CN110923305B - 一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准 - Google Patents
一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准，所述DNA分子量标准含有6条DNA片段，其长度分别为：2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、和5.7kb，各个片段中均包括能与针对于FMR1基因的探针结合的片段，且均不含有EagI或EcoRI的酶切位点。本发明为southernblot印迹杂交技术对脆性X综合征进行诊断提供了一种特定的DNA分子量标准，实现对临床检测样本型别进行准确快速的判断。在‑20±5℃条件下保存3年仍然可以正常使用，不影响检测结果。且易制备、在贮存和使用过程中具有良好的稳定性和可重复性；无生物传染性。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准。
背景技术
脆性X综合征(FXS)是以生长发育落后和精神发育迟滞为主要表现的遗传疾病。近年的研究还发现，FXS也是导致孤独症谱系障碍(ASD)的重要原因。
脆性X综合征的发病率仅次于唐氏综合征(21三体)，据统计，男性发病率约为1:4000，女性发病率为1:8000～1:6000。根据保守估计，我国至少有20万脆性X病人，主要特征为中度至重度智力低下，且随着年龄增加病情有加重的趋势，其他临床表现为特殊面容，如长脸或招风耳，青春期以后出现大睾丸，许多患者还表现为冲动、多动、焦虑、恐惧社交、语言呆板等孤独症行为。患者寿命与常人相同，但却不能独立生活，目前尚无有效治疗手段，只能通过特殊教育、技能训练及对症药物等综合手段，有限地提高患者的生活质量，给家庭和社会带来严重的心理和经济负担。
FXS严重危害儿童生长发育，早发现，早治疗，也可为家系遗传提供产前遗传咨询，避免家族中再次出现同样的患者，对家庭幸福美满、社会人口素质提高有重大意义，具有不可估量的社会效益和经济效益。
目前临床检测金标准为Southern印迹杂交方法，利用EcoRI和EagI限制性内切酶进行双酶切消化后，可以通过该方法检测出脆性X综合征相关基因FMR1前突变和全突变等位基因及嵌合体状态，同时可以了解甲基化状态，是最可靠的诊断方法。正常人DNA消化产物与探针杂交后，男性对应产生2.8kb大小的条带，女性有活性的X染色体对应产生2.8kb的条带，无活性的X染色体对应产生5.2kb的条带。男性携带者产生2.9～3.3kb的条带，而女性携带者的活性的X染色体对应产生2.9～3.3kb的条带，非活性X染色体对应产生5.3～5.7kb的条带。因此，2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、5.7kb这6个长度片段对FMR1基因分型尤为重要，特别是接近2.9kb和5.2kb这两个区分野生型和发病类型临界位置的片段。目前针对Southern blot技术的分子marker均针对广泛项目，无可以区分这几种型别的条带。但是在杂交分析中如果没有合适的DNA分子量标准，在对结果进行分析时会出现困难。比如女性携带者可能会出现两个大小不同的正常等位基因之间的分离程度可能与正常等位基因和突变前等位基因之间的分离程度相同，造成将携带者误判成正常者；或是对较小重复数的前突变的判断，如果没有较好的DNA分子量标准就会很难根据酶切片段大小判断基因型别。虽然国际上判断分子分型标准可通过多个未知样本检测，推测分子分型；但是缺乏准确性，而且考虑到样本采集的难易程度、生物安全性以及伦理问题，要持续制备以及用于大量的科研和临床实验显然是不合适的。
现在缺乏一种稳定性和重复性好，无生物传染性，结果可靠的可以监控杂交效果并对样本可以进行准确分型判断的DNA分子量标准。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准。该DNA分子量标准包含有6个片段，分别为2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、5.7kb，用于对脆性X综合征相关基因FMR1准确分型。
本发明的第一个目的是提供一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准。
本发明的第二个目的是提供任一所述的DNA分子量标准的制备方法。
本发明的第三个目的是提供任一所述DNA分子量标准在脆性X综合征southernblot印迹杂交检测中的应用。
本发明的第四个目的是提供任一所述DNA分子量标准在制备脆性X综合征southern blot印迹杂交检测试剂盒中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明提供一种适用于southern blot印迹杂交对脆性X综合征进行诊断的DNA分子量标准，合成对应大小的DNA片段，每条片段都包含southern blot探针序列，可以与样本一样可以与探针进行杂交并显色；再将片段插入到载体中制备成质粒，后对组合质粒进行酶切，得到相应大小的片段。片段混合制成DNA分子量标准中，包含有6个片段分别为2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、5.7kb，用于监控杂交效果并可以对样本进行准确分型，所述6条DNA片段均不含有EagI或EcoRI的酶切位点。
一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准，所述DNA分子量标准含有6条DNA片段，其长度分别为：2.8kb，2.9kb，3.3kb，5.2kb，5.3kb，5.7kb，各个片段中均包括能与探针结合的片段。
本专利并不限制各个片段能与探针结合的片段位于其片段的位置。优选地，各个片段能与探针结合的片段位于各片段的3’端。
优选地，所述针对于FMR1基因的探针其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
更优选地，所述能与探针结合的片段的序列如SEQ ID NO：13所示。
最优选地，所述DNA分子量标准含有6条DNA片段，其核苷酸序列如SEQID NO：1～6所示。
优选地，SEQ ID NO：1～6所示的DNA片段的拷贝数混合比例为1～3:2～4:1～3:1～3:2～4:1～3。
为了让阴性和阳性样本的临界片段更明显些，适当增加相应片段的用量。
更优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO：1～6所示的DNA片段的拷贝数混合比例为2:3:2:2:3:2。
以上所述的DNA分子量标准的制备方法，包括以下步骤：
S1.合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1～6所示的DNA片段；
S2.将S1的DNA片段分别连入克隆载体，得到重组质粒；
S3.将重组质粒进行酶切，得到含有S1的DNA片段的DNA片段；
S4.将S3得到的DNA片段按照拷贝数比例混合并定容。
优选地，步骤S2中，克隆载体为pEASY-T1。
优选地，步骤S3中，酶切使用的酶为NotI限制性内切酶，BcuI(SpeI)限制性内切酶和BstXI限制性内切酶。
优选地，步骤S4中，使用Low TE buffer进行定容。
优选地，步骤S4中，定容至终浓度为0.3～0.8ng/μL。
更优选地，定容至终浓度为0.4ng/μL。
本发明还要求保护以下内容：
以上任一所述DNA分子量标准在脆性X综合征southern blot印迹杂交检测中的应用；
以上任一所述DNA分子量标准在制备脆性X综合征southern blot印迹杂交检测试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明在体外构建的包含探针序列的长片段质粒，根据载体上特定的酶切位点进行酶切，得到脆性X综合征野生型，以及前突变与全突变临界值对应大小的片段。为southern blot印迹杂交技术对脆性X综合征进行诊断提供了一种特定的DNA分子量标准，实现对临床检测样本型别进行准确快速的判断。
在-20±5℃条件下保存3年仍然可以正常使用，不影响检测结果。且易制备、在贮存和使用过程中具有良好的稳定性和可重复性；无生物传染性。
附图说明
图1为DNA片段2.8kb对应合成的序列示意图。
图2为DNA片段2.9kb对应合成的序列示意图。
图3为DNA片段3.3kb对应合成的序列示意图。
图4为DNA片段5.2kb对应合成的序列示意图。
图5为DNA片段5.3kb对应合成的序列示意图。
图6为DNA片段5.7kb对应合成的序列示意图。
图7为脆性X综合征southern blot DNA分子量标准电泳结果。
图8为脆性X综合征southern blot DNA分子量标准显色结果。
图9为脆性X综合征southern blot DNA分子量标准检测样本显色结果。
图10为不含探针序列的DNA分子量标准显色结果。
图11为FMR1基因的探针southern blot杂交探针序列。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 DNA分子量标准的制备
1、获得DNA片段的重组质粒
设计了包含探针序列的6段DNA序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其序列核苷酸如SEQ ID NO：1～6所示(均不含有EagI或EcoRI的酶切位点)，每个片段上含有的southern blot印迹杂交结合FMR1基因的探针序列(其序列核苷酸如SEQ ID NO：13所示)，图1～6所示加粗的为探针序列。
将合成序列插入连接在pEASY-T1载体LacZα区域。
将6种质粒分别转化至大肠杆菌菌株，得到B28，B29，B33，B52，B53和B57六种重组大肠杆菌。培养大肠杆菌，分别提取重组质粒ZM28，ZM29，ZM33，ZM52，ZM53和ZM57。
2、获得6种固定大小的DNA片段
(1)对上述质提取的粒进行酶切
获得2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、5.7kb这三个片段，以上使用的限制性内切酶为NotI限制性内切酶(货号：ER0591)、BcuI(SpeI)限制性内切酶(货号：ER1251)和BstXI限制性内切酶(货号：ER1021)，均购自赛默飞公司。
(2)对上述酶切片段进行切胶回收
将6个相应DNA片段进行切胶回收，使用的试剂盒为北京天根生化科技公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。
3、确定混样比例
对上述回收的6种片段进行混合制成DNA分子量标准，切胶回收产物用紫外分光光度计进行浓度测定，6种片段按照拷贝数比例2:3:2:2:3:2进行混合，再加入Low TE buffer进行定容，终浓度为0.4ng/μL。配置比例如表1。
表1：
4、DNA分子量标准的使用
用制备的DNA分子量标准进行southern blot实验，对脆性X型别进行判定。southern blot实验的具体步骤为：
1、样本酶切：利用EagI和EcoRI两种限制性内切酶对待测样本分别进行酶切，以上使用的限制性内切酶均购自赛默飞公司。反应体系如下：
| 组分 | 体积(μL) |
| 10×EcoRI buffer | 5 |
| EcoRI | 2.5 |
| EagI | 2.5 |
| DNA | x(10μg) |
| 无菌水 | 40-x |
| Total | 50 |
反应条件为：37℃消化过夜
2、southern blot杂交探针制备：利用PCR DIG Probe Synthesis Kit合成southern blot做需要的杂交探针，试剂购自Roche公司；探针上游引物018F(其序列核苷酸如SEQ ID NO：14所示)，探针下游引物018R(其序列核苷酸如SEQ ID NO：15所示)，反应体系如下：
| 组分 | 体积(μL) |
| PCR buffer with MgCl2,10×conc | 5 |
| PCR DIG Probe Synthesis Mix,10×conc | 5 |
| 018F | 1 |
| 018R | 1 |
| Taq酶 | 1 |
| DNA | 1 |
| 无菌水 | 36 |
| Total | 50 |
反应条件：95℃变性10分钟，按照95℃30秒、51℃30秒、72℃40秒进行35个循环，最终于72℃延伸10分钟。
得到探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示(图11)。
3、Southern blot印迹杂交检测：制备1％的琼脂糖凝胶，再分别加入5μL的1kbDNA ladder，15μL的实施例1的制备southern印迹杂交的DNA分子量标准，50μL的酶切样本，在40V电压，2～8℃条件下，跑27h；电泳结束后进行变性转膜16～20h；再加入southernblot杂交探针进行过夜杂交，最后进行过夜化学显色。
具体片段大小对应基因型判断的标准见表2。
表2：
实施例2 DNA分子量标准的琼脂糖凝胶电泳
一、实验方法
使用实施例1的制备southern印迹杂交的DNA分子量标准进行1％的琼脂糖凝胶电泳，同时进行电泳的还有以下样本15000bp DNA ladder(货号：3582A)、2000bp DNA ladder(货号：3427A)、200bp DNA ladder(货号：3423A)、1kb DNA ladder(货号：3426A)，4种ladder各加入5μL，均购自宝日医生物公司；southern blot印迹杂交DNA分子量标准50μL。在40V电压，2-8℃条件下，跑26h。
二、实验结果
在凝胶成像下观察电泳结果，将制备的southern印迹杂交DNA分子量标准中6个片段电泳条带分别与上述4种ladder的条带进行比对，结果如图7所示，实施例1的制备的DNA分子量标准6个片段分别对应2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、5.7kb大小，片段2.8kb和2.9kb及5.2kb和5.3kb可以明显区分开，证明制备的DNA分子量标准中6个片段大小符合要求。
实施例3 DNA分子量标准的southern blot印迹杂交验证
一、实验方法
使用实施例1的制备southern印迹杂交的DNA分子量标准进行Southernblot印迹杂交检测，具体步骤为：制备1％的琼脂糖凝胶，分别加入5μL的1kbDNA ladder，15μL的实施例1的制备的DNA分子量标准，在40V电压，2～8℃条件下，电泳27h；电泳结束后进行变性转膜16～20h，再加入southern blot杂交探针(制备方法同实施例1，其核苷酸序列如SEQ IDNO：16所示)进行过夜杂交，最后进行化学显色。
二、实验结果
结果显示如图8所示，制备的southern印迹杂交DNA分子量标准中6个片段条带显色正常，上述片段与1kb DNA ladder进行比对，条带大小分别为2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、5.7kb；片段2.8kb和2.9kb及5.2kb和5.3kb可以明显区分开，证明制备的DNA分子量标准中可以用于southern blot印迹杂交实验。
实施例4 DNA分子量标准检测样本
一、实验方法
使用实施例1的制备southern印迹杂交的DNA分子量标准作为maker进行女性健康者的样本的检测。
1、样本酶切：利用EagI和EcoRI两种限制性内切酶对女性健康者的样本和实施例1制备的DNA分子量标准分别进行酶切，以上使用的限制性内切酶均购自赛默飞公司。反应体系如下：
反应条件为：37℃消化过夜
2、southern blot杂交探针制备：利用PCR DIG Probe Synthesis Kit合成southern blot做需要的杂交探针，试剂购自Roche公司。探针上游引物018F(其序列核苷酸如SEQ ID NO：14所示)，探针下游引物018R(其序列核苷酸如SEQ ID NO：15所示)，反应体系如下：
| 组分 | 体积(μL) |
| PCR buffer with MgCl2,10×conc | 5 |
| PCR DIG Probe Synthesis Mix,10×conc | 5 |
| 018F | 1 |
| 018R | 1 |
| Taq酶 | 1 |
| DNA | 1 |
| 无菌水 | 36 |
| Total | 50 |
反应条件：95℃变性10分钟，按照95℃30秒、51℃30秒、72℃40秒进行35个循环，最终于72℃延伸10分钟。
3、Southern blot印迹杂交检测：制备1％的琼脂糖凝胶，再分别加入5μL的1kbDNA ladder，15μL的实施例1的制备southern印迹杂交的DNA分子量标准，50μL的酶切样本，在40V电压，2～8℃条件下，跑27h；电泳结束后进行变性转膜16～20h；再加入southernblot杂交探针进行过夜杂交，最后进行过夜化学显色。
二、实验结果
结果显示如图9所示：制备的southern印迹杂交DNA分子量标准中6个片段条带显色正常，女性野生型样本显色结果有两条条带，分别是2.8kb与5.2kb，与DNA分子量标准中的2.8kb与5.2kb条带位置与其完全一致，证明制备的DNA分子量标准适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测。
对照例1不含探针序列的DNA分子量标准southern blot印迹杂交验证
一、实验方法
按照实施例1的方法制备不含探针序列的DNA分子量标准，每个片段不上加入的探针序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：7～12其余步骤与实施例1相同。
将制备得到的不含探针序列的DNA分子量标准，用于Southern blot印迹杂交检测，具体步骤：制备1％的琼脂糖凝胶，分别加入5μL的1kb DNA ladder，15μL的southernblot印迹杂交DNA分子量标准，在40V电压，2-8℃条件下，跑27h；电泳结束后进行变性转膜16～20h，再进行探针过夜杂交，最后进行化学显色。
二、实验结果
结果如图10所示，制备不含探针序列的southern印迹杂交DNA分子量标准中6个片段条带无法正常显色，证明制备的DNA分子量标准必须含有探针序列才可以用于southernblot印迹杂交实验。
序列表
<110> 广州市达瑞生物技术股份有限公司
<120> 一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2784
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctccgaccag tgtttgcctt ttatggtaat aacgcggccg gcccggcttc ctttgtcccc 60
aatctgggcg cgcgccggcg ccccctggcg gcctaaggac tcggcgcgcc ggaagtggcc 120
agggcggggg cgacctcggc tcacagcgcg cccggctatt ctcgcagctc accatggatg 180
atgatatcgc cgcgctcgtc gtcgacaacg gctccggcat gtgcaaggcc ggcttcgcgg 240
gcgacgatgc cccccgggcc gtcttcccct ccatcgtggg gcgccccagg caccaggtag 300
gggagctggc tgggtggggc agccccggga gcgggcggga ggcaagggcg ctttctctgc 360
acaggagcct cccggtttcc ggggtggggg ctgcgcccgt gctcagggct tcttgtcctt 420
tccttcccag ggcgtgatgg tgggcatggg tcagaaggat tcctatgtgg gcgacgaggc 480
ccagagcaag agaggcatcc tcaccctgaa gtaccccatc gagcacggca tcgtcaccaa 540
ctgggacgac atggagaaaa tctggcacca caccttctac aatgagctgc gtgtggctcc 600
cgaggagcac cccgtgctgc tgaccgaggc ccccctgaac cccaaggcca accgcgagaa 660
gatgacccag gtgagtggcc cgctacctct tctggtggcc gcctccctcc ttcctggcct 720
cccggagctg cgccctttct cactggttct ctcttctgcc gttttccgta ggactctctt 780
ctctgacctg agtctccttt ggaactctgc aggttctatt tgctttttcc cagatgagct 840
ctttttctgg tgtttgtctc tctgactagg tgtctaagac agtgttgtgg gtgtaggtac 900
taacactggc tcgtgtgaca aggccatgag gctggtgtaa agcggccttg gagtgtgtat 960
taagtaggtg cacagtaggt ctgaacagac tccccatccc aagaccccag cacacttagc 1020
cgtgttcttt gcactttctg catgtccccc gtctggcctg gctgtcccca gtggcttccc 1080
cagtgtgaca tggtgtatct ctgccttaca gatcatgttt gagaccttca acaccccagc 1140
catgtacgtt gctatccagg ctgtgctatc cctgtacgcc tctggccgta ccactggcat 1200
cgtgatggac tccggtgacg gggtcaccca cactgtgccc atctacgagg ggtatgccct 1260
cccccatgcc atcctgcgtc tggacctggc tggccgggac ctgactgact acctcatgaa 1320
gatcctcacc gagcgcggct acagcttcac caccacggcc gagcgggaaa tcgtgcgtga 1380
cattaaggag aagctgtgct acgtcgccct ggacttcgag caagagatgg ccacggctgc 1440
ttccagctcc tccctggaga agagctacga gctgcctgac ggccaggtca tcaccattgg 1500
caatgagcgg ttccgctgcc ctgaggcact cttccagcct tccttcctgg gtgagtggag 1560
actgtctccc ggctctgcct gacatgaggg ttacccctcg gggctgtgct gtggaagcta 1620
agtcctgccc tcatttccct ctcaggcatg gagtcctgtg gcatccacga aactaccttc 1680
aactccatca tgaagtgtga cgtggacatc cgcaaagacc tgtacgccaa cacagtgctg 1740
tctggcggca ccaccatgta ccctggcatt gccgacagga tgcagaagga gatcactgcc 1800
ctggcaccca gcacaatgaa gatcaaggtg ggtgtctttc ctgcctgagc tgacctgggc 1860
aggtcggctg tggggtcctg tggtgtgtgg ggagctgtca catccagggt cctcactgcc 1920
tgtccccttc cctcctcaga tcattgctcc tcctgagcgc aagtactccg tgtggatcgg 1980
cggctccatc ctggcctcgc tgtccacctt ccagcagatg tggatcagca agcaggagta 2040
tgacgagtcc ggcccctcca tcgtccaccg caaatgcttc taggcggact atgacttagt 2100
tgcgttacac cctttcttga caaaacctaa cttgcgcaga aaacaagatg agattggcat 2160
ggctttattt gttttttttg ttttgttttg gttttttttt tttttttggc ttgactcagg 2220
atttaaaaac tggaacggtg aaggtgacag caggagctcc actgttctgg gcgagggctg 2280
tgaagaaaga gtagtaagaa gcggtagtcg gcaccaaatc acaatggcaa ctgattttta 2340
gtggcttctc tttgtggatt tcggaggaga ttttagatcc aaaagtttca ggaagaccct 2400
aacatggccc agcagtgcat tgaagaagtt gatcatcgtg aatattcgcg tccccctttt 2460
tgttaaacgg ggtaaattca ggaatgcaca tgcttcagcg tctaaaacca ttagcagcgc 2520
tgctacttaa aaattgtgtg tgtgtgttta agtttccaaa gacctaaata tatgccatga 2580
aacttcaggt aattaactga gagtatatta ttactagggc attttttttt taactgagcg 2640
aaaatatttt tgtgccccta agaacttgac cacatttcct ttgaatttgt ggtgttgcag 2700
tggactgaat tgttgaggct ttatataggc attcatgggt ttactgtgct ttttaaagtt 2760
acaccattgc agatcaacta acac 2784
<210> 2
<211> 2884
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
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acaggagcct cccggtttcc ggggtggggg ctgcgcccgt gctcagggct tcttgtcctt 420
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ccagagcaag agaggcatcc tcaccctgaa gtaccccatc gagcacggca tcgtcaccaa 540
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cgaggagcac cccgtgctgc tgaccgaggc ccccctgaac cccaaggcca accgcgagaa 660
gatgacccag gtgagtggcc cgctacctct tctggtggcc gcctccctcc ttcctggcct 720
cccggagctg cgccctttct cactggttct ctcttctgcc gttttccgta ggactctctt 780
ctctgacctg agtctccttt ggaactctgc aggttctatt tgctttttcc cagatgagct 840
ctttttctgg tgtttgtctc tctgactagg tgtctaagac agtgttgtgg gtgtaggtac 900
taacactggc tcgtgtgaca aggccatgag gctggtgtaa agcggccttg gagtgtgtat 960
taagtaggtg cacagtaggt ctgaacagac tccccatccc aagaccccag cacacttagc 1020
cgtgttcttt gcactttctg catgtccccc gtctggcctg gctgtcccca gtggcttccc 1080
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cattaaggag aagctgtgct acgtcgccct ggacttcgag caagagatgg ccacggctgc 1440
ttccagctcc tccctggaga agagctacga gctgcctgac ggccaggtca tcaccattgg 1500
caatgagcgg ttccgctgcc ctgaggcact cttccagcct tccttcctgg gtgagtggag 1560
actgtctccc ggctctgcct gacatgaggg ttacccctcg gggctgtgct gtggaagcta 1620
agtcctgccc tcatttccct ctcaggcatg gagtcctgtg gcatccacga aactaccttc 1680
aactccatca tgaagtgtga cgtggacatc cgcaaagacc tgtacgccaa cacagtgctg 1740
tctggcggca ccaccatgta ccctggcatt gccgacagga tgcagaagga gatcactgcc 1800
ctggcaccca gcacaatgaa gatcaaggtg ggtgtctttc ctgcctgagc tgacctgggc 1860
aggtcggctg tggggtcctg tggtgtgtgg ggagctgtca catccagggt cctcactgcc 1920
tgtccccttc cctcctcaga tcattgctcc tcctgagcgc aagtactccg tgtggatcgg 1980
cggctccatc ctggcctcgc tgtccacctt ccagcagatg tggatcagca agcaggagta 2040
tgacgagtcc ggcccctcca tcgtccaccg caaatgcttc taggcggact atgacttagt 2100
tgcgttacac cctttcttga caaaacctaa cttgcgcaga aaacaagatg agattggcat 2160
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ggaatgcaca tgcttcagcg tctaaaacca ttagcagcgc tgctacttaa aaattgtgtg 2640
tgtgtgttta agtttccaaa gacctaaata tatgccatga aacttcaggt aattaactga 2700
gagtatatta ttactagggc attttttttt taactgagcg aaaatatttt tgtgccccta 2760
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acac 2884
<210> 3
<211> 3291
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cgggtctttg cagtcgtatg ggggcagggt agctgttccc cgcaaggaga gctcaaggtc 60
agcgctcgga cctggcggag ccccgcaccc aggctgtggc gccctgtgca gctccgccct 120
tgcggcgcca tctgcccgga gcctccttcc cctagtcccc agaaacagga ggtccctact 180
cccgcccgag atcccgaccc ggacccctag gtgggggacg ctttctttcc tttcgcgctc 240
tgcggggtca cgtgtcgcag aggagcccct cccccacggc ctccggcacc gcaggccccg 300
ggatgctagt gcgcagcggg tgcatccctg tccggatgct gcgcctgcgg tagagcggcc 360
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ttcccccagg tttacatgtt ccaatatgat tccacccatg gcaaattcca tggcaccgtc 1800
aaggctgaga acgggaagct tgtcatcaat ggaaatccca tcaccatctt ccaggagtga 1860
gtggaagaca gaatggaaga aatgtgcttt ggggaggcaa ctaggatggt gtggctccct 1920
tgggtatatg gtaaccttgt gtccctcaat atggtcctgt ccccatctcc cccccacccc 1980
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cctgacttgc gccccgctcc ctctttcttt gcagcaatgc ctcctgcacc accaactgct 2400
tagcacccct ggccaaggtc atccatgaca actttggtat cgtggaagga ctcatggtat 2460
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ccggggctgc gtgcaaccct ggggttgggg gttctgggga ctggctttcc cataatttcc 2580
tttcaaggtg gggagggagg tagaggggtg atgtggggag tacgctgcag ggcctcactc 2640
cttttgcaga ccacagtcca tgccatcact gccacccaga agactgtgga tggcccctcc 2700
gggaaactgt ggcgtgatgg ccgcggggct ctccagaaca tcatccctgc ctctactggc 2760
gagctccact gttctgggcg agggctgtga agaaagagta gtaagaagcg gtagtcggca 2820
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catcgtgaat attcgcgtcc ccctttttgt taaacggggt aaattcagga atgcacatgc 3000
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
tgtctttcct gcctgagctg acctgggcag gtcggctgtg gggtcctgtg gtgtgtgggg 60
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tgtgctatcc ctgtacgcct ctggccgtac cactggcatc gtgatggact ccggtgacgg 240
ggtcacccac actgtgccca tctacgaggg gtatgccctc ccccatgcca tcctgcgtct 300
ggacctggct ggccgggacc tgactgacta cctcatgaag atcctcaccg agcgcggcta 360
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gaagcggtag tcggcaccaa atcacaatgg caactgattt ttagtggctt ctctttgtgg 960
atttcggagg agattttaga tccaaaagtt tcaggaagac cctaacatgg cccagcagtg 1020
cattgaagaa gttgatcatc gtgaatattc gcgtccccct ttttgttaaa cggggtaaat 1080
tcaggaatgc acatgcttca gcgtctaaaa ccattagcag cgctgctact taaaaattgt 1140
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cac 1803
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ttcttagggg cacaaaaata ttttcgctca gttaaaaaaa aaatgcccta gtaataatat 180
actctcagtt aattacctga agtttcatgg catatattta ggtctttgga aacttaaaca 240
cacacacaca atttttaagt agcagcgctg ctaatggttt tagacgctga agcatgtgca 300
ttcctgaatt taccccgttt aacaaaaagg gggacgcgaa tattcacgat gatcaacttc 360
ttcaatgcac tgctgggcca tgttagggtc ttcctgaaac ttttggatct aaaatctcct 420
ccgaaatcca caaagagaag ccactaaaaa tcagttgcca ttgtgatttg gtgccgacta 480
ccgcttctta ctactctttc ttcacagccc tcgcccagaa cagtggagct c 531
Claims (5)
1.一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准物，其特征在于，所述DNA分子量标准物含有6条DNA片段，其长度分别为：2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb和5.7kb，所述6条DNA片段均不含有EagI和EcoRI的酶切位点，所述6条DNA片段含有如SEQ ID NO：1～6所示的核苷酸序列；
所述6条DNA片段的3’端均包括能与探针结合的片段，所述能与探针结合的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；
所述探针为针对于FMR1基因的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
2.根据权利要求1所述的DNA分子量标准物，其特征在于，所述6条DNA片段的拷贝数混合比例为1～3:2～4:1～3:1～3:2～4:1～3。
3.根据权利要求2所述的DNA分子量标准物，其特征在于，所述6条DNA片段的拷贝数混合比例为2:3:2:2:3:2。
4.权利要求1～3任一所述的DNA分子量标准物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1～6所示的DNA片段；
S2.将S1的DNA片段分别连入克隆载体，得到重组质粒；
S3.将重组质粒进行酶切，得到含有S1的DNA片段的6条DNA片段，所述6条DNA片段的长度分别为：2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb和5.7kb；
S4.将S3得到的DNA片段按照拷贝数比例混合并定容。
5.权利要求1～3任一所述的DNA分子量标准物在制备脆性X综合征southern blot印迹杂交检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述DNA分子量标准物用于根据southern blot印迹杂交检测的结果判断待测样本FMR1基因的基因型，具体判断标准如下：
所述待测样本来源于男性，则判断FMR1基因的基因型的标准为：
检测的结果为1条2.8 kb的杂交带，则判定待测样本的FMR1基因为野生型；检测结果为1条2.9~3.3kb的杂交带，则判定待测样本的FMR1基因为前突变型；检测结果为大于3.3kb单一或弥散状的杂交带，则判定待测样本的FMR1基因为全突变型；
所述待测样本来源于女性，则判断FMR1基因的基因型的标准为：
检测的结果为1条2.8kb的杂交带和1条5.2kb的杂交带，则判定待测样本的FMR1基因为野生型；检测结果为1条2.9~3.3kb的杂交带和1条5.2kb的杂交带，或检测结果为1条2.8kb的杂交带和1条5.3~5.7kb的杂交带，则判定待测样本的FMR1基因为前突变型；检测结果为1条2.8kb的杂交带和大于5.7kb单一或弥散状的杂交带，或检测结果为1条5.2kb的杂交带和大于5.7kb单一或弥散状的杂交带，或检测结果为1条2.8kb的杂交带、1条5.2kb的杂交带和大于5.7kb单一或弥散状的杂交带，或检测结果为1条2.8kb的杂交带、1条5.2kb的杂交带、3.3kb~5.2kb之间单一或弥散状的杂交带和大于5.7kb单一或弥散状的杂交带，则判定待测样本的FMR1基因为全突变型。
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