CN101871001B - 检测脆性x综合征的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测临床样品中脆性X综合征的试剂盒，特别是涉及以亚硫酸氢盐修饰-长片段聚合酶链反应技术筛查脆性X综合征的试剂盒。本试剂盒的扩增范围可涵盖所有正常人、脆性X前突变患者、部分脆性X全突变患者的脆性X片段。试剂盒具有分析时间短、高通量、所需要的细胞数少的特点，可以同时分析父亲DNA及母亲DNA，而且还可用于胚胎种植前诊断。

Description

检测脆性X综合征的试剂盒

技术领域

本发明涉及检测临床样品中脆性X综合征的试剂盒，特别是涉及以亚硫酸氢盐修饰-长片段聚合酶链反应技术筛查脆性X综合征的试剂盒。

背景技术

脆性X综合征(FraX)是一种常见的遗传性智力低下综合征，其发病率仅次于唐氏综合征，呈X连锁遗传，占X连锁智力低下的40％。发病率男性为1/4000，女性为1/6000。外显率也因性别不同有差异，男性80％，女性30％。脆性X综合征在表型方面具有两大特点：一是轻度到重度不等的智力低下，IQ值在20-60之间，伴有不同程度的体型异常；头大、方额、大耳朵、大下颌，大多数男性患者在青春期发育后出现大睾丸，并有明确的伴性遗传的智力低下家族史。二是行为障碍，多数男性患者性情孤僻、反应过度和精神失常。许多患者还出现轻度的结缔组织异常，如脊柱后侧凸、皮肤松弛、关节伸张过渡和二尖瓣脱垂等。当女性患者具有同样的表型异常时，根据正常基因所在染色体随机失活的程度而出现不等的外显率。

95％以上的FraX患者，其发病的分子遗传学基础是脆性X综合征智力低下基因1(FMR-1基因)(CGG)n结构扩展突变，5％以下则是由FMR1基因的错义突变和缺失型突变影响了FMR1基因的正常结构、功能所导致。

FMR-1基因位于Xq27.3，含17个外显子，全长38kb。在基因的5’非翻译区存在一段数目可变的(CGG)n重复序列，其上游250bp处存在一CpG岛。CpGG岛及(CGG)n如发生甲基化，则FMR-1基因的转录受到抑制。正常人群FMR-1基因(CGG)n重复次数在6～50之间。前突变(CGG)n重复数在50～200之间且CpG岛无异常甲基化，此时FMR-1基因表达基本正常。(CGG)n重复数超过200时为全突变，常伴有CpG岛异常甲基化，使FMR-1mRNA的翻译受抑制，从而造成临床症状。

后续的研究发现前突变的个体可能会患有轻微的认识/行为缺陷，20％的女性携带者有卵巢功能早期衰退，40％的男性携带者在50岁后会有脆性X综合征相关的振颤共济失调症(FXTAS)。

携带前突变的男性能将突变基因传给女儿，在此传递过程中，CGG序列一般不会有大的扩增，不会导致全突变。但是，第三代患病风险则有40％，第四代患病风险已高达50％；而他们的兄弟姐妹患病风险率却较低(＜9％)，此现象称为Sherman现象。

全突变母亲每次妊娠有50％机会传递全突变给胎儿，后者若为男性则几乎都有智力低下及不育，若为女性则精神发育迟缓(MR)的机会约50％。若母亲为前突变携带者，则胎儿受累(扩展为全突变)机会与母亲CGG重复数大小有关。CGG重复序列越长，出生全突变患儿的可能性越大。当母亲的CGG重复数为50-59时，基本后代DNA的CGG不扩展；当母亲的CGG重复数为60-69时，后代有17％的几率产生扩展；当母亲的CGG重复数位90-113时，扩展几率为100％。。前突变和全突变者的亲属出生患儿的可能性也比正常人群高。

脆性X综合征的常规实验室诊断主要为染色体分析和分子遗传学诊断。染色体分析通过诱导X染色体产生脆性部位；但敏感性低，有全突变的男性约15％～50％的细胞有脆性部位，女性仅为0～30％。因此对发病男性的诊断较成功，但前突变的女性和传递致病基因的男性容易漏诊，因为有脆性部位的细胞百分比低，甚至一些女性和有全突变而表现较轻的男性也不被发现。分子遗传学诊断主要检测FMR1基因CGG重复扩展及甲基化状况。目前有两种方法：多聚酶链反应(PCR)和Southern印迹。PCR对正常范围的重复序列和较小重复序列的前突变有很高的敏感性，但不能扩增出全突变和较大重复序列的前突变，因此PCR对全突变只能进行间接诊断。一般情况下，当PCR在男性扩增出1个正常范围或前突变片段，在女性扩增出2个片段(正常范围，中间范围或前突变)，不再需要Southern印迹进一步证实。但有时复杂的细胞嵌合体患者PCR方法会产生假阴性。也有学者设计出甲基化敏感PCR来了解男性患者的FMR1基因甲基化情况。但因正常女性存在X染色体失活(甲基化)，该方法并不适用。Southern印迹可以检测出各种大小CGG重复扩展和甲基化情况，但分辨度低，方法复杂、费时而昂贵，不适于大规模筛查。

FraX发病率高，目前尚无有效的治疗方法，而且前突变携带者也会患有若干疾病。降低FraX发病率的关键是查出携带者及患者，通过遗传咨询、产前诊断阻止患儿的出生。同时由于女性前突变携带者表型无明显异常，易被忽视，突变基因在传递过程中不断扩展，导致发病风险逐代递增。目前临床上各种筛查方法准确率低、时间长、步骤繁琐、费用昂贵。因而非常有必要开发一种方法简单，费用合理，短时间即可得出(CGG)n重复数的脆性X综合征筛查试剂盒。

亚硫酸氢盐修饰技术常用于DNA的甲基化研究，其原理是DNA中的C碱基在高浓度亚硫酸氢盐温育的情况下，会转化成T碱基。经过修饰后的DNA，其CG％会大幅度下降。将其用于脆性X片段的修饰中，可将其片段的CG％从100％降低至33％-66％。DNA复杂二级结构由此打开，从而有利于PCR的扩增。2006年后，ZHOU等人应用亚硫酸氢钠修饰及定量荧光PCR成功地区分了正常人、脆性X前突变患者及部分脆性X全突变患者。随后，科学家们应用类似技术对各种不同来源的样本如细胞系、全血、绒毛样本等进行了脆性X综合征的分析。与现有的技术手段相比，该方法分析时间短、高通量、所需要的细胞数少，可以同时分析父亲DNA及母亲DNA，而且还可用于胚胎种植前诊断。

本发明人应用亚硫酸氢盐修饰-长片段聚合酶链反应技术，选择X染色体上的脆性X片段进行修饰后长片段扩增，结合琼脂糖电泳进行片段长度分析，开发了一种可以快速准确筛查的脆性X综合征的试剂盒，该试剂盒的扩增范围可涵盖所有正常人、脆性X前突变患者、部分脆性X全突变患者的脆性X片段。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测脆性X综合征的试剂盒，该试剂盒以亚硫酸氢盐修饰-长片段聚合酶链反应技术扩增X染色体的脆性X片段，并根据扩增产物片段大小对(CGG)n的拷贝数进行分析。

脆性X位点是存在于胚胎或者胎儿细胞的遗传物质，在人群中存在多态性，核心重复单位为3个核苷酸(CGG)。脆性X综合征是指人X染色体脆性X片段(CGG)n拷贝数目异常。本发明应用亚硫酸氢盐修饰-长片段聚合酶链反应对脆性X片段位点进行扩增，检测其(CGG)n的拷贝数的差别，为脆性X综合征等疾病的分析提供依据。

为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：

(1)设计一个长片段PCR扩增体系，包括(a)可热启动的耐热DNA聚合酶(Taq酶)和(b)2-脱氧核苷三磷酸(dNTPs)，以及(c)能够与待检位点双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向引物，和(d)能够与待检片段双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物；

(2)选择来源于真核细胞的DNA，并进行亚硫酸氢盐修饰，以修饰后的DNA作为模板，在相互配对的引物中，其中一条互补到真核细胞DNA目的序列的5’-端，一条互补到真核细胞DNA目的序列的3’-端，使用上述PCR扩增体系通过一次聚合酶链反应扩增特定脆性X片段；

(3)针对扩增后产物进行脆性X片段的(CGG)n检测和分析，通过检测脆性X片段的大小，分析其(CGG)n的拷贝数。

其技术关键点在于设计特异性的引物，并保证其扩增的区域只包含特定脆性X片段。

基于以上技术方案发明的试剂盒包括：(1)分别装有PCR反应液、引物混合物、Taq酶、脆性X综合征标准品、阴性对照样品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

根据本发明的一个优选实施方案，其中PCR反应液包括dNTPs、PCR缓冲液和水，特征在于PCR缓冲液包含10mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM KCl、2mM MgCl₂。

根据本发明的一个优选实施方案，其中引物混合物包括能够与待检位点双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向引物，和能够与待检片段双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物，特征在于所使用的引物序列分别为：5’-AGTTTCGTATTTTTATTATT-3’(SEQ IDNO：1)和5’-CGTTGTCGTACGTTTTTT-3’(SEQ ID NO：2)；其中SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2匹配在一起可以检测脆性X片段。

根据本发明的一个优选实施方案，其中引物混合物中还可以使用的引物序列分别为：5’-CGGGCGTTCGAGGTTTA-3’(SEQ ID NO：3)和5’-ATCGTCGTCGTTCGCGTTC-3’(SEQID NO：4)；其中SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4匹配在一起可以检测脆性X片段。

根据本发明的一个优选实施方案，其中引物混合物中还可以使用的引物序列分别为：5’-CGTCGGGAGTTCGTTTT-3’(SEQ ID NO：5)和5’-TTCGTCGTTCGTTTAG-3’(SEQ IDNO：6)；其中SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6匹配在一起可以检测脆性X片段。

根据本发明的一个优选实施方案，其中引物混合物中还可以使用的引物序列分别为：5’-GGCGGGGTTCGGCGTCGAA-3’(SEQ ID NO：7)和5’-TTTCGTTATCGTCGTCGT-3’(SEQ ID NO：8)；其中SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8匹配在一起可以检测脆性X片段。

根据本发明的一个优选实施方案，引物混合物中引物的工作浓度范围为0.05μM-10.0μM，优选范围为0.1μM-1.8μM。

根据本发明的一个优选实施方案，可以使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，并可用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化，然后进行氨解处理。

根据本发明的一个优选实施方案，每微升的PCR反应液中加入2单位Taq酶。

根据本发明的一个优选实施方案，阴性对照样品为经检测(CGG)n拷贝数＜45的正常人DNA，脆性X综合征标准品为细胞株提取的DNA，其中所使用的细胞株为Coriell公司的NA06907和NA07537。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的生物样品是X染色体脆性X片段(CGG)n拷贝数目异常的临床样品，可以来源于人体各种组织和体液。用来检测脆性X片段(CGG)n拷贝数目异常的DNA来自人体血细胞或体细胞的DNA。例如，DNA样本可以来自外周血，脐血，羊水，绒毛细胞。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的亚硫酸氢盐修饰-长片段聚合酶链反应技术可以对脆性X前突变患者的DNA片段进行扩增，(CGG)n拷贝数大于55，扩增反应的循环数是15-35循环。

根据本发明的一个优选实施方案，亚硫酸氢盐修饰-长片段聚合酶链反应技术扩增产物的片段大小与(CGG)n的拷贝数成正比例，因此可以根据脆性X片段扩增产物等位基因的长度来分析(CGG)n数目是否存在异常。

任何可以分离核酸片段大小的方法例如过滤，高效液相色谱，电泳，亲和收集等方法均可用于分析样本中脆性X片段的拷贝数。根据本发明的一个优选实施方案，通过凝胶电泳的方法进行分离，优选琼脂糖电泳分离脆性X片段。

简单地说，本发明的试剂盒包括一个混合多种成分的PCR反应体系；选择来源于真核细胞的DNA作为模板；在相互配对的引物中，至少有1对以上的扩增引物。其中一条互补到真核细胞DNA目的序列的5’-端，另一条互补于真核细胞DNA目的序列的3’-端；而且PCR缓冲液和扩增反应需要的Taq酶参与扩增反应。

值得特别说明的是，本试剂盒采用亚硫酸氢盐修饰后-长片段聚合酶链反应技术，可以扩增正常人、脆性X前突变患者、部分全突变患者的脆性X片段。为了确保本发明试剂盒的准确性，我们还应用市售的NA06907和NA07537细胞株提取的DNA作为脆性X综合征标准品。借助这个额外标准品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测，以进一步验证本发明试剂盒的检测精确度和准确性，并作为生产本发明试剂盒附加的质量控制标准。

附图说明

图1显示两个正常样本的脆性X片段的电泳图。图1A显示一个正常男性样本扩增电泳图。

图1B显示一个正常女性样本扩增电泳图。

图2显示4个脆性X患者的脆性X片段的电泳图。其中图2A显示一个男性前突变样品样本扩增电泳图。图2B显示一个女性前突变样品样本扩增电泳图。图2C显示一个男性全突变样品样本扩增电泳图。图2D显示一个女性全突变样品样本扩增电泳图。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：检测试剂盒及其使用

(1)制备包括下列组成成分的试剂盒：PCR反应液1管(800μl/管)、引物混合物1管(200μl/管)、Taq酶1管(25μl/管)、脆性X综合征标准品2管(25ul/管)、阴性对照1管(25μl/管)。

(2)标本采集、运送和保存：

1.标本采集：标本为血液，羊水，绒毛组织。血液为常规取静脉血2ml或者胎儿脐带血0.5-1ml，EDTA抗凝处理；经穿刺获羊水2-5ml或者绒毛组织两条。

2.保存：可立即检测，4℃保存一周，-20℃保存期可达一年。

3.运输：标本运送应采用0℃冰壶。

(3)检测步骤和结果分析：

1.DNA提取

建议使用Qiagen DNA提取试剂盒。

羊水DNA提取：4℃ 1000g离心1.5ml羊水10分钟，去掉上清。加入200μl冰预冷的1×PBS溶液重悬沉淀。接下来按照Qiagen Blood Protocol说明书进行，直到最后一步。加入100μl AE溶液或者蒸馏水到QIAamp spin column，室温温育至少5分钟。室温6000g离心1分钟收集DNA溶液。

脐血、静脉血或者绒毛组织DNA提取：按照Qiagen Blood Protocol说明书进行，最后收集到200μl DNA溶液。

2.亚硫酸氢盐修饰

建议使用Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Gold试剂盒，按照其说明书进行，最后收集到10μl修饰后的DNA溶液

3.PCR反应体系配制

对于每一个PCR反应体系，混合以下成分到总体积为25ul。设置阴阳性对照。

组分	反应体积
		PCR反应液	16.5μl
引物混合物	4μl
		Taq酶系	0.5μl
DNA样品	5μl
		反应体系总量	25μl

4.PCR反应条件

93℃预变性4分钟，然后93℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 2分钟，共40个循环；最后72℃ 7分钟。

5.扩增产物电泳

对于每一个分析，5μl PCR产物与1μl 6×loading Buffer混合，进行琼脂糖凝胶电泳。

实施例2：通过亚硫酸氢盐修饰-长片段PCR扩增脆性X片段检测脆性X综合征

来自供体的血样、羊水或绒毛组织共6份，按照Qiagen DNA提取试剂盒的标准程序进行DNA提取纯化。随后将提取的DNA使用EZ DNA Methylation-Gold试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰。将修饰后的DNA与本试剂盒中提供的引物混合物，PCR缓冲液体系和Taq酶按照试剂盒检测规程进行扩增反应并上样分析，步骤详见实施例1。上样结果的分析图谱如图1A，图1B，图2A，图2B，图2C、图2D所示。其中图1A，图1B为正常男性和正常女性的电泳图。当样品为脆性X前突变时，男性只有一条扩增产物，片段在400bp和500bp之间，如图2A所示；女性有两条扩增产物，其中一条片段在400bp和500bp之间，如图2B所示。而当样品为脆性X全突变时，男性只有一条扩增产物，片段在600bp和700bp之间，如图2C所示；女性有两条扩增产物，其中一条片段在600bp和700bp之间，如图2D所示。从结果可见，本发明的试剂盒可以快速准确地检测脆性X综合征。

序列表

<110>中山大学达安基因股份有限公司

<120>检测脆性X综合征的试剂盒

<140>

<141>

<160>8

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

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<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

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<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>3

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<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>4

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<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>5

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<210>6

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>6

ttcgtcgttcgtttag

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>7

ggcggggttcggcgtcgaa

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>8

tttcgttatcgtcgtcgt

Claims (4)

1.一种检测脆性X综合征的试剂盒，试剂盒包括：(1)分别装有PCR反应液、引物混合物、Taq酶、脆性X综合征标准品、阴性对照样品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中引物混合物包括正向引物和反向引物，特征在于所使用的引物序列分别为：5’-AGTTTCGTATTTTTATTATT-3’和5’-CGTTGTCGTACGTTTTTT-3’；模板为经过亚硫酸氢盐修饰的DNA片段。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR反应液包括dNTPs、PCR缓冲液和水，特征在于PCR缓冲液包含10mM pH为8.0的Tris-HCl、150mM KCl、2mM MgCl₂，每微升的PCR反应液中加入2单位Taq酶。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于试剂盒采用亚硫酸氢盐修饰-长片段聚合酶链反应技术对脆性X前突变患者的DNA片段进行扩增，(CGG)n拷贝数大于55，扩增反应的循环数是15-35循环。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于通过凝胶电泳的方法分析样本中脆性X片段的拷贝数。

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