CN106906231A - 一种偶数dna分子量标准及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

利用基因工程和基因合成的方法得到两种重组载体p2186和p1000。分别采用核酸发酵制备p2186 DNA载体，然后进行EcoRI完全酶切，进而获得摩尔数相当的2kb、1kb、800bp、600bp的DNA片混合物‑Mix1。以质粒p1000为PCR模板，以特异引物进行扩增，获得1000bp的PCR产物，用EcoRI进行部分（不完全）酶切，可获得5种 DNA片段混合物‑Mix2。Mix1和Mix2经过适当调配，可以组成条带分布均匀的200bp ladder DNA分子量标准,其组成包括200bp、400bp、600bp、800bp、1000bp和2000bp，共6种双链DNA片段。本发明公开的两种200bp ladder制备用核酸载体p2186和p1000及其制备200bp ladder DNA分子量标准的方法，具有较大的技术及成本优势，不但效率高，省时省力，同时所得到的DNA分子量标准片段质量明显优于单一的载体酶切或PCR扩增来源的同类DNA 分子量标准。

Description

一种偶数DNA分子量标准及其制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因工程研究与应用领域。具体地说，涉及一种200bpladder DNA分子量标准制备用载体组合及其在制备200bp ladder DNA分子量标准中的应用。
背景技术
DNA分子量标准是指一组分子量已知的DNA分子的混合物，电泳后按照其分子量的大小和迁移率的不同，在电泳凝胶（琼脂糖凝胶或PAGE凝胶）上形成一个DNA片段分布的梯度 (ladder)，用以指示电泳过程中未知DNA样品的分子量。目前，各种规格的DNA分子量标准多由专业的生物技术公司专门生产。国内市场上的DNA分子量标准从最初的以进口产品为主、到目前以国产产品为主和许多自制品的出现，制备和生产DNA分子量标准的方法为越来越多的人所掌握。DNA分子量标准的生产主要涉及DNA样本的酶切消化产生较大的DNA分子和PCR扩增制备较小的DNA分子；其中限制性内切酶酶切的DNA分子的来源又可以分为天然的基因组DNA 和人工构建的质粒载体；PCR扩增又可分为单片段的扩增和多片段的扩增。
1. 通过限制性核酸内切酶酶切制备DNA分子量标准
利用DNA分子中存在的限制性内切酶酶切位点（天然的或人为加入的），采用合适的内切酶对其进行消化，从而形成一组分子量各异的DNA片段，用来作为DNA分子量标准。按照被消化DNA的来源可以分为两种：天然来源的特种DNA（如基因组）和人工构建的质粒DNA。天然来源的基因组DNA的限制性内切酶酶切是通过分离某种来源的基因组DNA分子，然后用一种或几种限制性内切酶进行消化，从而产生一系列的DNA片段组合，目前最常见的此类DNA分子是 Lamda噬菌体的基因组DNA（λDNA），由其产生的DNA分子量标准有λDNA/HindIII， λDNA/EcoRI+HindIII 等，也可以是某种具有多个常见酶切位点质粒，如pBR322 DNA/AluImarker和pBR322 DNA/BsuRI (HaeIII) marker，但是所用的内切酶都是不常用的，因而成本较高。人工构建载体(质粒)的限制性内切酶酶切是通过一次性把所需要的各种DNA片段克隆到高拷贝数的载体上，转入大肠杆菌，通过发酵培养和质粒DNA的分离纯化，经过适当的酶切即可以获得大量的目标DNA片段。这种方法的优势在于通过大肠杆菌的发酵扩增质粒获得目的DNA片段，其制备规模很容易放大（50升的发酵体系很容易建立，而PCR扩增一般只能在小于500微升的体系内进行），获得的DNA片段条带在凝胶上条带锐利，过程重复性高。不存在PCR扩增再现性不好的缺点。而且由于质粒是一种遗传单位具有生命的基本特性即无限繁殖（扩增），所以这种质粒一旦构建好，即可以无限应用，不存在再生的问题。因而具有很大的应用空间。
2. 通过PCR扩增制备DNA分子量标准
由于PCR（Polymerase Chain Reaction）技术强大的DNA片段的扩增能力，同时由于目前Taq DNA聚合酶工程菌株的广为流传，目前利用PCR方法生产DNA分子量标准不存在技术问题，成本主要是引物合成和dNTP的购置，其他PCR试剂如TaqDNA聚合酶，模板DNA，反应Buffer等均可自制。由于生产效率低， 浓度强度高， 因而限制了其大规模的制备和应用。
在DNA分子量标准制备研究方面，我国科研工作者进行了较为系统的研究， 如叶春江等人构建了多个具有实际应用价值的DNA 重组载体，通过酶切可以产生多种具有核酸分子量参考意义的DNA片段组合(Ye Chunjiang. Electrophoresis, 2010, 31:2929–2935; Wu Jianbing Mol Biol Rep. 2011, 38(4): 2729–2731; Zhe Chen Mol.Biotechnol. 2009, 42(1): 128-133; Huang Dongyi. Plant Molecular BiologyReporter 2008 26(4):316-323; 张颖. 中国生物工程杂志.2009, 29 (8) : 119-123)。
长期以来，分子生物学试剂与基因工程研究领域，特别是核酸电泳领域，对于200bp DNA ladder 的制备缺少一种简单高效的方法。普遍存在技术水平低，简单重复工作为主的DNA marker制备方法。从而使得目前该种类型的DNA marker 价格居高不下，既造成了巨大的人力、原料浪费， 同时对广大科研工作者造成了一定的影响。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有200bp ladder DNA 分子量标准制备技术的不足，提供一种高效、低成本的制备方法。
经过长期的研究和探索，本发明恰恰满足了本领域上述技术缺陷， 实现了DNA 分子量标准的高效率、低成本制造。通过构建两种DNA片段载体及其组合运用，实现了在200bpladder DNA 分子量标准制备过程中发挥核酸发酵和PCR 扩增两种方法各自优势的整合。其目的在于：实现一种技术含量高、成本低、效率高的200bp DNA ladder制备方法，提高该种DNA分子量标准质量的同时，有效的降低了制备成本，提高了生产效率。
本发明进一步的目的在于：公开一种用于200bp DNA ladder制备的重组载体及在制备200bp DNA ladder中的组合运用。为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
1. 重组载体p2186的构建：
利用生物信息学软件DNAMAN(Lynnon Biosoft)分析NCBI数据库中拟南芥基因组DNA染色体序列数据 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/4 )，获得了一组内源性的EcoRI位点。利用自主开发的生物信息学软件GASAP（申请人课题组自有软件）分析内源性的EcoRI位点分部模式A，获得了一条特征序列，其特点为GAATTC－－－（1000bp）－－－GAATTC ，命名为S(EcoRI1000EcoRI) 序列， 即两个相邻的EcoRI位点之间有1000bp的距离。 然后再用生物信息学软件DNAMAN定位S(EcoRI1000EcoRI) 上游800 bp、下游600 bp区域，选择其中不带有PstI、SphI和EcoRI位点的基因组区域为PCR扩增区，分别设计上游和下游引物靶序列，以使得PCR扩增获得E800-(EcoRI1000EcoRI)-600E的DNA产物，即2400（800+1000+600）bp的产物。
将上述PCR产物克隆（TA克隆）进入突变过的T载体（载体大小为2kb）, 获得重组载体p2186, 该载体经过EcoRI酶切，可以释放其中的 2kb、1kb、800bp、600bp的DNA片段，其中由于各片段摩尔数相同，因而其质量数不同，其质量比例为：2kb:1kb:800bp:600bp=2:1:0.8:0.6。
2. 重组载体p1000的构建：
人工设计了5组重复的200bp片段(片段序列无特别指定)，每两个相邻的200bp片段之间均有EcoRI位点序列，且该1000bp片段的首尾（5′和3′末端）均具有EcoRI位点，同时5′和3′末端除了EcoRI位点之外，其序列组成在1000bp片段序列中具有唯一性, 作为引物结合位点，以确保PCR扩增产物的唯一性。该序列被亚克隆到高拷贝质粒pT2K 载体中，所得质粒命名为p1000。
由于重组质粒载体结构特征，p2186经大肠杆菌发酵富集后，通过质粒提取、纯化后，可获得高质量的重组载体p2186。通过EcoRI完全酶切后产生含有2kb、1kb、800bp 和600bp的Mix1。与之类似，以p1000为PCR扩增模板，以特异性正向引物Pf: 5'-GAATTCGACTGAGTGTCCTGGCA-3'和反向引物Pr: 5'-GAATTCTCCAGTCAGCTACGATAA AAG-3'）进行扩增，所获得的1000bp片段中含有4个内部EcoRI位点和2个外部EcoRI位点，以内切酶EcoRI进行部分酶切，可以得到含有200-1000bp 的5条DNA片段混合物-Mix2。
以适量Mix1和Mix2进行调配，这样就获得了一种较为完整的200bp DNA 片段长度标志物，即DNA分子量标准， 其组成为：200bp、400bp、600bp、800bp、1kb和2kb。其中600bp、800bp和1000bp 3种DNA片段一部分来自质粒完全酶切，一部分来自PCR产物部分酶切，200bp、400bp 2种DNA片段全部来自PCR产物部分酶切。
本发明的有益效果在于：设计了两种可用于200bp DNA ladder 制备的重组载体，能够通过核酸发酵及完全酶切和PCR扩增及部分酶切的方式进行200bp DNA ladder 的优化制备方式。本发明的优势在于结合了核酸发酵（制备较大DNA片段具有优势）和PCR扩增（制备较小DNA片段具有优势）各自的优势，互补了两种方法制备不同分子量DNA片段的不足。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：重组载体p2186的构建
首先利用NCBI中开放的基因组序列数据，利用生物信息学软件DNAMAN (LynnonBiosoft)分析基因组序列已知的物种DNA序列, 如模式植物拟南芥的基因组数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/4 )，获得一组候选的内源性的EcoRI位点。在利用自主开发的生物信息学软件GASAP（申请人课题组自有软件）分析内源性的EcoRI位点分部模式，获得了一条特征序列，其特点为GAATTC－－－（800bp）－－－GAATTC ，命名为S8(EcoRI800EcoRI) 序列， 即两个相邻的EcoRI位点之间有800bp的距离。 然后再用生物信息学软件DNAMAN定位S8(EcoRI800EcoRI) 上游1000 bp、下游600 bp区域，选择其中不带有PstI、SphI和EcoRI位点的基因组区域为PCR扩增区，分别设计上游和下游引物靶序列，以使得PCR扩增获得E1000-(EcoRI800EcoRI)-600E的DNA产物，即2400（1000+800+600）bp的产物。
将上述PCR产物克隆（TA克隆）进入突变过的T载体（载体大小为2kb）, 获得重组载体p2186, 该载体经过EcoRI酶切，可以释放其中的 2kb、1kb、800bp、600bp的DNA片段，其中由于各片段摩尔数相同，因而其质量数不同，其质量比例为：2kb:1kb:800bp:600bp=2:1:0.8:0.6。
实施例2：重组载体p2186的构建
首先利用NCBI中开放的基因组序列数据， 利用生物信息学软件如DNAMAN(LynnonBiosoft)分析基因组序列已知的物种DNA序列, 如模式植物拟南芥的基因组数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/4 )，获得一组候选的内源性的EcoRI位点。在利用自主开发的生物信息学软件GASAP（申请人课题组自有软件）分析内源性的EcoRI位点分部模式，获得了一条特征序列，其特点为GAATTC－－－（600bp）－－－GAATTC，命名为S6(EcoRI600EcoRI) 序列， 即两个相邻的EcoRI位点之间有600bp的距离。 然后再用生物信息学软件DNAMAN定位S6(EcoRI600EcoRI) 上游800 bp、下游1000 bp区域，选择其中不带有PstI、SphI和EcoRI位点的基因组区域为PCR扩增区，分别设计上游和下游引物靶序列，以使得PCR扩增获得E800-(EcoRI600EcoRI)-1000E的DNA产物，即2400（800+600+1000）bp的产物。
实施例3：载体p1000的构建
设计人工序列E200E200E200E200E200E，其结构特点为：由5组重复的200bp片段组成，每两个相邻的200bp片段之间均有EcoRI位点序列。全序列合成并由上海闪晶生物科技有限公司合成，并将之亚克隆到高拷贝载体pUC18 载体中，获得重组载体p1000。且该1000bp片段的首尾（5′和3′末端）均具有EcoRI位点，同时5′和3′末端除了EcoRI位点之外，其序列组成在1000bp片段序列中具有唯一性, 作为引物结合位点，以确保PCR扩增产物的唯一性。
实施例4：200bp ladder DNA分子量标准的制备
过程I：将载体p2186转入大肠杆菌5DHα中，挑取单菌落；以LB培养基（胰蛋白胨:10g/L、酵母提取物:5g/L、 氯化钠:10g/L）过夜培养（添加1/1000的氨苄青霉素），待OD=30时，离心收菌，用碱法提取质粒DNA（Sambrook J , Russell DW. Molecular cloning : Alaboratory manual 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001），所获得粗提质粒经过等体积氯仿多次抽提之后加入2倍体积的无水乙醇，置于-20℃ 沉淀过夜。8000rpm离心，弃去上清，所得沉淀用70%乙醇悬浮洗涤3次，晾干。再以TE溶液溶解，加入适量的酶切缓冲液和EcoRI内切酶，37℃连续酶切，期间定期电泳检查酶切程度，直至完全酶切，获得Mix1。
过程II：以适量p1000为PCR模板，用引物组合（Pf: 5’-GAATTCGACTGAGTGTCCTGGCA-3’ 和Pr: 5’-GAATTCTCCAGTCAGCTACGATAA AAG-3’）为扩增引物。PCR体系如下：
94℃度预变性1分钟；循环程序为：94℃变性60s，61℃退火36s，72℃延伸80s，36个循环；最后72℃延伸15分钟。反应结束后，所得PCR产物（800bp的复合体DNA片段）进行纯化和浓缩。首先以氯仿抽提PCR反应液，然后加入1/10体积的3M NaAC和2倍体积的无水乙醇，置于-20℃ 过夜沉淀。离心收集沉淀，并晾干后，以PCR反应液1/5体积的TE溶液溶解沉淀，建立EcoRI内切酶部分酶切体系，获得部分酶切产生的200-1000bp的组合物产物-Mix2。
取5 mL Mix1和10mL Mix2 冰浴上充分混合，然后取2uL 进行平板琼脂糖凝胶电泳检测，判定二者的浓度关系，根据电泳检测结果，调整和补加浓度弱的一方，直至二者亮度相当。
实施例5：重组载体p2186的摇瓶发酵
过程I-摇瓶发酵：挑取含有重组载体p2186的大肠杆菌单菌落（菌株为TOP10）， 接种于5mL含有 1/1000体积的氨苄青霉素母液（50mg/mL）的LB培养基中，37℃摇床振荡（180rpm）过夜(12小时)培养，然后全量转接到含有300mL 2×YT 培养基（蛋白胨16g/L、酵母抽提物10g/L、NaCl 5g/L）的2升三角瓶中，继续培养18小时，直至培养体系中大肠杆菌OD600=80。此时，停止培养， 离心收菌，采用碱裂解法提取质粒DNA，其过程同实施例3。
同样的，以含有p1000质粒的大肠杆菌JM09进行摇瓶发酵，采用天根生物科技有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒DNA。得到质粒DNA先采用70%乙醇洗涤3次，并8000rpm离心回收沉淀，晾干。以适量的TE溶解风干后的质粒DNA，并以80℃水浴孵育该质粒DNA溶液，以灭活其中残留的外源核酸酶活性，以利于p1000质粒DNA的保存。置于-20℃保存，其保存期可达到5-10年。
过程II：以适量p1000为PCR模板，用引物组合（Pf: 5’-GAATTCGACTGAGTGTCCTGGCA-3’ 和Pr: 5’-GAATTCTCCAGTCAGCTACGATAA AAG-3’）为扩增引物。PCR体系如下：
96℃度预变性30s；循环程序为：95℃变性50s，61℃退火30s，72℃延伸70s，42个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，所得PCR产物（1000bp的复合体DNA片段）进行纯化和浓缩。首先以氯仿抽提PCR反应液，以去除DNA聚合酶；然后加入1/10体积的3M NaAC和2/3倍体积的异丙醇，充分混匀，然后置于-20℃ 过夜沉淀。离心收集沉淀，并晾干后，以PCR反应液1/4体积的TE溶液溶解沉淀，建立EcoRI内切酶部分酶切体系，获得部分酶切产生的200-1000bp的组合物产物-Mix2。
10 mL Mix1和15mL Mix2 冰浴上充分混合，然后取1uL 进行平板琼脂糖凝胶电泳检测，判定二者的浓度关系，根据电泳检测结果，调整和补加浓度弱的一方，直至二者亮度相当。
实施例6：重组载体p2186的发酵罐培养
以涂布有含p2186质粒的DH5α大肠杆菌茄子瓶斜面（LB培养基: 胰蛋白胨10g/L, 酵母粉5g/L, NaCl 10g/L）, 37℃过夜培养。同时在10升发酵罐中配制发酵培养基5升，组成如下(TB培养基)：胰蛋白胨12g/L, 酵母粉24g/L, 甘油4g/L, 消泡剂50μl。接种量5%。发酵过程中控制温度在33~35 ℃之间，自动流加30%的氨水，使pH保持在6.8-7.1左右。 搅拌转速在100~200rpm之间。溶氧大于等于20%。
发酵补料：根据实际经验，流加补料分三个阶段进行，发酵过程中0~8h不加补料，8~15h补加含50g葡萄糖的补料1000mL，15~22h加入含190g葡萄糖的补料1000mL。
待茄子瓶斜面长好后，以250mL灭菌水洗脱斜面上的菌体，并将其转移和接种到10升发酵罐中，开动搅拌，保持溶氧 ≥20%。发酵过程中每小时取样测定OD值，当OD值增长趋缓后，开始流加5×LB培养基，以补加营养成分。对于5升初始发酵体积而言，流加补料培养基量为2升。当OD值停止增加后，继续保持搅拌和通氧3小时后，停止发酵。
离心收菌、碱裂解法提取质粒DNA、质粒纯化及EcoRI酶切等流程与实施例3相似。
综上所述，本发明公开的200bp ladder DNA分子量标准制备体系及其制备方法，是一种便捷、高效、成本低制备200bp ladder的方法。与现有技术相比，在很大程度上节约了成本，首先体现在本发明是利用核酸发酵的方法制备200bp ladder中的2kb、1kb、800bp和600bp DNA片段，而同类型重组载体尚未见报道。再次，本发明中采用的人工复合体方式作为PCR模板，一对引物通过单次扩增循环，可以产生5个产物单位（通过酶切释放），从而高效的节省了普通PCR扩增反应中的引物、Taq DNA聚合酶和dNTPs的用量。
另外，质粒p1000也可以单独用于DNA片段的制备。以质粒p1000为PCR扩增模板，获得的1000bp复合体结构经过EcoRI 完全酶切可以获得200bpDNA片段，是一种高效的获得200bp DNA 片段的方式, 可以用于含有200bp片段的DNA marker。同时，该1000bp复合体结构可以单独通过EcoRI部分酶切产生200～1000bp的DNA ladder, 形成一种含有200bp、400bp、600bp、800bp、1000bp 5条DNA片段的DNA marker。
由于目前200bp DNA ladder是一种很常用的DNA分子量标准之一，所以本发明中涉及的两种重组载体组合及其用于制备200bp DNA ladder的方法均具有一定的应用价值或技术创新示例作用。
对于本技术领域的技术人员，本发明所公开的技术案例仅是示例作用，如本发明中的技术方案中的酶切位点，理论上可以是任何限制性内切酶，即使从成本角度出发，合适的内切酶也可以是PstI、EcoRI、HindIII、BamHI等。
供生物信息学分析的基因组也可以是任何已知的物种基因组序列（微生物、植物、动物等）。
本发明的通过一般性说明及具体实施方案已对本发明的核心实质做了较为详尽的阐述，但是在本发明的基础上，本领域的专业技术人员可以对其做出修改或改进，甚至是提高，而这种改进及提高是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或提高，均应属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.制备本发明中200bp ladder 的技术体系由两种人工构建和全基因合成的核酸重组载体p2186和 p1000构成。
2.p2186适用于核酸发酵和限制性内切酶完全酶切。
3.p1000适用于作PCR模板，扩增获得具有复合结构的PCR产物，获得的扩增产物再进行限制性内切酶消化。
4.根据权利要求1所述的重组载体p2186，其特征在于，其中包含1个拷贝的2000bp、1000bp 、800 bp、600bp 4种 DNA片段，经过酶切，从而产生含有4种DNA片段的混合物-Mix1。
5.根据权利要求1所述，重组载体p1000，其特征在于其中含有5个重复的200bp DNA片段，每两个重复单位之间均存在EcoRI酶切位点，经过PCR扩增获得的1000bp DNA 片段经过酶切，可以产生200bp、400bp、600bp、800bp和1000bp的5种DNA片段混合物-Mix2。
6.根据权利要求1和2所述，重组载体p2186酶切所采用的限制性内切酶为EcoRI，所采用的酶切方式为完全酶切。
7.根据权利要求1和3所述，重组载体p1000 扩增产物所采用的限制性内切酶为EcoRI，所采用的酶切方式为部分（不完全）酶切。
8.根据权利要求1、2和3所述，该200bp DNA ladder的制备方法，其特征在于包括以下3个过程：（1）重组载体p2186进行核酸发酵、质粒提取、纯化及EcoRI完全酶切，获得Mix1；（2）以p1000为模板，进行特异性PCR扩增，所得扩增产物经EcoRI部分酶切，获得Mix2。
9.（3）以适当的比例调配Mix1和Mix2，得到成品。
10.根据权利要求1-6所述， 本发明中所制备的DNA ladder组成为：200bp、400bp、600bp、800bp、1000bp、2000bp，共6种DNA片段。
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