PT96776B - Metodo e equipamento para a determinacao de variacoes especificas de nucleotidos e processo para a preparacao dos reagentes ai utilizados - Google Patents

Metodo e equipamento para a determinacao de variacoes especificas de nucleotidos e processo para a preparacao dos reagentes ai utilizados Download PDF

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Description

“MÉTODO E EQUIPAMENTO PARA A DETERMINAÇÃO DE VARIAÇQES ESPECÍFICAS DE NUCLEóTIDOS E PROCESSO PARA A PREPARÇÃO DOS REAGENTES Af UTILIZADOS5*
MEMÓRIA DESCRITIVA
RESUMO
A detecção ds nucleótido(s) variável(eis) baseia-se ns extensão de iniciadores s na incorporação de trifosfatos de nucleósidos detectáveis., Através da selecção dos iniciadoras dos passos de detecção a partir da região imediatamente adjacente ao nucleótido variável, esta variação pode ser detectada após incorporação de um ou mais trifosfatos de nucleósidos. Os trifosfatos de nucleósidos marcados que emparelham com o nucleótido variável são adicionados e medida a incorporação de uma marca no iniciador do passo de detecção. A selecção do iniciador do passo de detecção é importante para o método ds acordo com este invento e está dependente da sequência de nucleótidos de interesse. Os iniciadores do passo tíe detecção são preferencialmente
ÍV # '** «. Λ
seleccionados de forma a abranger a direcção 3’ do nucleótido variável a ser detectado»
V \ v - -3 ,·»'' região ime’SÍ a tamente na método é útil para identificar mutações e variações genéticas em pontos específicos»
CAMPO TÉCNICO
O presente invente está relacionado com um método e reagentes para a determinação de variaçSes específicas de nucieótidos numa região de polinucleótidos definida e com a utilização deste método na identificação específica de mutaçSes e variaçSes genéticas pontuais,.
FUhlDAnENT0 DO INVEN 10
ÍequfeTiAlteraçSes menores na
A informação genética dos organismos vivos está contida na sequência de nucleótidos do seu genoma» No processo da expressão de genes a sequência de nucleótidos é traduzida para cias de aminoácidos, i»e» proteínas» sequência de nucleótidos, mesmo a substituição de uma única base pode resultar num produto proteico alterado» A qualidade ou quantidade alterada de determinadas proteínas altera o fenótipo íi.e» as características observáveis) do organismo ou da célula, que por exemplo pode ser observado como o desenvolvimento de uma doença»
D conhecimento dos defeitos moleculares exactos causadores de doenças hereditárias, assim como a predisposição para perturbações genéticas e cancro está a aumentar ràp-idamente» 0 conhecimento da importância das mutaçSes somáticas em doenças malignas ê, no entanto, limitado devido & falta de processos de ensaios para o despiste de grandes números de amostras»
Doenças hereditárias causadas por mutaçSes pontuais incluem anemia das células falsiformes ε fl-talassémias, as quais ί~4 são causadas por mutaçSes 1989, New England J ,= Med»,
no gene da B-globxna·»'íAntonarakis, Vol» 320, pp» 153-163) Estas mutaçSes geralmente envolvem a substituição, a quatro nucleotidos da sequência inserção ou eliminação de do gene normal» A anemia um células falsiformes á provocada por homozigosidade para a substituição de um único par de bases no sexto codão nina, íAntonarakis, supra) Foi caracterizado um mutaçSes no gene da β-globina que podem leva (Antonarakis, supra)» do gene dai p>~gίοgrande número de r à β-talassémia
Outras doenças hereditárias mutaçSes pontuais incluem a-talassémia lia, deficiência em -anti-tripsina fibrose cística» conhecidas causadas por feni1cetonúria, hemofi(An t on a r a k i s, su pr a) e
A fibrose cística é a perturbação genética autossómica recessiva mais comum» Ela afecta cerca d© 1/2000 indivíduos das populaçSes do Caucaso e consequentemente a frequência de portadores é de aproximadamente 57»» A recente clonagem e análise genética do gene do regulador transmembranar da fibrose cística ÍCFTR) (Kerem et al,, 1989, Science, Vol 245, ρρ» 1073-1080) revelou uma mutação principal, designada delta F508, a qual é uma deleção de três nucleotidos que conduz à perda da fenilalanína no resíduo de aminoácido» A prevalência desta mutação- é da ordem dos 687» nas populações de doentes na América do Norte e Europa, A gama sendo 40—887 em relatórios contendo mais de 10O cromossomas CF, Devido à elevada frequência de fibrose cística, são necessários métodos eficientes para o despiste de portadores e para o diagnóstico pré-natal nos países com grupos de risco»
Um exemplo de um polimorfismo, que está relacionado com a predisposição para a doença é o polimorfismo de três alelos do gene da apolipoproteína E = Este polimorfismo
Este é devido
X
substituição de uma só base em dois loci do DMA^-nio gene Apo E CMahley, 1988, Science, Vai» 240, pp» 622-6301» Ele pode explicar até 10X das variações individuais nos níveis de colesterol do soro» Mais de 90% dos doentes com hiperlipoproteinémia tipo III são homoKiqóticos para, um dos alelos Apo E» □ complexo major de histocompatibilidade humano é um sistema polimórfico de genes presentes no mesmo cromossoma e situados dentro de uma região conservada do genoma» Os genes da classe II dentro da região HLA—D (antigénio de leucócitos humanos) codificam uma série de alelos altamente polimórficos (Thomson, 1988, Annu. Rev» Genet», 22531-50? Morei et al», 1998, Proc, Natl» Acad» Sei» USA, SSsSllí-8115? Scharf et al», 1988, Pro» Natl, Acad» Sei» USA, 85s3504—3508>. Mostrou-se que este polimorfismo está associado à susceptibilidade a doenças autoimunes, tais como diabetes dependentes da insulina ε pemphigus vulgarís»
A família de genes ras humanos, a qual inclui os genes homólogos Η—, K- e N-ras, é um dos potenciais alvos para as alterações mutagénicas que desempenham um papel na tumorigénese humana» Mutações pontuais no codão 12, 13 ou 61 dos genes ras convertem estes genes em oncogenss transformantss (Bos et 1985, Nature, vol» 3Í5, pp. 726-730).
Mutações somáticas pontuais no gene M-ras têm sido detectadas em associação com leucemias mielóides agudas (AMD (Farr et al,, 1988, Proc» Natl» Acad» Sei» USA, 85s1629-1633) e outras doenças hematológicas (Neri et al», 1988, Proc, Natl» Acad» Sei» USA, 85s9268-9272)» As mutações N-ras em AML ocorrem predominantemente nos codões 12, 13 e 61 do gene (ref)» Um método para a detecção sensível das mutações N-ras em pequenas quantidades de células leucémicas entre uma vasta maioria de células
- A normais constituiria um instrumento valioso ho--seguimento da terapia de AML e noutras doenças malignas associadas a N-ras,
A detecção de alterações especificas de bases na primeira e segunda posições dos codões 12, 13 e 61 do gene N-ras requere hibritíização com um grande número de sondas oligonucleotidicas diferentes ou determinação directa da sequência de nucleotidos do DNA amplificado» Um ponto critico em ambas as abordagens é a proporção ds células contendo a mutação» Dependendo do método escolhido uma mutação deve estar presente em 5-20% da população de células analisadas p-ara ser detectável»
Mutações pontuais e variações genéticas em microorganismos podem conduzir a patogenicidade alterada ou resistência à terapêutica» □ vírus da. imunodeficiência humana CHÍv-l) pode desenvolver mutantes que são resistentes ao zidovudine (AZT)» Os isolados ds vírus resistentes contêm várias mutações pontuais, mas três mutações parecem ser comuns a todas as estirpes resistente: Asp 67 — Asn ÍGAC — AAC) , Lis 70 — Arg CAAT - GAT) e Tre 215 - Fen CACC-TCC) ou Tir CACO - TAC) ÍLarder and Kemp, 1989, Science 246: 1155-115S).
Será portanto precisão alterações na:
importante se se puder determinar com sequências nucleotidicas no genoma de organismos vivos e com uma eficácia e facilidade tais que grandes números ds amostras podem ser despistadas» Isto daria oportunidade para o diagnóstico pré- e pós-natal de predisposições ou doenças hereditárias e para a detecção de mutações somáticas no cancro» Tal método poderia também ser usado para a selecção de células e estirpes para a biotecnologia industrial e para o cruzamento de plantas e animais» Presentemente, os métodos disponíveis têm desvantagens limitant.es da sua ultilização de rotina„
-- ** i' I'· Α
Os polimorfismos ou mutações nas sequên cias''de DNA são geralmente detectados por hibridação com oligonucleótidos sondas específicas de alelos CASO). A sequência de nucleótidos das sondas ASO é projectada para formar um híbrido de emparelhamento perfeito ou para conter um par de bases que não emparelhe no sítio dos resíduos de nucleótidos variáveis» A distinção entre um híbrida totalmente emparelhado e com um desemparelhamento baseia--se em i) diferenças na estabilidade térmica dos híbridos nas
1avagem C Pub1icação de as na estabilidade dósgradiente desnaturante condições usadas durante a hibridação ou Patente Europeia EP-237362), ii) diferenç híbridos analisados por electroforese em ou ii.i) clivagem química no sítio do desemparelhamento (Publica; ção de Patente Europeia EP—329-511)» sí tio
Os oligonucleétidos com extremos 3’ complementares do dos nucleótidos variáveis- foi usado como iniciadores específicos de alelu (Publicação de Eedido de Patenb
Europeia
EPí)» ft identificação do nucleótido variável baseia-se no facto de um desemparelhamento no extremo 3’ inibir a reacção de polimerização» Uma abordagem semelhante foi usada em ensaios de ligação de oligómeros, nos- quais dois oligonucleõtidos adjacentessão ligados apenas se existir um emparelhamento perfeito nos extremos dos oligonucleótidos (Publicação de Patente Europeia EP-33Ó731)« ft clivagem da sequência de DNA com enzimas- de restrição pode ser utilizada na identificação da variação, desde que o nucleótido variável altere, e»q» cria ou destrói, um sítio de restrição específico» A sequenciaçâo de nucleótidos έ o método mais informativo para a determinação dos nucleótidos variáveis»
Os métodos referidos atrás são processos relativamente complexos, sofrendo de desvantagens- que os tornam difíceis- de '1
sondas específicos de alelos requere uma optimizaçSo cuidadosa das condições de reacção separadamente para cada aplicação.O fraccionamento por electroforese em gel é necessário em vários métodos referidos atrás. Tais métodos não são facilmente automatizados ,
SUMÁRIO DO
INVENTO
Desenvolvemos agora um método melhorada que permite a detecção de variaçSes de nucleõtidos, Este método proporciona várias vantagens relativamente a métodos de trabalhos -anteriores, O método de acordo com este invento compreende poucos processos que são fáceis de realizar, Ele é especialmente adequado para determinações de rotina de mutações pontuais e variaçSes de nucleõtidos, tais como desemparelhamentos isolados, deleçSes, inserções e inversões, 0 método de acordo com o presente invento permite a quantificação da proporção de células mutagenizadas numa amostra assim como a identificação de mutações presentes em tão pouco como 0,5’Z da população celular analisada, Ainda o protocolo completo do método divulgado é facilmente automatizado-, o que torna maior a sua importância nos diagnósticos de rotina, método de detecção dois) nucleótido(s) variável(eis) baseia-se na extensão de iniciadores e incorporação de trifosfatos de nucleé-sido detectáveis no passo de detecção. Através da selecção dos iniciadores do passo de detecção da região imediatamente adjacente ao nucleótido variável, esta variação pode ser detectada após incorporação de apenas um trifosfato de nucleósido.
Os trifosfatos ds nucleósida marcados que emparelham com o nucleótido variável são adicionados e medida a incorporação de uma marca no iniciador do passo de detecção.
A selecção dos iniciadoras do passo ds detecção é importante para o método de acordo com este invento e está dependente da sequência ds nucleótidos de interesse» Os iniciadores do passo de detecção são preferencialmente seleccionadas de modo a a. abranger a região imediatamente adjacente ao extremo 3’ do nucleótido variável a ser dstectado» Os inicadores do passo de detecção podem ser também complementares de uma sequência distando vários nucleótidos do nucleótido variável. A única limitação respeitante à posição dos iniciadores do p-asso de detecção é que a sequência entre o extreo 3“ do iniciador do passo de detecção e o nucleótido variável a ser dstectado não deve conter um resíduo de nucleótido do mesmo tipo daquele que se pretende detectar» Osiniciadores do passo de detecção podem igualmente ser escolhidos para serem complementares de cadeias codificadoras ou não codificadoras da sequência de nucleótidos com interesse» ácido nucleico alvo é de preferência enriquecido pela amplificação in vitro para permitir a detecção de um único nucleótido variável no genoma humano» □ presente invento emprega com vantagem um método anteriormente divulgado para amplificação e modificação da afinidade do ácido nucleico alvo a ser detectada. No presente método o ácido nucleico alvo contendo oís> nucleótido(s) variávelCeis) é imobilizado num suporte sólido permitindo a remoção da mistura de amplificação do ácido nucleico alvo» □ presente invento também engloba reagentes iniciadores individuais e combinações de reagentes ou kits para a prática do invento» Se bem que os reagentes precisos e a forma de os
apresentar dependam do tipo de variações de nucleõtidos ou mutações pontuais a serem detectadas, tal kit incluirá de uma forma geral pelo menos um iniciador de amplificação modificado tendo uma fracção de ligação incluída e pelo menos um iniciador do passo ds detecção, mas poderá também incluir pelo menos um suporte adaptado para imobilizar as cópias modificadas do ácido nucleico alvo s pelo menos um trifosfato de nucleósido marcado»
BREVE DESCRIÇÃO DtiS DEsENHQõ
Figura 1 ilustra o estabelecimento de um teste de acordo com o método divulgado no caso de ser detectado um resíduo de nucleótido variável (X. ou. X_.)»
X jí.
Figura 2 ilustra o estabelecimento de um teste de acordo com o método divulgado no caso do iniciador do passo de detecção ser escolhido de forma a abranger a sequência de nucleótidos· distando n nucleótidos do nucleótido a ser detectado»
Figura 3 ilustra α estabelecimento de um teste de acordo com o método divulgado num caso em. que se pretende detectar uma pluralidade de desempare 1 bamentos a.djacentes uns aos outros» Neste caso o teste é realizado em dois passos, pelo que o iniciador do passo de detecção 1 é eluido antes de se realizar o passo dois»
Símbolos usados nas Figurass
- X e X? significam resíduos de nucleótidos nucleótido variável a ser detectado é representado por X»,
Xz,, X-- ou
lí
- Y,5 ',3 e Y^ representam nucleótidos complementares de ¥
13
X9j ou X^5 respectivamente
- dY significa um trifosfato da dssoxirribonucleósido
- dY? e dY+· significam trifosfatos ds desoxirribonucl-eósído marcadas ddY significa um trifosfato de didesoxirribonucleósido
- ddY? e ddY+ significam trifosfatos de didesoxirrihonucleótidos marcados
- ? e *· significam diferentes marcas detectáveis
DESCRICgÍQ DETALHADA DQ INVENTO □ presente invento baseia-se num método para, determinar uma variação de nucleótidos específica numa região previamente definida de um ácido nucleico presente numa mistura complexa de ácidos nucleicos, Esta região definida contendo -a variação de nucleótidos ê aqui referida como o ácido nucleico alvo, método de acordo com o invento baseia—se numa, reaccão de extensão de iniciadores, usando pelo menos um iniciador do passo ds detecção complementar da sequência de nucleótidos 3’ relativamente ao nucleótido variável a ser detectado. A detecção do nucleótido variável é realizada pela detecção de um trifosfato de nucleósido marcado incorporado através da. extensão do iniciador do passo de detecção»
De preferência o ácido nucleico alvo é amplificado in vitro antes do passo de detecção para proporcionar uma quantidade detectável do ácido nucleico alvo, A qua.ntida.de real de ácido nucleico variará dependendo da fracção de marcação empregue no
passo de detecção e ds sensibilidade de técnicas analíticas para aquela fracção» Num método preferido de acordo cora o presente invento, uma fracção de afinidade é introduzida nas cópias da região de interesse do ácido nucleico alvo. Isto é convenientemente feito por uma reacção de amplificação dependente de iniciador usando pelo menos ura iniciador de amplificação marcado cora afinidade» As cópias das moléculas de ácido nucleico alvo são imobilizadas num suporte sólido com a ajuda da fracção de afinidade introduzida,
Descrevera-se abaixo diferentes testes das realizações preferidas que são ainda ilustradas pelos exemplos» Para os familiarizados cora a matéria será evidente que as possibilidades de construção do teste não estão limitadas ás dadas nos exemplos e que o estabelecimento tío teste é determinado pela mutação ou variação de nucleótido a ser detectada»
a) Introdução de fracções com afinidade nas cópias do DNA alvo
A fonte do ácido nucleico alvo (DNA ou RNA) suspeito de conter o resíduo de nucleótido variável pode ser qualquer célula humana, animal ou vegetal ou um microorganismo» 0 ácido nucleico alvo pode ser isolado a partir de amostras biológicas por métodos convencionais de purificação de ácidos nucleicos, mas de acordo com o presente invento é possível usar amostras biológicas brutas« ácido nucleico a tido variável com interesse vitro usando um ou mais inic tidos com interesse» 0 termo
Ivo compreendendo o sítio do nucleó— é de preferência multiplicado in iadores perto da sequência de nucleóamplificação tal como aqui é usado * «.
refere-se a qualquer elongação dependente de iniciadores de uma sequência de nucleótidos com a ajuda de um agente de polimerização» ReacçSes de elongação dependentes de iniciadores adequadas são por exemplo a reacção em cadeia com polimerase (Kleppe et al», 1971, J» Mol» Biol» 56s341~3ói; s Patente U.S» 4,683,202), processos que utilizam reacçSes de replicação dependente de iniciador e transcrição independente de iniciador (Publicação de Patente EP-329S22) ou amplificação com ligação (PCT Publicação de Patente W0-89/09385>.
colecção de híbridos
Desenvolvemos anteriormente um método conveniente de sequenciação de nucleótidos, o qual está bem adaptado â utilização como instrumento de diagnóstico de rotina (Publicação de Patente U.S» S»N» 277,643, a qual é aqui incluida como cia). Este método utiliza o método d-;
baseado em afinidade descrito no Pedido de Patente U.S, S»N» 024,604, aqui incorporado como referência» De preferência o DNA alvo a ser testado é amplificado in vitro antes da sequenciação» Neste método um dos iniciadores usado na reacção de amplificação compreende uma fracção de ligação tal como a biotina» 0 fragmento enriquecido é capturado numa matrix sólida, à qual se ligou estreptavidina ou avidina. Os reagentes em excesso são totalmente removidos por lavagem da matrix. 0 fragmento capturado ê tornado reacções de terminação de cadeias são na matrix» Ds produtos da reacção determinação de cadeias são libertados e a sequência de nucleótidos é determinada após electroforese em gel de poliacrilamida» Este método de sequenciação em fase sólida é adequado para diagnóstico e proporciona várias vantagens relativamente a. métodos anteriores para determinação ds variações de nucleótidos descritos atrás, mas contem ainda o passo de electroforese em gel para, sequencia— ção que requere trabalho especializado, é demorado s dispendioso» em cadeia sxmples e a-» rea1i zadas d irec tamente
De acordo com o presente invento a a/nplificação do ácido nucleico alvo compreendendo a variação de nucleõtidos suspeita é convenientemente feita usando um iniciador modificado introduzindo fracções tíe afinidade nas cópias da sequência de ácido nucleico alvo» Nesta amplificação um ou mais dos iniciadores de amplificação são modificados para incluírem fracções de ligação» Seleccionando-se qual o iniciador de amplificação modificado, é possível determinar qual a cadeia de uma DNA de cadeia dupla em que ê defcectado o sítio variável« A sequência alvo do interesse é preferencialmente amplificado com um número adequado de ciclos desta reacção em cadeia com polimerase modificada»
Como resultado deste processo, cópias da sequência de ácido nucleico alvo, agora modificada com as fracções de ligação, são obtidas por incorporação dos iniciadores modificados nas moléculas de polinucleótidos sintetizadas» termo fracção de ligação como aqui é usado refere~sb a qualquer componente tendo afinidade para um outro componente que forma um par de afinidade com o outro componente» Por exemplo tais pares de afinidade podem ser biotina-avidina/estreptavidina, antigénios ou haptenos-anticorpos, derivados de metais pesados-tiogrupos, vários polinucleótidos tais como homopolinucleótidos como sejam poli dS-poli dC, poli dft-poli dT e poli dA-poli U« Podem ser usados como par de afinidade quaisquer pares de componentes com afinidade forte um para o outro» Pares ds de afinidade adequados são também encontrados entre liçandos e conjugados usados em métodos imunológicos» Uma “fracção ds ligação é uma fracção ds afinidade ou uma fracção que proporciona um sítio para a ligação de uma fracção de afinidade»
amplificação modificado1' tal como aqui é usado refere-se a um oligonucleótido iniciador modificado de forma a conter uma fraeção de ligação. Os oligonucleótidos termo iniciador de iniciadores podem ser sintetizados por métodos químicos convencionais ou preparados.por técnicas de DNA recombinante. A característica essencial do iniciador de amplificação é que ele é> capaz de se ligar especificamente por emparelhamento de bases à sequência de nucleôtidos alvo original de interesse num ponto da sequêmncia tal que o sitio de interesse seja amplificado. Assim as amplificação deve ser complementar de uma região da sequência de nucleôtidos alvo entre o extremo 35 do ácido nucleico alvo e o sitio com interesse. O extremo 35 do iniciador de amplificação é de preferência complementar da sequência de ácido nucleico alvo num ponto removido a menos de 1D0 resíduos do sítio de interesse devido a limitações na progressão da enzima polimerase. 0 tamanho dos iniciadores é de preferência entre 14 ε 40 bases, mas podem ser usados iniciadores tão curtos como 8 bases ou consideravelmente maiores do que 4€í bases. Os iniciadores são modificados com as fracções de ligação usando métodos químicos ou enzimáticos ou qualquer outro método. De preferência a fraeção é ligada ao extremo 55 do iniciador» São também ligação, desde que a propriedade de poss í ve is outros s í t i osemparelhamento de bases de iniciador e a sua capacidade para funcionar numa reacção de elongação sejam mantidas»
b) Separação das cópias de ácido nucleico alvo
Após amplificação, as cópias de ácido nucleico alvo são separadas da mistura de amplificação» No método preferido do invento, cópias das moléculas de ácido nucleico alvo contendo as
fracções de ligação são imobilizadas numa matrix sólida com a ajuda de um sitio de ligação complementar, e»q» o outro componente do par de afinidade» A matrix é então lavada para remover todo o material não ligado, tais como trifosfatos de nucleótidos e iniciadores, que possam interferir com as reacçSes durante o passode detecção» D ácido nucleico alvo imobilizado ê tornado de cadeia simples antes ou depois do passo de imobilização» A imobilização das cópias de ácido nucleico alvo modificado torna possível reutilizar a sequência alvo se se pretende realizar múltiplas determinações na mesma sequência alvo de interesse» □ termo matrix sólida.” como aqui ê usado refere-se a qualquer formato, tais como esferas, micropartículas, a superfície de uma cavidade da microtitulação ou um tubo de ensaio ou um filtro» 0 material da matriz pode ser polistireno, celulose, látex, nitrocelulose, nylon, poliacrilamida, dextrano ou agarose» O único pré— reques-ito para o material é que o sítio de ligação possa ser ligado a ele»
c) Iniciador do passo de detecçao
Após separação da mistura de amplificação, o fragmento de DNA de cadeia simples- é deixado a hibridar com um iniciador, o iniciador do passo de detecção, o qual é complementar da sequência de nucleótidos 3’ do nucleótido variável» Isto pode ser realizado numa forma imobilizada ou em solução» □ termo “iniciador do passo de detecção tal como aqui é usado refere-se a um oligonucleóíido ou polinucleótido iniciador, o qual funciona como ponto de iniciação para a elongação dependente de iniciador» 0 iniciador do passo de detecção pode
ser escolhida de forma a ser complementar da cadeia codificadora ou não codificadora de um alvo de cadeia dupla, dependendo de qual a cadeia que foi imobilizada no passo b) descrito atrás» 0 iniciador do passo de detecção pode ser modificado, e.g» com uma fracção de afinidade como descrito na secção a) acima mas usando uma fracção de afinidade diferente» De preferência o iniciador do passo de detecção não está modificado»
A selecção do iniciador do passo de detecção é- determinada pela natureza da variação de nucleótidos a ser detectada»
Numa realização preferida do método de acordo com o presente invento, o iniciador do passo de detecção é seleccionado de forma a ser imediatamente ao nucleótido variável a ser detecado»
Numa outra realização do método de acordo com o presente invento o iniciador do passo de detecção é seleccionado para ser hibridável cam uma sequência de nucleótidos resíduas de nucleótidos do nucleótido variável a ser única limitação relativamente ao número n de resíduas tidas entrs o extremo 3’ do iniciador do passo de d nucleótido variável é que não existam resíduos de idênticos ao(s) que se pretende detectar entre estes de nucleótidos» distando n detectada» A de nucleóetseção e o nucleótidos n resíduos
Uma outra reali invento são identificados variáveis» Neste caso é ação do método de acordo com o presente dois ou mais resíduos de nucleótidos necessário projectar pelo menos dois iniciadores diferentes do passo de detecção»
D estabelecimento do teste dependendo das variações de nucleótidos a serem detectadas é descrito abaixo»
d) Extensão do iniciador do passo de detecção iniciador do passo de- detecção é emparelhado oom as cópias do ácido nucleico alvo ε uma solução contendo um ou mais trifosfatos de nucleósido incluindo pelo menos um trifosfato ds nucleósido marcado ou modificado, são misturados com um agente de polimerização em condiçSes que favoreçam a extensão do iniciador» Podem ser usados trifosfatos de desoxirribonucleósidos marcados (dNTPs> ou trifosfatos de didesoxirrib-onucleósida terminadores de cadeia CddNTPs}» 0 agente de polimerização prolongará o iniciador com o trifosfato de nucleósido complementar do nucleótido variável adjacente ao iniciador» 0 ácido nucleico prolongado pode ser imobilizado durante esta extensão do iniciador do passo de detecção, por exemplo, através de ligação de afinidade de uma cópia amplificada modificada ou pode ser imobilizada depois, por exemplo, através de um iniciador detector modificado por afinidade» Em ambos os casos, após lavagem da matrix ds afinidade, a marca incorporada é medida directamente na matrix após eluição» termo “trifosfato de nucleósido marcado” tal como aqui é usado refere-se a qualquer trifosfato de nucleósido, desoxinucleósido-trifosfato ou didesoxinucleósidotrifosfato, marcado com uma marca detectável ou modificado ds forma, a compreender uma fracção de ligação capaz de se ligar a uma marca detectável» 0 método de acordo com o invento não está dependente da marca usada, se bem que a sensibilidade varie dependendo da detectabilidade da marca» A única limitação quanto ã escolha da marca detectável não pertubará a incorporação do trifosfato de nucleósido marcado durante a reacção de polimerização» termo “agente de polimerização tal como aqui è usado refere-se a qualquer enzima que seja capaz de realizar elongação
de ácidos nucleicos dependente de iniciadores» Enzimas adequadas incluem par exemplo, DNA-polimerase de T7, DNA-polímerase de T4, o fragmento Klenow da DNA-polimerase ds Escherichia co1i e outras DNA-polimerases, transcriptases reversas e pol i me rases adequadas de microorganismos termófilos tais como Thsrmus aguaticus e Thermus thermophi 1 us = e? Modos preferidos de detectar variações de nucleótidos
A Figura 1 ilustra esquemáticamente uma realização do invento» 0 ácido nucleico alvo está representado por X?s, com e X^, reresentando dois resíduos de nucleótidos alternativos no sítio a ser investigado.. D iniciador do passo de detecção ilustrado na Fig» 1 está representado por Y3s e é complementar da fracção da sequência alvo começando Ímediatamente adjacente a 3S do sítio a ser investigado» Na realização do invento o iniciador do passo de detecção é hibridado com a sequência alvo e um trifosfato de nucleósído ou uma mistura de trifosfatos de núcleo— sidos seleccionados ê adicionado e deixada decorrer a reacção de extensão de cadeias em condiçSes favoráveis á elongação do iniciador«
Na realização mais simples do invento, a mistura de trifosfato de nucleósidos do invento contem apenas o trifosfato de didesoxinucleótido (ddNPJ correspondendo a Xj ou Xo (faculta— tivamente a na Figura i)« A incorporação de um ddNTP termina a reacção de extensão da iniciador após incorporação deste nucleótido, após o que é possível determinar o nucleótido variável por detecção da marca incorporada do nucleótido adicionado..
Esta realização é especialmente adequada quando a variação de nucleótidos s ser detestada consiste numa única mutação pontual (X^ -> X?). A amostra pode ser dividida em duas partes, após o que X, é detectado numa das amostras e X^ na outra. Isto permite a identificação de amostras heterozigóticas, é igualmente possível adicionar dois ou mais ddNTPs diferentes e marcados de forma diferente a uma amostra não dividida (opção b na Fig, í), Nesta realização ê possível determinar mais de uma mutação pontual que ocorra no mesmo sítio de uma amostra não dividida (X, —> X-, ou X,).
έ também possível usar um trifosfato de desoxinucleésido marcado CdNTP), o qual corresponde ao nucleotido variável a ser detectado e para determinar a incorporação desta marca. Quando se usa um dNTP, ê vantajoso, mas não necessário, adicionar ddNTPs não marcados correspondendo aos outros três resíduos de nucleótidos não marcados (opção ç na Fig, ί), A adição de ddNTPs terminadores de cadeias proporciona um meio para evitar a incorporação de NTPs possivelmente remanescentes do passo de modificação (a).
Ainda uma outra possibilidade é usar dois ou mais dNTPs diferentes ε marcados diferentemente tornando possivel a detecção de heterozigóticos numa amostrei não dividida, Qaundo se usa mais do que um dNTP marcado os resultados podem ser difíceis de interpretar se o resíduo ae nucleotido X após o resíduo de nucleotido variável na sequência alvo fôr idêntico a qualquer dos adicionados (opção d na Fig, i>.
Figura 2 ilustra esquemáticamente uma outra realização do invento, 0 iniciador do passo ds detecção na Fig, 2 é complementar de uma fracção da sequência alvo distando n resíduos de nucleótidos do nucleótido variável a ser detectado, A única
limitação relativamente ao número n de ssíduos de nucleótidos entre o extremo 3’ do iniciador do passo de detecção e o nucleótido variável é que não deve haver resíduos d-e nucleótidos idênticos ao<s) que se pretende detectar entre estss n resíduos de nucleótidos» Neste caso os trifosfates de nucleósido adicionados compreendem dNTPs ri-ão marcados complementares dos n nucleótidos entre o iniciador e o nucleótido variável e pelo menos um trifosfato de nucleósido marcado dependendo d-a variação de nucleótidos a ser detectada» Dois ou mais ddNTPs marcados diferentemente podem certamente ser usados como anteriormente descrito nas realizações ilustradas pela Figura lh e d»
A Figura 3 ilustra esquematicamente ainda uma outra realização tío método de acordo com o presente invento onde dois ou mais resíduos de nucleótidos variáveis são identifiçados» Neste caso é necessário projectar pelo menos dois iniciadores diferentes do passo de detecção» u primeiro iniciador ê seleccionado para ser complementar da sequência de nucleótidos começando imediatamente adjacente- ao primeiro resíduo de nucleótido variável (iniciador 1 na Fig» 3)= Ainda um ou dois iniciadores de detecção são empregues abrangendo também o primeiro resíduo de nucleótidos variável detectado peio iniciador 1» 0 teste pode ser a amostra em duas, sendo o iniciador 1 1 para identificar o primeiro resíduo de nucleótidos variável» Os dois outros iniciadores (iniciadores 2 e 3 na Fig» -3) são adicionados à amostra 2 para detectar α segundo nucleótido variável» Devido à imobilização da sequência de ácido nucleico alvo, a. identificaçãp de dois, ou mais nucleótidos variáveis subsequentes pode ser identificada a partir de uma única, amostra não dividida, realizando os passos de detecção sequenciadamente e incluindo um passo de eluição após a detecção do primeira nucleótido variável para remover o iniciador 1» realizada dividindo adicionado à amostra do
Qs reagentes para usar na realização do método invento pode ser proporcionado individual.mente ou pode er apresentado na forma de kit. Por exi preparados compreendendo um ou mais detecção e um ou mais trifosfatos mplo? os kits iniciadores do de nucleósidos podem ser passo de marcados.
preferencía1mente compreendendo iniciadores da amplificação mar também combinações de ados por afinidade e um ou mais correspondendo a suporte(s) sólidos» arranjo dos reagentes dentro de recipientes do kit” dependerá dos reagentes específicos envolvidos» Cada um dos reagentes pode ser introduzido num recipiente individual, mas são também possíveis várias combinações.
Q presente invento é ilustrado com os exemplos que se seguem, os quais nao pretendem ser limitantes do âmbito do invento.
Exemplo 1
Identificação do polimorfismo da apolipoproteína codões relativamente aos resíduos de aminoãcidos ÍÍ2 s 158 C“”~3S como marca
E nos usando
Síntese de oligonucleótidos
Quatro iniciadores de PCR CPÍ-P4) e dois oligonucleóti·dos do passo de detecção· (Di e Ef2) foram sintetizados num
sintetizador de DNA Applied Biosystems 38ÍA, A sequência de nucleótidos dos oligonucleótidos e a sua localização (dado como números de nucleótidos) no gene da apolipoproteína Ε (Apo E) forams
Pl! 5’-AAG GA6 TTG AAG GCC TAC AAA T Í3Ó1Ó - 36373
P3; 5’-GAA CAA CTG AGC CCG GTG GCG s (3649 — 3670)
Dl; 55-GCG C6G ACA TGG AGG ACG TG (3725 - 37443
D2s 55-ATG CCG ATG ACC TGC ASA AG <3803 - 38823
P2; 5’-TCG CGG GCC CCG GCC TGG TAC A (3914 — 38933
P4s 5’—GGA TGG AGC TGA GGC CSC GCT c <3943 - 3922)
Um grupo amina 5’ foi adicionado ao iniciador P2 com o reagente aminolink II (Applied Biosystems)» 0 grupo amina foi biotinilado usando sulfo-NHS-biotina (Pierce Chemical Co») e purificado por HPLC de fase reversa»
As amostras de DNA
As amostras de sangue venoso foram obtidas de pacientes de fenótipo Apo E conhecido que frequentam o Lipid Outpatisnt Clinic da University Cerital Hospital de Helsinki, Finland» 0 DNA de leucócitos foi extraído de acordo com processos convencionais»
Amplificação por reacção em cadeia com polimerase
DNA iniciadores PI e solução de dATP» <100 ng por amostra) foz amplificado com os P4 (concentração final ί μϊΐ) em 10® μΐ de uma dCTP, dSTP, dTTP, ®„2 mM cada, 2® mM Tris-HCl, pH 8,8, 15 mM (ΝΗ4)2SO4,
MqCL
α,ΙΧ iween 20, 0,1 mg/mi de gelatina ε 2 ( Uni ted States ( Per ki η-Ε1mer / ,5 unidades de DNA-polimerase de Thermus aquaticus Biochemical Corp») num ciclizador térmico para DNA
Cetus) durante 25 ciclos de 1 min» a 96 *C e 2 min» a 65°C= Uma amostra (3 μΐ de uma diluição lsl00) desta primeira mistura de amplificação em PCR foi transferida para uma segunda PCR» Isto foi efectuado nas condições descritas atrás e dirigido pelos iniciadores P2 e P3 biotinilados»
Captura por afinidade do DNA Apo E amplificado e biotinilado em partículas de polistireno revestidas com avidina
Cinco μΐ oe uma suspensão a 5% ίρ/v) de particulas de polistireno revestidas com avidina (©,8 pm, Baxter Healthcare Corp») foram adicionados a uma amostra de 80 gl da segunda mistura de amplificação» As amostras forma mantidas a 20 °C durante 30 min. As partículas foram colhidas por centrifugação durante 2 min, numa centrífuga Eppendorf e foram lavadas uma vez por agitação com vortex com 1 ml d-e 15 mM NaCl, 1,5 mM Na-citrato (0,1 jí hSC), 0,2 % dodecilsulfato ml de 0,1% Tween 20 em 0,15 M NaCl 7,5 (PBS)» As partículas foram trai 0,15 M NaOH durante 5 min» a. 20^ lavadas uma vez com 1 ml de 0,1% 1 Tris-HCl, pH 7,5 e duas vezes com NaCl, 40 mM Tris-HCl, p.H 7,5, A última solução de lavagem foi di' partículas foram colhidas por centf ie sódio (SDS) e uma vez com 1 , tampão de fosfates 20 mM, pH zadas duas vezes com 200 μΐ de ;iC» as partículas foram então
wssrs 2-0 «a 50 mM NsCi, 40 mhl
1 ml de €ϊ,0ί% T KBsn em 5Θ mM
suspensão das particulas na
idida em quatr •o partes e $5¾
•ifugação em tubos separados»
Identificação dos nucleótidos variáveis
As partículas portadoras do fragmento de DNA foram ressuspensas em i@ pl de 50 mM NaCl, 2ô mM MqCl„ _Λ ω ~ .
h y 40 íris-HC1, pH 7,5, contendo 2 pmoles do iniciador do passo de detecção, 0 oligonucleótido Dl localizado imediatamente adjacente ao nucleótido variável número 3745 Ccodão Í12, T ou C) foi adicionado a dois dos tubos e o oligonucleótido D2 adjacente ao nucleótido variável número 3883 Ccodão 158, T ou Cí a dois tubos» □ oligonucleótido foi emparelhado com o molde de DNA por aquecimento das amostras a ó5’:'C durante 2 min» e deixando-os arrefecer até 20°C» Um pl de ditiotreitol β,ΙΜ e trifosfatos de desoxinucleótidos CdMTP) e trifosfatos de didesoxinucleótidos CddNTP) marcados com £‘“'^'81 foram adicionados para dar concentrações 1 cada num volume final de tõpl como se segues un
- para identificação de Ts C'‘J3S-dTTP (Amersham), ddCTP e ddGTP a dois tubos,, um em que o oligonucleótido Di e um em que o oligonucleótido D2 foram emparelhados»
- para identificação de Cs 3S-dCTP CAmersham), ddTTP s ddGTP a dois tubos, um em que o oligonucleótido Dl e um em que o oligonucleótido .02 foram emparelhados»
Dois pl C3U) de DNA-polimerase de T7 CSequenase , United States Biochemical Corp») foi adicionado a cada um dos tubose a reacção decorreu durante 6 min» a 42°C» As micropartículas foram lavadas a 20°C por agitação com vortex duas vezes com 1 ml de 0,1 x SSC, 0,2% SDS e duas vezes com 0,1% de Tween 20 em PBS» Para eluição dos produtos de reacção as partículas foram fervidas em 200 pl de H~0 durante 5 min», arrefecidas em gelo e centrifugadas durante 2 min» numa centrífuga Eppendorf» A radioactividade eluida foi medida num contador de cintilação liquida»
- s resultado de uma experiência pos E2/E2 (T/T no codão 112, codão 112, C/C no codão 158),
foram quatro amostras dos fenótiT/T no codão 158), E4/E3 ÍT/C no
E2/E3 (T/T no codão 112, T/C no
codão 158) analisados se segues © E4/E4 i como desc (C/C no :r.i.to atrá codão 112, i s e está, a C/C no codão p rssentad o na 158) foram tabela que
Amostra Fenótipo Detector Radioactividade eluida Resultado
n2 (codão) í cpm)
Reacçao T Reacção C
1. E2/E2 Dl(112) 18400 625 T/T
2. E4/E3 Dí(112) 73700 58Í00 T/C
3. E2/E3 DÍC112) 1120Θ0 1360 T/T
4. E4/E4 Dí(112) 2310 99700 C/C
5. Sem DNA Dl(112) 429 1195
1. E2/E2 D2Í158) 67000 7000 T/T
r-J E4/E3 D2C158) 35100 C/C
3. E2/E3 D2Í158) 44600 T/C
4. E4/E4 D2C158) 1485 193ΘΘ C/C
5. Sem DNA D2ÍÍ58) 686 760
Conclusão
As diferenças nos valores de cpms obtidos nas
T e C permitiu a identificação inequívoca do nucleótido reacções variável
no codão 112 e no codão 158 nucleótido vari· minado como descrito atrás iniciadores P3 e P2 biotin detecção foram então usados oposta do gne ApoEs nas quatro amostras de DNA» ;vel pode ser facultativamente determas realizando a segunda PCR com os .lados» Como iniciadores do passo de iniciadores complementares da cadeia
D4; 55-STA STB CAC CAB BCB 6CC BC <3765 - 3746) D5s 55-BBC CTB GTA CAC TBC CAB BC <3903 - 3884)
Exemplo 2
Identificação do nucleótido variável no codão 112 do gene da apolipoproteína E usando dupla marcação e E'^P3) numa única reacção»
Oligonucleôtidos e amostras de DNA iniciador de PCR PI, os iniciadores de PCR biotinilados P2, P3 e P4 ε o iniciador do passo de detecção Dl descrito no Exemplo 1 foram usados neste exemplo» 0 DNA foi extraído das amostras de sangue como descrito no Exemplo í»
Amplificação por reacção em cadeia coai polimerase e captura por afinidade
A amplificação por PCR e a captura por afinidade dos fragmentos amplificados foram realizadas como descrito no Exemplo 1. No último passo de lavagem cada uma das amostras foi dividida em duas partes.
Identificação do nucleotido variável no codão 112
As partículas foram rsssuspensas em 1© (ver Exemplo 1) contendo 2 pmoles do iniciador
μ.1 de tampão do passo de detecção Dl o qual híbrida 33 imediatamente adjacente ao nucleóA reacção de emparelhamento foi Adicionou-se um pl de ditiotreitol tido variável no codão 112 realizada como no Exemplo 1= ©, ÍM«
A identificacão do nucleótido variável ÍC ou T) foi agora, feita, pela adição de díMTPs marcados com C‘“'H3 e com C^^Pj
Tf Τ·-~ simultâneamente a uma amostra. Usou-se C’*H3-dCTP e C^Pl-dTTP ou
-y -yz~, —f
C'“'H3-tíTTP ε C^Pl-dCTP (Amersham)« Os C'“‘H3-dNTPs foram adiciona-y·^ dos para, concentrações ds ΙμΜ- Os C^^Pl-dNTPsforam diluídos em dNTPs não marcados para dar concentrações finais de ίμίΐ e actividades específicas semelhantes às dos E'-’H3-dNTPs» Todas as reacções continham ΙμΜ ddGTP. 0 volume final foi de 15 μΐ. Três unidades de DNA-polimerase de T7 foi adicionada e os processos de marcação e la.va.gem foram realizados como no Exemplo 1. A radioacTf Tf^í tividade E~‘H3 e Ε'^ΡΙ eluida. em cada, amostra foi medida simultS— neamente num contador de cintilação liquida 1219 Rackbeta 1219 íPharmacia/Wallac) marcando a janei para C'~!H3 nos canais 10-90 e
Τ' as janelas para Ε'-'^ΡΙηοε- canais 130-22©«
A Tabela abaixo mostra o resultado de uma experiência, na qual três amostras, uma do fenótípo E2/E3 CT/T no codão 112), uma dos fenótípo*
Ε4/Έ4 (C/C no codão 112) e uma do fenótípo
E3/E4 CT/C C'-‘2P3-dTTP no codão 112) foram ou usando C'“Ή 3-dTTP e analisadas usando E C‘’,2P3™dCTPs '-‘Kl-dCTP i
Amostra dNTPs marcados Radioactividade elu ~H; Ca.10-90 32P; ida (cpm) Ca» 130-221
E2/E3 E3H3dCTP/E E3H3dCTP/E32F3dTTP ’32P3dTTP Ó07S 502 > 186 7870 E4/E
E2/E3 E3H3dCTP/E32P3dTTP 5120 598€i
Sem DNA E‘'H3dCTP/ E'i2P3dTTP 172 148
E2/E3 Ε H 3 dTTP/ E · P 3 dCTP 108000 183
E4/E4 E3H3 dTTP/Eo2P3 dCTP 394 4932
Ε3/Έ4 Ε'“Ή 3 dTTP/ E 32P 3 dCTP 7800 514€*
Sem DNA E3H3dTTP/E32P3dCTP ·? X / í 44
ι
Conclusão
Os sinais obtidos permitiram a identificação do nucleótido variável no codão 112 das amostras não divididas usando dois dNTPs portadores de marcas diferentes» Neste Exemplo apenas metade de cada amostra foi analisado por reacção» Assim a outra metade da amostra pode ser usada parâ analisar a variação de nucleótidos no codão 158 do gene ApoE»
Exemplo 3
Identificação do nucleótido variável no codão gene da apolipoproteína E após tuna única amplificação por em cadeia com polimerase»
158 do reacção
Oligonucleótidos e -amostras de SNA
Neste Exemplo o iniciador biotinilado P2 s o iniciador P3 foram usados na amplificação por PCR. 0 iniciador do passo de detecção foi D2 (ver Exemplo i). G DNA foi extraído a partir de sangue venoso como descrito no Exemplo 1»
Amplificação por reaccão em cadeia com polimerase e captura por afinidade □ DNA (Í00 ng por amostra) iniciador P2 biotinilado e com o iniciado ΙμΜ) nas condições descritas no Exemplo ção5 Realizou-se apenas um processo de a em 30 ciclos de 1 min» a 55 °C e 1 min» a foi amplificado com o r P3 (concentração final 1 com a seguinte excepm ρ1i f icação consistindo
A captura por afinidade em partículas de polistireno revestidas com avídina foi feita como no Exemplo 1» Cada uma das amostras foi dividida em duas partes no último passo de lavagem»
Identificação do nucieótido variável no codão 158
As partículas foram ressuspensas em 10
Cver Exemplo
1) contendo pmoles do iniciador μΐ de tampão do passo de detecção D2 o qual híbrida 3’ imedíatamente adjacente ao nucleótido variável no codão 158.·. A reacção de empareihamento foi realizada como no Exemplo 1, Adicionou-se um μΐ de ditiotreitol •yt—
0,lM.dNTPs marcados com C~’^S1 e ddNTPs foram adicionados às reacçSes T e C como especificado no Exemplo 1» A reacção de extensão do iniciador, o processo de lavagem e a eluição da radioactividade ligada foi feito como descrito no Exemplo 1«
Três amostras com os 158), E2/E3 CT/C no codão 158) respectivamente, foram analisadas está apresentado na Tabela abaixo fsnótipos E2/E2 (T/ e E4/E3 (C/C no , 0 resultado desta
T no codão codão 158),
Amostra Radioactividade eluida (cpm) Resultado
reacção í reacção C
E2/E2 64600 7746 T/T
E2/E3 39600 22700 T/C
E4/E3 5640 53500 C/C
Sem DNA 1325 191Θ
Con c 1 usão método permitiu a identificação correcta do nucleótido variável na posíçães Í58 também quando o fragmento de DNA apo E foi enriquecido por uma única PCR com um par de iniciadores,-.
Exemplo 4
Identificação do nucleótido variável no codão 112 do gene da apolipoproteína E com detecção enzimática»
Oligonucleõtidos e amostras de DNA iniciador de PCR Pl, os iniciadores de PCR biótinilados P2, P3 e P4 e o iniciador do passo de detecção Dl descrito no Exemplo 1 foram usados neste exemplo» 0 DNA foi extraído das amostras de sangue como descrito no Exemplo í»
Amplificação por reacção em cadeia com polimerase
DNA <100 ng por amostra) foi amplificado com os iniciadores Pl e P4 numa concentração de ίμΜ como descrito no Exemplo 1» Três μΐ ds uma diluição ls!00 desta primeira de PCR foi novamente amplificada usando o iniciador biotini lado P2 e o iniciador P3 numa concentração de 0,1 μΜ» A segunda PCR foi ϊ
realizada d ur an te min. a 72 °C» ciclos de 1 min. a 96 °C, 1 min» a 55’:’C e 1
Captura por afinidade do DNA amplificado ea cavidades de microti— tulação revestidas com avidina
Duas quantidades de 15μ1 por amostra da segunda mistura de PCR foram transferidas para cavidades de microtitulação ÍNunc, Maxisorb), que tinham sido revestidas com estreptavidina por adsorção passiva.
cada uma das cavidades adicionou-se 30 ul
QS , 0,1M Tris-HCl, pH 7,5 CTBS)« As tiras de microtitulação foram incubadas durante 3 horas a 37°C com agitação suave» As cavidades foram lavadas três vezes com 200 μΐ de 0,1% Tween 20 em TBS a 20°C. As cavidades foram então tratadas duas vezes com 100 gl de 50 mM NaOH durante 5 min» a 20°C seguido de lavagem duas vezes com 200 gl de 0,1 x SSC, 0,2%
0„1% Tween Ξ0 sm 0,15M NaC1
SDS, duas vezes com 0,1% Tween em TB;
uma vez com 0,1% Tween em 50 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, pH z,o e finalmente uma vez com. 0,01% de Tween 20 em 50 mM NaCl, 4« mM Tris-HCl, pH 7,5=
Identificação do nucleétido variável
Dez pmoles do oligonucleótido Dl foram usadas para cada cavidade em 50 μΐ de 0,9M NaCl, 0,2M Tris-HCl, pH 7,5« As cavidades foram aquecidas a 65°C durante 2 min» e deixadas arrefecsr lentamente para 20°C» A mistura foi rejeitada e as cavidades foram lavadas uma vez com 200 μΐ de 0,25' M NaCl, 0,2M Tris-HCl, pH 7,5 a 20°C= Adicionou-se 50 μΐ de uma solução consistindo era digox.igenina-11-dlíTP ΙμΜ íBoehringer-Mannheim), 1 μΜ ddCTP, ΙμΜ
ddGTP, oligoniucleótido Di 0,2 μΜ, ditiotreitol ó mM, mM
NaCl, 15 mM MgCl^, 30 mM Tris-HCl, pH 7,5 e 3 unidades de DNA-polimera.se de T7» As tiras de microtitulação foram incubadas a 42uC durante 10 min» e as cavidades foram lavadas duas vezes com 200 μΐ de 0,í x SSC, 0,2% SDS e três vezes com 200 μΐ de 0,1% Twesn 20 em TBS» Em seguida adicionou-se 60 μΐ de uma diluição de Ís500 de um um conjugado anti-digoxigenina-fosfatas-e alcalina (Boehring-er-Mannheiro) numa solução ds ô,í% Twesn 2©, í% ds albumina sérica bovina em TBS e as tiras de microtitulaçSo foram incubadas a 37°C durante 2 horas com agitação suave» As cavidades foram lavadas seis vezes com 0,1% Tween 20- em TBS e uma vez com tampão IM di©tanolamina-©,5 M MgCI,,, pH 10. Finalmente adicionou-se £>& gl de 2mg/ml de p-nitrofenilfosfato em tampão alcalino» Após revelação da côr durante 20 min» à temperatura ambiente adicionou-se IO© gl de tampão alcalino e a absorvSncia do produto formado foi lida a 405 nm num leitor espectofotométrico»
Duas amostras com os fenótipos E2/E2 ÍT/T no codão 112) e E4/E4 CC/C no codão 112) foram analisadas» 0 resultado desta experiência está apresentado na Tabela abaixos
Amostra Absorvancia a 405 nm (amostras ém duplicado) Resultado
E2/E2 1,180 θ,707 T/T
E47E4 0,040 0,010 c/c
Sem DNA 0.025 0,010
Conclusão □ nucleótido variável no codão ÍÍ2 foi identificado após incorporação do digoxigenina-ll-dUTP e subsequente detecção com um anticorpo marcado com fosfatas© alcalina»
Exemplo 5
Identificação de polimorfismo da apolipoproteína E no codão do residuo de aminoácido 1X2 usando marcas fluorescent.es
Oligonucleótidos e amostras de DMA iniciador de PCR Pl3 os iniciadores de PCR biotinilados P2, P3 e P4 e o iniciador do passo de detecção Dl descrito no Exemplo 1 foram usados neste exemplo» 0 DNA foi extraído das amostras de sangue como descrito no Exemplo 1»
Amplificação por reacção em cadeia com polimerase e captura por afinidade
DNA CIO© ng por amostra) foi amplificado com os iniciadores PI e P4 numa concentração de ΙμΜ como descrito no
Exemplo 1« Trãs pl de uma diluição Ísi00 desta primeira mistura de PCR foi novamente amplificada usando P2 biotinilado e o iniciador P3 numa concentração de 1μΚ« A segunda PCR foi realizada durante 25 ciclos de 1 min» a 96*0, 1 min» & 55°C e í min» a 72°C. Os fragmentos de DNA amplificados biotinilados foram capturados em partículas de polistireno revestidas cóm avidina como no Exemplo 1« Cada uma das amostras foi dividida em duas partes no último passo de lavagem»
Identificação do nucleótido variável no codão 112
As partículas portadoras do DNA amplificado foram ressuspensas em 10 μΐ de tampão (ver Exemplo 1) contendo 5 pmoles do iniciador do passo de detecção que hibrida imediatamente 3’ relativamente ao nucleótido variável no codão 112« A reacção de emparelhamento foi realizada como no. Exemplo í. Um μΐ de ditiotreitol 0,1$ foi adicionada a cada um dos tubos» Para identificação de Ts 400 pm de dtíTTP fluorescente (terminador T? Dupont, NEK.-528T) foi adicionada a um dos tubos» Para identificação de C, 40 pm de ddCTP fluorescente (terminador C§ Dupont, NEK-519C) foi adicionado ao outro tubo» A ambos os tubos adicionou-se cinco unidades de DNA-polimerase ds T7 para um volume de reacção final de 15 μΐ« A? reacção decorreu durante 5 min» a 37*C« As partículas foram lavadas como descrito no Exemplo ί e os produtos de reacção foram eluidos. A fluorescência do material eluido foi medida num espectrofotómetro de fluorescência íFferck/Hitachi, F—1000? usando 490 nm como comprimento de onda de excitação e 550 nm para medição da fluorescência emitida»
Interpretação do resultado
Um sinal positivo apenas da reacção T mostra que o indíviduo έ homozigótico para um resíduo de císteina na posição 112»
Um sinal positivo apenas da reacção C mostra que o indíviduo é homozigótico para o resíduo arginina na posição 112=
Sinais positivos de ambas as reacções mostram que o indíviduo é heterozigótico, ie» tem apenas um alelo com um resíduo císteina e um alelo com um resíduo arginina na posição 112 do gene da apolipoproteína E»
Exemplo 6
Detecção da mutação de anemia das células falsiformes na sequência codificadora do codão ò do gene da B-globina humana»
Síntese de oligonucleôtidos
Os iniciadores de PCK foram projectados para conterem extremos 35 que não emparelham com o gene ds ê-glo-bina que seria altamente homólogo» Os dois iniciadores de PCR, designados Bl e B2 e um iniciador do passo de detecção B3 forma sintetizados pelo método descrita no Exemplo 1» 0 iniciador B2 foi biotinilado como descrito no Exemplo i. A sequência de nucleótidos dos oligonucleó tidos e a su.a localização no gene oa íl—globina (com números de nucleótidos relativos ao sítio as seguintess
Bl í 5S- -CAT TTG CTT CTG ACA CAA
B3: cr 5. w -CAT GGT GCA CCT GAC TCC
B2-. 5?- -CAA CTT CAT CCA CGT TCA
de iniciação da transer ição) são
CT C —49 — —3®) TG (-1 - 19) CC (73 — 54),
Amplificação oir reacção em cadeia com polimerase e captura por afinidade
DNA foi extraído de amostras de sangue como descrito no Exemplo 1. 0 DNA Cl®® ng por amostra) foi amplificado cora os iniciadores Bl ε B2 biotinilado como descrito no Exemplo 3. Os fragmentos de DNA amplificados ε biotinilados foram capturados em partículas de polistireno revestidas com avidina como no Exemplo 1, Cada uma das amostras imobilizadas foi dividida em duas partes»
Identificação da mutação A -> T no codão 6
As partículas portadoras da amostra ds DNA amplificado foram ressuspensas em 1® μΐ de tampão (ver Exemplo 1) contendo 2 pmoles do iniciador do passo ds dstscção B3» o qual hibrida imediatamente 3? relativamente ao sitio da mutação no codão 6= A reacção de emparelbamento foi realizada como no Exemplo 1« Adicionou-se dNTPs marcados com e ddNTPs para dar trações de ®,2 μΜ num volume final de 15 p.I como se segues concen
- para identificação de alelo normal CA)s r35Sj-ATP, ddTTP, ddSTP para um dos tubos L t5
- para identificaçãop da mutação íT); £ S3—dTTP, ddATP, ddSTP para o outro tubo.
Adicionou-se uma unidade de DNA-polimerase de T7 e a reacção decorreu durante 5 min» a 37°C» As partículas foram lavadas, os produtos de reacção foram eluidos e a radioactividade eluida foi medida num contador de cintilação líquida como descrito no Exemplo í .
Interpretação dos resultados
Um sinal positivo apenas da reação A mostra que o indíviduo é homozigótico e normal»
Um sinal positivo apenas da reacção T mostra que o indíviduo é bomozigótico para a mutação das células falsiformes.
indíviduo
Um sinal positivo para ambas as é portador da mutação das célula reacções mostra que o • falsiformes num alelo
i.e» ê beterozigótico.
nucleótido variável pode facultativamente ser deter— minado como descrito atrás mas realizando PCR com o iniciador Bi biotinilado e com o iniciador B2» Como iniciador do passo de detecção é então usado um iniciador complementar da cadeia oposta do gne da |5~gobinas
B4s 5?-CAB TAA CGS CAB BCS BCC BC (40-2Í)
Exemplo 7
Identificação da deleção delta F508 na fibrose cística
Síntese de oligonucleôtidos inicadores
Dois iniciadores de amplificação CCF1 e CF3) s um iniciador do passo de detecção ÍCF2) foram sintetizados como descrito no Exemplo 1» Os iniciadores foram projectados com base na sequência de nucleótidos conhecida do gene CF (Riordan et al,, Science 1989? 245; 1066-1072)« A sequência e a posição no gene CF dos iniciadores forams
CFl; 5?-CTS GA8 CCT TCA 8A8 8GT AAA AT-3? {1555-1577)
CF2; 5s-TSS CAC CAT TA A AGA AAA TAT CAT-3’ í1629-1652)
CF3; 5S-CAT 8CT TTA AT8 ACG CTT GTA TA-3’ {1703-16S1)
iniciador CF3 foi biotinilado como descrito no
Exemplo í»
As amostras de DNA
DNA fibrose cística relativamente â.
alvo foi extraído de leucócitos de doentes com , os quais tinham sido clinicaménte caracterizados mutação delta F50S, de acordo com métodos convenC&QO&Í.& «
Amplificação por PCR e captura por afinidade do DMA alvo
DNA C100 - 200 ng por amostra) foi amplificado com CF3 biotinilado e com o iniciador CF1 (concentrações finais 0,15 μΜ e 0,6 μΜ, respectivamente) nas condições descritas no Exemplo 1, com a seguinte excepçãos Foi realizado apenas um processo de amplificação consistindo em 31 ciclos de í min» a 96'-‘C, 1 min a 60°C e 1 min a 72°C»
A captura por afinidade em cavidades- de microtitulação revestidas com estreptavidina foi realizado como descrito no Exemplo 4»
Identificação do nucleótido variável
A extensão do iniciador do passo de detecção foi realizada como descrito em 50 p.l de 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 1,5 mM MgCl?, 15 mM (NHá)^30^, 0,1% Tween 20, 0,01% de gel tina contendo 0,2 μΜ do iniciador CF2 e 2 unidades- da DNA-polimerase Taq» Para identificação de Τ, 1 pCi de 'Ή-dTTP (Amersham) e 0,8 μΜ ddSTP e para identificação de C, 2 pCi de '“‘H-dCTP, 0,8 μΜ ddTTP foram adicionadas em duas cavidades paralelas e as placas foram incubadas durante 10 min a 55*C» As cavidades foram lavadas três vezes com 200 μΐ de ®,i% Tween em tampão TBS- e a marca incorporada foi eluida com 60 μΐ de 50 mM NaOH durante 5 min à temperatura ambiente e medido num contador de cintilação liquida»
Três amostras com os genótipos C/C, T/T e T/C no nucleótido 1653 do -gene CFTR, i»e» um homozigótico normal, um homozigófico delta F508 e um heterozigótico, foram usados neste exemplo métodos
Estas amostras foram previamente genotipadas por outros (Kere et al., Hum, Bsnet.-.« 1990; 35;413~415>» Os resulta-
dos na tabela abaixe genótipos é clara» :í mostram que a identificação de cada um dos
Amostra 3H-dTTP ícpm) 3H—dCTI (cpm) upmU/cpmT Γ-- - i. - X í bsno ti po
Normal homozigótico 349 9832 28,2 c/c
delta F50S homozigótico 1Í539 . S--~ 0 4 005 T/T
heterozigótico 11358 7457 0,66 T/C
x) nucleótido 1653 do gene CFTR.
Conclusão
Os genótipos das amostras foram verificados de acordo com as razões cproC/cpmT após incorporação de '“Ή-dTTP e ‘“‘HdCTP,
Exemplo 8
Detecção de mutações pontuai? do codão 12 no qene K-ras» sequência cotíificados-s
Síntese ds oligonucleótidos
Dois iniciadores de PCR, designados Rl e R2, respectivamente, foram sintetizados e o inicsdor Rl foi biotinilado como descrito no Exemplo 1» Para detecção de uma mutação do resíduo glicina (codificado por ΒΒΊΓ) na posição 12, sintetizaram—se dois iniciadores do passo de detecção, R3 e R4» R3 foi usado para detectar um <3 alterado na primeira posição do codão 12« A sequência e posição (como números de nucleôtidos) dos oligonucleótidos no primeiro exão do gene K—ras está apresentado abaixo?
Rl s 5’ -ATS ACT SAA TAT AAA CTT STS (1-20)
R2: crj w -TTC STC CAC AAA ATS ATT CTB (94—74)
R3 s 55 -AAS BCA CTC TTS CCT ACS CCA <56-36)
R4í 5J -ASB CAC TCT TBC CTA CSC CAC í55—35)
Amplificação por reacção em cadeia com polimerase, captura por afinidade e emparelhamento dos iniciadores do passo de detecção
DNA foi extraído de amostras de células tumorais por métodos convencionais usando digestão com proteinase K, extracção com fenol e precipitação com etanol» i©ô ng do DNA purificado foi amplificado com o iniciador biotinilado Rl e o iniciado}·
R2
usando as condições descritas no exemplo -5, de emparelhamento do iniciador ser de 5€í°C.
excepto a temperatura 0 DNA amplificado foi capturado em partículas de polistireno revestidas com avidina, desnaturado a as partículas foram lavadas como descrito no Exemplo ί. A amostra de DNA imobilizado foi dividida por dois tubos. As partículas num dos tubos foram ressuspensas em 10 μΐ de tampão (ver Exemplo 1) contendo 2 pmoles do oligonucleótido R3, a qual emparelhará imediatamente 3!‘ relativamente ao C complementar do segundo Θ no codão 12= Mo outro tubo usou-se 10 μΐ de tampão contendo 2 pmoles do oligonucleótido R4 que emparelha com 3’ do C complementar do primeiro G no codão 12= A reacção de emparelhamento foi realizada como no exemplo 1« Adicionou-se um μΐ de ditiotreitol <5,1 M = A mutação no codão 12 foi analisada de acorod com o método A ou com o método B abaixo= ft. Identificação de uma mutação qli -> não-qli no codão 12
Uma mistura de C’~'°B3-dATP, C^Bl-dBTP, C^SldTTF e ddCTP foram adicionados a ambos os tubos para dar uma concentração final de ΙμΜ cada em 15 μΐ. Uma unidade de DNA—polimerase de T7 foi adicionada e a reacção deixada prosseguir durante 5 min. a 37°C. fts partículas foram lavadas, os produtos de reacção foram sluidos e a radioactividade eluida foi medida num contador de cintilação líquida como descrito no Exemplo 1,
Um sinal positivo do tubo, em que R3 foi emparelhado, mostra que pelo menos parte dos genes K-ras na amostra mudou para uma resíduo de valina (codificada por STT), de ácido aspártico (BftT) ou de alanina (GBT) na posição 12.
Um sinal
4o positivo do tubo, em que P4 tinha sido emparelhado mostra que existe um resíduo cisteina íTGT), serina <ABT> ou arginina CCTG) na posição 12 em pelo menos parte dos (genes k-ras„
A ausência de sinal em ambos os tubos mostra que o codão 12 em ambos os alélos é o G6T normal codificador ds um resíduo qlicina»
B. Caracterização da mutação no codSo 12
A caracterização exacta da mutação foi adição a a.mboo os tubos de uma mistura de Γ',Λ“Ρj~dATr τ e i t -3. pe 1 e *72*
CJjS3-d6TP, f'H3-dTTP e ddCTP para uma concentração final de 1 μΜ em 15 μΐ. O ‘“p 3 “dATP e o EwUS3-dBTP foram diluídos em dATP e dSTP não marcados, respectivamente, para dar actividades específicas semelhantes às do C‘~‘H3-dTTP (cerca de l-S® Ci/mmole)« A diferença na eficiência de contagem de cintilação entre os três rsdioisótopos foi tomada em consideração para preparar a mistura de reacção, a qual dará iguais valores de cpm nos canais usados para medição (ver abaixo)»
Uma unidade de DNA-polimerase de T7 foi adicionado e a reacção deixada decorrer durante 5 min» a 37°C« As partículas foram lavadas e os produtos de reacção foram eluidos como descrito no Exemplo 1»
A radioactividade emitida por E'~'H3, C'“='~!S3 e l^Pj no produto eluido foi medido simultãneamnete num contador de cintilação» Num contador Rackbeta 1219 íPharmacia/Wallac3 usaram—se as seguintes janeias:
para medição de canais í®-9®, para medições de ['‘^53 canais 95-145 e 170-220» Antes da interpretação do ções para a passagem de sinal de <24%) e do E?] para os canais de
para medição de C'“’i'P3 canaisresultado foram feitas correc['33 para os canais de C''H3 E35S3 (13%).
Os resultados estão interpretados conforme especificado na tabela abaixo:
Iniciador do passo de detecção 3H Sinal de 33S 30 P Codão12 Resultado Aminoácido
R3 -r - - GAT ácido aspártico
R3 - -s- - GCT alanina
R3 - - -5- GTT valina
R3 - - — SST glicina
R4 + — — AGT serina
R4 - 4- CGT arginina
R4 - - 4- TST cisteína
R4 — — GGT glicina
A mutação no codão 12 do gene K-ras pode facultativamente ser determinada como descrito atrás, mas realizando PCR com o iniciador R2 faiotinilado e com o iniciador Ri. Como iniciador do passo de detecção foi então cadeia oposta do gene K-rass
R5: 5’-AAC TTG TGG TAG TTS GAG Rói 5’-ACT T6T GGT AGT TGG ABC usado um iniciador complementar da
CT (14 - 33) TG (15 - 34)
Detecção de mutações pontuais na sequência codificadora do codão 12 no gene N-ras ns presença de células não mutagenizadas
Síntese de oligonucleótidos
Dois iniciadores de PCR, designados Xi e X2, respectivamente, foram sintetizados e o iniciador XI foi biotinilado como descrita no Exemplo 1» Para detecção da nucleótido no codão 12 ÍG substituído por iniciador X3 do passo de detecção» A sequência e posição (como números de nucleótidos) dos oligonucleótidos no primeiro exão do gene N-ras estão descritas abaixo?
mutação do segundo A) sintetizou—se um
χΐϊ 5’ —SAC TGA GTA CAA AlT GGT GS (3-22)
X2s 5?-CTC TAT GGT GGG ATC ATA TT (111-91)
X3s 5’-ACT GGT GGT GGT TGG AGG AG (15—34)
As amostras da DNA
Uma linha celular que se sabe ser portadora de uma transição de nucleótidos (G -> A) na segunda posição do codão 12 do gene N-ras (linha celular PA-1, ATCC CRLÍ572) foi usada como sistema modelo para simular uma. situação em que as amostras de células de doentes com AML, poderão ser analisadas relativaments ϊ
a células mutagenizadas residuais em número mínimo durante o seguimento do tratamento dos doentes» normais foi e misturados a 0,1 /» de
DNA de células PA-í e de linfócitos humanos extraído por métodos convencionais como no Exemplo 7 para dar uma série de amostras representando 1007 célu1as mutagen izadas,
Amplificação por reacção em cadeia oom polimerase uNA extraído CIO® ng por amostra) foi amplificado usando os iniciadores Xi ε X2 nas condiçSes descritas no Exemplo
Captura por afinidade em partículas magnéticas revestidas com estreptavidina e emparelhamento dos iniciadores do passo de detecção
Streptavid ίπ, min a 20 °C as
Oitenta μΐ da mistura de amplificação e 20 μΐ de ÍM NaCl foi adicionado a 300 pg de esferas magnéticas de polistireno revestidas com estreptavidina (Dynabeads R M-2805
Dynal AS), As amostras foram mantidas durante 3€s esferas foram separadas da mistura de reacção usando um concentrador de partículas magnéticas CMPC-E, Dynal AS) e a mistura foi rejeitada. As esferas foram lavadas três vezes com 1 ml de 0,5M NaCl em tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5, 0,17 Tween 20 e tratadas duas vezes com í®0 μΐ de b® mM MaCl, 2® mM MgCl7,, 40 Tris-HCl, pH 7,5, contenda 2 pmoles da iniciador do passo detecção, X3» 0 iniciador foi deixado mM de
DNA emparelhar com o
molde durante 210 min a 37*0» Um μΐ de ditiotreitol 0,1 M, 15 pmoies de dTTP marcado com Ή s 1 unidade de DNA-polimerase de T7 (United Stated Biachemical Corporation) foram adicionados para dar um volume final de 15 μΐ. A reacção foi deixada decorrer durante 5 min. a 37°C„ as esferas foram lavadas 3 vezes e tratadas com Í00 μΐ tíe 50 mM NaOH, 0,15 M NaCl durante 5 min a 20°C. A radioactividade eluida foi medida num contador de cintilação líquida. Os resultados estão apresentados na Tabela abaixos
Detecção de mutações pontuais minoritárias em células PA-í
Células mutagenizadas <%) ~'H incorporado (cpm)t
5Ô 23 @00
5 3 4@@
fc^,5 80©
0 49@
Ϋ) Incorporação de '’Ή correspondendo a A no codão 12 (GAT)
Conclusão resultado mostra que o método de acordo com o presente invento detecta quantidades tão pequenas como 0,25% de DNA N—ras monoalélico mutagsnizado de um fundo de DNA normal. Esta sensibilidade está bem na gama necessária para fazer o despiste de doentes com AML e para controlar as mutações identificadas durante o tratamento e para o seguimento da doença»
Ί,
Exemplo 10
A detecção de mutações pontuais (A-T) na sequência codificadora do codão 215 Co número da sequência de aminoácidos è relativo à prolina NH_. terminai) do gene da transcriptase reversa de HIV-Í.
Síntese de oligonucleótidos
Dois iniciadores de PCR CHI e H2) ε um iniciador do passo de detecção CH3) foram sintetizados pelo método descrito no Exemplo i» 0 iniciador H2 foi biotinilado como descrito no Exemplo i» A sequência de nucleótido sdos oligonucleótidos e sua localização no gene da transcriptase reversa de H1V--Í ía numeração de nucleótidos está de acordo com Ratner et al», 1985, Wature 313 s 277-281) são as seguintes?
His 5' -GAG AAT CCA TAC AAT ACT CCA í2z8ó-2A0ó)
Η2ϊ 5' -TAA CCC ATC CAA AGG AAT GGA í 2824-2804)
H3s 5' —ATC TGT TGA GGT GGG GAC TT (2752-2771)
Amplificação por reacção em cadeia com polimerase e captura por afinidade
DNA foi extraído de células infectadas com HIV-1 como descrito no exemplo 1» 0 DNA í100 ng por amostra) foi amplificado com os iniciadores Hi e H2 (concentração final O,2 mM) como
temperatura de emparelhaser 50*C« Os fragmentos de DNA amplificados e capturados ens cavidades de placas de microticom estreptavidina como descrito no Exemplo 4» descrito no exemplo 1 com excepção de a mento do iniciador biotinilados foram tulação revestidas
Cada uma das amostras foi fragmentos de DNA ligados foram desnaturados e lavados ligada a duas cavidades ãs cavidades da placa de como descrito no Exemplo 4» paralelas» Os microtitu1ação
Identificação da mutação ft - l no codão 215 emparelnamento do iniciador de detecção H3 e a reacção de detecção foram feitos 10 min em 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, v,1% Tween 20, 0,01% Tween 20, 0,0 μΜ contendo para a reacção As 1 Amersham, UK), 0,8 μΜ de ddTTP e ss. mu i rsneamen te ςΑΟΓ rh uíV L.· Ul
1,5 mM MgCl^lS mM CNH 1% gelatina e iniciador pCi de '-‘H-dATP Í82 Ci
41 2 45
H3 0,2 7mmole, ddCTP e 1 U de DNA-polimerase
Taq (Promega). Para a reacção Ts IpCi de '‘H-dTTP C98 Ci/mmol) e 0,8 μΜ de ddATP e ddCTP» As cavidades foram lavadas três vezes com 0,1% Tween 20 em TBS e a radioactividade foi eluída com 60 ml de 50 mM NaOH durante 5 min à temperatura ambiente» A radioactividade eluida foi medida num contador de cintilação líquida»
Interpretação dos resultados
Um sinal positivo apenas da reacção A mostra que o isolado virai é do tipo selvagem» Um sinal positivo apenas para a reacção T mostra qus o isolado virai é portador de uma mutação no primeiro nucleótido do codão 215» Consequentemente, o aminoácido Tre mudou para Fen ou Tir» As reacçSes positivas em ambas as
reacções mostra que o vírus ê uma população mista de tipo selvagem e de vírus mutante»
Os determinadas amplificação nucieotidos variáveis nos codões 6/ e 7© poderão ssr de forma semelhante a partir do mesmo produto de
Figura 1.
Iniciador do passo de
detecção; 55-Y YYYYYYYY
Sequência alvo
imobilizada; 3?-X xxxxxxxxx^xxxxxxxxx- -fracção de ligação
Trifosfato V
de nucleósidos «icl .Í.C XOnâdoS κ cã } dd¥, ou ddY,_ I
b) ddY | e d d
c> dY4 Ce ddYr,, X · )
d> dY ε dY\+· (se X,, xí X xí forem diferentes de X’
Figura 2.
Iniciador do passa de dsteccãos 5’-YYYYYY
Sequência a 1 vo imobilizadas 3’-ΧΧΧΧΧΧ<X} X,X?X??XXXXXXXX~fracção de ligação η 1 '
Trifosfato de nucleósidos adio i on ad os s dY„ s ddY. ou ddY_ i-n 1 2 (apenas se Xj_n for diferente de ouX7)
Figura 3.
Passo de dstscção Iniciador is Iniciador 2s Iniciador 3;
£ «-vywvvwvv
U I 5 J i « i ί l \ ι
5S-YYYYYYYYYY,
Sequência alvo imobilizadas xxxxxxxxxx
Trifosfato de nucleósidos adicionados:
•fracção de liqação
Passo Is ddYj e/ou ddYo
Passo 2s ddY-, e/ou ddY» +

Claims (7)

  1. REIVINDICAÇÕES lã.
    Método para a detecção de uma variação específica de nucleótidos num sítio definido nuns polímero de ácido nucleico alvo em que um primeira resíduo de nucleótido é substituido por um segundo resíduo de nucleótido, caracterizado por compreender;
    Ca) a hibridação de uma quantidade detectével de um polímero de ácido nucleico alvo na forma de cadeia simples com um oligonuclsótido iniciador, o iniciador do passo de detecção, compreendendo uma pluralidade de resíduos de nucleótidos, sendo o referido iniciador complementar da sequência de nucleótidos com interesse numa região situada na direcção do extremo 35 de um sítio definido de tal forma que quando o iniciador é hibridado com o polimero não existem resíduos de nucleótidos entre o sítio definido e o extremo 3S do iniciador que sejam idênticos ao primeiro ou segundo resíduo de nucleótido a ser detectado?
    Cb) o prolongamento do iniciador usando um agente de polimerização numa mistura compreendendo um ou mais trifosfatos de nucleósido em que a mistura inclui pelo menos um trifosfato ds nucleósido complementar do primeiro ou do segundo resídua de nucleótido, a qual compreende meios para a detecção da incorporação do trifosfato de nucleósido num polímero de ácido nucleico s, facultativamente um ou mais trifosfatos de nucleósido terminadores de cadeia? e
    Cc) a detecção da incorporação do trifosfato de nucleósido, pelo que é determinada a identidade do resíduo ds nucleótido no sítio definido»
  2. 2ξ» - Método para a detecção de uma pluralidade de variações de nucleótiodos específicas em sítios definidos num polímero de ácido nucleico alvo en? que pelo menos o primeiro resíduo de nucleótido é substituído por um quarto resíduo de nucleótido num segundo sitio definido, caracterizado por compreender s ía) a hibridação de uma quantidade detectável de um polímero de ácido nucleico alvo na forma de cadeia simples com um primeiro inicidor do passo de detecção, compreendendo uma pluralidade de resíduos de nucleótidos, sendo o referido iniciador complementar da sequência, de nucleótidos de interesse numa região situada na direcção do extremo 3’ de um primeiro sítio definido de tal forma que quando o iniciador é hibridado com o polímero não há nenhum resíduo de nucleótido entre o primeiro sítio definido e o extremo 33 do iniciador que seja idêntico ao primeiro e segundo resíduos de nucleótidos, íb) o prolongamento do primeiro iniciador do passo de detecção usando um agente de polimerização numa, mistura compreendendo um ou mais trifosfatos de nucleósido em que a mistura inclui pelo menos um trifosfato de nucleósido complementar do primeiro ou do segundo resíduo de nucleótido, a qual compreende meios para a detecção da incorporação do trifosfato de nucleósido num polímero de ácido nucleico e, facultativamente um ou mais trifosfatos de nucleósido terminadores de cadeia? e íc) a detecção da incorporação do trifosfato de nucleósido, pelo que é determinada a identidade do resíduo de nucleótido no sítio definido?
    (d) a remoção do primeiro iniciador prolongado do passo de detecção formado no passo íc) a partir do polímero de ácido nucleico alvo; e
    Ce) a adição de um segundo iniciador do passo de detecção, sendo o referido iniciador complementar da sequência de nucleôtidos de interesse numa região situada na direcção do extremo 3’ a partir do segundo sítio definido de tal forma que quando o iniciador é hibridsdo com o polímero imobilizado não existem resíduos de nucleótidos entre o segundo sítio definido e o extremo 35 do iniciador que sejam idênticos ao terceiro ou quarto resíduo de nucleótido a ser detectada.
  3. 3ã» - Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por compreender ainda o passo de imobilização do polímero de ãcido nucleico alvo a um suporte sólido antes do passo ía)»
  4. 4â« - Método de acordo com a reivindicação í ou 2, caracterizado por o iniciador ser complementar de uma região da sequência de nucleôtidos de interesse prolongando-se na direcção do extremo 3’ do polímero de ácido nucleico alvo a partir do resíduo de nucleótido imediatamente adjacente ao sitio definido»
  5. 5ã. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o trifasfato de nucleósida incluindo meios de detecção da incorporação do trifosfato de nucleósido num polímero de ácido nucleico ser um trifosfato de desoxinucleótido» óâ» - Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o trifosfato de nucleósido incluindo meios de ί
    detecção da incorporação do trifosfato de nucleósido num polímero de ácido nucleico ser um trifosfato de didesoxinucleótido.
    71» ~ Método de acorda com a reivindicação í ou 2» caracterizado por a mistura incluir um segundo trifosfato de nucleósido compreendendo um segundo meio, diferente do referido primeiro meio, para a detecção da incorporação do segundo trifosfato de nucleósido num polímero de ácido nucleico»
    81» - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o produto pretendido do passo íd) ser eluido antes da determinação da incorporação do trifosfato de nucleósido incorporado.
    91» - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por as variações de nucleótidos serem detectatías num único passo pela adição ds uma pluralidade de iniciadores de passos ds detecção e trifosfatas de nucleósidas diferentemente marcados identificando os resíduos, de nucleótidos variáveis»
    101» - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a quantidade detectável de polímero ácido nucleico alvo ser obtida através da realização de uma reacção de amplificação modificada em que pelo menos um iniciador de amplificação compreende uma primeira fracção de ligação ligada ao iniciador» llã» variaçSes de nucleico alvo, embaladas
    - Equipamento (kit) para usar na determinação de nucleótidos específicas num polímero de ácido caracterizado por compreender, numa combinação ί
    a) pelo menos um iniciador de amplificação compreendendo um oligonucleótido que è complementar e hibrida com uma fracção do polímero de ácido nucleico alvo e que é eficaz como inicador para a polimerização enzimática de ácido nucleico alvo e uma primeira fracção de ligação?, fa) pelo menos um iniciador do passo de detecção compreendendo um oligonucleótido que é complementar e hibrida com uma fracção 3’ relativamente ao do polimero de ácido nucleico alvo;
    nucleótido variável e facu11a t ivamen te
    c) pelo menos um suporte sólido compreendendo uma matriz sólida e pelo menos um sitio de ligação que é capaz de imobilizar o oligonucleótido da sonda de amplificação através da primeira fracção de ligação; e
    d) pelo menos um trifosfato de nucleósido contendo meios para a detecção da incorporação do trifosfato de nucleósido num polímero de ãcido nucleico alvo»
    12ã« - Equipamento para usar na identificação da fismo da apolipoproteina E, passo de detecção compreender ACG TS» de acordo com a reivindicação íí variação de nucleótidos do polimorcaracterizado por o iniciador do a sequência 55—BCG CBS ACA TBB ABB
    Í3â. - Equipamento de acordo com a reivindicação lí para usar na identificação da variação de nucleótidos do polimorfismo da apolipoproteina E, caracterizado por o iniciador do passo de detecção compreender a sequência 55-ATG CCB ATB ABC TBC ABA AB«
    Í4ê» - Equipamento de acordo com a reivindicação XI para usar na identificação da variação de nucleótidos do polimorfismo da apolipoproteína E, caracterizado por o iniciador do passo de detecção compreender a sequência 53~STA CTG CAC CAG GCG GCC GC»
    Í5â» - Equipamento de acordo com a reivindicação íi para usar na identificação da variação de nucleótidos do polimorfismo da apolipoproteína E, caracterizado por o iniciador do passo de detecção compreender a sequência 5?-GGC CTG STA CA TBC CAG GC» íóé» ~ Equipamento de acordo com a reivindicação íí para usar na detecção da variação de nucleótidos no codão
  6. 6 do gene da β-globina humana que provoca anemia das células falsiforíiies, caracterizado por o iniciador do passo de detecção compreender a sequência 55-CAT GGT GCA CCT SAC TCC TG»
    Í7ã« - Equipamento de acordo com a reivindicação íí para usar na detecção da variação de nucleótidos no codão 6 do gene da β-globina humana que provoca anemia das células falsiformes, caracterizado por o iniciador do passo de detecção compreender a sequência 53-CAG TAA CGS CAG GCG GCC GC.
    18ã« ~ Equipamento de acordo com a reivindicação íi para usar na detecção da variação de nucleótidos no codão 12 do gene K-ras, caracterizado por o iniciador do passo de detecção compreender a sequência 5-’-AAG GCA CTC TTG CCT ACG CCA»
    19â. - Equipamento de acordo com a reivindicação 11 para usar na detecção da variação de nucleótidos no codão 12 do gene K-ras, caracterizado por o iniciador do passo de detecção compreender a sequência 53-AGG CAC TCT TGC CTA CGC CAC»
    20ã» - Equipamento de -acordo com a. reivindicação lí para usar na detecção da variação de nucleótidos no codão 12 do gene K-ras, caracterizado por o iniciador do passo de detecção compreender a sequência 5’-AAC TTG TGG TAG TTG GAG CT.
    21ã» - Equipamento de acordo com a reivindicação íl para usar na. detecção da variação de nucleótidos no codão 12 do gene K-ras, caracterizado por o iniciador do passo de detecção compreender a sequência 5’-ACT TST SST AST TSS A8C TS»
    22ã» - Equipamento de para usar na detecção da. variação gene N-ras, caracterizado por o j compreender a. sequência. 5S—ACT GS1 acordo com a reivindicação li de nucleótidos no codão 12 do niciador do passo de detecção
    SST SST TSS ASC AS»
    23â» - Equipamento de acordo com a reivindicação 11 para usar na detecção de resistência, a. AZT em vírus HIV-í, caracterizado por o iniciador do passo de detecção compreender a sequência 53—ATC iGT ISA StóT SSG SAC TT»
    24ã. - Equipamento de acordo com a. reivindicação para, usar na detecção da fibrose cística, caracterizado por o iniciador do passo de detecção compreender a. sequência 5’-TSS CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT»
    Z.-J:
    - Processo para a preparação de um reagente para a detecção da. presença de uma mutação pontual em que um resíduo de ácido nucleico anormal é substituido por um resíduo de ãcido nucleico anormal num sitio definido dentro de um gene de interesse, caracterizado por se incorporar no referido reagente um oligonucleótido de comprimento suficiente para, actuar como um iniciador para uma. reacção de polimerização de ácido nucleico numa extensão de cadeias catalisada por enzimas, tendo o referida oligonucleótido iniciador uma sequência que é complementar de uma região do gene de interesse começando com o resíduo de nucleótido ímediatamente adjacente e na direcção do extrema 33 do gene a partir de um sítio definido e prolongando-se a partir do sítio definido na direcção do extremo 3’ do gene pelo que a polimerização de ácido nucleico na extensão de cadeias catalizada por enzimas começará pela adição de um resíduo de ácido nucleico complementar do resíduo de nucleótido normal ou do resíduo de ácido nucleico anormal.
    2óê» - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o polinucleótido ter um comprimento de 10 - 40 resíduos de nucleótidos»
    27â» -* Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por se preparar um reagente tendo a sequência 55-GCG CGG ACA TGG AGG ACG TG»
    2Sê» - Processo de scordo com a reivindicação 25, caracteri zado por se preparar um reagente tendo a sequência 5’-ATG CL'8 ATG ACC TBC AGA AG»
    2’?ã» - Processo de acordo com a reivindicação caracterizado por se preparar um reagente tendo a sequência 5’GTA CTG CAC CAtí CCG GCC GC»
    Processo de acordo com reivindicação caracterizado por se preparar um reagente tendo a sequência GGC CTG GTA CAC TGC CAG GC»
    a.
    Processo ds acordo com a reivindicação caracterizado por se preparar um reagente tendo a sequência
    CAT GGT GCA CCT GAC TCC TG
    5»64
  7. 7Π3 ·_’.£. Ξ: j
    Ο *
    Processo de acordo cora a reivindicação
    25, caracterizado por se preparar um reagente tendo a sequência CAB TAA CBS CAG BCB BCC BC»
    33â» - Processo de acordo com a reivindicação caracterizado por se preparar um reagente tendo a sequência AAB BCA CTC TTS CCT ACG CCA.
    Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por se preparar um reagente tendo a sequência 5’AGB CAC TCT TBC CTA CBC CAC»
    35ã« - Processo de acordo com caracterizado por se preparar um reagente tendo a sequência o'1AAC TTB TGG TAG TTG GAG CT»
    36ã» - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por se preparar um reagente tendo a sequência 5?ACT GGT GGT GGT TGG ABC AG»
    3/ã. - Processo de acordo com a reivindicação caracterizado por se preparar um reagente tendo a sequência ATC TGT TGA GGT GGG GAC TT»
    38» Um reagente de acordo com a reivindicação caracterizada por se preparar um reagente tendo a sequência TBB CAC CAT TAA ABA AAA TAT CAT»
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