BRPI0720549A2 - Método de detecção de tamanho de ácido nucléico - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE DETECÇÃO DE TAMANHO DE ÁCIDO NUCLEICO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se em geral ao campo de diagnóstico médico. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos de detecção de mutações genéticas caracterizadas por uma expansão de repetições em tandem.

ANTECEDENTES

Uma repetição em tandem em DNA representa duas ou mais 10 cópias aproximadas contíguas de um padrão de nucleotídeos. Repetições em tandem foram mostradas ser causa associada de uma variedade de doenças humanas. Expansão drástica de repetições de trinucleotídeo tem sido associada com doenças tal como retardo mental do X frágil (vide Verkerk e outros (1991) Cell, 65, 905-914), doença de Huntington (vide Huntington's 15 Disease Collaborative Research Group (1993) Cell, 72, 971-983), distrofia miotônica (vide Fu e outros (1992) Science, 255, 1256-1258), atrofia muscular espinhal e bulbar (vide La Spada e outros (1991) Nature, 352, 77-79) e ataxia de Friedreich (vide Campuzano e outros (1996) Science, 271, 1423- 1427).

A síndrome do X frágil é uma das causas mais comuns de retar

do mental herdado, acontecendo em aproximadamente um em 1.250 homens e aproximadamente uma em 2.500 mulheres. Homens com síndrome do X frágil tipicamente exibem algum grau de dano mental, variando de incapacidades em aprendizagem até retardo mental até autismo. Traços físi25 cos característicos (por exemplo, orelhas grandes, face alongada com queixo proeminente), problemas de tecido conectivo (por exemplo, prolapso da válvula mitral e dedos fundidos) e comportamentos característicos (por exemplo, distúrbios de déficit de atenção, distúrbios da fala e respostas incomuns a vários estímulos de toque, de audição ou visuais) podem ser tam30 bém exibidos. Mulheres afetadas apresentam dano mental, características físicas e características comportamentais similares, mas mais leves do que aqueles de homens afetados. A mutação responsável pela síndrome do X frágil envolve expansão de uma seqüência de repetição em tandem de trinucleotídeo (CGG) localizada na região não-traduzida 5' do gene FMR1 no cromossomo X. O número de repetições de CGG no gene FMR1 determina se um indivíduo é 5 normal ou tem uma das duas categorias de mutação: pré-mutação e mutação integral. O número de repetições varia de menos do que 55 repetições em indivíduos não-carreadores, normais, enquanto uma pré-mutação consiste em 55 a 200 repetições e mutação integral consiste em mais do que 200 repetições (Chen e outros, Hum. Mol Genetics 12(23):3067-74, 2003).

Ambos os homens tendo uma pré-mutação e as mulheres tendo

uma pré-mutação em um gene FMR1 são carreadores, mas não são afetados. Carreadores homens são referidos como homens "transmissores normais" e passam a mutação relativamente sem modificação no tamanho a cada filha. Embora tais filhas não sejam afetadas, elas estão sob risco de ter 15 prole afetada porque uma pré-mutação é suscetível à expansão após passagem pela meiose feminina. Ainda, quanto maior a pré-mutação, maior o risco de expansão para uma mutação integral em qualquer prole.

A maioria dos homens com uma mutação integral exibe retardo metal e características físicas e comportamentais estereotípicas. Para homens com uma mutação integral em um gene FMR1, cerca de um terço exibe inteligência normal, cerca de um terço exibe inteligência na linha divisória e cerca de um terço exibe retardo mental.

Atualmente, a indústria padrão para avaliação de indivíduos carreadores ou afetados com expansão de regiões de repetição em tandem tal como X frágil é uma combinação de amplificação por PCR da região de repetição em tandem e análise através de Southern blotting.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto da invenção, são providos métodos de determinação dos tamanhos de um segmento de ácido nucleico particular de interesse em uma amostra de ácidos nucleicos. Este método é realizado através de fragmentação de um ácido nucleico, onde os fragmentos são preparados a partir de uma amostra contendo ácido nucleico, onde os fragmentos incluem alguns dos quais contêm o segmento e uma seqüência marcadora, onde separação é em frações de acordo com o tamanho sob condições onde um fragmento contendo o segmento estará localizado nas frações de acordo com o tamanho do segmento, e identificação daquela(s) fração(ões) conten5 do o segmento através da detecção da seqüência marcadora, onde o tamanho do segmento é determinado através da fração onde ele é identificado.

Este método é aplicável a essencialmente qualquer segmento de ácido nucleico de interesse, no entanto o método é particularmente condescendente à determinação do tamanho de segmentos de ácido nucleico que 10 são, por exemplo, difíceis de dimensionar pelos métodos de utilização de amplificação (por exemplo, PCR) através do segmento de ácido nucleico. Exemplos de segmentos de ácido nucleico que são difíceis de dimensionar pelos métodos utilizando amplificação através do segmento de ácido nucleico incluem segmentos de ácido nucleico que têm teor alto de bases guanina 15 e citosina, segmentos de ácido nucleico grandes e/ou segmentos tendo números grandes de repetições em tandem. Em uma modalidade preferida, o segmento de ácido nucleico particular de interesse é uma seqüência de ácido nucleico de repetição em tandem. Um comprimento de ácido nucleico que é difícil de amplificar através de PCR é geralmente maior do que 50.000 ba20 ses, mais tipicamente maior do que 100.000 bases, mais tipicamente maior do que 150.000 bases ou mais do que 200.000 bases ou até mesmo mais do que 250.000 bases.

Em outros aspectos, métodos da invenção são usados para determinar o tamanho de um segmento de ácido nucleico particular em uma 25 amostra de um indivíduo, deste modo determinando se aquele indivíduo tem uma anormalidade em tamanho daquele segmento de ácido nucleico particular, onde a anormalidade é devido a uma duplicação, adição ou deleção no segmento de ácido nucleico particular.

Em ainda outro aspecto, a invenção provê um método de detecção de uma mutação em um segmento de repetição em tandem de um gene em uma amostra de ácido nucleico, onde a mutação é caracterizada por um aumento no número de repetições comparado com o número de repetições no alelo do tipo selvagem. O método é realizado separando fragmentos de um ácido nucleico, onde os fragmentos são preparados de uma amostra contendo ácido nucleico, onde os fragmentos incluem alguns dos quais contêm o segmento de repetição em tandem e uma seqüência marcadora, onde 5 a separação é em frações de acordo com o tamanho sob condições onde um fragmento contendo o segmento de repetição em tandem estará localizado nas frações de acordo com o número de repetições no segmento de repetição em tandem; e identificação daquela(s) fração(ões) contendo o segmento através de detecção da seqüência marcadora. O número de repe10 tições no segmento de repetição em tandem é determinado através da fração onde ele é identificado. O número de repetições é comparado com o número no alelo do tipo selvagem correspondente, onde um número de repetições maior do que o número no alelo do tipo selvagem é indicativo de uma mutação.

Em certas modalidades, o aspecto acima da invenção inclui ain

da determinação de se uma mutação é uma pré-mutação ou uma mutação integral. Esta determinação é realizada através da comparação do número de repetições no segmento de repetição em tandem da amostra de ácido nucleico com o número no alelo de mutação integral correspondente, onde 20 um número maior de repetições do que o alelo do tipo selvagem, mas menos do que a mutação integral é indicativo de um alelo de pré-mutação, e um número de repetições maior do que ou igual à mutação integral é indicativo de um alelo de mutação integral. Em outras modalidades o número de repetições na região de repetição em tandem da amostra de ácido nucleico pode ser 25 comparado com o número de repetições encontrado em cada um de um alelo do tipo selvagem, um alelo de pré-mutação e um alelo de mutação integral.

Em modalidades particulares do aspecto acima da invenção são providos métodos de identificação de alelos de FMR1 tendo um número normal de repetições em tandem, uma pré-mutação ou uma mutação integral no ácido nucleico de um indivíduo, onde o método inclui:

fragmentação do ácido nucleico na amostra do indivíduo em fragmentos, onde o segmento de repetição em tandem do gene FMR1 está associado com uma seqüência marcadora no fragmento;

separação de fragmentos de um ácido nucleico, onde os fragmentos são preparados a partir de uma amostra contendo ácido nucleico do indivíduo, onde os fragmentos incluem alguns dos quais contêm um seg5 mento de repetição em tandem do gene FMR1 e uma seqüência marcadora, a separação em frações de acordo com o tamanho sob condições onde um fragmento contendo o segmento de repetição em tandem tendo um número normal de repetições estará localizado em uma primeira fração; e um fragmento contendo um segmento de repetição em tandem tendo uma pré10 mutação estará localizado em uma segunda fração; e um fragmento tendo uma região de repetição em tandem tendo uma mutação integral estará localizado em uma terceira fração;

identificação daquela(s) fração(ões) contendo o segmento através da detecção da seqüência marcadora, onde o número de repetições no segmento de repetição em tandem é determinado pela fração onde ele é identificado, onde

um resultado positivo na primeira fração indica que o indivíduo tem um alelo de FMR1 com um número normal de repetições em tandem;

um resultado positivo na segunda fração indica que o indivíduo tem uma pré-mutação no alelo FMR1; e

um resultado positivo na terceira fração indica que o indivíduo tem uma mutação integral no alelo FMR1.

Em outros aspectos, são providos métodos para detecção de carreadores de mutações genéticas caracterizados pela expansão ou redu25 ção de um segmento de repetição em tandem de um gene e diagnóstico de indivíduos afligidos com doenças causadas por tal expansão. O método envolve a detecção de alelos do tipo selvagem, alelos de pré-mutação e/ou alelos de mutação integral para um gene particular conforme acima descrito. Um genótipo pode ser então determinado com base no(s) alelo(s) presentes 30 em um indivíduo, permitindo a designação de estado normal, carreador ou afetado.

Conforme aqui usado um "carreador" é um indivíduo que carrega um alelo mutado ou alterado de um gene, mas ele não é afetado pelo distúrbio ou doença associado com mutação. Carreadores podem passar a mutação para uma criança ou prole em gerações futuras, que podem ser afetadas com a doença ou distúrbio. Com relação à síndrome do X frágil, ambos ho5 mens e mulheres podem ser carreadores. Conforme aqui usado em referência a homens, o termo "carreador" é usado intercomutavelmente com "carreador de pré-mutação" e refere-se a homens tendo um alelo de pré-mutação. Conforme aqui usado em referência a mulheres, o termo carreador compreende mulheres tendo um alelo de pré-mutação ou um alelo de mutação inte10 gral. Tais carreadores fêmeas podem ser também referidos aqui como "carreador de pré-mutação" (isto é, tendo um alelo de FMR1 de pré-mutação) ou um "carreador de mutação integral" (isto é, tendo um alelo de FMR1 de mutação integral).

Conforme aqui usado "afetado" refere-se a indivíduos que pos15 suem um ou mais alelos mutados de um gene particular e exibem a doença ou distúrbio (isto é, fenótipo) associado com esta mutação. Com relação à síndrome do X Frágil, homens tendo um alelo de FMR1 de mutação integral são afetados, enquanto mulheres tendo um alelo de mutação integral único podem ser afetadas ou podem ser um carreador de mutação integral.

Em algumas modalidades do aspecto da invenção acima, indiví

duos do sexo masculino afligidos com a síndrome do X Frágil (mutação integral) podem ser distinguidos de indivíduos que são carreadores (prémutação) ou daqueles que são normais. Uma amostra de ácido nucleico do indivíduo é fragmentada para produzir fragmentos de ácido nucleico onde o 25 segmento de repetição em tandem do gene FMR1 está associado com uma seqüência marcadora no fragmento. Os fragmentos são separados em frações de acordo com o tamanho sob condições onde o(s) fragmento(s) contendo o segmento de repetição em tandem estará(ão) localizado(s) nas frações de acordo com o número de repetições no segmento de repetição em 30 tandem, e identificação daquela(s) fração(ões) contendo o segmento através da detecção da seqüência marcadora. Em algumas modalidades, as frações são escolhidas de modo que a primeira fração captura fragmentos tendo um número de repetições dentro da faixa de repetições para um anelo normal; a segunda fração captura fragmentos tendo um número de repetições dentro da faixa de repetições para um alelo de pré-mutação; e a terceira fração captura fragmentos tendo um número de repetições dentro da faixa de repeti5 ções para um alelo de mutação integral. De acordo com a presente pesquisa no campo do X frágil, a faixa de repetições para um alelo normal do gene FMR1 é menos do que 55 repetições; a faixa de repetições para um alelo de pré-mutação é 55-200; e a faixa de repetições para um alelo de mutação integral e maior do que 200 repetições. Essas faixas podem ser +/- 10%. 10 Essas faixas podem mudar com o tempo conforme novos estudos são conduzidos e mais é aprendido sobre a correlação do número de repetições e estado de doença. Uma vez que homens geralmente têm um cromossomo X único (que está onde o gene FMR1 reside), apenas uma fração deve ser positiva para a seqüência marcadora. Deste modo, homens podem ser de15 signados com um fenótipo, com base no genótipo de acordo com o que segue: se a primeira fração por positiva para a seqüência marcadora, o indivíduo é normal; se a segunda fração por positiva para a seqüência marcadora, o indivíduo é um carreador; se apenas a terceira fração for positiva para a seqüência marcadora, o indivíduo é afetado com X frágil.

Em outro aspecto, são providos métodos para avaliação de indi

víduos do sexo masculino e do sexo feminino quanto ao estado de carreador de mutações na região de repetição em tandem do gene FMR1, o método inclui:

ensaio dos ácidos nucleicos de um indivíduo para determinar

gênero; e

ensaio do ácido nucleico para determinar o comprimento da região de repetição em tandem do gene FMR1 onde a determinação compreende

amplificação da região de repetição em tandem,

detecção de um produto de amplificação, e

determinação do número de repetições em tandem no produto de amplificação, onde em indivíduos do sexo masculino,

a presença de um produto de amplificação tendo menos do que 55 repetições em tandem indica que o indivíduo não é um carreador,

a presença de um produto de amplificação tendo 55 ou mais repetições em tandem indica que o indivíduo é um carreador, ou

na ausência de um produto de amplificação, o estado do carreador é indeterminado; e

em indivíduos do sexo feminino:

a presença de um produto de amplificação tendo mais do que 55 repetições em tandem indica que o indivíduo é um carreador; ou

a presença de um produto de amplificação único tendo menos do que 55 repetições em tandem, o estado do carreador é indeterminado.

Em certas modalidades, o método acima inclui ainda análise de indivíduos indeterminados para determinar o estado de carreador, onde a análise inclui,

separação de fragmentos de um ácido nucleico, onde os fragmentos são preparados a partir de uma amostra contendo ácido nucleico do indivíduo, onde os fragmentos incluem alguns dos quais contêm um segmento de repetição em tandem do gene FMR1 e uma seqüência marcadora, 20 a separação em frações de acordo com o tamanho sob condições onde um fragmento contendo o segmento de repetição em tandem tendo um número normal de repetições estará localizado em uma primeira fração; e um fragmento contendo um segmento de repetição em tandem tendo uma prémutação estará localizado em uma segunda fração; e um fragmento tendo 25 uma região de repetição em tandem tendo uma mutação integral estará localizada em uma terceira fração.

identificação daquela(s) fração(ões) contendo o segmento através da detecção da seqüência marcadora, onde o número de repetições no segmento de repetição em tandem é determinado pela fração onde ele é identificado, onde

em indivíduos do sexo masculino:

um resultado positivo na primeira fração indica que o indivíduo não é um carreador,

um resultado positivo na segunda fração indica que o indivíduo é um carreador de pré-mutação;

um resultado positivo na terceira fração indica que o indivíduo é

afetado; e

em indivíduos do sexo feminino:

um resultado positivo apenas na primeira fração indica que o indivíduo é homozigoto para um alelo normal;

um resultado positivo na segunda fração indica que o indivíduo é um carreador de pré-mutação; e

um resultado positivo na terceira fração indica que o indivíduo é um carreador de mutação integral.

Em modalidades preferidas do método acima, o ensaio de ácidos nucleicos para determinar gênero inclui amplificação de uma região do 15 ácido nucleico, de preferência através de PCR. Por exemplo, seqüências específicas para o cromossomo Y, tal como o local SRY, podem ser direcionadas para amplificação. Neste caso, amplificação apenas acontece na presença de um cromossomo Y. (Vide Sinclair, A. H. e outros, Nature, 346:240 244 (1990)). Em outros exemplos, certos genes que acontecem em ambos o 20 cromossomo Xeo cromossomo Y podem ser detectados para determinação de gênero, se os comprimentos dos genes correspondentes forem diferentes em cada cromossomo. Então, amplificação resulta em amplicons dimensionados diferentes tendo comprimentos específicos para ou o cromossomo X ou o Y. Neste caso, amplificação de ácidos nucleicos a partir de homens re25 sultaria em ambos amplicons, enquanto amostras de mulheres teriam apenas um amplicon. Exemplos de tais genes incluem DXZ1 e DYZ1 e o gene amelogenina. Em modalidades mais preferidas, o ensaio para determinar o gênero inclui:

amplificação de uma região do gene amelogenina que produz tamanhos diferentes de produtos de amplificação do gene amelogenina no cromossomo X e do gene amelogenina no cromossomo Y,

determinação do tamanho do produto ou produtos de amplificação, onde a presença de um produto de um tamanho único indica que o gênero é feminino e a presença de dois produtos de tamanhos diferentes indica que o gênero é masculino.

Ainda em modalidades adicionais, o ensaio para determinar gê5 nero é realizado em multiplex com a amplificação da região de repetição em tandem; de preferência em PCR multiplex; de preferência um ou mais controles internos estão incluídos na reação multiplex. Em modalidades preferidas, uma região do gene de insensibilidade a androgênio é amplificada como um controle interno.

Em uma modalidade preferida do aspecto da invenção acima,

uma amostra contendo DNA genômico é ensaiada quanto à expansão na região de repetição em tandem do gene FMR1. Então, amostras genômicas são submetidas à fragmentação de ácido nucleico e os fragmentos de ácido nucleico resultantes são separados por tamanho em frações. Uma sequên15 cia marcadora a montante ou a jusante da região de repetição em tandem do gene FMR1, que é associada com a região de repetição em tandem no ácido nucleico fragmentado, é amplificada através de reação em cadeia de polimerase. Em algumas modalidades a amplificação da seqüência marcadora e detecção do amplicon são feitas usando o sistema TaqMan. Em outras modali20 dades, a seqüência marcadora é amplificada e usando um iniciador marcado e o amplicon marcado resultante é detectado usando eletroforese capilar.

Um versado na técnica reconheceria prontamente que a separação de fragmentos em frações por tamanho pode ser modificada de modo que as frações correspondem a ou um número normal de repetições em 25 tandem ou um número anormal de repetições em tandem. Em algumas modalidades, o ácido nucleico fragmentado pode ser separado por tamanho em duas frações diferentes, uma fração superior de fragmentos de tamanho maior e uma fração inferior de fragmentos de tamanho menor. Nesta abordagem, as frações são designadas de modo que fragmentos de ácido nucle30 ico contendo um número normal de repetições em tandem serão encontrados na fração inferior enquanto fragmentos do ácido nucleico contendo um número anormalmente alto de repetições em tandem serão encontrados na fração superior. Em outras modalidades, o DNA fragmentado pode ser separado em qualquer número de frações. Em algumas modalidades, o DNA fragmentado pode ser separado em várias frações selecionadas do grupo consistindo em 2-16, de preferência 3 frações ou 4 frações ou 5 frações ou 6 frações ou 8 frações ou até mesmo 16 frações.

Em uma modalidade preferida do método acima, o DNA fragmentado é separado em frações superior e inferior, onde a fração inferior corresponde a uma região de repetição em tandem contendo menos do que 55 repetições (número normal de repetições) e uma fração superior conten10 do 55 ou mais repetições em tandem (pré-mutação e mutação integral). Um alelo normal pode então ser distinguido de uma pré-mutação ou uma mutação integral.

Em outra modalidade preferida do método acima, o DNA fragmentado é separado em três frações, onde uma primeira fração corresponde 15 a uma região de repetição em tandem de um alelo normal (isto é, menos do que 55 repetições), uma segunda fração corresponde a uma região de repetição em tandem de um alelo de pré-mutação (isto é, 55-200 repetições), uma terceira fração corresponde a uma região de repetição em tandem de um alelo de mutação integral (isto é, maior do que 200 repetições).

Em ainda outra modalidade preferida do método acima, um DNA

fragmentado é separado em quatro frações, onde uma primeira fração corresponde a uma região de repetição em tandem de um alelo normal, uma segunda fração corresponde a uma região de repetição em tandem de um alelo de pré-mutação pequeno, uma terceira fração corresponde a uma regi25 ão de repetição em tandem de um alelo de pré-mutação grande e uma quarta fração corresponde a uma região de repetição em tandem de um alelo de mutação integral. Em modalidades particulares, a primeira fração corresponde a 0-60 repetições; de preferência a segunda fração corresponde a 60-200 repetições; de preferência a terceira fração corresponde a 200-2000 repeti30 ções; e de preferência a quarta fração corresponde a 2000+ repetições. Em outra modalidade, o DNA é fragmentado com Blpl e Mlyl e fracionado de modo que a primeira fração corresponde a 6-62 repetições; de preferência a segunda fração corresponde a 63-140 repetições; de preferência a terceira fração corresponde a 141-220 repetições; e de preferência a quarta fração corresponde a 221-2000+ repetições. Em outra modalidade, o DNA é fragmentado com Alul e fracionado de modo que a primeira fração corresponde 5 a 6-68 repetições; de preferência segunda fração corresponde a 69-102 repetições; de preferência a terceira fração corresponde a 102-202 repetições; e de preferência a quarta fração corresponde a 203+ repetições. Em ainda outra modalidade, o DNA é fragmentado com Sphl e Bmtl e fracionado de modo que a primeira fração corresponde a 6-62 repetições; de preferência a 10 segunda fração corresponde a 63-163 repetições; de preferência a terceira fração corresponde a 164-196 repetições; e de preferência a quarta fração corresponde a 197+ repetições.

São também providos métodos de estimativa do número de repetições em tandem em uma amostra de DNA genômico. Neste método, amostras de teste contendo DNA genômico são submetidas à fragmentação de ácido nucleico. Os fragmentos de ácido nucleico resultantes são separados por tamanho em três ou mais frações de faixa de tamanho, e fragmentos contendo segmentos de repetição em tandem em várias frações são identificados através de detecção de uma seqüência marcadora flanqueando o segmento de repetição em tandem, que está associado com a região de repetição em tandem no ácido nucleico fragmentado. O tamanho da região de repetição em tandem detectada é então determinado relacionando o tamanho da fração contendo a repetição com o tamanho de um segmento de repetição em tandem presente em tais fragmentos de ácido nucleico. Separação em três ou mais frações de faixa de tamanho permite uma estimativa melhor do número de repetições em tandem. No caso do X frágil, o grau de expansão de uma pré-mutação ou mutação integral pode ser avaliado.

Em modalidades preferidas dos aspectos da invenção acima, o método inclui uma segunda fragmentação de ácido nucleico. De preferência a segunda fragmentação acontece após a separação por tamanho, que segue a primeira fragmentação de ácido nucleico; de preferência a segunda fragmentação é através de digestão de enzima de restrição. Em modalidades mais preferidas, a segunda fragmentação cliva o segmento de ácido nucleico particular de interesse (por exemplo, um segmento de repetição em tandem) de uma seqüência marcadora flanqueando o segmento de ácido nucleico particular. De preferência a segunda fragmentação de ácido nuclei5 co não cliva dentro da seqüência marcadora.

Em algumas modalidades dos aspectos da invenção acima, a seqüência marcadora é detectada através de amplificação de toda ou uma porção da seqüência marcadora e detecção do amplicon. Em modalidades preferidas, a seqüência marcadora é amplificada através de PCR e o ampli10 con é detectado através de eletroforese. Em modalidades mais preferidas, um iniciador usado na reação de amplificação por PCR compreende um marcador, deste modo marcando o amplicon resultante. O amplicon então marcado pode ser então detectado através de métodos tal como eletroforese capilar.

Em outras modalidades dos aspectos acima da invenção, a se

qüência marcadora é detectada usando métodos de PCR de tempo real tal como o sistema TaqMan. Nesta abordagem uma sonda é usada para detectar a região amplificada da seqüência marcadora.

Em ainda outras modalidades dos aspectos da invenção acima, a seqüência marcadora não precisa ser amplificada e pode ser detectada diretamente através de hibridização para duas sondas de oligonucleotídeo diferencialmente marcadas. As duas sondas, que hibridizam para segmentos distintos de uma seqüência marcadora, de modo que ambas as sondas podem se ligar simultaneamente, são contatadas com os ácidos nucleicos fragmentados sob condições de hibridização. A detecção simultânea de sondas diferencialmente marcadas hibridizadas para um fragmento de ácido nucleico único nas frações indica a presença de uma região de repetição em tandem em um fragmento contido naquela fração. As duas sondas de oligonucleotídeo da presente modalidade podem ser projetadas para hibridizar para segmentos de uma seqüência marcadora a montante ou a jusante da repetição em tandem. Esses segmentos da seqüência marcadora podem estar próximos da região de repetição em tandem ou podem estar a uma distância a montante ou a jusante. Em modalidades preferidas, os segmentos da seqüência marcadora estão dentro de 500 bases a montante ou a jusante da região de repetição em tandem; em modalidades mais preferidas os segmentos da seqüência marcadora estão dentro de 250 pares de base a 5 montante ou a jusante da região de repetição em tandem; em modalidades mais preferidas os segmentos da seqüência marcadora estão dentro de 100 bases a montante ou a jusante da região de repetição em tandem. As sondas podem ser projetadas para hibridizar para os mesmos filamentos ou filamentos opostos de uma seqüência marcadora de filamento duplo. As son10 das podem hibridizar a montante das repetições em tandem enquanto a outra sonda hibridiza a jusante. As sondas podem hibridizar para segmentos da seqüência marcadora que são separados por bases zero a várias centenas de milhares de bases contanto que ambos segmentos estejam localizados na mesma molécula de ácido nucleico contígua após a etapa ou etapas de 15 fragmentação. De preferência as sondas são separadas em menos do que 1 kb ou de preferência menos do que 500 bases ou menos do que 300 bases ou menos do que 200 bases ou menos do que 100 bases ou menos do que 50 bases ou menos do que 20 bases ou menos do que 10 bases ou menos do que 5 bases ou 1 base ou 0 base.

Em outro aspecto da invenção, são providos métodos de deter

minação do tamanho de um segmento de ácido nucleico particular em uma amostra de ácidos nucleicos, onde o tamanho é determinado usando informação obtida usando um primeiro método e um segundo método. Então, o método compreende medição do tamanho de um segmento de repetição em 25 tandem através de um primeiro método, medição do tamanho do segmento de repetição em tandem através de um segundo método e uso da informação obtida pelos primeiro e segundo métodos para determinar o tamanho da região de repetição em tandem. Em algumas modalidades, o primeiro método inclui uma amplificação da região de repetição em tandem, de preferência 30 a amplificação é através de PCR. Em modalidades preferidas, a amplificação por PCR inclui um iniciador marcado. Em outras modalidades preferidas o amplicon é submetido à eletroforese, de preferência eletroforese capilar, e o tamanho do amplicon é determinado através de comparação com uma rodada padrão em paralelo. Em outras modalidades, o primeiro método inclui Southern blotting. Em modalidades preferidas o segundo método compreende fragmentação dos ácidos nucleicos da amostra, separação dos ácidos nucleicos fragmentados em frações de acordo com tamanho e detecção de uma seqüência marcadora a montante ou a jusante do segmento de ácido nucleico particular de interesse, onde a seqüência marcadora está associada com o segmento de ácido nucleico particular de interesse no ácido nucleico fragmentado. O tamanho do segmento de ácido nucleico particular de interesse é então determinado relacionando o tamanho da fração contendo o segmento de ácido nucleico particular com o tamanho do segmento de ácido nucleico particular na amostra de ácidos nucleicos. Em certas modalidades, o primeiro método é usado como uma avaliação inicial e amostras para as quais o tamanho do segmento de ácido nucleico particular é incapaz de ser determinado através deste método são analisadas mais através do segundo método. Em outras modalidades, dimensionamento através de um dos dois métodos acima é usado para confirmar os resultados do dimensionamento pelo outro dos dois métodos acima. Em ainda outras modalidades, dimensionamento pelo primeiro método é usado para determinar melhor o tamanho do fragmento de ácido nucleico particular.

Em outro aspecto da invenção são providos iniciadores para amplificação de seqüências marcadoras flanqueando a região de repetição em tandem do gene FMR1. Em modalidades particulares, os iniciadores são selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4-9.

Em ainda outro aspecto da invenção, são providos estojos para

detecção do tamanho de um segmento de ácido nucleico particular em uma amostra compreendendo um par de iniciador para amplificação de uma seqüência de nucleotídeo marcadora a montante ou a jusante do segmento de ácido nucleico particular, e uma ou mais endonucleases de restrição para 30 clivagem da amostra de ácido nucleico para gerar um fragmento da amostra de ácido nucleico que contém o segmento de ácido nucleico particular e a seqüência marcadora a montante ou a jusante. Em certas modalidades, o estojo compreende ainda uma ou mais endonucleases de restrição para clivagem de um segmento de ácido nucleico particular da seqüência de nucleotídeo marcadora. Em ainda outras modalidades, o estojo pode conter ainda um o mais controles para verificação da separação de tamanho apro5 priada de fragmentos; de preferência, o controle consiste em um ou mais pares de iniciador que são usados para amplificar um ou mais fragmentos controle da amostra de ácido nucleico separada por tamanho. Em modalidades adicionais, o estojo pode conter ainda um ou mais controles para verificação do término de uma ou mais digestões de enzima; de preferência o 10 controle consiste em um ou mais pares de iniciador projetados para amplificar um fragmento controle que inclui um sítio de reconhecimento para a enzima usada. O estojo pode conter ainda quaisquer tampões necessários ou outros reagentes.

Em modalidades preferidas do aspecto acima da invenção, o segmento de ácido nucleico particular contém um segmento de repetição em tandem. Em modalidades mais preferidas, o estojo é para detecção do segmento de repetição em tandem do gene FMR1; de preferência a enzima para geração de fragmentos da amostra de ácido nucleico é Alul\ de preferência a enzima para clivagem da seqüência marcadora da repetição em tandem é BsfA//; de preferência o estojo contém um ou mais pares de iniciadores controle para determinar se as digestões das enzima estão terminadas; de preferência o estojo contém um ou mais pares de iniciador para detectar a presença de um ou mais fragmentos controle na amostra de ácido nucleico separada por tamanho. Em outras modalidades preferidas, o estojo é para a detecção do segmento de repetição em tandem do gene FMR1; de preferência as enzimas para geração de fragmentos da amostra de ácido nucleico são Blpl e /W/y/; de preferência a enzima para clivagem da seqüência marcadora da repetição em tandem é Bmtl] de preferência o estojo contém um ou mais pares de iniciadores de controle para determinar se as digestões de enzima estão terminadas; de preferência o estojo contém um ou mais iniciadores para detectar a presença de um ou mais fragmentos controle na amostra de ácido nucleico separada por tamanho. Em ainda outras modalidades preferidas, o estojo é para detecção do segmento de repetição em tandem do gene FMR1; de preferência as enzimas para geração de fragmentos da amostra de ácido nucleico são Sphl e Bmtl·, de preferência a enzima para clivagem da seqüência marcadora da repetição em tandem é BstNl·, de prefe5 rência o estojo contém um ou mais pares de iniciadores controle para determinar se digestões de enzima estão terminadas; de preferência o estojo contém um ou mais pares de iniciador para detectar a presença de um ou mais fragmentos controle na amostra de ácido nucleico separada por tamanho.

"Segmento" conforme aqui usado em referência a ácido nucleico refere-se a um pedaço de ácido nucleico contíguo.

"Segmento de ácido nucleico particular de interesse" conforme aqui usado refere-se a um "segmento" específico ou pedaço de ácido nucleico tendo uma seqüência conhecida, segmentos preferidos são aqueles segmentos que são difíceis de amplificar através de PCR. Exemplos incluem 15 segmentos de ácido nucleico tendo teor alto de bases guanina e citidina, segmentos grandes de ácido nucleico ou segmentos tendo números grandes de repetições em tandem, geralmente mais do que 100 repetições de trinucleotídeo. Em algumas modalidades o segmento compreende uma deleção, uma duplicação ou uma inserção. Em uma modalidade preferida, o segmen20 to de ácido nucleico particular de interesse compreende uma região de repetição em tandem.

"Segmentos de ácido nucleico que têm alto teor de bases guanina e citosina" ou "ricos em GC" referem-se àqueles segmentos de ácido nucleico de um genoma que são mais do que a média para aquele genoma. Em geral, rico em GC é mais do que 40% de bases guanina e citosina ou mais do que 50% ou mais do que 60% ou mais do que 75%.

"Tamanho" conforme usado em referência a um segmento de ácido nucleico particular de interesse refere-se à quantidade que descreve a magnitude deste segmento e pode ser representada por, por exemplo, peso molecular, número de pares de base ou número de cópias de uma repetição em tandem.

"Fragmento" conforme aqui usado refere-se a uma porção de ácido nucleico resultante de um processo onde comprimentos mais longos de ácido nucleico são quebrados em comprimentos menores de ácido nucleico. Ácidos nucleicos podem ser quebrados ou fragmentados através de meios químicos ou bioquímicos, de preferência ácidos nucleicos são frag5 mentados de uma maneira que é reproduzível, de preferência ácidos nucleicos são fragmentados por uma ou mais endonucleases de restrição. De preferência ácidos nucleicos são fragmentados de modo que o segmento de ácido nucleico particular de interesse e sua seqüência marcadora associada estão localizados no mesmo fragmento. O comprimento de um fragmento 10 contendo o segmento de ácido nucleico de interesse vai depender do comprimento do segmento de ácido nucleico de interesse bem como da enzima de restrição escolhida para fragmentar o DNA. Então, o comprimento do fragmento inclui o segmento de ácido nucleico de interesse mais a região a montante do segmento para o sítio de reconhecimento de enzima de restri15 ção 5' (isto é, a extremidade 5' do fragmento) e a região a jusante da região de segmento para o sítio de reconhecimento de enzima de restrição 3' (isto é, a extremidade 3' do fragmento).

"Separação de fragmentos" conforme aqui usado refere-se ao processo com o qual os fragmentos contidos em uma mistura de fragmentos diferentes são fisicamente separados uns dos outros.

"Fracionamento" conforme aqui usado refere-se a um processo com o qual uma mistura simples de componentes individuais é processada de modo que pelo menos alguns dos componentes individuais na mistura ficam separados uns dos outros. Por exemplo, cromatografia é um método 25 de fracionamento que separa uma mistura de componentes baseada em alguns princípios físicos/químicos. Os componentes podem ser separados em um gel ou em uma membrana de modo que os componentes individuais podem ser separadamente identificados. Os componentes individuais de uma mistura podem ser fracionados através de separação da mistura em 30 diferentes componentes que são capturados em alíquotas separadas de líquido (isto é, frações). Conforme aqui usado "fração" no contexto da invenção refere-se a uma coleção de fragmentos tendo um certo tamanho ou faixa de tamanhos que difere do tamanho ou faixa de tamanhos da mistura nãofracionada de fragmentos de partida.

"Identificação daquelas frações contendo o segmento" conforme aqui usado significa que a fração de fragmentos separados por tamanho que contém o segmento de interesse é determinada através da detecção de uma seqüência marcadora associada com este segmento em um fragmento de ácido nucleico.

A expressão "região de repetição em tandem" ou "segmento de repetição em tandem" conforme aqui usado refere-se a uma região de DNA que contém cópias múltiplas de uma seqüência de DNA curta. "Seqüências de repetição em tandem" ou "repetições em tandem" ou simplesmente "repetições" são usados intercomutavelmente aqui e referem-se à seqüência mais curta de DNA que é repetida na região de repetição em tandem. Tais repetições em tandem podem se encontrar adjacentes uma à outra na mesma orientação (isto é, repetições em tandem diretas) ou na direção oposta umas às outras (isto é, repetições em tandem invertidas). As seqüências repetidas podem ser di-, tri-, tetra- ou mais nucleotídeos de comprimento. Expansão do número de cópias das seqüências de repetição em tandem dentro das regiões de codificação ou não-codificação de alguns genes humanos está associada com doença de expansão de repetição.

Conforme aqui usado, o termo "amostra" ou "amostra de teste" refere-se a qualquer material líquido ou sólido contendo DNA genômico. Em modalidades preferidas, uma amostra de teste é obtida de uma fonte biológica (isto é, uma "amostra biológica"), tal como células em cultura ou uma a25 mostra de tecido de um animal, com mais preferência um humano. Tecidos de amostra preferidos incluem, mas não estão limitados a, sangue, medula óssea, fluidos corporais, fluido cerebroespinhal, plasma, soro ou tecido (por exemplo, material de biópsia).

Conforme aqui usado, "ácido nucleico" refere-se amplamente a segmentos de um cromossomo, segmentos ou porções de DNA, cDNA e/ou RNA. Ácido nucleico pode ser derivado ou obtido de uma amostra de ácido nucleico originalmente isolada de qualquer fonte (por exemplo, isolada de, purificada de, amplificada de, clonada de, transcrita reversa de amostra de DNA ou RNA).

"Ácido nucleico alvo" conforme aqui usado refere-se a segmentos de um cromossomo, um gene completo com ou sem seqüência intergê5 nica, segmentos ou porções de um gene com ou sem a seqüência intergênica, ou seqüência de ácidos nucleicos para os quais sondas ou iniciadores são designados. Ácidos nucleicos alvo podem incluir seqüências do tipo selvagem, seqüências de ácido nucleico contendo mutações, deleções ou duplicações, regiões de repetição em tandem, um gene de interesse, uma regi10 ão de um gene de interesse ou qualquer região a montante ou a jusante do mesmo. Ácidos nucleicos alvo podem representar seqüências ou alelos alternativos de um gene particular. Ácidos nucleicos alvo podem ser derivados de DNA, cDNA ou RNA genômico. Conforme aqui usado ácidos nucleicos alvo podem ser DNA nativo ou um produto amplificado por PCR.

O termo "seqüência marcadora" conforme aqui usado refere-se

a um segmento de ácido nucleico que está associado com um segmento de ácido nucleico de interesse de modo que detecção da seqüência marcadora em uma amostra é indicativo da presença do segmento de ácido nucleico de interesse. A seqüência marcadora para detecção de um segmento de ácido nucleico particular de interesse deve ser selecionada com base em que o marcador é unicamente ou substancialmente associado com o segmento de ácido nucleico de interesse em fragmentos presentes em uma fração de tamanho particular. Seqüências marcadoras podem ser detectadas através de amplificação de ácido nucleico usando métodos de hibridização baseados em iniciador. Seqüências marcadoras podem ser também detectadas através de hibridização para uma ou mais sonda(s) de ácido nucleico. De acordo com os métodos descritos aqui, um fragmento contendo um segmento de repetição em tandem é identificado em fragmentos de ácido nucleico fracionados através da detecção de uma seqüência marcadora que está ou a montante ou a jusante da repetição em tandem.

Seqüências marcadoras podem estar dentro do segmento de ácido nucleico de interesse ou podem estar flanqueando o ácido nucleico de interesse. O termo "flanqueando" conforme aqui usado refere-se a uma região de DNA ou próximo ou distante de uma região de interesse. A região de flanqueamento pode estar "a montante" (isto é, 5') ou a "jusante" (isto é, 3') da região de interesse. A seqüência marcadora pode estar próximo a uma região de repetição em tandem ou pode estar localizada distante a montante ou a jusante. Em modalidades preferidas, a seqüência marcadora está dentro de 500 bases a montante ou a jusante da região de repetição em tandem; em modalidades mais preferidas a seqüência marcadora está dentro de 250 bases a montante ou a jusante da região de repetição em tandem; em modaIidades mais preferidas, a seqüência marcadora está dentro de 100 bases a montante ou a jusante da região de repetição em tandem. A região de flanqueamento pode ser seqüência de codificação ou não-codificação e pode ser um gene igual ou diferente do gene compreendendo a região de interesse. Em modalidades preferidas, a seqüência marcadora está flanqueando o segmento de ácido nucleico de interesse.

Em certas modalidades, o tamanho do segmento de ácido nucleico particular de interesse é determinado relacionando o tamanho da fração contendo o segmento de ácido nucleico particular com o tamanho do segmento de ácido nucleico particular na amostra de ácidos nucleicos. Esta eta20 pa de relação do tamanho de fração contendo o segmento de ácido nucleico particular com o tamanho de segmento de ácido nucleico particular na amostra de ácidos nucleicos pode ser realizada usando uma tabela de pesquisa conforme aqui descrito. Em outras modalidades esta etapa é realizada com um programa de computador.

A expressão "relacionando o tamanho da fração contendo o

segmento de ácido nucleico particular de interesse com o tamanho do segmento de ácido nucleico particular de interesse que estaria presente naquela fração sob as condições que geraram o fragmento" conforme aqui usado refere-se aos meios através dos quais o tamanho do segmento de ácido nu30 cleico particular de interesse é determinado a partir de sua localização em um tamanho de fração particular. Em uma abordagem, uma tabela de pesquisa é estabelecida para cada combinação de um segmento de ácido nucleico particular de interesse e abordagem de fragmentação (por exemplo, endonuclease(s) de restrição particulares usada(s)). A tabela de pesquisa liga cada fração (contendo uma faixa de tamanhos de fragmento) ao comprimento do segmento de interesse que está presente em tais fragmentos.

Em qualquer fração particular, há fragmentos que contêm o segmento de interesse e outra seqüência. Então, em qualquer fração, uma pessoa pode calcular a partir dos dados da seqüência o número de bases nos fragmentos que representa o segmento de interesse. Esta correlação pode ser estabelecida experimentalmente ou usando seqüência de DNA conhecida para os 10 fragmentos gerados. Para qualquer amostra desconhecida particular, o tamanho de um segmento de interesse pode ser determinado relacionando o tamanho do fragmento que contém o segmento de interesse com a tabela de pesquisa apropriada refletindo as mesmas condições para geração fragmentada. Usando este processo uma pessoa relaciona o tamanho da fração con15 tendo o segmento de ácido nucleico particular de interesse com o tamanho do segmento de ácido nucleico particular de interesse que está presente na fração sob as condições que geraram o fragmento. Não é essencial que uma pessoa prepare uma tabela de pesquisa para realizar o método. Por exemplo, uma pessoa poderia gerar um programa de computador para realizar a 20 etapa de relação.

"Ácido nucleico genômico" ou "DNA genômico" refere-se a algum ou todos os DNA do núcleo de uma célula. DNA genômico pode estar intacto ou fragmentado (por exemplo, digerido com endonucleases de restrição através de métodos conhecidos na técnica). Em algumas modalidades, 25 DNA genômico pode incluir seqüência de todo ou uma porção de um gene único ou de genes múltiplos, seqüência de um ou mais cromossomos ou seqüência de todos os cromossomos de uma célula. Em contraste, o termo "ácido nucleico genômico total" é usado aqui para se referir ao complemento integral de DNA contido no genoma de uma célula. Como é bem conhecido, 30 ácido nucleico genômico inclui regiões de codificação de gene, íntrons, regiões não-traduzidas 5' e 3', DNA flanqueando 5' e 3' e segmentos estruturais tal como DNA telomérico e centromérico, origens de replicação e DNA intergênico. Ácido nucleico genômico pode ser obtido do núcleo de uma célula ou recombinantemente produzido. DNA genômico pode ser também transcrito de DNA ou RNA isolado diretamente do núcleo de uma célula. Amplificação por PCR pode ser também usada. Métodos de purificação de DNA e/ou RNA de uma variedade de amostras são bem conhecidos na técnica.

Os termos "alelo" e "variante alélica" são usados intercomutavelmente aqui. Um alelo é qualquer uma de várias formas ou seqüências alternativas do mesmo gene ocupando um dado local ou posição em um cromossomo. Um alelo único para cada local é herdado separadamente de 10 cada origem, resultando em dois alelos para cada gene. Um indivíduo tendo duas cópias do mesmo alelo de um gene particular é homozigoto neste local enquanto um indivíduo tendo dois alelos diferentes de um gene particular é heterozigoto.

"Doença de expansão de repetição" refere-se a qualquer uma de cerca de duas dúzias de doenças humanas mostrando padrões de herança Mendeliana mostradas ser causadas pelas expansões de repetições em tandem intrinsecamente polimórficas, principalmente envolvendo motivos de trinucleotídeo diferentes, mas não mais seqüências de repetição de até 12- mers (Tabela 1). Uma característica de um alelo contendo uma repetição em tandem expandida é uma instabilidade excessiva em gerações sucessivas (mutações dinâmicas). Ainda, esses alelos podem diferir em comprimentos entre várias populações de célula do mesmo organismo (mosaicismo). Um tipo de doença de expansão de repetição são os distúrbios de repetição de trinucleotídeo (por exemplo, síndrome do X frágil, distrofia miotônica 1, etc) a forma mais abundante de doenças de expansão de repetição. Essas doenças exibem instabilidade de repetição intergeracional com uma tendência à expansão adicional da repetição em tandem. Comprimentos de repetição grandes em gerações sucessivas podem levar a uma idade mais precoce de início em indivíduos afetados e/ou uma acentuação de sintomas clínicos. Os métodos de medição de comprimento de repetição em tandem conforme aqui descrito podem ser aplicados para medir comprimento de repetição em tandem para qualquer uma das doenças/genes na Tabela 3. Tabela 1. Doenças de expansão de repetição em tandem exemplares Doença (designação do gene) Proteína Seqüência de Localização da Faixa de Repetição repetição em tandem repetição repetição normal expandida Atrofia Dentatorrubral-palidoluisiana atrofina-1 CAG codificação 6-35 49-88 (DRPLA) Epilepsia mioclônica progressiva CSTB CCCCGCCCCGCG 5' UTR 2-3 50-80 (EPM1)# (SEQ ID NO: 39) Síndrome do XA Frágil (FRAXA)* FMR1 CGG 5' UTR 6-53 >230 Síndrome do XE Frágil (FMR1)* FMR-2 GCC 5' UTR 6-35 >200 Ataxia de Friedreich (FRDA)# Frataxina GAA intrônica 7-34 >100 Doença de Huntington (huntingtina) huntingtina CAG codificação 4-35 36-250 Doença de Huntington-tipo 2 (JPH-3) juntofilina-3 CTG codificação 6-27 >40-60 Atrofia musc. Espinobulbar, doença de rec. de CAG codificação 9-36 38-62 Kennedy (AR)* androgênio Distrofia miotôinca 1 (DM1) DMPK/SI X5 CTG 3' UTR 5-37 >50 Distrofia miotônica 2 (DM2) ZNF9 CCTG intrônica 10-26 75-> 11000 Ataxia espinocerebelar 1 (SCA1) ataxina-1 CAG codificação 6-44 39-82 Ataxia espinocerebelar 2 (SCA2) ataxina-1 CAG codificação 15-31 36-63 Tabela 1. continuação Doença (designação do gene) Proteína Seqüência de Localização da Faixa de Repetição repetição em tandem repetição repetição normal expandida Ataxia espinocerebelar 3, doença de ataxina-1 CAG codificação 12-40 55-84 Machado-Joseph (SCA3) Ataxia espinocerebelar 6 (SCA6) CACNA1A CAG codificação 4-18 21-33 Ataxia espinocerebelar 7 (SCA7) ataxina-7 CAG codificação 4-35 37-306 Ataxia espinocerebelar 8 (SCA8) desconhecida CTG 3' UTR 16-37 110-250 Ataxia espinocerebelar 10 (SCA 10) ataxina-10 ATTCT intrônica 10-22 800-4600 Ataxia espinocerebelar 12 (SCA 12) PP2A-PR55B CAG promotor 7-28 66-78 Ataxia espinocerebelar 17 (SCA 17) TBP CAG codificação 25-42 47-63 Distrofia muscular oculofaringeal PABPN1 GCG codificação 6 7-13 (PABPN1) Sinpolidactilia HOXD13 GCN codificação 15 22-24 * = Cromossomo X; # = autossômico recessivo; não-designado = autossômico dominante. Conforme aqui usado, o termo "oligonucleotídeo" refere-se a um polímero curto composto de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou qualquer combinação dos mesmos. Oligonucleotídeos da invenção são geralmente entre cerca de 10 e cerca de 100 nucleotídeos de comprimento.

Oligonucleotídeos são de preferência entre 15 a 70 nucleotídeos de comprimento, com 20 a 26 nucleotídeos sendo o mais comum. O código de letra única para nucleotídeos é conforme descrito no U.S. Patent Office Manual of Patent Examining Procedure, seção 2422, tabela 1. Com relação a isso, a designação de nucleotídeo "R" significa guanina ou adenina, "Y" representa 10 timina (uracila de RNA) ou citosina; e "M" significa adenina ou citosina. Um oligonucleotídeo pode ser usado como um iniciador ou como uma sonda.

Conforme aqui usado, o termo "substancialmente purificado" em referência a oligonucleotídeos não requer pureza absoluta. Ao contrário, representa uma indicação de que a seqüência é relativamente mais pura do 15 que no ambiente natural. Tais oligonucleotídeos podem ser obtidos através de vários métodos incluindo, por exemplo, síntese de laboratório, digestão de enzima de restrição ou PCR. Um oligonucleotídeo "substancialmente purificado" é de preferência mais do que 50% puro, com mais preferência pelo menos 75% puro e com mais preferência pelo menos 95% puro.

Conforme aqui usado, um oligonucleotídeo é "específico" para

um ácido nucleico se o oligonucleotídeo tiver pelo menos 50% de identidade de seqüência com uma porção do ácido nucleico quando o oligonucleotídeo e o ácido nucleico são alinhados. Um oligonucleotídeo que é específico para um ácido nucleico é um que, sob as condições de hibridização ou lavagem 25 apropriadas, é capaz de hibridização para o alvo de interesse e não substancialmente hibridização para ácidos nucleicos que não são de interesse. Níveis mais altos de identidade de seqüência são preferidos e incluem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e com mais preferência pelo menos 98% de identidade de sequên30 cia.

Conforme aqui usado, o termo "hibridiza" ou "hibridiza especificamente" refere-se a um processo onde dois filamentos de ácido nucleico complementares anelam um para o outro sob condições apropriadamente estringentes. Hibridizações são tipicamente e de preferência conduzidas com moléculas de ácido nucleico de comprimento de sonda, de preferência 20-100 nucleotídeos de comprimento. Técnicas de hibridização de ácido nucleico são bem conhecidas no campo. Vide, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Press, Palinview, N.Y. Aqueles versados na técnica compreendem como estimar e ajustar a estringência de condições de hibridização de modo que seqüências tendo pelo menos um nível desejado de complementaridade vão hibridizar estavelmente, enquanto aquelas tendo menor complementaridade não. Para exemplos de condições e parâmetros de hibridização, vide, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.; Ausubel, F.M. e outros, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J.

O termo "substancialmente complementar" conforme aqui usado significa que duas seqüências hibridizam sob condições de hibridização estringentes. O versado na técnica vai compreender que seqüências substancialmente complementares não precisam hibridizar ao longo de seu compri20 mento completo. Em particular, seqüências substancialmente complementares compreendem uma seqüência contígua de bases que não hibridiza para uma seqüência alvo ou marcadora, posicionada 3' ou 5' para uma seqüência contígua de bases que hibridiza sob condições de hibridização estringentes para um alvo ou seqüência marcadora.

O termo "complemento" conforme aqui usado significa a seqüên

cia complementar a um ácido nucleico de acordo com as regras de empareIhamento Watson/Crick padrão. Uma seqüência complementar pode ser também uma seqüência de RNA complementar à seqüência de DNA ou sua seqüência complemento, e pode ser também um cDNA.

O termo "seqüência de codificação" conforme aqui usado signifi

ca uma seqüência de um ácido nucleico ou seu complemento, ou uma parte do mesmo, que pode ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para e/ou o polipeptídio ou um fragmento do mesmo. Seqüências de codificação incluem exons em um DNA genômico ou transcritos de RNA primários imaturos, que são unidos pelo maquinário bioquímico da célula para prover um mRNA maduro. O filamento de antissentido é o complemento de tal áci5 do nucleico e a seqüência de codificação pode ser deduzida a partir do mesmo.

O termo "seqüência de não-codificação" conforme aqui usado significa uma seqüência de um ácido nucleico ou seu complemento, ou uma parte do mesma, que não é transcrito em aminoácido in vivo, ou onde tRNA 10 não interage para estabelecer ou tentar estabelecer um aminoácido. Seqüências de não-codificação incluem ambas as seqüências íntron no DNA do genoma ou transcritos de RNA primário imaturo, e seqüências associadas a gene tal como promotores, realçadores, silenciadores, etc.

O termo "amplificação" ou "amplificar" conforme aqui usado significa um ou mais métodos conhecidos na técnica para cópia de um ácido nucleico alvo, deste modo aumentando o número de cópias de uma seqüência de ácido nucleico selecionada. Amplificação pode ser exponencial ou linear. Um ácido nucleico alvo pode ser ou DNA ou RNA. As seqüências amplificadas desta maneira formam um "amplicon". Embora os métodos exemplares descritos a seguir refiram-se à amplificação usando a reação em cadeia de polimerase ("PCR"), vários outros métodos são conhecidos na técnica para amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, métodos isotérmicos, métodos de "Rolling circle", etc). O versado na técnica vai compreender que esses outros métodos podem ser usados ou em lugar de ou junto com métodos de PCR. Vide, por exemplo, Saiki, "Amplification of Genomic DNA" em PCR Protocols, Innits e outros, Eds., Academic Press, São Diego, CA, 1990, pp. 13-20; Wharam e outros, Nucleic Acids Res., 2001, 1 junho 1; 29(11):E54-E54; Hafner e outros, Biotechniques, 2001, Abril; 30(4):852-6, 858, 860 passim; Zhong e outros, Biotechniques, 2001 Abril; 30(4):852-6, 858, 860 passim.

Conforme aqui usado, um "iniciador" para amplificação é um oligonucleotídeo que anela especificamente para uma seqüência de nucleotídeo alvo ou marcadora. O nucleotídeo 3' do iniciador pode ser idêntico à seqüência alvo ou marcadora em uma posição de nucleotídeo correspondente para amplificação ótima.

"Filamento de sentido" significa o filamento de DNA de filamento duplo (dsDNA) que inclui pelo menos uma porção de uma seqüência de codificação de uma proteína funcional. "Filamento de antissentido" significa o filamento de dsDNA que é o complemento reverso do filamento de sentido.

Conforme aqui usado, um "iniciador avançado" é um iniciador que anela para o filamento de antissentido de dsDNA. Um "iniciador reverso" anela para o filamento de sentido de dsDNA.

Conforme aqui usado, seqüências que têm "identidade de seqüência alta" têm nucleotídeos idênticos pelo menos cerca de 50% de posições de nucleotídeo alinhadas, de preferência pelo menos cerca de 75% de posições de nucleotídeo alinhadas, com mais preferência pelo menos cerca 15 de 90% de posições de nucleotídeo alinhadas e com mais preferência pelo menos cerca de 95% de posições de nucleotídeo alinhadas.

Conforme aqui usado, "sistema de detecção de PCR TaqMan" refere-se a um método para PCR de tempo real. Neste método, uma sonda TaqMan que hibridiza para o segmento de ácido nucleico amplificado está 20 incluída na mistura de reação de PCR. A sonda TaqMan compreende um doador e um extintor fluoróforo em qualquer extremidade da sonda e está em proximidade íntima suficiente um com o outro de modo que a fluorescência do doador é absorvida pelo extintor. No entanto, quando a sonda hibridiza para o segmento amplificado, a atividade de exonuclease 5' da polimera25 se Taq cliva a sonda então permitindo que o fluoróforo doador emita fluorescência que pode ser detectada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Um esquema mostrando uma modalidade do método de detecção das repetições em tandem. A presença de fragmentos de FMR1 com um comprimento particular de repetição em tandem é mostrada esquematicamente na parte inferior para cada fração de tamanho indicada (isto é, pequena, média e grande). A designação de + ou - é mostrada abaixo da PCR para indicar se amplificação por PCR da seqüência marcadora de flanqueamento acontece quando o fragmento particular está presente na fração.

Figura 2. Seqüência exemplar (SEQ ID NO: 1) de uma região do gene FMR1 mostrando a região de repetição em tandem CGG (sublinhado simples), locais preferidos para hibridização de iniciadores de PCR (regiões sombreadas) e um local preferido para hibridização de sonda (sublinhado duplo).

Figura 3. Seqüência exemplar (SEQ ID NO: 2) da região nãotraduzida 3' a jusante do gene DM-1 mostrando a região de repetição em tandem CTG (sublinhado simples), locais preferidos para hibridização de iniciadores de PCR (regiões sombreadas) e um local preferido para hibridização de uma sonda (sublinhado duplo).

Figura 4. Seqüência exemplar (SEQ ID NO: 3) da primeira região intrônica do gene FRDA mostrando a região de repetição em tandem CAA (sublinhado simples), locais preferidos para hibridização de iniciadores de PCR (regiões sombreadas) e um local preferido para hibridização de uma sonda (sublinhado duplo).

Figura 5. Mapa de enzima de restrição de uma região do gene FMR1. FXCEF3, FXCER3, FMR1F4, FMR1R4, FXCEF2 e FXCER2 mostram 20 o local de hibridização de iniciadores de oligonucleotídeos preferidos. FXCEF3/FXCER3, FMR1F4/FMR1R4 e FXCEF2/FXCEFR2 são pares de iniciador preferidos para amplificação de seqüências marcadoras quando o ácido nucleico é fragmentado com SphIIBamW, Alul e Blpl/Mlyl, respectivamente. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 25 De acordo com a presente invenção, são providos métodos de

detecção de um segmento de ácido nucleico particular de interesse em uma amostra de ácidos nucleicos. Em modalidades particulares, o segmento de ácido nucleico particular de interesse é uma repetição em tandem e o método é usado para determinar informação sobre o tamanho de tal repetição em 30 tandem. Esta informação pode ser usada para determinar se um indivíduo carrega uma mutação genética caracterizada por um aumento (isto é, expansão) ou uma diminuição (isto é, redução) no número de repetições em tandem associadas com um gene particular. Então, é descrito um método de medição do tamanho de um segmento de repetição em tandem em uma amostra de ácidos nucleicos, o método compreendendo identificação da repetição em tandem em frações de fragmentos de ácido nucleico separados por 5 tamanho através da detecção de uma seqüência marcadora flanqueando o segmento de repetição em tandem e então relação do tamanho da fração contendo a repetição com o tamanho de um segmento de repetição em tandem presente em tais fragmentos de ácido nucleico. A Figura 1 mostra uma modalidade do presente método em forma esquemática. Como será discuti10 do, uma variação deste método é realizar uma segunda fragmentação após a separação por tamanho e antes da etapa de "análise".

Preparação da Amostra

Os métodos da presente invenção podem ser usados para detectar mutações caracterizadas por uma expansão ou redução de região de 15 repetição em tandem de um gene no DNA genômico de uma amostra de teste. Deste modo, o método pode ser realizado usando qualquer amostra biológica contendo DNA genômico. Exemplos incluem amostras de tecido ou qualquer fluido corporal contendo célula. Sangue é a amostra biológica preferida. Amostras biológicas podem ser obtidas através de procedimentos 20 padrão e podem ser usadas imediatamente ou armazenadas, sob condições apropriadas para o tipo de amostra biológica, para uso posterior.

Métodos de obtenção de amostras de teste são bem conhecidos daqueles versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a, aspirações, seções de tecido, coleta de sangue ou outros fluidos, biópsias cirúrgi25 cas ou de agulha e similar. A amostra de teste pode ser obtida de indivíduo ou paciente. A amostra de teste pode conter células, tecidos ou fluido obtido de um paciente suspeito de ser afligido com ou um carreador de um distúrbio causado por uma expansão de seqüências de repetição em tandem. A amostra de teste pode ser um líquido ou um tecido contendo célula. Amostras 30 podem incluir, mas não estão limitadas a, fluido amniótico, biópsias, sangue, células sanguíneas, medula óssea, amostras de biópsia de agulha fina, fluido peritoneal, plasma, fluido pleural, saliva, sêmen, soro, tecido ou homogenatos de tecido, seções de tecido congeladas ou em parafina. Amostras podem ser também processadas, tal como seccionamento de tecidos, fracionamento, purificação ou separação de organela celular.

Os métodos da invenção podem ser usados para realizar diag5 nóstico pré-natal usando qualquer tipo de célula embriônica ou fetal ou fluido corporal contendo ácido nucleico. Células fetais podem ser obtidas de fêmeas grávidas ou de uma amostra de um embrião. Então, células fetais estão presentes em fluido amniótico obtido através de amniocentese, vilos coriônicos aspirados por seringa, sangue umbilical percutâneo, uma biópsia de 10 pele fetal, um blastômero de um embrião de estágio de quatro células a oito células (pré-implante) ou amostra de trofectoderma de um blastócito (préimplante ou através de lavagem da urina).

Em modalidades particulares, DNA genômico pode ser usado. DNA genômico pode ser isolado de células ou tecidos usando métodos padrão, vide, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY. Fragmentação de DNA Genômico

DNA genômico pode ser fragmentado através de vários métodos bem conhecidos na técnica. De preferência, uma digestão de endonuclease de restrição é usada para fragmentar o DNA.

Uma "endonuclease de restrição" ou "enzima de restrição" conforme aqui usado refere-se a uma enzima que corta DNA de filamento duplo em uma seqüência específica (isto é, a seqüência ou sítio de reconhecimento). A frequência com a qual uma dada endonuclease de restrição corta DNA 25 depende do comprimento do sítio de reconhecimento da enzima. Por exemplo, algumas enzimas reconhecem sítios que são de quatro nucleotídeos de comprimento (referidos como "four cutters"). Em geral uma pessoa pode estimar com qual frequência uma enzima deve cortar um pedaço de DNA com base no comprimento do sítio de reconhecimento e suposição de que a pro30 babilidade de qualquer nucleotídeo ocorrer em uma dada localização seja %. Supondo que cada nucleotídeo tenha uma chance igual (isto é, %) de ocorrer em qualquer sítio particular dentro da seqüência de quatro nucleotídeos, então um "four-cutter" deve em média cortar uma a cada 256 pares de base (isto é, % x % x Va x Va = 1/256). Um cálculo similar pode ser aplicado a qualquer enzima de restrição contanto que o comprimento de seu sítio de reconhecimento seja conhecido, tornando possível prever o tamanho e número 5 de um fragmento de DNA que seriam obtidos cortando uma molécula de DNA de tamanho conhecido. Isto permite que um versado na técnica produza fragmentos de DNA de tamanho conhecido. Endonucleases de restrição são obtidas de bactérias ou são produzidos através de tecnologia recombinante e estão prontamente disponíveis de várias fontes comerciais.

No método de fragmentação de endonuclease de restrição, uma

endonuclease de restrição é combinada com uma amostra de DNA genômico e tampão apropriados para atividade ótima da endonuclease. Em geral, 1 unidade de endonuclease vai digerir 1 pg de DNA em 1 hora a 37°C.

Um versado na técnica reconheceria que este método de frag15 mentação pode ser modificado usando uma enzima de restrição que corta em uma frequência particular ou um sítio particular, ou usando enzimas de restrição múltiplas. A escolha de enzima ou combinações de enzima é feita para adequar o gene de interesse em um ensaio. Em geral, uma pessoa escolheria uma enzima ou combinações de enzima para gerar um fragmento 20 contendo a região de repetição em tandem completa e a seqüência marcadora a montante ou a jusante. Enzimas para fragmentação podem ser escolhidas usando um mapa de enzima de restrição da região circundando a repetição em tandem. Tais mapas podem ser prontamente gerados por programas de software bem conhecidos daqueles versados na técnica.

Em particular, uma pessoa escolheria uma enzima ou uma com

binação de enzimas para obter um fragmento apropriadamente dimensionado para distinguir uma região de repetição em tandem de comprimento normal de uma região de repetição em tandem de comprimento anormal. Na determinação de um tamanho apropriado de um fragmento, uma pessoa 30 consideraria a diferença na faixa de comprimentos de uma região de repetição em tandem normal conforme comparado com aquela de uma região de repetição em tandem anormal. Por exemplo, se as diferenças entre uma região de repetição em tandem normal e uma região de repetição em tandem anormal forem pequenas, uma pessoa escolheria um fragmento de comprimento menor, enquanto se a diferença for grande uma pessoa escolheria um fragmento de comprimento mais longo.

Em modalidades preferidas, Alul é usada para fragmentar os

ácidos nucleicos. Alul é uma enzima de restrição que reconhece uma seqüência de 4 nucleotídeos de DNA de filamento duplo (isto é, -AGCT-). Um versado na técnica reconheceria que os isosquizômeros (isto é, enzimas de restrição com a mesma seqüência de reconhecimento e sítio de corte) de 10 Alul podem prontamente substituir Alui. Exemplos de isosquizômeros de Alul incluem, mas não estão limitados a, BsaU, Marl, Mltl e Oxal. Um versado na técnica reconheceria ainda que um neoesquizômero (isto é, uma enzima de restrição com a mesma seqüência de reconhecimento que outra enzima, mas com um sitio de corte diferente) de Alul poderia também substituir Alui. 15 Um versado na técnica reconheceria que outras enzimas de res

trição com a mesma frequência de corte que Alul poderiam substituir Alul neste método. Por exemplo, Alul, que reconhece uma seqüência de 4 nucleotídeos, corta DNA em aproximadamente cada 256 bases. Outras enzimas com seqüências de reconhecimento de 4 nucleotídeos diferentes (por exem20 pio, Dnpl, Rsal, Mbol e Nlal) seriam esperadas cortar em uma frequência similar à Alul e então produziriam fragmentos de um tamanho similar àquele de Alui.

Em outras modalidades preferidas, Blpl e Mlyl são usadas em combinação para fragmentar os ácidos nucleicos. Em ainda outras modalidades preferidas, Sphl e Bmtl são usadas em combinação para fragmentar os ácidos nucleicos.

Separação por Tamanho de Fragmentos de DNA

Separação de fragmentos de DNA de acordo com tamanho pode ser realizada através de vários métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, vários métodos de eletroforese em gel ou cromatografia de coluna (por exemplo, cromatografia líquida de alta performance de exclusão de tamanho (SEC-HPLC) e HPLC de desnaturação (DHPLC)) podem ser usados.

Em eletroforese em gel, uma matriz de gel, a qual um campo elétrico é aplicado, é utilizada para separar moléculas de ácido nucleico ou fragmentos das mesmas com base em tamanho. Em geral, fragmentos de 5 ácido nucleico menores vão se mover mais rápido através da matriz de gel do que fragmentos maiores. Matrizes de gel preferidas incluem agarose e poliacrilamida.

Em modalidades preferidas, eletroforese capilar é usada para separar os ácidos nucleicos fragmentados. Eletroforese capilar é um método 10 de separação baseado na taxa de migração eletroforética diferencial de componentes de amostra em um capilar quando uma tensão é aplicada. Fragmentos ou moléculas separados são geralmente detectados em coluna usando análise espectrométrica ou fluorescência de UV através de uma janela no capilar. Em geral, um ou mais padrões (isto é, um segmento de áci15 do nucleico tendo comprimento conhecido) são primeiro injetados no capilar para determinar o tempo de eluição para cada padrão usando detecção em coluna. Então, os tempos de eluição dos padrões são usados para determinar a duração de tempo durante o qual uma fração será coletada a fim de atingir uma faixa de tamanho desejada para aquela fração.

Em algumas modalidades, as faixas de tamanho para as frações

usadas em um ensaio podem ser escolhidas com base no comprimento em pares de base de padrões comercialmente disponíveis. Vários padrões estão disponíveis contendo misturas de comprimentos de ácidos nucleicos. Em um exemplo, um fragmento de ácido nucleico contendo padrão tendo os com25 primentos que seguem é usado: 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb e 1000 pb. Então, frações seriam então escolhidas com base em um ou mais dos tamanhos presentes no padrão. Por exemplo, uma pessoa poderia escolher as três frações que seguem: 1) menos do que ou igual a 300 pb, 2) 301-500 pb e 3) maior do que ou igual a 501. Uma pes30 soa então coletaria frações da amostra de ácido nucleico fragmentado com base nos tempos de eluição dos padrões de 300 pb e 500 pb. A faixa em várias repetições em tandem presentes em cada fração pode ser calculada. Alternativamente, frações podem ser escolhidas com base em um número desejado de repetições em tandem para cada fração. Neste caso, padrões representando os limites superior e inferir em tamanho de cada fração podem ser sintetizados se não comercialmente disponíveis.

Em algumas modalidades, os fragmentos são separados no nú

mero menor de frações a fim de distinguir regiões de repetição em tandem de comprimento normal de anormal. Em modalidades particulares, os fragmentos podem ser separados em duas frações, uma correspondendo a uma região de repetição em tandem normal e uma correspondendo a uma região de repetição em tandem anormal.

Em outras modalidades, os fragmentos são separados em um número maior de frações a fim de determinar o tamanho da região de repetição em tandem. Em geral, mais frações vão permitir uma determinação mais precisa do comprimento da região de repetição em tandem. O número de 15 frações pode ser escolhido a fim de atingir um nível desejado de precisão na determinação do comprimento da região de repetição em tandem.

Em uma modalidade preferida do ensaio para determinar o número de repetições em tandem do gene FMR1, DNA fragmentado em Alul é separado em duas frações correspondendo a tamanhos de aproximadamen20 te 211-358 pb (fração menor) e 359 pb - 9 kb (fração superior). Fragmentos de amostras contendo um gene FMR1 normal (isto é, menos do que 55 repetições em tandem) vão se separar para a fração menor, enquanto fragmentos de genes FMR1 contendo pré-mutações (isto é, 55-200 repetições em tandem) ou mutações integrais (isto é, mais do que 200 repetições em 25 tandem) vão se separar na fração superior.

Em outra modalidade preferida o ensaio para determinar o número de repetições em tandem do gene FMR1, DNA fragmentado em Alul é separado em duas frações correspondendo a tamanhos de aproximadamente 211-400 pb (fração menor) e 401 pb - 9 kb (fração superior). Fragmentos 30 de amostra contendo um gene FMR1 normal (isto é, menos do que 55 repetições em tandem) e pré-mutações tendo 56-69 repetições em tandem, vão se separar na fração inferior, enquanto fragmentos de genes FMR1 contendo pré-mutações tendo 70-200 repetições em tandem ou mutações integrais (isto é, mais do que 200 repetições em tandem) vão se separar na fração superior.

Em outra modalidade preferida do ensaio para determinar o número de repetições em tandem do gene FMR1, DNA fragmentado em Alul é separado em quatro frações correspondendo a tamanhos de aproximadamente menos do que ou igual a 400 pb (primeira fração/menor), 401-500 pb (segunda fração), 501-800 pb (terceira fração) e 800 pb - 9 kb (quarta fração/maior). Fragmentos de amostras contendo um gene FMR1 normal (isto é, menos do que 55 repetições em tandem) e aqueles contendo pré-mutações tendo 56-68 repetições em tandem vão se separar na primeira fração/inferior, enquanto fragmentos de genes FMR1 contendo pré-mutações pequenas (isto é, 69-102 repetições em tandem) vão se separar na segunda fração, enquanto fragmentos dos genes FMR1 contendo pré-mutações maiores (isto é, 103-200 repetições em tandem) e mutação integrais tendo 201- 202 repetições em tandem vão se separar na terceira fração e enquanto mutações integrais tendo mais do que 202 repetições em tandem vão se separar na quarta fração/superior.

Em ainda outra modalidade preferida do ensaio para determinar o número de repetições em tandem do gene FMR1, DNA fragmentado com uma combinação de Sphl e Bmtl é separado em quatro frações correspondendo a tamanhos de aproximadamente menos do que ou igual a 500 pb (primeira fração/menor), 501-800 pb (segunda fração), 801-900 pb (terceira fração) e 901 pb - 9 kb (quarta fração/superior). Fragmentos de amostras contendo um gene FMR1 normal (isto é, menos do que 55 repetições em tandem) e aquelas contendo pré-mutações tendo 56-62 repetições em tandem vão se separar na primeira fração/inferior, enquanto fragmentos de genes FMR1 contendo pré-mutações pequenas (isto é, 63-163 repetições em tandem) vão se separar na segunda fração, enquanto fragmentos de genes FMR1 contendo pré-mutações grandes (isto é, 164-196 repetições em tandem) vão se separar na terceira fração, e enquanto pré-mutações grandes tendo 197-200 repetições em tandem e mutações integrais (isto é, mais do que 200 repetições em tandem) vão se separar na quarta fração/superior.

Em ainda outra modalidade preferida do ensaio para determinar

o número de repetições em tandem do gene FMR1, DNA fragmentado com uma combinação de Blpl e dMlyl é separado em quatro frações correspondendo a tamanhos de aproximadamente menos do que ou igual a 603 pb (primeira fração/inferior), 604-840 pb (segunda fração), 841-1078 pb (terceira fração) e 1079 pb - 9 kb (quarta fração/mais alta). Fragmentos de amostras contendo um gene FMR1 normal (isto é, menos do que 55 repetições em tandem) e aqueles contendo pré-mutações tendo 56-62 repetições em tandem vão se separar na primeira fração/inferior, enquanto fragmentos de genes FMR1 contendo pré-mutações pequenas (isto é, 63-140 repetições em tandem) vão se separar na segunda fração, enquanto fragmentos dos genes FMR1 contendo pré-mutações grandes (isto é, 141-200 repetições em tandem) e mutações integrais tendo 201-220 repetições em tandem vão se separar na terceira fração, e enquanto pré-mutações grandes tendo mais do que 220 repetições em tandem vão se separar na quarta fração/superior.

Em outra modalidade preferida, DNA fragmentado é separado em uma multiplicidade de frações, de acordo com tamanho. Coleta de fração automática é realizada usando, por exemplo, uma janela de tempo de fração 20 pré-ajustada, começando em aproximadamente 200 pb e terminando em 9 kb. Este método permite uma estimativa melhor de tamanho de fragmento e, então, uma estimativa do número de repetições.

Segunda Fragmentação de DNA

Em ainda outras modalidades preferidas, os métodos da inven25 ção incluem uma segunda fragmentação de ácido nucleico seguindo a separação por tamanho da primeira fragmentação de ácido nucleico. De preferência, uma digestão de endonuclease de restrição é usada para fragmentar mais o DNA. De preferência, a segunda fragmentação separa o segmento de repetição em tandem de uma seqüência marcadora associada.

Em modalidades preferidas, enzima de restrição BsaWI,

Hpy188l, Hphll ou BstNI é usada para a segunda fragmentação de ácido nucleico quando a seqüência marcadora está a montante do segmento de repetição em tandem. Em outras modalidades preferidas, enzima de restrição Smll, Bbvl ou Bmtl é usada para a segunda fragmentação de ácido nucleico quando a seqüência marcadora está a jusante do segmento de repetição em tandem. Um versado na técnica reconheceria que isosquizômeros e 5 neoesquizômeros das enzimas de restrição listadas poderiam ser também usados. Um versado na técnica seria capaz de identificar uma enzima de restrição adequada para a segunda fragmentação de ácido nucleico através da análise de fatores que incluem, mas não estão limitados a, a localização do marcador, a seqüência do marcador e a seqüência entre a seqüência 10 marcadora e o segmento de repetição em tandem.

Amplificação de Fragmentos de DNA Separados por Tamanho Seguindo Segunda Fragmentação

DNA separado por tamanho pode ser amplificado através de vários métodos conhecidos do versado na técnica. Métodos de amplificação 15 adequados para uso com os presentes métodos incluem, por exemplo, reação em cadeia de polimerase (PCR), reação em cadeia de Iigase (LCR), sistema de amplificação baseado em transcrição (TAS), reação de amplificação baseada em seqüência de ácido nucleico (NASBA), replicação de seqüência autossustentada (3SR), reação de amplificação de deslocamento de filamen20 to (DAS), amplificação de DNA boomerang (BDA), replicação Q-beta ou amplificação baseada em seqüência de ácido nucleico isotérmico. Esses métodos de amplificação descritos são cada um rapidamente descritos abaixo e são bem conhecidos na técnica.

PCR é uma técnica para fabricação de muitas cópias de uma 25 seqüência de DNA molde específica. A reação consiste em ciclos de amplificação múltiplos e é iniciada usando um par de seqüências de iniciador que hibridiza para as extremidades 5' e 3' da seqüência a ser copiada. O ciclo de amplificação inclui uma desnaturação inicial, e até 50 ciclos de anelamento, alongamento de filamento e separação de filamento (desnaturação). Em ca30 da ciclo da reação, a seqüência de DNA entre os iniciadores é copiada. Iniciadores podem se ligar ao DNA copiado bem como à seqüência molde original, de modo que o número total de cópias aumenta exponencialmente com o tempo. PCR pode ser realizada de acordo com Whelan e outros, Journal of Clinicai /W/croò/o/ogry, 33(3):556-561 (1995). Resumidamente, uma mistura de reação de PCR inclui dois iniciadores específicos, dNTPs, aproximadamente 0,25 U de polimerase Taq e tampão de PCR 1x. Para cada 25 5 μΙ de reação de PCR, amostra de 2 μΙ (por exemplo, DNA isolado de organismo alvo) é adicionada e amplificada usando um ciclador térmico.

LCR é um método de amplificação de DNA similar à PCR, exceto que ele usa quatro iniciadores ao invés de dois e usa a enzima Iigase para ligar ou unir dois segmentos de DNA. LCR pode ser realizada de acordo com 10 Moore e outros, Journal of Clinicai Microbiology 36(4): 1028-1031 (1998). Resumidamente, uma mistura de reação de LCR contém dois pares de iniciador, dNTP, DNA Iigase e DNA polimerase representando cerca de 90 μΙ, aos quais são adicionados 100 μΙ de ácido nucleico isolado do organismo alvo. Amplificação é realizada em um ciclador térmico (por exemplo, LCx de Ab15 bott Labs, North Chicago, IL).

TAS é um sistema de amplificação de ácido nucleico onde cada ciclo é compreendido de uma etapa de síntese de DNA e uma etapa de transcrição de RNA. Na etapa de síntese de cDNA, uma seqüência reconhecida por uma polimerase de RNA dependente de DNA (isto é, uma sequên20 cia de ligação de polimerase ou PBS) é inserida na cópia de cDNA a jusante da seqüência alvo ou marcadora a ser amplificada usando um primeiro de oligonucleotídeo de dois domínios. Na segunda etapa, uma polimerase de RNA é usada para sintetizar cópias múltiplas de RNA do molde de cDNA. Amplificação usando TAS requer apenas alguns ciclos porque transcrição de 25 RNA dependente de DNA pode resultar em 10-1000 cópias para cada cópia de molde de cDNA. TAS pode ser realizado de acordo com Kwoh e outros, PNAS 86:1173-7 (1989). Resumidamente, RNA extraído é combinado com tampão de amplificação de TAS e albumina de soro bovino, dNTPs, NTPs e dois iniciadores de oligonucleotídeo, um dos quais contém uma PBS. A a30 mostra é aquecida para desnaturar o molde de RNA e esfriada para a temperatura de anelamento de iniciador. Transcriptase reversa (RT) é adicionada à amostra incubada na temperatura apropriada para permitir alongamento de cDNA. Subsequentemente polimerase de RNA T7 é adicionada e a amostra é incubada a 37°C por aproximadamente 25 minutos para a síntese de RNA. As etapas acima são então repetidas. Alternativamente, após a síntese de cDNA inicial, ambas RT e polimerase de RNA são adicionadas seguindo uma desnaturação a 100°C de 1 minuto seguido por um alongamento de RNA de aproximadamente 30 minutos a 37°C. TAS pode ser também realizado em fase sólida de acordo com Wylie e outros, Journal of Clinicai Microbiology, 36(12):3488-3491 (1998). Neste método, alvos de ácido nucleico são capturados com contas magnéticas contendo iniciadores de captura específicos. As contas com alvos capturados são lavadas e peletizadas antes da adição de reagentes de amplificação que contêm iniciadores de amplificação, dNTP, NTP, 2500 U de transcriptase reversa e 2500 U de polimerase de RNA T7. Uma mistura de reação de TMA 100 μΙ é posta em um tubo, 200 μΙ de reagente de óleo são adicionados e amplificação é realizada através de incubação a 42°C em um banho de água por uma hora.

NASBA é um método de amplificação baseado em transcrição que amplifica RNA ou de alvo de RNA ou DNA. NASBA é um método usado para a amplificação contínua de ácidos nucleicos em uma mistura única em uma temperatura. Por exemplo, para amplificação de RNA, transcriptase do 20 vírus de mieloblastose de ave (AMV), RNase H e polimerase de RNA T7 são usadas. Este método pode ser realizado de acordo com Heim e outros, Nucleic Acids Res., 26(9):2250-2251 (1998). Resumidamente, uma mistura de reação de NASBA contém dois iniciadores específicos, dNTP, NTP, 6,4 U de transcriptase reversa AMV, 0,08 U de Rnase H de Escherichia colie 32 U de 25 polimerase de RAN T7. A amplificação é realizada por 120 minutos a 410C em um volume total de 20 μΙ.

Em um método relacionado, reação de replicação de seqüência (3SR) autossustentada, amplificação isotérmica de seqüências de DNA ou RNA alvo in vitro usando três atividades enzimáticas: transcriptase reversa, 30 polimerase de RNA dependente de DNA e ribonuclease H de Escheriehia eoli. Este método pode ser modificado de um sistema de 3 enzimas para um sistema de 2 enzimas usando transcriptase reversa do vírus da imunodeficiência humana (HIV)-I ao invés de transcriptase reversa do vírus da mieloblastose (AMV) para permitir amplificação com polimerase de RNA T7 mas sem ribonuclease H de E. coli. No 3SR de 2 enzimas, o RNA amplificado é obtido em uma forma mais pura comparado com 3SR de 2 enzimas (Gebi5 noga & Oehlenschaler, European Journal of Biochemistry, 235:256-261, 1996).

SDA é um método de amplificação de ácido nucleico isotérmico. Um iniciador contendo um sítio de restrição é anelado para o molde. Iniciadores de amplificação são então anelados para as seqüências adjacentes 5' 10 (formando um "mc/c") e amplificação é iniciada em uma temperatura fixa. Filamentos de DNA recém-sintetizados são "nicked" por uma enzima de restrição e a amplificação de polimerase começa novamente, deslocando os filamentos recém-sintetizados. SDA pode ser realizado de acordo com Walker e outros, PNAS, 89:392-6 (1992). Resumidamente, uma mistura de reação de 15 SDA contém quatro iniciadores de SDA, dGTP, dCTP, TTP, dATP, 150 U de Hinc Il e 5 U do fragmento grande deficiente em exonuclease de polimerase

I de DNA de E. coli ( polimerase exo' Klenow). A mistura de amostra é aquecida 95°C por 4 minutos para desnaturar DNA alvo antes da adição às enzimas. Após adição das duas enzimas, amplificação é realizada por 120 minutos a 37°C em um volume total de 50 μΙ. Então, a reação é terminada através de aquecimento por 2 minutos a 95°C.

Amplificação de DNA boomerang (BDA) é um método onde a polimerase começa extensão de um sítio de ligação de iniciador único e então faz uma volta para o outro filamento, eventualmente retornando para o 25 sítio de início original no DNA. BDA difere de PCR pelo seu uso de um iniciador único. Este método envolve uma digestão de endonuclease de um DNA de amostra, produzindo fragmentos de DNA diferentes com extremidades pegajosas, ligando os fragmentos a polinucleotídeos "adaptadores" (compreendidos de uma extremidade ligável e primeira e segunda seqüências 30 autocomplementares separadas por uma seqüência espaçadora) deste modo formando duplexes ligados. Os dúplexes ligados são desnaturados para formar moldes aos quais um iniciador de oligonucleotídeo anela em uma sequência específica dentro da seqüência alvo ou marcadora de interesse. O iniciador é estendido com uma polimerase de DNA para formar produtos de dúplex seguido por desnaturação dos produtos de dúplex. Ciclos múltiplos subsequentes de anelamento, extensão e desnaturação são realizados para atingir o grau desejado de amplificação (Patente U.S. No. 5.470.724).

O sistema de replicação Q-beta usa RNA como um molde. Qbeta replicase sintetiza o genoma de RNA de filamento simples do colifago QD. Clivagem do RNA e ligação em um ácido nucleico de interesse permitem a replicação desta seqüência quando o RNA é replicado pela Q-beta replicase (Kramer & Lizard, Trends Biotechnol. 1991 9(2):53-8. 1991).

Uma variedade de enzimas de amplificação é conhecida na técnica e inclui, por exemplo, polimerase de DNA1 polimerase de RNA, transcriptase reversa, Q-beta replicase, DNA termoestável e polimerase de RNA. Devido ao fato de que essas e outras reações de amplificação são catalisa15 das por enzimas, em um ensaio de etapa única os reagentes de liberação de ácido nucleico e os reagentes de detecção não devem ser inibidores potenciais de enzimas de amplificação se a última detecção for baseada em amplificação. Métodos de amplificação adequados para uso com os presentes métodos incluem, por exemplo, amplificação de deslocamento de filamento, 20 amplificação por círculo rolante "rolling c/rc/e", pré-amplificação de extensão de iniciador ou PCR de oligonucleotídeo degenerado (DOP). Esses métodos de amplificação são bem conhecidos na técnica e cada um descrito rapidamente abaixo.

De preferência, PCR é usada para amplificar uma seqüência 25 alvo ou marcadora flanqueando o segmento de repetição em tandem de interesse. Neste método, dois ou mais iniciadores de oligonucleotídeo que aneIam para filamentos opostos de uma seqüência alvo ou marcadora são repetitivamente anelados para suas seqüências complementares, estendidos por uma polimerase de DNA (por exemplo, polimerase AmpIiTaq Gold) e desna30 turados com calor, resultando em amplificação exponencial das seqüências de ácido nucleico alvo. Parâmetros de ciclização podem ser variados, dependendo do comprimento de ácidos nucleicos a serem estendidos. O versado na técnica é capaz de projetar e preparar iniciadores que são apropriados para amplificação de uma seqüência alvo ou marcadora. O comprimento dos iniciadores de amplificação para uso na presente invenção depende de vários fatores incluindo a identidade da seqüência de nucleotídeo e a tempe5 ratura na qual esses ácidos nucleicos são hibridizados ou usados durante amplificação de ácido nucleico in vitro. As considerações necessárias para determinar um comprimento preferido para um iniciador de amplificação de uma identidade de seqüência particular são bem conhecidas de uma pessoa versada na técnica e incluem considerações descritas aqui. Por exemplo, o 10 comprimento de um ácido nucleico ou oligonucleotídeo curto pode se relacionar com sua especificidade ou seletividade de hibridização.

Em algumas modalidades, a amplificação pode incluir um iniciador marcado, deste modo permitindo detecção do produto de amplificação deste iniciador. Em modalidades particulares a amplificação pode incluir uma 15 multiplicidade de iniciadores marcados, de preferência tais iniciadores são distinguivelmente marcados, permitindo a detecção simultânea de produtos de amplificação múltiplos.

Iniciadores de oligonucleotídeo podem ser projetados que estão entre cerca de 10 e cerca de 100 nucleotídeos de comprimento e hibridizam para a seqüência marcadora. Iniciadores de oligonucleotídeo são de preferência de 12 a 70 nucleotídeos; com mais preferência 15-60 nucleotídeos de comprimento; e com mais preferência 15-25 nucleotídeos de comprimento.

Em uma modalidade, um par de iniciador é projetado para amplificar uma seqüência marcadora a montante da região de repetição em tan25 dem do gene FMR1 seguindo separação por tamanho de fragmentos de ácido nucleico por Alui. Uma seqüência marcadora exemplar a montante da região de repetição em tandem de FMR1 para projeto de iniciadores de hibridização é mostrada na Figura 2 (SEQ ID NO: 1). Um iniciador avançado pode hibridizar para SEQ ID NO: 1 entre os nucleotídeos 1 e 45, com mais 30 preferência entre as posições 22 e 39, enquanto um iniciador reverso pode hibridizar para SEQ ID NO: 1 entre posições 70 e 115, com mais preferência entre 97 e 113. Um exemplo é usar um par de iniciador para amplificar uma região da seqüência de flanqueamento correspondendo a aproximadamente 95 pb a montante da região de repetição em tandem; mais especificamente usando um iniciador avançado, SEQ ID NO; 4 e um iniciador reverso, SEQ ID NO: 5 para amplificar uma região de 93 pb da seqüência marcadora. En5 tão, oligonucleotídeos preferidos que podem ser usados como iniciadores de amplificação incluem SEQ ID NO: 4 (5-GGTGGAGGGCCGCCTCTG-31) e SEQ ID NO: 5 (5'-AGCGGCGCCTCCGTCAAC-3'). Outros iniciadores de oligonucleotídeo preferidos são de aproximadamente 15-100 nucleotídeos de comprimento e compreendem SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Ainda 10 outros iniciadores de oligonucleotídeo preferidos incluem uma seqüência de oligonucleotídeo que hibridiza para o complemento de uma seqüência de 15- 100 nucleotídeos incluindo SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Tais oligonucleotídeos podem ser substancialmente purificados.

Tabela 2. Iniciadores para amplificação de seqüências marcadoras flanqueando FMR1

Nome do Iniciador SEQ ID NO: Seqüência do Iniciador FMR1F4 4 5'-GGTGGAGGGCCGCCT CT G-3' FMR1R4 5 5'-AGCGGCGCCTCCGTCACC-3' FXCEF2 6 5'-GATGGAGGAGCT GGT GGT GG-3' FXCER2 7 5-GGAAGGGCGAAGATGGGG-3' FXCEF3 8 5'-CGTGACGTGGTTTCAGTGTTTACA-3' FXCER3 9 5'-GGAAGTGAAACCGAAACGGAG-3' Em outra modalidade, um par de iniciador é projetado para am

plificar uma seqüência marcadora flanqueando a região de repetição em tandem do gene FMR1 seguindo separação por tamanho de ácidos nucleicos fragmentados por Blpl e Mlyl. Em um exemplo, um par de iniciador é 20 usado para amplificar uma região da seqüência de flanqueamento a jusante da região de repetição em tandem; mais especificamente usando um iniciador adiantado, FXCEF2 (SEQ ID NO: 6), e um iniciador reverso, FXCER2 (SEQ ID NO: 7), para amplificar uma região de 86 pb da seqüência marcadora. Então, oligonucleotídeos preferidos que podem ser usados como inicia25 dores de amplificação incluem SEQ ID NO: 6 (5'-GATGGAGGAGCTGGTGG TGG-3') e SEQ ID NO: 7 (5'-GGAAGGGCGAAGATGGGG-3'). Outros iniciadores de oligonucleotídeo preferidos são de aproximadamente 15-100 nucleotídeos de comprimento e compreendem SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7. Ainda outros iniciadores de oligonucleotídeo preferidos incluem uma se5 quência de oligonucleotídeo que hibridiza para o complemento de uma seqüência de 15-100 nucleotídeos incluindo SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7. Tais oligonucleotídeos podem ser substancialmente purificados.

Em outra modalidade, um par de iniciador é projetado para amplificar uma seqüência marcadora flanqueando a região de repetição em 10 tandem do gene FMR1 seguindo separação por tamanho de ácidos nucleicos fragmentados por Sphl e Bmtl. Em um exemplo, um par de iniciador é usado para amplificar uma região da seqüência de flanqueamento a jusante da região de repetição em tandem; mais especificamente usando um iniciador avançado, FXCEF3 (SEQ ID NO: 8) e um iniciador reverso, FXCER3 15 (SEQ ID NO: 9), para amplificar uma região de 86 pb da seqüência marcadora. Então, oligonucleotídeos preferidos que podem ser usados como iniciadores de amplificação incluem SEQ ID NO: 8 (5'-CGTGACGTGGTTTCAGT GTTTACA-3') e SEQ ID NO: 9 (5-GGAAGTGAAACCGAAACGGAG-3'). Outros iniciadores de oligonucleotídeo preferidos são de aproximadamente 15- 20 100 nucleotídeos de comprimento e compreendem SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9. Ainda outros iniciadores de oligonucleotídeo preferidos incluem uma seqüência de oligonucleotídeo que hibridiza para o complemento de uma seqüência de 15-100 nucleotídeos incluindo SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9. Tais oligonucleotídeos podem ser substancialmente purificados.

Controles de ensaio podem ser usados no ensaio para detecção

de carreadores e indivíduos afligidos pela síndrome do X frágil. Controles positivos para gene FMR1 normal ou do tipo selvagem (isto é, menos do que 55 repetições em tandem), a pré-mutação (55-200 repetições em tandem) e a mutação integral (mais do que 200 repetições em tandem) podem ser usados.

Controles adicionais podem ser incluídos no ensaio para determinar se a digestão da enzima de restrição do DNA genômico está completa. Uma abordagem para avaliar o término da digestão por uma enzima de restrição particular é determinar se o DNA digerido pode apoiar uma amplificação por PCR usando um par de iniciador de teste que amplia o sítio da enzima de restrição usada para digestão. Então, se o ácido nucleico foi 5 completamente digerido pela enzima de restrição, não deve haver nenhuma amplificação a partir do par de iniciador de teste, no entanto, se digestão estiver incompleta, deixado algum ácido nucleico intacto, o par de iniciador de teste deve amplificar o alvo. Esta amplificação por PCR da digestão de teste pode ser conduzida a qualquer momento após digestão incluindo du10 rante amplificação da seqüência marcadora.

Tabela 3. Iniciadores controle exemplares

Nome do SEQ ID Seqüência do Iniciador Iniciador NO: AIuIF 10 5'-CT CCAAT GCCT CCT GCGT CC-3' AIuIR 11 5'-GGGGGTAGGGAGT GT CT GAGAGT CT-3' Blpl F 12 5'-AGTGTTTAGAAGGAAAAGGCTGAGC-3' Blpl R 13 5'-GCCCAAAGTTTCATAGGTAGCAAA-3' LargeF 14 5'-CACCCT ACAAGCCGT CGCTAACA-3' LargeR 15 5'-CGTGCCTT GT CGGTAT CATTAGCAA-3' FIIctrIIF 16 5'-CT GAATTT GTTTGGTTT GAT GAT GC-3' FIIctrIIR 17 5'-CCTGTGTTATCTGTGCCCATTTTAA-3' Flllctrl3F 18 5'-/6-FAM/AT CTGGGT CT GAATAAT GT GAGG AG-3' Flllctrl3R 19 5'-CCTAACTTT CATT CTT GT CACCCTT-3' LgctrIF 20 5'-/6-FAM/AGGTTT GAGT GTATCGCCT GAT AGA-3' LgetrIR 21 5'-T GAGTTT CAT GTTT GCT CTT GCT C-3' AIuIFtaq 22 5'-GCCT CCT GCGT CCTT GT AGA-3' AIuIRtaq 23 5'-T GAGAGT CTT GTTT CAG CAGT GTTAA-3' LargeFtaq 24 5'-CAAGCCGTCGCTAACAAGGA-3' LargeRtaq 25 5'-GAT GT CTT GTATGGTGCCCT CAT-3' Em uma modalidade particular de um ensaio para distinguir indivíduos normais de carreadores e indivíduos afetados de síndrome do X frágil, o DNA genômico é digerido com Alui. Então, o término da digestão de DNA genômico por Alul pode ser determinado através da amplificação de uma região contendo um sítio de reconhecimento de Alui. Em um exemplo de tal controle, um par de iniciadores, AIuIF e AIuIR (SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 1, respectivamente), é usado para amplificar um segmento alvo de 103 pb de um fragmento de ácido nucleico contendo um sítio de reconheci5 mento de Alui. Amplificação deste segmento vai acontecer quando digestão de Alul estiver incompleta. Em outra modalidade deste ensaio, o DNA genômico é digerido com Blpl e Mlyl Então, o término da digestão de DNA genômico por Blpl e Mlyl pode ser determinado através da amplificação de uma região contendo um sítio de reconhecimento de Blpl ou um Mlyl. Em um 10 exemplo de tal controle, um par de iniciadores, Blpl F e Blpl R (SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente), é usado para amplificar um segmento de 138 pb de segmento alvo de ácido nucleico contendo um sítio de reconhecimento de Blpl. Amplificação deste segmento vai apenas acontecer quando digestão de Blpl estiver incompleta.

Controles adicionais podem ser incluídos no ensaio para verificar

separação por tamanho apropriada de DNA fragmentado. Usando ferramentas de análise de seqüência conhecidas daqueles versados na técnica, uma pessoa poderia determinar a distribuição de tamanho de fragmentos obtidos usando uma enzima de restrição particular. Uma pessoa poderia então iden20 tificar um fragmento controle específico tendo um tamanho que corresponde à faixa de tamanho de uma fração particular. Então uma pessoa poderia verificar a separação por tamanho apropriada do DNA fragmentado através da detecção do fragmento controle na fração apropriada pelo seu tamanho. Uma pessoa poderia usar um fragmento controle único em uma fração, um 25 controle em cada fração relevante para a determinação de uma repetição em tandem normal versus anormal ou uma fração controle em todas as frações.

Em uma modalidade particular de um ensaio para distinguir indivíduos tendo um alelo de FMR1 normal daqueles tendo um alelo de FMR1 com pré-mutação e aqueles tendo um alelo de FMR1 de mutação integral, 30 uma amplificação controle é também incluída para determinar se os fragmentos contendo repetição em tandem maiores (obtidos através de digestão com Alul) estão coletados na fração apropriada de tamanho. Em um exempio de tal controle, um par de iniciadores, LargeF e LargeR (SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, respectivamente), vai amplificar um segmento de 121 pb de um fragmento de Alul de 8,479 pb do gene USP41 quando presente em uma fração. Em outra modalidade do ensaio, onde o DNA genômico é dige5 rido com Blpl e Mlyl, controles são incluídos para detectar separação por tamanho apropriada de fragmentos de 675 pb, 905 pb e 7,031 pb. Em um exemplo, um par de iniciadores, FIIctrIF e FIIctrIIR (SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17, respectivamente), vai amplificar um segmento de 102 pb de um fragmento de BlplM\y\ de 675 pb do gene CFTR quando presente em uma 10 fração. Em outro exemplo, um par de iniciadores, Flllctrl3F e Flllctrl3R (SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, respectivamente), vai amplificar um segmento de 113 pb de um fragmento de Blpl/Mlyl de 905 pb do gene CFTR quando presente em uma fração. Em outro exemplo, um par de iniciadores, LgctrIF e LgctrIR (SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21, respectivamente), vai amplificar 15 um segmento de 156 pb de um fragmento de Blpl/Mlyl de 7,031 pb do cromossomo 21 (21:20912766-20919795) quando presente em uma fração. Detecção de Seqüências Marcadoras

Seqüências marcadoras podem ser amplificadas antes da detecção ou podem ser detectadas diretamente após separação por tamanho 20 sem uma etapa de amplificação. Em algumas modalidades, a seqüência marcadora é amplificada e o amplicon resultante é detectado através de eletroforese, de preferência eletroforese capilar. Em modalidades preferidas, a seqüência marcadora é amplificada usando um iniciador marcado de modo que o amplicon resultante é detectavelmente marcado. Em modalidades pre25 feridas, o iniciador é fIuorescentemente marcado, no entanto, os iniciadores podem ser marcados de acordo com o método descrito abaixo para sondas de oligonucleotídeo.

Em modalidades preferidas, o DNA fragmentado é detectado diretamente, sem uma etapa de amplificação, usando duas sondas de ácido nucleico distinguivelmente marcadas que hibridizam para dois segmentos separados de uma seqüência marcadora a montante ou a jusante das repetições em tandem. A detecção simultânea de ambos marcadores em um complexo de hibridização indica a presença da seqüência marcadora (e então a repetição em tandem associada). Em uma modalidade, detecção é realizada usando um Trilogy 2020 Analyzer (US Genomics Wobum, MA). Nesta modalidade, duas sondas com marcadores fluorescentes distinguíveis são 5 contatadas com os fragmentos de DNA separados por tamanho. A mistura resultante de complexos de hibridização é direcionada a um tubo capilar onde ela é exposta a Iasers múltiplos de comprimentos de onda diferentes. Os marcadores fluorescentes das sondas são excisados de modo que fótons são emitidos e detectados. A detecção simultânea de marcadores fluores10 centes de cores diferentes indica a presença da região alvo.

Oligonucleotídeos de sonda podem ser detectavelmente marcados através de métodos conhecidos na técnica. Marcadores úteis incluem, por exemplo, corantes fluorescentes (por exemplo, Cy5®, Cy3®, FITC, rodamina, fósforos de lantamida, vermelho Texas), 32P, 35S, 3H, 14C1 125I, 131I, re15 agentes densos em elétron (por exemplo, ouro), enzimas, por exemplo, como geralmente usado em um ELISA (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, beta-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores colorimétricos (por exemplo, ouro coloidal), marcadores magnéticos (por exemplo, Dynabeads®), biotina, digoxigenina ou haptenos e proteínas para as 20 quais antissoro ou anticorpos monoclonais estão disponíveis. Outros marcadores incluem Iigantes ou oligonucleotídeos capazes de formar um complexo com o receptor ou complemento de oligonucleotídeo correspondente, respectivamente. O marcador pode ser diretamente incorporado ao ácido nucleico a ser detectado ou ele pode ser ligado a uma sonda (por exemplo, um 25 oligonucleotídeo) ou anticorpo que hibridiza ou se liga ao ácido nucleico a ser detectado.

Em uma modalidade preferida o marcador detectável é um fluoróforo. O termo "fluoróforo" conforme aqui usado refere-se a uma molécula que absorve Iuz em um comprimento de onda particular (frequência de exci30 tação) e subsequentemente emite Iuz de um comprimento de onda tipicamente mais longo (frequência de emissão), diferente, em resposta). Porções fluorescentes adequadas incluem os fluoróforos que seguem conhecidos na técnica:

Ácido 4-acetamido-4,-isotiocianatoestilbeno-2,2'-dissulfônico acridina e derivados: acridina

isotiocianato de acridina

Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647 (Molecular Probes) ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfônico (EDANS)

4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 dissulfonato (Lucifer Yellow VS)

N-(4-anilino-1 -naftil)maleimida antranilamida

corantes Black Hole QuencherTM (BHQTM) (biosearch Technologies) BODIPY® R-6G, BODIPY® 530/550, BODIPY® FL AmareIoBriIhante cumarina e derivados: cumarina

7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120) 7-amino-4-trifluormetilcouluarin (Coumarin 151)

Cy2®, Cy3®, Cy3,5®, Cy5®, Cy5,5® cianosina

4,'6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI)

5',5"-dibromopirogalol-sulfoneftaleína (Bromopyrogallol Red)

7,-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina pentaaceato de dietilenotriamina

ácido 4,4'-diisotiocianatodiidro-estilbeno-2,2'-dissulfônico

ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-dissulfônico

cloreto de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonila (DNS, cloreto de dansila)

ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzóico (DABCYL)

4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC)

Eclipse® (Epoch Biosciences Inc.) eosina e derivados: eosina

isotiocianato de eosina eritrosina e derivados: eritrosina B isotiocianato de eritrosina

etídio

fluoresceína e derivados:

5-carboxifluoresceína (FAM)

5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF)

2',7l-dimetóxi-4',5,-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE)

fluoresceína

isotiocianato de fluoresceína (FITC) hexacloro-6-carboxifluoresceína (HEX)

QFITC (XRITC)

tetraclorofluoresceína (TET)

fluorescamina IR144 IR446

isotiocianato de Malachite Green 4-metilumbeliferona orto cresolftaleína nitrotirosina pararosanilina Vermelho Fenol B-ficoeritrina, R-ficoeritrina o-ftaldialdeído Oregon Green® iodeto de propídio pireno e derivados pireno

butirato de pireno

butirato de succinimidil 1-pireno QSY® 7, QSY® 9, QSY® 21, QSY® 35 (Molecular Probes)

Reactive Red 4 (Cibacron® Brilliant Red 3B-A) rodamina e derivados:

6-carbóxi-X-rodamina (ROX)

6-carboxirodamina (R6G)

cloreto de sulfonila de Iissamina rodamina B rodamina (Rhod) rodamina B rodamina 123 rodamina verde

isotiocianato de rodamina X sulforodamina B sulforodamina 101

derivado de cloreto de sulfonila de sulforodamina 101 (Texas

Red)

N1N1N', N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA) tetrametil rodamina

isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC) riboflavina ácido rosólico

derivados de quelato de térbio

Outros análogos de nucleotídeo fluorescente podem ser usados, vide, por exemplo, Jameson, Meth. Enzymoi 278:363-390, 1997; Zhu1 Nuci Acids Res. 22:3418-3422, 1994. Patentes U.S. Nos. 5.652.099 e 6.268.132 25 também descrevem análogos de nucleosídeo para incorporação a ácidos nucleicos, por exemplo, DNA e/ou RNA, ou oligonucleotídeos, através de síntese enzimática ou química para produzir oligonucleotídeos fluorescentes. Patente U.S. No. 5.135.717 descreve reagentes ftalocianina e tetrabenztriazaporfirina para uso como marcadores fluorescentes.

O marcador detectável pode ser incorporado a, associado com

ou conjugado a um ácido nucleico. Marcador pode ser ligado por braços separados de vários comprimentos para reduzir impedimento estérico potencial ou impacto sob outras propriedades úteis ou desejadas. Vide, por exemplo, Mansfield, Moi Cell. Probes 9:145-156, 1995.

Marcadores detectáveis podem ser incorporados a ácidos nucleicos através de meios covalentes ou não-covalentes, por exemplo, através 5 de transcrição, tal como marcação de iniciador aleatório usando polimerase Klenow, ou tradução nick ou amplificação ou equivalente conforme conhecido na técnica. Por exemplo, uma base de nucleotídeo é conjugada a uma porção detectável, tal como corantes fluorescentes, por exemplo, Cy3® ou Cy5® e então incorporada a ácidos nucleicos genômicos durante síntese ou 10 amplificação de ácido nucleico. Ácidos nucleicos podem então ser marcados quando sintetizados usando conjugados de Cy3®- ou Cy5®-dCTP misturados com dCTP não-marcado.

Sondas de ácido nucleico podem ser marcadas usando PCT ou tradução nick na presença de nucleotídeos precursores marcados, por e15 xemplo, nucleotídeos modificados sintetizados através de acoplamento de alilamina-dUTP aos derivados de éster de succinimidila dos corantes fluorescentes ou haptenos (tal como biotina ou digoxigenina) podem ser usados; este método permite preparação de costume de nucleotídeos fluorescentes mais comuns, vide, por exemplo, Henegariu, Nat. Biotechnol. 18:345-348, 20 2000.

Sondas de ácido nucleico podem ser marcadas por meios nãocovalentes conhecidos na técnica. Por exemplo, o Kreatech Biotechnology's Universal Linkage System® (ULS®) provê uma tecnologia de marcação nãoenzimática, onde um grupo platina forma uma ligação coordenativa com 25 DNA, RNA ou nucleotídeos através da ligação à posição N7 de guanosina. Esta tecnologia pode ser também usada para marcar proteínas através de ligação a nitrogênio e enxofre contendo cadeias laterais de aminoácidos. Vide, por exemplo, Patentes U.S. No.s 5.580.990; 5.714.327; e 5.985.566; e Patente Européia No. 0539466.

A ligação de uma sonda à seqüência marcadora flanqueando a

região de repetição em tandem pode ser determinada através de hibridização como é bem conhecido na técnica. Hibridização pode ser detectada em tempo real ou em tempo não-real.

Um método geral para PCR de tempo real usa sondas fluorescentes tal como as sondas TaqMan®, molecular beacons e scorpions. As sondas empregadas em tecnologias TaqMan® e molecular beacon são baseadas no princípio de extinção de fluorescência e envolvem um fluoróforo doador e uma porção de extinção.

O termo "fluoróforo doador" conforme aqui usado significa um fluoróforo que, quando em proximidade grande com uma porção de extinção, doa ou transfere energia de emissão para o agente de extinção. Como um 10 resultado de energia de doação para a porção de extinção, o fluoróforo doador vai emitir menos Iuz em uma frequência de emissão particular que ele teria na ausência de uma porção de extinção posicionada mais próximo.

O termo "porção de extinção" conforme aqui usado significa uma molécula que, em proximidade grande com um fluoróforo doador, absorve a 15 energia de emissão gerada pelo doador e ou dissipa a energia como calor ou emite Iuz de um comprimento de onda mais longa do que o comprimento de onda de emissão do doador. No último caso, o agente de extinção é considerado ser um fluoróforo aceitador. A porção de extinção pode agir através de extinção proximal (isto é, colisional) ou através de transferência de ener20 gia de ressonância Fõster ou de fluorescência ("FRET"). Extinção através de FRET é geralmente usada em sondas TaqMan® enquanto extinção proximal é usada em sondas do tipo molecular beacon e scorpion.

Em extinção proximal (a.k.a. extinção por "contato" ou "colisional"), o doador está em proximidade grande com a porção de extinção de 25 modo que energia do doador é transferida para o agente de extinção, que dissipa a energia como calor oposto a uma emissão de fluorescência. Em extinção FRET, o fluoróforo doador transfere sua energia para um agente de extinção que libera a energia como fluorescência em um comprimento de onda maior. Extinção próxima requer posicionamento muito próximo do doa30 dor e porção de extinção, enquanto extinção FRET, também relacionada com distância, acontece em uma distância maior (geralmente 1-10 nm, a transferência de energia dependendo de R-6, onde R é a distância entre o doador e o aceitador). Então, quando extinção FRET está envolvida, a porção de extinção é um fluoróforo aceitador que tem um espectro de frequência de extinção que se sobrepõe ao espectro de frequência de emissão de doador. Quando extinção através de FRET é empregada, o ensaio pode de5 tectar um aumento em fluorescência de fluoróforo de doador resultante de distância maior entre o doador e o extintor (fluoróforo aceitador) ou uma diminuição em emissão de fluoróforo aceitador resultante de distância maior entre o doador e o extintor (fluoróforo aceitador).

Sondas TaqMan® (Heid e outros, 1996) usam a atividade de exonuclease 5' fluorogênica de polimerase Taq para medir a quantidade de seqüências alvo ou marcadoras em amostras de DNA. Sondas TaqMan® são oligonucleotídeos que contêm um fluoróforo doador geralmente na ou próximo da base 5' e uma porção de extinção tipicamente na ou próximo da base 3'. A porção de extinção pode ser um corante tal como TAMRA ou pode ser uma molécula não-fluorescente tal como ácido 4-(4-dimetilaminofenilazo) benzóico (DABCYL). Vide Tyagi e outros, Nature Biotechnology 16:49-53 (1998). Quando irradiado, o doador fluorescente excitado transfere energia para a porção de extinção ao redor através de FRET ao invés de fluorescência. Então, a proximidade grande do doador e do extintor previne emissão de fluorescência de doador enquanto a sonda está intacta.

Sondas TaqMan® são projetadas para anelar para uma região interna de um produto de PCR. Quando a polimerase replica um molde ao qual uma sonda TaqMan® é ligada, sua atividade de exonuclease 5' cliva a sonda. Isto põe um fim na atividade do agente de extinção (não FRET) e o 25 fluoróforo doador começa a emitir fluorescência que aumenta em cada ciclo proporcional à taxa de clivagem de sonda. Acúmulo de produto de PCR é detectado através do monitoramento do aumento em fluorescência do corante repórter (note que iniciadores não são marcados). Se o agente de extinção for um fluoróforo aceitador, então acúmulo de produto de PCR pode ser 30 detectado através de monitoramento da diminuição em fluorescência do fluoróforo aceitador.

Ensaio TaqMan® usa parâmetros de ciclagem térmica e condições de reação PCR universais. Devido ao fato da clivagem acontecer apenas se a sonda hibridizar para o alvo, a fluorescência detectada se origina de amplificação específica. O processo de hibridização e clivagem não interfere com o acúmulo exponencial do produto. Uma condição específica para 5 sondas fluorogênicas é que não haja nenhum G na extremidade 5'. Um 'G' adjacente ao corante repórter extingue fluorescência de repórter mesmo após clivagem.

Outros métodos de hibridização de sonda detectada em tempo real podem ser usados para detecção de amplificação de uma seqüência alvo ou marcadora flanqueando uma região de repetição em tandem. Por exemplo, as sondas MGB Eclipse® comercialmente disponíveis (Epoch Bioscience), que não contam com degradação de uma sonda, podem ser usadas. Sondas MGB Eclipse® funcionam através de um mecanismo de fluorescência disparada por hibridização. Sondas MGB Eclipse® têm o Eclipse® Dark Quencher e a MGB posicionados na extremidade 5' da sonda. O fluoróforo está localizado na extremidade 3' da sonda. Quando a sonda está em solução e não hibridiza, a conformação tridimensional traz o agente de extinção em proximidade grande com o fluoróforo, e a fluorescência é extinta. No entanto, quando a sonda anela para uma seqüência alvo ou marcadora, a sonda é descrita, o agente de extinção é movido do fluoróforo e a fluorescência resultante pode ser detectada.

Fluoróforos doadores adequados incluem 6-carboxifluoresceína (FAM), tetracoloro-6-carboxifluoresceína (TET), 2'-cloro-7'-fenil-1,4-dicloro-6- carboxifluoresceína (VIC) e similar. Agentes de extinção adequados incluem 25 tetra-metilcarboxirodamida (TAMRA) ácido 4-(4-dimetilaminofenilazo) benzóico ("DABCYL" ou um análogo de "DABCYL") e similar. Tetrametilrodamida (TMR) e 5-carboxirodamina 6G (RHD) podem ser combinadas como fluoróforos doadores com DABCYL como agente de extinção. Ensaios TaqMan multiplex podem ser realizados usando marcadores detectáveis múltiplos 30 cada um compreendendo uma combinação de doador e agente de extinção diferente. Sondas para detecção de seqüência amplificada em tempo real podem ser armazenadas congeladas (-IO0C a -30°C) como estoques de 100 μΜ. Sondas TaqMan estão disponíveis da Applied BioSystems (4316032).

Em uma modalidade preferida, PCR de tempo real é realizada usando sondas TaqMan® em combinação com uma amplificação/analisador adequado tal como o ABI Prism 7900HT Sequence Detection System. O ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System é um sistema de PCR de tempo real de alta produtividade que detecta e quantifica seqüências de ácido nucleico. Resumidamente, sondas TaqMan® específicas para a seqüência alvo ou marcadora amplificada são incluídas na reação de amplificação por PCR. Essas sondas contêm um corante repórter na extremidade 5' e um corante de extinção na extremidade 3'. Sondas hibridizando para seqüências alvo ou marcadoras diferentes são conjugadas com um corante repórter de fluorescência diferente. Durante PCR, as sondas fluorescentemente marcadas se ligam especificamente às suas respectivas seqüências alvo ou marcadoras; a atividade de nuclease 5' de Taq polimerase cliva o corante repórter a partir da sonda e um sinal de fluoresceína é gerado. O aumento em sinal de fluorescência é detectado apenas se a seqüência alvo ou marcadora for complementar à sonda e for amplificada durante PCR. Uma falta de combinação entre sonda e alvo reduz muito a eficiência de hibridização e clivagem de sonda. O ABI Prism 7700HT ou 7900HT Sequence detection System mede o aumento em fluorescência durante ciclagem térmica de PCR, provendo detecção em "tempo real" de acúmulo de produto de PCR.

A detecção em tempo real do ABI Prism 7900HT ou 7900HT Sequence Detector monitora a fluorescência e calcula Rn durante cada ciclo de PCR. O ciclo limiar, ou valor Ct, é o ciclo no qual fluorescência intersecta o valor limiar. O valor limiar é determinado através do software de sistema de detecção de seqüência ou manualmente.

Sondas de oligonucleotídeo podem ser projetadas que são entre cerca de 10 e cerca de 100 nucleotídeos de comprimento e hibridizam para a região amplificada. Sondas de oligonucleotídeo são de preferência de 12 a 30 70 nucleotídeos; com mais preferência 15-60 nucleotídeos de comprimento; e com mais preferência 15-25 nucleotídeos de comprimento. A sonda pode ser marcada. Em um exemplo, SEQ ID NO: 26 pode ser usada como uma sonda de oligonucleotídeo para detectar uma seqüência marcadora associada com a região de repetição em tandem do gene FMR1 (seguindo fragmento genômica por Alui), quando a seqüência marcadora é amplificada por iniciadores avançados e reversos conforme mostrado na SEQ ID NO: 4 e SEQ 5 ID NO: 5, respectivamente. A SEQ ID NO: 27 pode ser usada para detectar amplicons de um fragmento controle de Alul amplificados por AIuIFtaq e AluIRtaq (SEQ ID NOs: 22 e 23, respectivamente) e SEQ ID NO: 28 pode ser usada para detectar o amplicon do fragmento controle de Alui, conforme amplificado por LargeFtaq e LargeRtaq (SEQ ID NOs: 24 e 25, respectiva10 mente).

Tabela 4: Sondas TaqMan

Nome da Sonda SEQ ID NO: Seqüência da Sonda Flanqueamento de CGG 26 5'-6-FAM-CT CT GAGCGGGCG-3' Controle Alul 27 5' -VIC-AGGAAG CT AAGCAGTT G-3' Controle Larga 28 5'-N ED-ACT GTACACAACAT CG-3' Fragmentos amplificados podem ser detectados usando métodos de eletroforese em gel padrão. Por exemplo, em modalidades preferidas, frações amplificadas são separadas em um gel de agarose e tingidas com brometo de etídio através de métodos conhecidos na técnica para detectar fragmentos amplificados.

Dimensionamento através de Amplificação por PCR e Eletroforese

Em certas modalidades, métodos envolvendo amplificação da região de repetição em tandem são usados para medir o tamanho daquela 20 região. Em algumas modalidades, tais métodos são usados como uma avaliação antes do uso de um segundo método para dimensionamento da região de repetição em tandem. Em modalidades preferidas, a amplificação é de preferência feita através de PCR. Neste método, a região de repetição em tandem inteira é amplificada. Os amplicons resultantes são dimensionados 25 usando eletroforese, de preferência eletroforese capilar.

Em um exemplo, iniciador avançado FX-5F (SEQ ID NO: 29, 5' GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACT TCC GGT 3') é usado em uma reação de amplificação com iniciador reverso FX-3F (SEQ ID NO: 30, 5' AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT CCA-3') para amplificar a região de repetição em tandem do gene FMR1. De preferência, um dos iniciadores deste par de iniciador é marcado, de preferência o marcador é um marcador fluorescente. Produto de amplificação pode ser detectado e di5 mensionado através de eletroforese, de preferência eletroforese capilar. Alternativamente, produtos de amplificação podem ser detectados e dimensionados usando Southern blot.

Correlação de Tamanho de Fragmento a Estado Normal ou Carreador/ Afetado

A fração onde a seqüência marcadora a montante ou a jusante

da região de repetição em tandem é detectada corresponde ao tamanho do fragmento contendo a repetição em tandem. Esta correlação permite uma estimativa do número de repetições em tandem e, então, se um indivíduo é normal ou carrega um alelo tendo uma expansão na região de repetição em tandem.

Em algumas modalidades, indivíduos que são afligidos com uma doença associada com uma mutação na região de repetição em tandem de um gene podem ser distinguidos daqueles que são normais. Uma amostra de ácido nucleico do indivíduo é fragmentada para produzir fragmentos de 20 ácido nucleico onde o segmento de repetição em tandem do gene está associado com uma seqüência marcadora em um fragmento. Os fragmentos são separados em frações de acordo com o tamanho sob condições onde o(s) fragmento(s) contendo o segmento de repetição em tandem estará(ão) localizado(s) na fração de acordo com o número de repetições no segmento 25 de repetição em tandem, e identificação daquela(s) fração(ões) contendo o segmento através de detecção da seqüência marcadora. As frações são escolhidas de modo que uma fração corresponde a regiões de repetição em tandem tendo um número normal de repetições (isto é, um alelo normal) e outra fração que corresponde a um número anormal de repetições (isto é, 30 um alelo mutado). Se apenas a primeira fração for positiva, o indivíduo é normal; se apenas a última fração for positiva, o indivíduo pode ser um carreador ou pode ser afligido com a doença. Um resultado positivo em ambas as frações indica um heterozigoto e o indivíduo pode ou não ser afetado, dependendo de se a doença é dominante ou recessiva. Se a doença for dominante, heterozigotos serão afetados; se a doença for recessiva, o heterozigoto não será afetado, mas será um carreador da doença.

Em outras modalidades, indivíduos que têm um alelo normal po

dem ser distinguidos daqueles que têm uma pré-mutação ou uma mutação integral na região de repetição em tandem de um gene. Uma amostra de ácido nucleico do indivíduo é fragmentada para produzir fragmentos de ácido nucleico onde o segmento de repetição em tandem do gene é associado 10 com uma seqüência marcadora em um fragmento. Os fragmentos são separados em frações de acordo com tamanho sob condições onde o(s) fragmento(s) contendo o segmento de repetição em tandem estarão localizados nas frações de acordo com o número de repetições no segmento de repetição em tandem, e identificação daquela(s) fração(ões) contendo o segmento a15 través de detecção da seqüência marcadora. As frações são escolhidas de modo que uma primeira fração corresponde a regiões de repetição em tandem tendo um número normal de repetições (isto é, um alelo normal), uma segunda fração corresponde a regiões de repetição em tandem tendo um número de repetições em uma pré-mutação (isto é, um alelo de pré20 mutação) e uma terceira fração que corresponde a regiões de repetição em tandem tendo um número de repetições em uma mutação integral (isto é, um alelo de mutação integral). Em geral, se apenas a primeira fração for positiva, o indivíduo é normal; se apenas a segunda fração for positiva, o indivíduo carrega a pré-mutação e se apenas a terceira fração for positiva, o indi25 víduo é afetado com a doença. Um resultado positivo em mais de uma fração indica um heterozigoto. Um heterozigoto pode ser um carreador ou um indivíduo afetado dependendo do gene envolvido e da dominância da doença.

Em algumas modalidades, indivíduos tendo uma mutação associada com síndrome do X frágil (isto é, uma mutação integral no gene FMR1) podem ser distinguidos de indivíduos tendo uma pré-mutação ou um alelo normal. Uma amostra de ácido nucleico do indivíduo é fragmentada para produzir fragmentos de ácido nucleico onde o segmento de repetição em tandem do gene FMR1 é associado com uma seqüência marcadora em um fragmento. Os fragmentos são separados em frações de acordo com o tamanho sob condições onde o(s) fragmento(s) contendo o segmento de repe5 tição em tandem estarão localizados nas frações de acordo com o número de repetições no segmento de repetição em tandem, e identificação daquela(s) fração(ões) contendo o segmento através da detecção da seqüência marcadora. As frações são escolhidas de modo que uma primeira fração corresponde a regiões de repetição em tandem tendo um número normal de 10 repetições (isto é, um alelo normal), uma segunda fração corresponde a regiões de repetição em tandem tendo várias repetições em uma pré-mutação (isto é, um alelo de pré-mutação) e uma terceira fração que corresponde a regiões de repetição em tandem tendo várias repetições em uma mutação integral (isto é, um alelo de mutação integral). Em modalidades preferidas, 15 as frações são escolhidas de modo que a primeira fração corresponde a regiões de repetição em tandem tendo menos do que 55 repetições, a segunda corresponde a regiões de repetição em tandem tendo 55-200 repetições e a terceira corresponde a regiões de repetição em tandem tendo mais do que 200 repetições. Deste modo, se a primeira fração for positiva (isto é, a 20 seqüência marcadora foi detectada nesta fração), indica que a região de repetição em tandem contém menos do que 55 repetições (isto é, um alelo normal), se a segunda fração for positiva, indica que a região de repetição em tandem contém 55-200 repetições (isto é, um alelo de pré-mutação) e se a terceira fração for positiva, indica que a repetição em tandem contém mais 25 do que 200 repetições (isto é, um alelo de mutação integral). Em indivíduos do sexo masculino, um fenótipo ou estado de doença pode ser designado com base nesses resultados. Homens geralmente possuem apenas o cromossomo X (o cromossomo que contém o geme FMR1), deste modo, se a primeira fração for positiva, o indivíduo é normal; se a segunda fração for 30 positiva, o indivíduo é um carreadora da pré-mutação; se a terceira fração for positiva, o indivíduo é afligido com X frágil. Indivíduos do sexo feminino possuem dois cromossomos X, deste modo, mulheres possuindo dois alelos normais são normais e mulheres possuindo um alelo de pré-mutação ou um alelo de mutação integral são carreadoras. Mulheres heterozigotas para um alelo normal e um alelo de mutação integral podem ou não ser afetadas, dependendo de outros fatores tal como estado de metilação do gene.

Em certas modalidades de um ensaio para distinguir indivíduos

tendo uma região de repetição em tandem normal do gene FMR1 daqueles tendo uma pré-mutação ou mutação integral, duas frações de DNA genômico fragmentado com Alul são separadas através de eletroforese capilar e coletadas através de coletor de fração automático, um entre 211-400 pb, um 10 entre 401 pb - 9 kb. Fragmentos Alul tendo 6-68 repetições estarão presentes na fração inferior, então alelos normais e aqueles com pré-mutações pequenas (isto é, 55-68 repetições) serão separados nesta fração. Alelos normais e pré-mutações pequenas podem ser distinguidos mais através de amplificação da região de repetição em tandem e dimensionamento com eletro15 forese. A pré-mutação, compreendendo uma faixa de 69-200 repetições, e a mutação integral, compreendendo 201-2000+ repetições, estarão presentes na fração superior. Deste modo, se a fração inferior for positiva (isto é, a seqüência marcador foi detectada nesta fração), indica que há uma região de repetição em tandem CGG que contém 6-68 repetições; se a fração superior 20 for positiva, indica que há região de repetição em tandem CGG que contém 68-2000+ repetições. Um resultado positivo em ambas frações indica um heterozigoto onde um alelo é normal e o outro alelo contém a pré-mutação ou a mutação integral.

Em outras modalidades do ensaio para determinar tamanho da 25 região de repetição em tandem do gene FMR1, DNA fragmentado com uma combinação de Blpl e dMlyl é separado em quatro frações correspondendo a tamanhos de aproximadamente menos do que ou igual a 603 pb (primeira fração/inferior), 604-840 pb (segunda fração), 841-1078 pb (terceira fração) e 1079 pb - 9 kb (quarta fração/superior). Fragmentos de amostras contendo 30 um gene FMR1 normal (isto é, menos do que 55 repetições em tandem) e aqueles contendo pré-mutações tendo 56-62 repetições em tandem vão se separar na primeira fração/inferior. Alelos normais e pré-mutações pequenas podem ser distinguidos mais através da amplificação da região de repetição em tandem e dimensionamento com eletroforese. Fragmentos de genes FMR1 contendo pré-mutações pequenas (isto é, 63-140 repetições em tandem) vão se separar na segunda fração, enquanto fragmentos de genes 5 FMR1 contendo pré-mutações grandes (isto é, 141-200 repetições em tandem) e mutações integrais tendo 201-220 repetições em tandem vão se separar na terceira fração, e enquanto pré-mutações grandes tendo mais do que 220 repetições em tandem vão se separar na quarta fração/superior. 141-200 repetições de pré-mutação grande podem ser distinguidas de muta10 ções integrais de 201-220 usando, por exemplo, métodos Southern blot padrão.

Em outra modalidade, o DNA genômico digerido com Alul é fracionado em tamanho usando eletroforese capilar em uma multiplicidade de frações. Coleta de frações automática é realizada usando a janela de tempo 15 de fração pré-ajustada de aproximadamente 30 segundos por fração, começando em 200 pb e terminando em 9 kb. Aproximadamente 16 frações são coletadas. A fração ou frações que são positivas para detecção da seqüência marcadora a montante ou a jusante da região de repetição em tandem correspondem a uma faixa de tamanho e, então, o número de repetições em 20 tandem pode ser estimado.

Determinação de Gênero

Em algumas modalidades, um ensaio de ácido nucleico para determinar gênero é combinado com um ensaio para determinar o comprimento da região de repetição em tandem do gene FMR1. Em modalidades 25 preferidas, o ensaio de ácido nucleico inclui amplificação de DNA. Tais ensaios de amplificação de DNA podem direcionar amplificação alvo de seqüências específicas para o cromossomo Y (por exemplo, o local SRY (Sinclair e outros, Nature, 346:240 244, 1990)). Neste caso, amplificação apenas acontece na presença de um cromossomo Y, indicando que os ácidos nucle30 icos são de um homem. A ausência de amplificação sugere que os ácidos nucleicos são de uma mulher. No entanto, nesses ensaios, um controle positivo é de preferência incluído para detectar falsos negativos. Em outros exemplos, certos genes que acontecem em ambos o cromossomo Xeo cromossomo Y1 mas tendo comprimentos diferentes dependendo de se o gene acontece no cromossomo X ou no cromossomo Y, podem ser direcionados para amplificação. Neste exemplo, uma região 5 compreendendo o segmento do gene que difere entre os cromossomos X e Y seria amplificada. Isto resulta em produtos de amplificação tendo tamanhos diferentes, correspondendo ao ácido nucleico molde (isto é, o cromossomo X ou o cromossomo Y). Então, amplificação de ácidos nucleicos de homens resultaria em amplicons de ambos tamanhos, enquanto amostras de 10 mulheres resultariam em amplicons tendo apenas um tamanho.

Em uma modalidade preferida, o gene da amelogenina é direcionado para determinação de gênero. Diferenças de seqüência entre os homólogos X e Y do gene da amelogenina têm sido usadas para diferenciar homens e mulheres. Por exemplo, dois conjuntos de iniciador se estendendo 15 uma deleção de 6 pares de base (pb) do gene da amelogenina no cromossomo X foram usados para gerar fragmentos de 106/112 pb ou 212/218 pb para produtos X/Y, respectivamente (Sullivan e outros, BioTechniques, 15:636-9, 1993). Em modalidades preferidas, os iniciadores que seguem são usados para amplificar uma região do gene da amelogenina:

iniciador AMLF2, 5' -AGTACTTGACCACCTCCTGATCTACAAGG 3'

(SEQ ID NO: 40) e

iniciador AMLR2, 5’-TTTTTAACAGTTTACTTGCTGATAAAACTCAYCC 3' (SEQ ID NO: 41).

Este par de iniciador resulta em um amplicon de 134 pb corres25 pondendo ao homólogo do cromossomo X e um amplicon de 140 pb correspondendo ao cromossomo Y. Então, ambos amplicons seriam gerados através de amplificação de ácidos nucleicos de homens, enquanto apenas um amplicon seria gerado através de amplificação de ácidos nucleicos de mulheres.

Os exemplos que seguem servem para ilustrar a presente inven

ção. Esses exemplos não pretendem de modo algum limitar o escopo da invenção. EXEMPLO 1

Digestão de Enzima de Restrição

Este exemplo descreve métodos para detectar expansão da região de repetição em tandem do gene FMR1. Amostras de teste de DNA 5 genômico e amostras controle de DNA eram endonuclease de restrição digerida com Alui. 1,0 pg de DNA de teste ou controle foi usado para cada digestão. DNA genômico foi purificado e diluído para uma concentração de 50 ng/pL. A mistura de reação para a digestão foi preparada de acordo com a tabela que segue.

Tabela 5. Mistura de reação de Alul

Reagente (pL/amostra) IOXNEBuffer 2 3,0 Alul (1 OU/pL) 1,0 H2O estéril 7,0 Total 10,0 10 pL da mistura de reação de Alul foram adicionados a cada amostra de DNA. As amostras foram misturadas através de vórtex e giro em uma microfuge e são então incubadas da noite para o dia a 37°C.

EXEMPLO 2 Separação por Tamanho de DNA Digerido A. Abordagem de duas frações

DNA digerido por enzima de restrição conforme descrito no Exemplo 1 foi separado em frações de acordo com tamanho. DNA Iadder de 1 kb e as amostras de DNA genômico de teste digerido foram postos em uma 20 placa de 96 cavidades. A placa foi submetida à autoamostragem e fracionamento automático usando um Beckman Coulter P/ACE MDQ Series CapilIary Electrophoresis System em modo de separação de polaridade reversa. O Iadder foi primeiro injetado no capilar com 6 kv/60 s, então ativado com 200V/cm para determinar o tempo de corte de dimensionamento correto. 25 Coleta de fração automática foi realizada usando uma janela de tempo de fracionamento pré-ajustada correspondendo a 211-400 pb (fração inferior) e 401 pb - 9 kb (fração superior). As separações são monitoradas em coluna através de detecção UV. Os dados foram adquiridos e avaliados através do pacote de software P/AC E MDQ 32 Karat.

As amostras digeridas foram fracionadas usando as mesmas condições que o DNA Iadder de 1 kb. A fração inferior (211-396 pb) e a fra5 ção superior (396 pb - 9 kb) foram coletadas com base nos tempos de corte de dimensionamento conforme determinado usando o Iadder de 1 kb para cada faixa de tamanho. Frações foram coletadas usando o autocoletor P/ACE MDQ e armazenadas em uma placa de 96 cavidades em 30 μΙ_ de tampão 0,1 X TBE por cavidade.

A. Abordagem de 16 frações

Coleta de fração automatizada foi realizada usando uma janela de tempo de fracionamento pré-ajustada 30 segundos por fração, começando mais ou menos de 200 pbs e terminando em 9 Kbs. As separações foram monitoradas em coluna através de detecção UV. Os dados foram adquiridos e avaliados através do pacote de software P/AC MDQ 32 Karat.

O DNA Iadder de 1 kb e as amostras de DNA genômico digerido foram postos em uma placa de 96 cavidades. A placa foi submetida à autoamostragem, fracionamento automático na máquina Coulter P/ACE MDQ com controle de esfriamento. O Iadder foi primeiro injetado com eletrocinéti20 ca no capilar com 6 kv/60 s, então ativado com 200V/cm para determinar a janela de dimensionamento correta (de preferência 200 pbs- 9 Kbs).

As amostras digeridas foram fracionadas com base na mesma condição que a condição de atividade de DNA Iadder de 1 kb. Um total de 16 frações foi coletado usando autocoletor P/ACE MDQ's e armazenado em uma placa de 96 cavidades em 5 pL de dH20 por cavidade.

EXEMPLO 3

Amplificação por PCR e Detecção de Fragmentos com Repetições em Tandem

Em um ensaio para detectar mutações caracterizadas por uma expansão da região de repetição em tandem do gene FMR1, master mixes de PCR de trabalho foram feitas conforme descrito. A. Amplificação por PCR (não-TaqMan)

Uma PCR Master Mix para amplificação de fragmentos e para análise de separação por tamanho de produto de PCR foi preparada conforme mostrado na Tabela 6.

Tabela 6. Preparação de master mix de iniciador de PCR (não-Taqman)

para seqüência de flanqueamento de CCG 5'

Solução de Estoque Uma Reação 500 Reações Concentração (ML) (ML) Final 10X Tampão de PCR 2,5 1250 1X (1,5 mM) (com MgCI2 15 mM) 5X Solução Q 5,00 2500 1X MgCI2 25 mM 0,5 250 0,5 mM dNTPs 25 mM 0,2 100 0,2 mM Iniciador FMR1F4 100 μΜ 0,5 250 2,0 μΜ (SEQ ID NO: 4) Iniciador FMR1R4 100 μΜ 0,5 250 2,0 μΜ (SEQ ID NO: 5) Iniciador AIuIF 100 μΜ 0,1 50 0,4 μΜ (SEQ ID NO: 10) Iniciador AIuIR 100 μΜ 0,1 50 0,4 μΜ (SEQ ID NO: 11) Iniciador LargeF 100 μΜ 0,10 50 0,4 μΜ (SEQ ID NO: 14) Iniciador LargeR 100 μΜ 0,10 250 0,4 μΜ (SEQ ID NO: 15) DMSO 1,25 625 5% KCI2 1M 1,25 625 50 mM dH20 7,5 3750 Total 19,6 9800 A mistura principal do iniciador de PCR foi armazenada em alí

quotas de 1,5 ml_ a -20°C antes do uso. Quando prontas para uso, reações de PCR foram preparadas conforme mostrado na Tabela 7. Tabela 7. Mistura de amplificação de PCR final para seqüência flanquean

do CCG5'

Reagente Per Rxn !<4 placa Placa inteira (ML) (ML) (ML) Master Mix 19,6 940,8 1881,6 HotStarTaq 0,4 19,2 38,4 Fração de DNA 5,0 - Total 25,0 1200 2400 As misturas de amplificação finais foram vedadas fortemente em placas com película Microseal A. As placas foram vortexadas rapidamente 5 (aproximadamente 5 segundos) e giradas por aproximadamente 30 segundos em uma centrífuga de placa a 2.000-6.000 g (1.600 rpm em uma centrífuga Sorvall T6000D). A placa foi transferida para o ciclador térmico ABI 9700.

As condições do ciclador térmico para amplificação eram como

segue:

Etapa 1 95°C por 15 minutos Etapa 2 95°C por 60 segundos Etapa 3 64°C por 60 segundos Etapa 4 72°C por 30 segundos

Etapa 5 Etapas 2-4 repetidas, 34 vezes

Etapa 6 72°C por 5 minutos Etapa 4 4°C indefinidamente.

Produtos de PCR foram então carregados no analisador genético ABI 3100 para detecção.

B. Amplificação por PCR TaqMan

Uma master mix de PCR Taqman para detecção de seqüência flanqueando CCG5' foi preparada conforme mostrado na Tabela 8. Tabela 8. Preparação de master mix de PCR Taqman para seqüências flanqueando CCG 5'

Solução de Estoque Uma Reação 500 Reações Concentração (ML) (ML) Final 5X Solução Q 10,00 5000 1X MgCI2 25 mM 1,0 500 0,5 mM Iniciador FMR1F4 100 μΜ 1,0 500 2,0 μΜ (SEQ ID NO: 4) Iniciador FMR1R4 100 μΜ 1,0 500 2,0 μΜ (SEQ ID NO: 5) Iniciador/A/u/Ftaq 100 μΜ 0,40 200 0,8 μΜ (SEQ ID NO: 22) Iniciador AIuIRtaq 100 μΜ 0,40 200 0,8 μΜ (SEQ ID NO: 23) Iniciador LargoFtaq 100 μΜ 0,40 200 0,8 μΜ (SEQ ID NO: 24) Iniciador LargoRtaq 100 μΜ 0,40 200 0,8 μΜ (SEQ ID NO: 25) DMSO 2,50 1250 5% KCI2IM 2,50 1250 50 mM Sonda de Flanqueamento 0,10 100 0,2 μΜ de CGG (SEQ ID NO: 26) Sonda Controle Alul 0,10 100 0,2 μΜ (SEQ ID NO: 27) Sonda Controle Larga 0,10 100 0,2 μΜ (SEQ ID NO: 28) d H2O 20 100 Total 20 10000 A master mix de PCR Taqman foi armazenada em alíquotas de

1,5 mL a -20°C antes do uso. Quando prontas para uso, reações de PCR Taqman foram preparadas conforme mostrado na Tabela 9. Tabela 9. Master mix de PCR TaqMan

Reagentes 1 reação % de placa Vi placa 3A de placa Placa in¬ (ML) (ML) (ML) (ML) teira (pL) Master mix 25,0 750 1600 2150 2750 Universal TaqMan 2X Mistura de 20,0 600 1280 1720 2200 Iniciador/Sonda Total 45,0 1350 2880 3870 4950 45 μΙ_ da master mix de PCR TaqMan foram adicionados a cada cavidade da placa de 96 cavidades contendo as frações de DNA separado por tamanho. As cavidades são vedadas com força com película Microseal 5 A. As placas foram vortexadas rapidamente (aproximadamente 5 segundos) e giradas por aproximadamente 30 segundos em uma centrífuga de placa a 2.000-6.0000 g (1.600 rpm em uma centrífuga Sorvall T6000D). A placa foi transferida para o detector de seqüência ABI 7700 (ou 7900 HT).

As condições de termociclador para TaqMan foram como segue:

Etapa 1 95°C por 15 minutos Etapa 2 95°C por 60 segundos Etapa 3 64°C por 60 segundos Etapa 4 72°C por 30 segundos Etapa 5 Etapas 2-4 repetidas, 40 vezes Etapa 6 72°C por 5 minutos Etapa 7 4°C indefinidamente. EXEMPLO 4

Detecção de Frações Amplificadas Através de Eletroforese em Gel

Eletroforese em gel foi usada para identificar o tamanho de 20 fragmentos amplificados por PCR preparados conforme descrito no Exemplo 3A. 6 [iL de 6X FEB (ficoll, corante de carregamento azul de bromofenol EDTA) foram adicionados a 6 μί de produtos de PCR e a mistura resultante foi carregada no gel. DNA Iadder de 50 pb foi carregado nas primeira e última cavidade do gel. Amostras sofreram eletroforese em agarose 0,8% a 200 25 V por 1,5 hora. Gel terminado foi fotografado com aparelho de fotodocumentação de UV (Alpha Innotech Image Analysis System).

EXEMPLO 5

Detecção de Mutações de Expansão da Região de Repetição em Tandem do Gene DM-1

Em um ensaio para detectar mutações caracterizadas por uma

expansão da região de repetição em tandem do gene DM-1, amostras de teste de DNA genômico são endonuclease de restrição digerida com com Alui. Aproximadamente 1,0 pg de DNA genômico de teste é usado para cada digestão. A mistura de reação para a digestão é preparada de acordo 10 com o protocolo do fornecedor da enzima. As amostras são misturadas e incubadas a 37°C para digestão completa.

O DNA digerido com enzima de restrição é separado de acordo com tamanho usando eletroforese capilar e duas frações são coletadas, de modo que a primeira fração (250-360 pb) corresponde à faixa de repetição normal (por exemplo, 5-37 repetições) e a segunda fração (400 pb - 9 kb) corresponde a uma mutação de repetição expandida (por exemplo, maior do que 50 repetições). DNA Iadder de 1 kb é primeiro injetado no capilar para determinar o tempo de corte de dimensionamento correto. Coleta de fração automática é realizada usando uma janela de tempo de fracionamento préajustada correspondendo a uma fração inferior e uma fração superior. As separações são monitoradas em coluna através de detecção UV. As amostras digeridas são então fracionadas usando as mesmas condições que o DNA Iadder 1 kb. A fração inferior e a fração superior são coletadas com base nos tempos de corte de dimensionamento conforme determinado usando o Iadder de 1 kb para cada faixa de tamanho.

Cada fração é analisada usando o método de PCR de tempo real TaqMan quanto à presença de um fragmento contendo a região de repetição em tandem DM-1. Neste método, um segmento da região nãotraduzida 3' do gene DM-1 é amplificada usando um iniciador avançado (por 30 exemplo, Si-CcatttctttctttcGGcca-S'; SEQ ID NO: 31) e um iniciador reverso (por exemplo, 5'-AGGCCTGCAGTTTGCCC-3'; SEQ ID NO: 32). O fragmento amplificado é detectado com uma sonda marcada TaqMan, 5'TGAGGCCCTGACGTGG-3' (SEQ ID NO: 33).

A presença do segmento amplificado apenas na fração inferior é indicativo de um homozigoto individual para o alelo DM-1 normal. A presença do segmento amplificado apenas na fração superior é indicativo de um homozigoto individual para um alelo(s) mutante(s). A presença do segmento amplificado em ambas as frações é indicativo de um heterozigoto.

EXEMPLO 6

Detecção de Mutações de Expansão da Região de Repetição em Tandem do Gene FRDA

Em um ensaio para detectar mutações caracterizadas por uma

expansão da região de repetição em tandem do gene FRDA, amostras de teste de DNA genômico são endonuclease de restrição digerida com Alul e Rsal. Aproximadamente 1,0 pg de DNA genômico de teste é usado para cada digestão. A mistura de reação para a digestão é preparada de acordo 15 com o protocolo do fornecedor de enzima. As amostras são misturadas e incubadas a 37°C para completar a digestão.

O DNA digerido com enzima de restrição é separado de acordo com o tamanho usando eletroforese capilar e duas frações são coletadas, de modo que a primeira fração (300-405 pb) corresponde à faixa de repetição normal (por exemplo, 7-34 repetições) e a segunda fração (600 pb - 9 kb) corresponde a uma mutação de repetição expandida (por exemplo, maior do que 100 repetições). DNA ladder de 1 kb é primeiro injetado no capilar para determinar o tempo de corte de dimensionamento correto. Coleta de fração automatizada é realizada usando uma janela de tempo de fracionamento pré-ajustada correspondendo a uma fração inferior e uma fração superior. As separações são monitoradas em coluna através de detecção UV. As amostras digeridas são então fracionadas usando as mesmas condições que o DNA ladder de 1 kb. A fração inferior e a fração superior são coletadas com base em seus tempos de corte de dimensionamento conforme determinado usando o DNA ladder de 1 kb para cada faixa de tamanho.

Cada fração é analisada usando o método de PCR de tempo real TaqMan quanto à presença de um fragmento contendo a região de repetição em tandem FRDA. Neste método, um segmento da primeira região intrônica do gene FRDA é amplificado usando um iniciador avançado (por exemplo, 5'-AGGCCTAGGAAGGTGGATCAC-3'; SEQ ID NO: 34) e iniciador reverso (por exemplo, 5-ACCATGTTGGCCAGGTTAGTCT-3'; SEQ ID NO: 5 35). O fragmento amplificado é detectado através de uma sonda marcada TaqMan; 5'-TGAGGTCCGGAGTTC-3' (SEQ ID NO: 36).

A presença do segmento amplificado apenas na fração inferior é indicativo de um indivíduo homozigoto para o alelo de FRDA normal. A presença do segmento amplificado apenas na fração superior é indicativo de 10 um indivíduo homozigoto para um(uns) alelo(s) mutante(s). A presença do segmento amplificado em ambas as frações é indicativo de um heterozigoto. Exemplo 7

Detecção de Mutações de Expansão da Região de Repetição em Tandem do Gene FMR1

Neste exemplo, mutações de expansão da região de repetição

em tandem do gene FMR1 foram detectadas através de fragmentação com Alul, fracionamento de tamanho, seguido por uma segunda digestão de enzima de restrição com BstNI. Então, amostras de teste de DNA genômico eram endonuclease de restrição digerida com Alul conforme acima descrito 20 no Exemplo 1. O DNA digerido foi então fracionado em quatro frações usando eletroforese capilar. A fração 1 contém ácidos nucleicos com 0-60 repetições em tandem CCG, fração 2 contém 60-200 repetições em tandem CCG, fração 3 contém 200-2000 repetições em tandem CCG e fração 4 contém 2000+ repetições em tandem de CCG. Seguindo fracionamento, uma alíquo25 ta de cada uma das quatro frações foi digerida com uma segunda endonuclease de restrição, BstNI, que clivou o marcador da região de repetição em tandem de CCG. Seguindo o segundo fracionamento do ácido nucleico, cada uma das quatro frações foi submetida à PCR conforme descrito no Exemplo 3B (isto é, Amplificação por PCR TaqMan).

A. Segunda Digestão de Enzima de Restrição de Amostras de Indivíduos Afetados

Amostras afetadas foram testadas com e sem uma segunda digestão de enzima de restrição onde a seqüência marcadora foi clivada da região de repetição em tandem. Amostras tendo a segunda digestão tinham sinais muito mais fortes (isto é, sinais de unidade de fluorescência relativa (RFU) maiores) comparado com amostras que não sofreram uma segunda 5 digestão de enzima. Cada amostra foi ativada em duplicata; dados são mostrados abaixo na tabela 9. Esses dados sugerem que há amplificação maior da seqüência marcadora quando a seqüência marcadora é clivada a partir da região de repetição em tandem.

Tabela 10. Sinais de Unidade de Fluorescência Relativa (RFU) de Amostras Afetadas com ("com 2o") e Sem uma Segunda Digestão de En

zima de Restrição ("sem 2o").

N0 da Amostra Fração 1 Fração 2 Fração 3 Fração 4 15251 sem 2o 75 0 445 0 Duplicata 0 0 0 0 15251 com 2o 1752 781 787 0 2566 931 695 0 15050 sem 2o 980 0 210 0 259 0 318 0 15050 com 2o 3571 0 873 0 2270 586 1042 0 14792 sem 2o 575 0 328 0 662 280 246 0 14792 com 2o 1223 243 658 0 1308 450 967 0 B. Segunda Digestão de Enzima de Restrição de Amostras de Indivíduos Normais

Amostras normais foram testadas com e sem uma segunda di15 gestão de enzima de restrição onde a seqüência marcadora foi clivada da região de repetição em tandem. Amostras tendo menos material de partida que sofrem a segunda digestão tinham sinais comparáveis ou maiores (isto é, sinais de unidade de fluorescência relativa (RFU) maiores) comparado com amostras tendo mais material de partida que não sofreram uma segunda digestão de enzima. Dados são mostrados abaixo na tabela 10. Esses dados sugerem que há amplificação maior da seqüência marcadora quando a seqüência marcadora é clivada da região de repetição em tandem.

Tabela 11. Sinais de Unidade de Fluorescência Relativa (RFU) de Amostras Normais com ("com 2o") e Sem uma Segunda Digestão de En

zima de Restrição ("sem 2o")

N0 da Amostra Fração 1 Fração 2 Fração 3 Fração 4 14028 sem 2o 3044 0 0 0 14028 com 2o 4356 0 0 0 13616 sem 2o 2701 0 0 0 13616 com 2o 2396 0 0 0 13488 sem 2o 1399 0 0 0 13488 sem 2o 2258 0 0 0 13524 sem 2o 1051 0 0 0 13524 com 2o 1074 0 0 0 EXEMPLO 8

Detecção de Mutações de Expansão da Região de Repetição em Tandem do Gene FMR1

Neste exemplo, mutações de expansão da região de repetição

em tandem do gene MFR1 são detectadas através de fragmentação com Blpl e Mlyl, fracionamento de tamanho, seguido por uma segunda digestão de enzima de restrição com Bmtl.

Amostras de teste de DNA genômico são endonuclease de restrição digerida com Blpl e Mlyl usando aproximadamente 1,5 pg de DNA de teste ou controle (purificado e diluído para uma concentração de 50 ng/pL) para cada digestão. A mistura de reação para a digestão é preparada de acordo com a tabela que segue. Tabela 12. Mistura de reação de Blpl/Mlyl

Reagente ^L/amostra) DNA Genômico 50 ng/mL 30 μΙ_ IOXNEBuffer 4 3,5 (New England BioLabs) Blpl (10 U/μΙ-) 0,75 Mlyl (10 ΙΙ/μΙ_) 0,75 Total 35,0 As amostras são misturadas através de vórtex e giro em uma microfuge e são então incubadas a 37°C por 16 horas e armazenadas a 4°C.

O DNA digerido é então fracionado em quatro frações usando eletroforese 5 capilar usando P/ACE MDQ Capillary Electrophoresis System. Fração 1 (menos do que 603 pb) contém ácidos nucleicos com 6-62 repetições em tandem de CCG, fração 2 (603-840 pb) contém 63-140 repetições em tandem de CCG, fração 3 (841-1078 pb) contém 141-220 repetições em tandem de CCG e fração 4 (1079 pb - 9 kb) contém 221-2000+ repetições em tan10 dem de CCG. Seguindo fracionamento, uma alíquota de cada uma das quatro frações é digerida com a endonuclease de restrição, Bmtl, que cliva a marcadora da região de repetição em tandem de CCG. A mistura de reação de Bmtl é preparada de acordo com a tabela que segue.

Tabela 13. Mistura de reação de Bmtl

Reagente ^L/amostra) DNA genômico fracionado 30 μι. IOXNEBuffer 2 3,0 (New England Biolabs) Bmtl (10 U/μί) 0,75 Total 33,75,0 As misturas de reação de digestão são incubadas a 37°C por 16

horas e armazenadas a 4°C.

Seguindo a segunda digestão de ácido nucleico, cada uma das quatro frações é submetida à PCR usando os iniciadores que seguem: Tabela 14. Iniciadores para amplificação por PCR de fragmentos Blpl/Mlyl

Nome do SEQ ID Seqüência do Iniciador Iniciador NO: FXCEF2 6 5-/6-FAM/GAT GGAGGAGCT GGT GGT GG-3' FXCER2 7 5-GGAAGGGCGAAGATGGGG-3' Blpl F 12 5'-/H EX-AGT GTTTAG AAGG AAAAGG CT GAG C-3' Blpl R 13 5'-GCCCAAAGTTTCATAGGTAGCAAA-3’ FIIctrIIF 16 5'-/H EX/CT GAATTT GTTTGGTTT GAT GATGC-3' FIIctrHR 17 5-CCTGTGTTATCTGTG CCCATTTTAA-3' Flllctrl3F 18 5'-/6-FAM/AT CT GGGT CT GAATAAT GT GAGGAG-3' Flllctrl3R 19 5'-CCTAACTTT CATT CTT GT CACCCTT-3' LgctrIF 20 5'-/6-FAM/AGGTTT GAGT GTATCGCCT GAT AG A-3' LgctrIR 21 5'-T GAGTTT CAT GT TTGCTCTTGCTC-3' Uma master mix de PCR para amplificação de fragmentos para

análise de tamanho é preparada de acordo com a Tabela 15. Tabela 15. Master mix de PCR

Reagente Vol. para 1 reação Cone. Final em (ML) Reação de PCR Tampão 10X Qiagen 2,5 1X MgCI2 25 mM Qiagen* 0,75 2,25 mM DMSO 1,25 5% (v/v) KCL** 1M 1,25 105 mM dNTP 25 mM 0,2 0,2 mM FXCEF2100 μΜ 0,25 1 μΜ FXCER2 100 μΜ 0,25 1 μΜ Blpl F 100 μΜ 0,015 0,06 μΜ Blpl R 100 μΜ 0,015 0,06 μΜ IgetrIF 100 μΜ 0,06 0,24 μΜ IgctrIR 100 μΜ 0,06 0,24 μΜ FIIctrIIF 100 μΜ 0,015 0,06 μΜ FIIctrIIR 100 μΜ 0,015 0,06 μΜ Flllctrl3F 100 μΜ 0,02 0,08 μΜ Reagente Vol. para 1 reação Cone. Final em (ML) Reação de PCR Flllctrl3R 100 μΜ 0,02 0,08 μΜ Água 12,83 Total 19,5 *, ** 2,5 μΙ_ tampão 10Χ PCR contém MgCI2 15 mM, KCI 50 mM. MgCI2 de reação total é 2,25 mM, KCI é 105 mM.

Uma mistura de amplificação de PCR final é feita adicionando 0,5 μ!_ de HotStarTaq (Qiagen) a cada reação de PCR individual seguido por 5 5 μΐ_ de DNA fracionado digerido. As misturas de amplificação finais são vedadas com força em placas com película Microseal A. As placas são vortexadas rapidamente (aproximadamente 5 segundos) e giradas por aproximadamente 30 segundos em uma centrífuga de placa a 2.000-6.000 g (1.600 rpm em uma centrifuga Sorvall T6000D). A placa é transferida para o cicla10 dor térmico ABI 9700.

As condições do ciclador térmico para amplificação são como

segue:

Etapa 1 95°C por 15 minutos Etapa 2 95°C por 30 segundos Etapa 3 55°C por 30 segundos

Etapa 4 72°C por 60 segundos Etapa 5 Etapas 2-4 repetidas, 33 vezes Etapa 6 72°C por 10 minutos Etapa 7 4°C indefinidamente.

2 μΙ_ de produto de PCR são combinados com 10,5 pL de for

mamida Hi-Di (Applied Biosystems) com padrão de tamanho ROX 350 (Applied Biosystems), aquecidos a 95°C por 5 minutos seguido por 5 minutos em gelo. Amostras foram então carregadas no analisador genético ABI 3100 para detecção.

EXEMPLO 9

Deteccão de Mutações de Expansão da Região de Repetição em Tandem do Gene FMR1 Neste exemplo, mutações por expansão da região de repetição em tandem do gene FMR1 são detectadas através de fragmentação com Sphl e Bmtl, fracionamento de tamanho, seguido por uma segunda digestão de enzima de restrição com BstNI. Então, amostras de teste de DNA genô5 mico são endonuclease de restrição digerida com Sphl e Bmtl usando aproximadamente 1,5 pg de DNA de teste ou controle (purificado e diluído para uma concentração de 50 ng/pL) para cada digestão. A mistura de reação para a digestão é preparada de acordo com a tabela que segue.

Tabela 16. Mistura de reação de Sphl/Bmtl

Reagente (p L/amostra) DNA Genômico (50 ng/pL) 30 IOXNEBuffer 2 3,5 (New England Biolabs) Sphl (10 U/pL) 0,75 Bmtl (10 U/pL) 0,75 Total 35,0 As amostras são misturadas através de vórtex e giro em uma

microfuge e são então incubadas da noite para o dia a 37°C. O DNA digerido é então fracionado em quatro frações usando eleteroforese capilar. A fração

I contém ácidos nucleicos com 6-62 repetições em tandem, fração 2 contém 63-162 repetições em tandem, fração 3 contém 164-196 repetições em tan15 dem e fração 4 contém mais do que repetições em tandem. Seguindo fracionamento, uma alíquota de cada uma das quatro frações é digerida com uma segunda endonuclease de restrição, Bmtl, que clivou o marcador da região de repetição em tandem de CCG. Seguindo o segundo fracionamento de ácido nucleico, cada uma das quatro frações é submetida à PCR usando os 20 iniciadores que seguem:

Tabela 17. Iniciadores para amplificação por PCR de fragmentos Sphl/Bmtl

Nome do Iniciador SEQ ID NO: Seqüência do Iniciador FXCEF3 8 5'-CGT GACGT GGTTT CAGT GTTT ACA-3' FXCER3 9 5'-GGAAGT GAAACCGAAACGG AG-3' PCR é realizada usando as condições que seguem:

Etapa 1 95°C por 15 minutos

Etapa 2 95°C por 30 segundos Etapa 3 55°C por 30 segundos Etapa 4 72°C por 60 segundos

Etapa 5 Etapas 2-4 repetidas, 33 vezes Etapa 6 72°C por 10 minutos Etapa 4 4°C indefinidamente.

Produtos de PCR são então carregados no analisador genético ABI3100 para detecção.

EXEMPLO 10

Identificação de um Fragmento Controle para Uso no Ensaio de FMR1

Um fragmento Alul de uma região do genoma distinta de FMR1, que era maior do que 6000 bases, contendo repetições de trinucleotídeo, e tendo um teor de GC alto e/ou ilhotas de CpG foi identificado para uso como um fragmento controle no ensaio de FMR1. Este fragmento foi identificado como segue. Todos os sítios Alul no genoma humano foram identificados usando o programa EMBOSS Restrict (Rice e outros, "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite". Trends in Genetics 16(6):276- 7 (2000), resultando em uma previsão de 11,5 milhões de fragmentos produzidos por uma digestão com Alui. A partir desses fragmentos, 20 fragmentos tendo um comprimento mais longo do que 6000 bases foram identificados usando o programa TACG (Mangalam, H.J. "tacg - a grep for DNA". BMC Bioinformatics 3:8 (2002)). As seqüências desses 20 fragmentos foram obtidas usando EMBOSS ExtractSeq. Desses 20 fragmentos, um fragmento correspondendo a uma região do gene USP41 no cromossomo 22 (isto é, cromossomo 22:19033185-19041663) foi verificado ter uma região de repetição de nucleotídeo grande. O teor de GC foi analisado usando EMBOSS geecee e a análise de ilha CpG foi realizada usando EMBOSS cpgseek e newepgreport.

EXEMPLO 11

Determinação do Tamanho da Região de Repetição em Tandem de FMR1 usando PCR

Para determinar o tamanho da região de repetição em tandem da região de FMR1, a região é amplificada através da reação em cadeia de polimerase na presença de um iniciador fluorescentemente marcado (por 5 exemplo, 6-FAM) e os tamanhos dos amplicons marcados resultantes são determinados através de eletroforese capilar. Uma segunda repetição de trinucleotídeo (CAG no gene receptor de androgênio ligado a X) é coamplificada usando um par de iniciador onde um dos iniciadores é fluorescentemente marcado e coanalisado para prover um controle de amplificação in10 terno.

Então, a região de repetição em tandem do gene FMR1 é amplificada usando FX-F5 (SEQ ID NO: 29) como o iniciador avançado e FX-3F (SEQ ID NO: 30) como o iniciador reverso, e repetição de nucleotídeo do gene de receptor de androgênio ligado a X usando AR-5F (SEQ ID NO: 37) 15 como o iniciador avançado e AR-R2 (SEQ ID NO: 38) como o iniciador reverso, conforme mostrado na tabela abaixo.

Tabela 18. Iniciadores para amplificação de PCR

Nome do SEQ ID Seqüência do Iniciador Iniciador NO: FX-5F 29 5'-(6-FAM) GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACT TCC GGT 3' FX-3F 30 5'- AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT CCA-3' AR-5F 37 5'-(HEX) ACC AGG TAG CCT GTG GGG CCT CTA CGA TGG GC-3' AR-R2 38 5'-GCT TTC CAG AAT CTG TTC CAG AGC GTG CGC GA-3' Uma master mix de PCR para amplificação de fragmentos para

análise de tamanho é preparada de acordo com a Tabela 19. Tabela 19. Master mix de PCR

Reagente Vol. para 1 reação Vol. para 1000 (ML) reações (pL) 10X Tampão (Qiagen) 1,0 1000 MgCI2 25 mM Qiagen (Qiagen) 0,2 200 dNTP 25 mM 0,08 80 Iniciador FX-5F 100 pM 0,04 40 Iniciador FX-3F 100 pM 0,04 40 Iniciador AR-5F 100 pM 0,04 40 Iniciador AR-R2 100 pM 0,04 40 DMSO 0,2 200 Solução 5X A (Betaína) 5,0 5.000 Água 1,16 1.160 Total 10,0 A master mix de PCR é separada em alíquotas em alíquotas de

1.100 pL às quais 5,5 pL de Taq polimerase (5 U/pL) de Qiagen e 22 pL de polimerase de DNA Pfu (2,5 U/pL) da Stratagene são adicionados para fazer a solução de mistura de polimerase/máster.

DNA genômico é diluído para 20 ng/mL em tampão TE. Amostras são aquecidas para 93-97°C por 4-6 minutos e esfriadas em gelo. 10 pL de solução de mistura de polimerase/máster são adicionados a 2 pL (40 ng) de DNA genômico diluído.

As amostras são transferidas para o ciclador térmico ABI 9700

uma vez o ciclador térmico tendo atingido 85°C +/- 2°C. As condições de PCR para amplificação são como segue:

Etapa 1 95°C por 6 minutos

Etapa 2 95°C por 1 minuto Etapa 3 60°C por 2 minutos

Etapa 4 75°C por 5 minutos Etapa 5 Etapas 2-4 repetidas, 31 vezes Etapa 6 75°C por 13 minutos Etapa 7 4°C indefinidamente. Produtos de PCR são então carregados no analisador genético ABI 3100 para detecção.

EXEMPLO 12

Avaliação de Carreador quando à Síndrome do X Frágil Neste exemplo, amostras de indivíduos do sexo masculino e do

sexo feminino foram avaliadas quanto ao estado carreador de síndrome do X frágil através de um método de duas etapas, onde amostras foram inicialmente avaliadas com PCR multiplex para estabelecer gênero e tamanho da região FMR1 e foram submetidas á análise de dimensionamento adicional com base nos resultados da PCR multiplex. Todas as amostras que foram determinadas ser do sexo feminino e heterozigotas para dois alelos normais não foram submetidas à análise adicional. Todas as amostras determinadas ser do sexo feminino e aparentemente homozigotas no local FMR1 (24% de todas as análises) foram submetidas à análise adicional para determinar o tamanho da região de repetição em tandem de FMR1. Amostras identificadas como do sexo masculino e hemizigotas para um alelo de FMR1 normal não foram submetidas à análise adicional, enquanto amostras identificadas como do sexo masculino, mas não exibindo nenhuma amplificação de FMR1 são submetidas à análise adicional para determinar o tamanho da região de repetição em tandem de FMR1.

DNA genômico foi extraído de 150 pL de sangue integral coletado em tubos a vácuo de coleta de sangue anticoagulado de EDTA usando um Xtractor GeneTM (Corbett Life Science, Mortlake1 NSW, Austrália) de acordo com o Protocolo de Extração de DNA de Sangue Integral do fabrican25 te. A eluição final foi realizada em 100 pL de tampão para dar consistentemente concentrações de 50-100 ng/pL.

Amostras de DNA genômico foram então analisadas através de PCR multiplex consistindo em uma amplificação da região de repetição em tandem de FMR1 usando iniciador FX-5F (marcado com FAM; SEQ ID NO: 30 29) e iniciador FX-3F (SEQ ID NO: 30); amplificação de uma região do gene da amelogenina para estabelecer gênero usando iniciador AMLF2, 5'-AGTA CTTGACCACCTCCTGATCTACAAGG 3' (marcado com FAM; SEQ ID NO: 40) e iniciador AMLR2, 5' -TTTTTAACAGTTTACTTGCTGATAAAACTCAY CCC 3' (SEQ ID NO: 41) e amplificação da repetição de trinucleotídeo do receptor de androgênio ligado a X usando AR-5F (marcado com HEX SEQ ID NO: 37) e iniciador AR-R2 (SEQ ID NO: 38) como um controle interno positivo.

Uma master mix de PCR para a PCR multiplex foi preparada consistindo em 3,3 μΜ de cada um dos iniciadores acima, tampão de PCR Padrão Qiagen 1X, MgCI2 0,4 mM, DMSO 2%, Solução Q Qiagen 1 X, dNTP 0,2 mM e 0,25 unidade de polimerase de DNA Taq Qiagen (Qiagen, Valen10 cia, CA), 0,5 unidade de Polimerase de DNA Pfu (Stratagene, La Jolla, CA). Um [íL de solução de DNA isolado foi adicionado a 10 μί da mistura de iniciador multiplex para um volume final de 11 μί. As condições de PCR foram como segue: 95°C por 6 minutos seguido por 32 ciclos de 95°C por 1 minuto, 60°C por 2 minutos, 75°C por 5 minutos e finalmente os produtos amplifi15 cados foram estendidos a 75°C por 15 minutos. Os fragmentos de PCR foram analisados em um sequenciador de DNA automático ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e análise de fragmento realizada com software ABI GeneScanTM V3.7 e GenotyperTM V3.7 (Applied Biosystems). O par de iniciador da amelogenina resulta em um amplicon de 134 pb cor20 respondendo ao homólogo do cromossomo X e um amplicon de 140 pb correspondendo ao cromossomo Y.

Para a análise adicional para determinar tamanho da região de repetição em tandem do gene FMR1, DNA genômico foi digerido por 16 horas a 37°C com enzimas de restrição Blpl e Mlyl (New England BioLabs, 25 Ipswich, MA, USA). Seguindo incubação os fragmentos de restrição foram ou injetados com pressão ou injetados a vácuo em um sistema de eletroforese capilar P/ACE® MDQ com um Detector UV/Vis (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). DNA de filamento duplo desnaturado foi separado em uma resistência de campo elétrico de 100 V/cm, em tampão TBE 1 X (Tris-Borato 30 90 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3). Temperatura capilar foi mantida a 25°C. Quatro frações foram coletadas em tampão TBE 0,1X (Tris-borato 9 mM, EDTA

0,2 mM, pH 10). A fração inicial consistia em pesos moleculares entre 400 bps a 600 pbs; a segunda fração incluía pesos moleculares entre 600 bps a 800 bps; a terceira fração incluía pesos moleculares de 800 bps a 1.000 bps; e a quarta fração incluía pesos moleculares de 1.000 bps a 8.000 bps. Nenhum controle interno para digestão de restrição incompleta foi usado por5 que falha de qualquer enzima em clivar em FMR1 resultaria em um fragmento muito grande para ser coletado em qualquer fração.

Todas as frações coletadas foram então submetidas à digestão por enzima de restrição com Bmtl (New England Biolabs) de acordo com o procedimento do fabricante a fim de clivar a seqüência marcadora da região 10 de repetição em tandem. Cinco μΙ_ de cada fração digerida foram transferidos para placas de 96 cavidades contendo 20 μΙ_ de mistura de PCR em cada cavidade. Esta mistura de PCR consiste em tampão de PCR Padrão Qiagen 1X, MgCI2 1,5 mM, DMSO 5%, KCI 100 mM, dNTP 0,2 mM, 2,5 unidades polimerase de DNA Taq HotStart (Qiagen, Inc.) e 1 μΜ de cada um dos 15 iniciadores que seguem: iniciador de FXCEF2 (marcado com FAM; SEQ ID NO: 6), iniciador de FXCER2 (SEQ ID NO: 7) e 0,001 μΜ de cada um dos iniciadores que seguem: iniciador de Blpl F (marcado com HEX, SEQ ID NO: 12), iniciador de Blpl R (SEQ ID NO: 13), iniciador de IgctrIF (marcado com FAM; SEQ ID NO: 20), iniciador de IgctrIR (SEQ ID NO: 21), iniciador de 20 F2ctrl1F (marcado com HEX, SEQ ID NO: 16), iniciador de F2ctrl1R (SEQ ID NO: 17), iniciador de F3ctrl3F (marcado com FAM SEQ ID NO: 18), iniciador de F3ctrl3R (SEQ ID NO: 19). As condições de PCR foram como segue: 95°C por 15 minutos seguindo por 33 ciclos de 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto e finalmente os produtos amplificados 25 foram estendidos a 72°C por 10 minutos. Os produtos de PCR finais foram então analisados em um 3100 Prism Genetics Analyzer (Applied Biosystems) usando padrão de tamanho GenescanTM-350 ROX (Applied Biosystems).

1.662 amostras de sangue, tendo sido retirados os dados de identificação, foram submetidas à análise através do método acima descrito. Nesta população de amostras, havia 995 mulheres e 557 homens. Dos indivíduos do sexo masculino, 6 foram determinados ser carreadores de prémutação (0,6%) e 7 foram determinados ser carreadores de mutação integral (0,7%). Todos os 13 carreadores foram corretamente identificados conforme verificado através de análise de PCRISouthern blot padrão, levando a uma sensibilidade de 100%. Um paciente único interpretado como um nãocarreador através do ensaio de PCRISouthern blot padrão parecia ser um carreador de pré-mutação através do método acima. Este paciente pode ser mosaico para um alelo de pré-mutação ou este representa um resultado falso positivo. Devido à natureza anônima das amostras, não foi possível revisar os dados de Southern blot ou retestar a amostra. Supondo que este resultado seja um falso positivo, a especificidade do método acima é 99,5%. Dos 557 homens, houve um carreador de pré-mutação e 5 indivíduos afetados. Essas determinações foram confirmadas através de análise Southern blot. Então, o método acima detectou todos os homens carreadores de prémutação e homens afetados sem quaisquer resultados falso positivos nos 551 homens não-afetados.

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que geralmente compreendido por um versado comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Todas as seqüências de nucleotídeo providas aqui são apresentadas na direção 5' até 3'.

A invenção ilustrativamente descrita aqui pode ser adequadamente praticada na ausência de quaisquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente aqui descritos. Então, por exemplo, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo", etc, devem ser lidos ex25 pressamente e sem limitação. Adicionalmente, os termos e expressões empregados aqui foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há nenhuma intenção no uso de tais termos e expressões de exclusão de quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções das mesmas, mas é reconhecido que várias modificações são possí30 veis dentro do escopo da reivindicação reivindicada.

Então, deve ser compreendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita pelas modalidades preferidas e características opcionais, modificação, melhoria e variação da invenção concretizada aqui descrita podem ser recorridas por aqueles versados na técnica, e que tais modificações, melhorias e variações são consideradas estar dentro do escopo da invenção. Os materiais, métodos e exemplos providos aqui 5 são representativos de modalidades preferidas, são exemplares e não são pretendidos como limitações do escopo da invenção.

A invenção foi descrita amplamente e genericamente aqui. Cada uma das espécies mais limitadas e agrupamentos subgenéricos se encaixando na descrição genérica também faz parte da invenção. Isto inclui a 10 descrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer assunto do gênero, sem importar se ou não o material excisado é especificamente aqui mencionado.

Ainda, onde características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, aqueles versados na técnica vão reconhecer que a invenção é também então descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.

Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui são expressamente incorporadas a título de referência em sua totalidade, ao mesmo ponto como se cada um fosse incorporado a título de referência individualmente. No caso de conflito, o presente pedido, incluindo definições, vai prevalecer.

Outras modalidades são conforme mostrado nas reivindicações que seguem.

Claims (54)

1. Método para determinação do tamanho de um segmento de ácido nucleico em uma amostra de ácido nucleico compreendendo: separação de fragmentos de um ácido nucleico, os ditos fragmentos preparados a partir de uma amostra contendo ácido nucleico, em que os ditos fragmentos incluem alguns que contêm o dito segmento e uma seqüência marcadora, em que a seqüência marcadora não está contida dentro do segmento, e a dita separação em frações de acordo com o tamanho sob condições em que um fragmento contendo dito segmento estará Iocalizado nas ditas frações de acordo com o tamanho do segmento, e identificação daquela(s) fração(ões) contendo o segmento através de detecção da seqüência marcadora, em que o tamanho do segmento é determinado pela fração em que ele é identificado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o segmento de ácido nucleico é difícil de amplificar através de reação em cadeia de polimerase.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o dito segmento de ácido nucleico é rico em bases guanina e citosina.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os ditos fragmentos são preparados usando uma ou mais endonucleases de restrição.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as ditas frações são escolhidas para separar fragmentos contendo segmentos tendo um tamanho normal dos fragmentos contendo segmentos tendo um tamanho anormal.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita separação é em um número de frações selecionado do grupo consistindo em 2- 16.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita separação é através de eletroforese.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a dita eletroforese é eletroforese capilar.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita separação é através de cromatografia.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda após a dita etapa de separação, clivagem de todo ou uma porção do segmento da dita seqüência marcadora em fragmentos que contêm o dito segmento e a dita seqüência marcadora.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a dita clivagem é realizada usando uma endonuclease de restrição.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita detecção, compreende ainda amplificação da dita seqüência marcadora.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a dita amplificação é realizada com reação em cadeia de polimerase (PCR).

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a dita PCR inclui um iniciador marcado.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita detecção é realizada usando o sistema de detecção de PCR Taqman.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita seqüência marcadora é detectada através de hibridização para duas sondas que hibridizam simultaneamente para a seqüência marcadora.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito segmento compreende uma região de repetição em tandem.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o tamanho determinado é o número de repetições na dita região de repetição em tandem.

19. Método de acordo com a reivindicação 19, em que as ditas frações são escolhidas para separar fragmentos com um número normal de repetições em tandem de fragmentos contendo um número anormal de repetições em tandem.

20. Método de acordo com a reivindicação 17, em que as ditas repetições em tandem são repetições em tandem de trinucleotídeo.

21. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a dita repetição em tandem está associada com um gene selecionado do grupo consistindo em DRPLA, EPM1, FRAXA, FMR1, FRDA, huntingtina, JPH-3, AR, DM1, DM2, SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7, SCA8, SCA10, SCA12, SCA17, PABPN1 E H0XD13.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a dita repetição em tandem está associada com um gene selecionado do grupo consistindo em FMR1, FRDA e DM1.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o dito gene é FMR1.

24. Método de detecção de uma mutação em um segmento de repetição em tandem de um gene em uma amostra de ácido nucleico, em que a dita mutação é caracterizada por uma mudança no número de repetições comparado com o número de repetições no alelo do tipo selvagem, o dito método compreendendo: separação de fragmentos de um ácido nucleico, os ditos fragmentos preparados de uma amostra contendo ácido nucleico, em que os ditos fragmentos incluem alguns que contêm o dito segmento de repetição em tandem e uma seqüência de marcador, em que a seqüência marcadora não está contida dentro do segmento, e a dita separação em frações de acordo com tamanho sob condições em que um fragmento contendo o segmento de repetição em tandem estará localizado nas ditas frações de acordo com o número de repetições no segmento de repetição em tandem; identificação daquela(s) fração(ões) contendo o segmento através de detecção da seqüência marcadora, em que o número de repetições no segmento de repetição em tandem é determinado pela fração em que ele é identificado, e comparação do número de repetições no segmento de repetição em tandem a partir da amostra de ácido nucleico com o número no alelo do tipo selvagem correspondente, em que várias repetições diferindo do número no alelo do tipo selvagem é indicativo de uma mutação.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, compreendendo ainda, determinação se uma mutação é uma pré-mutação ou uma mutação integral através da comparação do número de repetições no segmento de repetição em tandem da amostra de ácido nucleico com o número no alelo de mutação integral correspondente, em que um número de repetições maior do que o alelo do tipo selvagem mas menor do que a mutação integral é indicativo de um alelo de pré-mutação, enquanto várias repetições maiores do que ou iguais à mutação integral é indicativo de um alelo de mutação integral.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, em que os ditos fragmentos são obtidos usando uma ou mais endonucleases de restrição.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a dita uma ou mais endonucleases de restrição são selecionadas do grupo consistindo em Alui, Sphl, Bmtl, Blpl, Mlyl e BstNI.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que a dita uma ou mais endonuclease de restrição é Alui.

29. Método de acordo com a reivindicação 27, em que as ditas uma ou mais endonucleases de restrição são Sphl e Bmtl.

30. Método de acordo com a reivindicação 27, em que as ditas uma ou mais endonucleases de restrição são Blpl e Myll.

31. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a dita separação é através de eletroforese.

32. Método de acordo com a reivindicação 33, em que a dita eletroforese é eletroforese capilar.

33. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a dita separação é através de cromatografia.

34. Método de acordo com a reivindicação 24, em que as ditas frações são escolhidas para separar fragmentos contendo segmentos de repetição em tandem tendo um número normal de repetições em tandem de fragmentos contendo segmentos de repetição em tandem tendo um número anormal de repetições.

35. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a dita separação é em um número de frações selecionado do grupo consistindo em 2-16.

36. Método de acordo com a reivindicação 24, compreendendo ainda após a dita etapa de separação, clivagem de todo ou uma porção do segmento de repetição em tandem da dita seqüência marcadora em fragmentos que contêm o dito segmento de repetição em tandem e dita sequência marcadora.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que a dita clivagem é realizada usando uma endonuclease de restrição.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que a dita endonuclease de restrição é selecionada do grupo consistindo em BsaWI, Hphl, Bbvl, BstNI, Hpy1881, Smll e Bmtl.

39. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a dita detecção, compreende ainda amplificação do dito marcador.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a dita amplificação é realizada com reação em cadeia de polimerase (PCR).

41. Método de acordo com a reivindicação 40, em que a dita amplificação emprega um iniciador detectavelmente marcado.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, a dita detecção é realizada com eletroforese.

43. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a dita detecção é realizada usando o sistema de detecção de PCR Taqman.

44. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a dita seqüência marcadora é detectada através de hibridização para duas sondas que hibridizam simultaneamente para a seqüência marcadora.

45. Método de acordo com a reivindicação 24, em que as ditas repetições em tandem são repetições em tandem de trinucleotídeo.

46. Método para avaliação de indivíduos machos e fêmeas quanto ao estado de carregamento de mutações na região de repetição em tandem do gene FMR1, o dito método compreendendo ensaio de ácidos nucleicos de um indivíduo para determinar gênero; e ensaio do dito ácido nucleico para determinar o comprimento da região de repetição em tandem do gene FMR1 em que a dita determinação compreende amplificação da região de repetição em tandem, detecção de um produto de amplificação, e determinação do número de repetições em tandem no produto de amplificação, em que em indivíduos machos: a presença de um produto de amplificação tendo menos do que55 repetições em tandem indica que o indivíduo não é um carreador, a presença de um produto de amplificação tendo 55 ou mais repetições em tandem indica que o indivíduo é um carreador, ou na ausência de um produto de amplificação, o estado do carreador é indeterminado; e em indivíduos fêmeas: a presença de um produto de amplificação tendo mais do que 55 repetições em tandem indica que o indivíduo é um carreador; ou a presença de um produto de amplificação único tendo menos do que 55 repetições em tandem, o estado do carreador é indeterminado.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, compreendendo ainda análise de indivíduos indeterminados para determinar estado carreador, em que a dita análise compreende: separação de fragmentos de um ácido nucleico, os ditos fragmentos preparados a partir de uma amostra do indivíduo contendo ácido nucleico, em que os ditos fragmentos incluem alguns que contêm um segmento de repetição em tandem do gene FMR1 e uma seqüência marcadora, em que a seqüência marcadora não está contida dentro do segmento de repetição em tandem, a dita separação em frações de acordo com tamanho sob condições em que um fragmento contendo o segmento de repetição em tandem tendo um número normal de repetições estará localizado em uma primeira fração; e um fragmento contendo um segmento de repetição em tandem tendo uma pré-mutação estará localizado em uma segunda fração; e um fragmento tendo uma região de repetição em tandem tendo uma mutação integral estará localizado em uma terceira fração, identificação daquela(s) fração(õe) contendo o segmento através de detecção da seqüência marcadora, em que o número de repetições no segmento de repetição em tandem é determinado pela fração em que ele é identificado, em que em indivíduos machos: um resultado positivo na primeira fração indica que o indivíduo não é um carreador, um resultado positivo na segunda fração indica que o indivíduo é um carreador de pré-mutação, um resultado positivo na terceira fração indica que o indivíduo é afetado; e em indivíduos fêmeas: um resultado positivo apenas na primeira fração indica que o indivíduo é homozigoto para um alelo normal; um resultado positivo na segunda fração indica que o indivíduo é um carreador de pré-mutação; e um resultado positivo na terceira fração indica que o indivíduo é um carreador de mutação integral.

48. Método de acordo com a reivindicação 46, em que o dito ensaio de ácidos nucleicos para determinar gênero compreende amplificação de ácido nucleico.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, em que a dita amplificação de ácido nucleico compreende amplificação de uma região do gene amelogenina que produz tamanhos diferentes de produtos de amplificação do gene amelogenina no cromossomo X e do gene amelogenina no cromossomo Y, determinação do tamanho do produto ou produtos de amplificação, em que a presença de um produto de um tamanho único indica que o gênero é fêmea e a presença de dois produtos de tamanhos diferentes indica que o gênero é masculino.

50. Método de acordo com a reivindicação 48, em que a dita amplificação de uma região do gene amelogenina é realizada em multiplex com a amplificação da dita região de repetição em tandem do gene FMR1.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que a dita amplificação multiplex compreende ainda amplificação de uma ou mais seqüências controle.

52. Método de acordo com a reivindicação 47, compreendendo ainda após a dita etapa de separação clivagem de todo ou uma porção do segmento de repetição em tandem dos ditos fragmentos de seqüência marcadora que contêm dito segmento de repetição em tandem e dita seqüência marcadora.

53. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o gene é o gene FMR1.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, em que a identificação de um segmento de repetição em tandem na primeira fração indica que o indivíduo tem um alelo de FMR1 com um número normal de repetições em tandem; a identificação de um segmento de repetição em tandem na segunda fração indica que o indivíduo tem um alelo de FMR1 com prémutação; e a identificação de um segmento de repetição em tandem na terceira fração indica que o indivíduo tem um alelo de FMR1 de mutação integral.