HU211058B - Processes, kits and reagent compositions for determining of specific nucleotide variants - Google Patents

Processes, kits and reagent compositions for determining of specific nucleotide variants Download PDF

Info

Publication number
HU211058B
HU211058B HU91516A HU51691A HU211058B HU 211058 B HU211058 B HU 211058B HU 91516 A HU91516 A HU 91516A HU 51691 A HU51691 A HU 51691A HU 211058 B HU211058 B HU 211058B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
primer
nucleotide
sequence
detection step
oligonucleotide
Prior art date
Application number
HU91516A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT61330A (en
HU910516D0 (en
Inventor
Hans Erik Soederlund
Ann-Christine Elisabe Syvaenen
Original Assignee
Orion Yhtymae Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orion Yhtymae Oy filed Critical Orion Yhtymae Oy
Publication of HU910516D0 publication Critical patent/HU910516D0/hu
Publication of HUT61330A publication Critical patent/HUT61330A/hu
Publication of HU211058B publication Critical patent/HU211058B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

A jelen találmány tárgyát eljárások, reagenskészletek és készítmények képezik, specifikus nukleotidvariációk meghatározására egy meghatározott polinukleotidrégióban, valamint a módszer alkalmazása specifikus pontmutációk és genetikai variációk meghatározásában.
Az élő szervezetek genetikai információja genomjuk nukleotid-szekvenciájában található. A gén-expresszió során a nukleotid-szekvencia aminosav-szekvenciákká, azaz fehéijékké fordítódik le. A nukleotid szekvencia minimális változásai, még egyetlen bázis helyettesítése is megváltozott fehérjeterméket eredményezhet. Az adott fehérje megváltozott mennyisége vagy minősége megváltoztatja a sejt fenotípusát (azaz a megfigyelhető jellemzőket), amelyek például egy betegség kifejlődése formájában figyelhetők meg.
Az örökletes betegségeket, a genetikai rendellenességekre való hajlamot és rákot okozó molekuláris hibákra vonatkozó ismeretek rohamosan szaporodnak. Az arra vonatkozó ismeretek, hogy mi a szomatikus mutációk jelentősége a rosszindulatú sejtszaporodásban, azonban korlátozottak, mivel hiányzik egy gyors és megbízható módszer nagyszámú minták átvizsgálására.
A pontmutációk által okozott örökletes betegségek közé tartozik a sarlósejtes anémia, valamint a β-talasszémia, amit a β-globin génben létrejött mutációk okoznak [Antonarakis, New England J. Med., 320, 153-163 (1989)]. Ezek a mutációk általában magukba foglalják 1—4 nukleotid helyettesítését, inszercióját vagy delécióját a normális génszekvenciában. A sarlósejtes anémiát a β-globin gén hatodik kodonjában egyetlen bázispár szubsztitúciójára vonatkozó homozigóta állapot okozza [Antonarakis, New England J. Med., 320, 153-163 (1989)]. Számos olyan mutációt azonosítottak a β-globin génben, amely β-talasszémiához vezethet [Antonarakis, New England J. Med., 320, 153-163 (1989)].
Más. pontmutációk által okozott betegségek közé tartozik az α-talasszémia. fenilketonúria, hemofília, α,-antitripszin hiány [Antonarakis, New England J. Med., 320, 153-163 (1989)], valamint a cisztás fibrózis.
A cisztás fibrózis a legáltalánosabb autoszomális recesszív genetikai rendellenesség. Ez a kaukázusi populáció egyedeinek körülbelül 1/2000 részét érinti, ennek következtében a hordozók gyakorisága körülbelül 5%. A cisztás fibrózis transzmembrán szabályozó (CFTR) gén legújabb klónozása és genetikai analízise [Kerem et. al., Science, 245, 1073-1080 (1989)] egy fontos mutációt mutatott ki, jele F508, amely három nukleotid deléciója, és ennek eredménye egy fenilalanin eltűnése az 508-as aminosav-pozícióból. Ez a mutáció van túlsúlyban az észak-amerikai és az európai beteg-populáció 68%-ban, az arány 40-88% között van azokban a jelentésekben, amelyek több mint 100 CF kromoszóma analízisével készültek. A cisztás fibrózis nagy gyakorisága következtében a hordozók kiszűréséhez, valamint a születés előtti diagnosztizáláshoz hatékony módszerre van szükség a veszélyeztetett csoport országaiban.
A polimorfizmus egyik példája, amely korrelál a betegségre való hajlammal, az apolipoprotein-E gén három-alléles polimorfizmusa. Ez a polimorfizmus az Apo-E-gén két DNS-lókusza egyetlen bázisos szubsztitúciójának következménye [Mahley, Science, 240, 622-630 (1988)]. Ez megmagyarázhatja a szérum koleszterin-szintek egyéni variációjának több mint 10%át. A HI-as típusú hiperlipoproteinémiában szenvedő betegeknek több mint 90%-a homozigóta az egyik Apo-E-allélre.
A humán fő hisztokompatibilitási komplex kapcsolt gének polimorf rendszere, amely a genomnak egy konzervált régiójában található. AHLA-D (humán leukocita antigén) régió ΙΙ-es típusú génjei számos polimorf alléit kódolnak [Thomson, Ann. Rév. Génét., 22, 31-50 (1988); Morei et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8111-8115 (1988); Scharf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3504-3508 (1988)]. Εσοί a polimorfizmusról kimutatták, hogy kapcsolatban áll az autoimmun betegségekkel, például az inzulin-függő cukorbetegséggel és az idült, hólyagos pemphigussal.
A humán ras-géncsalád, amelybe beletartozik a H-, K-, és N-ras gén, egyike a mutációs változások lehetséges célpontjának, amely szerepet játszik a humán tumorgenezisben. A ras-gének 12, 13 vagy 61-es kodonjának bármelyikében keletkező pontmutációról kimutatták, hogy ezeket a géneket transzformáló onkogénekké alakítja [Bős et al., Natúré, 315, 726-730 1985)]. Az N-ras-gén szomatikus pontmutációiról kimutatták, hogy az akut mieloid leukémiával (AML) vannak kapcsolatban [Farret. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1629-1633 (1988)], valamint más hematológiai jellegű rosszindulatú sejtszaporodással [Neri et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 9268-9272 (1988)]. Egy olyan eljárás, amely alkalmas az N-ras mutációk érzékeny kimutatására kismennyiségű leukémiás sejtből nagyszámú egészséges sejt között, nagyon értékes eszköz lenne az AML és más N-ras-hoz kapcsolódó rosszindulatú sejtszaporodás utókezelésében.
Az N-ras gén 12, 13 és 61-es kodonjának első és második pozíciójában létrejött specifikus bázisváltozások kimutatására vagy számos különböző oligonukleotid próbával végzett hibridizációra van szükség, vagy az amplifikált DNS nukleotid szekvenciájának közvetlen meghatározására. Mindkét megközelítésnek kritikus pontja a mutációt tartalmazó sejtek aránya. A választott módszertől függően a mutációnak az analizált sejt-populáció 5-20%-ában jelen kell lennie ahhoz, hogy kimutatható legyen.
A pontmutációk és genetikai variációk a mikroorganizmusokban gyakran megváltozott patogenitáshoz vagy gyógyszerek elleni megváltozott rezisztenciához vezetnek. A humán immunhiányos állapotot okozó vírus (HIV-1) olyan mutánsokat képes létrehozni, amelyek rezisztensek a zidovudinra (AZT). A rezisztens vírusizolátumok számos pontmutációt tartalmaznak, de három mutáció tűnik általánosnak az összes rezisztens törzsben: Asp 67 - Asn (GAC-AAC), Lys 70 - Arg (AAT-GAT) és Thr 215 - Phe (ACC-TCC) [Larder and Kemp, Science. 246, 1155-1158 (1989)].
HU 211 058 Β
Tehát nagyon jelentős lenne, ha az élő szervezetek genomjának nukleotid szekvenciájában beálló változásokat pontosan, hatásosan és egyszerűen meg lehetne határozni, és így nagyszámú mintát lehetne átvizsgálni, ez megadná a lehetőséget az örökletes hajlamok vagy betegségek pre- és posztnatális diagnosztizálására, valamint a szomatikus mutációk kimutatására rákos elváltozások esetén. Ez a módszer alkalmazható lenne sejtek és törzsek ipari biotechnológiai célra történő szelektálására, valamint a növénynemesítésben és állattenyésztésben. A jelenleg alkalmazott módszerek olyan hátrányokkal bírnak, amelyek megakadályozzák rutinszerű alkalmazásukat.
A DNS szekvenciákban a polimorfizmust vagy mutációkat legáltalánosabban allél-specifikus oligonukleotid (ASO) próbákkal végzett hibridizációval lehet kimutatni. Az ASO próbák szekvenciáját vagy úgy tervezik meg, hogy tökéletesen illeszkedő hibridet képezzen. vagy úgy, hogy a változó nukleotidnál egy nem illeszkedő bázispár jöjjön létre. A tökéletesen illetve tökéletlenül illeszkedő hibrid közötti megkülönböztetés azon alapulhat, hogy:
i) különbség van a hibridek hőstabilitásában a hibridizálás vagy mosás során alkalmazott körülmények között (EP 237 362 számú európai közrebocsátási irat).
ii) különbség van az analizált hibridek stabilitásában a denaturáló gélelektroforézis körülményei között, vagy iii) kémiai hasítás végezhető a helytelen illeszkedés helyén (EP 329 311 számú európai közrebocsátási irat).
Azokat az oligonukleotidokat használják allél-specifikus próbaként, amelyeknek a 3'-vége komplementer a változó nukleotidok helyével (EP 332 435 számú európai közrebocsátási irat). A változó nukleotidokat azon az alapon azonosítják, hogy a rossz illeszkedés a 3’-végen megakadályozza a polimerizációs reakciót. Hasonló megközelítést alkalmaznak az oligomer ligálási vizsgálatokban, amelyekben két szomszédos oligonukleotid csak akkor ligálódik össze, ha az oligonukleotidok végein tökéletes az illeszkedés (EP 336 731 számú európai közrebocsátási irat).
A DNS szekvencia restrikciós enzimekkel történő hasítását használhatjuk a változás azonosítására, azzal a feltétellel persze, hogy a változó nukleotid megváltoztat, azaz létrehoz vagy elront egy specifikus restrikciós helyet. A nukleotid-szekvenálás a legtöbb információt adó módszer a variábilis nukleotidok meghatározásában.
A fentiekben említett módszerek viszonylag komplex eljárások, és olyan hátrányoktól szenvednek, amelyek nehezen felhasználhatóvá teszik őket a rutinszerű diagnosztikában. Az allél-specifikus oligonukleotidpróbák alkalmazása megköveteli a reakciókörülmények alapos optimalizálását külön-külön minden egyes alkalmazás során. A gélelektroforézissel végzett elválasztás módszerét alkalmazzák a fenti módszerek közül sokban. Ezek a módszerek nem automatizálhatók könnyen.
Kidolgoztunk egy javított eljárást, amely lehetővé teszi a nukleotid variációk kimutatását. Ez a módszer számos előnnyel rendelkezik a szakirodalomban korábban közölt módszerekkel szemben. A jelen találmány szerinti módszer kisszámú, könnyen kivitelezhető lépést tartalmaz. Speciálisan arra van beállítva, hogy a pontmutációkat és a nukleotid variációkat, például az egyszeres helytelen illeszkedéseket, deléciókat, inszerciókat és inverziókat rutinszerűen meg lehessen határozni vele. A jelen találmány szerinti módszer lehetővé teszi az elmutált sejtek arányának meghatározását egy mintában, valamint azoknak a mutációknak a meghatározását, amelyek a vizsgált sejtpopulációnak kevesebb mint 0,5%-ban vannak jelen. Továbbá a leírt módszer könnyen automatizálható, ami egyre fontosabbá válik a rutinszerű diagnosztikában.
A variábilis nukleotid(ok) kimutatásának módszere azon alapszik, hogy a kimutatási lépésben láncindító molekula meghosszabbítást és detektálható nukleozidtrifoszfát beépítést végzünk. A variábilis nukleotid közvetlen szomszédságában levő régiónak megfelelően megválasztva a kimutatási lépés láncindító molekuláit, a variációt már akkor is lehet detektálni, ha csak egy nukleozid-trifoszfát épült be.
A variábilis nukleotidnak megfelelő jelzett nukleozid-trifoszfátokat adunk a rendszerhez, és mérjük a jelzés beépülését a kimutatási lépés során.
A kimutatási lépés láncindító molekuláinak helyes megválasztása fontos a jelen találmány szerinti módszerben, és függ a keresett nukleotid szekvenciától. A kimutatási lépés láncindító molekuláit előnyösen úgy választjuk meg, hogy lefedjék azt a régiót, amely a kimutatandó variábilis nukleotidtól 3'-irányban található közvetlenül. A kimutatási lépés láncindító molekulái egy olyan szekvenciával komplementerek, amely a variábilis nukleotidtól néhány nukleotiddal távolabb kezdődik. A kimutatási lépés láncindító molekuláinak a helyére vonatkozó egyetlen korlátozás az, hogy a kimutatási lépés láncindító molekulájának 3'-vége és a kimutatandó variábilis nukleotid közötti szekvencia nem tartalmazhat ugyanolyan típusú nukleotidot, mint amilyet ki akarunk mutatni. A kimutatási lépés láncindító molekuláinak megválasztásánál mindegy, hogy a keresett nukleotid szekvencia kódoló vagy nem-kódoló szálával komplementer.
A kiválasztott nukleinsavat előnyösen in vitro módszerekkel felszaporítjuk (amplifikáljuk), ezzel tesszük lehetővé egyetlen variábilis nukleotid kimutatását a humán genomban. A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazunk egy korábban leírt módszert a kimutatandó cél-nukleinsav amplifikálására és affinitás-módosítására. A találmány szerinti eljárásban a variábilis nukleotido(ka)t tartalmazó cél-nukleinsavat szilárd hordozóra rögzítjük, ami lehetővé teszi az amplifikációs reakcióelegy eltávolítását a cél-nukleinsav mellől.
A jelen találmány tárgyát képezik az egyes láncindító molekulákat tartalmazó reagens-készítmények és reagens-kombinációk vagy reagenskészletek, amelyek a találmány szerinti módszer végrehajtására alkalma3
HU 211 058 Β sak. Míg a pontos reagensek és a csomagolás függenek a kimutatandó nukleotid variációktól vagy pontmutációktól, egy ilyen reagenskészlet általában tartalmaz legalább egy módosított amplifikációs láncindító molekulát, amely rendelkezik egy kapcsoló-egységgel; legalább egy, a kimutatási lépésben alkalmazott láncindító molekulát; de tartalmazhat legalább egy hordozót is, úgy kialakítva, hogy rögzítse a kiválasztott nukleinsav módosított kópiáit; és legalább egy jelzett nukleozidtri foszfátot.
Az ábrák rövid leírása. Az
1. ábrán egy találmány szerinti eljárás végrehajtására alkalmas reagenskészletet látunk, abban az esetben, amikor egy variábilis nukleotidot (X) vagy Xz) mutatunk ki. A
2. ábrán egy találmány szerinti eljárás végrehajtására alkalmas reagenskészletet látunk, abban az esetben, amikor a kimutatási lépés láncindító molekuláját úgy választjuk meg, hogy a kimutatandó variábilis nukleotidtól n nukleotid távolságig terjedő régiót fedje le. A
3. ábrán egy találmány szerinti eljárás végrehajtására alkalmas készletet látunk, abban az esetben, amikor több helytelen illeszkedés van egymás mellett és ezt kell kimutatni. Ebben az esetben a vizsgálatot két lépésben hajtjuk végre, amikor a kimutatási lépéshez tartozó 1-es láncindító molekulát kimossuk, mielőtt a második lépést végrehajtjuk.
Az ábrákon alkalmazott jelzések:
- X és X'jelentése: nukleotidok
- A kimutatandó variábilis nukleotid jelzése X,, X2, X3 vagy X4
- Y„ Y2. Y3 es Y4 jelentése az X,, X2, X3 vagy X4 nukleotidokkal komplementer nukleotid
- dY jelentése: dezoxi-ribonukleozid-trifoszfát
- dY* és dY+jelentése: jelzett dezoxi-ribonukleozid-trifoszfát
- ddY jelentése: didezoxi-ribonukleozid-trifoszfát
- ddY* és ddY+ jelentése: jelzett didezoxi-nukleotid-trifoszfát
- * és + jelentése: különböző jelzések.
A találmány tárgya eljárás specifikus nukleotid-variációk meghatározására, egy komplex nukleinsav keverékben levő nukleinsav-molekula előzőleg meghatározott régiójában. Ezt, a nukleotid-variációt tartalmazó meghatározott régiót nevezzük a továbbiakban „célnukleinsav”-nak.
A találmány szerinti eljárás egy láncindító molekula meghosszabbítási reakción alapul, legalább egy láncindító molekulát alkalmazva a kimutatási lépésben, amely komplementer a kimutatandó variábilis nukleotidtól 3'-irányban levő nukleotid-szekvenciával. A variábilis nukleotid kimutatását úgy hajtjuk végre, hogy kimutatunk egy jelzett nukleozid-trifoszfátot, amely a kimutatási lépés láncindító molekulájának meghoszszabbítása során épül be.
A kiválasztott nukleinsavat előnyösen in vitro amplifikáljuk a kimutatási lépés előtt, hogy a kiválasztott nukleinsavból kimutatható mennyiséggel rendelkezzünk. A nukleinsav aktuális mennyisége változó, függ a kimutatási lépésben alkalmazott jelző molekulától, valamint az erre a molekulára kidolgozott analitikai módszer érzékenységétől. A jelen találmány szerinti módszer egy előnyös megvalósítási módja szerint egy affmitási egységet építünk be a kiválasztott nukleinsav kiválasztott régiójának másolataiba. Ezt kényelmesen egy láncindító molekulától függő amplifikációs reakcióval végezhetjük el, legalább egy affinitás-jelzéssel ellátott amplifikációs láncindító molekula alkalmazásával. A kiválasztott nukleinsav-molekulák másolatait egy szilárd hordozón rögzítjük, a bevitt affinitás-egység segítségével.
Az alábbiakban a találmány szerinti eljárás előnyös megvalósítási módjára különböző kísérleti elrendezéseket írunk le, majd az eljárást tovább illusztráljuk példákkal. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárás végrehajtásának lehetőségei nem korlátozódnak a megadott példákra, és a vizsgálati módszer kísérleti elrendezését a kimutatandó mutáció vagy nukleotid variáció határozza meg.
a) Affinitást egység béé ítése a kiválasztott DNS másolataiba
A kiválasztott nukleinsav (DNS vagy RNS) forrása, amelyről feltételezzük, hogy tartalmazza a variábilis nukleotid csoportot, lehet bármely humán, állati vagy növényi sejt, vagy mikroorganizmus. A kiválasztott nukleinsavat izolálhatjuk a biológiai mintákból szokványos nukleinsav-tisztítási módszereket alkalmazva, de a jelen találmány alapján használhatunk nyers biológiai mintákat is.
A kiválasztott variábilis nukleotid-helyet tartalmazó nukleinsavat előnyösen in vitro módszenei amplifikáljuk, a kiválasztott nukleotid szekvenciához közel eső láncindító molekulát alkalmazva. A „amplifikáció” szakkifejezés alatt a továbbiakban egy nukleinsav szekvenciának bármely, láncindító molekula jelenlététől függő meghosszabbítását értjük, egy polimerizáló ágens segítségével. A megfelelő láncindítómolekulafüggő reakció például a polimeráz láncreakció [Kleppe et al., J. Mól. Bioi., 56, 341-361 (1971); valamint a 4 683 202 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]; az olyan folyamatok, amelyek mind a láncindító molekulától függő replikációt mind az attól független transzkripciót alkalmazzák (EP 329 822 számú európai közrebocsátási irat); vagy a ligálási sokszorozó reakciók (PCT közrebocsátási irat, száma: WO 89/09 835).
Korábban kifejlesztettünk egy kényelmes módszert a nukleotidok szekvenciájának meghatározására, amely jól adaptálható arra, hogy rutinszerű diagnosztikai módszer legyen (371 437 számú európai közrebocsátási irat, mely részét képezi a jelen találmányi leírásnak). Ebben az eljárásban alkalmazzuk a 202 583 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban ismertetett affinitás-alapú hibrid-megkötési módszerünket is. A vizsgálandó cél-DNS-t előnyösen szekvenálás előtt amplifikáljuk. Ebben a módszerben az amplifikációs
HU 211 058 Β reakcióban alkalmazott láncindító molekulák közül az egyik tartalmaz egy kapcsoló-egységet, például biotint, Az amplifikált fragmentet megkötjük egy szilárd hordozón, amelyhez streptavidint vagy avidint kapcsoltunk. A fölöslegben levő reagenst teljesen eltávolítjuk a hordozó mosásával. A befogott fragmenst egy szálúvá tesszük, és a lánc-terminációs reakciókat közvetlenül a hordozón hajtjuk végre. A lánc-terminációs reakció termékeit felszabadítjuk, és a nukleotid szekvenciát meghatározzuk poliakrilamid gélelektroforézis után. Ez a diagnosztikailag megfelelő szilárd fázisú szekvenálási módszer számos előnnyel rendelkezik a szakirodalomban korábban alkalmazott módszerekkel szemben a fentiekben leírt nukleotid variációk meghatározása során, de még mindig tartalmazza a munkaigényes, drága és szakértelmet igénylő szekvenáló gélelektroforézis lépést.
A jelen találmány szerint a feltételezett nukleotidvariációt tartalmazó cél-nukleinsav amplifikálását egyszerűen végrehajthatjuk oly módon, hogy módosított láncindító molekulával affinitási csoportot juttatunk be a kiválasztott nukleinsav szekvencia másolataiba. Egy ilyen amplifikációs során az amplifikációs láncindító molekulák közül az egyik, vagy mindkettő tartalmazhat rögzítő csoportokat. Annak megválasztásával, hogy melyik amplifikációs láncmolekula van módosítva, lehetséges annak meghatározása, hogy egy kétszálú DNS-nek melyik szálán mutatjuk ki a variábilis helyet. A kiválasztott szekvenciát előnyösen megfelelő számú ciklussal amplifikáljuk a polimeráz láncreakcióban.
Az eljárás eredményeképpen rögzítő csoportokkal módosított másolatait kapjuk az eredeti nukleinsav szekvenciának, a módosított láncindító molekuláknak a megszintetizált polinukleotid molekulákba történő beépítésével.
A „rögzítő egység” szakkifejezés alatt a továbbiakban bármely olyan komponenst értűnk, amely egy másik komponenshez affinitással rendelkezik, és egy affinitás-párt képez a másik komponenssel. Például a biotin - avidin/streptavidin; az antigének vagy haptének antitestek; a nehézfém származékok - tiocsoportok; különböző polinukleotidok, úgymint a homopolinukleotidok, például a poli dG - poli dC; poli dT - poli dA; és a poli dA - poli U ilyen affinitás-párok. Bármely olyan komponens-pár használható affinitás párként, amelyek erős affinitással rendelkeznek egymáshoz. Megfelelő affinitás-párok találhatók az immunológiai módszerekben alkalmazott ligandumok és konjugátumok között. Egy „rögzítő egység” egy affinitás-egység, vagy egy olyan csoport, amely helyet biztosít egy affinitás-csoport kapcsolódásához.
A „módosított amplifikációs láncindító molekula” olyan oligonukleotid láncindító molekulát jelent a továbbiakban, amelyet úgy módosítottak, hogy egy rögzítő csoportot tartalmazzon. Az oligonukleotid indító molekulákat megszintetizálhatjuk standard kémiai módszerekkel, vagy rekombináns DNS-technikával állíthatjuk elő. Az amplifikációs láncindító molekula lényeges tulajdonsága, hogy bázis-párosodás révén képes a kiválasztott, eredeti nukleinsav szekvenciához kötődni a szekvenciának egy olyan pontjánál, amely lehetővé teszi, hogy a vizsgálandó szekvencia-rész megsokszorozódjon. így az sokszorozási reakciónak komplementernek kell lennie a kiválasztott nukleinsav szekvencia azon régiójával, amely a kiválasztott nukleinsav szekvencia 3'-vége és a számunkra fontos hely között van. A sokszorozási indító molekula 3'-vége előnyösen azzal a résszel komplementer, amely kevesebb mint 100 nukleotid távolságra van a számunkra fontos helytől, mivel a polimeráz enzimnek korlátozott a processzivitása. A láncindító molekulák mérete előnyösen 14 és 40 bázispár között változik, de a 8 bázisnál rövidebb, vagy 40 bázisnál lényegesen hosszabb láncindító molekulák is használhatók. A láncindító molekulákat rögzítő egységek hozzákapcsolásával módosítjuk, kémiai, enzimológiai vagy egyéb módszerekkel. A rögzítő csoport előnyösen a láncindító molekula 5'végéhez kapcsolódik. Más rögzítési pontok is lehetségesek, azzal a feltétellel, hogy a láncindító molekula bázispár-képző tulajdonsága, valamint a meghosszabbító reakcióban való működőképessége megmarad.
b) A cél-nukleinsav molekulák elválasztása
Amplifikáció után a cél-nukleinsav másolatait elválasztjuk az amplifikációs reakció-elegyből. A találmány szerinti előnyös módszer szerint a rögzítő csoportokat tartalmazó cél-nukleinsav másolatokat szilárd hordozón rögzítjük egy kiegészítő rögzítő hely, például az affinitás-pár másik komponense segítségével. A hordozót ezután mossuk az összes nem rögzített anyag, például a nukleotid trifoszfátok és indító molekulák eltávolítása céljából, amelyek zavarnák kimutatási lépés reakcióit. A rögzített cél-nukleinsavat egyszálúvá tesszük, akár a rögzítő lépés előtt, akár a rögzítő lépés után. A módosított cél-nukleinsav másolatok rögzítése lehetővé teszi hogy újra használjuk a cél-szekvenciát, ha többszörös meghatározást kell elvégezni ugyanazon a kiválasztott szekvencián.
A „szilárd hordozó” szakkifejezés a továbbiakban bármely megjelenési formára vonatkozik, lehet például gyöngy, mikrorészecske, egy mikrotiter lemez vagy egy kémcső felszíne, egy mérőpálca, vagy egy szűrő. A hordozó anyaga lehet polisztirol, cellulóz, latex, nitrocellulóz, nylon, poliakrilamid, dextrán vagy agaróz. Az anyaggal szemben az egyetlen elvárás az, hogy rögzítési helyet lehessen kapcsolni hozzá.
c) A kimutatási lépés láncindító molekulája
Az amplifikációs reakcióelegyből való elválasztás után az egyszálú DNS-fragmenst hagyjuk hibridizálódni egy láncindító molekulával, a kimutatási lépés láncindító molekulájával, amely komplementer a variábilis nukleotid 3'-oldalán levő nukleotid szekvenciával. Ezt végrehajthatjuk rögzített állapotban, vagy oldatban is.
A „kimutatási lépés láncindító molekulája” szakkifejezés a továbbiakban egy olyan oligo- vagy polinukleotid láncindító molekulára vonatkozik, amely az iniciáció kiindulási pontjaként működik a láncindító molekulától függő hosszabbodási reakcióban. A kimutatási lépés láncindító molekuláját úgy választjuk meg,
HU 211 058 Β hogy hibridizálható legyen egy olyan nukleotid szekvenciához, amely közvetlen vagy közeli szomszédja a kimutatandó variábilis nukleotidnak. A kimutatási lépés láncindító molekuláját úgy választhatjuk meg, hogy komplementer legyen a kiválasztott kétszálú DNS kódoló vagy nem-kódoló szálával, attól függően, hogy melyik szálat immobilizáltuk a fentiekben leírt b) lépésben. A kimutatási lépés láncindító molekuláját módosíthatjuk, például az a) részben leírt affinitási csoporttal, de egy különböző affinitás-csoport felhasználásával. Előnyösen a kimutatási lépés láncindító molekuláját nem módosítjuk.
Kimutatási lépés láncindító molekuláinak megválasztását meghatározza a kimutatandó nukleotid-variációk természete.
A találmány szerinti módszer egy előnyös megvalósítási módja szerint a kimutatási lépés láncindító molekuláját úgy választjuk meg, hogy közvetlen szomszédja legyen a kimutatandó variábilis nukleotidnak.
A jelen találmány szerinti módszer egy másik megvalósítási módja szerint a kimutatási lépés láncindító molekuláját úgy határozzuk meg, hogy a kimutatandó variábilis nukleotidtól n nukleotid távolságban levő nukleotid szekvenciával hibridizálódjon. A variábilis nukleotid és a kimutatási lépés láncindító molekulája közötti nukleotidok n számára vonatkozó egyetlen korlátozás, hogy nem lehet benne a kimutatandó nukleotiddal azonos nukleotid.
A jelen találmány szerinti módszer másik megvalósítási módja szerint kettő vagy több variábilis nukleotidot azonosítunk. Ebben az esetben legalább két különböző láncindító molekulát kell megszintetizálni a kimutatási lépéshez.
A találmány szerinti eljárás kimutatandó nukleotid variációktól függő megvalósításait az alábbiakban részletesen ismertetjük.
d) A kimutatási lépés láncindító molekulájának meghosszabbítása
A kimutatási lépés láncindító molekuláját a célnukleinsav másolataival hibridizáltatjuk, majd egy olyan oldatot adunk hozzá, amely egy vagy több nukleozid-trifoszfátot tartalmaz, közöttük egy jelzett vagy módosított nukleozid-trifoszfátot is, egy polimerizáló ágenssel együtt, a láncindító molekula meghosszabbítását elősegítő körülmények között. Akár jelzett dezoxinukleotid-trifoszfátok (dNTP-k), akár lánc-terminációs didezoxinukleotid-trifoszfátok (ddNTP-k) alkalmazhatók. A polimerizációs ágens meghosszabbítja a láncindító molekulát a láncindító molekulával szomszédos variábilis nukleotiddal komplementer nukleozid-trifoszfáttal. A meghosszabbított nukleinsavat rögzíthetjük a kimutatási lépés láncindító molekulájának meghosszabbítása alatt, például egy módosított amplifikált másolat affinitás-kötésével, vagy rögzíthetjük később, például egy affinitás-módosított kimutató láncindító molekula útján. Bármelyik esetben az affinitás hordozó mosása után a beépült jelzést közvetlenül mérhetjük a hordozón vagy az eluálás után.
A „jelzett nukleozid-trifoszfát” szakkifejezés jelentése a továbbiakban bármely nukleozid-trifoszfát, dezoxi- vagy didezoxinukleozid-trifoszfát, kimutatható jelzéssel megjelölve, vagy módosítva oly módon, hogy tartalmazzon egy kapcsoló csoportot, amely képes megkötni egy kimutatható jelzést. A találmány szerinti módszer nem függ az alkalmazott jelzéstől, jóllehet az érzékenység változik a jelzés kimutathatóságától függően. A kimutatható jelzés megválasztásának egyetlen korlátja, hogy nem zavarhatja a jelzett nukleozid-trifoszfát beépülését a polimerizációs reakció során.
A „polimerizáló ágens” szakkifejezés jelentése a továbbiakban bármely olyan enzim, amely képes nukleinsavaknak láncindító molekula jelenlététől függő meghosszabbítására. A megfelelő enzimek közé tartozik például a T7-DNS-polimeráz, a T4-DNS-polimeráz, az Escherichia coli DNS-polimerázának Klenowfragmense és más alkalmas DNS-polimerázok, a reverz-transzkriptáz és a hőtűrő mikroorganizmusokból, például A Thermus aquaticus-ból és a Thermus thermophilus-ból izolált polimerázok.
e) Előnyös módszer nukleotid variációk kimutatására
Az 1. ábrán láthatjuk a találmány egy előnyös megvalósítási módjának sémáját. A cél-nukleinsavat X-ek jelölik, Xrgyel illetve X2-vel jelölve a vizsgált helyen a két alternatív nukleotid csoportot. Az 1. ábrán Y-okkal jelöljük a kimutatási lépés láncindító molekuláját, mely komplementer a cél-szekvenciának a vizsgált helytől közvetlenül a 3'-irányban található részletével. A találmány alkalmazása során a kimutatási lépés láncindító molekuláját hibridizáljuk a cél-szekvenciával, majd egy kiválasztott nukleozid-trifoszfátot vagy nukleozid-trifoszfátok elegyét adjuk hozzá, és egy lánchosszabbító reakciót hagyunk lejátszódni, a láncindító molekula meghosszabbítására alkalmas körülmények között.
A találmány legegyszerűbb megvalósítása során a nukleozid-trifoszfát elegy csak a jelzett didezoxinukleozid-trifoszfátot tartalmazza (ddNTP), amely vagy az Xp vagy az X2 nukleotidnak felel meg (1. ábra). Egy ddNTP beépülése leállítja a láncindító molekulát meghosszabbító reakciót, ezután lehetséges meghatározni a variábilis nukleotidot a hozzáadott nukleotid beépült jelzésének kimutatásával.
A találmánynak ez a megvalósítási módja különösen akkor előnyös, ha a kimutatandó nukleotid variáció egyetlen pontmutáciőból áll (X|-X2). A mintát két részre oszthatjuk, ezután Xj-et kimutatjuk az egyik mintából, X2-t kimutatjuk a másik mintából. Ez lehetővé teszi a heterozigóta minták azonosítását. Az is ugyanúgy lehetséges, hogy két vagy több különböző és különbözőképpen jelzett ddNTP-t adunk az osztatlan mintához (a b lehetőség az 1. ábrán). Ebben a megvalósítási módban lehetséges egynél több, ugyanazon a helyen előforduló pontmutáció meghatározása egyetlen osztatlan mintából (Xj-X,, X2. X3 vagy X4).
Az is lehetséges, hogy jelzett dezoxinukleozid trifoszfátot (dNTP) alkalmazzunk, amely megfelel a kimutatandó variábilis nukleotidnak, majd meghatároz6
HU 211 058 B zuk ennek a jelzésnek a beépülését. Ha jelzett dNTP-t használunk, akkor előnyös, de nem szükségszerű hogy jelzetlen ddNTP-t adjunk a reakcióelegyhez, amely a másik három nukleotidnak felel meg (c változat az 1. ábrán). A láncterminációs ddNTP-k hozzáadása a reakcióelegyhez megakadályozza, hogy a modifikációs lépésből megmaradó NTP-k beépüljenek (a).
Egy másik lehetőség két vagy több, különbözőképpen jelzett dNTP használata, ami lehetővé teszi a heterozigóták kimutatását egy osztatlan mintában. Ha egynél több jelzett dNTP-t használunk, akkor az eredményeket esetleg nehezen lehet értelmezni abban az esetben, ha a cél-szekvenciában a variábilis nukleotidot követő X nukleotid azonos bármelyik hozzáadottal (d változat az 1. ábrán).
A 2. ábra a találmány egy másik megvalósítási módját ábrázolja sematikusan. A 2. ábrán a kimutatási lépés indító molekulája komplementer a cél-nukleinsavon a variábilis nukleotidtól n nukleotid távolságig levő szekvenciával. Az egyetlen korlátozás a kimutatási lépés láncindító molekulája és a variábilis nukleotid közötti távolságot jelző n számra, hogy az n nukleotid között nem lehet a kimutatandóval azonos nukleotid csoport. Ebben az esetben a hozzáadott nukleozid-trifoszfátok tartalmaznak jelzetlen dNTP-ket, amelyek komplementerek a láncindító molekula és a variábilis nukleotid közötti n számú nukleotiddal, és legalább egy jelzett nukleozid-trifoszfátot, a kimutatandó nukleotid variációtól függően. Természetesen két vagy több jelzett dNTP használható amint azt a korábbiakban leírtuk, az 1 b és d ábrán illusztrált módon.
A 3. ábrán a találmány szerinti eljárásnak egy újabb megvalósítási módja látható, ahol két vagy több variábilis nukleotidot azonosítunk. Ebben az esetben legalább két különböző kimutatási lépésben szereplő láncindító molekulát kell szintetizálni. Az első láncindító molekulát úgy választjuk meg, hogy komplementer legyen az első variábilis nukleotid csoport közvetlen szomszédságában levő nukleotid szekvenciával (az 1es láncindító molekula a 3. ábrán). Ezenkívül egy vagy két kimutatási láncindító molekulát alkalmazunk, amelyek szintén átfogják az első láncindító molekula által kimutatott első variábilis nukleotidot. A vizsgálatot úgy hajtjuk végre, hogy a mintát kettéosztjuk, ezután az 1 -es láncindító molekulát hozzáadjuk az első mintához, ezzel azonosítjuk az első variábilis nukleotid csoportot. A két másik láncindító molekulát (2-es és 3-as a 3. ábrán) hozzáadjuk a a 2. mintához, így mutatjuk ki a második variábilis nukleotidot. A cél-nukleinsav rögzítése következtében két vagy több további variábilis nukleotidot is azonosítani lehet egyetlen osztatlan mintáról, az említett kimutatási lépéseket egymás után végrehajtva, és beiktatva egy mosási lépést az első variábilis nukleotid kimutatása után, hogy eltávolítsuk az 1-es láncindító molekulát.
A találmány szerinti eljárás végrehajtásához szükséges reagensek beszerezhetők külön-külön, vagy reagenskészlet formába csomagoltan. Olyan reagenskészletek állíthatók elő például, amelyek egy vagy több kimutatási lépésben használt láncindító molekulát és egy vagy több jelzett nukleozid-trifoszfátot tartalmaznak, emellett előnyösen tartalmazzák még egy vagy több affinitás-jelzett amplifikációs láncindító molekula és a megfelelő hordozó(k) kombinációit.
A reagensek elrendezése a reagenskészlet hordozó dobozában a használt specifikus reagensektől függ. Mindegyik reagens csomagolható egyedi tartóba, de különböző kombinációk is lehetségesek.
A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű példákkal kívánjuk részletesebben ismertetni.
7. példa
Az apolipoprotein-E-gén polimorfizmusának azonosítása a 112-es és 158-as aminosavak kodonjaiban, [35]S-t használva jelzésként
Az oligonukleotidok szintézise
Négy PCR láncindító molekulát (P1-P4) és két, a kimutatási lépésben használt oligonukleotid láncindító molekulát (Dl és D2) szintetizálunk Applied Biosystems 381 DNS-szintetizáló berendezéssel. Az oligonukleotidok nukleotid-szekvenciája, valamint elhelyezkedésük (nukleotid sorszámban megadva) az apolipoprotein-E génen (Apó E) a következő:
Pl: 5'-AAG GAG TTG AAG GCC TAC AAA T
(3616-3637) P3: 5'-GAA CAA CTG AGC CCG GTG GCG G
(3649-3670) Dl: 5'-GCG CGG ACA TGG AGG ACG TG
(3725-3744) D2: 5'-ATG CCG ATG ACC TGC AGA AG
(3863-3882) P2: 5'-TCG CGG GCC CCG GCC TGG TAC A
(3914-3893) P4 : 5'-GGA TGG CGC TGA GGC CGC GCT C
(3943-3922)
A P2 láncindító molekulához egy 5' amino csoportot adunk hozzá az aminolink II reagenssel (Applied Biosystems). Az amino csoportot biotinilezzük szulfoNHS-biotin felhasználásával (Piece Chemical Co.), majd fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk.
A DNS-minták
Vénás vérmintákat veszünk olyan betegektől, akikről ismert, hogy Apo-E-fenotípussal rendelkeznek, és a University Central Hospital of Helsinki, Finnország, Lipid Outpatient Clinic rendelésére járnak. Leukocita DNS-t az ismert módszerekkel vonunk ki a mintából.
Polimeráz láncreakció - amplifikáció
A DNS-t (100 ng per minta) a Pl és P4 láncindító molekulák segítségével amplifikáljuk (a végső koncentráció 1 mól) 100 μΐ következő összetételű oldatban: 0,2-0,2 mmól dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 20 mmól TRIS-HC1 pH = 8,8, 15 mmól (NH4)2SO4 1,5 mmól MgCl2, 0,1% Tween 20, 0,1 mg/ml zselatin és 2,5 egység Thermus aquaticus DNS-polimeráz (United States Biochemical Corp.), DNS hőciklus berendezést (PCR berendezés, Perkin-Elmer/Cetus) alkalmazva, 25 ciklust végzünk, 1 percig 96 °C-on tartjuk a mintát, majd
HU 211 058 Β két percig 65 ’C-on. Az első PCR amplifikációs elegyből egy alikvot részt (3 μΐ 1:100 hígítású oldat) átviszünk egy második PCR-folyamatba. Ezt is az előzőkben ismertetett körülmények között hajtjuk végre, és a biotinilezett P2-láncindító molekulát, valamint a P3láncindító molekulát használjuk.
A biotinilezett amplifikált Apo-E DNS affinitás-befogása avidinnel borított polisztirol részecskéken Avidinnel borított polisztirol részecskék 5%-os szuszpenziójából (0,8 pm, Baxter Healthcare Corp.) öt μΙ-t adunk a második amplifikációs lépés reakcióelegyébe. A mintákat 30 percig 20 °C-on tartjuk. A részecskéket centrifugálással nyerjük ki (2 perc egy Eppendorf centrifugában), majd egyszer mossuk 1 ml 15 mmól NaCl, 1,5 mmól Na-citrát (O.lxSSC), 0,2% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) összetételű oldatban, majd egyszer 1 ml 0,1% Tween 20, 15 mól NaCl, 20 mmól foszfát puffer pH = 7,5 (PBS) összetételű oldatban. A részecskéket kétszer kezeljük 200 μΐ 0.15 mól NaOH-val 5 percig 20 ’C-on. A részecskéket ezután egyszer mossuk 1 ml 0,1% Tween 20, 50 mmól NaCl, 40 mmól TRIS-HC1 pH = 7,5 összetételű oldattal, majd kétszer mossuk 1 ml 0,01% Tween 20, 50 mmól NaCl, 40 mmól TRIS-HC1 pH = 7,5 összetételű oldattal. Az utolsó mosási lépésben a részecskeszuszpenziót négy részre osztjuk, majd a részecskéket centrifugálással ülepítjük külön csövekben.
A variábilis nukleotidok azonosítása A DNS-fragmentet hordozó részecskéket 10 μΐ mmól NaCl, 20 mmól MgCl2, 40 mmól TRIS-HC1 pH = 7,5 összetételű oldatban szuszpendáljuk, amely 2 pmólt tartalmaz a kimutatási lépés láncindító molekulájából. A 3745-ös számú variábilis nukleotid (112-es kodon. T vagy C) közvetlen szomszédságában levő Dl oligonukleotidot adjuk az előző csövek közül kettőhöz, majd a 3883-as számú variábilis nukleotid (158-as ko10 don, T vagy C) közvetlen szomszédságában levő D2oligonukleotidot adjuk a másik két csőhöz. Az oligonukleotidokat hagyjuk hibridizálódni a DNS-templáttal oly módon, hogy a mintákat 2 percre 65 °C-ra melegítjük, majd hagyjuk őket lehűlni 20 ’C-ra. Egy μΐ 0,1 mólos ditiotreitol és [35S]-jelzett dezoxinukleozidtrifoszfátok (dNTP), valamint didezoxinukleozid-trifoszfátok (ddNTP) oldatát adjuk a szuszpenzióhoz, így kapunk mindegyikből 1 mólos koncentrációt 15 μΐ végtérfogatban, az alábbiak szerint:
- a T: [35S]-d TTP (Amersham) azonosításához ddCTP-t és ddGTP-t adunk két csőhöz, melyek közül az egyikben a Dl oligonukleotid, a másikban a D2-oIigonukleotid hibridizálódott a részecskéken levő DNS-fragmenttel;
- a C: [35S)-dCTP (Amersham) azonosításához ddTTP-t és ddGTP-t adunk két csőhöz, amelyek közül az egyikben a Dl oligonukleotid, a másikban a D2-oligonukleotid hibridizálódott a részecskéken levő DNS-fragmenttel.
Két μΐ T7-DNS-polimerázt (Sequenase, United States Biochemical Corp.) adunk minden egyes csőhöz, majd a reakciót 6 percig hagyjuk folyni 42 ’Con. A mikrorészecskéket 20 ’C-on mossuk kétszer vortexelve 1 ml 0,lxSSC, 0,2% SDS összetételű oldattal, majd kétszer 0,1% Tween PBS-es oldatával. A reakció-termékek leoldása céljából a részecskéket 200 μΐ vízben forraljuk 5 percig, jégbehűtjük, majd 2 percig Eppendorf centrifugában centrifugáljuk. A leoldott radioaktivitást folyadék szcintillációs számlálóval mérjük. Egy kísérletnek az eredményeit, melyben az E2/E2 fenotípus (T/T a 112-es, T/T a 158-as kodonban), az E4/E3 fenotípus (T/C a 112-es, C/C a 158-as kodonban), az 82/E3 fenotípus (T/T a 112-es, T/C a 158-as kodonban), és az E4/E4 fenotípus (C/C a 112-es kodonban, C/C a 158-as kodonban) eredményeit vizsgáltuk a fentiek szerint, adjuk meg az alábbi táblázatban:
Minta sorsz. Fenotípus Detektor (kodon) Eluált radioaktivitás (cpm) Eredmény
T-reakció C-re akció
1. E2/E2 Dl (112) 18 400 625 T/T
2. E4/E3 Dl (112) 73 700 58 100 T/C
3. E2/E3 Dl (112) 1 120 1 360 T/T
4. E4/E4 Dl (112) 2 310 99 700 T/T
5. nincs DNS Dl (112) 429 1 195
1. E2/E2 D2 (158) 67 000 7 000 T/T
2. E4/E3 D2 (158) 3 220 35 100 C/C
3. E2/E3 D2 (158) 44 600 26 400 T/C
4. E4/E4 D2(158) 1 485 19 300 C/C
5. _ nincs DNS D2 (158) 686 760
HU 211 058 B
Következtetések
A T- és C-reakciókban kapott cpm-értékek különbségei lehetővé tették a variábilis nukleotid azonosítását mind a 112-es, mind a 158-as kodonban, az összes DNS-mintában.
A variábilis nukleotidokat adott esetben meghatározhatjuk a fentiek szerint, azzal a különbséggel, hogy a második PCR-reakciót biotinilezett P3- és P2-láncindító molekulákkal végezzük. A kimutatási lépés láncindító molekuláiként olyan molekulákat használunk ezután, amelyek komplementerek az Apó E-gén ellentétes láncával:
D4: 5'-GTA CTG CAC CAG GCG GCC GC (3765-3746)
D5: 5'-GGC CTG GTA CAC TGC CAG GC (3903-3884)
2. példa
A variábilis nukleotid azonosítása az apolipoprotein-E-gén 112-es kodonjában, kettős jelölést [3H] és [32P] alkalmazva egy reakcióban
Oligonukleotidok és DNS minták
Ebben a példában az 1. példában leírt PCR-P1láncindító molekulát, valamint a biotinilezett P2-, P3-, P4-láncindító molekulákat és a Dl kimutatási lépésben szereplő láncindító molekulát alkalmazzuk. A DNS-t az 1. példa szerint vonjuk ki a vérmintákból.
Polimeráz láncreakció - amplifikálás és affinitás befogás
A PCR-es amplifikálást és az amplifikált fragmentek affinitás befogását az 1. példában leírtak szerint végezzük. Az utolsó mosási lépésben mindegyik mintát két alikvot-részre osztjuk.
A variábilis nukleotid azonosítása a 112-es kodonban
A részecskéket 10 μΐ pufferben szuszpendáljuk (lásd az 1. példát), amely 2 pmólt tartalmaz a Dl kimutatási lépés láncindító molekulából, amely közvetlenül 3'-irányban hibridizál a 112-es kodonban levő variábilis nukleotiddal. A hibridizációs reakciót az 1. példában leírtak szerint hajtjuk végre. Egy μΐ 0,1 mólos ditiotreitolt adunk hozzá.
A variábilis nukleotid (C vagy T) azonosítását úgy végezzük, hogy [3H]- és [32P]-jelzett dNTP-ket adunk egyszerre egy mintához. Használhatunk [3H]dCTP-t és [32P]-dTTP-t, vagy [3H] -dTTP-t és [32P]dCTP-t (Amersham). A [3H] -dNTP-ket 1 mól koncentrációban alkalmazzuk. A [32P]-dNTP-ket jelzetlen dNTP-vel hígítjuk, így kapunk 1 mólos végkoncentrációt, és a [3H]-d NTP-khez hasonló specifikus aktivitást.
Mindegyik reakcióelegy 1 μπιόΐ ddGTP-t tartalmaz. A végtérfogat 15 μΐ. Három egység T7-DNS-polimerázt adunk az elegyhez, majd a jelzési és mosási eljárást az 1. példában leírt módon hajtjuk végre. A lemosott [3H] és [32] radioaktivitást minden mintánál megmérjük, Rackbeta 1219 szcintillációs számlálóval (Pharmacia/Wallac), az ablakot [3H)-ra állítva a 10-90es csatornákon, és a 130-220-as csatornákon az ablakot [32P]-re állítjuk.
Az alábbi példa egy kísérlet eredményeit mutatja, amelyben három mintát, az egyik E2/E3 fenotípusú (T/T a 112-es kodonban), a másik E4/E4 fenotípusú (C/C a 112-es kodonban), a harmadik E3/E4 fenotípusú (T/C a 112-es kodonban), analizálunk vagy [3H]dCTP-t és [32p]-dTTP-t vagy [3H]-dTTP-t és [32P]dCTP-t alkalmazva.
Minta Jelzett dNTP-k A leoldott radioaktivitás (cpm)
3H; 10-90cs. 32P; 130-220 cs.
E2/E3 [3H]dCTP/[32P]dTTP 502 7870
E4/E4 [3H]dCTP/[32P]dTTP 6070 186
E3/E4 [3H]dCTP/[32P]dTTP 5120 5980
nincs [3H]dCTP/[32P]dTTP 172 148
DNS
E2/E3 [3H]dTTP/[32P]dCTP 10 800 183
E4/E4 [3H]dTTP/[32P]dCTP 394 4932
E3/E4 [3H]dTTP/[32P]dCTP 7800 5140
nincs [3H]dTTP/[32P]dCTP 175 44
DNS
Következtetések
A kapott eredmények lehetővé teszik a variábilis nukleotidok azonosítását a 112-es kodonban osztatlan mintákból, két, különböző jelzést hordozó dNTP-t alkalmazva. Ebben a példában reakciónként csak a minta felét elemeztük. így a minták másik felét felhasználhatjuk az Apo-E-gén 158-as kodonjában levő nukleotid variációk elemzésére.
3. példa
A variábilis nukleotid azonosítása az apolipoprote55 in-E-gén 158-as kodonjában, egyetlen polimeráz láncreakció végrehajtása után.
Oligonukleotidok és DNS-minták
Ebben a példában a biotinilezett P2- és P3-láncindí60 tó molekulákat alkalmazzuk a PCR-reakcióban. A ki9
HU 211 058 B mutatási lépésben használt láncindító molekula a D2 (lásd az 1. példát). A DNS-t az 1. példában leírt módon vonjuk ki vénás vérből
Polimeráz láncreakció - amplifikálás és affinitás befogás
A DNS-t (100 ng/minta) a biotinilezett P2- és P3láncindító molekulával amplifikáljuk (végkoncentráció 1 pmól) az 1. példában leírt körülmények között, a következő eltéréssel: Csak egyetlen amplifikációs lépést hajtunk végre, amely 30 ciklusból áll (1 perc 96 ’C-on, 1 perc 55 °C-on és 1 perc 72 °C-on).
Az affinitás befogást avidinnel borított polisztirol részecskéken az 1. példában leírt módon végezzük. Az utolsó mosási lépésben mindegyik mintát kettéosztjuk.
A variábilis nukleotid azonosítása a 158-as kódoltban
A részecskéket 10 μ] pufferben szuszpendáljuk (lásd az 1. példát), amely 2 pmólt tartalmaz a D2 kimutatási lépés láncindító molekulából, amely közvetlenül 3'-irányban hibridizál a 158-es kodonban levő variábilis nukleotiddal. A hibridizációs reakciót az 1. példában leírtak szerint hajtjuk végre. Egy μΙ 0,1 mólos ditiotreitolt adunk hozzá. [35S]-sel jelzett dNTP-ket és ddNTP-ket adunk a T- és C-reakciókhoz, az 1. példában leírtak szerint. A láncindító molekula meghoszszabbítási reakciót, a mosást és a megkötött radioaktivitást az 1. példában leírt módon hajtjuk végre.
Három mintát vizsgálunk, az E2/E2 fenotípusút (T/T a 158-as kodonban), az E2/E3 fenotípusút (T/C a 158-as kodonban), és az E4/E3 fenotípusút (C/C a 158-as kodonban). Ennek a kísérletnek az eredményei az alábbi táblázatban láthatók:
Minta A leoldott radioaktivitás (cpm) Eredmény
T-reakció C-reakció
E2/E2 64 600 7746 T/T
E2/E3 39 600 22 700 T/C
E4/E3 5 640 53 500 C/C
nincs DNS 1 325 1 910
Következtetés
Az eljárás lehetővé teszi a variábilis nukleotidok azonosítását a 158-as pozícióban akkor is, ha az apo-EDNS ffagmens egyetlen PCR-reakcióban amplifikáljuk, egy láncindító molekulapárral.
4. példa
A variábilis nukleotid azonosítása az apolipoprotein-E-gén 112-es nukleotidjában, enzimatikus emésztés alapján
Oligonukleotidok és DNS-minták
Az első példában leírt Pl-, valamint biotinilezett P2-, P3- és P4-láncindító molekulákat, valamint a Dl, kimutatási lépésben alkalmazott láncindító molekulát használjuk.
Polimeráz láncreakció - amplifikáció
ADNS-t (100 ng per minta) a Pl - és P4-láncindító molekulákkal sokszorozzuk, 1 %mól koncentrációban, az 1. példában leírtak szerint. Ennek az első PCRelegynek 1:100 hígításából három mikrolitert újra amplifikálunk a biotinilezett P2- és P3-láncindító molekulákat alkalmazva 0,1 pmól koncentrációban. A második PCR reakciót 30 ciklusban hajtjuk végre (1 perc 96 °C-on, 1 perc 55 °C-on és 1 perc 72 ’C-on).
Az ampliftkált DNS affinitás-befogása avidinnel borított mikrotiter mérőhelyekben A második PCR-reakcióelegyből mintánként két μΐ-es alikvot részt viszünk át mikrotiter lemezek mérőhelyeibe (Nunc, Maxisorb), amelyeket előzőleg paszszív adszorpció útján streptavidinnel borítottunk. 30 μΐ 0,1%-os Treen 20,0,15 pmól NaCl, 0,1 pmól TRIS-HC1 pH = 7,5 (TBS) összetételű oldatot adunk minden egyes mérőhelybe. A mikrotiter lemezeket 3 órán át 37 C-on inkubáljuk, óvatos rázás közben. A mérőhelyeket háromszor mossuk 200 pl 0,1%-os Tween 20 TBS-ben készült oldatával, 20 ’C-on. A mérőhelyeket ezután kétszer öt percig kezeljük 100 pl 50 mmól NaOH-val 20 °C-on, majd kétszer mossuk 200 pl OJxSSC, 0,2% SDS összetételű oldattal, majd ismét kétszer mossuk 0,1% Tween 20 TBS-ben készült oldatával egyszer mossuk 0,1 Tween 20, 50 mmól NaCl, 40 mmól TRIS-HC1 pH = 7,5 összetételű oldattal, és végül egyszer mossuk 0,01 % Tween 20 50 mmól NaCl. 40 mmól TRIS-HC1 pH = 7,5 összetételű oldattal.
A variábilis nukleotid kimutatása A Dl-nukleotidból 10 pikomólt adunk mindegyik mérőhelybe 50 μ], 0.9 mól NaCl, 0,2 mól TRIS-HC1 pH = 7,5 összetételű oldatban. A mérőhelyeket 2 percig 65 °C-on tartjuk, majd lassan hagyjuk 20 °C-ra hűlni. Az elegyeket elöntjük, majd a mérőhelyeket egyszer mossuk 200 pl 0,25 mól NaCl, 0,2 mól TRIS-HC1 pH = 7,5 összetételű oldattal. Ezután 50 pl következő összetételű oldatot adunk hozzá: 1 mól digoxigenin-11-UTP (Boehringer-Mannheim), 1 mól ddCTP, 1 mól ddGTP, 0,2 mól Dl-oligonukleotid, 6 mmól TRIS-HC1 pH = 7,5 és 3 egység T7-polimeráz. A mikrotiter lemezeket 10 percig 42 ’C-on inkubáljuk, majd a lemezeket kétszer mossuk 200 pl O.lxSSC, 0,2% SDS összetételű oldattal, majd háromszor mossuk 200 μ] 0,1 % Tween 20 TBS-ben készült oldatával. Ezután egy anti-digoxigenin-alkalikus-foszfatáz konjugátum (Boehringer-Mannheim) 0,1% Tween 20, 1% szarvasmarha szérum albumin TBS-ben készült oldatával kapott 1:500 arányú hígítását adjuk hozzá, és a mikrotiter lemezeket 37 ’C-on inkubáljuk 2 órán át enyhe rázatás közben. A mérőhelyeket hatszor mossuk 0.1% Tween 20 TBS-ben készült oldatával, majd egyszer mossuk 1 mól dietanol-amin, 0,5 mól MgC!2 pH = 10 összetételű pufferrel. Végül 60 pl 2 mg/ml koncentrációjú pnitrofenil-foszfátot adunk hozzá lúgos pufferben. A színt hagyjuk szobahőmérsékleten kifejlődni 20 percig, majd 100 pl alkalikus puffért adunk hozzá és a keletkezett termék abszorbanciáját spektrofotometriásán mérjük 405 nm-en.
HU 211 058 Β
Egy E2/E2 fenotípusú (T/T a 112-es kodonban) és egy E4/E4 fenotípusú (C/C a 112-es kodonban) mintát vizsgálunk. Ennek a kísérletnek az eredményei az alábbi táblázatban találhatók:
Minta Abszorpció 405 nm-en (két párhuzamos minta) Eredmény
E2/E2 1,180 0,707 T/T
E4/E4 0,040 0,010 C/C
Nincs DNS 0,025 0,010
Következtetések
A 112-es kodonban levő variábilis nukleotidot azonosítottuk digoxigenin-11-d UTP beépülésével, majd ezt követően egy alkalikus foszfatázzal jelzett antitesttel végzett kimutatással.
5. példa
Az apolipoprotein E polimorfizmus kimutatása a 112-es aminosavat kódoló kodonban fluoreszcens jelzések alkalmazásával
Oligonukletotidok és DNS minták
Az első példában leírt Pl; valamint biotinilezett P2-, P3- és P4-láncindító molekulákat, valamint a Dl, kimutatási lépésben alkalmazott láncindító molekulát használjuk. A DNS-t az 1. példában leírt módon vonjuk ki a vérmintákból.
Polimeráz láncreakció - amplifikálás és affinitásbefogás
A DNS-t (100 ng per minta) 1 pmól koncentrációjú Pl - és P4-láncindító molekulákkal amplifikáljuk az 1. példában leírtak szerint. Ennek az első PCR-elegynek 1:100 arányú hígításából három μΐ-t újra amplifikálunk 1-1 pmól biotinilezett P2- és P3-láncindító molekulákkal. A második PCR-reakciót 25 ciklusban végezzük (1 perc 96 °C-on, 1 perc 55 ’C-on és 1 perc 72 ’C-on). A biotinilezett amplifikált DNS fragmenteket az 1. példa szerint avidinnel borított polisztirol részecskékre kötjük ki. Az utolsó mosási lépésben mindegyik mintát két részre osztjuk.
A variábilis nukleotid azonosítása a 112-es kodonban
Az amplifikált DNS-t hordozó részecskéket 5 pmól, a 112-es kodon variábilis nukleotidja 3' irányban levő közvetlen szomszéd szekvenciával hibridizálódó, a kimutatási lépésben szereplő láncindító molekulát tartalmazó 10 μΐ pufferben szuszpendáljuk (lásd
1. példa). A hibridizációs reakciót az 1. példában leírt módon hajtjuk végre. Minden egyes csőhöz egy ml 0,1 mólos ditiotreitol oldatot adunk. A T-nukleotid azonosítása céljából 400 pmól fluoreszcens ddTTP-t (Tterminátor; DuPont, NEK-528T) adunk az egyik csőhöz. A C-nukleotid azonosítása céljából 40 pmól fluoreszcens ddCTP-t (C-terminátor; Du Pont, NEK-519C) adunk a másik csőhöz. Öt egység T7-DNS-polimerázt adunk mindkét csőhöz 15 μΐ végsó reakciótérfogatban. A reakciót 5 percig hagyjuk lejátszódni 37 ’C-on. A részecskéket az 1. példában leírt módon mossuk, majd a reakciótermékeket eluáljuk. Az eluátum fluoreszcenciáját egy fluoreszcencia spektrofotométerben mérjük (Merck/Hitachi, F-1000), 490 nm-t használva gerjesztő hullámhosszként és 550 nm-t használva a kibocsátott fluoreszcencia mérésére.
Az eredmények magyarázata
A csak a T-reakciőból százrmazó pozitív jel azt mutatja, hogy az alany a 112-es helyen található ciszteinre nézve homozigóta.
A csak a C-reakcióból származó pozitív jel azt mutatja, hogy az alany a 112-es helyen található argininre nézve homozigóta.
A mindkét reakcióból kapott pozitív jel azt mutatja, hogy az alany heterozigóta, azaz van egy olyan allélje, amely cisztein csoportot tartalmaz, és van egy allélje, amely arginin csoportot tartalmaz az apolipoprotein gén 112-es pozíciójában
6. példa
A sarlósejtes anémia mutációjának kimutatása a humán β-globin gén 6-os kodonjában
Az oligonukleotidok szintézise
APCR-indító molekulákat úgy tervezzük meg, hogy az egyébként erősen homológ β-globin génnel nem pontosan illeszkedő 3'-véggel rendelkezzenek. Két PCR-indító molekulát, az egyik jele Bl, a másik jele B2, és egy a kimutatási reakcióban használt láncindító molekulát (jele B3) szintetizálunk az 1. példában leírt módon. A B2 láncindító molekulát az 1. példában leírt módon biotinilezzük. Az oligonukleotidok nukleotid-szekvenciáját, valamint elhelyezkedésüket a β-globin génen (a transzkripciós iniciációs jelhez viszonyított nukleotid számozás) az alábbiakban mutatjuk be:
Β1: 5'-CAT TTG CTT CTG ACA CAA CT (-49 —30) B3: 5'-CAT GGT GCA CCT GAC TCC TG (-1 - 19) B2: 5'-CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC (73 - 54)
Polimeráz láncreakció - amplifikáció és affinitásbefogás
A DNS-t az 1. példában leírt módon vonjuk ki a vérmintákból. A DNS-t (100 ng per minta) a Bl-láncindító molekulával, és a biotinilezett B2-láncindító molekulával amplifikáljuk a 3. példában leírtak szerint. A biotinilezett, amplifikált DNS-fragmenteket az 1. példa szerint polisztirollal borított részecskékre rögzítjük. Mindegyik rögzített mintát két részre osztjuk.
Az A - T mutáció azonosítása a 6-os kodonban
Az amplifikált DNS mintát hordozó részecskéket 10 μΐ pufferben szuszpendáljuk (lásd 1. példa), amely a 6-os kodon mutációs helyétől 3'-irányban közvetlen szomszédságban levő szekvenciával hibridizál. A hibridizációs reakciót az 1. példában leírtak szerint hajtjuk végre. Egy μΐ 0,1 mól ditiotreitolt adunk a rendszerhez. [35S]-jelzett dNTP-ket és ddNTP-ket adunk a rend11
HU 211 058 Β szerhez, így 15 μΐ végtérfogatban 0,2 mól végkoncentrációt kapunk az alábbiak szerint:
- A normál alléi (A) kimutatására: [35S]-dATP.ddTTP, ddGTP az egyik csőben;
- a mutáció kimutatására (T):
[35S]-dTTP, ddATP, ddGTP a másik csőben.
Egy egység T7-polimerázt adunk a reakcióelegyhez, majd a reakciót 5 percig hagyjuk lejátszódni 37 ’C-on, A részecskéket mossuk, a reakciótermékeket eluáljuk, és az eluált radioaktivitást szcintillációs számlálóval mérjük, az 1. példában leírtak szerint.
Az eredmény magyarázata
A csak az A-reakcióból származó pozitív jel azt mutatja, hogy az alany normális homozigóta.
A csak a T-reakcióból származó pozitív jel azt mutatja, hogy az alany homozigóta a sarlósejtes anémiára vonatkozóan.
Ha mindkét reakcióban pozitív jelet kapunk, akkor ez annak a jele, hogy az alany az egyik alléiban hordozza a sarlósejtes anémia mutációját, azaz heterozigóta.
A variábilis nukleotidokat adott esetben a fentiek szerint meg lehet határozni, de úgy is, hogy a PCR-reakciót biotinilezett Bl- és B2-láncindító molekulával végezzük. A kimutatási lépés indító molekulájaként ebben az esetben a β-globin-gén nem-kódoló szálával komplementer láncindító molekulát alkalmazunk:
B4: 5'-CAG TAA CGG CAG GCG GCC GC (40-21)
7. példa
A F5O8 deléció kimutatása a cisztás fibrózisban
Oligonukleotid láncindító molekukák szintézise
Két amplifikációs láncindító molekulát (CF1 és CF3) és egy kimutatási lépésben használt láncindító molekulát szintetizálunk az 1. példában leírtak szerint. A láncindító molekulákat a CF-gén ismert nukleotid szekvenciája alapján terveztük [Riordan et al., Science, 245, 1066-1072(1989)].
A láncindító molekulák szerkezete és a CF génen elfoglalt helyzete a következő:
CF1: 5'-CTG CAG CCT TCA GAG GGT AAA AT-3' (1555-1577)
CF2: 5-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT -3' (1629-1652)
CF3: 5'-CAT GCT TTA ATG ACG CTT CTA TA-3' (1703-1681)
A CF3-láncindító molekulát az 1. példában léírt módon biotinilezzük.
A DNS-minták
A cél-DNS-t cisztás fibrózisban szenvedő olyan finn betegek leukocita sejtjeiből vontuk ki, akiket klinikailag, standard módszerek alkalmazásával F508 mutáció hordozóiként jellemeztek.
A cél-DNS PCR-es amplifikálása és affinitás-befogadása
ADNS-t (100-200 ng per minta) a biotinilezett CF3- és CF1-láncindító molekulákkal amplifikáljuk (végkoncentráció 0,15 mól illetve 0,6 mól), az 1. példában leírt körülmények között, a következő különbséggel: Csak egy sokszorozó lépést végzünk (31 ciklus, 1 perc 96 ’C-on, 1 perc 60 ’C-on és 1 perc 72 ’C-on). Az affinitás-befogást streptavidinnel borított mikrotiter lemezeken végezzük, a 4. példában leírtak szerint.
A variábilis nukleotid azonosítása
A kimutatási lépésben a láncindító molekula meghosszabbítását a leírás szerint végezzük, 50 μΐ 50 mmól TRIS-HC1 pH = 8,8, 1,5 mmól MgCl2, 15 mmól (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20, 0,01% zselatin összetételű oldatban, amely 0,1 μπιόΗ tartalmaz a CF2indító molekulából és 2 egység Tag-DNS-polimerázt. A T nukleotid azonosítása céljából 1 pCi 3H-dTTP-t és 0,8 pmól ddGTP-ι, majd a C nukleotid azonosítása céljából 2 pCi ’H-dCTP-t és 0,8 μπιόΐ ddTTP-t adunk két-két párhuzamos mérőhelybe, majd a lemezeket 10 percig 55 ’C-on inkubáljuk. A lemezeket háromszor mossuk 200 μΙ 0.1 %-os Tween 20 TBS pufferben készült oldatával, majd a beépült jelölést 60 μΐ 50 mmólos NaOH-val 5 percig kezelve távolítjuk el szobahőmérsékleten, majd folyadék szcintillációs számlálóval mérjük.
Három, a CTTR gén 1653-as nukleotidjában C/C, T/T és T/C genotípussal rendelkező mintát, azaz egy normál homozigótát, egy AF508 homozigótát és egy heterozigótát használunk ebben a kísérletben. Ezeknek a mintáknak a genotípusát már korábban meghatározták más módszerekkel [Kere et al., Hűm. Génét., 85, 413-415 (1990)]. Az alábbi táblázatban szereplő eredmények azt mutatják, hogy az egyes genotípusokat tisztán azonosítani lehet.
Minta 3H-dTTP (cpm) 3-dCTP cpm cpmC/cpm T Genotí- pus*
Normál homozigóta 349 9832 28,2 C/C
AF508 homozigóta 11 539 52 0,005 T/T
Heterozi- góta 11 358 7457 0,66 T/C
* A CFTR gén 1653-as nukleotidja
Következtetések
A minták genotípusát a cpmC/cpmT arányok alapján határoztuk meg a 3H-dTTPés a 3H-dCTP beépülése után.
8. példa
Pontmutációk kimutatása a K-ras gén 12-es kodonjában
Az oligonukleotidok szintézise
Két PCR-láncindító molekulát szintetizálunk (RÍ, illetve R2), majd az RÍ-láncindító molekulát az 1. példában leírtak szerint biotinilezzük. A 12-es glicin csoportot kódoló kodon (GGT) mutációjának kimuta12
HU 211 058 B tásához két, a kimutatási lépésben használt láncindító molekulát szintetizálunk (R3 illetve R4). Az R3 molekulát használjuk az elmutált G-nukleotid kimutatására a 12-es kodon második pozíciójában, majd az R4-molekulát használjuk az elmutált G-nukleotid kimutatására a 12-es kodon első pozíciójában. A K-ras-gén első exonjának megfelel8 oligonukleotidok szekvenciáját és pozícióját (nukleotidok sorszámában) az alábbiakban adjuk meg:
R1: 5'-ATG ACT GAA TAT AAA CTT GTG (1-20) R2: 5-TTC GTC CAC AAA ATG ATT CTG (94-74) R3: 5-AAG GCA CTC TTG CCT ACG CCA (56-36) R4:5-AGG CAC TCT TGC CTA CGC CAC (55-35)
Polimeráz láncreakció - amplifikáció affinitás befogás és a kimutatási lépés indító molekuláinak hibridinációa
A DNS-t rákos sejtekből vonjuk ki standard módszerekkel, proteináz-K-val végzett emésztést, fenolos extrakciót és alkoholos kicsapást alkalmazva. A tisztított DNS-ből 100 ng-ot a biotinilezett RÍ-láncindító molekulával, valamint az R2-láncindító molekulával amplifikáljuk, a 3. példában leírt körülményeket alkalmazva, azzal a különbséggel, hogy a láncindító molekula hibridizációs hőmérséklete 50 °C. Az amplifikált DNS-t avidinnel borított polisztirol részecskéken rögzítjük, denaturáljuk, majd a részecskéket az 1. példában leírt módon mossuk. A rögzített DNS mintákat két csőbe osztjuk szét. Az egyik csőben levő részecskéket 10 μΐ pufferben szuszpendáljuk (lásd 1. példa), amely 2 pmólt tartalmaz az R3-oligonukleotidból. Az R3-oligonukleotid hibridizál a 12-es kodon második G-jével komplementer C-től 3'-irányban közvetlen szomszédságban levő szekvenciával. A másik csőbe 10 μΐ puffért teszünk, amely 2 pmólt tartalmaz az R4 oligo nukleotidból. Az R4-oligonukleotid a 12-es kodon első G-jével komplementer C-tól 3'-irányban levő szekvenciával hibridizál. A hibridizációs reakciót az 1. példában leírtak szerint hajtjuk végre. Egy μΐ ditiotreitolt adunk a reakcióelegyekhez. A 12-es kodonban levő mutációt az alábbi, A és B módszerek szerint elemezzük.
A. A Gly - nem-Gly mutáció azonosítása a 12-es kodonban
Egy [35S]-dATP, [35S]-dGTP és [35S]-dTTP valamint ddCTP-t tartalmazó elegyet adunk mindkét csőhöz 15 μΐ végtérfogatban, 1-1 pmól végkoncentrációban. Egy egység T7-DNS polimerázt adunk hozzá, majd a reakciót hagyjuk 5 percig 37 °C-on lejátszódni. A részecskéket mossuk, majd a reakcióterméket eluáljuk, és az eluált radioaktivitást szcintillációs számlálóval mérjük, az 1. példában leírtak szerint.
Az abból a csőből származó pozitív jel, amelyben az R3-nukleotid hibridizálódott, azt mutatja, hogy a mintában a K-ras-géneknek legalább egy része a 12-es kodonban elmutált valinra (GTT-kodon), aszparaginsavra (GAT-kodon), vagy alaninra (GCT-kodon).
Az abból a csőből származó pozitív jel, amelyben az R4-nukleotid hibridizálódott, azt mutatja, hogy a mintában a K-ras-géneknek legalább egy része a 12-es kodonban elmutált ciszteinre (TGT-kodon), szerinre (AGT-kodon), vagy argininre (CTG-kodon).
Ha egyik csőből sem kapunk jelet, ez azt mutatja, hogy mindkét alléiban a 12-es kodon a normál GGT, amely glicin csoportot kódol.
A mutáció azonosítása a 12-es kodonban
A mutáció pontos azonosítását úgy végezzük, hogy mindkét csőhöz egy [32P]-dATP, [35S]-dGTP, [3H]dTTP és ddCTP tartalmú elegyet adunk 1 mól koncentrációban, 15 μΐ végtérfogatban. A [32P]-dATP-t és a [35S]-d GTP-t jelzetlen dATP-ben, illetve dGTP-ben hígítjuk, így kapunk a [3H]-dTTP-hez hasonló specifikus aktivitást (körülbelül 100 Ci/mmól). A három radioaktív izotóp szcintillációs számlálási hatásfoka közötti különbséget figyelembe vesszük egy reakcióelegy tervezése során, amely azonos cpm értéket ad a mérésre használt csatornákon (lásd alább).
Egy egység T7-DNS-polimerázt adunk a reakcióelegyhez, majd 5 percig 37 °C-on hagyjuk lejátszódni a reakciót. A részecskéket mossuk, majd a reakciótermékeket eluáljuk az 1. példa szerint.
Az eluált termékben a [3H], [35] és [32P]-izotópok által kibocsátott radioaktivitást egyszerre méljük egy szcintillációsszámlálóban. Egy Rackbeta 1219-es számlálóban (Pharmacia/Wallac) a következő ablak-értékeket állítjuk be:
a [3H] mérésére: 10-90-es csatorna a [35S] mérésére: 95-145-ös csatorna a [32P] mérésére: 170-220-as csatorna Az eredmények értelmezése előtt korrigáljuk a [35S]-ből a [3H] -csatornára átfolyt jelet (24%), és a [32P] -ről a [35S]-csatornákra átfolyt jelet (13%).
Az eredményeket az alábbi táblázat alapján értelmezzük:
Kimutatási lépés indító molekula Jel Eredmény
3H 35s 32P 12-es kodon amino- sav
R3 + - - GAT Asp
R3 - + - GCT Alá
R3 - - + GTT Val
R3 - - - GGT Gly
R4 + - - AGT Ser
R4 - + - CGT Arg
R4 - - + TGT Cys
R4 - - - GGT Gly
A K-ras-gén 12-es kodonjában levő mutációkat adott esetben a fentiek szerint határozhatjuk meg, de elvégezhetjük biotinilezett R2- és RÍ-láncindító molekulák alkalmazásával is. A kimutatási lépés láncindíló molekulájaként a K-ras-gén nem-kódoló szálával komplementer oligonukleotidot használunk:
R5: 5-AAC TTG TGG TAG TTG GAG CT (14-33) R6: 5'-ACT TGT GGT AGT TGG AGC TG (15-34)
HU 211 058 Β
9. példa
Pontmutációk kimutatása az N-ras-gén 12-es kodonjában, nem-mutált sejtek jelenlétében
Az oligonukleotidok szintézise
Két PCR-láncindító molekulát szintetizálunk, jelük
X2 és X2, majd az Xl indító molekulát az 1. példában leírtak szerint biotinilezzük. A 12-es kodon második nukleotidjában keletkező mutáció (G helyett A van) kimutatására egy X3-láncindító molekulát szintetizálunk a kimutatási lépéshez. Az N-ras-gén első exonjának megfelelő oligonukleotidok szekvenciáját és helyzetét (nukleotidszámokban) az alábbiakban adjuk meg:
Xl : 5'-GAC TGA GTA CAA ACT GGT GG
(3-22)
X2 : 5'-CTC TAT GGT GGG ATC ATA TT
(111-91)
X3 : 5'-ACT GGT GGT GGT TGG AGC AG
(15-34)
A DNS-minták
Modell-rendszerként egy olyan sejtvonalat használunk. amelyről ismert, hogy az N-ras-gén 12-es kodonjának második pozíciójában egy nukleotid-cserét (GA) tartalmaz (PA-1-sejtvonal, ATCC CRL1572), annak a helyzetnek az utánzására, amikor AML-betegekböl származó sejtmintákat lehet elemezni minimális maradék mutáns sejtek kimutatására a betegek kezelését követően.
A PA-1-sejtekből és normál humán limfocitákból származó DNS-t a 7. példában ismertetett standard módszerrel vonjuk ki, majd olyan arányban keverjük össze, hogy a mutáns sejtek 100-0,1%-os arányának megfeleljen.
Polimeráz láncreakció - amplifikálás
A kivont DNS-t (100 ng per minta) az Xl- és X2láncindító molekulák felhasználásával megsokszorozzuk. a 3. példában leírt körülmények között.
Affinitás-befogás steptavidinnel borított mágneses részecskéken, és a kimutatási lépés láncindító molekuláinak hibridizációja
A sokszorozó elegyből nyolcvan mikrolitert, valamint 20 pl 1 mólos NaCl oldatot adunk 300 pg streptavidinnel borított mágneses polisztirol gyöngyhöz (DynabeadsR M-280, Streptavidin, Dynal AS). A mintákat 30 percig 20 °C-on tartjuk, a gyöngyöket egy mágneses részecske-sűrítővei (MPC-B; Dynal AS) elválasztjuk, majd az elegyet elöntjük. A gyöngyöket háromszor mossuk 1 ml 0,5 mólos NaCl, 20 mmól nátrium-foszfát puffer pH = 7,5, 0,1% Tween 20 összetételű oldattal, majd kétszer kezeljük 100 pl 50 mmól NaCl, 20 mmól MgCl2, 40 mmól T1S-HC1 pH = 7,5 össztételű oldattal, amely a kimutatási lépés láncindító molekulájából (X3) 2 pmolt tartalmaz. Az indító molekulát hagyjuk hibridizálódni a DNS-templáttal 10 percig 37 °C-on. Egy pl 0,1 mólos ditiotreitolt, 15 pmól 3H-val jelzett dTTP-t és egy egység T7-DNS-polimerázt (United States Biochemical Corporation) adunk a reakcióelegyhez 15 pl végtérfogatban. A reakciót 5 percig hagyjuk lejátszódni 37 °C-on. A gyöngyöket háromszor mossuk, majd 100 pl 50 mmólos NaCl-dal kezeljük 5 percig 20 °C-on. A lemosott radioaktivitást folyadék szcintillációs számlálóval mérjük. Az eredményeket az alábbiakban adjuk meg:
Kisebbségben levő pontmutációk kimutatása PA-1 -sejtekben
Mutáns sejtek (%) beépült 3H (cpm)*
50 23 000
5 3 400
0,5 800
0 490
*) A 3H beépülése, ha a 12-es kodonban A nukleotid van (GAT)
Következtetések
A fenti eredmények azt mutatják, hogy a jelen találmány szerinti módszenei már 0,25% mutáns monoallelikus N-ras-DNS-t ki lehet mutatni a normális DNS háttere mellett. Ez az érzékenység még bőven abban a tartományban van, amely elegendő elég az AML-betegek szűrővizsgálatához, és ahhoz, hogy az azonosított mutációkat kövessük a betegség kezelése során, majd az ezt követő időszakban.
10. példa
Pontmutáció (A-T) kimutatása a HIV-1-reverztranszkriptáz gén 215-ös kodonjában (az aminosav szekvencia sorszáma az NH2 terminális prolinhoz viszonyítva).
Az oligonukleotidok szintézise
Két PCR láncindító molekulát (Hl és H2) és egy kimutatási lépés láncindító molekulát (H3) szintetizálunk az 1. példában leírt módszerrel. A H2 indító molekulát az 1. példában leírt módszerrel biotinilezzük. Az oligonukleotidok nukleotid szekvenciája és elhelyezkedésük a HIV-1 reverz transzkriptáz-génen [a nukleotidok sorszámozása Ratner és munkatársai szerint, Natúré, 313, 277-281 (1985)] az alábbi:
Hl: 5'-GAG AAT CCA TAC AAT ACT CCA
(2286-2306)
H2 : 5'-TAA CCC ATC CAA AGG AAT GGA
(2824-2804)
H3 : 5'-ATC TGT TGA GGT GGG GAC TT
(2752-2771)
Polimeráz láncreakció - amplifikáció és affinitásbefogás
A DNS-t az 1. példában leírt módszerrel vonjuk ki a HIV-l-vírussal fertőzött sejtekből. A DNS-t (100 ng per minta) a Hl - és H2-láncindító molekulákkal amplifikáljuk (végkoncentráció 0,2 mmól) az 1. példában leírt módszerrel, azzal a különbséggel, hogy a láncindító molekula hibridizációs hőmérséklete 50 °C. A biotinilezett amplifikált DNS-fragmeneket streptavidinnel borított mikrotiter lemezeken fogjuk ki a 4. példában leírt módon. Mindegyik mintát két párhuzamos kísér14
HU 211 058 Β letben kötjük meg. A mikrotiter lemez falára kötődött DNS-fragmenteket denaturáljuk, majd mossuk a 4. példában leírtak szerint.
Az A-T mutáció azonosítása a 215-ös kodonban
A kimutatási lépés H3-láncindító molekulájának hibridizációját és a kimutatási reakciót egyszerre végezzük 50 °C-on 10 percig 50 mmól TRI-HC1 pH-8,8, 1,5 mmól MgCl2, 15 mmól (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20, 0,01% zselatin és 0,2 pmól H3-láncindító molekula összetételű oldatban, amely az A reakcióhoz a következőket tartalmazza: 1 pCi 3H-dATP (82 Ci/mmól, Amersham, UK), 0,8 pmól ddTTP és ddCTP, valamint 1 egység Tag-DNS-polimeráz (Promega). A T reakcióhoz: 1 pCi 3H-dTTP (98 Ci/mmól) és 0,8 pmól ddATP valamint ddCTP. A mérőhelyeket háromszor mossuk 0,1% Tween 20-szal TBS-ben és a radioaktivitást 60 ml 50 mmólos NaOH-val mossuk le, 5 percig szobahőmérsékleten kezelve a mérőhelyeket. Az eluált radioaktivitást folyadék-szcintillációs számlálóval mérjük meg.
Az eredmények értelmezése
A csak az A-reakcióból kapott pozitív jel azt jelenti, hogy a vírus-izolátum vad típusú. A csak a T-reakcióból kapott pozitív jel azt jelenti, hogy a vírus izolátum a 215-ös kodon első nukleotidjában mutációt hordoz. Ennek következtében a Thr-aminosav Phe- vagy Tyraminosavvá mutált el. A mindkét reakcióból kapott pozitív jel azt mutatja, hogy a vírus a vad típusú és a mutáns vírusok kevert populációja.
A 67-es és 70-es kodonok variábilis nukleotidjait hasonló módon lehet meghatározni ugyanabból az amplifikációs reakciótermékből.

Claims (44)

1. Eljárás egy vizsgálandó polinukleotid-molekula meghatározott helyén található specifikus nukleotidvariáció kimutatására, ahol egy első nukleotidot egy második nukleotid helyettesíthet, azzal jellemezve, hogy (i) az egyszálú formában levő polinukleotid-molekula kimutatható mennyiségét hibridizáljuk egy láncindító oligonukleotid-molekulával, amely láncindító molekula szekvenciája oly módon komplementer egy, a vizsgálandó polinukleotidon a meghatározott helytől 3'-irányban található nukleotid-szekvenciarészlettel, hogy amikor a láncindító molekula a vizsgálandó polinukleotid-molekulával hibridizál, a láncindító molekula 3'-vége és a meghatározott hely között nincs az első vagy második azonosítandó nukleotiddal megegyező nukleotid;
(ii) a láncindító molekulát polimerizációt katalizáló ágens alkalmazásával egy vagy több nukleozid-trifoszfátot és adott esetben egy vagy több lánctermináló nukleozid-trifoszfátot tartalmazó reakcióelegyben meghosszabbítjuk, amelyben legalább az egyik nukleozid-trifoszfát komplementer az első vagy a második nukleotiddal és olyan jelzést hordoz, amely alapján polinukleotidba történő beépülése kimutatható; és (iii) az adott nukleozid-trifoszfát beépülését kimutatjuk és ezáltal a meghatározott helyen található nukleotidot azonosítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépés végrehajtása előtt a vizsgálandó polinukleotid-molekulát szilárd hordozóhoz immobilizáljuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy láncindító molekulaként a vizsgálandó polinukleotidon egy, a meghatározott hellyel közvetlenül szomszédos nukleotiddal kezdődő, 3'-irányban található nukleotid-szekvenciarészlettel komplementer szekvenciájú oligonukleotidot alkalmazunk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelzést hordozó nukleotidként dezoxinukleozid-trifoszfátot alkalmazunk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelzést hordozó nukleotidként didezoxinukleozid-trifoszfátot alkalmazunk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (ii) lépésben az első nukleotid jelzésétől különböző jelzésű második nukleozid-trifoszfátot is alkalmazunk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó polinukleotid-molekula kimutatható mennyiségét olyan módosított amplifikációs reakcióval állítjuk elő, amelyben legalább az egyik amplifikációs láncindító molekulaként a láncindító molekulához kötött kapcsolóegységet is tartalmazó láncindító molekulát alkalmazunk.
8. Eljárás egy vizsgálandó polinukleotid-molekula meghatározott helyein található két vagy több specifikus nukleotidvariáció kimutatására, ahol legalább egy első meghatározott helyen egy első nukleotidot egy második nukleotid helyettesíthet és egy második meghatározott helyen egy harmadik nukleotidot egy negyedik nukleotid helyettesíthet, azzal jellemezve, hogy (i) az egyszálú formában levő polinukleotid-molekula kimutatható mennyiségét hibridizáljuk egy első kimutatási lépésben használt első láncindító oligonukleotid-molekulával, amely láncindító molekula szekvenciája oly módon komplementer a vizsgálandó polinukleotidon egy, az első meghatározott helytől 3’irányban található nukleotid-szekvenciarészlettel, hogy amikor az első láncindító molekula a vizsgálandó polinukleotidmolekulával hibridizál, a láncindító molekula 3'-vége és az első meghatározott hely között nincs az első vagy második azonosítandó nukleotiddal megegyező nukleotid;
(ii) az első kimutatási lépésben használt láncindító molekulát polimerizációt katalizáló ágens alkalmazásával egy vagy több nukleozid-trifoszfátot és adott esetben egy vagy több lánctermináló nukleozid-trifoszfátot tartalmazó reakcióelegyben meghosszabbítjuk, amelyben legalább az egyik nukleozid-trifoszfát komplementer az első vagy a második nukleotiddal és olyan jelzést hordoz, amely alapján polinukleotidba történő beépülése kimutatható; és
HU 211 058 Β (iii) az adott nukleozid-trifoszfát beépülését kimutatjuk és ezáltal az első meghatározott helyen található nukleotidot azonosítjuk;
(iv) eltávolítjuk a (ii) lépésben meghosszabbított első láncindító molekulát a vizsgálandó polinukleotidmolekuláról; és (v) a reakcióelegyhez hozzáadunk egy második kimutatási lépésben használt második láncindító oligonukleotid-molekulát, amely láncindító molekula szekvenciája oly módon komplementer a vizsgálandó polinukleotidon egy, a második meghatározott helytől 3’irányban található nukleotid-szekvenciarészlettel, hogy amikor a második láncindító molekula a vizsgálandó polinukleotid-molekulával hibridizál, a második láncindító molekula 3'-vége és a második meghatározott hely között nincs a harmadik vagy negyedik azonosítandó nukleotiddal megegyező nukleotid;
(vi) a második kimutatási lépésben használt második láncindító molekulát polimerizációt katalizáló ágens alkalmazásával egy vagy több nukleozid-trifoszfátot és adott esetben egy vagy több lánctermináló nukleozid-trifoszfátot tartalmazó reakcióelegyben meghosszabbítjuk, amelyben legalább az egyik nukleozid-trifoszfát komplementer a harmadik vagy a negyedik nukleotiddal és olyan jelzést hordoz, amely alapján polinukleotidba történő beépülése kimutatható; és (vii) az adott nukleozid-trifoszfát beépülését kimutatjuk és ezáltal a második meghatározott helyen található nukleotidot azonosítjuk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépés végrehajtása előtt a vizsgálandó polinukleotid molekulát szilárd hordozóhoz immobilizáljuk.
10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy láncindító molekulaként a vizsgálandó polinukleotidon egy, a meghatározott hellyel közvetlenül szomszédos nukleotiddal kezdődő, 3'-irányban található nukleotid-szekvenciarészlettel komplementer szekvenciájú oligonukleotidot alkalmazunk.
11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelzést hordozó nukleotidként dezoxinukleozid-trifoszfátot alkalmazunk.
12. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelzést hordozó nukleotidként didezoxinukleozid-trifoszfátot alkalmazunk.
13. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (ii) lépésben az első nukleotid jelzésétől különböző jelzésű második nukleozid-trifoszfátot is alkalmazunk.
14. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iv) lépésben keletkező meghosszabbított terméket a beépült nukleozid-trifoszfát mennyiségének meghatározása előtt eluáljuk.
15. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó polinukleotid-molekula kimutatható mennyiségét olyan módosított amplifikációs reakcióval állítjuk elő, amelyben legalább az egyik amplifikációs láncindító molekulaként a láncindító molekulához kötött kapcsolóegységet is tartalmazó láncindító molekulát alkalmazunk.
16. Eljárás egy vizsgálandó polinukleotid-molekula meghatározott helyein található két vagy több specifikus nukleotidvariáció kimutatására, ahol legalább egy első meghatározott helyen egy első nukleotidot egy második nukleotid helyettesíthet és egy második meghatározott helyen egy harmadik nukleotidot egy negyedik nukleotid helyettesíthet, azzal jellemezve, hogy (i) az egyszálú formában levő polinukleotid-molekula kimutatható mennyiségét egy lépésben hibridizáljuk legalább két különböző szekvenciájú láncindító oligonukleotid-molekulával, amely láncindító molekulák egyikének szekvenciája oly módon komplementer a vizsgálandó polinukleotidon, egy az első meghatározott helytől 3'-irányban található nukleotid-szekvenciarészlettel, hogy amikor az egyik láncindító molekula a vizsgálandó polinukleotid-molekulával hibridizál, a láncindító molekula 3'vége és az első meghatározott hely között nincs az első vagy második azonosítandó nukleotiddal megegyező nukleotid;
és amely láncindító molekulák másikának szekvenciája oly módon komplementer a vizsgálandó polinukleotidon a második meghatározott helytől 3'-irányban található másik nukleotid-szekvenciarészlettel, hogy amikor a másik láncindító molekula a vizsgálandó polinukleotid-molekulával hibridizál, a második láncindító molekula 3'-vége és a második meghatározott hely között nincs a harmadik vagy negyedik azonosítandó nukleotiddal megegyező nukleotid;
(ii) a láncindító molekulákat egy polimerizációt katalizáló ágens alkalmazásával, két vagy több nukleozid-trifoszfátot és adott esetben egy vagy több lánctermináló nukleozid-trifoszfátot tartalmazó reakcióelegyben meghosszabbítjuk, amelyben legalább az egyik nukleozid-trifoszfát komplementer az első vagy a második, és legalább egy másik nukleozid-trifoszfát komplementer a harmadik vagy a negyedik meghatározandó nukleotiddal és a komplementer nukleozid-trifoszfátok olyan egymástól különböző jelzéseket hordoznak, amelyek alapján polinukleotidba történő beépülésük a másik jelzett nukleotid beépülésétől függetlenül kimutatható;
(iii) az adott nukleozid-trifoszfátok beépülését kimutatjuk és ezáltal az első és a második meghatározott helyen található nukleotidokat azonosítjuk.
17. Csomagolva kiszerelt reagenskészlet vizsgálandó polinukleotid-molekulák specifikus nukleotid-variációinak kimutatására, azzal jellemezve, hogy
a) legalább egy amplifikációs láncindító molekulát amely tartalmaz egy olyan oligonukleotid-szekvenciát, amely komplementer és hibridizálódni képes vizsgálandó polinukleotid molekula valamely részletével és enzimatikus nukleinsav-polimerizáció kiindulópontjául alkalmazható, valamint egy első kapcsolóegységet
b) legalább egy, kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulát - amely olyan oligonukleotidszekvenciát tartalmaz, amely komplementer és hibridizálódni képes a vizsgálandó polinukleotid molekulának egy variábilis nukleotidjától 3'-irányban található szekvencia-részlettel-; és adott esetben
HU 211 058 Β
c) legalább egy szilárd mátrixot tartalmazó szilárd hordozót - mely legalább egy olyan kapcsolóhelyet tartalmaz, amely képes immobilizálni az amplifikációs láncindító oligonukleotidot az első kapcsolóegységen keresztül; és
d) legalább egy, polinukleotidba történő beépülésének kimutatására alkalmas jelzést hordozó nukleozidtrifoszfátot tartalmaz.
18. A 17. igénypont szerinti, apolipoprotein-E-polimorfizmusra jellemző nukleotid-variáció kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5'-GCG CGG ACA TGG AGG ACG TG szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindítót tartalmaz.
19. A 17. igénypont szerinti, apolipoprotein-E-polimorfizmusra jellemző nukleotid-variáció kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5-ATG CCG ATG ACC TGC AGA AG szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindítót tartalmaz.
20. A 17. igénypont szerinti, apolipoprotein-E-polimorfizmusra jellemző nukleotid-variáció kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5-GTA CTG CAC CAG GCG GCC GC szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindítót tartalmaz.
21. A 17. igénypont szerinti, apolipoprotein-E-polimorfizmusra jellemző nukleotid-variáció kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5-GGC CTG GTA CAC TGC CAG GC szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindító molekulát tartalmaz.
22. A 17. igénypont szerinti, sarlósejtes anémiát okozó humán (β-globin-gén 6. kodonjában található nukleotid-variáció kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5'-CAT GGT GCA CCT GAC TCC TG szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindító molekulát tartalmaz.
23. A 17. igénypont szerinti, sarlósejtes anémiát okozó humán β-globin-gén 6. kodonjában található nukleotid-variáció kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5'-CAG TAA CGG CAG GCG GCC GC szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindító molekulát tartalmaz.
24. A 17. igénypont szerinti, K-ras-gén 12. kodonjában található nukleotid-variáció kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5AAG GCA CTC TTG CCT ACG CCA szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindító molekulát tartalmaz.
25. A 17. igénypont szerinti, K-ras-gén 12. kodonjában található nukleotid-variáció kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5'AGG CAC TCT TGC CTA CGC CAC szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindító molekulát tartalmaz.
26. A 17. igénypont szerinti, K-ras-gén 12. kodonjában található nukleotid-variáció kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5 AAC TTG TGG TAG TTG GAG CT szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindító molekulát tartalmaz.
27. A 17. igénypont szerinti, K-ras-gén 12. kodonjában található nukleotid-variáció kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5'ACTTGT GGT AGT TGG AGC TG szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindító molekulát tartalmaz.
28. A 17. igénypont szerinti, N-ras-gén 12. kodonjában található nukleotid-variáció kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5'ACT GGT GGT GGT TGG AGC AG szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindító molekulát tartalmaz.
29. A 17. igénypont szerinti, HIV-1-vírusok AZTrezisztenciájának kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5'-ATC TGT TGA GGT GGG GAC TT szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindító molekulát tartalmaz.
30. A 17. igénypont szerinti, a cisztás fibrózis kimutatására szolgáló reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy kimutatási lépésben alkalmazható láncindító molekulaként az 5-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT szekvenciarészletet magába foglaló szekvenciájú láncindító molekulát tartalmaz.
31. Diagnosztikai reagens-készítmény olyan pontmutációk kimutatására, melyek esetében egy kiválasztott génen belül egy meghatározott helyen egy normálisan előforduló nukleotidot egy rendellenes nukleotid helyettesíthet, azzal jellemezve, hogy egy enzimmel katalizált lánchosszabbító polimerizációs reakcióban láncindító molekulaként alkalmazható oligonukleotidot
- melynek szekvenciája komplementer a kiválasztott gén azon részletével, amely a meghatározott hellyel 3'-irányban közvetlenül szomszédos és a gén 3'-végének irányában helyezkedik el és ily módon alkalmas arra, hogy olyan enzimatikusan katalizált lánchosszabbító nukleinsav-polimerizáció kiindulópontja legyen, melyben az első beépülő nukleotid a meghatározott helyen található normális vagy rendellenes nukleotiddal komplementer nukleotid lesz - és szokásosan alkalmazott hordozó és/vagy egyéb segédanyagokat tartalmaz.
32. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 10-40 nukleotid-bázis hosszúságú oligonukleotidot tartalmaz.
HU 211 058 Β
33. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve. hogy 5'-GCG CGG ACA TGG AGG ACG TG szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
34. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 5-ATG CCG ATG ACC TGC AGA AG szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
35. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 5'-GTA CTG CAC CAG GCG GCC GC szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
36. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 5-GGC CTG GTA CAC TGC CAG GC szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
37. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 5'-CAT GGT GCA CCT GAC TCC TG szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
38. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 5'-CAG TAA CGG CAG GCG GCC GC szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
39. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 5'-AAG GCA CTC TTG CCT ACG CCA szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
40. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jel5 lemezve, hogy 5-AGG CAC TCT TGC CTA CGC
CAC szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
41. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 5'-AAC TTG TGG TAG TTG GAG CT szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
10
42. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 5'-ACT GGT GGT GGT TGG AGC AG szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
43. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 5'-ATC TGT TGA GGT GGG GAC TT
15 szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
44. A 31. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 5-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz.
HU 211 058 Β
Int. Cl.6: C 12 Q 1/68
A kimutatási lé pés láncindító molekulája:
Immobilizált célszekvencia:
Hozzáadott nukleozidtrifoszfátok:
5’-Y YYYYYYYY
3’-X X X X X X X X X Χ,Χ’ X X X X X X * * - kapcsoló X2 egység
a) ddY, vagy ddY2
b) ddY/ és ddY2 +
c) dY/ (és ddY’)
d) dY! és dY2 + (ha Χυ X2 * X’)
1. ábra
HU 211 058 Β Int. Cl.6: C 12 Q 1/68
A kimutatási lépés láncindító molekulája: 5’-Y Y Y Y Y Y
Immobilizált célszekvencia: 3’-X X X X X X (X)n X,X’X”X X X X X X X X2
- kapcsoló egység
Hozzáadott nukleozidtrifoszfátok: a) dYVn és ddY·,* vagy ddY2 (csak akkor, ha X,.n * X, vagy X2)
2. ábra
HU 21 1 058 B Int. Cl.6: C 12 Q 1/68
A kimutatási lépés láncindító molekulái: 1.)
2.)
3.)
5’-Y Y Y Y 5’-Y Y Y Y 5’-Y Y Y Y
Y Y Y Y Y γ γ γ γ γ Yl
Y Y Y Y Y Y2
Immobilizált célszekvencia:
Hozzáadott nukleozidtrifoszfátok:
3’-X XXXXXXXX XiX3X’X”X X X X X X X - kapcsoló X2X4 egység
1, lépés: ddY/ és/vagy ddY2’
2. lépés: ddY3* és ddY4 +
3. ábra
HU91516A 1990-02-16 1991-02-15 Processes, kits and reagent compositions for determining of specific nucleotide variants HU211058B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48200590A 1990-02-16 1990-02-16

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU910516D0 HU910516D0 (en) 1991-09-30
HUT61330A HUT61330A (en) 1992-12-28
HU211058B true HU211058B (en) 1995-10-30

Family

ID=23914258

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU91516A HU211058B (en) 1990-02-16 1991-02-15 Processes, kits and reagent compositions for determining of specific nucleotide variants

Country Status (18)

Country Link
EP (1) EP0648280B1 (hu)
JP (1) JP2786011B2 (hu)
AT (1) ATE180019T1 (hu)
AU (1) AU642709B2 (hu)
CA (1) CA2071537C (hu)
DE (2) DE648280T1 (hu)
DK (1) DK0648280T3 (hu)
ES (1) ES2072235T3 (hu)
FI (1) FI102297B (hu)
GR (2) GR950300047T1 (hu)
HU (1) HU211058B (hu)
IE (1) IE910525A1 (hu)
IL (1) IL97222A (hu)
NO (1) NO311529B1 (hu)
NZ (1) NZ237134A (hu)
PT (1) PT96776B (hu)
WO (1) WO1991013075A2 (hu)
ZA (1) ZA911152B (hu)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US6013431A (en) 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
US6004744A (en) * 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
WO1992016180A2 (en) * 1991-03-13 1992-10-01 Siska Diagnostics, Inc. Detection of 3'-azido-3'-deoxythymidine resistance
US7026115B1 (en) 1991-09-24 2006-04-11 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
US20100267023A1 (en) 1992-09-24 2010-10-21 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
GB9208000D0 (en) * 1992-04-10 1992-05-27 Univ London Quantitative viral assay
WO1993022457A1 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Massachusetts Institute Of Technology Screening for genetic variation
JP2001507921A (ja) * 1992-04-27 2001-06-19 トラスティーズ オブ ダートマス カレッジ 生物学的液体中の遺伝子配列の検出
GB9210176D0 (en) * 1992-05-12 1992-06-24 Cemu Bioteknik Ab Chemical method
US5981176A (en) * 1992-06-17 1999-11-09 City Of Hope Method of detecting and discriminating between nucleic acid sequences
WO1993025563A1 (en) * 1992-06-17 1993-12-23 City Of Hope A method of detecting and discriminating between nucleic acid sequences
DE69232846T2 (de) * 1992-06-17 2003-08-21 City Of Hope, Duarte Verfahren zum nachweis und unterscheiden von nukleinsäuresequenzen
JPH08507198A (ja) * 1992-07-02 1996-08-06 エリフィーレ ビー．フェ． 特異的対立遺伝子の検出のための単一ヌクレオチドプライマー伸張法およびそのためのキット
US5710028A (en) * 1992-07-02 1998-01-20 Eyal; Nurit Method of quick screening and identification of specific DNA sequences by single nucleotide primer extension and kits therefor
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US6153379A (en) * 1993-06-22 2000-11-28 Baylor College Of Medicine Parallel primer extension approach to nucleic acid sequence analysis
US7001722B1 (en) 1993-06-22 2006-02-21 Baylor College Of Medicine Parallel primer extension approach to nucleic acid sequence analysis
US6071699A (en) 1996-06-07 2000-06-06 California Institute Of Technology Nucleic acid mediated electron transfer
CA2111503A1 (en) * 1993-12-15 1995-06-16 Mcgill University Apolipoprotein e polymorphism and alzheimer's disease
US6428955B1 (en) 1995-03-17 2002-08-06 Sequenom, Inc. DNA diagnostics based on mass spectrometry
GB9507238D0 (en) 1995-04-07 1995-05-31 Isis Innovation Detecting dna sequence variations
GB9517914D0 (en) * 1995-09-02 1995-11-01 Tepnel Medical Ltd Identification of bases in nucleic acid sequences
NO954667D0 (no) * 1995-11-17 1995-11-17 Dagfinn Oegreid Fremgangsmåte til deteksjon av Ki-ras mutasjoner
WO1997035033A1 (en) 1996-03-19 1997-09-25 Molecular Tool, Inc. Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide
CA2260362A1 (en) * 1996-07-11 1998-01-22 Takanori Oka Nucleic acid assay process and assay kit
AU4065397A (en) 1996-08-14 1998-03-06 Life Technologies, Inc. Stable compositions for nucleic acid amplification and sequencing
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US7045285B1 (en) 1996-11-05 2006-05-16 Clinical Micro Sensors, Inc. Electronic transfer moieties attached to peptide nucleic acids
US7381525B1 (en) 1997-03-07 2008-06-03 Clinical Micro Sensors, Inc. AC/DC voltage apparatus for detection of nucleic acids
US6133436A (en) * 1996-11-06 2000-10-17 Sequenom, Inc. Beads bound to a solid support and to nucleic acids
US6140053A (en) 1996-11-06 2000-10-31 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US5945284A (en) * 1997-05-27 1999-08-31 The Perkin-Elmer Corporation Length determination of nucleic acid repeat sequences by discontinuous primer extension
US6309829B1 (en) 1997-05-27 2001-10-30 Pe Corporation (Ny) Length determination of nucleic acid repeat sequences by discontinuous primer extension
US5888778A (en) * 1997-06-16 1999-03-30 Exact Laboratories, Inc. High-throughput screening method for identification of genetic mutations or disease-causing microorganisms using segmented primers
US6566101B1 (en) 1997-06-16 2003-05-20 Anthony P. Shuber Primer extension methods for detecting nucleic acids
US7105353B2 (en) 1997-07-18 2006-09-12 Serono Genetics Institute S.A. Methods of identifying individuals for inclusion in drug studies
GB9715034D0 (en) * 1997-07-18 1997-09-24 Zeneca Ltd Assay
EP0892068A1 (en) * 1997-07-18 1999-01-20 Genset Sa Method for generating a high density linkage disequilibrium-based map of the human genome
US7745142B2 (en) 1997-09-15 2010-06-29 Molecular Devices Corporation Molecular modification assays
US6537751B1 (en) 1998-04-21 2003-03-25 Genset S.A. Biallelic markers for use in constructing a high density disequilibrium map of the human genome
CA2245039A1 (en) * 1998-08-13 2000-02-13 Vito Scalia Primer-specific and mispair extension assay for identifying gene variation
AU5890899A (en) * 1998-08-28 2000-03-21 Sangtec Molecular Diagnostics Ab A method for measuring a patient's ability to metabolise certain drugs
DE19855469C2 (de) * 1998-12-01 2001-01-11 Michael Esrich Verfahren zur Bestimmung des Apolipoprotein-E-Genotyps in einer menschlichen Probe
US6280947B1 (en) 1999-08-11 2001-08-28 Exact Sciences Corporation Methods for detecting nucleotide insertion or deletion using primer extension
US6503718B2 (en) 1999-01-10 2003-01-07 Exact Sciences Corporation Methods for detecting mutations using primer extension for detecting disease
US6573047B1 (en) 1999-04-13 2003-06-03 Dna Sciences, Inc. Detection of nucleotide sequence variation through fluorescence resonance energy transfer label generation
EP1923471B1 (en) 1999-04-20 2012-12-19 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
JP2001245698A (ja) * 1999-11-22 2001-09-11 Xiao Bing Wang 核酸検出法
AU1939001A (en) 1999-12-02 2001-06-12 Dna Sciences, Inc. Methods for determining single nucleotide variations and genotyping
US6518024B2 (en) 1999-12-13 2003-02-11 Motorola, Inc. Electrochemical detection of single base extension
US6762018B1 (en) 1999-12-23 2004-07-13 Tetragen Sa Analysis of nucleotide polymorphisms at a site
AU3838901A (en) 2000-02-16 2001-08-27 Illumina Inc Parallel genotyping of multiple patient samples
US6355433B1 (en) 2000-06-02 2002-03-12 Dna Sciences, Inc. Determination of nucleotide sequence variations through limited primer extension
SG115374A1 (en) * 2000-07-17 2005-10-28 Xiao Bing Wang Detection of sequence variation of nucleic acid by shifted termination analysis
CH699253B1 (de) * 2000-09-18 2010-02-15 Eidgenoessische Forschungsanst Verfahren zur Charakterisierung und/oder Identifikation von Genomen.
AU2002227156A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US6428964B1 (en) 2001-03-15 2002-08-06 Exact Sciences Corporation Method for alteration detection
US6803201B2 (en) 2002-01-24 2004-10-12 Stratagene Compositions and methods for polynucleotide sequence determination
JP4143756B2 (ja) * 2002-06-21 2008-09-03 財団法人名古屋産業科学研究所 心筋梗塞のリスク診断方法
DE10245145B4 (de) * 2002-09-27 2004-12-02 IPK-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Verfahren zum Nachweis von SNPs auf polydimensionalen Microarrays
US7803579B2 (en) 2002-10-29 2010-09-28 Riken Process for amplifying nucleic acid
WO2005063977A1 (ja) 2003-12-25 2005-07-14 Riken 核酸の増幅法およびこれを利用した変異核酸の検出法
US7170050B2 (en) 2004-09-17 2007-01-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and methods for optical analysis of molecules
US7302146B2 (en) 2004-09-17 2007-11-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and method for analysis of molecules
US9109256B2 (en) 2004-10-27 2015-08-18 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Method for monitoring disease progression or recurrence
US9777314B2 (en) 2005-04-21 2017-10-03 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Analysis of heterogeneous nucleic acid samples
CN104862383B (zh) 2008-03-28 2019-05-28 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于核酸测序的组合物和方法
WO2012049279A1 (en) 2010-10-14 2012-04-19 Universitaet Des Saarlandes MEANS AND METHODS APPLYING SINGLE NUCLEOTIDE PRIMER EXTENSION WITH ION PAIR-, REVERSED-PHASE HPLC (SIRPH) FOR THE DIAGNOSIS OF SNPs

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8311018D0 (en) * 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
US4851331A (en) * 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase
AU622104B2 (en) * 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
FI80476C (fi) * 1987-10-09 1990-06-11 Orion Yhtymae Oy Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning.
IE61148B1 (en) * 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
EP0333465B1 (en) * 1988-03-18 1994-07-13 Baylor College Of Medicine Mutation detection by competitive oligonucleotide priming
WO1989009835A1 (en) * 1988-04-08 1989-10-19 The Salk Institute For Biological Studies Ligase-based amplification method
AU3694689A (en) * 1988-04-28 1989-11-24 Mark H. Skolnick Amplified sequence polymorphisms (asps)
AU629845B2 (en) * 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
CA2002076A1 (en) * 1988-11-21 1990-05-21 Brent A. Burdick Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids
IL92474A (en) * 1988-11-29 1994-04-12 Orion Yhtymae Oy Reaction method and combination for determining nucleotide sequences
DK0457824T4 (da) * 1989-02-13 2004-10-11 Geneco Pty Ltd Detektion af en nukleinsyresekvens eller en ændring deri
AU5640090A (en) * 1989-03-21 1990-11-05 Collaborative Research Inc. A dna diagnostic test using an exonuclease activity

Also Published As

Publication number Publication date
ES2072235T3 (es) 1999-07-16
ATE180019T1 (de) 1999-05-15
HUT61330A (en) 1992-12-28
HU910516D0 (en) 1991-09-30
NO923116D0 (no) 1992-08-10
FI102297B1 (fi) 1998-11-13
ES2072235T1 (es) 1995-07-16
DE648280T1 (de) 1995-11-30
JPH05504477A (ja) 1993-07-15
AU7235191A (en) 1991-09-18
NO923116L (no) 1992-08-10
CA2071537C (en) 2003-02-11
IE910525A1 (en) 1991-08-28
EP0648280B1 (en) 1999-05-12
GR950300047T1 (en) 1995-07-31
CA2071537A1 (en) 1991-08-17
FI923653A0 (fi) 1992-08-14
NZ237134A (en) 1992-06-25
ZA911152B (en) 1991-11-27
JP2786011B2 (ja) 1998-08-13
WO1991013075A3 (en) 1991-10-17
NO311529B1 (no) 2001-12-03
IL97222A (en) 1995-08-31
PT96776B (pt) 1998-05-29
FI102297B (fi) 1998-11-13
DE69131233D1 (de) 1999-06-17
PT96776A (pt) 1991-10-31
DE69131233T2 (de) 1999-11-04
IL97222A0 (en) 1992-05-25
WO1991013075A2 (en) 1991-09-05
EP0648280A1 (en) 1995-04-19
GR3030790T3 (en) 1999-11-30
DK0648280T3 (da) 1999-11-01
FI923653A (fi) 1992-08-14
AU642709B2 (en) 1993-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU211058B (en) Processes, kits and reagent compositions for determining of specific nucleotide variants
US6013431A (en) Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
CA2105060C (en) Nucleic acid typing by polymerase extension of oligonucleotides using terminator mixtures
US5888778A (en) High-throughput screening method for identification of genetic mutations or disease-causing microorganisms using segmented primers
JP4422897B2 (ja) 核酸を検出するためのプライマ伸長法
US5834181A (en) High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids
US5849483A (en) High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids
US5888819A (en) Method for determining nucleotide identity through primer extension
US20050164184A1 (en) Hybridization portion control oligonucleotide and its uses
EP1723261A1 (en) Detection of strp, such as fragile x syndrome
WU et al. Direct analysis of single nucleotide variation in human DNA and RNA using in situ dot hybridization
CA2282705A1 (en) Nucleic acid analysis methods
US20010006780A1 (en) Process for detecting a known sequence in genomic dna
Lopez-Crapez et al. Detection of K-ras Mutations by a Microelectronic DNA Chip
CA2205234A1 (en) High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SANGTEC MEDICAL AB, SE

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB, SE

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees