DE648280T1 - Verfahren und reagens zum nachweis von spezifischen nukleotid-variationen. - Google Patents

Verfahren und reagens zum nachweis von spezifischen nukleotid-variationen.

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DE648280T1
DE648280T1 DE0648280T DE91903942T DE648280T1 DE 648280 T1 DE648280 T1 DE 648280T1 DE 0648280 T DE0648280 T DE 0648280T DE 91903942 T DE91903942 T DE 91903942T DE 648280 T1 DE648280 T1 DE 648280T1
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Ann-Christine Sf-00270 Helsinki Syvaenen
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Claims (1)

  1. EP 91 90 3942.0
    ORION-YHTYMÄ OY
    U.Z.: C 978 EP
    Patentansprüche
    (Übersetzung nach Art. 67 EPÜ)
    1. Verfahren zum Nachweis einer spezifischen Nucleotidvariation an einer bestimmten Stelle in einem Ziel-
    jg Nucleinsäurepolymer, in dem ein erster Nucleotidrest durch einen zweiten Nucleotidrest ersetzt ist, wobei eine nachweisbare Menge des Ziel-Nucleinsäurepolymers nach Durchführung einer modifizierten Amplifikationsreaktion erhalten wird, in der mindestens ein Amplifikati-
    2g ons-Primer eine erste, an den Primer gebundene Verknüpfungseinheit umfaßt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
    (a) Immobilisierung des Ziel-Nucleinsäurepolymers an einen festen Träger vor Durchführung des Schrittes (b>'
    (b) Hybridisierung der nachweisbaren Menge eines Ziel-Nucleinsäurepolymers in Einzelstrangform mit einem Oligonucleotidprimer, nämlich dem Primer des Nachweisschrittes, umfassend eine Vielzahl von Nucleo-
    2g tidresten, wobei der Primer komplementär zur Nucleo-
    tidsequenz von Interesse in einem Bereich in Richtung 3'-Ende von der bestimmten Stelle aus ist, so daß, wenn der Primer mit dem Polymer hybridisiert, es keine Nucleotidreste zwischen der bestimmten
    oQ Stelle und dem 3'-Ende des Primers gibt, die iden
    tisch mit den ersten oder zweiten nachzuweisenden Nucleotidresten sind,
    (c) Verlängerung des Primers unter Verwendung eines Polymerisationsmittels in einem Gemisch, das eines
    3g oder mehrere Nucleosidtriphosphate umfaßt, wobei das
    Gemisch mindestens ein Nucleosidtriphosphat umfaßt, das komplementär zum ersten oder zweiten Nucleotidrest ist, umfassend Mittel zum Nachweis des Ein-
    baus des Nucleosidtriphosphats in ein Nucleinsäure-
    polymer, und gegebenenfalls eines oder mehrere Kettenabbruch-Nucleosidtriphosphate; und
    (d) Nachweis des Einbaues des Nucleosidtriphosphats, wobei die Identität des Nucleotidrestes an der bestimmten Stelle festgestellt wird.
    2. Verfahren zum Nachweis einer Vielzahl von spezifischen Nucleotidvariationen an bestimmten Stellen in einem Ziel-Nucleinsäurepolymer, wobei mindestens ein erster Nucleotidrest durch einen zweiten Nucleotidrest an einer ersten definierten Stelle ersetzt wird und ein drittes Nucleotid durch einen vierten Nucleotidrest an einer zweiten definierten Stelle ersetzt wird, wobei eine nachweisbare Menge eines Ziel-Nucleinsäurepolymers nach Durchführung einer modifizierten Amplifikationsreaktion erhalten wird, wobei mindestens ein Amplifikationsprimer eine an den Primer gebundene erste Verknüpfungseinheit umfaßt, umfassend:
    (a) Immobilisierung des Ziel-Nucleinsäurepolymers an einen festen Träger vor Durchführung des Schrittes (b) ,
    {b) Hybridisierung einer nachweisbaren Menge eines Ziel-Nucleinsäurepolymers in Einzelstrangform mit einem ersten Nachweisschritt-Primer, umfassend eine Vielzahl von Nucleotidresten, wobei der Primer komplementär zur Nucleotidsequenz von Interesse in einem Bereich in Richtung 3'-Ende von der ersten definierten Stelle aus ist, so daß, wenn der Primer mit dem 3^ Polymer hybridisiert, es keine Nucleotidreste zwi
    schen der ersten bestimmten Stelle und dem 3'-Ende des Primers gibt, die identisch mit den ersten und zweiten Nucleotidresten sind;
    {c) Verlängerung des ersten Nachweisschritt-Primers unter Verwendung eines Polymerisationsmittels in
    einem Gemisch, das eines oder mehrere Nucleosidtri-
    phosphate umfaßt, wobei das Gemisch mindestens ein
    Nucleosidtriphosphat umfaßt, das komplementär zu dem ersten oder zweiten Nucleotidrest ist, umfassend Mittel zum Nachweis des Einbaus des Nucleosidtriphosphats in ein Nucleinsäurepolymer, und gegebenenfalls eines oder mehrere Kettenabbruchnucleosidtriphosphate;
    (d) Nachweis des Einbaus des Nucleosidtriphosphats, wobei die Identität des Nucleotidrests an der ersten bestimmten Stelle festgestellt wird,
    (e) Entfernen des verlängerten ersten Nachweisschritt-Primers, der in Schritt (c) gebildet wurde, vom Ziel-Nucleinsäurepolymer; und
    (f) Zugabe eines zweiten Nachweisschritt-Primers, wobei der Primer komplementär zu der Nucleotidsequenz von Interesse in einem Bereich in Richtung 3'-Ende von der zweiten bestimmten Stelle aus ist, so daß, wenn der Primer mit dem immobilisierten Polymer hybridisiert, es keine Nucleotidreste zwischen der zweiten bestimmten Stelle und dem 3'-Ende des Primers gibt,
    2^ die identisch mit den nachzuweisenden dritten oder
    vierten Nucleotidresten sind.
    3. In vitro-Verfahren zum Nachweis einer Prädisposition für eine genetische Erkrankung in einem Patienten, die von einer spezifischen Nucleotidvariation an einer bestimmten Stelle im genetischen Material des Patienten herrührt, wobei ein erster Nucleotidrest durch einen zweiten Nucleotidrest ersetzt ist, umfassend die folgenden Schritte:
    ^ (a) Gewinnung einer Probe, die eine nachweisbare Menge des vom Patienten stammenden genetischen Materials enthält, durch Durchführung einer modifizierten Amplifxkationsreaktion, wobei mindestens ein Amplifikationsprimer eine erste an den Primer gebundene ^5 Verknüpfungseinheit umfaßt,
    _06_4£_2a0
    (b) Immobilisierung des Ziel-Nucleinsäurepolymers an einen festen Träger vor Durchführung des Schrittes (O,
    (c) Hybridisierung der nachweisbaren Menge an genetischem Material in Einzelstrangform mit einem ersten Oligonucleotidprimer, nämlich dem ersten Nachweisschritt-Primer, umfassend eine Vielzahl von Nucleotidresten, wobei der Primer komplementär zur Nucleotidsequenz von Interesse in einem Bereich in Richtung 3'-Ende von der ersten bestimmten Stelle aus ist, so daß, wenn der Primer mit dem genetischen Material hybridisiert, es keine Nucleotidreste zwischen der definierten Stelle und dem 3'-Ende des Primers gibt, die identisch mit den ersten und zwei-
    ten Nucleotidresten sind;
    (d) Verlängerung des Primers unter Verwendung eines Polymerisationsmittels in einem Gemisch, das eines oder mehrere Nucleosidtriphosphate umfaßt, wobei das Gemisch mindestens ein Nucleosidtriphosphat umfaßt,
    das komplementär zu dem ersten oder zweiten Nucleotidrest ist, umfassend Mittel für den Nachweis des Einbaus der Nucleosidtriphosphate in ein Nucleinsäurepolymer, und gegebenenfalls eines oder mehrere Kettenabbruchnucleosidtriphosphate; und
    (e) Nachweis des Einbaus des Nucleosidtriphosphats, wobei die Identität des Nucleotidrestes an der bestimmten Stelle festgestellt wird und somit, ob der Patient eine Prädisposition für die entsprechende genetische Erkrankung hat.
    Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Punktmutationen an einer bestimmten Stelle im Genom eines Mikroorganismus, die zu einer veränderten Pathogenität oder Therapieresistenz in den Mikroorganismus führen, wobei ein erstes Nucleotid durch einen zweiten Nucleotidrest ersetzt ist, umfassend die folgenden Schritte:
    ■*■ {a) Gewinnung einer Probe, die eine nachweisbare Menge des genetischen Materials vom Mikroorganismus enthält, durch Durchführung einer modifizierten Amplifikationsreaktion, wobei mindestens ein Amplifikationsprimer eine erste, an den Primer gebundene Ver
    knüpfungseinheit enthält,
    (b) Immobilisierung des Ziel-Nucleinsäurepolymers an einen festen Träger vor Durchführung des Schrittes
    ^ (c) Hybridisierung der nachweisbaren Menge an genetischem Material in Einzelstrangform mit einem Oligonucleotidprimer, dem Nachweisschritt-Primer, umfassend eine Vielzahl von Nucleotidresten, wobei der Primer komplementär zur Nucleotidsequenz von
    1^ Interesse in einem Bereich in Richtung 3'-Ende von
    der definierten Stelle aus ist, so daß, wenn der Primer mit dem genetischen Material hybridisiert, es keine Nucleotidreste zwischen der bestimmten Stelle und dem 3'-Ende des Primers gibt, die identisch mit dem ersten oder zweiten nachzuweisenden Nucleotidre
    sten sind,-
    (d) Verlängerung des Primers unter Verwendung eines Polymerisationsmittels in einem Gemisch, das
    eines oder mehrere Nucleosidtriphosphate umfaßt, wobei das Gemisch mindestens ein Nucleosidtriphosphat
    umfaßt, das komplementär zum ersten oder dem zweiten
    Nucleotidrest ist, umfassend Mittel für den Nachweis
    des Einbaus des Nucleosidtriphosphats in ein
    Nucleinsäurepolymer, und gegebenenfalls eines oder mehrere Kettenabbruchnucleosidtriphosphate; und
    (e) Nachweis des Einbaus des Nucleosidtriphosphats, wobei die Identität des Nucleotidrests an der bestimmten Stelle festgestellt wird, und somit, ob eine
    Punktmutation vorliegt.
    35
    5. In vitro-Verfahren zum Nachweis von Zellen mit einer Punktmutation an einer bestimmten Stelle im genetischen
    , ■ &igr; 6 " 0648 28&Tgr;&Ggr;
    Material, wobei ein erster Nucleotidrest durch einen zweiten Nucleotidrest ersetzt ist, wenn die mutierten Zellen in einer Zellpopulation gemischt vorliegen, umfassend die folgenden Schritte:
    (a) Gewinnung einer nachweisbaren Menge von genetischem Material aus der Zellpopulation, während das Verhältnis von mutierten zu nicht-mutierten Zellen aufrechterhalten wird, durch Durchführung einer modifizierten Amplifikationsreaktion, wobei mindestens ein Amplifikationsprimer eine erste, an den Primer gebundene Verknüpfungseinheit enthält,
    (b) Immobilisierung des Zielnucleinsäurepolymers an einen festen Träger vor Durchführung des Schrittes (O,
    (c) Hybridisierung der nachweisbaren Menge an genetischem Material in Einzelstrangform mit einem Oligonucleotidprimer, dem Nachweisschritt-Primer, umfassend eine Vielzahl von Nucleotidresten, wobei der Primer komplementär zur Nucleotidsequenz von
    Interesse in einem Bereich in Richtung 3'-Ende von der bestimmten Stelle aus ist, so daß, wenn der Primer mit dem genetischen Material hybridisiert, es keine Nucleotidreste zwischen der bestimmten Stelle und dem 3'-Ende des Primers gibt, die identisch mit den nachzuweisenden ersten oder zweiten Nucleotidresten sind;
    (d) Verlängerung des Primers unter Verwendung eines Polymerisationsmittels in einem Gemisch, das eines oder mehrere Nucleosidtriphosphate umfaßt, wobei das
    Gemisch mindestens ein Nucleosidtriphosphat umfaßt, das komplementär zu dem ersten oder zweiten Nucleotidrest ist, umfassend Mittel für den Nachweis des Einbaus des Nucleosidtriphosphats in ein Nucleinsäurepolymer, und gegebenenfalls eines oder mehrere Kettenabbruchnucleosidtriphosphate; und
    (e) Nachweis des Einbaus des Nucleosidtriphosphats, wobei die Identität des Nucleotidrests an der bestimm-
    %0
    ten Stelle festgestellt wird, und somit, ob mutierte Zellen vorliegen.
    6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Primer komplementär ist zu einem Bereich der Nucleotidsequenz von Interesse, der sich in Richtung 3'-Ende des Ziel-Nucleinsäurepolymers vom unmittelbar neben der bestimmten Stelle gelegenenNucleotidrest aus erstreckt.
    7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Nucleosidtriphosphat, das das Mittel zum Nachweis des Einbaus des Nucleosidtriphosphats in einem Nucleinsäurepolymer enthält, ein Desoxynucleosidtriphosphat ist.
    8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Nucleotidtriphosphat, das das Mittel zum Nachweis des Einbaus des Nucleosidtriphosphats in ein Nucleinsäurepolymer enthält, ein Didesoxynucleosidtriphosphat ist.
    9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Gemisch ein zweites Nucleosidtriphosphat enthält, das ein vom ersten Mittel unterschiedliches zweites Mittel umfaßt, zum Nachweis des Einbaus des zweiten Nucleo-
    sidtriphosphats in ein Nucleinsäurepolymer.
    25
    10. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das verlängerte Produkt von Schritt (d) eluiert wird, bevor der Einbau des eingebauten Nucleosidtriphosphats festgestellt wird.
    ° 11. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Nucleotidvariationen in einem einzigen Schritt durch Zugabe einer Vielzahl von Nachweisschritt-Primern und unterschiedlich markierten Nucleosidtriphosphaten zur Identifizierung der unterschiedlichen Nucleotidreste nachgewiesen wer-
    den.
    12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 6 bis 9, wobei der Mikroorganismus HIV ist.
    13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Punktmutation an einer Stelle auftritt, die ausgewählt ist aus Asp 67, Lys 80 und Thr 215.
    14. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die Zellen Lymphocyten sind.
    15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zellen leukämische Zellen sind.
    16. Kit zur Verwendung in der Bestimmung spezifischer
    Nucleotidvariatxonen in einem Ziel-Nucleinsäurepolymer, umfassend in verpackter Kombination
    (a) mindestens einen Amplifikationsprimer, umfassend ein Oligonucleotid, das komplementär ist zu und hybridisiert mit einem Teil des Ziel-Nucleinsäurepolymers
    und das wirksam ist als Primer für die enzymatische Nucleinsäurepolymerisation, und eine erste Verknüpfungseinheit ;
    (b) mindestens einen Nachweisschritt-Primer, umfassend
    ein Oligonucleotid, das komplementär ist zu und hy-
    bridisiert mit einem Teil, der 31 zu einem variablen Nucleotid des Ziel-Nucleinsäurepolymers liegt; und
    (c) mindestens einen festen Träger, umfassend eine feste Matrix und mindestens eine Verknüpfungsstelle, die das Oligonucleotid der Amplifikationssonde über die
    erste Verknüpfungseinheit immobilisieren kann; und
    (d) mindestens ein Nucleosidtriphosphat, das Mittel zum Nachweis des Einbaus des Nucleosidtrxphosphats in ein Nucleinsäurepolymer enthält.
    17. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung bei der Identifizierung der Nucleotidvariation von Apolipoprotein E-PoIy-
    ; morphismus, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz 5'-GCG CGG ACA TGG AGG ACG TG umfaßt.
    18. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung bei der Identifizierung der Nucleotidvariation von Apolipoprotein E-PoIymorphismus, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz 5'-ATG CCG ATG ACC TGC AGA AG umfaßt.
    19. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung bei der Identifizie-10
    rung der Nucleotidvariation von Apolipoprotein E-PoIymorphismus, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz 5'-GTA CTG CAC CAG GCG GCC GC umfaßt.
    20. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung bei der Identifizie-
    rung der Nucleotidvariation von Apolipoprotein E-PoIymorphismus, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz 5·- GGC CTG GTA CAC TGC CAG GC umfaßt.
    21. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung beim Nachweis der
    Nucleotidvariation in Codon 6 des menschlichen b-Globingens, das Sichelzellenanämie verursacht, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz
    5'-CAT GGT GCA CCT GAC TCC TG umfaßt.
    22. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung beim Nachweis der
    Nucleotidvariation in Codon 6 des menschlichen b-Globingens, das Sichelzellenanämie verursacht, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz
    5'-CAG TAA CGG CAG GCG GCC GC umfaßt.
    23. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung beim Nachweis einer Nucleotidvariation in Codon 12 des K-ras-Gens, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz
    5'-AAG GCA CTC TTG CCT ACG CCA umfaßt.
    24. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung beim Nachweis einer Nucleotidvariation in Codon 12 des K-ras-Gens, wobei der
    &iacgr;&ogr;
    Nachweisschritt-Primer die Sequenz 5'-AGG CAC TCT TGC CTA CGC CAC umfaßt.
    25. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung beim Nachweis einer 5
    Nucleotidvariation in Codon 12 des K-ras-Gens, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz 5'-AAC TTG TGG TAG TTG GAG CT umfaßt.
    26. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung beim Nachweis einer Nucleotidvariation in Codon 12 des K-ras-Gens, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz
    5'-ACT TGT GGT AGT TGG AGC TG umfaßt.
    27. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung beim Nachweis einer 15
    Nucleotidvariation in Codon 12 des N-ras-Gens, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz
    5'-ACT GGT GGT GGT TGG AGC AG umfaßt.
    28. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung beim Nachweis von 20
    Resistenz gegenüber AZT in HIV-I-Viren, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz
    5'-ATC TGT TGA GGT GGG GAC TT umfaßt.
    29. Kit nach Anspruch 16 zur Verwendung beim Nachweis von 25
    cystischer Fibröse, wobei der Nachweisschritt-Primer die Sequenz 5 ' -TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT umfaßt.
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