JPH05504477A - 特定のヌクレオチド変異の決定のための方法および試薬 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 特定のヌクレオチド変異の決定の ための方法および試薬 技術分野 本発明は、限定されたポリヌクレオチド領域における特定のヌクレオチド変異の 決定のための方法および試薬ならびに特定の点突然変異および遺伝的変異の同定 におけるこの方法の用途に関する。

背景技術 生物の遺伝情報は、生物のゲノムのヌクレオチド配列中に伝えられている。遺伝 子発現の過程において、ヌクレオチド配列はアミノ酸配列、すなわちタンパク質 に翻訳される。ヌクレオチド配列における小さな変化は、−個の塩基の置換でさ え、タンパク質生産物が変更されるという結果を生じうる。えられるタンパク質 の質または量か変更されることで、その生物またはその細胞の遺伝表現型（すな わち観察しつる特性）が変化する。そのような遺伝表現型の変化は、たとえば、 病気の発展として観察されうる。

遺伝病および癌の素質ばかりでなく、遺伝病の原因となる正確な分子の欠陥につ いての情報は急速に増加しつつある。しかしながら、多数のサンプルをスクリー ニングするための迅速で確かなアッセイ手順がないために、悪性１瘍における体 細胞変異の関連性についての情報は限られている。

点突然変異によって起こる遺伝病には、鎌状赤血球貧血およびβ−サラセミアが 含まれる。これらは、β−グロビン遺伝子における突然変異によって起こる（ア ントナラキス（Ａｎｔｏｎａ＋ａｋｉｓ）　、１９８９、ニューイングランドジ ャーナル　オブ　メディシン（Ｎｅｗ　ＥＢｌａｎｄ　Ｊ　Ｍｅｄ）、３２０巻 、１５３〜１６３頁）。これらの突然変異は、一般に正常な遺伝子の配列から１ から４個のヌクレオチドの置き換え、挿入または削除を包含する。鎌状赤血球貧 血は、β−グロビン遺伝子の６番目のコドンにおける唯一の塩基対の置換につい てのホモ接合性（ｈｏｍｏＢｇｏｓｉτＹ）によって起こる（アントナラキス、 前出）。β−サラセミアに導きうる、β−グロビン遺伝子における多数の突然変 異はすでに特徴づけされている（アントナラキス、前出）。

点突然変異によって起こる、他の知られた遺伝病には、α−サラセミア、フェニ ルケトン尿症、ヘモフィリア、αｌ−アンチトリプシン欠損症（アントナラキス 、前出）および嚢胞性線維症が含まれる。

嚢胞性線維症は、最もありふれた常染色体劣性遺伝病である。白色人種人口の約 １／２０００人がこの病気にかっかでいる。したがって、保因者の頻度は約５％ である。

最近の嚢胞性嚢胞性線維過膜貫通物質（ＣＦＴＲ）遺伝子（ケレム（Ｋｅ＋ｅｍ ｊ　ら、１９８９、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４５巻、１０７３−１０ ８０頁）のクローニングおよび遺伝学的分析により、ΔＦ５０８　と表わされる １つの主要な突然変異が判明した。これは、アミノ酸残基５０８番でフェニルア ラニンの欠失を生じる３つのヌクレオチドの削除である。この突然変異の罹患率 は、　１００以上のＣＦ染色体を包含する報告において４０〜８８％の範囲であ り、北米およびヨーロッパのｐ者人口において平均して６８％である。

嚢胞性線維症の頻度は高いため、危険群の国（ｔｉｃｋＢｏｕｐ　ｃｏｕｎ＋＋ ｉｅ＋）では保因者のスクリーニングのための、および出生前診断のための有効 な方法が必要とされている。

病気に対する素質と関係のある多型性（ｐｏ１７ｍｏ＋ｐｈロｍ）の−例は、ア ポリポタンパク質Ｅ遺伝子の３対立（ｔｈｒｅｅ−ａ　ｌ　ｌ　！ｌ　ｉ　ｃ） 多型性である。この多型性は、ＡｐｏＥ遺伝子上の２つのＤＮＡ位置での単一塩 基置換によるものである（マーレイ（Ｍａｈｌｅｙ）、１９８８、サイエンス、 ２４０巻、６２２〜６３０頁）。血清コレステロール水準における個人差の１０ ％はどは説明しうる。タイプＩＩＩ高すポタンパク質血症の患者の９０％以上は ＡｐｏＥの対立遺伝子の１つについてホモ接合である。

ヒト主要組織適合性複合体は、ゲノムの保存領域中に位置する連結した遺伝子の 多型性システムである。ＨＬＡ−Ｄ　（ヒト白血球抗原）領域中のクラス１１遺 伝子は一連の高多型性対立遺伝子をコードする（トムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ）　 、１９８８、アニュアル　レビュー　オブ　ジェネティクス１Ａｎｎｕ、Ｒ＋ｖ 、Ｇｅｎｅｔ！　、２２　：　３１〜５０　；モレル（Ｍｏｄｅｌ）　ら、１９ ８８、プロシーディング　オブ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンス　オ ブ　ユナイテッド　スティン　オブ　アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　５ｃｉＵＳＡ）、８５　：　８１１１−８１１５　；シャルフ（Ｓｃｈ ａ＋！ｊら、１９８８、ＰＴＯＣ，！ｌａｄ、〜ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、 　８５　：　３５０４〜３５０８）　、この多型性は、インシュリン依存性糖尿 病および尋常性天庖癒などの自己免疫疾患に対する罹病性に関連していることが 示されている。

ヒトｒａｓ遺伝子ファミリー（相同なＨ−１Ｋ−およびＮ−ｒａｓ遺伝子を含む ）は、ヒト腫瘍発生において１つの役割を果す、突然変異変化の潜在標的の１つ である。ｒａｓ遺伝子のコドン１２．１３または６１のいずれにおける点突然変 異も、これらの遺伝子を形質転換オンコジーンに変えることがわかっている（ボ ス（Ｂｏ＋）　ら、１９８５、ネイチ＋　−（Ｎａ＋ｌ１ｒｅ）、３１５巻、７ ２６〜７３０頁）。Ｎ−ｒａｓ遺伝子における体細胞突然変異が急性骨髄性白血 病（ＡＭＬ）（ファル（Ｆ　ａ　ｔ　＋ｊら、１９８８、ＰＩＯＣ，Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５　：　１６２９〜１６３３）および他の 血液の悪性腫瘍（ネリ（Ｎｅ＋ｉ）ら、１９８８、Ｐ＋ｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　［ｌＳＡ。

８５　：　９２６８−９２７２　）に関連して検出された。非常に多数の正常細 胞の中の少量の白血病細胞におけるＮ−ｒａｓ突然変異の感度のよい検出のため の方法は、ＡＭＬおよび他のＮ−ｒａｓ関連悪性腫瘍の治療の追跡調査において 、非常に価値ある手段を構成するであろう。

Ｎ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２．１３および６１の第１および第２の位置におけ る特定の塩基の変更の検出には、多数の異なるオリゴヌクレオチドプローブとの ハイブリダイゼーションまたは増幅されたＤＮＡの直接配列決定のいずれかが必 要である。両方法における重大な点は、突然変異を含む細胞の割合である。選ぶ 方法によって、検出可能であるためには、突然変異は、分析される細胞の５〜２ ０％に存在しなくてはならない。

微生物における点突然変異および遺伝的変異は、病原性または治療に対する耐性 の変更につながりつる。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）はンドブジン（＋ １ｄＯｖｕｄｉｎｅ　（〜２１１）に耐性である変異体をつくり出すことができ る。その耐性ウィルス単離体は数個の点突然変異を含むが、３つの突然変異はす べての耐性株に共通するように見える・１〜＋ｐ６７−へ＋ｎ　（ＧＡｃ−ＡＡ Ｃ）、Ｌ７＋７０−人Ｂ　（ＡＡＴ−Ｇ　Ａ　Ｔ　）およびＴｈ＋２１５−Ｐｈ ｅ　（ＡＣＣ−ＴＴＣｊ　もしくはＴＴ＋　（入ＣＣ−Ｔ、Ｂｊ（ラーダー（ｔ ａｒｄｅｔ’Ｈおよびケンプ（Ｋｅｍｐｊ、１９８９、サイエンス　２４６・１ １５５〜１１５８）。

したがって、生物のゲノムにおけるヌクレオチド配列中の変更を正確に、かつ多 数のサンプルをスクリーニングしうるほど効率的で簡単に決定することができれ ば、有意義である。これによって、遺伝疾病素貧もしくは遺伝病の出生前もしく は後の診断のための機会ならびに癌における体細胞突然変異の検出のための機会 がえられる。

そのような方法は、産業バイオテクノロジーのための細胞および株の選択に、な らびに植物および動物の改良にも用いられうる。現在利用可能な方法は、ルーチ ンでの使用が限られるという欠点を有している。

Ｄ　Ｎ　Ａ配列における多型性または突然変異は、最も一般的には、対立遺伝子 特異性オリゴヌクレオチド（ＡｓＯ）プローブへのハイブリダイゼーションによ って検出される。Ａ　Ｓ　Ｏプローブのヌクレオチド配列は、完全にマツチした ハイブリッドを形成するようにまたは変異ヌクレオチド残基の部位にミスマツチ した塩基対を含有するように設計される。マツチしたハイブリッドとミスマツチ したハイブリッドとの間の区別は、１）ハイブリダイゼーションまたは洗浄の際 に用いられる条件におけるハイブリッドの熱安定性の相異（ヨーロッパ特許公開 Ｈｐ−２３７３６２）　、ｉｉ）変性勾配電気泳動ｆｄ：ｎａｕ＋ｉｎｇ　ｇ＋ ａｄｉ＋ｎｔｅｌ＋ｃｔ＋ｏｐｈｏ＋ｅ＋ｉ＋）　により分析されたノ＼イブリ 、ソドの安定性の相異または１ｉｉｊミスマツチの部位での化学的開裂（ヨーロ ッパ特許公開ＥＰ−３２９３１１）に基づく。

変異ヌクレオチドの部位に相補的な３′末端を有すｊオリゴヌクレオチドが、対 立遺伝子特異的プライマーとして用いられている（ヨーロッパ特許公開ＥＰ−３ ３２４３５）。

変異ヌクレオチドの同定は、３′末端のミスマツチはポリメリゼーション反応を 阻害するという事実にもとずく。

オリゴマーリゲーションアツセイにおいて同様の方法が用いられる。その方法で は、２つの隣接するオリゴヌクレオチドが、その末端で完全にマツチするときに のみ、それらのオリゴヌクレオチドはリゲーションされる（ヨーロッパ特許公開 ＥＰ−３３６７３１）。

制限酵素でのＤＮＡ配列の開裂は、変異ヌクレオチドが、特定の制限部位を、た とえばつくるまたは壊すなど、変更するということを条件に、変異の同定に用い られうる。ヌクレオチド配列決定は、変異ヌクレオチドの決定のために最も有益 な方法である。

上で述べた方法は比較的複雑な手順であり、そのためルーチンの診断における使 用が困難であるという欠点を有する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロ ーブの使用には、それぞれの適用について別々に反応条件を注意深く最適にする ことが必要とされる。上の方法のいくつかには、ゲル電気泳動による分画が必要 である。そのような方法は、容易に自動化されない。

我々は、今やヌクレオチド変異の検出を可能にする改善された方法を開発した。

この方法は、従来の技術に勝るいくつかの利点を提供する。本発明の方法は、少 ない、容易に行なわれる手順からなるものである。本発明の方法は、とくに、点 突然変異ならびに単一のミスマツチ、欠失、挿入および逆位のようなヌクレオチ ド変異のルーチンの決定に適している。本発明の方法では、分析される細胞の全 数の０．５％程度の少数しか存在しない突然変異の同定だけでなく、サンプル中 の突然変異細胞の割合の定量をも可能とする。さらに、開示された方法の全部の プロトコールは、容易に自動化されうる。自動化は、ルーチンの診断においてま すます重要になっている。

変異ヌクレオチドの検出の方法は、プライマーの延長および、検出の段階で検出 可能なヌクレオチドトリホスフェートの取り込みに基づいている。変異ヌクレオ チドと直接に隣接する領域から検出段階プライマーを選択することにより、この 変異を１つのヌクレオチドトリホスフェートはどの少ない取り込みの後でも検出 することができる。

変異ヌクレオチドとマツチする標識されたヌクレオチドトリホスフェートを加え て、検出段階プライマーへの標識の取り込みを測定する。

検出段階プライマーの選択は本発明の方法にとって重要であり、関心のあるヌク レオチド配列によって決まる。

好ましくは検出するべき変異ヌクレオチドから３′末端方向の領域に直接及ぶよ うに検出段階プライマーを選ぶ。

検出段階プライマーは、変異ヌクレオチドから取り除かれたいくつかのヌクレオ チドの始めの配列に相補的であってもよい。検出段階プライマーの位置に関する 唯一の制限は、検出段階プライマーの３′末端と検出すべき変異ヌクレオチドと の間の配列は、検出すべきヌクレオチド残基と同型のものを含んでいてはならな いということである。検出段階プライマーは、関心のあるヌクレオチド配列のコ ードストランドまたは非コードストランドのいずれに対しても、相補的であるよ うに等しくうま（選ぶことができる。

標的核酸は、好ましくは、ヒトゲノム中の単一の変異ヌクレオチドを検出しうる ようにインビトロでの増幅により豊富化される。本発明では、これよりも以前に 開示された、検出すべき標的核酸の増幅および親和性修飾のための方法を有利に 用いることができる。本方法では、変異ヌクレオチドを含有する標的核酸は、標 的核酸から増幅混合物を除くことが可能であるような固体支持体上に固定化され る。

本発明には、本発明の方法を実施するための個々のプライマー試薬および試薬の 組合わせ、すなわちキットもまた含まれる。厳密な試薬および包装は検出するべ きヌクレオチド変異または点突然変異のタイプによるが、そのようなキットには 一般に、少なくとも１つの付着部分を有する修飾された増幅プライマーおよび少 なくとも１つの検出段階プライマーが含まれるが、また、標的核酸の修飾された コピーを固定化するのに適合する少なくとも１つの支持体および少なくとも１つ の標識化ヌクレオシドトリホスフェートを含んでいてもよい。

ＦＩＧ　１は、１つの変異ヌクレオチド残基（ＸｌまたはＸ２）が検出されるば あいの、開示された方法による試験のための構成を説明するものである。

ＦＩＧ　２は、検出段階プライマーが検出すべき変異ヌクレオチドからｎヌクレ オチドのヌクレオチド配列に及ぶように選ばれたものであるばあいの、開示され た方法による試験のための構成を説明するものである。

ＦＩＧ　３は、互いに隣接する複数のミスマツチを検出するばあいの、開示され た方法による試験のための構成を説明するものである。このばあいには、試験は ２段階で行なわれる。段階２を行なう前に、検出段階プライマー１を溶出させる 。

図面で用いる記号。

−ＸおよびＸ′はヌクレオチド残基を示す。

−検出すべき変異ヌクレオチドは、Ｘ　１Ｘ２、Ｘ３またはＸ４のいずれかで示 される。

−Ｙ、、Ｙ　、Ｙ３およびＹ４はそれぞれＸｌ、Ｘ　１Ｘ　またはＸ４に相補的 なヌクレオチドを示す。

−ｄＹはデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを示す。

−ｄＹ＊およびｄＹ　は標識化デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを示 す。

−ｄｄＹはジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを示す。

−ｄｄＹ＊およびｄｃｌＹ−は標識化ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェ ートを示す。

−率および＋は異なる検出可能な標識を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、複雑な核酸混合物中に存在する核酸のあらかじめ定められた領域にお ける特定のヌクレオチド変異を決定する方法に属する。ヌクレオチド変異を含む この定められた領域を、ここでは「標的核酸」と呼ぶ。

本発明の方法は、検出すべき変異ヌクレオチドから３゛のヌクレオチド配列に相 補的な少なくとも１つの検出段階プライマーを用いるプライマー延長反応に基づ いている。変異ヌクレオチドの検出は、検出段階プライマーの延長により取り込 まれる標識化ヌクレオシドトリホスフェートを検出することにより行なわれる。

好ましくは、検出段階に先立って、検出可能な量の標的核酸をえるため標的核酸 をインビトロで増幅する。核酸の現実の量は、検出段階で用いる標識部分および その標識部分を分析する技術の感度により異なるであろう。

本発明の好ましい方法においては、標的核酸の関心のある領域のコピー中に親和 性部分を導入する。少なくとも１つの親和性標識をされた増幅プライマーを用い たプライマー依存増幅反応により、親和性部分の導入を便利に行なう。標的核酸 のコピーを、導入した親和性部分の助けで固体支持体上に固定化する。

テストの異なる構成を以下に好ましい具体例の記載において述べ、さらに実施例 により説明する。テストの作成の可能性はこれらの示された実施例に限定される ものでないことおよびテストの構成は与えられた検出すべき突然変異またはヌク レオチド変異によって決定されるということは、当業者にとって明白である。

ａ）標的ＤＮＡのコピーへの親和性部分の導入変異ヌクレオチド残基を含むと思 われる標的核酸源（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、ヒト、動物もしくは植物の細胞ま たは微生物のいずれでもよい。標的核酸は、通常の核酸精製方法により、生物学 的サンプルがら単離することができるが、本発明の方法では、精製していない生 物学的サンプルを用いることが可能である。

関心のある変異ヌクレオチド部位を含む標的核酸を、好ましくは関心のあるヌク レオチド配列に近接した１またはそれ以上のプライマーを用いてインビトロで増 幅する。ここで用いられる「増幅」の語は、ポリメライジングエージェントの助 けをかりたヌクレオチド配列のいがなるプライマー依存延長をも指す。適当なプ ライマー依存延長反応は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅ＋ａ＋ ＋　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）　（クレッペ（Ｋｌｅｐｐ＋）ら）１９７ １、ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオロジー（Ｌ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ ）　５６　：　３４１〜３６１およびアメリカ特許４、６８３．２０２　）　、 プライマー依存複製および非依存転写の両方を用いる方法（ヨーロッパ特許公開 　Ｅ　Ｐ　−３２９８２２）またはリゲーション増幅反応法（ｌｉｇａｔｉｏｚ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　＋ｅａｃｔｉｏｌ　（Ｐ　ＣＴ特許公開　ＷＯ− ８９１０９８３５）である。

我々はこれより前に、ルーチン診断手段として用いるのに向いている簡便なヌク レオチド配列決定法を開発した（アメリカ特許出願Ｓ、　Ｎ、　２７７、６４３ 　、ここでは参考として組み入れる）。この方法は、ここで参考として組み入れ るアメリカ特許Ｓ、　！１．０２４．６０４に開示された親和性を基礎とするハ イブリッド収集法を利用する。好ましくは、テストすべき標的ＤＮＡを、配列決 定の前にインビトロで増幅する。この方法では、増幅反応に用いるプライマーの １つは、ビオチンのような付着部分を含有する。豊富化された断片を、ストレプ トアビジンまたはアビジンを付着した固体マトリックス上に捕獲する。過剰の試 薬を、マトリックスを洗浄することにより完全に除去する。

捕獲された断片を一本鎖とし、読終わり反応を直接マトリックス上で行なう。読 終わり反応の生成物を解放し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動ののちヌクレオ チド配列を決定する。この診断に適した固相配列決定法には、前記のヌクレオチ ド変異の決定のための従来の技術よりも有利な点がいくつかあるが、しかし依然 として手のかかる、高価な、熟練を要する配列決定ゲル電気泳動段階が含まれる 。

本発明では、ヌクレオチド変異を含むと思われる標的核酸の増幅は、標的核酸配 列のコピー中に親和性部分を導入した修飾プライマーを用いることにより簡便に 行なわれる。そのような増幅においては、一方または両方の増幅プライマーを付 着部分を含むように修飾する。どちらの増幅プライマーを修飾するように選択す るかによって、二重鎖ＤＮＡのどちらの鏡上に変異部位が検出されるか決定する ことが可能である。好ましくは、この修飾ポリメラーゼ連鎖反応を適当なサイク ル数行なうことで、関心のある標的配列を増幅する。

この過程の結果として、合成されたポリヌクレオチド分子中へ修飾プライマーを 取り込むことにより、元の標的核酸配列のコピー、今や付着部分で修飾されてい るコピーをえる。

二こで用いられる「付着部分」の語は、他の構成要素に対して親和性を有し、そ の構成要素とともに親和性ペアを形成するいずれの構成要素をも指す。たとえば 、ビオチン−アビジン／′ストレプトアビジン、抗原もしくはハプテン−抗体、 重金属誘導体−チオ基、ポリｄＧ−ポリｄＣ，ポリｄＡ−ポリｄＴおよびポリｄ Ａ−ポリＵのようなホモポリヌクレオチドなどの様々なポリヌクレオチドがその ような親和性ペアである。互いに強い親和性を有するいかなる構成要素ペアをも 、親和性ペアとして用いることができる。免疫学的方法において用いられるリガ ンドおよびコンジュゲートの中にも適当な親和性ペアを見出す。「付着部分」は 親和性部分または親和性部分の付着のための部位を提供する部分である。

ここで用いられる「修飾された増幅プライマー」の語は、付着部分を含むように 修飾されたオリゴヌクレオチドプライマーを指す。オリゴヌクレオチドプライマ ーは、標準的な化学的方法によって合成してもよいし、組換えＤＮＡ技術により 作製してもよい。増幅プライマーの必須の特徴は、関心のある部位が増幅される ように、配列中のある点で元の関心のある標的ヌクレオチド配列と塩基対形成に よって特異的に結合することができるということである。したかって、増幅は標 的核酸の３−末端と関心のある部位との間の標的ヌクレオチド配列の領域に相補 的でなくてはならない。増幅プライマーの３″末端は、ポリメラーゼ酵素の前進 性における限界のため、好ましくは関心のある部位から＋００残基以上離れてい ない点にある標的核酸配列と相補的である。プライマーの大きさは、好ましくは １４から４０塩基の間であるが、８塩基はどの短いプライマーまたは４０塩基よ りかなり長いプライマーも用いうる。化学的または酵素的または他の方法を用い て、プライマーを付着部分にて修飾する。好ましくは、付着部分はプライマーの ５゛末端に付着させる。

プライマーの塩基対を形成する性質および延長反応において機能する能力を維持 するという条件で、他の部位に付着することもまた可能である。

ｂ）標的核酸コピーの分離 増幅のあと、標的核酸コピーを増幅混合物から分離する。本発明の好ましい方法 においては、付着部分を含む標的核酸分子のコピーを、相補的付着部位、たとえ ば親和性ペアの他方の構成要素の助けで固体マトリックス上に固定化する。つぎ に、マトリックスを洗浄して、検出段階の間の反応を妨げる、ヌクレオチドトリ ホスフェートおよびプライマーのようなすべての非結合物賀を除去する。固定化 された標的核酸を、固定化段階の前または後のいずれかに一本鎖にする。修飾さ れた標的核酸コピーの固定化により、同じ関心のある標的配列について複数の決 定を行なわなくてはならないとき、標的配列を再使用することが可能となる。

ここで用いられる「固体マトリックス」の語は、ビーズ、微粒子、マイクロタイ ターウェルもしくは試験管の表面、検油棒（ｄｉｐｓｔｉｃｋｊまたはフィルタ ーのような、いかなるかたちをも指す。マトリックスの材料は、ポリスチレン、 セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、 デキストランまたはアガロースであってもよい。材料について唯一の必要条件は 、付着部位がそれに付着することができるということである。

増幅混合物から分離したのち、−末鎖ＤＮＡ断片をプライマー、すなわち変異ヌ クレオチドの３′ヌクレオチド配列と相補的である検出段階プライマーとハイブ リダイズさせる。これは固定化された状態で、または溶液中で行なうことができ る。

ここで用いる「検出段階プライマー」の語は、プライマー依存延長のための開始 点として機能するオリゴまたはポリヌクレオチドプライマーをさす。検出段階プ ライマーは、検出すべき変異ヌクレオチドと直接または近接して隣接するヌクレ オチド配列とハイブリダイズするように選ばれる。前記の段階（ｂ）においてど ちらのストランドが固定化されたかによって、二重鎖の標的のコードストランド または非コードストランドのいずれに対して相補的であるようにも検出段階プラ イマーを選ぶことができる。たとえば前記ａ）項で述べたように親和性部分で、 しかし異なる親和性部分を用いて検出段階プライマーを修飾することができる。

好ましくは、検出段階プライマーは修飾しない。

検出段階プライマーの選択は、検出すべきヌクレオチド変異の性質によって決め られる。

本発明の方法の好ましい具体例では、検出段階プライマーを、検出すべき変異ヌ クレオチドに直接隣接しているように選ぶ。

本発明の方法の別の具体例では、検出段階プライマーを、検出すべき変異ヌクレ オチドからｎヌクレオチド残基離れたヌクレオチド配列にハイブリダイズしうる ように選択する。検出段階プライマーの３′末端と変異ヌクレオチドとの間のｎ 個のヌクレオチド残基に関する唯一の制限は、これらｎヌクレオチド残基の中に 検出すべき残基と同一のヌクレオチド残基があってはいけないということである 。

本発明の別の具体例では、２またはそれ以上の変異ヌクレオチド残基を同定する 。このばあいには、少なくとも２つの異なる検出段階プライマーを設計すること が必要である。

検出すべきヌクレオチド変異によるテストの構成を、さらに以下に述べる。

ｄ）検出段階プライマーの延長 検出段階プライマーを標的核酸のコピーとアニーリングさせ、プライマー延長に 適する条件の下、少なくとも１つの標識されたもしくは修飾されたヌクレオシド トリホスフェートを含む１またはそれ以上のヌクレオシドトリホスフェートを含 有する溶液に、ポリメライジングエージェントとともに加える。標識化デオキシ リボヌクレオシドトリホスフェ−）　（ｄＮＴＰ　ｓ）または読終わりジデオキ シリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ　ｓ）のいずれをも用いるこ とができる。ポリメライングエージェントにより、プライマーは、プライマーと 隣接する変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオシドトリホスフェートで延長され る。この検出段階プライマー延長の間、延長された核酸を、たとえば修飾され増 幅されたコピーの親和性結合によって、固定化していてもよい。

または、そののち、たとえば親和性−修飾化検出子プライマーによって、固定化 してもよい。いずれのばあいにも、親和性マトリックスを洗浄したのち、取り込 まれた標識を直接にマトリックス上でまたは溶出後に測定する。

ここで用いる「標識化ヌクレオチドトリホスフェート」の語は、検出可能な標識 で標識された、または検出可能な標識と結合可能な付着部分を包含するよう修飾 されたいかなるヌクレオシドホスフェート、デオキシ−もしくはジデオキシヌク レオシドトリホスフェートをも指す。

感度は、標識の検出されやすさにより変化するが、本発明の方法は、用いられる 標識に依存しない。検出可能な標識の選択に関する唯一の制限は、ポリメリゼー ション反応の間、標識化ヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを妨害しない ということである。

ここで用いる「ポリメライジングエージェント」の語は、核酸のプライマー依存 延長の可能ないかなる酵素をも指す。適当な酵素には、たとえば、Ｔ７ＤＮＡポ リメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ニジエリシア　コリ（Ｅ＋ｃｈ！＋１ｃ ｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼのフレナラ（に１ｅｌｌｏｖ）断 片および他の適当なりＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素ならびにサーマス　アクア チヵス（Ｔｈ＋＋ｍｕ＋ｘｑｚａ＋ｉｃｐ＋　）およびサーマス　サーモフィラ ス（Ｔ。

：５！Ｔコｏｐｈｉｌｑｌ　のような高温細菌由来のポリメラーゼが含まれる。

ｅ）ヌクレオチド変異を検出する好ましい聾様ＦＩＧ　１は本発明の具体例を図 式で説明するものである。

調べるべき部位の２つの二者択一のヌクレオチド残基を表わすＸｌおよびＸ２と ともに、標的核酸をＸ−で表わす。ＦＩＧ　１で説明される検出段階プライマー はＹ′で表わされ、調べるべき部位の３′の文字で直接始まる標的配列の部分に 相補的である。本発明を実行するには、検出段階プライマーを標的配列にハイブ リダイズし、選ばれた１種のヌクレオシドトリホスフェートまたは複数種ヌクレ オシドトリホスフェートの混合物を加え、プライマーの延長に好ましい条件下、 鎖延長反応を進めさせる。

本発明の最も単純な具体例では、ヌクレオシドトリホスフェート混合物には、Ｘ 　またはＸ２のいずれかに対応する、標識化ジデオキシヌクレオシドトリホスフ ェート（ｄｄＮＴＰ）のみが含まれる（ＦＩＧ　１の選択枝ａ）。

ｄｄＮＴＰの取り込み、この１つのヌクレオチドのみの取り込みによりプライマ ーの延長が終了し、その後、加えたヌクレオチドの取り込まれた標識を検出する ことにより、変異ヌクレオチドを決定することができる。

この具体例は、検出すべきヌクレオチド変異が単一の点突然変異（Ｘ　−Ｘ２） からなるものであるときに、とくに適している。サンプルを２つの部分に分割す るこのサンプルを同定することができる。分割しないサンプルに、２またはそれ 以上の異なる、かつ異なる標識をされたｄｄＮＴＰを加えることも、同じく可能 である（ＦＩＧ　１の選択枝ｂ）。この具体例では、１つの分割しないサンプル から、同部位に生じた１以上の点突然変異を決定することが可能である（Ｘ　− Ｘ　ＳＸ　またはＸ４）。

検出すべき変異ヌクレオチドに対応する標識化デオキシヌクレオシドトリホスフ ェート（ｄＮＴＰ）を用いて、この標識の取り込みを測定することも可能である 。標識化ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐを用いるときは、他の３種のヌクレオチド残基に対応す る非標識化ｄｄＮＴＰを加えることが、必要ではないが有利である（ＦＩＧ　１ の選択枝且）。読経わりｄｄＮＴＰを加えることで、おそらく修飾段階（ａ　） がら残るＮＴＰの取り込みを防ぐ手段が提供される。

さらに別の可能性は、２またはそれ以上の異なる、かつ異なる標識をされたｄＮ ＴＰを用いることにより、分割しないサンプル中のへテロ接合体を検出すること が可能となることである。２以上の標識化ｄＮＴＰを用いるばあい、標的配列中 の変異ヌクレオチド残基の後のヌクレオチド残基Ｘが加えたヌクレオチドのいず れかと同一であると、結果の解釈が困難であるかもしれない（図１の選択枝ｄ） 。

ＦＩＧ　２は、本発明の他の具体例を図式で説明するものである。ＦＩＧ　２に おける検出段階プライマーは、検出すべき変異ヌクレオチドからｎヌクレオチド 残基離れて始まっている標的配列の部分と相補的である。検出段階プライマーの ３′末端と変異ヌクレオチドとの間のｎ個のヌクレオチド残基に関する唯一の制 限は、これらｎヌクレオチド残基の中に検出すべきものと同一のヌクレオチド残 基があってはならないことである。このばあい、加えるヌクレオシドトリホスフ ェートは、プライマーと変異ヌクレオチドとの間のｎヌクレオチドに相補的な非 標識化ｄＮＴＰおよび少なくとも１つの検出すべきヌクレオチド変異によって決 まる標識化ヌクレオシドトリホスフェートからなる。もちろん、前に述べたよう に、ＦＩＧ１互および旦で説明される具体例において、２またはそれ以上の異な る標識をされたｄｄＮＴＰを用いることができる。

さらに、ＦＩＧ　３は本発明の２またはそれ以上の変異ヌクレオチド残基を同定 する、また別の具体例を図式で説明するものである。このばあいには、少なくと も２つの異なる検出段階プライマーを設計することが必要である。

東１のプライマーは、第１の変異ヌクレオチド残基に直接に隣接して始まるヌク レオチド配列に相補的であるように選ばれる（ＦＩＧ　３のプライマー１）。さ らに、プライマー１により検出される第１の変異ヌクレオチド残基にも及ぶよう に１またはそれ以上の検出プライマーを選ぶ。テストは、サンプルを２つに分割 して行なうことができる。それによって、プライマー１をサンプル１に加え、第 １の変異ヌクレオチド残基を同定する。他の２つのプライマー（ＦＩＧ　３のプ ライマー２および３）をサンプル２に加え、第２の変異ヌクレオチドを検出する 。標的核酸配列の固定化によって、第１の変異ヌクレオチドの検出ののちの、プ ライマーを除去するための溶出段階を含めて、前述の検出段階を続けて行なうこ とによりその後の２またはそれ以上の変異ヌクレオチドを分割しない単一のサン プルから同定することができる。

本発明の方法を実行するのに用いる試薬は、別々に提供されてもよく、またはキ ットの形態にひとまとめにされていてもよい。たとえば、１またはそれ以上の検 出段階プライマーおよび１またはそれ以上の標識化ヌクレオチドトリホスフェー トからキットを作製してもよい。好ましくは、さらに１またはそれ以上の親和性 標識された増幅プライマーおよび対応する固体支持体をいっしょに組合せたもの も含めて作製してもよい。

キットの容器中の試薬の配列は、含まれる特定の試薬によって決まる。各試薬は 別々の容器に包装してもよいが、様々な組合せもまた可能である。

以下の具体的な実施例によって本発明を説明するが、それによって本発明の範囲 が限られることを意図するものではない。

実施例１ 標識として一５コＳを用いたアミノ酸残基１１２および１５８に対するコドンに おけるアポリポタンパク質Ｅ多型性の同定 オリゴヌクレオチドの合成 アプライド　バイオシステムズ社ｆＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ＋ｙｕ！ｍ＋）の３８ １ＡＤＮＡ自動合成機にて、４つのＰＣＲプライマー（Ｐｉ〜Ｐ４）および２つ の検出段階オ＋）−ｆ−ｊライマー（ＤｉおよびＤ２）を合成した。オリゴヌク レオチドのヌクレオチド配列およびアポリポタンパク質Ｅ遺伝子（、Ａ　ｐ　ｏ 　Ｅ　）上でのそれらの位置（ヌクレオチド番号として示す）は。

Ｐｉ　：　５’　−ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＧＣＣＴＡＣＡＡＡ　Ｔ （３６１６〜３６３７）　［配列番号１コＰ３　：　５’−ＧＡＡ　ＣＡＡ　Ｇ ＴＧ　ＡＧＣＣＣＧ　ＧＴＧ　ＧＣＧ　Ｇ（３６４９〜３６７０）　［配列番号 ２］Ｄｌ　：　５′−ＧＣＧ　ＣＧＧ　ＡＣＡ　ＴＧＧ　ＡＧＧ　ＡＣＧ　ＴＧ （３７２５〜３７４４）　［配列番号３コＤ２　：　５’−ＡＴＧ　ＣＣＧ　Ａ ＴＧ　ＡＣＣＴＧＣＡＧＡ　ＡＧ（３８６３〜３８８２）　［配列番号４］Ｐ２ 　：　５’−ＴＣＧ　ＣＧＧ　ＧＣＣＣＣＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＡＣＡ（３９１ ４〜３８９３）　［配列番号５］Ｐ４　：　５’　−ＧＧＡ　ＴＧＧ　ＣＧＣＴ ＧＡ　ＧＧＣＣＧＣＧＣＴ　Ｃ（３９４３〜３９２２）　［配列番号６コである 。

アミノリンク１１試薬（ａｍｉａｏｌｉｎｋ　Ｉｆ　ｚａｇｅｎ＋）　（アプラ イド　バイオシステムズ社）とともに、プライマーＰ２に５′−アミノ基を加え る。そのアミノ基は、スルポーＮＨＳ−ビチオン（ピニルセケミカル社（Ｐｉｅ ｒｃｅＣｈｍｉｃａｌ　Ｃｏ、））を用いてビオチン化し、逆相ＨＰＬＣにより 精製した。

ＤＮＡサンプル フィンランド国、ヘルシンキ（Ｈｅｌ＋１ｎｋｉ）のリピッドオートペイシャン ト　クリニック　オブ　ユニバーシティ　セントラル　ホスピタル（Ｌｉｐｉｄ 　０ｕｔｐａｔｉｅｎ＋　Ｃｌ１ｎｉｃｏｆ　［：ｎ１ｙｅｚｉｌｙ　ＣｅｎＨ ａｌ　ＨＯ＋ｐｉｔａｌ）の担当する、知られたＡｐｏｌ：フェノタイプの患者 から静脈血サンプルをえた。標準的手順にしたがって、白血球ＤＮＡを抽出した 。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅 ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各０．２ｍＬ２０ｍＭ　Ｔ＋ｉ＋− ＭＣＩ　（ｐＨ８，８）　、１５ｍＭ（ＮＨ４）　２Ｓｏ４．１、５ｚＭ　Ｍｇ （１，０，ｉ％　丁ｖｅｉｎ　２０、０１ｍｇ／ｚｌゼラチンおよび２．５ユニ ツトのサーマス　アクアナカスＤＮＡポリメラーゼ（ユナイテッド　スティッ　 バイオケミカル社（Ｕｚｉ＋＋ｄ　Ｓ＋ａ＋！＋　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｒｐ、：　）の溶液１００μｌ中、ＰｌおよびＰ４プライマー（最終濃度１μ Ｍ）とともにＤＮＡ　（サンプルあたり　ｌＯＬ＋ｇ）をＤＮＡサーマルサイク ラー（ｔｈｅ＋コａｌ　ｃｙｃｌｅ＋）　（パーキン−エルマー／シーラス（Ｐ ｅ＋ｋｉｎ−Ｅ１ｍｅ＋　／　Ｃｅｔｕ＋））にて、１分間９６℃および２分間 ６５℃で２５サイクル増幅を行なった。この第１のＰＣＲ増幅混合物の一部分（ １・１００希釈の３μｌ）を第２のＰＣＲへ移行した。この第２のＰＣＲは、ビ オチン化プライマーＰ２およびＰ３指令で前述の条件にて行なった。

アビジンコートされたポリスチレン粒子（０，８μｍ１バクスターへルスケア社 （Ｂａｘｔ＋＋　ＨｅｘＮｈｃａ＋ｅ　Ｃｏｒｐ、）　）の５％（Ｗ／Ｖ）懸濁 液の５μｌを、第２増幅混合物の一部８０μｍへ加えた。サンプルを２０℃にて ３０分間保った。

エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏ＋り遠沈管中２分間遠心して粒子を集め、１ｍ ｌの１５ｍＭ　ＮａＣｌ、　１．５ｍＭ　Ｎａ−クエン酸（０，１ＸＳＳＣ）、 　０２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）でボルテクシング（ｖ　ｏ　ｔ　ｔ 　ｌ　Ｉ　ｉ　ｎ　ｇ）することにより１回、さらに１ｍｌの０．１５Ｍ　Ｎａ Ｃ１，２０１ｎＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）（ＰＢＳ）中０．１％７ｖｅｓ ｎ　２０で１回洗浄した。つぎに、粒子をｌｚｌの５０ｍＭ　ＮａＣ１，４０ｍ Ｍ　Ｔ＋ｉ＋−）ＩｃＩ（ｐＨ７，５）中０１％Ｔｖｅｅｎ２０で１回、さらに １ｍｌの５０ｎＭ　ＮａＣｌ　、４０ｚＭＴ＋ｉ＋−１１ｃｌ　（ｐＨ７，５） 中０．１％Ｔｖｅｅｎ　２０で２回洗浄した。

最後の洗浄溶液中に粒子を懸濁したものを４分割し、別々の試験管中遠心により 粒子を集めた。

変異ヌクレオチドの同定 ＤＮＡ断片を担った粒子を、２ｐモルの検出段階プライマーを含有する１０μｌ の５０ａ＋ＪＩ　ＮａＣ１，２０ＩＩｌｉＪｉ１ｇｃ１２．４０ｍＭ　Ｔ＋ｉ＋ −ＨＣｌ　（ｐＨ７，５ｉ中に懸濁した。変異ヌクレオチド３７４５番（コドン １１２、ＴまたはＣ）に直接隣接して位置するＤ１オリゴヌクレオチドを前記試 験管の２つに加え、変異ヌクレオチド３８８３番（コドン１５８、ＴまたはＣ） に隣接したＤ２オリゴヌクレオチドを２つの試験管に加えた。サンプルを６５℃ にて２分間熱することによりオリゴヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとアニーリングし 、２０℃に冷却した。１μｌの０．１Ｍジチオスライトールならびに［３５Ｓ］ −標識化デオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）およびジデオキシ ヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）を以下のように加えて、最終容量 １５μ■中各１μＭ濃度とした・ −丁の同定用＝［３５コ　５−ｄＴＴＰ　（アマジャム）、ｄｄＣＴＰおよびｄ ｄＧＴＰを、１本にはオリゴヌクレオチドＤ１および１本にはオリゴヌクレオチ ドＤ２が入ってアニーリングされた２本の試験管に加えた。

−〇の同定用：　［”５］　５−ｃｌｃＴＰ　（アマジャム）、ｄｄＴＴＰおよ びｄｄＧＴＰを、１本にはオリゴヌクレオチドＤ１および１本にはオリゴヌクレ オチドＤ２が入ってアニーリングされた２本の試験管に加えた。

Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（セクエナーゼ（Ｓｅｑｏｅｎａ＋ｅ）商標、ユナイテ ッド　スティン　バイオケミカル社）の２μ１（３Ｕ）を各試験管に加え、４２ ℃にて６分間反応を進行させた。微粒子を、１ｍｌの　Ｌｌｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，０ ，２％ＳＤＳにて２回ボルテクシングすることにより２回、ＰＢＳ中０．１％Ｔ ｖｅ＋ｑ２０にて２回、２０℃で洗浄した。反応生成物の溶出のため、粒子を２ ００μｌの水中５分間煮沸し、氷上で冷却し、エッペンドルフ遠沈管中２分間遠 心した。溶出された放射能を液体シンチレーションカウンター中で測定した。フ ェノタイプＥ２／Ｅ２　（コドン１１２でＴ　／”　Ｔ　、コドン１５８でＴ／ Ｔ）　、Ｅ４／Ｅ３　（コドン１１２でＴ　／′Ｃ、コドン１５８でＣ／Ｃ）　 、Ｅ　２／Ｅ　３（コドン：１２でＴ／Ｔ、コドン１５８でＴ／Ｃ）およびＥ４ ／′Ｅ４（コドン１１２でＣ／Ｃ，コドン１５８でＣ／Ｃ）の４つのサンプルを 前述のようにして分析した実験の結果を以下の表に示す Ｉ　Ｅ２／Ｅ２　Ｄｉ（１１２）　１８４００　６２５　Ｔ／Ｔ２　Ｅ４／Ｅ３ 　Ｄｉ（１１２）　７３７００　５８１００　Ｔ／Ｃ３Ｅ２／Ｅ３　Ｄｉ（１１ ２）　１１２０００　１３６０　Ｔ／Ｔ４　Ｅ４／Ｅ４　Ｄｉ（１１２）　２３ １０　９９７００　Ｃ／Ｃ５ＤＮＡなし　ＤＩ　（１１２）　４２９　１１９５ １Ｅ２／Ｅ２Ｄ２（１５８）６７０００７０００Ｔ／Ｔ２　Ｅ４／Ｅ３　Ｄ２（ １５８）　３２２０　３５１００　Ｃ／Ｃ３Ｅ２／Ｅ３　Ｄ２（１５８）　４４ ６００　２６４００　Ｔ／Ｃ４Ｅ４／Ｅ４　Ｄ２（１５８）　１４８５　１９３ ００　Ｃ／Ｃ５ＤＮＡなし　Ｄ２　（１５８）　６８６　７６０Ｔ−反応および Ｃ−反応によってえたｃｐｍの値における差異により、４つすべてのＤＮＡサン プル中コドン１１２およびコドン１５８双方における変異ヌクレオチドを明らか に同定した。

ビオチン化プライマーＰ３およびプライマーＰ２で第２のＰＣＲを行なうほかは 、前記のようにして変異ヌクレオチドを任意に決定することができる。つぎに、 検出段階プライマーとして、ＡｐｏＥ遺伝子の反対の（ｏｐｐｏｓ目ｅ）鎖に相 補的なプライマーを用いる・Ｄ４　：　５’−ＧＴＡ　ＣＴＧ　ＣＡＣＣＡＧ　 ＧＣＧ　ＧＣＣＧＣ（３７６５〜３７４６）　［配列番号７］Ｄ５・５’　−Ｇ ＧＣＣＴＧ　ＧＴＡ　ＣへＣＴＧＣＣＡＧ　ＧＣ（３９０３〜３８８４）　［配 列番号８］実施例２ １つの反応に二つの標識化（ＩＩＨ］および［３２Ｐ］）を用いた、アポリポタ ンパク質Ｅ遺伝子のコドン１１２中の変異ヌクレオチドの同定 オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡサンプルこの実施例では、実施例１で述べたＰ ＣＲプライマーＰ１、ビチオン化されたＰ２、Ｐ３およびＰ４、ならびに検出段 階プライマーＤ１を用いた。実施例１で述べたようにして、血液サンプルからＤ ＮＡを抽出した。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および親和性捕獲実施例に１に述べたよう にして、ＰＣＲ増幅および増幅された断片の親和性捕獲を行なった。最後の洗浄 段階で、サンプルをそれぞれ２分割した。

コドン１１２での変異ヌクレオチドの同定ただちに３′からコドン１１２におけ る変異ヌクレオチドヘハイブリダイズする検出段階プライマーＤ１を２ｐモル含 有する緩衝液（実施例１参照）１０μｌ中に粒子を懸濁した。実施例１で行なっ たように、アニーリング反応を行なった。　０．１Ｍジチオスライドール１μｌ を加えた。

［３Ｈ］−および［”’Ｐ］−標識化されたｄＮＴＰを同時に１つのサンプルに 加えることによって、変異ヌクレオチド（ＣまたはＴ）の同定を奇行なった。［ ３Ｈ］−ｄＣＴＰおよび［３２ＰコーｄＴＴＰまたは［３Ｈ］　−ｄＴＴＰおよ び一２ＰコーｄＣＴＰ　（アマジャム）のいずれかを用いた。［３Ｈコ−ｄＮＴ Ｐは１μＭ濃度になるように加えた。［３２Ｐｌ　−ｄＮＴＰを非標識化ｄＮＴ Ｐ中へ希釈し、最終濃度１μＭおよび口３Ｈ］　−ｄＮＴＰの比放射能と同様の 比放射能とした。すべての反応には１μＭ　ｄｄＧＴＰを含有させた。最終容量 を１５μｌとした。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを３ユニット加え、実施例１で行な ったように標識化および洗浄の手順を行なレーションカウンター（ファルマシア ／ワラク（Ｐｈａ＋ｍａｑｉａ、ｙ’Ｗａｌｌａｃ）　）で〔３Ｈコ用ウインド ウをチャンネル１０〜９０に、［３２Ｐコ用ウインドウをチャンネル１３０〜２ ２０に合わせることにより測定した。

下の表は、３つのサンプル、フェノタイプＥ　２／Ｅ　３（コドン１１２でＴ　 ／−′Ｔ　’）の１つ、フェノタイプＥ　４／Ｅ４（コドン１１２でＣ／’　Ｃ ）の１つおよびフェノタイプＥ３／Ｅ４（コドン１１２でＴ／Ｃ）の１つを、［ ３Ｈコ−ｄＣＴＰおよび［３２ｐ］−ａＴＴｐを用いるかまたは［３Ｈ］−ｃｌ ＴＴＰおよび［３２Ｐ］　−ｄＣＴＰを用いるかのいずれかにより、分析した。

Ｅ４／Ｅ４　［３ＨコｄＣＴＰ／［３２Ｐ］ｄＴＴＰ　６０７０　１８６Ｅ３／ Ｅ４　［３Ｈ１ｄＣＴＰ／［３２Ｐ］ｄＴＴＰ　５１２０　５９８０ＤＮＡなし 　［３）１］ｄＣＴＰ／［３２Ｐ’１ｄＴＴＰ　１７２　１４８Ｅ２／Ｅ３　［ ３ＨコｄＴＴＰ／　［３２Ｐ１　ｄＣ丁ｐ　１０８００　１８３Ｅ４／Ｅ４　［ ３）ＩＭＴＴＰ／ｌ”２Ｐ１ｄＣＴＰ　３９４　４９３２Ｅ３／Ｅ４　［３Ｈ］ ｄＴＴＰ／［３２Ｐ］ｄＣＴＰ　７８００　５１４０異なる標識を担う２種のｄ ＮＴＰを用いて分割しないサンプルからえたシグナルにより、コドン１１２にお ける変異ヌクレオチドが同定された。この実施例では、各反応で各サンプルの半 量のみを分析した。したがって、サンプルの残り半量をＡｐｏＥ遺伝子のコドン １５８におけるヌクレオチド変異を分析するのに用いることができる。

実施例３ 単回ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ののちのアポリポタンパク質Ｅ遺伝子のコ ドン１５８における変異ヌクレオチドの同定 オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡサンプルこの実施例では、ＰＣＲ増幅において 、ビオチン化プライマーＰ２およびプライマーＰ３を用いた。検出段階プライマ ーはＤ２てあった（実施例１参照）。実施例１に述へたようにして、静脈血より ＤＮＡを抽出した。

ポリメラーゼ連鎖反応増幅および親和性捕獲１分間９６℃、１分間５５℃および １分間７２℃の３０サイクルからなる増幅段階を１回行なっただけであることを 除いて、実施例１で述べた条件で、ビオチン化Ｐ２およびＰ３プライマー（最終 濃度１μＭ）を用いてＤＮＡ（サンプルあたり　１０１００ｎを増幅した。

実施例］で行なったようにして、アビジンコートしたポリスチレン粒子上への親 和性捕獲を行なった。最終洗浄段階において、各サンプルを２つに分割した。

コドン１５８における変異ヌクレオチドの同定コドン１５８の変異ヌクレオチド の３′と直接ハイブリダイズする検出段階プライマーＤ２を２ｐモル含有する緩 衝液（実施例１参照）　１０μｌ中に粒子を懸濁した。実施例１で行なったよう にアニーリング反応を行なった。

３　ｉＭジチオスライトール１μｍを加えた。実施例１に述べたようにして、Ｔ −およびＣ−反応に（，３５３コー標識化ｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰを加えた。

実施例１に述べたようにして、プライマー延長反応、洗浄手順および結合放射能 の溶出を行なった。

フェノタイプＥ２／Ｅ２（コドン１５８でＴ／’Ｔ）、Ｅ２／Ｅ３（コドン１５ ８でＴ／Ｃ）およびＥ４／Ｅ３（コドン１５８でＣ／Ｃ）を有する３つのサンプ ルを分析した。

この実験の結果を下の表に示す Ｅ２／Ｅ２　６４６００　７７４６　Ｔ／ＴＥ２／Ｅ３　３９６００　２２７０ ０　Ｔ／ＣＥ４／Ｅ３　５６４０　５３５００　Ｃ／ＣＤＮ、Ａなし　１３２５ 　１９１０ この方法により、Ａ　Ｉ）　ＯＥ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片が１つのプライでの変異ヌク レオチドも正しく同定された。

実施例４ 酵素的検出をともなうアポリポタンパク質Ｅ遺伝子のコドン１１２における変異 ヌクレオチドの同定オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡサンプル実施例１で述べた ＰＣＲプライマーＰ１、ビオチン化Ｐ２、Ｐ３およびＰ４ならびに検出段階プラ イマーＤ１を用いた。ＤＮＡを実施例１で述べたようにして、血液サンプルから 抽出した。

ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ　ＣＲ）増幅実施例１で述べたようにして、プライマ ーＰ１およびＰ４を１μＭ濃度で用いてＤＮＡ　（サンプルあたり　１００ｎｇ ）を増幅した。この第１ＰＣＲ混合物の１　！００希釈の３μｍを、ビオチン化 Ｐ２およびＰ３プライマーを０１ＭＭ濃實で用いて、再増幅した。第２のＰＣＲ は、１分間９６℃、１分間５５℃および１分間７２℃で３０サイクル行なった。

第２のＰＣＲ混合物のサンプルあたり１５μＩＸ２をストレプトアビジンで受動 性吸収によりコートされたマイクロタイター用ウェル（ヌンク（Ｎａｎｃ）、マ キシソルブ（Ｍａｘｉ＋ｏ＋ｂ））　ヘ移した。Ｏ，１５Ｍ　ＮａＣ１、０，１ Ｍ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ　、ｐＨ７，５（ＴＢＳ）中０１％Ｔｖｅｅｎ２０を各ウ ェル３０ｍ１加えた。このマイクロタイター用プレートをゆるく振とうしながら ３７℃にて３時間インキュベートした。ウェルを２０℃にて２００ｍ１のＴＢＳ 中０，１％Ｔｖｅｅｎ２０で３回洗浄した。

つぎに、ウェルを２０℃にて５０ｍＭ　Ｎ＋ＯＨＩＯＧμｌで５分間、２回処理 を行なった。つづいて、２００ｍ１の　０．１ＸＳＳＣ１０２％ＳＤＳで２回、 ＴＢＳ中０１％Ｔｖｅｅａ　２０で２回、５０ｍＭ　！ｆａｃｌ、４０ｍＳｉ　 Ｔ＋ｉ＋−ＨＣｌ　、　ｐＨ７５中０１％Ｔｖ＋ｅａ２０で１回ならびに最後に ５０ｍＭ　ＮａＣ１、４０ｍｊ　Ｔｔ’＋５−ＨＣ：、ｐｉ７５中００１％Ｔｗ ｅｅｎ２０で１回洗浄した。

変異ヌクレオチドの同定 ５０ｕ　１の０．９Ｍ　ＮａＣ１１０，２Ｍ　Ｔ＋ｉ＋−可ＣＩ　、ｐＨ７，５ 中１０ｐモルオリゴヌクレオチドＤ１を各ウェルに加えた。

ウェルを６５℃にて２分間熱し、ゆっくり２０℃まで冷却した。混合物を捨て、 ２０℃にて２００　ｕ　１の０．２５Ｍ　ＮａＣ１０、２Ｍ　Ｔ＋１ｓ−ＨＣＩ 　、　ｐＨ７，５で１回ウェルを洗浄した。１μＭジゴキシゲニンー１１−ｄＵ ＴＰ（ベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｈ＋ｉｎｇｅ＋−Ｍａｎａｈｅｉｍ） 　）　、１　μＭ　ｄ　ｄ　ｅ　Ｔ　Ｐ。

１ＭＭ　ｄｄＧＴＰ、０．２μＭオリゴヌクレオチドＤ１．６１ジチオスライト ール、３７．５ｍＭ　ＮａＣ１，１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．３０ｍＭ　Ｔ＋１ｓ− ＨＣＩ　、　ｐ！（７，５および３ユニツトのＴ　７　ＤＮＡポリメラーゼを含 有する溶液５０μｍを加えた。マイクロタイター用プレートを４２℃にて１０分 間インキュベートした。２００μｌの　０．ＩＸ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，０，２％ＳＤＳ で２回、２００μｍのＴＢＳ中０．１％Ｔｖｅｅｎ２０で３回ウェルを洗浄した 。ツぎにＴＢＳ中０．１％Ｔｖ＋ｅｎ　２（１，１％牛血清アルブミンの溶液で １　：　５００希釈した抗ジゴキシゲニンーアルカリンホスファターゼコンジュ ゲート（ベーリンガーーマンハイム）　６０μｌを加え、マイクロタイター用プ レートをゆるく振とうしながら３７℃にて２時間インキュベートした。ＴＢＳ中 　０．１％　Ｔｖｅｅｎで６回、１Ｍジェタノールアミン−０，５Ｍ　Ｍｇｃ＋ ２緩衝液、ｐＨ１Ｏで１回、ウェルを洗浄した。最後にアルカリ性の緩衝液中２ ｍｇ／ｍ１ｐ−二トロフェニルフォスフエーｈ６０μｌを加えた。顕色ののち２ ０分間室温にてアルカリ性緩衝液１００μｌを加えて、形成された生成物の吸光 度を分光光度計で４０５ｎｍにて測定した。

フェノタイプＥ２／Ｅ２　（コドン１１２でＴ／Ｔ）およびＥ４／Ｅ４　（コド ン１１２でＣ／Ｃ）を有する２つのサンプルを分析した。この実験の結果を以下 の表に示す。

Ｅ２／Ｅ２　１．１８０　０．７０７　Ｔ／ＴＥ４／Ｅ４　０．０４０　０．０ １０　Ｃ／ＣＤＮＡなし　０．０２５　０．０１０ ジオキシゲニン−１ｉ−ｄ　Ｕ　Ｔ　Ｐの取り込みおよびひき続くアルカリンホ スファターゼで標識された抗体での検出ののち、コドン１１２における変異ヌク レオチドを同定した。

実施例５ 蛍光標識を用いたアミノ酸残基１１２に対するコドンにおけるアポリポタンパク 質Ｅ多型性の同定オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡサンプル実施例１で述べたＰ ＣＲプライマーＰ１、ビオチン化Ｐ２、Ｐ３およびＰ４ならびに検出段階プライ マーＤ１を用いる。ＤＮＡを実施例１で述べたようにして血液サンプルから抽出 する。

ポリメラーゼ連鎖反応および親和性捕獲実施例１で述べたようにして、プライマ ーＰ１およびＰ４を用いてＤ　Ｎ　Ａ　（サンプルあたり　１０１００ｎを増幅 する。この第１ＰＣＲ混合物を１１００希釈したちの３μｍをビオチン化Ｐ２お よびＰ３プライマーを１μＭ濃度にて用いて再増幅する。第２のＰＣＲは、１分 間９６℃、１分間５５℃および１分間７２℃にて２５サイクル行なう。実施例１ のように、ビオチン化増幅されたＤＮＡ断片をアビジンコートしたポリスチレン 粒子上に捕獲する。最後の洗浄段階で各サンプルを２つの部分に分割する。

コドン１１２における変異ヌクレオチドの同定増幅したＤＮＡを担う粒子を、コ ドン１１２における変異ヌクレオチドの３′と直接ハイブリダイズする検出段階 プライマーを５ｐモル含有する緩衝液（実施例１参照）１０μｌ中に懸濁する。

実施例１と同様にアニーリング反応を行なう。各試験管にＯ，１Ｍジチオスライ トール１μｌを加える。Ｔの同定のために、４００ｐｍの蛍光ｄｄＴＴＰ　（Ｔ −ターミネーター：デュポン（Ｄｏｐｏｎ＋）、ＮＥＫ−５２８Ｔ）を試験管の １つに加える。Ｃの同定のために、４０Ｍｍの蛍光ｄｄＣＴＰ　（Ｃ−ターミネ ータ−；デュポン、ＮＨＫ−５＋９Ｃ）を他の試験管に加える。Ｔ７ＤＮＡポリ メラーゼ５ユニットを、最終反応容量が１５μｌとなるように両方の試験管に加 える。５分間３７℃にて反応を進行させる。実施例１で述べたようにして粒子を 洗浄し、反応生成物を溶出させる。溶出物の蛍光を、励起波長として４９０ｎｍ および発する蛍光の測定のために５５０ｎｍを用いて分光光度計（メルク／日立 （Ｍｅ＋ｃｈ／　［１ｉｔａｃｈ、　Ｆ　−１０００））　ニて測定する。

結果の解釈 Ｔ−反応のみからの陽性シグナルにより、被検物は位置１１２のシスティン残基 に対するホモ接合であることが示される。

Ｃ−反応のみからの陽性シグナルにより、被検物は位置＋１２のアルギニン残基 に対するホモ接合であることが示される。

両方の反応からの陽性シグナルにより被検物はへテロ接合である、すなわちアポ リポタンパク質Ｅ遺伝子の位置１１２にシスティン残基を有する１つの対立遺伝 子およびアルギニン残基を有する１つの対立遺伝子を有する。

実施例６ ヒトβ−グロビン遺伝子のコドン６をコードする配列における鎌状赤血球突然変 異の検出 オリゴヌクレオチドの合成 δ−グロビン遺伝子にミスマツチするかまたは強く相補的である３′末端を含有 するようにＰＣＲプライマーを設計する。Ｂ１およびＢ２で示される２つのＰＣ Ｒプライマーならびに１つの検出段階プライマーＢ３を実施例１で述べた方法に より合成する。プライマーＢ２を実施例１で述べたようにビオチン化する。オリ ゴヌクレオチドのヌクレオチド配列およびそれらのβ−グロビン遺伝子上での位 ！（転写開始部位に対するヌクレオチド番号として）は以下のとおりである。

Ｂｌ　：　５’−ＣＡＴ　ＴＴＧ　ＣＨＣＴＧ　ＡＣＡ　ＣＡＡ　ＣＴ（−４９ 〜−３０）［配列番号９］ ８３　：　５’　−ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＧＡＣＴＣＣＴＧ（−１ 〜１９）［配列番号１９コ Ｂ２　：　５′−ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＣＣＡ　ＣＧＴ　ＴＣＡ　ＣＣ（７ ３〜５４）［配列番号１１］ ポリメラーゼ連鎖反応増幅および親和性捕獲実施例１で述べたようにして血液サ ンプルからＤＮＡを抽出する。実施例３で述べたようにして、プライマーＢ１お よびビオチン化Ｂ２を用いてＤ　Ｎ　Ａ　（サンプルあたり　１００Ｂ）を増幅 する。実施例１のように、ビオチン化増幅されたＤＮＡ断片をアビジンコートし たポリスチレン粒子上に捕獲する。各固定化サンプルを２つの部分に分割する。

コドン６におけるＡ−Ｔ突然変異の同定増幅されたＤＮＡサンプルを担っている 粒子を、コドン６中突然変異部位の３′と直接ハイブリダイズするＢ３検出段階 プライマー２ｐモルを含有する緩衝液（実施例１参照）１０μｌ中に懸濁する。

実施例１のようにアニーリング反応を行なう。　０．１Ｍジチオスライドール１ μｍを加える。以下のように［３５Ｓ１−標識化ｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰを加 え、最終容量１５μｌ中０２μＭ濃度とするニ ー　正常対立遺伝子（Ａ）の同定のために。

［３５Ｓ］　−ｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰを試験管のうち１本へ −突然変異（Ｔ）の同定のために　［３５Ｓ］　−ｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄ ＧＴＰを他の試験管へ加える。

Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ１ユニットを加え、３７℃にて５分間反応させる。粒子 を洗浄し、反応生成物を溶出させで溶出された放射能を実施例１で述へたように 、シンチレーションカウンターで測定する。

結果の解釈 八−反応のみからの陽性シグナルは被検物がホモ接合であり正常であることを示 す。

Ｔ−反応のみからの陽性シグナルは被検物が鎌状赤血球に対してホモ接合である ことを示す。

両方の反応からの陽性シグナルは被検物は１つの対立遺伝子中に鎌状赤血球突然 変異を担う、すなわちヘテロ接合であることを示す。

前記のように、ビオチン化プライマーＢ１およびＢ２を用いてＰＣＲを行なうこ とを除いて、変異ヌクレオチドを任意に決定することができる。検出段階プライ マーとして、さらに、β−グロビン遺伝子の反対の鎖に相補的なプライマーを用 いる： Ｂ４５’−Ｃ入ＧＴＡへＣＧＧ　ＣＡＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＣ（４０〜２１）〔 配列番号１２］ 嚢胞性線維症におけるΔＦ５０８欠損の同定第１１ゴヌクレオチドプライマーの 合成２つの増幅プライマー（ＣＦＩおよびＣＦ３）および１つの検出段階プライ マー（ＣＦ　２）を実施例１で述べたように合成した。プライマーは、ＣＦ遺伝 子の既知のヌクレオチド配列（リオルダン（Ｒｉｏ＋ｄａｎｊ　ら、サイエンス ＋９８９　：　２４５　：　ｌＨ６〜１０７２）に基づいて設計した。プライマ ーの配列およびＣＦ遺伝子上の位置はＣＦｉ：５’−ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　 ＴＣへＧＡＧＧＧＴ入Ａ、〜へ丁−３′（１５５５〜Ｔ７）［配列番号１３コ ＣＦ２５’−ＴＧＧ　ＣＡＣＣＡＴ　ＴＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＣＡＴ −３’（１６２９〜５２）［配列番号１４コ ＣＦ’１５’−ＣＡＴ　ＧＣＴ　ＴＴＡ　へＴＧ　ＡＣＧ　ＣＴＴ　ＣＴＡ　７ 人−３′（１７０３〜８１）［配列番号Ｉ５コ であった。

プライマー〇Ｆ３を実施例１で述べたようにビオチン化した。

ＤＮＡサンプル 標準的な方法によりΔＦ５０８突然変異に関して臨床的に特徴づけされている、 フィンランド人の嚢胞性線維症患者の白血球から標的ＤＮＡを抽出した。

標的Ｄ　Ｎ　ＡのＰＣＲ増幅および親和性捕獲１分間９６℃、１分間６０℃およ び１分間７２℃の３１サイクルからなる唯一っの増幅過程を行なったということ を除いては、実施例１で述べた条件にて、ビオチン化ＣＦ３およびＣＦＩプライ マー（最終濃度、それぞれ０．１５μＭオヨヒ０．６μＭ）　テＤＮＡ　（サン プルあたり　１００〜２００１ｇ）を増幅した。

ストレプトアビジンコートされたマイクロタイター用ウェル上への親和性捕獲を 実施例４で述べたように行なった。

検出段階プライマーの延長を、０２ＨＭのプライマーＣＦ２および２ユニツトの ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌの　５０ｍＭ　Ｔ＋ｉ＋−ＨＣｌ 、　ｐＨ８，８，１，５ｚ！ｄＭｇＣ１２，１５ｍ！ｊ　（ＮＨ４）　２　ＳＯ ４、０，１％Ｔｖ＋ｅｎ　２０ＳＯ，０１％ゼラチン中、述べたように行なった 。Ｔの同定のために１μＣ１３Ｈ−ｄＴＴＰ（アマジャム）および０８ＨＭｄｄ ＧＴＰ、ならびにＣの同定のために２μＣｉ”Ｈ−ｄＣＴＰＳ　Ｏ，８ＨＭｄｄ ＴＴＰを平行な２列のウェルに入れ、そのプレートを５５℃にて１０分間インキ ュベートした。２００μｌのＴＢＳ緩衝液中　０．１％Ｔｗ＋ｅｎ　２０で３回 ウェルを洗浄し、取込まれた標識を６０μｌの５０ｍＭ　ＮａＯＨで、室温にて 、５分間溶出させ、液体シンチレーションカウンターで測定した。

この実施例では、ＣＦＴＲ遺伝子のヌクレオチド１６５３における遺伝子型Ｃ／ Ｃ，Ｔ／ＴおよびＴ／Ｃを有する３つのサンプル、すなわち１つの正常なホモ接 合体、１つのΔＦ５０８ホモ接合体および１つのへテロ接合体を用いた。あらか じめこれらのサンプルの遺伝子型を他の方法（ケレ（Ｋｅ＋ｅ”、ら、ヒユーマ ン　ジエネティクス（Ｈｑｍ、　Ｇ！ｎ＋＋）、１９９０；　８５：　４１３〜 ４！５　）によりあらかじめ決定した。下の表の結果は、各遺伝子型の同定が明 確であることを示す。

［以下余白］ 正常ホモ接合体　３４９　９８３２　２８．２　Ｃ／Ｃヘテロ接合体　１１３５ ８　７４５７　０．６６　Ｔ　／　ＣＸ）　ＣＦＴＲ遺伝子のヌクレオチド１６ ５３結　論 サンプルの遺伝子型を、３Ｈ−ｄＴＴＰおよび３ＨｄＣＴＰの取り込みののちＣ ｐ　ｍ　Ｃ／　ｃ　ｐ　ｍ　Ｔ比率によって確かめた。

実施例８ に−ｒａｓ遺伝子のコドン１２をコードする配列における点突然変異の検出 オリゴヌクレオチドの合成 Ｒ１およびＲ２で示される２つのＰＣＲプライマーをそれぞれ合成し、プライマ ーＲ１を実施例１で述べたようにビオチン化する。位置１２におけるグリシン残 基（ＧＧＴによりコードされている）の突然変異の検出のために、２つの検出段 階プライマー、Ｒ３およびＲ４を合成した。Ｋ−ｒａｓ遺伝子の篤１のエクソン 上のオリゴヌクレオチドの配列および（ヌクレオチド番号としての）位置を以下 に示す・ Ｒ１５’−ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＡＡＡ　ＣＴＴ　ＧＴＧ（１〜２ ０）［配列番号１５］ Ｒ２５’−ＴＴＣＧＴＣＣＡＣ口Ａ　入ＴＧ　ＡＴＴ　ＣＴＧ（９４〜Ｔ４）［ 配列番号１７コ Ｒ３５′−入ＡＧ　ＧＣＡ　ＣＴＣＴＴＧ　ＣＣＴ　ＡＧＧ　ＣＣＡ（５６〜３ ６）［配列番号１８〕 Ｒ４５’−ＡＧＧ　ＣＡＣＴＣＴ　ＴＧＣＣＴ〜　ＣＧＣＣＮ６（５５〜３５） ［配列番号１９コ プロテイナーゼにでの消化、フェノール抽出およびエタノール沈殿を用いる標準 的な方法により癌細胞サンプルからＤＮＡを抽出する。プライマーのアニーリン グ温度を５０℃にする以外は実施例３で述べた条件を用いて、ビオチン化プライ マーＲ１およびプライマーＲ２にて１００＋＋ｇの精製されたＤＮＡを増幅する 。増幅されたＤＮＡをアビジンコートされたポリスチレン粒子上に捕獲し、変性 させて実施例］で述べたようにして粒子を洗浄する。

固定化されたＤＮＡサンプルを２本の試験管に分ける。

その試験管の１本中の粒子をコドン１２における第２のＧに相補的なＣの３′と 直接アニールする２ＨモルのオリゴヌクレオチドＲ３を含有する緩衝液（実施例 １参照）１〕μｌ中に懸濁する。他の試験管ではコドン１２における第１のＧに 相補的なＣにアニーリングする２ＨモルのオリゴヌクレオチドＲ４を含有する１ ０μｍの緩衝液を用いる。アニーリング反応を、実施例１におけると同様にして 行なう。Ｏ，１Ｍジチオスライトールを１μｍ加える。

コドン１２における突然変異を以下の方法Ａまたは方法Ｂにより分析する。

Ａ、コドン１２におけるグリシンがら非グリシンへの突然変異の同定 ［３５ｓ　コ　ｄＡＴＰ　、［３５Ｓ］　−ｄＧＴＰ　、［３５ｓ　］ｄＴＴＰ およびｄｄＣＴＰの混合物を各１５μｌ中最終濃度１μＭとなるように両方の試 験管に加える。１ユニツトの７７ＤＮＡポリメラーゼを加え、３７℃にて５分間 反応を進行させる。粒子を洗浄し、反応生成物を溶出させ、溶出した放射能を実 施例１で述べたようにシンチレーションカウンターで測定する。

Ｒ３をアニールした試験管からの陽性のシグナルにより、サンプル中のに−ｒａ ｓ遺伝子の少なくとも１部が位置１２においてバリン（ＧＴＴでコードされてい る）、アスパラギン酸（Ｇ　Ａ　Ｔ）またはアラニン（Ｇ　ＣＴ）残基へ突然変 異していることが示される。

Ｒ４をアニールした試験管からの陽性のシグナルにより、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の少 なくとも１部が位置１２にシスティン（ＴＧＴ）　、セリン（Ａ　Ｇ　Ｔ）また はアルギニン（ＣＴＧ）残基があることが示される。

両方の試験管からのシグナルが欠けていることにより、両方のアレルにおけるコ ドン１２がグリシン残基をコードする正常なＧＧＴであることが示される。

Ｂ、コドン１２における突然変異の特徴づけ突然変異の正確な特徴づけを、両方 の試験管に［３２Ｐ］−ｄＡＴＰ、［３５ｓ］−ｄＧＴＰ、［３Ｈ］　−ｄＴＴ ＰおよびｄｄＣＴＰの混合物を１５μｌ中最終濃度１μＭになるように加えるこ とによって行なう。［３２ｐ］−ａＡＴＰおよび［３５Ｓ］−ｄＧＴＰを、［３ Ｈ］　−ｄＴＴＰの比放射能（約１００ｃｉ／ｍモル）と同様の比放射能を生じ るように、それぞれ非標識化ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ中に希釈する。その３種の 放射性同位体の間でのシンチレーションカウント能力における差異を考慮して、 測定に用いられるチャンネル（下記参照）において等しいＣｐｍ値を生じるであ ろう反応混合物を設計する。

１ユニツトの７７ＤＮＡポリメラーゼを加え、３７℃にて５分間反応を進行させ る。粒子を洗浄し、反応生成物を実施例１に述べたように溶出させる。

溶出された生成物中の、Ｈ］、［３５Ｓ］および〔３２「　３ Ｐ］により放射される放射能をシンチレーションカウンターで同時に測定する。

ラックベータ１２１９カウンター（ファルマシア／ワラツク）において、以下の ウィンドウセツティングを用いる：　［”Ｈ］の測定のために　チャンネル１０ 〜９０、［３５Ｓコの測定のためにチャンネル９５〜１４５および［３２Ｐ］の 測定のためにチャンネルｔ７Ｑ〜２２０゜結果の解釈の前に、［３５ＳＪから口 ３Ｈ］チャンネルへのシグナルのオーバーフロー（２４％）に対する、および［ ＰＩから（３５ｓ１チヤンネルへのシグナルのオーバーフロー（１３％）に対す る修正を行なう。

結果は、以下の表に示すように解釈される：［以下余白］ Ｒ３＋　−ＧＡＴ　アスパラギン酸 Ｒ４＋　−ＡＧＴ　セリン Ｒ４−＋　−ＣＧＴ　アルギニン Ｒ４−−＋　ＴＧＴ　システィン Ｒ４−−−ＧＧＴ　グリシン に−ｒａｓ遺伝子のコドン１２における突然変異を、ビオチン化プライマーＲ２ およびプライマーＲ１を用（旭たＰＣＲを行なうほかは、上述のように任意に決 定することができる。その際に−ｒａｓ遺伝子の反対ストランドに相補的なプラ イマー Ｒ５：５’−ＡＡＣＴＴＧ　ＴＧＧ　τＡＧ　ＴＴＧ　Ｉ：、入ＧＣτ（１４〜 ３３）［配列番号２０］ Ｒ６５′−へＣＴ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＡＧＴ　ＴＧＧ　ＡＧＣＴＧ（１５〜３４ ）［配列番号２１コ を検出段階プライマーとして用いる。

実施例９ 非突然変異細胞存在におけるＮ−ｒａｓ遺伝子中コドン１２をコードする配列中 の点突然変異の検出オリゴヌクレオチドの合成 ＸｌおよびＸ２で示される２つのＰＣＲプライマーをそれぞれ合成し、プライマ ーＸ１を実施例１で述べたようにしてビオチン化する。コドン１２における第２ のヌクレオチド（ＧがＡで置換される）の突然変異の検出のために、検出段階プ ライマーＸ３を合成する。オリゴヌクレオチドの配列およびＮ−ｒａｓ遺伝子の 第１のエキソン上の（ヌクレオチド番号としての）位置は以下のとおりである・ Ｘｔ：５’−ＧＡＣＴＧＡ　ＧＴＡ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧ（３〜２２ ）［配列番号２２］ Ｘ２５’　−ＣＴＣＴＡＴ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＡＴＣＡＴＡ　ＴＴ（１１１〜９ １）０配列番号２３コ Ｘ３　５’−ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　００丁　ＴＧＧ　ＡＧＣＡＧ（１５〜３ ４）［配列番号２４コ ＤＮＡサンプル Ｎ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２の２番目の位置にヌクレオチド変換（Ｇ−Ａ）を 有することが知られる細胞株（細胞株Ｐ　Ａ　−１、ＡＴＣＣＣＲＬ１５７２） を、ＡＭＬ患者の治療の追跡の間から、患者の細胞サンプルを最少の残基突然変 異細胞について分析することができる状態をまねたモデル系として用いた。

Ｐ　Ａ　−１からのおよび正常ヒト白血球からのＤＮＡを実施例７で行なったの と同様に標準的方法によって抽出し、突然変異細胞が１００％から　０，１％で 表わされる一連のサンプルを生じるように混合した。

ポリメラーゼ連鎖反応増幅 実施例３で述べた条件で、プライマーＸ１およびＸ２を用いて、抽出したＤＮＡ （サンプルあたり　１００Ｂ）を増幅した。

３００Ｍｇのストレプトアビジンコートされた磁気ポリスチレンビーズ（ダイナ ビーズ（Ｄｙａａｂｅａｄ＋）　、登録商標、Ｍ−２１１０、ストレプトアビジ ン、Ｄｙｎａｌ　ＡＳ）に、８０ｕ　ｌの増幅混合物および２０μｌのＬＭ　Ｎ ａＣ１を加えた。サンプルを２０℃にて３０分間保持し、磁気粒子コンセントレ ータ−（Ｍ　Ｐ　Ｃ−Ｅ　、　Ｄｒｃａｌ　ＡＳ）を用いて反応混合物からビー ズを分離して、混合物を捨てた。ビーズを１ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩 衝液、ｐＨ７，５、０１％Ｔｖｅｅｎ　２Ｇ中Ｑ、５Ｍ　ＮａＣｌで３回洗浄し 、２ｐモルの検出段階プライマーＸ３を含有する１００　ｕ　ｌの　５０ｍＭ　 ＮｌＣｌ、２０ｍＭＭｇＣＩ２．４０ｍＭ　Ｔｒｉｐ−ｉｌｃｌ　、ｐＨ７，５ で２回処理した。３７’Ｃにて１０分間、プライマーを鋳型ＤＮＡヘアニーリン グさせた。１μｌの　Ｇ、１Ｍジチオスライトール、１５ｕモルの３Ｈ標識化ｄ ＴＴＰおよび１ユニツトのＴ７ＤＮＡ−ポリメラーゼ（ユナイテッド　ステイテ ッド　バイオケミカル　コーポレーション（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｄ　Ｂｉ ｏｃｈ＋ｍ１ｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　）を加えて最終濃度１５μｌと した。３７℃にて５分間反応を進行させた。ビーズを３回洗浄し、２０℃にて５ 分間ｔＱＱ　ｕ　ｌの５０ｍＭ　ＮａＱＨ，０１５Ｍ　！１ｔｃｌ　１（ＩＱμ ｌで処理した。溶出した放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。

結果を以下の表に示す。

ＰＡ−１細胞における最少の点突然変異の検出突然変異細胞（％）３■（取り込 み（ｃｐｍ）”５０　２３．０００ ＊）　コドン１２中Ａ　（ＧΔＴ）に対応する３Ｈの取り込み結　論 結果より、本発明の方法は、正常ＤＮＡのバックグランドから０２５％はどの少 量の突然変異した単一対立遺伝子性Ｎ　−ｒ　ａ　ｓ　ＤＮＡを検出することが 示される。この感度は、ＡＭＬ患者の判別のためならびに治療中の同定された突 然変異の監視および疾病の追跡のために必要な範囲にうまく入っている。

実施例１０ ＨＩＶ−１逆転写酵素遺伝子のコドン２１５（アミノ酸する配列中の点突然変異 （Ａ　−Ｔ　）の検出オリゴヌクレオチドの合成 実施例１で述べた方法により、２つのＰＣＲプライマー（ＨｌおよびＨ２）なら びに１つの検出段階プライマー（Ｈ３）を合成する。実施例１で述べたようにじ てプライマーＨ２をビオチン化する。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列お よびそれらのＨＩＶ−１逆転写酵素遺伝子上の位置（ヌクレオチド番号づけはラ トナー（ＲＮｎｅ「）ら、１９８５、ネイチャー３１３　：　２７７〜２８１に 従っている）は以下のとおりである。

Ｈｌ：５’−ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＣＣＡ　ＴＡＣＡＡＴ　ＡＣＴ　ＣＣＡ（２２８ ６〜２３０６）　０配列番号２５］Ｈ２：５’−ＴＡＡ　ＣＣＣ：〜ＴＣＣＡＡ 　ＡＧＧ　ＡＡＴ　ＧＧ人（２８２４〜２８０４）　０配列番号２６］Ｈ３：５ ’−ＡＴＣＴＧＴ　ＴＧＡ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＴＴ（２７５２〜２７７１ ）　Ｃ配列番号２了コポリメラ一ゼ連鎖反応増幅および親和性捕獲実施例１で述 べたようにしてＨＩＶ−１感染細胞からＤＮＡを抽８する。プライマーアニーリ ング温度を５０℃とする以外は、実施例１で述べたようにして、プライマーＨ１ およびＨ２（最終濃度０．２ｍＭ）を用いて、ＤＮＡ（サンプルあたりＩＧＯｎ ｇ　）を増幅する。ビオチン化増幅されたＤＮＡ断片を、実施例４で述べたよう にストレプトアビジンコートされたマイクロタイター用プレートウェル上に捕獲 する。各サンプルを、２列の平行なウェルに結合する。マイクロタイター用プレ ートウェルに結合したＤＮＡ断片を実施例４で述べたように変性させ、洗浄する 。

コドン２１５中のＡ−Ｔ突然変異の同定Ａ反応のためには：１μＣｉの”Ｈ−ｄ ＡＴＰ　（８２Ｃｉ／ｍモル、アマジャム、英国）の　０．８．ｃｚＭのａｃｔ Ｔ”ｒｐおよびｄｄＣＴＰならびに１ユニツトのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（プ ロメガｌ？ｉ０ＴＩＨｇｌ：　）を含有する、Ｔ−反応のためには　１μＣ１の ３Ｈ−ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐ　（９８Ｃｉ／′ｍモル）および０３μＭのｄ　ｄ　Ａ　 Ｔ　ＰおよびｄｄＣＴＰを含有する、５０ｚＭ　ＴＴ１！−ＨＣ！　、ｐ　Ｈ８ ，８，１，５ｍ１ｌ　ＭｇＣｌ、　、１５ｍＭ（ＮＨ）　Ｓｏ　、０．１％Ｔｖ ｅｅｎ　２０％　０．０１％ゼラチンおよび０２μＭのプライマー上３中、５０ ’Ｃにて１０分間、検出プライマーＨ３のアニーリングおよび検出反応を同時に 行なう。ウェルをＴＢＳ中０１％Ｔｖｅｔｎ　２０で３回洗浄し、室温にて５分 間５０ｚＭ　ＮａＯＨ６ｈｌで放射能を溶出させる。溶出した放射能を液体シン チレーションカウンターで測定する。

結果の解釈 八−反応のみからの陽性シグナルは、単離されたウィルスが野生型であることを 示す。Ｔ−反応のみからの陽性シグナルは、単離されたウィルスがコドン２１５ の第１のヌクレオチドに突然変異を有することを示す。したがって、アミノ酸Ｔ ｈｒはＰｈｅまたはＴｙｒに変わっている。両方の反応からの陽性の反応は、ウ ィルスが野性型ウィルスと突然変異したウィルスの混合集団であることを示す。

同じ増幅生成物から同様の方法においてコドン６７およびＴ］中の変異ヌクレオ チドを決定することができる。

配列表 （１）一般情報 （ｉ　ｉ　’、：発明の名称：　特定のヌクレオチド変異の決定のための方法お よび試薬 （ｉｉｉ）配列の数：２７ （１ｖ）通信住所・ オリオン　コーポレーション オリオン　ファルマセウチカ フィンランド共和国 （■Ｉ）現行出願データ （Ａ）出願番号　決定される予定 ・′Ｂ）出願臼・ （Ｃ）分　類： （２）配列番号１についての情報 （＋１配列の特徴。

（Ａ）長さ　２２塩基 ｔｏ）型　核酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種類：　ＤＮＡ （ｘｌ）配列の記載・配列番号１ 人ＡＧ　ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＧＣＣＴＡＣＡＡＡ　Ｔ（２）配列番号２に ついての情報・ （１）配列の特徴。

（Ａ）長さ・２２塩基 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載　配列番号２ ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＡＧＣＣＣＧ　ＧＴＧ　ＧＣＧ　Ｇ（２）配列番号３ についての情報： （ｉ）配列の特徴 （＾）長さ　２０ （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）トポロジー、直鎖状 （１１）分子の種類　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載・配列番号３ ＧＣＧ　ＣＧＧ　〜Ｃ入　ＴＣＧ　ＡＧＧ　ＡＣＧ　ＴＧ（２）配列番号４につ いての情報。

ｆｉ）配列の特徴 （Ａ）　長さ・２０ （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 い１）分子の種類：　ＤＮＡ （Ｘｌ）配列の記載；配列番号４ ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＡＴＧ　入ＣＣＴＧＣＡＧ、〜　入Ｇ　２０（２）配列番号５ についての情報・ い）配列の特徴。

（人）長さ、２２ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ （１１）配列の記載：配列番号５ ＴＣＧ　ＣＧＧ　ＧＣＣＣＣＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＡＣＡ　２２２２　。

（２）配列番号６についての情報・ （ｉ）配列の特徴： （入）長さ　２２ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種類：　ＤＮＡ （Ｘｌ）配列の記載・配列番号６ ＧＧＡ　ＴＧＧ　ＣＧＣＴＧＡ　ＧＧＣＣＧＣＧＣＴ　Ｃ２２［） （２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）　長さ、２０ （Ｂｌ型、核酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　へ丁（２）配列番 号１４についての情報４ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、２４ ｉＢｊ型・核酸 （Ｃ）トポロジー・直鎖状 （ｌり分子の種類・ＤＮＡ （！１）配列の記載：配列番号１４ ＴＧＧ　ＣＡＣＣＡＴ　ＴＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＣＡＴ（２）配列番 号１５についての情報。

（１）配列の特徴： （Ａ）　長さ、２３ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）トポロジー　直鎖状 （１１）分子の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ （ｘｌ）配列の記載　配列番号１５ ＣＡＴ　ＣＣＴ　ＴＴＡ　ＡＴＧ　ＡＣＧ　ＣＴＴ　ＣＴＡ　ＴＡ（２″　配列 番号１６についての情報 （１）配列の特徴： （Ａ＋　長さ　２１ ［Ｂｊ型　核酸 （Ｃゝ　トポロジー　直鎖状 （１１）分子の種類　ＤＮＡ （ｘｉ；配列の記載　配列番号１６ ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＡＡＡ　ＣＴＴ　ＧＴＧ２３　（２）配列番 号１７についての情報（１）配列の特徴・ （Ａｉ　長さ、２１ （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）トポロジー、直鎖状 （１１）分子の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載・配列番号１７ ＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＣＴＧ　２１２４　（２）配列番 号１８についての情報・（１）配列の特徴： （Ａ）　長さ：２１ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種類：　ＤＮＡ （工１）配列の記載：配列番号１８ ＡＡＧ　ＧＣＡ　ＣＴＣＴＴＧ　ＣＣＴ　ＡＣＧ　ＣＣＡ　２１２３　（２）配 列番号１９についての情報：（１）配列の特徴： （Ａ）　長さ＝２１ （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種類・ＤＮＡ （Ｘり配列の記載：配列番号１９ ＡＧＧ　ＣＡＣＴＣＴ　ＴＧＣＣＴＡ　ＣＧＣＣＡＣ２１（２″配列番号２０に ついての情報・ （１，配列の特徴 ｉへ］　長さ　１８ （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）トポロジー　直鎖状 ｔｌｌ）分子の種類　ＤＮＡ ：ｒｉ：配列の記載−配列番号２０ 〜ＡＣＴＴＧ　ＴＧＧ　ＴＡＣＴＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴ　１８（２）配列番号２１ についての情報 、′ｌ）配列の特徴 （へ）長さ、１８ （′Ｂ）型　核酸 （Ｃ）トポロジー　直鎖状 ・１：Ｉ）分子の種類・ＤＮＡ ｆｘｉ）、配列の記載　配列番号２１ ＡＣＴ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　、へＧＴ　ＴＧＧ　ＡＧＣＴＧ　１８、′２）配列番 号２２についての情報。

′１゛　配列の特徴・ ・′入）長さ　２０ ・３．・型　核酸 １、ｃ＋　トポロジー　直鎖状 （置）分子の種類　Ｄ　Ｎ　、Ａ ・！１：配列の記載　配列番号２２ ＧＡＣＴＧへＧＴＡ　ＣＡへ〜ＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧ　２０１２）配列番号２３に ついての情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）　長さ、２０ ｉＢ）型　核酸 （Ｃ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ （Ｘｉ）配列の記載・配列番号２３ ＣＴＣτＡＴ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＡＴＣＡＴＡ　ＴＴ　２０（２）配列番号２４ についての情報 （＋）配列の特徴： ＦＡ）長さ、２０ ＦＢ）型・核酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種類・ＤＮＡ （ＸＩ）配列の記載：配列番号２４ ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＴＧＧ　ＡＧＣＡＧ　２０（２）配列番号２ ５についての情報 （１）配列の特徴・ 口）長さ・２１ （Ｂｊ型：核酸 （Ｃ）トポロジー　直鎖状 （）１）分子の種類　ＤＮＡ （ｘｌ）配列の記載：配列番号２５ ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＣＣＡ　ＴＡＣ〜人Ｔ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　２１（２）配列番号 ２６についての情報 （１）配列の特徴： ［Ａ）　長さ＝２１ ｆＢｉ型　核酸 （Ｃ）トポロジー　直鎖状 （１１）分子の種類：　ＤＮＡ （１１）配列の記載：配列番号２６ ＴＡＡ　ＣＣＣＡＴＣＣＡＡ　入ＧＧ　入Ａτ　ＧＧ入（２）配列番号２７につ いての情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：２０ ［Ｂ）型・核酸 （Ｃ）トポロジー・直鎖状 （１１）分子の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ （Ｋ１）配列の記載、配列番号２７ ＡＴＣＴＧＴ　ＴＧＡ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＴＴ２１　固定イし””３’− ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ１Ｘ’ＸＸＸＸ−付着部標的・ 標的　３’−ＸＸ　Ｘ　ＸＸＸＸｎＸ１　Ｘ’Ｘ”Ｘ　Ｘ　Ｘ−付着部分、ない とき たは ＦＩ［Ｅ、２ 固定化された 、的、　３’−Ｘ　ＸＸＸＸＸＸＸ１Ｘ３Ｘ　ＸＸＸ　−付着部分２　Ｘａ ＦＩＧ、３ 要　約　書 変異ヌクレオチドの検出はプライマー延長および検出可能なヌクレオシドトリホ スフェートの取り込みに基づくものである。変異ヌクレオチドに直接に隣接する 領域から検出段階プライマーを選択することにより、１つのヌクレオシドトリホ スフェートはど少ない取り込みの後でも検出することができる。変異ヌクレオチ ドとマツチする標識化ヌクレオシドトリホスフェートを測定する。

検出段階プライマーの選択は本発明の方法にとって重要であり、関心のあるヌク レオチド配列によって決まる。

好ましくは検８すべき変異ヌクレオチドから３゛末端方向の領域に直接及ぶよう に検出段階プライマーを選ぶ。

本方法は、特定の点突然変異および遺伝子変異の同定において有用である。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年８月１２日 、１□□４や　、ウ　囚 １特許出願の表示 ＰＣＴ／Ｆ　Ｉ　９１１０００４６ ２発明の名称 特定のヌクレオチド変異の決定のための方法および試薬３特許出願人 住　所　フィンランド共和国、０２１ｏｏ　ニスポー、オリオニンチェ　１ 名　称　オリオンーユヒチュメ　オサケ　ユキチュア国　籍　フィンランド共和 国 ４代理人　〒５４０ 住　所　大阪市中央区谷町二丁目２番２２号５補正嘗の提出年月日 ２３７３６２）　、ｉｉ’、：　変性勾配電気泳動（ｄ＋ｌＩａ冒＋：Ｂ　ｇ＋ ＋ｄｌ＋ｎｔｅ１＋ＣＩ：ＯｐＨＯＴ！１ｌｉ）により分析されたハイブリッド の安定性の相異またはｉｉｉ：ミスマツチの部位での化学的開裂（ヨーロッパ特 許公開ＥＰ−３２９３１！　）に基つく。

変異ヌクレオチドの部位に相補的な３′末端を有するオリゴヌクレオチドが、対 立遺伝子特異的プライマーとして用いられている（ヨーロッパ特許公開Ｅ　Ｐ　 −３３２４３５）。

変異ヌクレオチドの同定は、３′末端のミスマツチはポリメリゼーション反応を 阻害するという事実にもとずく。

オリゴマーリゲーションアッセイにおいて同様の方法が用いられる。その方法で は、２つの隣接するオリゴヌクレオチドか、その末端で完全にマツチするときに のみ、それらのオリゴヌクレオチドはリゲーションされる（ヨーロッパ特許公開 ＥＰ−３３６７３１）。

国際特許公開ＷＯ−９０／　＋０４１４には、対立遺伝子特異的なプライマー延 長により増幅された断片におけるＤＮＡ配列変異の検出の方法か述べられている 。この方法では、取り込まれた標識を検出するためにいくつかのゲル分離段階が 必要である。

制限酵素でのＤ　Ｎ　Ａ配列の開裂は、変異ヌクレオチドか、特定の制限部位を 、たとえばつくるまたは壊すなど、変更するということを条件に、変異の同定に 用いられうる。ヌクレオチド配列決定は、変異ヌクレオチドの決定のために最も 有益な方法である。

上で述べた方法は比較的複雑な手順であり、そのためルーチンの診断における使 用が困難であるという欠点を有する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロ ーブの使用には、それぞれの適用について別々に反応条件を注意深く最適にする ことが必要とされる。上の方法のいくつかには、ゲル電気泳動による分画が必要 である。そのような方法は、容易に自動化されない。

請求の範囲 ■　少なくとも１つの増幅プライマーがプライマーに結合した第１の付着部分を 含有している修飾増幅反応を行なうことにより、検出可能な量の標的核酸ポリマ ーをえて、 （ａ）段階（ｂ）の前に標的核酸ポリマーを固体支持体に固定化すること、 （ｂ）検出可能な量の標的核酸ポリマーを、−木組のかたちでオリゴヌクレオチ ドプライマー、すなわち複数のヌクレオチド残基からなる検出段階プライマーで あって、該ポリマーに対してハイブリダイズされるときには、定められた部位と 、プライマーの３′末端との間に検出されるべき第１または第２のヌクレオチド 残基と同一であるヌクレオチド残基がないように、定められた部位から３′末端 方向に配置された領域において関心のあるヌクレオチド配列と相補的であるプラ イマーとハイブリダイズすること。

（Ｃ）１またはそれ以上のヌクレオシドトリホスフェートを含有してなる混合物 であって、核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出す るための手段および任意に１またはそれ以上の読終りヌクレオシドトリホスフェ ートを含有してなる第１または第２のいずれかのヌクレオチド残基に相補的な少 なくとも１つのヌクレオシドトリホスフェートを含有している混合物中、ポリメ ライジングエージェントを用いてプライマーを延長すること；ならびに（ｄ）　 ヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出し、それによって定められた部 位のヌクレオチド残基が何であるか決定すること を含んでなる、第１のヌクレオチド残基が第２のヌクレオチド残基によって置換 されている標的核酸ポリマー中の定められた部位での特定のヌクレオチド変異を 検出するための方法。

２、　少なくとも１つの増幅プライマーがプライマーに結合した第１の付着部分 を含有している修飾増幅反応を行なうことにより、検出可能な量の標的核酸ポリ マーをえて、 （ａ）段階（ｂ）の前に標的核酸ポリマーを固体支持体に固定化すること、 （ｂ）検出可能な量の標的核酸ポリマーを、−木組のかたちで、複数のヌクレオ チド残基からなる第１の検出段階プライマーであって、該ポリマーに対してハイ ブリダイズされるときには、第１の定められた部位と、プライマーの３゛末端と の間に第１または第２のヌクレオチド残基と同一であるヌクレオチド残基がない ように、第１の定められた部位から３″末端方向に配置された領域において関心 のあるヌクレオチド配列と相補的であるプライマーとハイブリダイズすること： （Ｃ）１またはそれ以上のヌクレオシドトリホスフェートを含有してなる混合物 であって、核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出す るための手段および任意に１またはそれ以上の読終りヌクレオシドトリホスフェ ートを含有してなる第１または第２のヌクレオチド残基に相補的な少なくとも１ つのヌクレオシドトリホスフェートを含有している混合物中、ポリメラインング エージェントを用いて第１の検出段階プライマーを延長すること： （ｔｌ）　ヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出し、それによって第 １の定められた部位のヌクレオチド残基が何であるか決定すること （ｅ）段階（Ｃ）において形成された延長された第１検出段階プライマーを標的 核酸ポリマーから除去する二と：ならびに （１）第２の検出段階プライマーであって、固定化されたポリマーに対してハイ ブリダイズされるときには、第２の定められた部位と、プライマー３′末端との 間に検出されるべき第３または第４のヌクレオチド残基と同一であるヌクレオチ ド残基がないように、定められた部位から３′末端方向に配置された領域におい て関心のあるヌクレオチド配列と相補的であるプライマーを加えること を含んでなる、少なくとも第１のヌクレオチド残基が第１の定められた部位で第 ２のヌクレオチド残基によって置換されており、策３のヌクレオチドが第２の定 められた部位で第４のヌクレオチド残基によって置換されている標的核酸ポリマ ー中の定められた部位での複数の特定のヌクレオチド変異を検出するための方法 。

３、（ａ：少なくとも１つの増幅プライマーがプライマーに結合した第１の付着 部分を含有している修飾増幅反応を行なうことにより、患者に由来する、検出可 能な量の遺伝物質を含有するサンプルをえること；ｌｂ１段階（＋）の前に標的 核酸ポリマーを固体支持体に固定化すること、 （ｃ）その検出可能な量の遺伝物質を、−木組のかたちで第１のオリゴヌクレオ チドプライマー、すなわち複数のヌクレオチド残基からなる篤１の検出段階プラ イマーであって、該遺伝物質に対してハイブリダイズされるときには、定められ た部位と、プライマーの３′末層との間に第１または第２のヌクレオチド残基と 同一であるヌクレオチド残基がないように、第１の定められた部位から３゛末端 方向に配置された領域において関心のあるヌクレオチド配列と相補的であるプラ イマーとハイブリダイズすること；　′ （ｄ）１またはそれ以上のヌクレオシドトリホスフェートを含有してなる混合物 であって、核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出す るための手段および任意に１またはそれ以上の読終りヌクレオシドトリホスフェ ートを含有してなる第１または第２のいずれかのヌクレオチド残基に相補的な少 なくとも１つのヌクレオシドトリホスフェートを含有している混合物中、ポリメ ライジングエージェントを用いてプライマーを延長すること；ならびに（ｅ）　 ヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出し、それによって定められた部 位のヌクレオチド残基が何であるか、そして患者が関連遺伝病に対する素質を有 するかどうか決定すること という段階を含んでなる、第１のヌクレオチド残基が第２のヌクレオチド残基に よって置換されている患者の遺伝物質中の定められた部位での特定のヌクレオチ ド変異から結果として生じる患者の遺伝病素質を検出するための方法。

４（ａ）少なくとも１つの増幅プライマーがプライマーに結合した第１の付着部 分を含有している修飾反応を行なうことにより、微生物に由来する、検出可能な 量の遺伝物質を含有するサンプルをえること：（ｂ）段階（ｃ）の前に標的核酸 ポリマーを固体支持体に固定化すること、 （ｃ）検出可能な量の遺伝物質を、−重鎖のかたちでオリゴヌクレオチドプライ マー、すなわち複数のヌクレオチド残基からなる検出段階プライマーであって、 該遺伝物質に対してハイブリダイズされるときには、定められた部位と、プライ マーの３−末端との間に検出されるべき第１または第２のヌクレオチド残基と同 一であるヌクレオチド残基がないように、明確に定められた部位から３′末端方 向に配置された領域において関心のあるヌクレオチド配列と相補的であるプライ マーとハイブリダイズすること： （ｄ）１またはそれ以上のヌクレオシドトリホスフェートを含有してなる混合物 であって、核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出す るための手段および任意に１またはそれ以上の読終りヌクレオシドトリホスフェ ートを含有してなる第１または第２のヌクレオチド残基に相補的な少なくとも１ つのヌクレオシドトリホスフェートを含有している混合物中、ポリメライジング エージェントを用いてプライマーを延長すること； （ｅｉ　ヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出し、それによって定め られた部位のヌクレオチド残基が何であるか、そして点突然変異が起きているか どうか決定すること という段階を含んでなる、微生物の病原性または治療に対する耐性を変化させる 微生物のゲノムにおける定められた部位での、第１のヌクレオチド残基が第２の ヌクレオチド残基によって置換されている点突然変異の存在を検出するための方 法。

５（ａ）少なくとも１つの増幅プライマーがプライマーに結合した第１の付着部 分を含有している修飾反応を行なうことにより、非突然変異細胞に対する突然変 異細胞の比率を維持しながら、細胞手段から検出可能な量の遺伝物質をえること ： （ｂ）段階（ｃ）の前に標的核酸ポリマーを固体支持体に固定化すること、 （ｃ）検出可能な量の遺伝物質を、−重鎖のかたちでオリゴヌクレオチドブライ マー、すなわち複数のヌクレオチド残基からなる検出段階プライマーであって、 該遺伝物質に対してハイブリダイズされるときには、定められた部位と、プライ マーの３゛末端との間に検出されるべき第１または東２のヌクレオチド残基と同 一であるヌクレオチド残基がないように、定められた部位から３゛末端方向に配 置された領域において関心のあるヌクレオチド配列と相補的であるプライマーと ハイブリダイズすること； （ｄ）１またはそれ以上のヌクレオシドトリポスフエートを含有してなる混合物 であって、核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出す るための手段および任意に１またはそれ以上の読終りヌクレオシドトリホスフェ ートを含有してなる第１または篤２のいずれかのヌクレオチド残基に相補的な少 なくとも１つのヌクレオシドトリホスフェートを含有している混合物中、ポリメ ライジングエージェントを用いてプライマーを延長すること；ならびにｆｅ）　 ヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出し、それによって定められた部 位のヌクレオチド残基が何であるか、そして突然変異細胞が存在するがどうか決 定すること という段階を含んでなる、突然変異細胞が細胞集団中に混合されているとき、第 １のヌクレオチド残基が第２のヌクレオチド残基によって置換されている、遺伝 物質中定められた部位での点突然変異を有する細胞を検出する方法。

６　プライマーが、定められた部位に直接に隣接するヌクレオチド残基から標的 核酸ポリマーの３′末端方向に延長される、関心あるヌクレオチド配列の領域に 相補的である請求項１から５記載の方法。

７　核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出するため の手段を含有するヌクレオシドトリホスフェートがデオキシヌクレオシドトリポ スフエートである請求項１から５記載の方法。

８　核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出するため の手段を含有するヌクレオシドトリホスフェートがンデオキシヌクレオシドトリ ホスフエートである請求項１から５記載の方法。

９　混合物が、核酸ポリマーへの第２のヌクレオシドトリホスフェートの取り込 みを検出するための、第１の手段とは異なる第２の手段を含有する第２のヌクレ オシドトリホスフェートを含む請求項１から５記載の方法。

１０　段階（′ｄ）の延長された生成物を取り込まれたヌクレオシドトリホスフ ェートの取り込みの決定の前に溶出させる請求項２記載の方法。

１１、複数の検出段階プライマーおよび変異ヌクレオチド残基を同定する異なっ た標識を行なったヌクレオシドトリホスフェートを加えることにより単一の段階 でヌクレオチド変異を検出する請求項２記載の方法。

１２　微生物がＨＩＶである請求項４記載の方法。

１３、点突然変異がＡｓｐ６７、Ｌ　ｙ　ｓ　８０およびＴ　ｈ　ｒ　２１５の 中からえらばれた部位にある請求項１２記載の方法。

１４、細胞がリンパ球である請求項５記載の方法。

１５、細胞が白血病細胞である請求項１４記載の方法。

＋６．　（ａ’、標的核酸ポリマーの１部分に相補的でありハイブリダイズする オリゴヌクレオチドであって、酵素核酸ポリメリゼーションのためのプライマー および第１付着部分として有効である、オリゴヌクレオチドを含有する少なくと も１つの増幅プライマー；（ｂｊ　標的核酸ポリマーの３゛から変異ヌクレオチ ドまでの部分に相補的でありハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する 少なくとも１つの検出段階プライマー；ならびに任意に （ｃ　ｊ固体マトリックス、および第１付着部分を介して増幅プローブのオリゴ ヌクレオチドを固定化することのできる少なくとも１つの付着部位を含有する少 なくとも１つの固体支持体；および （′ｄ）核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフエートの取り込みを検出する ための手段を含有する少なくとも１つのヌクレオシドトリホスフエートのひとま とめにされた組合せを含有してなる、標的核酸ポリマーにおける特定のヌクレオ チド変異を決定するのに用いるためのキット。

１７、検出段階プライマーが 配列５’−ＧＣＧ　ＣＧＧ　人ＣＡ　ＴＧＧ　ＡＧＧ　ＡＣＧ　ＴＧを含んでな る、アポリボ蛋白Ｅ多型のヌクレオチド変異の同定において用いるための請求項 １６記載のキット。

１８　検出段階プライマーが 配列５’−ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＡＴＧ　ＡＣＣＴＧＣＡＧＡ　ＡＧを含んでなる、 アポリボ蛋白Ｅ多型のヌクレオチド変異の同定において用いるための請求項１６ 記載のキット。

１９　検出段階プライマーが 配列５’−ＧＴＡ　ＣＴＧ　ＣＡＣＣＡＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＣを含んでなる、 アポリボ蛋白Ｅ多型のヌクレオチド変異の同定において用いるための請求項１６ 記載のキット。

２０　検出段階プライマーが 配列５’−ＧＧＣＣＴＧ　ＧＴＡ　ＣＡＣＴＧＣＣＡＧ　ＧＣを含んでなる、ア ポリボ蛋白Ｅ多型のヌクレオチド変異の同定において用いるための請求項１６記 載のキット。

２１、検出段階プライマーが 配列５’−ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＧＡＣＴＣＣＴＧを含んでなる、 鎌状赤血球貧血を引き起こすヒトβ−グロビン遺伝子のコドン６におけるヌクレ オチド変異の検出において用いるための請求項１６記載のキット。

２２、検出段階プライマーが 配列５’−Ｃ，へＧ　ＴＡＡ　ＣＧＧ　ＣＡＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＣを含んでな る、鎌状赤血球貧血を引き起こすヒトβ−グロビン遺伝子のコドン６におけるヌ クレオチド変異の検出において用いるための請求項１６記載のキット。

２３、検出段階プライマーが 配列５′−人ＡＧ　ＧＣＡ　ＣＴＣＴＴＧ　ＣＣＴ　ＡＣＧ　ＧＣＡを含んでな る、Ｋ　−ｒ　ａ　ｓ遺伝子のコドン１２におけるヌクレオチド変異の検出にお いて用いるための請求項１６記載のキット。

２４゜検出段階プライマーが 配列５’−ＡＧＧ　ＣＡＣＴＣＴ　ＴＧＣＣＴＡ　ＣＧＣＣＡＣを含んでなる、 Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２におけるヌクレオチド変異の検出において用いる ための請求項１６記載のキット。

２５、検出段階プライマーが 配列５’−ＡＡＣＴＴＧ　ＴＧＧ　ＴＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴを含んでなる 、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２におけるヌクレオチド変異の検出において用い るための請求項１６記載のキット。

２６　検出段階プライマーが 配列５’−ＡＣＴ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＡＧＴ　ＴＧＧ　ＡＧＣＴＧを含んでなる 、Ｋ　−ｒ　ａ　ｓ遺伝子のコドン１２におけるヌクレオチド変異の検出におい て用いるための請求項１６記載のキット。

２７、検出段階プライマーが 配列５’　−ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＴＧＧ　ＡＧＣＡＧを含んでな る、Ｎ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２におけるヌクレオチド変異の検出において用 いるための請求項１６記載のキット。

２８　検出段階プライマーが 配列５′−ＡＴＣＴＧＴＧＣＡ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＴＴを含んでなる、Ｈ ＩＶ−１ウイルスにおけるＡＺＴに対する耐性の検出において用いるための請求 項１６記載のキット。

２９　検出段階プライマーが 配列５’−ＴＧＧ　ＣＡＣＣＡＴ　ＴＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＣＡＴを 含んでなる、嚢胞性線維症の検出において用いるための請求項１６記載のキット 。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）検出可能な量の標的核酸ポリマーを、一本鎖のかたちでオリゴヌクレ オチドプライマー、すなわち複数のヌクレオチド残基からなる検出段階プライマ ーであって、該ポリマーに対してハイブリダイズされるときには、定められた部 位と、プライマーの３′末端との間に検出されるべき第１または第２のヌクレオ チド残基と同一であるヌクレオチド残基がないように、定められた部位から３′ 末端方向に配置された領域において関心のあるヌクレオチド配列と相補的である プライマーとハイブリダイズすること； （ｂ）１またはそれ以上のヌクレオシドトリホスフェートを含有してなる混合物 であって、核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出す るための手段および任意に１またはそれ以上の読終りヌクレオシドトリホスフェ ートを含有してなる第１または第２のいずれかのヌクレオチド残基に相補的な少 なくとも１つのヌクレオシドトリホスフェートを含有している混合物中、ポリメ ライジングエージェントを用いてプライマーを延長すること；ならびに（ｃ）ヌ クレオシドトリホスフェートの取り込みを検出し、それによって定められた部位 のヌクレオチド残基が何であるか決定すること を含んでなる、第１のヌクレオチド残基が第２のヌクレオチド残基によって置換 されている標的核酸ポリマー中の定められた部位での特定のヌクレオチド変異を 検出するための方法。
2. ２．（ａ）検出可能な量の標的核酸ポリマーを、一本鎖のかたちで、複数のヌク レオチド残基からなる第１の検出段階プライマーであって、該ポリマーに対して ハイブリダイズされるときには、第１の定められた部位と、プライマーの３′末 端との間に第１または第２のヌクレオチド残基と同一であるヌクレオチド残基が ないように、第１の定められた部位から３′末端方向に配置された領域において 関心のあるヌクレオチド配列と相補的であるプライマーとハイブリダイズするこ と；（ｂ）１またはそれ以上のヌクレオシドトリホスフェートを含有してなる混 合物であって、核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検 出するための手段および任意に１またはそれ以上の読終りヌクレオシドトリホス フェートを含有してなる第１または第２のヌクレオチド残基に相補的な少なくと も１つのヌクレオシドトリホスフェートを含有している混合物中、ポリメライジ ングエージェントを用いて第１の検出段階プライマーを延長すること； （ｃ）ヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出し、それによって第１の 定められた部位のヌクレオチド残基が何であるか決定すること （ｄ）段階（ｃ）において形成された延長された第１検出段階プライマーを標的 核酸ポリマーから除去すること；ならびに （ｅ）第２の検出段階プライマーであって、固定化されたポリマーに対してハイ ブリダイズされるときには、第２の定められた部位と、プライマー３′末端との 間に検出されるべき第３または第４のヌクレオチド残基と同一であるヌクレオチ ド残基がないように、定められた部位から３′末端方向に配置された領域におい て関心のあるヌクレオチド配列と相補的であるプライマーを加えること を含んでなる、少なくとも第１のヌクレオチド残基が第２の定められた部位で第 ４のヌクレオチド残基によって置換されている標的核酸ポリマー中の定められた 部位での複数の特定のヌクレオチド変異を検出するための方法。
3. ３．（ａ）患者に由来する、検出可能な量の遺伝物質を含有するサンプルをえる こと； （ｂ）その検出可能な量の遺伝物質を、一本鎖のかたちで第１のオリゴヌクレオ チドプライマー、すなわち複数のヌクレオチド残基からなる第１の検出段階プラ イマーであって、該遺伝物質に対してハイブリダイズされるときには、定められ た部位と、プライマーの３′末端との間に第１または第２のヌクレオチド残基と 同一であるヌクレオチド残基がないように、第１の定められた部位から３′末端 方向に配置された領域において関心のあるヌクレオチド配列と相補的であるプラ イマーとハイブリダイズすること； （ｃ）１またはそれ以上のヌクレオシドトリホスフェートを含有してなる混合物 であって、核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出す るための手段および任意に１またはそれ以上の読終りヌクレオシドトリホスフェ ートを含有してなる第１または第２のいずれかのヌクレオチド残基に相補的な少 なくとも１つのヌクレオシドトリホスフェートを含有している混合物中、ポリメ ライジングエージェントを用いてプライマーを延長すること；ならびに（ｄ）ヌ クレオシドトリホスフェートの取り込みを検出し、それによって定められた部位 のヌクレオチド残基が何であるか、そして患者が関連遺伝病に対する素質を有す るかどうか決定すること という段階を含んでなる、第１のヌクレオチド残基が第２のヌクレオチド残基に よって置換されている患者の遺伝物質中の定められた部位での特定のヌクレオチ ド変異から結果として生じる患者の遺伝病素質を検出するための方法。
4. ４．（ａ）徴生物に由来する、検出可能な量の遺伝物質を含有するサンプルをえ ること： （ｂ）検出可能な量の遺伝物質を、一本鎖のかたちでオリゴヌクレオチドプライ マー、すなわち複数のヌクレオチド残基からなる検出段階プライマーであって、 該遺伝物質に対してハイブリダイズされるときには、定められた部位と、プライ マーの３′末端との間に検出されるべき第１または第２のヌクレオチド残基と同 一であるヌクレオチド残基がないように、明確に定められた部位から３′末端方 向に配置された領域において関心のあるヌクレオチド配列と相補的であるプライ マーとハイブリダイズすること； （ｃ）１またはそれ以上のヌクレオシドトリホスフェートを含有してなる混合物 であって、核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出す るための手段および任意に１またはそれ以上の読終りヌクレオシドトリホスフェ ートを含有してなる第１または第２のヌクレオチド残基に相補的な少なくとも１ つのヌクレオシドトリホスフェートを含有している混合物中、ポリメライジング エージェントを用いてプライマーを延長すること； （ｄ）ヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出し、それによって定めら れた部位のヌクレオチド残基が何であるか、そして点突然変異が起きているかど うか決定すること という段階を含んでなる、微生物の病原性または治療に対する耐性を変化させる 微生物のゲノムにおける定められた部位での、第１のヌクレオチド残基が第２の ヌクレオチド残基によって置換されている点突然変異の存在を検出するための方 法。
5. ５．（ａ）非突然変異細胞に対する突然変異細胞の比率を維持しながら、細胞手 段から検出可能な量の遺伝物質をえること； （ｂ）検出可能な量の遺伝物質を、一本鎖のかたちでオリゴヌクレオチドプライ マー、すなわち複数のヌクレオチド残基からなる検出段階プライマーであって、 該遺伝物質に対してハイブリダイズされるときには、定められた部位と、プライ マーの３′末端との間に検出されるべき第１または第２のヌクレオチド残基と同 一であるヌクレオチド残基がないように、定められた部位から３′末端方向に配 置された領域において関心のあるヌクレオチド配列と相補的であるプライマーと ハイブリダイズすること； （ｃ）１またはそれ以上のヌクレオシドトリホスフェートを含有してなる混合物 であって、核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出す るための手段および任意に１またはそれ以上の読終りヌクレオシドトリホスフェ ートを含有してなる第１または第２のいずれかのヌクレオチド残基に相補的な少 なくとも１つのヌクレオシドトリホスフェートを含有している混合物中、ポリメ ライジングエージェントを用いてプライマーを延長すること；ならびに（ｄ）ヌ クレオシドトリホスフェートの取り込みを検出し、それによって定められた部位 のヌクレオチド残基が何であるか、そして突然変異細胞が存在するかどうか決定 すること という段階を含んでなる、突然変異細胞が細胞集団中に混合されているとき、第 １のヌクレオチド残基が第２のヌクレオチド残基によって置換されている、遺伝 物質中定められた部位での点突然変異を有する細胞を検出する方法。
6. ６．さらに、段階（ａ）の前に標的核酸ポリマーを固体支持体へ固定化するとい う段階を含む請求項１から５記載の方法。
7. ７．プライマーが、定められた部位に直接に隣接するヌクレオチド残基から標的 核酸ポリマーの３′末端方向に延長される、関心あるヌクレオチド配列の領域に 相補的である請求項１から５記載の方法。
8. ８．核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出するため の手段を含有するヌクレオシドトリホスフェートがデオキシヌクレオシドトリホ スフェートである請求項１から５記載の方法。
9. ９．核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出するため の手段を含有するヌクレオシドトリホスフェートがジデオキシヌクレオシドトリ ホスフェートである請求項１から５記載の方法。
10. １０．混合物が、核酸ポリマーへの第２のヌクレオシドトリホスフェートの取り 込みを検出するための、第１の手段とは異なる第２の手段を含有する第２のヌク レオシドトリホスフェートを含む請求項１から５記載の方法。
11. １１．段階（ｄ）の延長された生成物を取り込まれたヌクレオシドトリホスフェ ートの取り込みの決定の前に溶出させる請求項２記載の方法。
12. １２．複数の検出段階プライマーおよび変異ヌクレオチド残基を同定する異なっ た標識を行なったヌクレオシドトリホスフェートを加えることにより単一の段階 でヌクレオチド変異を検出する請求項２記載の方法。
13. １３．検出可能な量の核酸ポリマーを、少なくとも１つの増幅プライマーがプラ イマーに結合された第１の付着部分を含有している、修飾増幅反応を行なうこと により検出可能な量の標的核酸ポリマーをえる請求項１から５記載の方法。
14. １４．微生物がＨＩＶである請求項４記載の方法。
15. １５．点突然変異がＡｓｐ６７、Ｌｙｓ８０およびＴｈｒ２１５の中からえらば れた部位にある請求項１４記載の方法。
16. １６．細胞がリンパ球である請求項５記載の方法。
17. １７．細胞が白血病細胞である請求項１６記載の方法。
18. １８．（ａ）標的核酸ポリマーの１部分に相補的でありハイブリダイズするオリ ゴヌクレオチドであって、酵素核酸ポリメリゼーションのためのプライマーおよ び第１付着部分として有効である、オリゴヌクレオチドを含有する少なくとも１ つの増幅プライマー；（ｂ）標的核酸ポリマーの３′から変異ヌクレオチドまで の部分に相補的でありハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する少なく とも１つの検出段階プライマー；ならびに任意に （ｃ）固体マトリックス、および第１付着部分を介して増幅プローブのオリゴヌ クレオチドを固定化することのできる少なくとも１つの付着部位を含有する少な くとも１つの固体支持体；および （ｄ）核酸ポリマーへのヌクレオシドトリホスフェートの取り込みを検出するた めの手段を含有する少なくとも１つのヌクレオシドトリホスフェートのひとまと めにされた組合せを含有してなる、標的核酸ポリマーにおける特定のヌクレオチ ド変異を決定するのに用いるためのキット。
19. １９．検出段階プライマーが 配列５′【配列があります】 を含んでなる、アポリポ蛋白Ｅ多型のヌクレオチド変異の同定において用いるた めの請求項１８記載のキット。
20. ２０．検出段階プライマーが 配列５′【配列があります】 を含んでなる、アポリポ蛋白Ｅ多型のヌクレオチド変異の同定において用いるた めの請求項１８記載のキット。
21. ２１．検出段階プライマーが 配列５′【配列があります】 を含んでなる、アポリポ蛋白Ｅ多型のヌクレオチド変異の同定において用いるた めの請求項１８記載のキット。
22. ２２．検出段階プライマーが 配列５′【配列があります】 を含んでなる、アポリポ蛋白Ｅ多型のヌクレオチド変異の同定において用いるた めの請求項１８記載のキット。
23. ２３．検出段階プライマーが 配列５′【配列があります】 を含んでなる、鎌状赤血球貧血を引き起こすヒトβ−グロビン遺伝子のコドン６ におけるヌクレオチド変異の検出において用いるための請求項１８記載のキット 。
24. ２４．検出段階プライマーが 配列５′【配列があります】 を含んでなる、鎌状赤血球貧血を引き起こすヒトβ−グロビン遺伝子のコドン６ におけるヌクレオチド変異の検出において用いるための請求項１８記載のキット 。
25. ２５．検出段階プライマーが 配列５′【配列があります】 を含んでなる、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２におけるヌクレオチド変異の検出 において用いるための請求項１８記載のキット。
26. ２６．検出段階プライマーが 配列５′【配列があります】 を含んでなる、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２におけるヌクレオチド変異の検出 において用いるための請求項１８記載のキット。
27. ２７．検出段階プライマーが 配列５′【配列があります】 を含んでなる、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２におけるヌクレオチド変異の検出 において用いるための請求項１８記載のキット。
28. ２８．検出段階プライマーが 配列５′【配列があります】 を含んでなる、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２におけるヌクレオチド変異の検出 において用いるための請求項１８記載のキット。
29. ２９．検出段階プライマーが 配列５′−【配列があります】 を含んでなる、Ｎ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２におけるヌクレオチド変異の検出 において用いるための請求項１８記載のキット。
30. ３０．検出段階プライマーが 配列５′−【配列があります】 を含んでなる、ＨＩＶ−１ウィルスにおけるＡＺＴに対する耐性の検出において 用いるための請求項１８記載のキット。
31. ３１．検出段階プライマーが 配列５′−【配列があります】 を含んでなる、嚢胞性線維症の検出において用いるための請求項１８記載のキッ ト。
32. ３２．酵素触媒作用による連鎖延長核酸ポリメリゼーション反応のためのプライ マーとして働くのに充分な長さのオリゴヌクレオチドであって、関心のある遺伝 子の領域に相補的な配列を有し、定められた部位から遺伝子の３′末端方向に直 接に隣接するヌクレオチド残基で始まり、定められた部位から遺伝子の３′末端 方向に伸びており、それによって、酵素触媒作用による連続延長核酸ポリメリゼ ーションは正常な核酸残基または異常な核酸残基のいずれかに相補的な核酸残基 を加えることによって始まるオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなる、関心 ある遺伝子中の定められた部位で正常な核酸残基が異常な核酸残基で置換される 点突然変異の存在を検出するための試薬。
33. ３３．オリゴヌクレオチドが１０〜４０ヌクレオチド残基の長さを有する請求項 ３２記載の試薬。
34. ３４．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。
35. ３５．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。
36. ３６．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。
37. ３７．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。
38. ３８．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。
39. ３９．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。
40. ４０．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。
41. ４１．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。
42. ４２．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。
43. ４３．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。
44. ４４．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。
45. ４５．配列５′−【配列があります】を有する請求項３２記載の試薬。