CN100485046C

CN100485046C - Abo血型基因与短串联重复基因座复合扩增系统

Info

Publication number: CN100485046C
Application number: CNB2006101715929A
Authority: CN
Inventors: 高阳; 陈初光; 马斌; 王曙光
Original assignee: DINGSHENG TECHNOLOGY (BEIJING) Co Ltd; PEOPLESPOT (BEIJING) CO Ltd
Current assignee: DINGSHENG TECHNOLOGY (BEIJING) Co Ltd; PEOPLESPOT (BEIJING) CO Ltd
Priority date: 2006-12-31
Filing date: 2006-12-31
Publication date: 2009-05-06
Anticipated expiration: 2026-12-31
Also published as: CN101008035A

Abstract

本发明涉及“一种血型基因与短串联重复基因座复合扩增检验系统”，其特征在于该系统包括ABO血型基因和STR基因座的引物，通过PCR反应在一个扩增体系中同时扩增。本发明可以为检测节省大量成本，提高工作效率。可以节约50%以上的成本，提供更多的遗传标记信息，明显提高检测的准确性，具有更高的个体识别能力和非父排除率。本发明反应体系具有更高的灵敏度，可以检测最低至0.05ng DNA，在这一极其微量模板情况下仍能够检出全部15个STR位点并判断出性别和血型。对微量模板的检测在法医学和案件侦破方面具有非常关键的作用。

Description

ABO血型基因与短串联重复基因座复合扩增系统

技术领域：

本发明属于生物技术领域。进一步，本发明涉及检测人类基因组中具有多态性的遗传标记和ABO血型基因。本发明特别涉及用聚合酶链式反应在一个扩增体系中同时扩增多个短串联重复基因座和ABO血型基因。

背景技术：

短串联重复序列(STR)是大量分布在人类基因组中的重复DNA片段，能够通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到长度不等的产物，并且扩增产物可以用放射性、银染色或荧光方法检测。而且，这类序列具有多态性、遗传稳定性等特点，因此被广泛用于身份识别和亲权鉴定等用途的遗传标记。用于个体识别和亲权鉴定时，需要同时检测多个位点才能够达到需要的识别能力，美国的联邦调查局(FBI)建立了一种DNA指数系统，其中包含了13个STR基因座位vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、TH01、TPOX、D8S1179、D3S1358、CSF1PO。早期对于STR基因座位的扩增和检测是通过单个PCR实现的，每个反应只能检测单个位点，成本很高，效率低下。因此在一个反应体系中检测多个STR非常重要，既能节约成本又提高工作效率。但是由于其中的技术要求很高，目前国际上仅有美国ABI公司的Identifiler试剂盒和美国Promega公司的PowerPlex16试剂盒两种产品可以实现在一个扩增体系种检测13种以上的STR基因座位。

血型鉴定在身份识别和亲权鉴定方面也具有非常重要的作用，尤其是对于案件侦破工作。跟血清学方法相比，用基因扩增方法鉴定血型可以得到更精确的结果，并且适合于各种血清学无法判断的检材(如骨骼、毛发等)和微量检测。1990到1993年，Yamamoto等克隆得到血型的A、B、O各等位基因并比较了其核苷酸序列的差异，为在DNA水平鉴定ABO基因型提供了理论基础[Yamamoto F等，J Biol Chem，1990，265：1146]。通过各种方法检测血型基因之间的差异序列，实现A、B、O基因分型。检测方法包括聚合酶链式反应—序列特异性引物(PCR-SSP)，聚合酶链式反-单链构象多态性(PCR-SSCP)，应聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)[Procter J.等，Tissue Antigens，1997，50(5)：475；S.P.Yip，Blood，2000，95(4)：1487；Carrll L等，J Forensic Sci，1996，41(1)：134-137]。目前美国G&T公司产品，可以通过PCR方法检测血型，但是其产物长度较大(超过1000bp)，不适合用荧光标记分析，因此检测灵敏度比较低。

发明内容：

本发明针对上述领域的缺陷，提供一种血型基因与短串联重复基因座复合扩增检验系统，使血型基因与多个STR基因座同时在一个反应中检测，极大的提高工作效率，能够一次提供更多的信息量，对于身份识别、亲权鉴定等遗传学及法医学应用有重要意义。

一种血型基因与短串联重复基因座复合扩增检验系统，其特征在于该系统包括ABO血型基因和STR基因座的引物，通过PCR反应在一个扩增体系中同时扩增。

所述ABO血型基因座为A/0796，B796，0261，A/B261。

所述STR基因座为Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D3S1358、TH01、D8S1179、TPOX、CSF1PO、Penta D。

所述的引物分别为：

1)Amelogenin，正向引物序列5’-3’是CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG；Amelogenin，反向引物序列5’-3’是ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG；

2)vWA，正向引物序列5’-3’是CCCTAGTGGATAAGAATAATC；反向引物序列5’-3’是GGACAGATGATAAATACATAG；

3)D21S11，正向引物序列5’-3’是CTCAGTCTCCATAAATATGT；反向引物序列5’-3’是TCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGT；

4)D18S51，正向引物序列5’-3’是GAGCCATGTTCATGCCACTG；反向引物序列5’-3’是TAACAAACCCGACTACCAGC；

5)Penta E，正向引物序列5’-3’是CCGATGCAGGTGTATTACCTGAG；反向引物序列5’-3’是CATGGAAAGAATTCTCTTATTTGGGTT

6)D5S818，正向引物序列5’-3’是GCAAGTATGTGACAAGG；反向引物序列5’-3’是CCACAGTTTACAACATTTGTATC

7)D7S820，正向引物序列5’-3’是GAGACGGGGTTTCACCATGTTG；反向引物序列5’-3’是TCATTGACAGAATTGCACC；

8)D13S317，正向引物序列5’-3’是CATGGTATCACAGAAGTCT；反向引物序列5’-3’是CCAAAAAGACAGACAGAAAGATAG；

9)D16S539，正向引物序列5’-3’是CAGATGCTCGTTGTGCACA；反向引物序列5’-3’是GCCTACAGAGTGATTCCATTTTTAT；

10)FGA，正向引物序列5’-3’是CTGGCATTCATGGAAGGC；反向引物序列5’-3’是CTTCAGGACTTCAATTCTGCTT；

11)D3S1358，正向引物序列5’-3’是GCAGTCCAATCTGGGTGAC；反向引物序列5’-3’是CTCATGAAATCAACAGAGGC；

12)TH01，正向引物序列5’-3’是ATTCAAAGGGTATCTGGGCTCTG；反向引物序列5’-3’是TGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT

13)D8S1179，正向引物序列5’-3’是GGCCGGGCAACTTATATGTA；反向引物序列5’-3’是TTGTGTTCATGAGTATAGTTT；

14)TPOX，正向引物序列5’-3’是CACCCAGAACCGTCGACTGGC；反向引物序列5’-3’是CCACACAGGTTAATTAAGA；

15)CSF1PO，正向引物序列5’-3’是ACTCCAGGGCAGTGTTCCA；反向引物序列5’-3’是AGCCCATTCTCCAGCCTCC

16)Penta D，正向引物序列5’-3’是AAGTAGGATCACTTGAGCCTG；反向引物序列5’-3’是CAAGTCCTTTTTTAGATATGTGA；

17)A/B261，正向引物序列5’-3’是CTGTGGCGCTTCTGATGTCCTCGTGGTGA；反向引物序列5’-3’是CTTGAGGATGTCGATGTTG；

18)0261，正向引物序列5’-3’是AACGATGTCCTCGTGGTAC；反向引物序列5’-3’是CTTGAGGATGTCGATGTTG；

19)A/0796，正向引物序列5’-3’是GCGTCTACTACCTGGGGGG；反向引物序列5’-3’是TAGCATCTGGTCGACCATCATG；

20)B796，正向引物序列5’-3’是GACTGCAGGGCGATTTCTACTACA；反向引物序列5’-3’是TAGCATCTGGTCGACCATCATG。

该检验系统中还包括有检测引物的荧光标记物。

所述检测引物的荧光标记物是A/B261，0261，A/0796，B796，Amelogenin，vWA，D21S11，D18S51，Penta E等位点的引物所采用的蓝色标记物6-FAM标记。

所述的检测引物的荧光标记物是D5S818，D7S820，D13S317，D16S539，FGA等位点的引物所采用的绿色标记物HEX标记。

所述的检测引物的荧光标记物是TH01，TPOX，D8S1179，D3S1358，CSF1PO，Penta D位点所采用的黄色标记物TMR标记。

所述的PCR反应的缓冲体系：50mM KCI，10mM Tris-HCI，2.5mM MgCI₂，1.0mg/ml BSA和各200mM的dNTP。

所述的PCR反应条件是：95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温35秒钟，70℃保温50秒钟，『运行30个循环』；60℃保温30分钟；4-10℃保温。

本发明采用聚合酶链式反应在一个扩增体系中同时扩增多个短串联重复基因座和ABO血型基因，该反应体系中能扩增4个ABO血型基因、1个性别决定位点与15个STR基因座，并能够通过常规手段检测和分型。

PCR方法分析短串联重复序列的原理与PCR方法鉴定ABO血型原理不同，反应条件和产物长度范围也差别很大，将这两个体系融合非常困难。PCR分析短串联重复序列主要原理是在重复序列的上游和下游设计合适引物，使所有片段长度在可检测范围内(70-500bp)，并且不同基因座位的扩增产物长度不同，用以区分不同基因型。ABO血型基因序列是高度相似的，只是在个别部位有单个核苷酸的突变，无法通过改变引物位置实现片断长度差别，只能通过设计精确的引物和条件，保证引物能够识别1个核苷酸的差别，产物长度范围要与前者相似，还要在序列特异性的引物末端添加不与模板结合的序列来调节产物的长度。由于原理不同，PCR反应条件也差别很大，PCR方法鉴定ABO基因对反应条件要求非常苛刻，反应温度改变1度都可能导致非特异性产物产生，最终导致判型错误，要使得两种检测体系适应同样的反应条件需要进行大量计算和试验。

本发明用于ABO血型基因的鉴别位点是第6个外显子的261位(A、B基因为G，O基因此处缺失一个核苷酸)和第7个外显子的796、802、803位(A、O基因为C/G/G，B基因此处A/G/C)。采用4对引物分别扩增A/B基因和O基因的261位，A/O和B基因的796、802、803位，得到长度不等的特征性片段，通过读取片段可以判断血型[姜先华等，中国法医学杂志，2004，19(1)：41—42]。判断ABO基因型可以依据下表。

	O261	A/B261	A/O796	B796
	O261	A/B261	A/O796	B796	AA	－	+	+	－
AO	+	+	+	－	AA	－	+	+	－
AO	+	+	+	－	AB	－	+	+	+
BB	－	+	－	+	AB	－	+	+	+
BB	－	+	－	+	BO	+	+	+	+
OO	+	－	+	－	BO	+	+	+	+

本发明所采用的STR基因作为包括FBI规定的CODIS中的所有核心序列，vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、TH01、TPOX、D8S1179、D3S1358、CSF1PO。另外包括两个5核苷酸重复序列，Penta D和Penta E，这两个位点在中国各族人群中都具有高度多态性，并且影子带很少，非常适合用于中国人群个体识别[吕德坚等，中国法医学杂志，2003，18(6)：332—334；李海燕等，中国法医学杂志，2004，19(6)：330-333]。

本发明提供的STR基因座位和血型基因检测引物采用3种颜色的荧光标记物标记，ABO，Amelogenin，vWA，D21S11，D18S51，Penta E等位点的引物用蓝色标记物6-FAM(羧基荧光素)标记；D5S818，D7S820，D13S317，D16S539，FGA等位点的引物采用绿色标记物HEX(六氯-6-甲基荧光素)标记；TH01，TPOX，D8S1179，D3S1358，CSF1PO，PentaD等6个位点采用黄色标记物TMR(4-甲基-6-羧基-罗丹明)标记。

本发明中的20对引物可以在同一个反应体系中，同一反应条件下同时扩增。具体的序列见表1。

表1 引物序列

位点名称　　　　　引物方向　　　　　　　　　　序列5’-3’

Amelogenin Forward CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG

Amelogenin Reverse ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG

vWA Forward CCCTAGTGGATAAGAATAATC

vWA Reverse GGACAGATGATAAATACATAG

D21S11 Forward CTCAGTCTCCATAAATATGT

D21S11 Reverse TCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGT

D18S51 Forward GAGCCATGTTCATGCCACTG

D18S51 Reverse TAACAAACCCGACTACCAGC

Penta E Forward CCGATGCAGGTGTATTACCTGAG

Penta E Reverse CATGGAAAGAATTCTCTTATTTGGGTT

D5S818 Forward GCAAGTATGTGACAAGG

D5S818 Reverse CCACAGTTTACAACATTTGTATC

D7S820 Forward GAGACGGGGTTTCACCATGTTG

D7S820 Reverse TCATTGACAGAATTGCACC

D13S317 Forward CATGGTATCACAGAAGTCT

D13S317 Reverse CCAAAAAGACAGACAGAAAGATAG

D16S539 Forward CAGATGCTCGTTGTGCACA

D16S539 Reverse GCCTACAGAGTGATTCCATTTTTAT

FGA Forward CTGGCATTCATGGAAGGC

FGA Reverse CTTCAGGACTTCAATTCTGCTT

D3S1358 Forward GCAGTCCAATCTGGGTGAC

D3S1358 Reverse CTCATGAAATCAACAGAGGC

TH01 Forward ATTCAAAGGGTATCTGGGCTCTG

TH01 Reverse TGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT

D8S1179 Forward GGCCGGGCAACTTATATGTA

D8S1179 Reverse TTGTGTTCATGAGTATAGTTT

TPOX Forward CACCCAGAACCGTCGACTGGC

TPOX Reverse CCACACAGGTTAATTAAGA

CSF1PO Forward ACTCCAGGGCAGTGTTCCA

CSF1PO Reverse AGCCCATTCTCCAGCCTCC

Penta D Forward AAGTAGGATCACTTGAGCCTG

Penta D Reverse CAAGTCCTTTTTTAGATATGTGA

A/B261 Forward CTGTGGCGCTTCTGATGTCCTCGTGGTGA

A/B261 Reverse CTTGAGGATGTCGATGTTG

O261 Forward AACGATGTCCTCGTGGTAC

O261 Reverse CTTGAGGATGTCGATGTTG

A/O796 Forward GCGTCTACTACCTGGGGGG

A/O796 Reverse TAGCATCTGGTCGACCATCATG

B796 Forward GACTGCAGGGCGATTTCTACTACA

B796 Reverse TAGCATCTGGTCGACCATCATG

扩增反应在一定的缓冲体系中进行。缓冲体系中包括：50mM KCI，10mM Tris-HCI(pH8.3 at 25℃)，2.5mM MgCI₂，1.0mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和各200mM的dNTP。dNTP是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。

扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI 2400、Bio-Rad iCycler等)采用以下的程序可以得到较好的结果：95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温35秒钟，70℃保温50秒钟，『运行30个循环』；60℃保温30分钟；4-10℃保温。扩增产物应当尽快检测，如果在4℃可以保存1周左右，在-20℃可以保存1月左右。

本发明中的模板DNA为人类基因组DNA。由各种常规方法(比如磁珠法、酚氯仿法、树脂纯化等方法)[分子克隆实验手册第三版，冷泉港出版社]提取的模板DNA可以得到较好的结果。DNA可以由以下组织或细胞制备：血液、精液、骨骼、毛发、唾液、汗液含有胎儿细胞的羊水等。DNA模板量在0.5ng至4ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基因座位检测不出，模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生。

本发明由于采用了荧光标记的引物，扩增产物也带有荧光标记物，并且标记物可以在激光激发下发出可以被测序仪(如ABI 377 DNA sequencer)或遗传分析仪(如ABI 3130、3100 genetic analyzer)识别的光，所以扩增产物可以通过测序仪或遗传分析仪等仪器上进行电泳和检测分析。

本发明可以为检测节省大量成本，提高工作效率。1个反应体系中可以检测16个STR基因座位，同时可以检测出ABO血型。目前一般采用检测血型和STR基因座位分别进行，采用本发明可以节约50％以上的成本，并且操作和反应时间减少50％。

本发明可以在一次反应中提供更多的遗传标记信息，明显提高检测的准确性，具有更高的个体识别能力和非父排除率。

本发明反应体系具有更高的灵敏度，可以检测最低至0.05ng DNA，在这一极其微量模板情况下仍能够检出全部15个STR位点并判断出性别和血型。对微量模板的检测在法医学和案件侦破方面具有非常关键的作用。

本发明可以用于法医学分析、亲权鉴定、监测骨髓移植、连锁分析以及检测遗传疾病和癌症等领域。本发明在法医学应用具有独特的优势，尤其是对于案件侦破，我国目前DNA数据库建立不很完善，而血型数据比较完善，在进行案件侦破或串并案的时候往往需要通过血型数据补充DNA数据结果，使用本发明可以同时查询这两种信息，为案件侦破提供有力帮助。

说明书附图

图1采用本发明扩增DNA后得到的分析图谱

图2采用PowerPlex16扩增DNA后得到的分析图谱

具体实施方式

实施例1 复合扩增16个基因座位及ABO血型基因并用ABI 3130遗传分析仪荧光检测

血液由志愿者捐献，经血清学检验为O型血。模板DNA由血液中用chelex100方法提取。扩增反应在ABI 9700热循环仪上进行，检测ABI 3130遗传分析仪，数据分析采用GeneMapper v3.2软件。样品同时采用Promega公司的PowerPlex 16试剂盒检测，结果作为对照。

1.1.荧光标记引物合成

按照表1提供的序列，化学方法合成，每一对引物有一条用荧光分子标记。引物合成及荧光标记由上海生工生物工程有限公司完成。引物合成和标记后，HPLC方法纯化引物，PAGE胶检测纯度，只有一条目的条带。

1.2.chelex-100方法提取DNA(具体方法参考Forensic DNA Protocol，Humana Press，1998)

1)取3ul加抗凝剂的血液于500μl离心管中

2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加195μl 5％的chelex(200-300mesh，购自Bio-Rad公司)，再加入5μl蛋白酶K(20mg/ml，购自天根生化科技有限公司)

3)振荡样品，56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟，

4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟

5)小心吸出约150μl上清，转移至新管中，10μlPCR反应体系取1μl作为模板

6)短期内使用的话，4℃保存，如需要长期保存，冻存在冰箱-20℃

1.3.聚合酶链式反应扩增基因

1)取缓冲液、引物、酶，按照下表配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μl，加入模板DNA。

2)按照下面的反应条件设置热循环扩增仪(PCR仪)，将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温35秒钟，70℃保温50秒钟，『运行30个循环』；60℃保温30分钟；4℃持续保温，直至取出样品。

1.4.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3130遗传分析仪进行电泳和检测

1)取(0.5μl分子量内标+10μl去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液

2)混匀后分装，每管10μl，再分别加入1μl扩增产物和等位基因阶梯，简短离心将液体收集到离心管管子底部

3)样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态

4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测

5)大约40分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱和结果。见图1及表2，PowerPlex 16试剂盒检测结果见图2。

ABO基因	O	AB	AO	B
ABO基因	O	AB	AO	B	信号	+	-	+	-

该样本血型为O，与血清学结果一致。

表2：该样本15个STR基因座位和性别位点的基因分型结果

STR基因座位	Amelogenin	vWA	D21S11	D18S51	Penta E
STR基因座位	Amelogenin	vWA	D21S11	D18S51	Penta E	基因型	X，X	16，19	29，32.2	14，20	12，14’5

STR基因座位	D5S818	D7S820	D13S317	D16S539	FGA
STR基因座位	D5S818	D7S820	D13S317	D16S539	FGA	基因型	11，13	11，11	11，12	10，11	24，26

STR基因座位	D3S1358	TH01	D8S1179	TPOX	CSF1PO	Penta D
STR基因座位	D3S1358	TH01	D8S1179	TPOX	CSF1PO	Penta D	基因型	15，16	7，9	14，15	8，9	11，11	12，12

从图1及表2与图2的检测结果表明：由图1可以看出该样本血型基因中有O261和A/O796两条带，因此血型为O型，与血清学结果一致。样本各个STR位点基因型结果见表2。用PowerPlex 16试剂盒得到的分型结果跟表2完全一致，见图2。

SEQUENCE LISTING

<110>鼎生科技(北京)有限公司

<120>ABO血型基因与短串联重复基因座复合扩增系统

<130>P06270/DSH

<160>40

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>Amelogenin正向引物序列5′-3′

<400>1

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>Amelogenin反向引物序列5′-3

<400>2

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>vWA正向引物序列5′-3′

<400>3

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>vWA反向引物序列5′-3<400>4

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>D21S11正向引物序列5′-3′

<400>5

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>D21S11反向引物序列5′-3′

<400>6

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>D18S51正向引物序列5′-3′

<400>7

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>D18S51反向引物序列5′-3<400>8

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>Penta E正向引物序列5′-3′

<400>9

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>Penta E反向引物序列5′-3′

<400>10

<210>11

<211>17

<212>DNA

<213>D5S818正向引物序列5′-3′

<400>11

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>D5S818反向引物序列5′-3′

<400>12

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>D7S820正向引物序列5′-3′

<400>13

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>D7S820反向引物序列5′-3′

<400>14

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>D13S317正向引物序列5′-3′

<400>15

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>D13S317反向引物序列5′-3′

<400>16

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>D16S539正向引物序列5′-3′

<400>17

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>D16S539反向引物序列5′-3′

<400>18

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>FGA正向引物序列5′-3′

<400>19

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>FGA反向引物序列5′-3′

<400>20

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>D3S1358正向引物序列5′-3′

<400>21

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>D3S1358反向引物序列5′-3′

<400>22

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>TH01正向引物序列5′-3′

<400>23

<210>24

<211>23

<212>DNA

<213>TH01反向引物序列5′-3′

<400>24

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>D8S1179正向引物序列5′-3′

<400>25

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>D8S1179反向引物序列5′-3′

<400>26

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>TPOX正向引物序列5′-3<400>27

<210>28

<211>19

<212>DNA

<213>tpox反向引物序列5′-3′

<400>28

<210>29

<211>19

<212>DNA

<213>CSF1PO正向引物序列5′-3′

<400>29

<210>30

<211>19

<212>DNA

<213>CSF1PO反向引物序列5′-3<400>30

<210>31

<211>21

<212>DNA

<213>Penta D正向引物序列5′-3′

<400>31

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>Penta D反向引物序列5′-3′

<400>32

<210>33

<211>29

<212>DNA

<213>A/B261正向引物序列5′-3′

<400>33

<210>34

<211>19

<212>DNA

<213>A/B261反向引物序列5′-3′

<400>34

<210>35

<211>19

<212>DNA

<213>O261正向引物序列5′-3′

<400>35

<210>36

<211>19

<212>DNA

<213>O261反向引物序列5′-3′

<400>36

<210>37

<211>19

<212>DNA

<213>A/O796正向引物序列5′-3′

<400>37

<210>38

<211>22

<212>DNA

<213>A/O796反向引物序列5′-3′

<400>38

<210>39

<211>24

<212>DNA

<213>b796正向引物序列5′-3′

<400>39

<210>40

<211>22

<212>DNA

<213>B796反向引物序列5′-3′

<400>40

Claims

1、一种检测血型基因与短串联重复基因座的复合PCR方法，其特征在于该PCR反应体系中包括ABO血型基因和STR基因座的引物，通过PCR反应在一个扩增体系中同时扩增；所述ABO血型基因座为A/O796、B796、O2061、A/B261，所述STR基因座为Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、PentaE、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D3S1358、TH01、D8S1179、TPOX、CSF1PO、Penta D；所述的引物分别为：

18)O261，正向引物序列5’-3’是AACGATGTCCTCGTGGTAC；反向引物序列5’-3’是CTTGAGGATGTCGATGTTG；

19)A/O796，正向引物序列5’-3’是GCGTCTACTACCTGGGGGG；反向引物序列5’-3’是TAGCATCTGGTCGACCATCATG；

2、权利要求1所述的检测血型基因与短串联重复基因座的复合PCR方法，所述PCR反应体系中还包括有检测引物的荧光标记物。

3、权利要求2所述的检测血型基因与短串联重复基因座的复合PCR方法，所述检测引物的荧光标记物是A/B261，O261，A/O796，B796，Amelogenin，vWA，D21S11，D18S51，PentaE等位点的引物所采用的蓝色标记物6-FAM标记，所述的检测引物的荧光标记物是D5S818，D7S820，D13S317，D16S539，FGA等位点的引物所采用的绿色标记物HEX标记，所述的检测引物的荧光标记物是TH01，TPOX，D8S1179，D3S1358，CSF1PO，Penta D位点所采用的黄色标记物TMR标记。

4、权利要求1所述的检测血型基因与短串联重复基因座的复合PCR方法，所述的PCR反应的缓冲体系为：50mM KCl，10mM Tris-HCl，2.5mM MgCl₂，1.0mg/ml BSA和各200mM的dNTP。