴＡ
ＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴ）　　及びｄ（
ＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧ
ＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴ）を使用
して１０２６対断片を調製した。２番目のブラ。

イマーの２６ヌクレオチドはｐＢＲ３２２には存在せず
、上記のＴ７プロモーターを示すものである。このプロ
モーターは、ｐＢＲ３２２からの１０００塩基対断片に
隣接して挿入された。

これらの結果は、鋳型鎖と完全にマツチしていないがそ
れにもかかわらず十分にハイブリダイズして酵素的に伸
長するプライマーは、当初の鋳型に対応する鎖よりむし
ろプライマーの鎖を含む長鎖生成物を生成せしめるとい
うことを暗示する。

長鎖生成物はインビトロ変異を生じさせる第２のプライ
マー用の鋳型としての役割を果たす、その後のサイクル
では、更に多くのミスベアしたブライミングが要求され
ないので、効率が減少することなくこの変異は増幅され
る。この場合、その５″末端に相補的でない伸長部分が
あるプライマーが、複製されるべき鋳型に隣接して生成
物中に新しい配列を挿入するために使用された。

！土斑上立 本実施例は単コピー遺伝子を増幅させる際にバックグラ
ウンドを減少させるためにネスト状に（ｎｅｓ　ｔｅｄ
）セットしたプライマーを使用することを例示するもの
である。

野性型β−グロビン対立遺伝子についてホモ接合体であ
る全ヒトＤＮＡに対して、２０サイクルの増幅を次のよ
うに行った。１０μｇのＤＮＡ、それぞれ２００ピコモ
ルの次式のプライマー、ｄ（ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴ
ＴＣＡＣＴＡＧＣ”）　　及びｄ　（ｃＡＡＣＴＴＣＡ
ＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）並びに１００ナノモルずつ
のｄＮＴＰを、１００μｌの３０ｍＭ）リス−アセテー
ト、６０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭジチオスレイト
ール、及び１０ｍＭ酢酸マグネシウム中で１００℃にて
１分間加熱し、２５℃に１分間下げて、そして２単位の
クレノー断片とともに２分間処理した。加熱、冷却、ク
レノー試薬の添加のサイクルを１９回繰り返した。１０
μＥの液体を反応混合物から取り出し、更に１０回の増
幅のためのサイクルを次の各プライマーを用いて行った
。

ｄ　（ｃＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣ
ＴＣＣＴＧ）　　及びｄ　（ｃＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡ
ＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣτＣＣ）これらは、上
記で生産された１１０塩基対断片中に含まれる５８塩基
対断片を増幅した。増幅すべき最後の１０回のサイクル
は、ｌＯμｌのアリコートを、上記した各デオキシＮＴ
Ｐ１００ナノモルと各プライマー２００ピコモルを含む
９０μｌの新しいトリス−アセテート緩衝液に希釈する
ことにより達成することができた０反応条件は上記の通
りとした。１０サイクルの後１０μｌのアリコート（当
初のＤＮＡの１００ナノグラムに対応）を６％のＮｕレ
シーブＦＭＣ社）アガロースゲルに加え、臭化エチジウ
ムを使って視覚化した。

第１０図は、紫外線で発光させた従来法の通り赤いフィ
ルターを通して写真撮影した上記ゲルを示すものである
。レーン１は分子量のマーカーである。レーン２は上記
反応のアリコートである。

レーン３は当初の野性型ＤＮＡが増幅の前に旦ｄｅｌに
より開裂されたこと以外は上記したものと同じ反応のア
リコートである。レーン４は線状赤血球貧血β−グロビ
ン対立遺伝子についてホモ接合体であるヒトＤＮＡを増
幅の前にＤｄｅｌで処理したこと以外は上記と同様な反
応のアリコートである（譲状赤血球貧血対立遺伝子は増
幅される断片内に旦ｄｅ１部位を含まない）、レーン５
は鮭の精子ＤＮＡでヒ）ＤＮＡを置き換えた以外は上記
と同様の反応のアリコートである。レーン６は増幅後反
応液を旦ｄｅＩで処理したこと以外は上記と同様な反応
のアリコートである（旦ｄｅｌは５８塩基対の野性型生
成物を２７塩基対及び３４塩基対の断片に変換する）、
レーン７は増幅後Ｄｄｅｌで処理したレーン４の材料の
アリコートである（５８塩基対の譲状赤血球貧血生成物
はＤｄｅｌを含まない）。

アガロースゲルの臭化エチジウム染色のみを使用してヒ
トＤＮＡの１マイクログラムからの単コピー遺伝子を代
表する５８塩基対断片を検出するためには、約ｓｏｏ、
　ｏｏｏ倍に増幅することが必要である。これは、ここ
で２つのオリゴヌクレオチドのネスト状セットを使用し
て達成することができる。第１のセントは１１０塩基対
断片を増幅し、そして内部のネスト状セットは、第１０
図に示すように便利に検出できるレベルになるまでこの
生成物のサブ−断片を増幅する。先行する増幅工程で増
幅された配列中に含まれ、又他のプライマーの伸長生成
物中にも含まれるより小さな配列をプライマーを使って
増幅する末法は、例えばコナーらのＰＮＡＳ８０巻２７
８頁（１９８３年）及びレアリーらのＰＮＡＳ８０巻４
０４５頁（１９８３年）に記載されているように放射性
同位体又は非放射性同位体プローブのハイブリダイゼー
ションの方法論に頬ることなく、β−グロビンの座にお
ける野性型を譲状赤血球貧血対立遺伝子から区別するこ
とを可能にする。

ｘＪＬＬＬ上 末法は、患者のＤＮＡ試料中の例えばクラミジアのよう
な伝染性疾患と関連する特定の配列を、所望の増幅され
た配列を含むビオチン化されたハイブリダイゼーション
プローブを使用しかつ前述の米国特許第４，３５８，５
３５号に記載された方法を使用して検出する際に有用で
あることが期待される。

ビオチン化されたハイブリダイゼーションプローブは、
一部が二重鎖となったＤＮＡに、次式のスペーサーアー
ムを介してビオチンに結合した４°−メチレン置換−４
，５“−８−トリメチルプソラレンを挿入しかつ光を照
射することにより調製することができる。

Ｙ−（ｃ）Ｉｔ）ｚ−０（（ｃｌｌｚ）ｇｏ）　ｙ−Ｃ
ＨｘＣＩＩｔＮＨ一式中Ｙは、Ｏ，ＮＨ又はＮ−ＣＨｏ
、ｘはｌがら４までの数、モしてｙは２から４までの数
である会プローブ上のビオチニル基の検出には（エンゾ
バイオケム社により市販されているストレプタビジンー
酸性フォスファターゼ複合体を用いて、パンツレフトに
製造者が示している検出方法により達成することができ
る。ハイブリダイゼーシヨンプローブは、検出用複合体
との結合、及びそれに続く酸性ホスファターゼにより触
媒される反応（この反応が沈澱性色素を生成する）に基
く沈澱した染色スポットとして見ることができる。

叉星■上又 本実施例では、実施例７の方法を基本的には使用し、ヒ
トβ−グロビン遺伝子上の１１９塩基対断片を次のプラ
イマーを使用して増幅させた。

５’　−ＣＴＴＣＴＧｃａｇＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡ
ＣＴＡＧＣ−３’　（ＧＨｌＢ　　）５°−ＣＡＣａＡ
ｇＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ−３’　　（Ｇ
Ｈ１９）ここで小文字は野性型配列とミスマツチし、制
限酵素部位を生成する。全スキームは表１に示しである
０表１はヒトβ−グロビン遺伝子の１１９塩基対断片を
クローン化しかつ配列決定するために使用され、又内部
制限部位を含むよう設計されているプライマーＧＨ１Ｂ
及びＣ；ＨＩ３を図解したものである。出発コドンＡＴ
Ｇにはアンダーラインが引かれている。ＧＨｌＢは、負
鎖と相補的な２６塩基対のオリゴヌクレオチドでかつ内
部にヱ王１部位を有している。ＧＨ１９は玉鎖に相補的
である２３塩基対のオリゴヌクレオチドであり、内部に
ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を含んでいる。矢印は、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩによる伸長方向を示す、四角で囲った配
列は各プライマーの制限酵素認識配列を示す、これらの
プライマーは、バクテリオファージＭ１３のヱ１０とＨ
ｉｎｄｌｌｌ制限部位に対して相同である遺伝子領域を
第１にスクリーニングして選択された０次に、プライマ
ーは先行する実施例で記載した通りに調製された。

以下余白 工Ｌ１０ ｄｅｌ ＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧ
ＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣ色ＴＧＧτｃｃ
＾ＣＣＴＧ＾ＣＴＣＣＴＧＡＧ（ｉＡＧＡ＋Ｇ＾＾ＧＡ
ＣＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＡＧＴＧＡＴＣＧＴＴＧＧ
ＡＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴＧＧ丁＾ＣＣＡＣＧτＧＧＡＣ
丁ＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＣＴ’ＣＴＴＣＴＩ；ε１！■
ｐｃＴＧＴＧＴＴｃＡｃ丁八ＣＣ皿 ライマー ライマー 以下余白 皿 ＣＣＡ　ＣＴ　Ｔ　Ｇ　ＣＡ　ＣＣＴ　Ａ　＄　Ａ　Ｃ
：Ｇ’ｊＣＴＧＣＣＧＴ？ＡＣＴＧＣＣＣ丁ＧＴＧＧＧ
ＣＣＡＡＧＣＴＧ＾＾ｃｃτ１１．ＧＡＴＧＡＡＧＴＴ
ＧＧＴＧ　（ヤ）’ＣＡＧＡＣＧＧＣＡＡｒＧＡＣＧＧ
ＧＡＣＡＣＣＣＣＧ丁？ＣＣＡＣ丁ＴＧＣＡＣＣＴＡＣ
ＴＴＣＡＡＣＣＡＣ（−）びクローニング 実施例２で述べたように細胞系Ｍｏ１ｔ４から単離した
１マイクログラムのヒトゲノムＤＮＡの増幅を２０サイ
クル行った後、反応生成物の１４分の１を、ラベルした
β−グロビンに特異的であり、その配列が、５°−ＣＴ
ＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＩＩ；ＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧ
ＴＴＡ−−ＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＧＧ−３°であるオリ
ゴヌクレオチドプローブＲ５０６に上述のオリゴマー制
限法を用いてハイブリダイズさせた。溶液ハイプリダイ
ゼーシッンの後、反応混合物を上述した制限消化条件下
で旦±１により処理して８塩基対オリゴヌクレオチドを
生成せしめた。この８塩基対の生成物の量は、増幅され
生成された生成物の量に比例する。

この消化生成物は３０％のポリアクリルアミドゲル上で
分離し、オートラジオグラフィーで視覚化した。

オートラジオグラムを分析した結果、該増幅は野性型β
−グロビン遺伝子の玉鎖及び負鎖のそれぞれと相補的で
あるプライマーＰ　Ｃ０３（５’−ＡＣ−−ＡＣＡＡＣ
ＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−３°）及びＰ　ＣＯ４（
５’−ＣＣ−−ＡＣＴＴＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＣ
−３°）による増幅と増幅効率において匹敵するもので
あることが分かった。

増幅された生成物はエタノールで沈澱して脱塩しそして
ｌ縮し、そしてサンプルを１０ｍＭ）リス、　１　０ｍ
ＭＭｇＣｂ　　、　１ｍＭＤＴＴ、　　　１００ｍＭＮ
ａＣ１から成る制限緩衝液（ｐＨ８）に再溶解し、ヱ王
口及びＨｉｎｄｌｌＩで同時に消化した。その消化後、
試料をセントリコン１０濃縮装置で脱塩し、ベーリンガ
ー・マンハイム社から入手できるＰ　ｓｔｌ／肛ｎｄｌ
ＴＩで消化されたベクター旧３■ｐｌＯ−の０．３マイ
クログラムと、１２℃で一晩連結した。

全部の結合混合物がメリーランド州ベテスダのＢＲＬか
ら入手できるＥ、コーリー株ＪＭ１０３へ形質転換され
た。形質転換株を調製するための方法は、Ａ、ワルトン
によりＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　Ｔｈ１ｒｄＣ１ｅｖｅ
ｌａｎｄ　Ｓ　ｖｘ　ｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍ
ｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　
　１４３−１５３頁に記載されている。

形質転換混合物を、ナイロンフィルターを用いるプラー
クハイブリダイゼーシヨンにょるスクリーニングのため
、Ｘ−ゲル培地上に移した。フィルターを、β−グロビ
ンに特異的な、配列が５’　−ＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡ
ＧＴＡＡＣ（：ＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡ
ＧＴＣＡＧ−３’であるオリゴヌクレオチドプローブＲ
３２４により検知して、β−グロビン挿入部の数を決定
した。

フィルターはプライマーＰＣＯ４で再度標識され、全挿
入数を決定した。

ブレーティング　びスクリーニング 表■は、ブレーティングとプラークハイブリダイゼーシ
ヨンのデータを纏めたものである。フィルターをプライ
マーＰＣＯ４で検知し、増幅とクローニングに起因する
挿入部のパーセントを決定した。　１２０６個のクリア
ーなプラーク（クリアーなプラークの全数の９０％）が
プライマーにハイブリダイズした。１５のプラークがβ
−グロビンに特異的なプラークＲ３Ｏ４にハイブリダイ
ズした。

増幅されたプライマーに陽性なプラークのうちβ−グロ
ビンに陽性なプラークは約１％である。

以下余白 ＴＡＢＬＥ　　Ｉｌ １　　　　　２Ｂ　　　　　　２５　　　　２４６　　
　　　　１合計　　１５８　　　１３２　　１２０６　
　　　１５増幅された配列を含有するプラークに対する
β−グロビン挿入部を含有するプラークの％＝１５／１
２０６Ｘ１００−１．２４％。

全プラークに対するβ−グロビン挿入部を含有するプラ
ークの％−１５／１４９６Ｘ１００　＝約１％。

全プラークに対する増幅された配列を含有するプラーク
のイー１２０６／１４９６Ｘ１００−８０％。

本　プライマーＰＣＯ４とハイブリダイズしないクリア
ーなプラーク。

ｍ−プライマーＰＣ（１４とハイブリダイズスルフクリ
アーなプラーク。

、びサザン　　法 ３つのβ−グロビン陽性プラークと２つのβ−グロビン
陰性プラーク（しかしＰＣＯ４プライマーｉ性）のファ
ージＤＮＡから少し調製したＤＮＡを制限酵素分析法で
分析した。増幅したβ−グロビン断片を含むＭ１３クロ
ーンからのＤＮＡの、に旦ｌ！消化は特徴的な２８３塩
基対断片を生ずる・Ｍｓｔｌ！消化の後、３つのβ−グ
ロビン陽性クローンは全て予想のとおり２８３塩基対断
片を生成し、一方プライマーとのみ陽性であった２つの
クローンは大きい断片を生成した。

この分析からのゲルをＭＳ！ナイロンフィルターに移し
、リグビーらによりＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ　１１３巻２
３７−５１頁（１９７７年）に記載された標準的なニン
クトランスレーシッン法により調製した放射性ラベルヲ
行った二フクトランスレーシツンしたβ−グロビンプロ
ーブとハイブリダイズさせた。β−グロビンプローブと
ハイブリダイズできるバンドは、３つのβ−グロビン陽
性クローンのみであった。２つの他のクローンはβ−グ
ロビンプローブにハイブリダイズしない挿入部を有して
いた。

星■至立扼 β−グロビン挿入部を含むことが制限酵素分析により示
された１０個のβ−グロビン陽性クローンを、Ｍ１３ジ
デオキシ配列決定法を用いて配列決定した。１０の内９
つはβ−グロビンの野性型配列と同一であった。他のク
ローンは、β−グロビンプライマーでは非常に僅かしか
増幅しないことが示されているδ−グロビン遺伝子と同
じであった。

結論として、β−グロビン配列の増幅において、変形さ
れたリンカ−プライマーは変形されていないプライマー
とほぼ等しい効率を宵していた。プライマーは、増幅さ
れたＤＮＡのクローニングベクターへの挿入を容易にす
ることができた。ゲノムの他のセグメントの増幅のため
、１％のクローンのみがヘモグロビン配列を有していた
。

１０の内９つが公にされているβ−グロビン配列と同じ
であることが分かり、該技術はゲノムＤＮＡを高い忠実
度で増幅することを示した。１つのクローンは公表され
ているδ−グロビンと同一であったことが分かり、この
ことはプライマーがδ−グロビンに対する有意な配列相
同性を持っているにもかかわらず、β−グロビン遺伝子
に特異的であることを証明した。

クローニングをβ−グロビンの２６７塩基対断片を用い
て行う場合、このクローニングはジメチルスルフオキシ
ドが増幅工程に存在（３７℃で１０容量％）するときの
み効果的であることが分かった。

制限部位−修飾プライマーを使用して、ヒトＮ−ｒａｓ
ＭｉＪＸ遺伝子を増幅し、クローン化し、一部を配列決
定することができ、更にＨＬＡ−ＤＱ−α及びＤＱ−β
遺伝子の２４０塩基対断片をクローン化することもでき
た。これら全ての増幅は１０容量％のジメチルスルフオ
キシドの存在下３７℃で行った。ＨＬＡ　　ＤＱ−α及
びＤＱ−β遺伝子を増幅するためのプライマーは、臭化
エチジウムで染色したアガロースゲル上に具体的なバン
ドを与えるというよりも汚れを生ずるにすぎないβ−グ
ロビンやＤＲ−βプライマーに比べて、それらの意図す
る標的物に対して海かに特異的であった。更に１（ＬＡ
　　ＤＱ−αプライマーは、所望のＨＬＡ標的断片を含
む増幅される挿入部を有する２０％までのクローンを生
成し、ところがβ−グロビンクローンの１％が標的配列
を含んでいた。ＨＬＡ　　ＤＱ−α及びＤＱ−β遺伝子
クローニングはＤＭＳＯが存在し高温のときにのみ効果
的であった。

去立出土主 本実施例は、それぞれ７４塩基対の２つのオリゴヌクレ
オチドから出発して４９４塩基対のＴＮＦ遺伝子を調製
するために末法を使用することを例示するもである。

以下余白 ブｊ：ヒ乙二 使用したプライマーは実施例２に記載した方法で調製し
、それぞれ７４塩基対を有し、下記に示すものである。

■、下記に示す１０サイクルのプロトコールを、プライ
マーとして下記ステップ（ａ）に概略を示すように相互
作用をするプライマーＴＮＩＯ及びＴＮＩＩを用いて行
った。

■、上上記パート外らの反応混合物全２μｌをプライマ
ーＬＬＯ９及びＬＬ１２に加えた。下記のプロトコール
を１５サイクル行い、これにより下記ステップ（ｂ）で
概略を示すように、プライマーがパートＩの生成物と相
互作用する。

■、パート■からの反応混合物全２μｌをプライマーＴ
ＮＯ８及びＴＮ１３に加えた。下記のプロトコールを１
５サイクル行い、これにより、下記ステップ（ｃ）で概
略を示すように、プライマーがパート■の生成物と相互
作用する。

■、上記パートＩＩＩからの反応混合物全２μｌをプラ
イマーＬＬＯ？及びＬＬ１４に加えた。下記のプロトコ
ールを１５サイクル行い、これにより、下記ステップ（
ｄ）で概略を示すように、プライマーがパート■の生成
物と相互作用をする。

プロトコール 各反応は１００μｌの、 各２ｍＭのデオキシＡＴＰ、デオキシＣＴＰ。

デオキシＧＴＰ及びＴＴＰ； ３μＭの各ステップで使用する各プライマー；１×ポリ
メラーゼ緩衝液（３０ｍＭのトリスアセテート、６０ｍ
Ｍの酢酸ナトリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２
．５ｍＭのジチオスレイトール）　； を含んでいる。

各ステップは、 １）沸騰水中で１分、 ２）室温冷却１分、 ３）ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片１μ！（５単位
）添加、 ４）重合反応の２分間の進行、 から成る。

次のサイクルは再度ステップ１）から始める。

以下余白 十 ５’　　ＬＬＯ９ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
χＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ１十 ５’　　ＴＭ０１　　　　　　　　　　ＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ１以丁余白　　　　　　　　　　　
　（ＴＮ：ＸＸＸＸＸＸＸ　　　　　　　　　　　５’
　　ＬＬ１２：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ　
　　　　　　　５’　　ＴＭ１３：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＦ遺伝子） ■工Ｒと１匝 細胞系５Ｃ−１（ｃＴＣＣ＃００８２）は、１９８５年
３月１９日、米国、２０８５２、メリーランド州ロフク
ビルパークローンドライブ１２３０１に所在するアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクシ四ン（ＡＴＣＣ）
にＡＴＴＴ受理番号第ＣＲＬａ２Ｓ３号として寄託され
た。５Ｃ−１の寄託は、ＡＴＣＣと本特許出願人のシー
タス・コーポレーシッンとの間の契約に従って行われた
。ＡＴＣＣとの契約は、本寄託を記載しかつ特定する米
国特許が発行された場合又は米国又は外国特許出願が公
衆に公告された場合又は公開された場合のいずれか早い
方が来たときにこの細胞系の子孫を公衆がそれを永続的
に利用できるようにするために提供し、更に本細胞系を
利用させることについては、米国特許商標間長官が米国
特許法第１２２条及びそれに関する長官のルール（３７
ＣＦＲ１，１４条も特に８８６００６３８に関連して含
む）に従つて権限を持って決定した人間に対しても行う
０本出願の譲受人はもし寄託した細胞系が好適な条件下
で培養したにもかかわらず、死滅し、失われ、損傷した
ときは通知を受けてから迅速に同じ細胞系の育成培養基
と置き換えることに同意する。

纏めると、本発明はまず１つ又はそれ以上の特定の核酸
を、プライマーの伸長により生産される生成物が引き続
き次のプライマーの伸長反応の鋳型としての役割を果た
すような連鎖反応を用いて増幅させることにより核酸中
の配列を検出するようにした方法を提供する０本法は当
初にほんの僅かの量しか含まれていない核酸配列を検出
するた。

めに特に有用である。更に増幅法は分子クローニングに
も使用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、増幅されることが望まれるヒト−β−グロビ
ンの９４塩基対長の配列を示すものであり、線状赤血球
貧血に伴う単一塩基対変化を９４■ｅｒの下方に描いで
ある。 第２図は、ヒトの野性型ＤＮＡ中、及び正常のβ−グロ
ビン遺伝子のｌ、９ｋｂの旦憇旧断片を含むプラスミド
（ｐＢＲ３２Ｂ　：　ＨｂＡと示される）中に含まれる
上記９４ａ＊ｅｒの増幅を示す臭化エチジウムで染色さ
れたポリアクリルアミドのゲルの写真である。 第３図は、ＧＩＢＲ３２８：　ｌｌｂ＾、及びβ−グロ
ビンの鎌状赤血球対立遺伝子の１．９　ｋ　ｂ旦憇旧断
片を含有するプラスミド（ｐＢＲ３２８：　ＨｂＳと称
する）中に存在する特定の標的９４−ｍａｒ配列のいず
れかの増幅を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動のオ
ートラジオグラフを示し、ｐＢＲ３２Ｂ　：　１ｌｂＡ
では増幅されるべき配列がＭｓｔ　ＩＩにより開裂され
、そしてｐＢＲ３２Ｂ　：　ＨｂＳでは増幅されるべき
配列が処理されたがＭｓｔＩ［により開裂されなかった
。 第４図は、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用い
る３サイクルについて、ヒトβ−グロビンの所望の９４
髄ｅｒ配列の増幅のためのポリメラーゼの連鎖反応のス
テップと生成物の詳細を示すものである。 第５図は、ｐＢＲ３２８：　ＨｂＡ中の２４０ｍａｒ配
列の４サイクル後の増幅を示す臭化エチジウムで染色さ
れたポリアクリルアミドのゲルを示す写真であり、ここ
はアリコートがＮｃｏｌ（レーン３）　、　ＭｓＬＩＩ
（レーン４）又はＨｉｎｆｌ　（レーン５）により消化
される。レーン１は分子量の基準で、レーン２は無傷の
２４０ｂｐの生成物を含んでいる。 第６図は、旦ｄｅｌ及び並立［１制限部位間にある正常
な（β＾）β−グロビン遺伝子及び譲状赤血球（β３）
β−グロビン遺伝子の配列を示すもので、β＾について
の１本線はＤｄｅ１部位（ｃＴＧＡＧ）の位置を示し、
β＾及びβ３についての２重線はＨｉｎｆＩ部位（ＧＡ
ＣＴＣ）の位置を示している。 第７図は、４０ｍｅｒプローブ、並びにＤｄｅｌ及びこ
れに続く基１ｎｆｌ制限酵素を用いる正常β−グロビン
の逐次的な消化の結果を示すものである。 第８図は、第７図と同じ４０＋ｅｒプローブ並びに旦ｄ
ｅｌ及びこれに続く旦旦ｆｌ制限酵素を使用する線状β
−グロビンの逐次的な消化の結果を示すものである。 第９図は、増幅、プローブとのハイブリダイゼーション
、及び旦ｄｅＩと旦１ｎ４１による逐次的消化を受けた
全ヒトＤＮＡの試料中に存在するβ−グロビン対立遺伝
子を特異的に特徴付けるための・第７図と同じ４Ｏ−ｓ
ｅｔプローブの使用を示す・臭化エチジウムで染色され
たポリアクリルアミドのゲルを示す写真である。 第１０図は、臭化エチジウムと紫外線を用いて視覚化し
た６ｚのＮｕレシーブガロースゲルの写真を示すもので
ある。この写真は、１１０−ｈｐ増幅生成物のサブ−フ
ラグメントの増幅を示し、このサブ−フラグメントは１
１０ｂｐ断片内の内部ネストである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、１種の核酸又は複数の核酸の混合物を含む試料中に
   少なくとも１種の特定の核酸配列が存在するか否かを検
   出し、あるいは試料中の２種の異なった配列を区別する
   方法であって、該試料は該配列を含むと思われるもので
   あり、そして、（ａ）増幅されるべきそれぞれの異なっ
   た特定の配列の各鎖用のオリゴヌクレオチドプライマー
   で、増幅されるべきそれぞれの異なった特定の配列の各
   鎖について各核酸鎖に相補的な各プライマーの伸長生成
   物が合成されるようなハイブリダイゼーション条件下、
   前記試料を処理し、かつここで前記プライマーは、各特
   定の配列の鎖に実質的に相補的であるように選択され、
   １つのプライマーから合成された伸長生成物が、それが
   相補物から分離されたときに他のプライマーの伸長生成
   物の合成の鋳型としての役割を果たすものであり、（ｂ
   ）検出すべき配列が存在すれば、変性条件下で前記試料
   を処理して鋳型からプライマーの伸長生成物を分離し、 （ｃ）前記試料をオリゴヌクレオチドプライマーにより
   、ステップ（ｂ）で生成した各単鎖を鋳型として使用し
   てプライマーの伸長生成物が合成されるように処理して
   、もし存在するならば前記特定の配列の増幅を生じさせ
   、 （ｄ）ステップ（ｃ）の生成物に、検出されるべき各配
   列用であり該配列又はその変異体とハイブリダイズする
   ことができる標識されたオリゴヌクレオチドプローブを
   加え、そして、 （ｅ）該ハイブリダイゼーションが生じたか否かを決定
   する、 ことから成る方法。 ２、ステップ（ｂ）と（ｃ）は少なくとも１回繰り返さ
   れ、ステップ（ａ）と（ｃ）はプライマーとともにある
   いは別に加えられる４つの異なったヌクレオチド三リン
   酸と重合用試薬により処理することによって行われるも
   のである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、重合用試薬がＥ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリ
   メラーゼ、Ｅ・コリＤＮＡポリメラーゼ I のＫｌｅｎ
   ｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素で
   ある特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、前記核酸が二重鎖であり、そして該鎖がステップ（
   ａ）の前に変性により分離される特許請求の範囲第１項
   〜第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５、前記核酸がＤＮＡであり、そしてプライマーがデオ
   キシリボヌクレオチドである特許請求の範囲第１項〜第
   ４項のいずれか１項に記載の方法。 ６、使用される各プライマーは、その５′末端に他のプ
   ライマーの制限部位と同じか異なった制限部位を有し、
   そしてステップ（ｃ）の後であってステップ（ｄ）の前
   に該各制限部位に特異的な制限酵素によりステップ（ｃ
   ）の生成物を開裂させ、該開裂した生成物を開裂してい
   ない生成物と分離し、そしてステップ（ｄ）で使用する
   特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の
   方法。 ７、前記特定の核酸配列が遺伝子性疾患、癌性疾患又は
   伝染性疾患と関連している特許請求の範囲第１項〜第６
   項のいずれか１項に記載の方法。 ８、１又は２以上の核酸を含む試料中の少なくとも１つ
   の特定の核酸配列（該核酸の少なくとも１つがこの配列
   を含有すると思われる）を検出すするためのキットであ
   って、 （ａ）検出されるべきそれぞれ異なった配列の各鎖用の
   １又は複数のプライマーのためのコンテナー（このプラ
   イマーは各特定の核酸配列の各鎖に実質的に相補的であ
   って、１つのプライマーから合成された伸長生成物がそ
   の相補物から分離されたときに、他のプライマーの伸長
   生成物合成用の鋳型としての役割を果たすことができる
   ）（ｂ）重合試薬を収容するコンテナー； （ｃ）４つの異なった各ヌクレオシド三リン酸用のコン
   テナー； （ｄ）配列が試料中に含まれるならばその配列とハイブ
   リダイズすることができる標識されたオリゴヌクレオチ
   ドプローブを収容するコンテナー；及び、 （ｅ）該プローブと該配列のハイブリッドを検出する手
   段を収容するコンテナー； を有するパッケージタイプの多コンテナー型ユニットか
   ら成るキット。 ９、１種の核酸又は複数の核酸の混合物中に含まれる特
   定の核酸配列をベクター中にクローニングする方法であ
   って、 （ａ）増幅されるべきそれぞれの異なった特定の配列の
   各鎖用のオリゴヌクレオチドプライマーにより、増幅さ
   れるべきそれぞれの異なった特定の配列の各鎖について
   各核酸鎖に相補的な各プライマーの伸長生成物が合成さ
   れるような条件下、前記核酸を処理し、かつここで前記
   プライマーは、各特定の配列の鎖に実質的に相補的であ
   るように選択され、１つのプライマーから合成された伸
   長生成物が、それが相補物から分離されたときに他のプ
   ライマーの伸長生成物の合成の鋳型としての役割を果た
   すものであり、更に該プライマーはそれぞれその５′末
   端に、他のプライマーの制限部位と同じか異なった制限
   部位を有するものであり；（ｂ）その上で単鎖分子が合
   成された鋳型からプライマーの伸長生成物を分離； （ｃ）オリゴヌクレオチドにより、ステップ（ｂ）で生
   産された単鎖分子を、ステップ（ｂ）で生成された各単
   鎖を鋳型として使用してプライマーの伸長生成物が合成
   されるように処理し、ここで増幅されるべき特定の配列
   に依存してステップ（ａ）と（ｃ）を０から有効量まで
   のジメチルスルフォキシドの存在下、あるいは約４５℃
   までの温度のもとで行い； （ｄ）ステップ（ｃ）の生成物に各制限部位用の制限酵
   素を加えて、制限消化中に開裂した生成物を得、そして
   、 （ｅ）開裂した生成物を１又は２以上のクローニングベ
   クターに連結する； ことから成る方法。 １０、合成すべき核酸断片より少ないヌクレオチドを有
   する既存の核酸断片と２つのオリゴヌクレオチドとから
   核酸断片を合成する方法であって、該合成すべき核酸は
   左方のセグメント、中央のセグメント及び右方のセグメ
   ントから成り、該中央のセグメントは少なくとも実質的
   に前記既存の核酸断片のヌクレオチド配列を意味し、左
   右のセグメントは２つのプライマーの５′末端に存在す
   るヌクレオチド配列を意味し、これらの３′末端は前記
   既存の核酸の鎖を分離することにより生ずる単鎖の３′
   末端に相補的かあるいは実質的に相補的であり；そして
   、 （ａ）各核酸鎖に相補的である各プライマーの伸長生成
   物が合成されるような条件下で、前記既存断片の鎖を２
   つのオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、ここで、
   該２つのプライマーは、一方のプライマーから合成され
   る伸長生成物が相補物から分離されたときに他方のプラ
   イマーの伸長生成物の合成のための鋳型としての役割を
   果たすように、前記既存断片の各鎖の３′末端と実質的
   に相補的であるように選択され、そして各プライマーは
   その５′末端において前記既存断片と相補的でなく、合
   成すべき核酸断片の２つの末端に対応するヌクレオチド
   の配列を含むものであり；（ｂ）その上でプライマー伸
   長生成物が生成された鋳型からプライマー伸長生成物を
   分離して単鎖分子を生成せしめ；そして （ｃ）スッテプ（ｂ）において生成した各単鎖を鋳型と
   して用いてプライマー伸長生成 物が合成さる条件下で、ステップ（ｂ）から生じた単鎖
   分子をスッテプ（ａ）のプライマーにより処理し、こう
   して２つの中間二重鎖核酸分子（このそれぞれは、オリ
   ゴヌクレオチドプライマーの一方の５′末端に存在する
   核酸配列が導入されている）と２つの十分な長さの核酸
   分子（このそれぞれには、オリゴヌクレオチドプライマ
   ーの両方の５′末端に存在する核酸配列が導入されいる
   ）とを生成せしめ； （ｄ）前記十分な長さの二重鎖分子の有効量を生産する
   のに十分な回数ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）を繰り
   返し； （ｅ）ステップ（ｄ）の生成物の鎖を２つのプライマー
   で処理して、ステップ（ｄ）の生成物が両末端において
   伸びるように処理し；そして、（ｆ）中央セグレメント
   としてのステップ （ｄ）の生成物及びステップ（ｄ）の生成物の鎖を分離
   することにより生成する単鎖の３′末端と相補的か実質
   的に相補的である２つのオリゴヌクレオチドプライマー
   を使用しながらステップ（ａ）からステップ（ｄ）まで
   を繰り返す； ことから成る方法。