BRPI0709545A2 - amplificação especìfica de seqüência de dna fetal de uma mistura de origem fetal-maternal - Google Patents

Abstract

<B>AMPLIFICAçãO ESPECìFICA DE SEQUêNCIA DE DNA FETAL DE UMA MISTURA DE ORIGEM FETAL-MATERNAL<D>. A presente invenção fornece um método de amplificar sejetivamente sequências de DNA fetal a partir de uma mistura de origem fetai-maternal. Esse método utiliza metilação diferencial para permitir a amplificação seletiva de seqúências específicas trofoblásticas/fetais a partir de misturas de DNA que contêm uma alta proporção de DNA não-trofoblástico/fetal. A invenção também fornece métodos de utilização de sequências de DNA fetal amplificada para detecção de aneuploidia.

Description

"AMPLIFICAÇÃO ESPECÍFICA DE SEQÜÊNCIA DE DNA FETAL DE UMAMISTURA DE ORIGEM FETAL-MATERNAL"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um método de amplificar seletivamente seqüências deDNA fetal de uma fonte materna-fetal mista. Esse método utiliza metilaçãodiferencial para permitir a amplificação seletiva de seqüências específicastrofoblásticas/fetais de misturas de DNA que contêm uma alta proporção de DNAnão-trofoblástico/fetal. A invenção também fornece métodos de utilização deseqüências de DNA fetal amplificado para detecção de aneuploidia.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

Amplos estudos indicam que a incidência de aneuploidia de cromossomo inteiro emrecém-nascidos está entre 1 e 2%. Hsu1 Em: A. M. (ed) Distúrbios Genéticos e oFeto. pp 179-248) (1998). Essas anormalidades de cromossomo representam umacausa significativa de morbidade e mortalidade pré-natais, bem como uma causa importante de retardo de desenvolvimento severo em sobreviventes de longo prazo.Dada a dependência de idade materna de trissomias comuns e o aumento marcadona idade materna média, é claro que a importância de avaliar a aneuploidiacontinuará aumentando. Métodos confiáveis, baratos e não-invasivos para adetecção de aneuploidia durante gravidez são urgentemente necessários. Opções atuais para teste de aneuploidia são inadequadas. No momento, testeinvasivo através de amostragem da vilosidade coriônica ("CVS") ou amniocentese éapresentado como uma opção para todas as mulheres com 35 anos de idade e maisvelhas e para outras mulheres com risco elevado conhecido de aneuploidia. Dessaforma, a maioria das mulheres, já que elas não se enquadram nessas categoriais,não têm a opção de teste invasivo. A idade materna funciona deficientemente comoum teste de triagem já que muitos bebês nascem de mulheres com menos de 35anos e apenas cerca de 1 em 250 mulheres com 35 anos de idade terá umatrissomia descoberta por amniocentese. Durante os últimos 20 anos, houvemelhorias importantes na eficiência de triagem sérica materna para trissomia 21("T21"). A triagem moderna atual que usa soro materno de dois momentosgestacionais, bem como ultra-som, tem uma "sensibilidade" de -95% para detecçãode T21 com uma taxa de falso positivo de 5%. Vide exemplo de Wald N.J., et aí.111:521-31. (2004). Há, entretanto, três desvantagens importantes com esse tipo deteste. Primeira, este não fornece um diagnóstico, mas uma probabilidade desíndrome de Down. Um resultado "positivo" é definido como um risco de síndromede Down maior ou igual a uma mulher de 35 anos de idade. Dessa forma, muitasmulheres com um resultado "positivo" ainda terão de considerar que a chance deencontrar realmente a síndrome de Down é ainda menor do que 1%. Segunda, esseteste é limitado à trissomia 21 e 18. O terceiro problema é que esse teste temapenas 95% de sensibilidade. Uma sensibilidade de 95% em um teste de triagemcomo este tem um grande valor a partir da perspectiva de saúde pública, mas paramuitas pacientes, a chance de 5% de não detectar a T21 é inaceitável. Testesobviamente não-invasivos com valores preditivos positivos muito maiores esensibilidades maiores seriam muito mais úteis para as pacientes e imediatamente substituiriam os métodos de triagem existentes quando eles se tornassemdisponíveis.

Com início cerca de 12 anos atrás, a demonstração de células fetais de váriaslinhagens no sangue materno causou grande entusiasmo. Técnicas para purificaressas células a partir da circulação materna foram desenvolvidas e a viabilidade dediagnóstico pré-natal de diversas condições foi demonstrada. Todavia, essesmétodos não se tornaram práticos. Isso ocorre amplamente devido à escassez decélulas fetais e os problemas intimidantes de purificação delas. Bianchi, D.W. et al.,Br. J. Haematol. 105:574-83 (1999).

Uma grande quantidade de publicações recentes documentou que DNA fetal livreestá presente no plasma materno em praticamente todas as gravidezes com inícioantecipadamente no primeiro trimestre e continuando até o parto. Bischoff, F.Z., etal., Hum. Reprod. Update. 11:59-67 (2005). Múltiplos estudos demonstraram que osexo fetal pode ser determinado por amplificação de seqüências específicas decromossomo Y no DNA derivado do plasma materno e outros relatórios mostraramque o genótipo de grupo sangüíneo Rh fetal também pode ser determinado. Aquantidade absoluta de DNA fetal no plasma materno não é grande e depende daidade gestacional, bem como da técnica de recuperação. Estimativas, que são todasbaseadas na PCR quantitativa, sugerem que pode haver o equivalente de 50-200equivalentes de genoma de DNA fetal por ml de sangue inteiro, dependendo daidade gestacional e de outros parâmetros. Bischoff et al. 2005 Hum. Reprod. Update11:59-67). As origens de DNA derivado do plasma materno também são incertas.Muitos investigadores presumiram que este provavelmente deve ser derivado dotrofoblasto, já que este é o tecido em mais contato com a circulação materna.Evidência direta com relação a isto é originada de uma única publicação, queidentificou mosaicismo placentário de uma anormalidade de cromossomo Y. Flori E,et al., Relatório de caso Hum. Reprod. 19:723-4 (2004). Apesar desse sucessoinicial na demonstração da presença de DNA fetal no plasma materno, os principaisproblemas no diagnóstico pré-natal, como determinação da presença de trissomiascomuns não foi realizada usando DNA derivado do plasma materno. Isso ocorredevido ao fato de que o DNA fetal no plasma materno existe como uma mistura comDNA materno e o componente materno é geralmente mais abundante. A razão deDNA fetal a materno parece variar amplamente de amostra para amostra e demétodo para método. No mínimo, é aproximadamente 1% da massa do DNA e nomáximo, poderia ser muito maior. Benachi A, et al., Clin. Chem. 51:242-4 (2005).

Embora a PCR possa ser usada para amplificar quantidades muito pequenas deDNA1 não há método geral para amplificar seletivamente o DNA fetal. Qualqueresforço para amplificar seqüências comuns ao feto e à mãe apenas terão sucessona amplificação das seqüências maternas. Até aqui, foi apenas através do uso deiniciadores específicos para seqüências que não estão presentes no componentematerno (como o cromossomo Y) que a amplificação seletiva de seqüências fetaisfoi realizada. Técnicas de separação física foram usadas para aumentar a razão docomponente fetal de DNA derivado do plasma. Li Y, et. al. Jama 293:843-9 (2005); LiY, et al. Prenat. Diagn. 24:896-8 (2004a); Li Y, et al., Clin. Chem. 50:1002-11.Todavia, essas técnicas são improváveis de alguma vez produzirem DNA fetal depureza suficiente para permitir diagnóstico pré-natal de rotina.

Amostras do cérvix uterino de mulheres grávidas mostraram conter células fetais, eisso representa outra fonte potencial de DNA fetal que poderia ser usada paradiagnóstico pré-natal não-invasivo. A literatura sobre esse tópico focou duasquestões: 1) a confiabilidade de recuperação de células fetais a partir do cérvix uterino e métodos para melhorá-la e 2) métodos para separar células fetais daampla base de células maternas. Embora vários diagnósticos pré-natais tenham sidorealizados usando células fetais e DNA derivado de amostras cervicais, ambasdessas questões continuam como obstáculos significativos para o uso de rotinadessa idéia. A taxa de sucesso mais alta relatada da obtenção de células fetais apartir de amostras cervicais maternas foi de 82% e essa ocorreu apenas quando a5/55

técnica semi-invasiva de instilação de solução salina foi usada. Cioni R, et al.,Prenat. Diagn. 25:198-202 (20Q5). Ambos os meios morfológico (Tutschek B1 et al.,Prenat. Diagn. 15:951-60 (1995); Bussani C, et al., Mol. Diagn. 8:259-63 (2004)) eimunológico (Katz-Jaffe M.G., et al., Bjog 112:595-600 (2004)) foram usados paraseparar células fetais das maternas e ambos mostraram enriquecer a porcentagemde células fetais. Entretanto, o DNA obtido a partir desses métodos deveprovavelmente estar altamente contaminado com DNA materno. Além disso,nenhum estudo amplo nem sistêmico foi relatado.

Claramente, um método que permitiria a detecção e a análise de seqüências deDNA trofoblástico (e, dessa forma, fetal) quando elas estiverem em uma mistura comDNA materno seria extremamente útil. Amostras derivadas do plasma materno ou docérvix uterino seriam, então, usadas diretamente para análises fetais sem separaçãofísica extensa de células maternas e fetais ou DNA. De forma alternativa, métodosfísicos para enriquecimento de DNA fetal seriam combinados com amplificaçãoespecífica trofoblástica/fetal para aumentar os benefícios de ambos os métodos.Dessa forma, há ainda uma necessidade de um método que forneceria amplificaçãoseletiva do DNA fetal obtido a partir de uma fonte de DNA fetal/materno mista. Apresente invenção supre essa necessidade.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um método para amplificação seletiva de DNA fetal apartir de uma amostra de DNA fetal e materno mista, compreendendo DNA isoladode uma amostra de DNA fetal/materno mista; digerindo o DNA com uma enzimaespecífica de metilação; ligando o DNA digerido com um ligador; submetendo o DNAdigerido à amplificação por PCR mediado por ligador para obter produtos de PCRamplificados; removendo o ligador e o DNA iniciador dos produtos de amplificação;circularizando os produtos de PCR amplificados; submetendo os produtos de PCRcircularizados à digestão com exonuclease para reduzir qualquer DNA nãocircularizado a simples nucleotídeos; e submetendo os produtos à amplificação emcírculo rolante isotérmica para amplificar seletivamente o DNA fetal para produzir representações sensíveis à metilação a partir do DNA fetal.

Qualquer enzima específica de metilação pode ser usada e enzimas preferidasHpyChlV-4, Clal1 Acll e BstBI. Em configurações preferidas, a amplificação por PCRmediada por Iigador é realizada durante 12 ciclos. Ainda, em configuraçõespreferidas, a digestão com exonuclease é com Bal-31.A presente invenção também fornece um método de identificação de ampliconespecífico fetal compreendendo, preparando separadamente representaçõessensíveis à metilação a partir de DNA fetal e DNA de sangue inteiro usando ométodo de amplificação seletiva de DNA fetal descrito acima; marcando o DNA fetale o DNA de sangue inteiro para produzir provas de DNA fetal marcadas e provas deDNA de sangue inteiro marcadas; hibridizando as provas de DNA marcadas a doisarranjos idênticos de oligonucleotídeos, onde esses arranjos de nucleotídeoscorrespondem a fragmentos de restrição previstos para uma dada enzima sensível àmetilação; e comparando os dois arranjos entre si para localizar um oligonucleotídeoque hibridize-se exclusivamente para uma prova de DNA fetal; e identificando o oligonucleotídeo hibridizado a partir da etapa d como um amplicon específico fetal.Em outras configurações, a prova de DNA fetal e a prova de DNA de sangue inteirosão marcadas com dois diferentes rótulos o que permite que a hibridização deprovas marcadas seja realizada em um arranjo. O rótulo pode ser fluorocromo.Em configurações preferidas, a enzima sensível à metilação usada na amplificação seletiva é HpyCh4-IV.Preferivelmente, o DNA fetal é obtido a partir de gravidezes de primeiro trimestre emais preferivelmente de gravidezes de aproximadamente 56-84 dias.

A presente invenção também fornece um conjunto de amplicos específicos fetaisproduzidos pelo método descrito acima. A presente invenção fornece também umarranjo que compreende o conjunto de amplicons específicos fetais.

A presente invenção também fornece um método para determinar se o número decópia de um local pré-determinado do DNA fetal em uma mistura de DNA fetal ematerno é reduzido ou elevado conforme comparada com um número de cópianormal no local pré-determinado. O método compreende a amplificação seletiva dolocal pré-determinado do DNA fetal na amostra de teste e em uma amostra decontrole usando a amplificação seletiva do DNA fetal descrito acima. A amostra decontrole tem um número de cópia normal no local pré-determinado do DNA fetal. Naseqüência, o método compreende a comparação da quantidade do DNA amplificadona amostra de teste com a quantidade de DNA amplificado na amostra de controle;e correlacionando a quantidade reduzida de DNA amplificado com um número decópia reduzido ou uma quantidade elevada de DNA amplificado com um aumento nonúmero de cópia.

Em outra configuração, a comparação inclui a normalização do DNA amplificado apartir do local pré-determinado ao DNA amplificado a partir de um local de controlepresente no mesmo número de cópia na amostra de teste e na amostra de controle.

A presente invenção também fornece um método de determinação em uma amostrade teste se um número de cópia de um local pré-determinado é reduzido ou elevado,em comparação com um número de cópia normal, compreendendo a amplificaçãoseletiva de DNA fetal na amostra de teste e em uma amostra de controle usando ométodo de amplificação seletiva de DNA fetal descrito acima, onde a referidaamostra de controle tem um número de cópia normal no local pré-determinado;marcando DNA a partir da amostra de teste e o DNA da amostra de controle a partirda etapa a com um rótulo para produzir provas de DNA de teste marcadas e provasde DNA de controle marcadas; hibridizando provas de DNA de teste marcadas eprovas de DNA de controle marcadas para um arranjo de amplicons específicosfetais descrito acima; comparando a quantidade de hibridização entre as provas deDNA de teste e as provas de DNA de controle para determinar a potência do sinal; ecorrelacionando a potência do sinal com um aumento ou uma diminuição no númerode cópia no local pré-determinado na amostra de teste.Em outra configuração, o DNA de amostra de teste e o DNA de amostra de controlesão marcados com duas provas diferentes, o que permite que a hibridização sejarealizada em um arranjo.

DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

A Figura 1 ilustra uma eletroforese com gel de agarose, marcado com etídio de DNAde sangue e trofoblástico/fetal digerido com diversas enzimas. "B" e "T" indicamamostras de sangue e trofoblástica/fetal, respectivamente. A linha branca horizontalindica um peso molecular de aproximadamente 1500bp.

A Figura 2 ilustra exemplos representativos de amplificações mediadas porligadores. O painel da parte superior mostra PCR mediada por Iigador de DNApurificado de quatro amostras diferentes de soro materno. Produtos após 24 ciclossão mostrados. O painel da parte inferior mostra PCR mediada por Iigador de DNApurificado a partir do soro materno. Produtos após 20 ciclos são mostrados. Vias 1 e2 foram coletadas sem formaldeídeo e vias 3 e 4 foram coletadas em tuboscontendo formaldeídeo.

A Figura 3 ilustra um gel que mostra representação amplificada de DNAstrofoblástico/fetal e sangüíneo digeridos por Acll. As vias são conforme segue: 1)marcador; 2) trofoblasto/fetal; e 3) sangue. As vias 4 e 5 são as mesmas que a 2 e a3, exceto que Iigase não foi usada durante a etapa de ligação com o ligador. Aslinhas brancas indicam a porção que foi extraída para clonagem.

A Figura 4 mostra os resultados da PCR usando iniciadores para amplicons de Acllespecíficos. A PCR usando iniciadores para Acll específica foi realizada em 12representações identicamente preparadas de DNAs trofoblástico/fetal e sangüíneo.Resultados dos 4 conjuntos iniciadores são mostrados. Um total de 10 dessesconjuntos iniciadores trofoblásticos/fetais "específicos" foi identificado. "T" e "B"indicam que o gabarito foi derivado de trofoblasto/fetal e sangue, respectivamente.

A Figura 5 mostra os produtos de PCR usando conjuntos iniciadores específicostrofoblásticos/fetais na Bal-31 tratada, representações isotermicamente amplificadasde DNAs trofoblástico/fetal e sangüíneo. Cada par ("T" e "B") é o resultado de umconjunto iniciador na representação trofoblástica/fetal e sangüínea. O painel da partesuperior mostra produtos visíveis para todas as seis amostras trofoblásticas/fetaisapós 22 ciclos de PCR1 nenhum produto visível para as amostras de sangue. Opainel da parte inferior mostra que após 35 ciclos, iniciadores 1 e 2 têm produtosvisíveis a partir das representações sangüíneas.

A Figura 6 mostra seqüências de produtos de PCR contendo um SNP informativo noamplicon específico trofoblástico/fetal. O Painel A é a partir do DNA sangüíneo deentrada. O Painel B é a partir do DNA trofoblástrico/fetal de entrada. O Painel C é apartir de uma mistura de 20:1 dos dois DNAs de entrada. O Painel D é a partir darepresentação amplificada sensível à metilação de amostra de DNA mista. Issomostra que um SNP heterozigoto presente no DNA trofoblástico/fetal é amplificadolimpamente apesar de estar presente em apenas 5% e, portanto, não-detectável namistura inicial.

A Figura 7 mostra produtos de PCR de dois DNAs iniciais, bem como aquelesamplificados a partir da mistura de 20:1. Iniciadores que amplificaram umpolimorfismo repetido de CA em um amplicon de Acll específico trofoblástico/fetal foram usados para demonstrar amplificação seletiva em uma mistura de dois DNAs.O Painel A é o DNA de sangue inteiro de entrada com genótipo 198/202. O Painel Bé o DNA trofoblástico/fetal de entrada com genótipo 196/196. O Painel C é a misturade 20:1 com genótipo 198/202. O Painel D é a amplificação sensível à metilação damistura de 20:1 mostrando que o genótipo trofoblástico/fetal é obtido apesar de contaminação de 95% com DNA de sangue inteiro.

A Figura 8 mostra dados de um microarranjo descrito por Lucito et aí. Genome Res13:2291-305 (2003). Cada ponto representa uma razão média de Iog10 deintensidade de 10.000 oligos colocados sobre um arranjo de vidro ecomparativamente hibridizados. Todos os endereços representando fragmentos de Bglll com locais de Hindlll internos estão à extrema esquerda. Razões médias parafragmentos com locais de Hindlll internos são geralmente acima de 1:1 (10°).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um método de amplificação seletiva de seqüências deDNA fetal de uma fonte materna-fetal mista. Geralmente, o método envolve as etapas de: isolamento de DNA de uma fonte materna-fetal mista; submissão do DNAisolado à PCR mediada por ligador; circularização dos produtos de PCRamplificados; digestão com exonuclease; e finalmente, amplificação em círculorolante isotérmica.

O DNA pode ser obtido de uma fonte materna-fetal mista de DNA. Fonte maternal-fetal de DNAProcedimentos invasivos como amostragem da vilosidade coriônica ("CVS") eamniocentese podem fornecer DNA fetal puro que pode ser usado para diagnósticopré-natal. Embora esses procedimentos sejam rotineiramente usados, eles têmriscos associados. Por outro lado, existem diversas vias não-invasivas paraobtenção de DNA fetal: recuperação do DNA livre de célula que está presente noplasma materno e através da recuperação de células fetais esfoliadas a partir docérvix uterino materno. Todavia, esforços para usar DNA fetal para diagnóstico pré-natal de rotina foram limitados pelo fato de que o DNA fetal existe em uma misturacom DNA materno.

Os métodos da presente invenção possibilitam o uso de misturas de DNA materno-fetal já que esta utiliza as diferenças na metilação do DNA de DNA fetal e maternopara fornecer amplificação de seqüências específicas fetais a partir de amostrasmistas de DNA fetal/materno. Tirando vantagens dessas diferenças de metilação, apresente invenção fornece um método de amplificação seletiva de seqüências fetaisa partir de uma mistura de DNA fetal e materno. Esse método, dessa forma, fornecea possibilidade de realizar testes pré-natais com relação a anormalidadescromossômicas comuns no DNA, derivado de plasma materno ou de um esfregaçocervical.

Conforme discutido acima, a presente invenção recorre à diferença de metilaçãoentre o DNA fetal e materno.

Diferenças na metilação de DNA fetal e materno - Hipometilação de DNAtrofoblástico/fetal

A metilação do DNA é um evento epigenético que afeta a função celular através daalteração da expressão genética e refere-se à adição covalente de um grupo metila,catalizado por DNA metiltransferase (DNMT), ao 5-caborno de citosina em umdinucleotídeo CpG. Os métodos de metilação do DNA podem ser divididosaproximadamente em dois tipos: análise de metilação global e de gene específico. Oestado de metilação de DNA de mamífero sofre alterações dramáticas durante odesenvolvimento fetal. Considera-se que, no momento da concepção, os genomasmaternos e paternos são extensivamente metilados. No curso das primeiras divisõescelulares, essa metilação é amplamente "apagada" e, então, posteriormente, notempo de implantação, metilação de-novo ocorre e uma grande quantidade demetilação está presente novamente. Bird A, Genes. Dev. 16:6-21 (2002). Em todosos tecidos adultos que foram estudados, uma alta porcentagem (até 85%) dedinucleotídeos CpG são metilados. Gruenbaum Y, et a/., FEBS Lett 124:67-71(1981).

O conhecimento de quais seqüências são metiladas é atualmente rudimentar e éamplamente baseado em estudos realizados nos anos 80 que recorreram a técnicassimples, como comparações de metilação e digestões de DNA não-sensíveis àmetilação. Bird AP (1980) Nucleic Acids Res. 8:1499-504 (1980). Há um grandeacordo de interesse atual na metilação e seu papel na regulação da expressãogenética. Toda a literatura existente sobre metilação de DNA genômico é baseadanas amostras derivadas de fontes fetais ou adultas, como fígado e sangue inteiro.

Até o momento, não há estudos sistemáticos de metilação em tecidos extra-embriônicos, como trofoblasto/fetal. No curso da realização de diagnóstico pré-natalde distúrbios, como Síndrome de Prader-Willi e Síndrome do X Frágil, observou-seque o' DNA trofoblástico/fetal é relativamente hipometilado em comparação comDNA derivado do sangue, do fígado e da pele. lida T., Human Reprod. 9:1471-3(1994). Essa diferença é mais aparente ao realizar análises de Southern Blots queutilizam enzimas de restrição sensíveis à metilação. Quando mais DNA de mamíferoé digerido com uma enzima de restrição sensível à metilação, com uma seqüênciade reconhecimento de base quatro (por exemplo, Hpall), é evidente observar que amaioria do DNA permanece com peso molecular alto. O peso molecular médio defragmentos está acima de 15kb, considerando-se que a freqüência prevista de Hpallprevê um tamanho de fragmento médio muito menor. Olhando esses digestos (VideFigura 1), as pessoas poderiam achar que, no mínimo, 80% dos locais Hpall nãosão cortados. Embora isso não possa ser observado na figura, se alguém usar géiscom uma porcentagem maior de agarose, é claro que haja distribuição bimodal defragmentos, com um grupo sendo muito pequeno e o outro muito grande. Essasobservações basicamente recapitulam a descoberta do chamado "Hpall TinyFragment' [Pequeno Fragmento de Hpall] ou "ilhas de HTF", relatado em 1983.Cooper D.N., et ai, Nucleic Acids Res. 11:647-58 (1983). Se alguém digerir omesmo DNA com Mspl (mesma seqüência de reconhecimento que a Hpall, mas nãoé sensível à metilação), o peso molecular médio dos fragmentos é muito próximo dotamanho previsto. Entretanto, o mesmo experimento usando DNA preparado detrofoblasto/fetal de primeiro trimestre produz resultados muito diferentes. Há umadiminuição óbvia no peso molecular médio de DNA trofoblástico/fetal digerido comHpall, embora este ainda não seja igual àquele obtido por digestão com Mspl. Issoclaramente demonstra que o DNA preparado de trofoblasto/fetal é relativamentehipometilado (menos metilado) e isso fornece o prognóstico importante de que asáreas hipometiladas são muito mais amplamente distribuídas por todo o genoma doque são o CpG ou as ilhas de "HTF".

É difícil determinar precisamente o grau de hipometilação no DNA trofoblástico/fetalrelativo ao DNA de sangue inteiro, mas densitometria realizada nos digestos de DNAtrofoblástico/fetal vs. DNA de sangue inteiro, usando a enzima HpyChlV-414/55(semelhante àquela na Fig. 1), indica que para uma janela de fragmento de 500-1000bp, a densidade do esfregaço é consistentemente 2-3 vezes maior paraamostras trofoblásticas/fetais. Isso implica que nessa variação de tamanho, o DNAtrofoblástico/fetal digerido com HpyCh4-IV contém 2 a 3 vezes mais fragmentos doque o DNA de sangue inteiro.

A dependência da idade gestacional de diferenças de metilação entre o DNAtrofoblástico/fetal e derivado do sangue inteiro ainda não foi completamenteinvestigada. Em uma série de 10 amostras variando na idade gestacional de 9 a 20semanas, nenhuma diferença nas digestões realizadas com Hpall e HpyCH4-IV foi detectada. Entretanto, experiência com análise de Southern blots sensível àmetilação dos locais de Prader-Willi e do X Frágil indica que no meio do segundotrimestre, pode haver mais metilação de DNA trofoblástico/fetal do que está presenteno primeiro trimestre. Dessa forma, preferivelmente as amostras de DNA misto sãoobtidas de gravidezes de 10-13 semanas (por LMP).

Um método da presente invenção, dessa forma, fornece amplificação seletiva deDNA fetal a partir de uma amostra mista de DNA fetal e materno, utilizando asdiferenças de metilação entre o DNA fetal e o DNA materno discutidas acima.Conforme observado anteriormente, geralmente o método envolve as etapas de:isolamento de DNA de uma fonte materna-fetal mista; submissão do DNA isolado à PCR mediada por ligador; circularização dos produtos de PCR amplificados;digestão com exonuclease; e finalmente, amplificação em círculo rolante isotérmica.Os métodos da presente invenção compreendem a submissão do DNA isolado àPCR mediada por ligador.

PCR mediada por ligador

Geralmente, a PCR mediada por ligador começa com a digestão do DNA com umaenzima de restrição e com a ligação de Iigadores de duplo filamento àsextremidades digeridas. A PCR1 então, é realizada com um iniciador quecorresponde ao Iigador e fragmentos de até aproximadamente 1,5kb sãoamplificados. Vide Saunders1 R.D., et al., Nucleic Acids Res. 17:9027-37 (1989) eLisitsyn, N.A., et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59:585-7 (1994). Usandoessa técnica, foi possível amplificar o DNA a partir de uma única célula e detectarsubseqüentemente aneuploidia, usando o produto amplificado para realizarhibridização comparativa. Klein, C.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:4494-9(1999). Em outro estudo, representações amplificadas foram usadas para detectarvariações de número de cópia genômica simples usando-as como provas dehibridização para microarranjos com BAC. Guillaud-Bataille, M., et al., NucIeicAcidsRes. 32:e112 (2004).

Nesse método, a freqüência de digestão da enzima de restrição determina acomplexidade do produto amplificado que é resultado. Escolhendo uma enzima quese divida de forma não-freqüente, a complexidade da representação amplificadapode ser reduzida a uma fração do DNA genômico inicial, tornando a etapa dehibridização subseqüente muito mais fácil de ser realizada. Isso foi particularmenteútil nos cenários onde uma pessoa deseja realizar hibridizações comparativas entreduas fontes genômicas complexas. Um exemplo interessante é uma técnicachamada "ROMA" (Representationat Oligonucleotide Microarray Analysis) [Análisede Microarranjo de Oligonicleotídeo Representacional] que foi instrumental emrevelar um alto grau de variação de número de cópia genômica nos humanos.Lucito, R., et al. Genome Res. 13:2291-305 (2003); Sebat, J., et al., Science305:525-8 (2004); Jobanputra, V., et al., Genet Med 7:111-8 (2005).

O Exemplo 1 mostra o uso bem-sucedido de amplificação mediada por Iigador deDNA isolado do plasma de mulheres grávidas. Antes da amplificação, a enzimasensível à metilação com CpG HpyCh4-IV foi usada para digerir DNA purificado.Após a digestão, Iigadores foram recozidos e ligados ao DNA digerido e finalmente aPCR foi realizada usando o filamento da parte superior do par Iigador após seguindoum protocolo publicado. Vide Exemplo 1 e Guillaud-Bataille, M., et ai, MucIeicAcidsRes. 32:e112 (2004). Notavelmente, foi determinado que os métodos de coleta desangue materno preferivelmente não devem envolver formaldeídeo.

O Exemplo 2 mostra amplificação específica bem-sucedida de metilação mediadapor Iigador de DNA trofoblástico/fetal. O DNA trofoblástico/fetal, bem como amostrasde DNA de sangue inteiro foram digeridos com enzima sensível à metilação comCpG Acll. Semelhante ao exemplo 1, após digestão com enzima, Iigadores foramrecozidos e ligados ao DNA digerido.Finalmente a PCR foi realizada usando ofilamento da parte superior do par Iigador seguindo o mesmo protocolo de PCRestabelecido no Exemplo 1. Notavelmente, o DNA trofoblástico/fetal produziuconsístentemente produtos de PCR mais robustos e de aparência diferente o queocorreu com o sangue inteiro. Entretanto, foi determinado que apesar do fato de queuma enzima sensível à metilação com CpG ter sido usada, DNA não-trofoblástico/fetal (isto é, DNA de sangue inteiro) ainda foi amplificado.Conseqüentemente, os presentes inventores determinaram que a amplificação porPCR mediada por Iigador isolada não foi adequada para um DNA trofoblástico/fetalespecificamente amplificado.

Conseqüentemente, na etapa de PCR mediada por Iigador da presente invenção,uma amostra mista de DNA é obtida e digerida com uma enzima sensível àmetilação com CpG para formar DNA digerido com extremidades digeridas. Asenzimas sensíveis á metilação são conhecidas na área e incluem, entre outras,HpyChlV-4, Clal1 Acll e BstBI.

Usando uma enzima de restrição sensível à metilação com CpG para clivar o DNAantes da ligação com ligador, apenas fragmentos definidos por locais não metiladospodem ser amplificados. Em um cenário no qual haja uma mistura de DNAs de duas fontes diferentes, uma menos metilada do que a outra, a digestão com uma enzimasensível à metilação seguida por ligação com ligador e amplificação permite aamplificação seletiva de fragmentos definidos por locais diferencialmente metilados.Essa idéia foi usada em conjunto com "análise de diferença representacional" paraprovar as diferenças de metilação entre tecidos normais e cancerosos. Vide Ushijima T, et al., Proc Natl. Acad. Sei. USA 94:2284-9 (1997) e Kaneda, A., et a/., Acad. Sei.983:131-4 (2003). O grau para o qual a amplificação diferencial pode ser atingida poressa abordagem depende (em parte) do grau ao qual as diferenças de metilaçãoestão presentes. Por exemplo, se um dado local for 100% metilado em um DNA e0% metilado em outro, então, um alto grau de amplificação diferencial é esperado. Pouco se sabe atualmente sobre o grau ao qual muitos locais genômicos sãometilados. As ferramentas para determinação do estado de metilação, denominadasanálise de Southern blots e seqüenciamento com bissulfeto, geralmente mostraramque locais específicos ou são completamente metilados ou completamente nãometilados, sugerindo que o estado de metilação dos dados locais é muito regulado e mantido. Essa idéia é adicionalmente corroborada pelo fato de que os dois alelos decertos locais são precisamente metilados de forma diferente nas regiões do genomaque exibem compensação de estampagem e dosagem. Entretanto, a quantidade delocais específicos que foram extensivamente investigados é limitada. Ainda, osmétodos de detecção (análise com Southern blots e seqüenciamento com bissulfeto) não são capazes de distinguir entre diferenças sutis no grau de metilação.Entretanto, usando métodos da presente invenção, entretanto, foi determinado quehá uma amplificação diferencial altamente específica de seqüênciatrofoblástica/fetal.

Conforme observado acima, a metilação de genomas de mamífero é altamente não-randômica. Regiões ricas em GG e CpG ou ilhas de "HTF" são relativamentehipometiladas enquanto seqüência rica em AT é relativamente mais metilada. Porexemplo, mais de 90% dos locais para enzima rica em GC de corte raro, Notl, estãolocalizados em ilhas de GpG hipometiladas resultando em digestões muito maisfreqüentes com essa enzima do que pode ser ingenuamente previsto. Vide Fazzari, M.J., Greally JM, Nat. Rev. Genet. 5:446-55. (2004). Já que a presente invençãoutiliza diferenças de metilação para amplificar diferencialmente seqüênciasespecíficas trofoblásticas/fetais, e já que parece muito provável que as ilhas de CpGsão hipometiladas nos DNAs trofoblásticos/fetais e em outros, os métodos focam ametilação com CpG em DNA não-rico com GC. Para esse fim, enzimas de restrição que contêm uma CpG sensível à metilação, mas, de outra forma, consistem de ATsão preferidas. Quatro enzimas se enquadram nessa categoria. Uma é uma enzimade base quatro, HpyChlV-4 e corta em ACGT. As três enzimas restantes sãoenzimas de base seis: Ciai, Acll e BstBI com seqüências ATCGTA, AACGTT eTTCGAA, respectivamente.

Análise informal de 10 milhões de bases de genômico randomicamente escolhidoindicou que locais dessas enzimas quase nunca estão presentes nas ilhas de CpG.Mapas de restrição de locais de Notl foram comparadas com aqueles de Acll, Clal eBstBI. A análise mostrou que esses locais ricos em AT não estão aglomerados nasilhas de CpG e pelo contrário, eles essencialmente nunca ocorrem dentro das ilhas de CpG.De forma surpreendente, os locais de reconhecimento de Acll1 BstBI e Clal sãotambém muito raros. Parece que o genoma humano contém apenas -150.000 locaisde Acll, em vez de 750.000 que seriam previstos sob a hipótese de que a seqüênciagenômica é equilibrada com relação à freqüência de A, C, T e G. Essa redução de-80% na quantidade de locais de Acll real comparada com a esperada é devido àescassez relativa de dinucleotídeos CpG. Devido à PCR mediada por Iigador poderapenas amplificar fragmentos de até aproximadamente 1.500bp de comprimento,pesquisamos todos os fragmentos de Acll precistos entre 400 e 1500bp edescobrimos que a quantidade total no genoma humano é apenas de -15.000. Sefor presumido que até 90% dos locais de Acll previstos no DNA de sangue inteirosão bloqueados por metilação (uma hipótese conservadora dado o fato de que ametilação com CpG é elevada na seqüência rica em Acll), a quantidade verdadeirade fragmentos esperados nessa variação de tamanho pode ser de 1.000 - 2.000. Notodo, esses -2.000 fragmentos representariam menos de 0,1% de toda a seqüênciagenômica. O mesmo cálculo para DNA trofoblástico/fetal (presumindo-se queapenas -80% dos locais são metilados) prevê aproximadamente 2.000 - 4.000fragmentos de Acll amplificáveis. Esse cálculo fornece o prognóstico importante deque aproximadamente metade de todos os fragmentos amplificados em umarepresentação sensível à metilação de DNA trofoblástico/fetal seria esperada quefosse "específica" ou altamente enriquecida em comparação com umarepresentação de sangue inteiro semelhantemente preparada.

Após o DNA obtido da amostra mista ser digerido com uma enzima específica demetilação, conforme discutido acima, o DNA é, então, ligado a um ligador.Preferivelmente, o ligador tem um local de restrição integrado, que posteriormenteserá usado para fornecer extremidades adesivas compatíveis, necessárias para aetapa de circularização. Qualquer local da enzima de restrição que produzextremidades adesivas mediante a digestão pode ser usado. Por exemplo, Mlulfornece extremidades adesivas. Após a ligação ao ligador, o DNA resultante éamplificado usando um iniciador que se liga a um local dentro do ligador. Aamplificação por PCR é, então, realizada. A quantidade de ciclos pode variar, mas,preferivelmente, a quantidade de ciclos criará uma representação de tamanhoselecionado de fragmentos digeridos. Em configurações preferidas, 5 a 15 ciclos deamplificação são realizados. Em uma configuração mais preferida, 8-14 ciclos deamplificação são realizados. Em uma configuração mais preferida, 12 ciclos deamplificação são realizados.

Além da amplificação por PCR mediada por ligador, os métodos da presenteinvenção ainda compreendem a circularização dos produtos de PCR amplificados;digestão com exonuclease; e finalmente amplificação em círculo rolante isotérmica(discutida abaixo), já que os presentes inventores determinaram que a PCR mediadapor ligador não foi suficiente para amplificar especificamente o DNA fetal. O Exemplo2 mostra que algumas seqüências de DNA não-fetal foram amplificadas.Circularização de produtos de PCR amplificados

Após os ciclos de amplificação serem realizados, os produtos amplificados são,então, digeridos com uma enzima que se separa do ligador. Por exemplo, se oligador tiver um local de Mlul integrado, então, os produtos seriam submetidos à umdigesto de enzima Mlul. Após a digestão clivar o ligador, o DNA de peso molecularbaixo (ligador e DNA iniciador) é removido. Qualquer método adequado pararemover o DNA de peso molecular baixo pode ser usado, como purificação com gelde agarose ou purificação com coluna. Em configurações preferidas, a purificaçãocom coluna é usada.O DNA purificado é, então, diluído para criar uma solução diluída. Esse DNA é,então, tratado com Iigase de DNA T4 durante a noite para permitir a circularizaçãopermitindo a ligação das extremidades adesivas, criadas pelo digesto de enzimamais inicial. Digerindo e ligado em uma solução diluída (por exemplo, 0,5ml emtampão de ligação 1X), a auto-ligação intramolecular (circularização) de moléculascom extremidades adesivas compatíveis é fortemente favorecida. O DNA inicialoriginal que foi fundido e parcialmente recozido novamente 12 vezes (durante aamplificação por PCR) é muito ineficientemente digerido e circularizado. Ainda, osprodutos não especificamente amplificados que necessitam de extremidadesadequadas também serão altamente improváveis de formarem círculoscovalentemente fechados.Digestão com Exonuclease

Após o DNA ser precipitado (usando métodos comumente conhecidos na área) esuspenso novamente em um tampão adequado, como água, a mistura de ligação étratada por digestão extensiva com uma exonuclease que ataca as extremidades deDNA com filamento simples e filamento duplo (por exemplo, nuclease Bal-31). Asmoléculas circulares criadas por ligação são resistentes à digestão, mas digestãoextensiva reduzirá quaisquer moléculas lineares a nucleotídeos simples. Essadigestão é usada para, dessa forma, eliminar o DNA genômico inicial, bem comoprodutos não especificamente amplificados. Alternativamente, em vez de uma únicaexonuclease, como Bal-31, uma mistura de exonucleases poderia ser usada. Porexemplo, uma enzima ataque DNA de filamento simples (exonuclease de feijãomungo) e a outra enzima ataca o DNA de filamento duplo (exonuclease Lambda) eonde nenhuma das enzimas possui atividade de endonuclease e nem cliva o DNAde filamento duplo nos cortes.Através do termo digestão extensiva, significa que uma quantidade suficiente deenzima é usada para que não seja Iimitante e que o tempo permitido para digestãoseja longo o suficiente para não ser limitante. Por exemplo, em uma configuração, 2unidades de nuclease Bal-31 são usadas na mistura de digestão e permitidas para proceder durante 45 minutos. As unidades são definidas funcionalmente conforme aquantidade de enzima necessária para digerir 400 bases de DNA linear em umasolução de 40ng/pl em 10 minutos.Amplificação em círculo rolante isotérmica

As ligações tratadas com nuclease são, então, usadas como gabarito paraamplificação em círculo rolante isotérmica. A amplificação em círculo rolanteisotérmica é conhecida na área e é geralmente uma amplificação de um círculo deDNA circular usando iniciadores randômicos resistentes à exonuclease e umapolimerase de DNA com grande processividade. Qualquer procedimento deamplificação em círculo rolante isotérmica pode ser usado. Um kit comumenteconhecido, se disponível a partir de Amersham e é usado seguindo asrecomendações do fabricante.

Usando um método da presente invenção, os inventores foram capazes dedemonstrar amplificação específica do componente trofoblástico/fetal (portanto, DNAfetal) e amostras de DNA misto para produzir representações sensíveis à metilaçãoa partir do DNA fetal. Vide Exemplo 4.

A presente invenção também fornece um método de identificação de ampliconespecífico fetal. Vide exemplo 5 para uma explanação detalhada. Esse métodocompreende a preparação separadamente de representações sensíveis à metilaçãoa partir de DNA fetal e DNA de sangue inteiro usando o método de amplificação de DNA fetal seletivo descrito acima. Amplicon específico fetal significa que amplificaráa partir do DNA trofoblástico/fetal, mas não outro DNA1 usando os métodos descritosna presente invenção.

O DNA trofoblástico/fetal é o DNA que é hipometilado em comparação com o DNAadulto. Enzimas de restrição que são sensíveis à metilação clivarão locais fetais hipometilados e não clivarão locais maternos metilados.

As representações sensíveis à metilação do DNA fetal são marcadas com umprimeiro fluorocromo e o DNA de sangue inteiro é marcado com um segundofluorocromo, diferente do primeiro fluorocromo para produzir provas de DNA fetalmarcadas e provas de DNA de sangue inteiro marcada. As provas marcadas são deixadas para hibridizar com um arranjo de oligonucleotídeos correspondendo afragmentos de restrição previstos para uma dada enzima sensível à metilação.Alternativamente, se dois arranjos idênticos separados forem usados, as provas nãoprecisam ser marcadas com fluorocromos diferentes. O(s) arranjo(s) é(são)estudado(s) para localizar oligonucleotídeo(s) que se hibridiza(m) exclusivamente a uma prova de DNA fetal. Esses oligonucleotídeos são identificados como umamplicon específico fetal.

Em configurações preferidas, a enzima sensível à metilação usada na amplificaçãode DNA específico fetal é HpyCh4-IV.

Preferivelmente, o DNA fetal é obtido de gravidezes de primeiro trimestre deaproximadamente 56-84 dias já que há suspeita de que diferenças na metilação deDNA fetal e materno são mais acentuadas no início da gestação.A presente invenção ainda fornece um amplicon específico fetal produzido pelométodo descrito acima. A presente invenção também fornece um arranjocompreendendo um conjunto dos amplicons específicos fetais identificados usando os métodos da presente invenção.A presente invenção também fornece um método para determinar se o número decópia de um local pré-determinado de DNA fetal em uma mistura de DNA fetal ematerno é reduzido ou elevado em comparação com um número de cópia normal nolocal pré-determinado. Vide exemplo 6 para uma discussão detalhada. Esse métodocompreende a amplificação seletiva do local pré-determinado do DNA fetal naamostra de teste e em uma amostra de controle usando o método de amplificaçãode DNA fetal discutido acima. A amostra de controle tem um número de cópianormal no local pré-determinado do DNA fetal.

A quantidade relativa do DNA amplificado para um dado local na amostra de teste écomparada com a quantidade relativa de DNA amplificado para o mesmo local naamostra de controle. Uma quantidade reduzida de DNA amplificado estácorrelacionada com um número de cópia reduzido e uma quantidade elevada deDNA está correlacionada com um aumento no número de cópia.Em uma configuração preferida, a comparação inclui normalização do DNAamplificado do local pré-determinado para DNA amplificado de um local de controle,presente no mesmo número de cópia na amostra de teste e na amostra de controle.A presente invenção ainda fornece outro método para determinar em uma amostrade teste se um número de cópia para um local pré-determinado é reduzido ouelevado, em comparação com um número de cópia normal. Vide exemplo 7 parauma discussão detalhada. Esse método compreende a amplificação seletiva do DNAfetal na amostra de teste e em uma amostra de controle usando o método deamplificação seletiva de DNA fetal discutido acima. A amostra de controle tem umnúmero de cópia normal no local pré-determinado.

O DNA da amostra de teste e da amostra de controle a partir da etapa a é marcadopara fornecer provas marcadas. A marcação é realizada para fornecer um meio dedetecção de hibridização. Por exemplo, se um arranjo precisar ser usado, o DNA daamostra de teste é marcado com um primeiro fluorocromo e o DNA da amostra decontrole é marcado com um segundo fluorocromo diferente. Alternativamente, sedois arranjos idênticos separados forem usados, um para as provas de DNA de testee um para as provas de DNA de amostra, dois rótulos diferentes não sãonecessários.

Após a marcação das provas de DNA, elas são hibridizadas para um arranjo deamplicons específicos fetais conforme descrito e produzido pelos métodos dainvenção reivindicada. A quantidade de hibridização entre as provas de DNA deteste e as provas de DNA de controle é medida para determinar a potência do sinal.Um sinal forte do DNA de teste em comparação com o DNA de controlecorrelaciona-se com um aumento no número de cópia. Um sinal fraco do DNA deteste em comparação com o DNA de controle correlaciona-se com uma diminuiçãono número de cópia.

EXEMPLOS

Exemplo 1: PCR de ligador-adaptador para amplificar DNA plasmáticoA PCR mediada por Iigador foi usada para amplificar DNA derivado do plasma demulheres grávidas. Um protocolo padrão (Johnson, K.L. et ai, Clin, Chem. 50:516-21 (2004)) foi usado para purificar DNA de uma amostra de 10ml de sangue inteiroanti-coagulado (plasma materno). As amostras foram centrifugadas duas vezes pararemover as células. O plasma resultante foi passado através de uma membrana deligação de DNA. O DNA foi removido da membrana e o DNA resultante foi digeridocom HpyCh4-IV (cortes em ACGT). Ligadores foram recozidos e ligados e a PCR foirealizada usando o filamento da parte superior do par de Iigador seguindo umprotocolo padrão (Guillaud-Bataille, M., et ai, Nucleic Acids. Res. 32:e112 (2004)).Os ligadores foram discretamente modificados de maneira que eles criaram um localde Mlul quando ligados ao DNA digerido com HpuCh4-IV.

Os Iigadores foram os seguintes:

CTAG G AG CTG G C AG ATC GTAC ATTG AC G

11 Il I M 11 M 11111 Il I

GCATGTAACTGCGC

A Figura 2 mostra exemplos representativos dessas amplificações e mostra que osprodutos de PCR são facilmente detectados. Para provar que a amplificação foiespecífica e mediada por ligador, os produtos de PCR foram clonados usando umprotocolo de clonagem de TA padrão. Dez colônias randômicas foram coletadas eseqüenciadas, e em 9 de 10 casos, a seqüência mostrou que o adaptador do ligadorfoi ligado a um local genuíno de HypCH4-N em cada extremidade. Esse experimentofornece forte evidência de que a PCR de ligador-adaptador pode ser usada paraamplificar o DNA derivado do plasma.

Inspeção do painel da parte inferior da Fig. 2 mostra que os produtos de PCRmediada por ligador gerados com esse protocolo são notavelmente diferentesdependendo do uso de formaldeídeo durante a coleta de sangue materno. Apenasdois exemplos são mostrados, mas esse resultado foi consistente entre 12 amostrascoletadas de forma separada. O escalonamento observado quando o sangue écoletado na presença de formaldeídeo é fortemente recordativo de escalonamentoapoptótico, sugerindo que o formaldeídeo favorece a amplificação de fragmentosapoptóticos. Talvez a fixação de proteínas ao DNA possa resultar em DNA que nãoseja digerível com enzimas de restrição ou o escalonamento possa simplesmenterepresentar uma redução dramática na complexidade do produto de PCR.

Conseqüentemente, é preferido que as coletas de sangue materno não envolvamformaldeídeo. Essa atitude está de acordo com uma publicação recente que refuta anoção de que o formaldeídeo aumenta a proporção de DNA fetal. Chinnapapagari,S.K., et al., Clin1 Chem. 51:652-5 (2005).

Exemplo 2: Demonstração de amplificação específica de metilação de DNAtrofoblástico/fetal

Para o propósito de demonstrar metilação diferente entre o DNA trofoblástico/fetal ede sangue inteiro, a complexidade altamente reduzida resultante do uso de um corteraro, a enzima rica em AT é benéfica. Portanto, representações amplificadas deamostras de DNA trofoblástico/fetal e de sangue inteiro usando Acll forampreparadas. As amostras de DNA trofoblástico/fetal foram derivadas de gravidezesde primeiro trimestre eletivamente terminadas entre 56 e 80 dias de gestação etodos os DNAs de sangue inteiro foram preparados de voluntárias adultas normais.

Todas as amplificações foram realizadas de acordo com um protocolo publicado.Vide Guillaud-Bataille, M., et al., Nucleic Acids. Res. 32:e112 (2004).

Resumidamente, 0,5pg de DNA genômico foi digerido com Acll em excesso notampão recomendado. 25ng deste foram usados para ligar ao par deligador/adaptador. Após a ligação, 2,5ng de DNA ligado foram usados como gabaritopara PCR. Após 14 ciclos, 1/10° do volume do produto foi usado como gabarito parauma segunda etapa de PCR para 10 ciclos adicionais usando o mesmo iniciador.

Nesse momento, os produtos foram mostrados em um minigel (vide Figura 3).Consistentes com a previsão de metilação diferencial, os produtos de PCR do DNAtrofoblástico/fetal consistentemente produziram produtos de PCR mais robustos e deaparência diferente do que o DNA de sangue inteiro.

Fragmentos oscilando entre -500 e 1.OOObp foram extraídos do gel, digeridos comMlul para remover o ligador/adaptador e ligados a um vetor de clonagem digeridocom Mlul. O ligador/adaptador foi criado de maneira que a ligação a uma saliênciade Acll resulte na criação de um local de Mlul. Essas ligações foram transformadasem bactérias para produzir mini-conjuntos de fragmentos de Acll amplificados deDNAs iniciais de trofoblástico/fetal e de sangue inteiro. No momento da clonagem, representações trofoblásticas/fetais consistentemente produziram, no mínimo, duasvezes mais colônias, de modo que o melhor mini-conjunto trofoblástica/fetal continhaaproximadamente 8.000 recombinantes em comparação com aproximadamente3.000 para o melhor conjunto de sangue inteiro.

Trinta e cinco colônias randômicas de um conjunto trofoblástico/fetal foram coletadas e suas inserções seqüenciadas. A análise com o UCSC browser mostrou que todasmenos quatro seqüências corresponderam aos fragmentos de Acll previstos,menores do que 1 kg de comprimento, indicando que a digestão, a ligação ao Iigadore as etapas de amplificação ocorreram conforme previsto. Deve-se observar que oprocedimento de clonagem fortemente seleciona contra produtos de amplificação não propostos já que o local de Mlul é apenas criado quando o Iigador é ligado auma saliência de Acll.

Quando uma tentativa de clonar os produtos de PCR utilizou um procedimento declonagem de TA, a eficiência da clonagem foi fraca e uma alta porcentagem declones refletiu produtos de amplificação não-específicos. Dessa forma, foi concluído que uma porcentagem significativa da massa do DNA resultante da amplificaçãomediada por Iigador é não-específica.

Um total de 30 pares de iniciadores de PCR específicos foi criado para amplificarsub-segmentos de fragmentos de Acll amplificados. A PCR foi, então, realizadausando representações de Acll amplificadas de DNA de sangue inteiro e DNAtrofoblástico/fetal como gabarito. Para esses experimentos, representações de"segunda etapa", conforme descrito acima, foram diluídas de 1 a 10 e foram usadascomo gabarito para cada um dos conjuntos de iniciador específicos e amplificaçõesforam realizadas para 20 ciclos de um conjunto padrão de condições.Os conjuntos de iniciador que amplificaram a partir de representaçõestrofoblásticas/fetais, mas não de representações de sangue inteiro, foramadicionalmente testados através da amplificação de um conjunto de 6representações trofoblásticas/fetais e de 6 representações de sangue inteiro (videFigura 4). Destas, 10 provaram ser trofoblásticas/fetais "específicas" no sentido deque todas as 6 representações trofoblásticas/fetais produziram um produtoclaramente visível enquanto nenhuma das 6 representações de sangue inteiroproduziu um produto sob as mesmas condições. Isso corresponde a uma chance de10/30 ou 33% de que um fragmento de restrição de Acll amplificadorandomicamente escolhido seja razoavelmente consistente com a estimativa (acima)do grau ao qual o DNA trofoblástico/fetal é globalmente hipometilado.

Dos 20 conjuntos de iniciador remanescentes, 10 amplificaram igualmenterepresentações trofoblásticas/fetais e sangüíneas e outras 10 forneceram resultadosinconsistentes. Quando usados para amplificar algumas representações de AcII1 osprodutos esperados foram amplificados, enquanto em outros casos eles não foram.Esses resultados sugerem que: 1) há variação extrema na metilação em locais deAcll relevantes; 2) que alguns locais de Acll são alterados por SNPs comuns; ou 3)que a eficiência da PCR é afetada pela presença de um SNP. Na verdade, diversosexemplos, nos quais SNPs alteraram locais de Aclll bem como exemplos de SNPsque afetam a eficiência de PCR foram identificados. Esse tipo de variação deseqüência é esperado e não altera a conclusão de que uma alta porcentagem deamplicons de Acll randomicamente escolhidos são relativamente trofoblásticos/fetaisespecíficos.

Importante foi a observação de que alguns conjuntos de iniciador amplificaram fitasfortes a partir de representações trofoblásticas/fetais e fitas muito mais fracas a partirde representações de sangue inteiro. Vide as fitas fracas no 32 painel a partir daparte superior na Figura 4. Ainda, como a quantidade de ciclos de PCR foi elevadade 20 para 30, fitas visíveis foram amplificáveis a partir de representações desangue inteiro para quase todos os conjuntos de iniciador (não mostrado). Já que ameta da invenção é a amplificação específica de DNA trofoblástico/fetal quando esteé misto com outro DNA1 amplificação "vazada" de DNA não-trofoblástico/fetal éproblemática.

Em sua variação linear estreita, pode-se prever que 3-4 ciclos de PCRcorrespondem a amplificação de 10 vezes e que uma diferença de 3-4 ciclos nolimiar de detecção corresponde a uma diferença no registro na quantidade degabarito. Para detectar DNA trofoblástico/fetal quando representar 1% do DNA emuma mistura, amplificação diferencial de 6-8 ciclos de PCR seria necessária. Dos 10conjuntos de iniciador trofoblástico/fetal "específico", apenas 1 ou 2 atenderam aesses critérios estritos.

Três possíveis causas de amplificação fraca a partir de representações de sangueinteiro foram consideradas. Primeira, pequenas quantidades do DNA genômicoinicial ainda presentes na representação amplificada podem fornecer gabaritosuficiente para conseguir um produto fraco. Foi calculado que dos 2,5ng de DNAgenônico inicial, apenas alguns picogramas estavam presentes nas representaçõesdiluídas, tornando improvável que isso foi a fonte de fitas fracamente amplificadasapós 20 ciclos de PCR. Entretanto, isso poderia potencialmente explicar aamplificação após 30 ciclos. Segunda, a metilação pode ser incompleta em muitoslocais de CpG. Locais que são altamente, mas não completamente metilados dariamum aumento às representações onde o fragmento de restrição correspondenteestava presente em um nível baixo, mas detectável. Claramente, essa explanação éprovável de ser válida nos extremos. Muitos locais podem ser metilados a 99% dotempo, enquanto outros são metilados a 99,9%. Uma terceira explanação paraamplificação fraca a partir de amplicons de sangue inteiro é a amplificação não-específica durante a formação de representações conforme descrito acima. Oprocesso de desnaturação, recozimento novo e realização de extensões de iniciadorcom DNA genômico complexo contendo grandes quantidades de seqüênciarepetitiva é certo para criar grandes quantidades de produtos não propostos. Paradeterminar qual dessas três possibilidades foi a fonte da amplificação "vazada" apartir do DNA de sangue inteiro, um esquema alternativo para amplificaçãorepresentacional foi planejado.

Exemplo 3: Amplificação isotérmica de moléculas circulares após digestão comnuclease

Para superar as questões de amplificação fraca discutidas no Exemplo 2, ospresentes inventores procuraram desenvolver um método de amplificaçãoconveniente que, semelhante à clonagem, selecionaria fortemente fragmentos derestrição genuínos e contra produtos não especificamente amplificados.Para esse fim, o DNA genômico foi digerido com Acll e ligações de Iigador forampreparadas conforme descrito acima. Após 12 ciclos de amplificação com uminiciador Iigador1 produtos foram digeridos com Mlul (que se separa do ligador),removido de DNA de peso molecular baixo (ligador e iniciador) através depurificação de coluna, diluído a 0,5ml em tampão de ligação 1X (para criar umasolução diluída) e tratado com Iigase de DNA T4 durante a noite. A fundamentaçãopor trás disso é a seguinte. Os 12 ciclos iniciais de PCR criam uma representação detamanho selecionado de fragmentos de Acll1 bem como produtos não-específicos,não queridos. Através da digestão e ligação de uma solução diluída, a auto-ligaçãointra-molecular (circularização) de moléculas com extremidades adesivascompatíveis é fortemente favorecida. O DNA inicial original que foi fundido eparcialmente recozido novamente 12 vezes é muito ineficientemente digerido ecircularizado. Os produtos não especificamente amplificados que necessitam deextremidades adequadas também serão altamente improváveis de formaremcírculos covalentemente fechados.

Após precipitação, a mistura de ligação foi tratada por digestão extensiva comnuclease Bal-31, uma exonuclease que ataca as extremidades de DNA comfilamento simples e filamento duplo. As moléculas circulares criadas por ligação sãoresistentes à digestão, mas digestão extensiva reduzirá quaisquer moléculaslineares a nucleotídeos simples. Esta é prevista para eliminar o DNA genômicoinicial, bem como produtos não especificamente amplificados. As ligações tratadascom nuclease foram, então, usadas como gabarito para amplificação em círculorolante isotérmica usando um kit comercial (Amersham) seguindo as recomendaçõesdo fabricante. Isso resulta em uma amplificação de ~10.000 vezes que não envolvefusão nem recozimento novo. Dean, F.B., et ai, Genome Res. 11:1095-9 (2001). Nofinal desse procedimento, o DNA resultante foi diluído e usado como gabarito paraPCR com os conjuntos de iniciador trofoblástico/fetal "específico" descritos acima.

Essa análise produziu um total de 5 (dos 30 originais) conjuntos de iniciador para oqual foi possível claramente detectar produtos de PCR a partir de representaçãotrofoblástica/fetal em 22 ciclos enquanto até 35 ciclos com representações desangue inteiro não produziram produto visível. Exemplos de sucesso e falha sãomostrados na Figura 5. Uma diferença de 13 ciclos no limiar da detecção de PCRcorresponde a uma diferença no gabarito inicial de, no mínimo, 1000 vezes e prevêque esses amplicons devem ser facilmente detectados nas misturas de DNA onde ocomponente trofoblástico/fetal é apenas 1%.

Os presentes inventores concluíram que amplificação não-específica naamplificação mediada por Iigador convencional é uma fonte importante de"vazamento" ou histórico e que o protocolo de amplificação com nuclease/isotérmicamelhora essa situação de forma significativa. Além disso, a metilação incompletatambém provavelmente deve estar presente em muitos locais genômicos, e issoreduz a quantidade total de amplicons de metilação fortemente específicos.

Exemplo 4: A amplificação de amostras mistas trofoblásticas/fetais e de sangueinteiro

Para testar se amplificação específica do componente trofoblástico/fetal de amostrasmistas de DNA foi possível, um amplicon de Acll trofoblástico/fetal específico foiidentificado, que contém um polimorfismo de nucleotídeo simples comum ("SNP")que altera um local de Banll. Os seis DNAs de teste trofoblásticos/fetais e os seisDNAs de teste de sangue inteiro usados acima foram genotipados com relação aesse SNP e após encontrar um par de sangue inteiro/írofoblástico/fetai comgenótipos distintos nesse local, misturas de 10:1 e 20:1 de DNA genômico forampreparadas. A quantidade absoluta de DNA nessas misturas foi de 25ng,significando que o componente trofoblástico/fetal em uma mistura de 20:1 foi apenasde ~100Pg e, portanto, menor do que o componente fetal presente em uma amostrade plasma de 10ml. Representações sensíveis à metilação foram preparadasconforme descrito acima e representações diluídas foram, então, usadas comogabarito para PCR. Produtos foram analisados por digesto de restrição, bem comopor seqüencialmente direto (Figura 6).

Dentro da sensibilidade do ensaio, não houve evidência de amplificação docomponente de sangue inteiro.

Para demonstrar adicionalmente a capacidade de amplificar seletivamente o componente trofoblástico/fetal de misturas de DNA1 os presentes inventores usarampolimorfismos repetidos de seqüência simples ("SSR"). Apesar de serem maisinformativos do que os SNPs1 com heterozigosidades bem acima de 50%, os SSRstambém oferecem a possibilidade de avaliar facilmente o grau relativo deamplificação de alelos na mesma amostra da DNA através da medição da altura do pico relativo ou da área com um seqüenciador automatizado.

Para encontrar amplicons de Acll contendo SSRs potencialmente polimórficos, DNAde plasmídeo de um mini-conjunto trofoblástico/fetal (acima) foi digerido com Mlul enovos Iigadores foram ligados às extremidades do fragmento. A PCR usando uminiciador consistindo de (CA)i0, bem como um iniciador correspondendo ao filamento"da pc.rte inferior" do Iigador foi realizada. Esse método foi previsto para amplificarporções de fragmentos de Acll que contêm repetições de CA. Os produtos de PCRforam clonados e colônias randômicas foram coletadas e seqüenciadas. Dessas 15seqüências, todas corresponderam aos fragmentos de Acll previstos menores doque 1Kb de comprimento, e cinco continham uma repetição de CA longa o suficiente para ser potencialmente polimórfica. Iniciadores específicos flanqueando umarepetição de CA foram sintetizados e usados para PCR em representaçõesamplificadas e três das cinco mostraram ser trofoblásticas/fetais específicas.Dez de doze DNAs de teste mostraram ter variações heterozigóticas nocomprimento de CA para uma dessas, e um par de DNAs (trofoblástico/fetal e de sangue inteiro) com genótipos distintos foi selecionado para criar misturas de testeconsistindo de 10:1 e 20:1 de DNA de sangue inteiro e DNA trofoblástico/fetal,respectivamente.

DNA genômico misto foi, então, usado para preparar representações sensíveis àmetilação e diluições destas foram, então, usadas como gabarito para PCR cominiciadores para o polimorfismo. Os produtos de PCR de cada um dos dois DNAsiniciais, bem como aqueles amplificados das misturas de 20:1 são mostrados naFigur? 7. Claramente, a amplificação desse amplicon sensível à metilação é, nomínimo, 20 vezes mais eficiente a partir do DNA trofoblástico/fetal do que a partir doDNA de sangue inteiro. Os resultados desses experimentos provam que com osmétodos da presente invenção, amplificação preferencial de DNA trofoblástico/fetal épossível.

Exemplo 5: Análise de microarranjo para identificação de larga escala de ampliconstrofobíásticos/fetais específicos

O desenvolvimento de um conjunto de amplicons trofoblásticos/fetais específicos é aprimeira etapa em direção do teste de aneuploidia conforme descrito abaixo.

Hibridização comparativa com microarranjos de oligonucleotídeo customizados é, nomomento, uma tecnologia de rotina, comercialmente disponível que foiextensivamente usada para avaliar diferenças de número de cópia genômica. Amesma tecnologia fornece um método ideal para a identificação de larga escala deamplicons trofoblásticos/fetais específicos. Para atingir essa meta, representaçõessensíveis à metilação, preparadas separadamente de DNA trofoblástico/fetal e desangue inteiro são marcadas com diferentes fluorocromos e comparativamentehibridizadas a arranjos de oligonucleotídeos que correspondam a fragmentos derestrição previstos para uma dada enzima sensível à metilação. Em contraste com ahibridização de arranjo com relação a alterações no número de cópia, ondediferenças no nível de hibridização são extremamente sutis, aquelesoligonucleotídeos (endereços de arranjo) que hibridizam exclusivamente à provatrofoblástica/fetal são identificados, refletindo digestão 0 ou quase 0 de locais derestrição correspondentes no DNA derivado do sangue. Através da realizaçãodessas análises de microarranjo usando provas feitas de diferentes amostrastrofoblásticas/fetais múltiplas, aqueles amplicons que consistentemente mostramamplificação altamente diferencial são identificados e usados para fornecer umcatálogo de uma grande quantidade de amplicons trofoblásticos/fetais específicoslocalizados nos cromossomos alvo.

Escolha da enzima de restrição

Nos estudos descritos acima, onde a meta foi demonstrar a existência de ampliconstrofoblásticos/fetais específicos, uma enzima de corte raro que resultou emrepresentações amplificadas com complexidade extremamente reduzida foideliberadamente empregada. Para o propósito de diagnóstico pré-natal futuro,diversas centenas de amplicons trofoblásticos/fetais por cromossomo para oscromossomos alvo, 13, 18, 21 X e Y são obtidas, e, devido ao peso molecular médiobaixo do DNA derivado do plasma, o foco está nos segmentos curtos. Claramente,enzimas, como Acll1 resultam em muito poucos fragmentos para esse propósito, e,portanto, uma enzima de corte mais freqüente para análise de microarranjo é usada.

A enzima HpyCh4-IV é ideal para produzir representações para experimentos demicroarranjo. Essa enzima é a única comercialmente disponível cuja seqüência dereconhecimento (que é ACGT) atende ao critério de ter A ou T nas posiçõesdiferentes de CpG central. Em um genoma com proporções equilibradas de A, C, Ge T, deve haver 16 vezes mais locais para HpyCh4-IV do que para Acll1 e isso, porsua vez, preveria -2400 fragmentos entre 100 e 1500bp de comprimento paracromossomo número 21. Na verdade, a quantidade verdadeira de fragmentos deHpyCh4-IV de tamanho 100-1500 previstos para o cromossomo 21 é 17.152,refletindo a distribuição extremamente não-uniforme de dinucleotídeos CpG comrelação à enzima rica em AT. Se alguém criar a hipótese de que 80% dos locais sãobloqueados por metilação na DNA trofoblástico/fetal, pode-se estimar sem basecientífica que a quantidade verdadeira de fragmentos de cromossomo 21 navariação de tamanho alvo é de 2-3000. Se 15% foram trofoblásticos/fetaisespecíficos, então, 300-450 desses amplicons são previstos.

Construção do Arranjo

Tecnologia atual permite a produção de arranjos contendo ~380.000 oligosdiferentes, suficientes para permitir a avaliação de mais da metade de todos osfragmentos de HpyCh4-IV no genoma inteiro em um único experimento. Entretanto,para realizar esse tipo de análise em 10 pares de amostra, seria necessário ummínimo de 20 desses arranjos e, portanto, seria excessivamente caro. Como umaalternativa para diminuir o custo, um formato de arranjo no qual 4 arranjos idênticossão fornecidos, cada um consistindo de ~98.000 oligos cada, são sintetizados nomesmo "chip". Um "chip" único desse tipo permite 4 hibridizações, que é suficientepara 2 hibridizações em duplicata, de reversão de cor. 98.000 oligos fornecemespaço suficiente para pesquisar -12.000 fragmentos em cada um dos 4cromossomos relevantes (13, 18, 21 e X) com cada oligo em duplicata. 12.000 ésuficiente para representar a maioria de fragmentos de 100-1500bp localizados nocromossomo 21, e, por sua vez, espera-se que produza diversas centenas deamplicons trofoblásticos/fetais específicos por cromossomo. Devido a todos ossegmentos Y serem fetais específicos, apenas 1000 segmentos Y sãorepresentados nos arranjos. É previsto que produza ~200 amplicons de cromossomoY, que deve ser mais do que suficiente.Oligonucleotídeos

Um banco de dados contendo a seqüência de todos os ~17.000 fragmentos deHpyCh4-IV previstos no cromossomo 21, 18, 13, XeY entre 100 e 1500bp no comprimento é preparado. Esses arquivos são, então, usados para criação de provae síntese de arranjo. Devido ao peso molecular baixo do DNA plasmático, aquantidade máxima possível de fragmentos curtos será representada nos arranjos.Já que aproximadamente 50% dos fragmentos menores do que 400bp não terãoseqüência adequada para criação de oligonucleotídeo, isso deixará aproximadamente 2.500 para serem representados no arranjo. Todos os arranjostambém contêm uma série de oligonucleotídeos de controle negativo.

Amostras trofoblásticas/fetais

Conforme discutido acima, DNA trofoblástico/fetal de primeiro trimestre é usadodevido a duas considerações: 1) as diferenças na metilação entre DNA trofoblástico/fetal e outro DNA são mais acentuadas na gestação inicial; e 2) ummétodo diagnóstico no primeiro trimestre é desejável. Usando a mesma lógica,hibridizações de microarranjo usando representações amplificadas a partir de DNAtrofoblástico/fetal derivado de gravidezes de 56-84 dias são realizadas. Essasamostras podem ser coletadas de gravidezes eletivamente terminadas e o DNA serápreparado por digestão com proteinase K de rotina seguida por extração defenol/clorofórmio.

Amostras não-trofoblásticas/fetais

amostras femininas randomicamente escolhidas são reunidas em vez de tentarescolher amostras de DNA de sangue inteiro individuais adequadas. Através dareunião de DNA derivado do sangue, uma única representação com um perfil médiode metilação é produzida.

Presume-se que o DNA materno contido em amostras obtidas do cérvix é derivadodo epitélio cervical e é, dessa forma, semelhante ao DNA derivado dos fibroblastoscutâneos. Não há estudos sistemáticos comparando a metilação no DNA derivadodo sangue e da pele, mas não há razão para acreditar que eles sejam diferentes aesse respeito. No passado, experimentos de mapeamento genético foram realizadosnos quais análise com Southern blots com digestos sensíveis à metilação foramhibridizados para mais de 20 provas diferentes e nenhuma diferença entre o DNA dosangue e de fibroblasto nunca foi observada.Síntese de Prova

O protocolo de amplificação com nuclease/em círculo rolante descrito acima é usadopara preparar representações sensíveis à metilação de DNAs trofoblásticos/fetais enão-trofoblásticos/fetais. 0,5pg de cada DNA genômico é digerido com HpyCh4-IVem excesso. 25ng desse digesto são ligados ao par de Iigador e 1/102 da ligação éusado para realizar a PCR durante 12 ciclos. Nos exemplos acima, usando digestosde Acll1 ligação legítima do ligador à extremidade do fragmento produziu um local deMlul (ACGCGT) e o mesmo resultado é obtido ao usar HpyCh4-IV que cliva após o Adeixar o CGT. Após 12 ciclos de PCR, os produtos resultantes são digeridos comMlul e circularizados conforme acima. Após a ligação, DNA linear remanescente édigerido com nuclease Bal-31 e após a troca de tampão com uma coluna SephadexG50, amplificação em círculo rolante isotérmica é realizada usando um kitcomercialmente disponível (Amersham Bioscience). Nesse momento, o DNA éverificado em um minigel para determinar se produtos adequados estão presentes.O rendimento do DNA usando esse protocolo está rotineiramente entre 3 e 5pg, maspor causa de apenas uma porção do produto de PCR circularizado ser usada paraamplificação, pode facilmente ser escalonada para quantidades maiores. Apósdeterminar a quantidade por fluorometria e a qualidade usando produtos digeridoscom Mlul em um minigel, o DNA é fornecido para um fabricante de arranjo, comoNimbleGen, para marcação de prova e hibridização de arranjo.

Interpretação dos dados do microarranjo

O processamento dos dados brutos é uma primeira etapa importante. Para cadaendereço de arranjo, a intensidade do sinal (com relação ao oligos de controle) éavaliada. Nódoas que provam não ser confiáveis são excluídas da análise. Paracada endereço de arranjo com um sinal adequado, a razão de intensidade dos doissinais (Cy3 e Cy5) é determinada. Por causa das razões transformadas em logterem propriedades estatísticas melhores do que razões simples, tudo serátransformado em log (base 2). Dados de arranjo são normalizados subtraindo-se arazão log2 média de um arranjo inteiro de cada valor individual do arranjo. Já quecada oligo está presente na duplicata, são calculadas as médias das razõesnormalizadas de endereços de duplicata e são calculadas médias desses meios coma razão média de reversão de cor correspondente do mesmo endereço de duplicata.

Dessa forma, o valor final para cada segmento é baseado em quatro hibridizações esuas razões médias de Iog2 correspondentes. Essa análise é facilmente realizadacom pacotes de software existentes.

A localização desses amplicons que estão presentes nas representaçõestrofoblásticas/fetais, mas são ausentes ou quase ausentes nas representações desangue inteiro é muito diferente do que nos experimentos de comparação genômicatípica, onde há a busca por diferenças sutis nas razões de hibridização emendereços de arranjo genomicamente contíguos. Dados de Lucito et ai, GenomeRes. 13;2291-305 (2003) fornecem um exemplo de como os dados provavelmenteaparecerão. Vide a Figura 8. Esses autores realizaram hibridizações comparativaspara arranjos em slide de vidro de 10.000 oligonucleotídeos que corresponderam afragmentos de BgIII. Uma prova de hibridização consistiu de uma representação"completa" de Bglll de DNA genômico e a outra consistiu de uma representaçãosemelhante, com exceção de que o DNA também foi digerido com Hindlll,amplamente eliminando todos os fragmentos com um local de Hindlll interno. Issocria uma situação semelhante à presente invenção, onde uma representaçãocontém elementos que são essencialmente faltantes a partir de outra representação.Assim como é evidente na figura, os sinais da razão média de Iogi0 variam de 0 a muito mais de 1, refletindo uma diferença > 10 vezes na intensidade para muitossegmentos. Os resultados dos arranjos da presente invenção serão semelhantesàqueles, mas, devido ao fato de o método de amplificação de prova criar muitomenos amplificação não-específica do que aquele usado por esses autores, éprovável que uma porcentagem maior de endereços com razões média de Iogi0 maiores do que 1 será observada.

Aqueles endereços com uma razão média de 10 vezes ou maior são consideradoscomo sendo "trofoblásticos/fetais específicos". Claramente, aqueles endereços comas mais altas razões médias são os mais desejáveis. A análise de cada hibridizaçãoproduz uma lista de endereços de prova com sinais que atendem a esse critério e uma comparação pareada das 10 hibridizações planejadas fornece uma lista finaldesses endereços que são consistentes entre as amostras, fornecendo o catálogodesejado de amplicons de HpyCh4-IV trofoblásticos/fetais específicos para os cincocromossomos relevantes.

Exemplo 6: Amplificação de polimorfismos fetais específicos do DNA plasmático ecervical maternoA amplificação de polimorfismos fetais também é um possível setor para teste deaneuploidia não-invasiva. QF-PCR de polimorfismos de STR mostrou ser altamentebem-sucedido para o diagnóstico rápido de aneuploidia em diagnóstico pré-natalconvencional (Nicolini et ai, Hum. Reprod. Update 10:541-48 (2004)) e pode seradaptado para uso com representação sensível à metilação. Portanto, polimorfismosúteis localizados nos amplicons específicos à metilação definidos no Exemplo 5 sãoidentificados e alelos fetais desses polimorfismos nas amostras de DNA cervical eplasmático são detectados.

Descoberta dos polimorfismos úteis

Para os propósitos de mapeamento genético, SNPs se tornaram o tipo mais útil emais rico. Embora milhões de SNPs estejam em bancos de dados de domíniopúblico e métodos de ensaio para SNPs abundantes, seu uso para a detecção deaneuploidia apresenta um desafio maior do que polimorfismos de STR. Não apenaseles são menos polimórficos, mas métodos para usá-los para teste de aneuploidia(Pont-Kingdon, G. et ai, Clin. Chem 49: 1087-94(2003)) depende da amplificaçãoigual de alelos que pode não ser realista no contexto de representações sensíveis àmetilação. Tendo isso em mente, STRs úteis localizados nos amplicons específicosà metilação são identificados.

Para demonstrar a viabilidade de localização de STRs localizados nos ampliconsespecíficos à metilação, o cromossomo 21 foi pesquisado com relação a fragmentosde HypCh4-IV que contêm usos potencialmente polimórficos de seqüência simples.

Dos ~ 17.000 fragmentos previstos, quase 400 contêm STRs que provavelmentedevem ser polimórficos. Vide Tabela 1.

Tabela 1: Polimorfismos de Cromossomo 21 Potencial

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Os arranjos descritos no Exemplo 5 acima contêm oligos correspondentes aomáximo possível destes, dessa forma, aumentando as chances de que locaispotencialmente polimórficos serão encontrados nos amplicons específicos àmetilação. Dado que aproximadamente 15% dos fragmentos devam provavelmenteser altamente específicos à metilação, até 60 amplicons trofoblásticos/fetaisespecíficos potencialmente polimórficos no cromossomo 21 são identificados.Devido ao fato de eles geralmente produzirem produtos de PCR mais facilmenteinterpretados, repetições de tri e tetra nucleotídeo são usadas. Um par de iniciadorflanqueando o polimorfismo alvo é designado. Um dos dois iniciadores é marcadocom um fluorocromo para análise de comprimento de fragmento fácil em umseqüenciador automatizado e a PCR é realizada em 10 amostras de DNAgenômicos randômicas. Marcadores com uma heterozigosidade razoável sãorevelados dessa maneira, e candidatos promissores são ainda testados.

Testes de amplificação nas amostras mistas de DNA

Amostras de DNA trofoblástico/fetal e de sangue inteiro existentes são genotipadoscom relação aos polimorfismos identificados acima e pares de amostra mistos comgenótipos distintos são preparados. Dados indicam que a detecção dos genótipostrofoblásticos/fetais nas misturas onde o componente trofoblástico/fetal é de 5% doDNA inicial total é viável, dessa forma, misturas de 20:1 são primeiramente testadas,seguidas pela análise deteste com razões de 50:1 e 100:1.

Teste de amplificação fetal específica

Polimorfismos identificados que funcionam bem nos testes acima são usados paratestar se alelos fetais podem ser amplificados a partir de amostras maternas. Paraesse propósito, amostras de DNA materno e fetal são obtidos para cada amostra delavagem plasmática e/ou cervical materna. Para amostras plasmáticas de gravidezesem andamento, O DNA fetal é obtido da espécime de CVS e para amostras delavagem, é obtido da espécime de terminação. Para aqueles casos onde há umaamostra de sangue materno, mas não amostra fetal direta, a disponibilidade de umaamostra paterna permitirá a identificação de alelos fetais específicos. As amostrasmaternas e fetais (ou paternas) são genotipadas com relação a esses polimorfismosusando PCR fluorescente. Com 5-10 locais de um lado, é provável que um ou maislocais serão informativos com relação a quase todas as gravidezes. Amostras quesão previstas para permitirem a identificação inequívoca de alelos fetais sãoselecionadas.

Como amostras adequadas são identificadas, representações sensíveis à metilaçãodas amostras fetais/maternas mistas (ou cervicais ou plasmáticas) são preparadasconforme descrito acima. Devido ao fato da seleção de tamanho do DNA plasmáticoparecer enriquecer significativamente o DNA fetal (Li et al., Clin. Chem. 50:1002-11(2004)), a seleção de tamanho é conforme segue. Após a digestão inicial, ligaçãocom Iigador e amplificação de 12 ciclos, os produtos de PCR são carregados em umminigel de agarose a 2%. Uma fatia do gel contendo fragmentos entre 100 e 400 éextraída e usada para a etapa subseqüente da digestão com Mlull circularização eamplificação isotérmica. Esse protocolo atinge as mesmas vantagens que a seleçãode tamanho do DNA diretamente. Para amostras de lavagem cervical (obtidas deacordo com o protocolo acima) da célula inteira, pellet obtido da espécime delavagem é preparado, e usado para amplificação sensível à metilação.Os produtos amplificados são usados como gabarito para amplificação depolimorfismos informativos e a análise de fragmento revela se os alelos fetaisespecíficos podem ser amplificados.Teste de aneuploidia

Amostras de gravidezes com uma alta suspeita de trissomia 21 são obtidas conforme elas se tornam disponíveis. Representações amplificadas sensíveis àmetilação são preparadas conforme descrito acima a partir dessas amostras. Omesmo procedimento de seleção de tamanho, conforme discutido, é usado. Apósdeterminar o genótipo fetal verdadeiro com relação ao painel de marcadores decromossomo 21 trofoblástico/fetal específico (usando DNA do CVS ou da terminação), o mesmo conjunto de PCRs nas representações amplificadas é usado.Exemplo 7: Uso de representação específica à metilação para hibridização degenoma comparativa de microarranjo ("CGH")Considerações gerais

A hibridização comparativa de arranjos de oligonucleotídeo é capaz de detectar deleções genômicas pequenas e duplicações (Sebat et al. 2004; Jobanputra et al.2005; Selzer et al. 2005). A detecção de deleções citogenicamente visíveis eaneuploidia de cromossomo inteiro é comparativamente simples com essa técnica.Historicamente, um fator chave no sucesso dessa técnica é o fato de querepresentações amplificadas reduzem a complexidade da prova, tornando a proporção que é realmente homóloga aos oligonucleotídeos alvo muito maior. Maisrecentemente, melhorias nas técnicas de marcação da prova tornaram possível usardiretamente provas genômicas inteiras, marcadas nos microarranjos deoligonucleotídeo. Diversos grupos relataram o uso dessa técnica para detectarpequenas alterações, simples de número de cópia, provando que provas altamente complexas são rotineiramente bem-sucedidas (Brennan et al. 2004; Selzer et al.2005; Hinds et al. 2006). Dessa forma, a hibridização comparativa derepresentações específicas à metilação para arranjos de oligonucleotídeos quecorrespondem a amplicons trofoblásticos/fetais específicos podem ser usada paradetectar aneuploidia fetal.

Nesse esquema, representações sensíveis à metilação são preparadas de amostrasde DNA de amostras plasmáticas ou cervicais de mulheres grávidas conformedescrito acima. As representações amplificadas de dois indivíduos diferentes, um decontrole normal e o outro de cariótipo desconhecido, são, então, usadas comoprovas de hibridização comparativa ao conjunto de alvos de oligonucleotídeotrofoblástico/fetal específico definidos no Exemplo 5. Se as duas gravidezes tiveremcariótipos normais (e são do mesmo sexo), então, sinais de hibridizaçãosemelhantemente equilibrados são esperados para todos os 5 cromossomosrepresentados no arranjo. Se uma das duas gravidezes tiver uma aneuploidia decromossomo inteiro (por exemplo, trissomia 21), então, o conjunto de oligorepresentando esse cromossomo seria esperado mostrar um desequilíbrio relativogeral de sinal de dois fluorocromos quando comparado com os outros 4cromossomos. O sexo fetal seria refletido pelas razões médias de sinais dosconjuntos de prova de cromossomo do sexo. O grau de desequilíbrio de sinal paraqualquer dado endereço no arranjo não precisa ser amplo, desde que os dados detodos ~100 endereços representando esse cromossomo sejam considerados emconjunto.

O principal parâmetro de determinação do sucesso desse esquema é o grau ao qualos amplicons trofoblásticos/fetais específicos são representados na prova dehibridização. Claramente, se alguém tiver iniciado com DNA fetal puro, a detecçãode aneuploidia com essa técnica seria trivial. De forma semelhante, se alguém tiveriniciado uma mistura igual de DNA fetal e materno, a representação sensível àmetilação de seqüência trofoblástica/fetal seria muito além de 50% da massa daprova e a detecção de aneuploidia seria esperada para funcionar apenas se alguémtivesse iniciado com DNA fetal puro. A facilidade com a qual esse esquema é bem-sucedido, claramente diminui conforme a proporção de DNA trofoblástico/fetaldiminui. Com isso em mente, uma situação onde o DNA inicial é 1%trofoblástico/fetal e 99% materno é considerada e discutida abaixa.A amplificação sensível à metilação em uma mistura de 99:1 terão 2 conseqüênciasimportantes. Primeira, a complexidade da seqüência geral será reduzida em ~98%(vide abaixo); e segunda, fragmentos trofoblásticos/fetais específicos estarãopresentes. Em termos de massa de DNA, o componente trofoblástico/fetal derivado(específico e não-específico) ainda será de aproximadamente 1,5 - 2% do total. Àmedida que o DNA trofoblástico/fetal é hipometilado, sua eficiência de amplificação eproporção é elevada, mas esse efeito é pequeno, já que os dados indicam que nãomais do que 30% dos fragmentos na representação trofoblástica/fetal sãotrofoblásticos/fetais específicos. Uma prova de hibridização que representa apenas-2% da massa total do DNA na mistura da prova pode fornecer um sinal confiável?Isso depende da complexidade geral da mistura da prova. Para calcular acomplexidade aproximada das provas que são produzidas pelo nosso procedimento sensível à metilação, foi considerado que o cromossomo 21, que consiste de ~49Mbde DNA1 contém -17.000 fragmentos de HpyCh4-IV de tamanho 100-1500bp. Ametilação bloqueará a amplificação de 80-90% destes, criando uma quantidade totalde fragmentos amplificados de -1.700 - 3.400. Já que o tamanho médio destes é~500bp, a complexidade amplificada total é de aproximadamente 0,85-1,7 X 106 ouaproximadamente 1,5-3% da seqüência inicial total. Isso corresponde a umaredução aproximada de 97-98% na complexidade, em comparação com DNAgenômico. Uma prova de hibridização produzida a partir de amostra de DNA quecontinha 1% de DNA trofoblástico/fetal seria esperada ter apenas ~2% de suamassa derivada do componente trofoblástico/fetal, mas, devido ao fato de acomplexidade geral ser reduzida em 98%, a concentração eficaz da provatrofoblástica/fetal específica é semelhante à concentração de qualquer dadosegmento em uma prova de genoma inteiro. Portanto, prevê-se que provasderivadas de representações amplificadas específicas à metilação de DNA que era,no mínimo, 1% derivado de componente trofoblástico/fetal devem fornecer sinais de hibridização iguais ou melhores do que aqueles das provas de genoma inteiro.Obviamente, proporções iniciais maiores de DNA trofoblástico/fetal forneceriamsinais proporcionalmente mais fortes.

Desenho Experimental

Arranjos

O Exemplo 5 discute provas de oligonucleotídeos de amplicons trofoblásticos/fetaisespecíficos dos 5 cromossomos relevantes. Conforme declarado acima, estimou-seque a quantidade desses amplicons será de aproximadamente 200 por cromossomoou aproximadamente 1.000 no total. Qualquer arranjo poderia ser usado. Porexemplo, um arranjo onde oligos convencionalmente sintetizados são imobilizadosnos slides de vidro pode ser usado. Diversos procedimentos para produção dearranjos de oligonucleotídeo nos slides de vidro foram descritos. (Guo et al. NucleicAcids Res 22:5456-65 (1994); Zammatteo et al. Anal Biochem 280:143-50 (2000);Kimura et al. Nucleic Acids Res 32:e68 (2004)). As seqüências de oligonucleotídeocorrespondendo a ~1.000 oligos específicos ao componente trofoblástico/fetalantecipado, conforme determinado no Exemplo 5, e oligos convencionalmentesintetizados para ~500 destes (~100 por cromossomo) são obtidos. Arranjos dessesoligos são produzidos seguindo protocolos existentes. Todos os oligos sãomarcados em duplicata, e oligos não-homólogos com Tm previsto semelhante sãomarcados como controles negativos. Como controles positivos de hibridização, -10amplicons por cromossomo que consistentemente se hibridizaram de forma igualpara provas derivadas de componente trofoblástico/fetal e de sangue periférico (doExemplo 5) também são incluídos. Aqueles oligos que não funcionam bem nashibridizações de teste descrito abaixo são removidos do arranjo e substituídos poroutros que possam funcionar melhor.

Provas de hibridização para avaliação de arranjos

Inicialmente determinou-se se os sinais de hibridização específica ao componentetrofoblástico/fetal confiáveis podem ser obtidos através de hibridização comparativaconforme previsto acima. Tentativas iniciais na hibridização com esses arranjosutilizam misturas "artificiais" de DNA trofoblástico/fetal e de sangue inteirocitogeneticamente normal em vez de amostras maternas reais. Inicialmente, 3dessas misturas (A, B e C) são preparadas de 3 pares de DNAtrofoblástico/fetal/sangüíneo separados e em todos os 3, uma razão de 1:1 dos 2DNAs será usada. Em cada um dos 3, o DNA de sangue inteiro é de uma mulherenquanto os dois das amostras trofoblásticas/fetais são de homem e o terceiro é demulher. Representações específicas à metilação são, então, preparadas seguindo omesmo protocolo conforme acima. Após linearização e determinação do tamanho eda concentração médios, a marcação da prova seguirá protocolos existentes.(Ushijima et al. Proc Natl Acad Sci USA 94:2284-9 (1997); Brennan et al. CâncerRes. 64:4744-8 (2004)). A chave para isso é o uso de iniciadores randômicosdiretamente marcados, bem como dNTPs marcados durante a extensão de Klenow.Todas as três misturas (A, B e C) serão marcadas com Cy3 e Cy5 em reaçõesseparadas (6 provas no total) de maneira que cada mistura possa sercomparativamente hibridizada a si mesma, bem como às outras.Provas feitas de misturas de 1:1 devem resultar em sinais de hibridização muitointensos e conforme a proporção de DNA trofoblástico/fetal diminui, a intensidade dosinal diminuirá de forma correspondente. Ao realizar hibridizações comparativas dos6 pares possíveis que surgem de 3 misturas trofoblásticas/fetais/de sangue inteiro(AA1 AB1 AC, BB, BC e CC), dados importantes sobre a confiabilidade e areprodutibilidade da técnica são produzidos.Análise de Dados

Assim como no exemplo 5, dados brutos do arranjo são avaliados com relação àqualidade através da determinação da potência de sinal com relação a controlespositivos e negativos de hibridização, bem como consistência de réplica e nódoasnão-confiáveis são excluídas. Para cada hibridização, a razão média de sinal,associada com cada endereço do arranjo, é determinada. Razões sãotransformadas em log2 e normalizadas através da subtração do valor da razãomediana de Iog do arranjo inteiro de cada valor individual do arranjo. Cada razãomédia é baseada em quatro hibridizações já que cada oligo é marcado em duplicatae cada hibridização é realizada duas vezes, com reversão de cor. Razões de Iognormalizadas para os 3 autossomos são centralizadas ao redor de 0 para todasessas comparações já que elas são todas citogeneticamente normais. A análisepadrão das técnicas de variância ("ANOVA") é aplicada para obter uma estimativapreliminar do grau de variação observado entre hibridizações realizadas comamostras citogeneticamente normais. A razão do sinal dos cromossomos sexuaisdeve ser óbvia a partir dessa técnica. Todas as três possibilidades de homem comhomem, mulher com homem e mulher com mulher são testadas. Assim como emtodas as situações, quando XX for comparativamente hibridizado a XY, deve haverum sinal derivado de X de -2:1 em uma cor e uma razão obviamente muitodiscrepante de sinal Y na outra cor.

Após uma razão de 1:1 de DNA trofoblástico/fetal e de sangue inteiro resultar emhibridizações confiáveis, o mesmo conjunto de hibridizações de controle usando osmesmos DNAs, mas com razão de 10:1 de componente de sangueinteiro:trofoblástico/fetal é realizado. De forma semelhante, o exercício inteirousando misturas de 50:1 é realizado. Esse exercício é importante para determinaraproporção inicial de DNA fetal que uma amostra deve conter para ser analisada deforma bem-sucedida por essa técnica. Se uma razão de 50:1 de DNA de sangueinteiro para trofoblástico/fetal for útil nesse contexto, então, deve ser possível usaramostras plasmáticas e/ou cervicais maternas como o material inicial pararepresentações amplificadas.

Detecção de aneuploidia

Os dados derivados dos experimentos acima permitem a detecção de aneuploidiausando amplificação específica à metilação. Para esse fim, misturas "artificiais" deDNA de sangue inteiro normal e DNA trofoblástico/fetal de trissomia 21 em razõesde 10:1 e 50:1 são preparadas. Essas misturas são usadas para criar provas de hibridização específica à metilação com Cy3 e Cy5 e estes são comparativamentehibridizados a eles mesmos, bem como para as 3 misturas citogeneticamentenormais descritas acima. Em uma hibridização comparativa de uma mistura detrissomia 21 com ela mesma, a razão média do cromossomo 21 é semelhante àsrazões médias para os outros 2 autossomos já que cada prova tem 3 cópias docromossomo 21. Quando uma mistura de trissomia 21 é comparativamentehibridizada a uma mistura normal, a razão média de cromossomo 21 ésignificativamente diferente dos outros autossomos, refletindo três cópias docromossomo 21 em uma amostra e 2 em outra.

Para formalizar essa análise, as razões médias de Iog2 entre todos os 3cromossomos é comparada usando ANOVA. Isso fornece a capacidade de testar ahipótese nula global de que as razões médias de Iog de todos os cromossomos sãoas mesmas e rejeitando a hipótese nula implicaria que, no mínimo, um cromossomotem um desequilíbrio. Realizando comparações em par entre as razões médias delog2 dos dados de cromossomos individuais com aquela dos outros cromossomos, épossível determinar qual cromossomo está fornecendo um sinal desequilibrado.Devido ao fato de que 3 hipóteses adicionais serão testadas, uma correção deBonferroni é aplicada. Dessa forma, a hipótese nula global será testada em um nívelde 0,05 e, se rejeitada, as hipóteses de par específicas ao cromossomo seriamtestadas no nível de 0,015.Com aproximadamente 100 endereços de arranjo por cromossomo, há um podermuito alto para detectar aneuploidia. Teoricamente, deseja-se detectar qualqueraumento no número de cópia que corresponde a uma razão média de 1,5 (0,58 naescala de Iog2). Experiência, entretanto, mostrou que aumentos no número de cópiade 3:2 (como na trissomia) podem corresponder a razões observadas tão baixasquanto 1,15 (0,2 na escala de log2) devido ao ruído nos dados. A análise de poderindica que para uma dada comparação em par, haverá um poder maior do que~99,99% para detectar um aumento no número de cópia de 0,2 (escala de Iog2) sealguém presumir que o desvio padrão de razões médias de sinal de log2 varie de 0,1a 0,2 (valores típicos) e assumindo uma taxa de erro de tipo 1 de 0,01. Mesmo comum desvio padrão de 0,4, que representaria uma hibridização com muito ruído e debaixa qualidade, o poder de detecção de aneuploidia é de 97%.Teste de amostras maternas reais

Os dados de todas as hibridizações descritas acima comparando misturas de DNAnormais conhecidas e de trissomia conhecidas permitem a determinação daproporção de DNA fetal que é necessária para obter hibridizações confiáveis e,assim, determinação da trissomia. Por todas as razões citadas acima, acredita-seque mesmo proporções baixas de DNA fetal (2-5%) serão bem-sucedidas.

Conseqüentemente, assim como no exemplo 6, a análise com DNA derivado delavagem plasmática e cervical é realizada, já que cada tipo de amostra tem suaspotências e fraquezas. A coleta de amostra de gravidezes em andamento (amostrassangüíneas normais), bem como de casos de terminação eletiva, é realizada comono exemplo 6. De forma semelhante, a preparação de representações amplificadastambém é idêntica. Na verdade, as mesmas representações amplificadas podem serusadas para o exemplo 6, bem como para este exemplo.

A hibridização comparativa é realizada com pares de amostras com carótipos fetaisnormais, conforme determinado por análise citogenética de rotina ou por QF-PCR.

Assim como uma maneira prática, quatro dessas amostras de gravidezes, bem comodois controles de não-gravidez no grupo de DNA plasmático, bem como no grupo delavagem cervical são usadas, dando um total de 12 amostras. A comparação em parresulta em 15 análises para cada grupo. A quantidade real de hibridizações é 30, jáque cada uma é realizada com reversão de pigmento. A análise dos dados dessashibridizações é realizada conforme descrito acima, e esta fornece diversasinformações críticas: a capacidade de obter de forma confiável sinais que estejamacima da base; a faixa da variação normal que é esperada na intensidade do sinal; ese comparações de razões médias de Iog entre cromossomos adequadamentecentralizados ao redor de 0 para amostras citogeneticamente normais.Sinais de hibridização fetal confiáveis podem ser obtidos de representaçõesamplificadas sensíveis à metilação de amostras maternas e podem, então, serusados para detectar aneuploidia. Conforme discutido acima, esse esforço começacom trissomia 21 já que isso é o mais relevante e o mais disponível. Provas sãopreparadas a partir de amostras cervicais e plasmáticas obtidas de pacientes quetiveram gravidezes com trissomia 21 documentadas. Estas são comparativamentehibridizadas uma com a outra, bem como com provas preparadas de casos normais.A análise estatística procede exatamente como nos experimentos descritos acima.Devido ao fato de a hibridização confiável ser obtida, o poder para detectaraneuploidia é extremamente alto.

Além das possibilidades diagnosticas pré-natais, os métodos da presente invençãopodem ser usados para compreender mais a biologia. Por exemplo, a análise demicroarranjo do tipo discutido no exemplo 5 pode ser usada para examinar adependência da idade gestacional de metilação trofoblástica/fetal. Observaçõespreliminares sugerem que há amplas alterações na metilação conforme a gravidezprogride, mas não há compreensão de qual papel essas alterações podem ter naexpressão ou na função genéticas placentárias. De forma semelhante, não houveinvestigações sobre o papel da metilação placentária na doença. Além dessa metautilitária mencionada nesse pedido, o desenvolvimento de um método para aavaliação ampla de diferenças de metilação entre DNA trofoblásto/fetal e somáticoderivado de outras fontes é provável que tenha muitas aplicações biológicasinteressantes. Por exemplo, uma pessoa poderia procurar alterações globais nametilação trofoblástica/fetal nos estados da doença, como pré-clampsia, restrição decrescimento fetal intra-uterino, gravidez molar e outros. Em uso a longo prazo, acombinação de amplificação sensível à metilação e hibridização de microarranjopermitirá a avaliação sistemática da metilação placentária nos estados de doença,como falha da gravidez antecipada, restrição de crescimento intra-uterino, pré-clampsia e outros.

Claims (15)

1. "Método para amplificação seletiva de DNA fetal de uma amostra mista deDNA fetal e maternal", caracterizado por compreender:a) o isolamento do DNA de uma amostra mista de DNA fetal/maternal;b) a digestão do DNA com uma enzima específica de metilação;c) a ligação do DNA digerido com um conector;d) a sujeição do DNA digerido à amplificação mediada por conector PCR paraobter produtos PCR amplificados;e) a remoção do conector e do DNA base dos produtos da amplificação;f) a circularização dos produtos PCR amplificados;g) a sujeição dos produtos PCR amplificados circularizados à digestãoexonucleásica para reduzir qualquer DNA não-circularizado a nucleotídeosúnicos; eh) a sujeição dos produtos do passo g) para uma amplificação isotérmica circulargiratória para amplificar seletivamente o DNA fetal para produzirrepresentações sensíveis à metilação do DNA fetal.

2. "Método para amplificação seletiva de DNA fetal de uma amostra mista deDNA fetal e maternal", da reivindicação 1, caracterizado pela enzima específicade metilação ser HpyChlV-4, Clslj Acll ou BstBI.

3. "Método para amplificação seletiva de DNA fetal de uma amostra mista deDNA fetal e maternal", da reivindicação 1, caracterizado pela amplificaçãomediada por conector PCR ser realizada por 12 ciclos.

4. "Método para amplificação seletiva de DNA fetal de uma amostra mista deDNA fetal e maternal", da reivindicação 1, caracterizado pela digestãoexonucleásica ocorrer com Bal-31.

5. "Método de identificação de amplicon fetal específico", caracterizado porcompreender:a) a preparação separada de representações sensíveis à metilação do DNA fetale do DNA de sangue total utilizando o método da reivindicação 1;b) a rotulação do DNA fetal e do DNA de sangue total para produzir sondas deDNA fetal rotulado e sondas de DNA de sangue total rotulado;c) a hibridização das sondas de DNA rotulado em dois arranjos idênticos deoligonucleotídeos, onde ditos arranjos de nucleotídeos correspondem afragmentos previsíveis de restrição para uma dada enzima sensível àmetilação;d) a comparação de dois arranjos com eles mesmos para localizar umoligonucleotídeo que hibridize exclusivamente para uma sonda de DNA fetal;e) a identificação do oligonucleotídeo hibridizado do passo d) como umamplicon fetal específico;

6. "Método de identificação de amplicon fetal específico", da reivindicação 5,caracterizado pela sonda de DNA fetal e a sonda do DNA de sangue total seremrotuladas com dois rótulos diferentes e pela hibridização das sondas rotuladas serempara um arranjo.

7. "Método de identificação de amplicon fetal específico", da reivindicação 5, caracterizado pela enzima sensível à metilação utilizada no passo a) ser HpyCh4-IV.

8. "Método de identificação de amplicon fetal específico", da reivindicação 5,caracterizado pelo DNA fetal ser obtido de gravidezes de primeiro trimestre.

9. "Método de identificação de amplicon fetal específico", da reivindicação 8, caracterizado pelo DNA fetal ser obtido de gravidezes em torno de 56-84 dias.

10. "Banco de dados de amplicons", caracterizado por ser produzido pelométodo da reivindicação 5.

11. "Arranjo", caracterizado por compreender o banco de dados de ampliconsfetais específicos da reivindicação 10.

12. "Método para determinar se o número cópia para um lócus predeterminadode DNA fetal em uma mistura de DNA fetal e maternal é reduzido ou aumentadoquando comparado a um número cópia normal no lócus predeterminado",caracterizado por compreender:a) a amplificação seletiva do lócus predeterminado do DNA fetal na amostra-teste e em uma amostra-controle utilizando o método da reivindicação 1, ondedita amostra-controle possui um número cópia normal no lócuspredeterminado do DNA fetal;b) a comparação da quantidade de DNA amplificado na amostra-teste com aquantidade de DNA amplificado na amostra-controle; ec) a correlação da quantidade reduzida de DNA amplificado com o número cópiareduzido ou uma quantidade aumentada de DNA amplificado com o númerocópia aumentado.

13. "Método para determinar se o número cópia para um lócus predeterminadode DNA fetal em uma mistura de DNA fetal e maternal é reduzido ou aumentadoquando comparado a um número cópia normal no lócus predeterminado", dareivindicação 12, caracterizado pela comparação incluir a normalização do DNAamplificado do lócus predeterminado para o DNA amplificado de um lócus-controlepresente no mesmo número cópia na amostra-teste e na amostra-controle.

14. "Método para determinar em uma amostra-teste se o número cópia para umlócus predeterminado é reduzido ou aumentado quando comparado a umnúmero cópia normal", caracterizado por compreender:a) a amplificação seletiva do DNA fetal na amostra-teste e em uma amostra-controle utilizando o método da reivindicação 1, onde dita amostra-controlepossui um número cópia no lócus predeterminado;b) a rotulação do DNA da amostra-teste e do DNA da amostra-controle do passoa) com um rótulo para produzir sondas de DNA rotulado do teste e sondas deDNA rotulado do controle;c) a hibridização das sondas de DNA rotulado do teste e de DNA rotulado docontrole para um arranjo de amplicons fetais específicos da reivindicação 11;d) a comparação da quantidade de hibridização entre as sondas de DNA doteste e sondas do DNA do controle para determinar a força do sinal;e) a correlação da força do sinal com o aumento ou a redução no número cópiano lócus predeterminado na amostra-teste.

15. "Método para determinar em uma amostra-teste se o número cópia para umlócus predeterminado é reduzido ou aumentado quando comparado a umnúmero cópia normal", da reivindicação 14, caracterizado pela amostra do DNAdo teste e pela amostra do DNA do controle serem rotuladas com duas sondasdiferentes e onde a hibridização é para um arranjo.