CN105441545A

CN105441545A - 一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法

Info

Publication number: CN105441545A
Application number: CN201510948472.4A
Authority: CN
Inventors: 谢小冬; 车团结; 尤崇革; 沈颂东; 李琳; 李亚鹏
Original assignee: Suzhou Baiyuan Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Baiyuan Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2016-03-30

Abstract

本发明提供一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法，步骤如下：（1）构建重组阴性质粒和重组阳性质粒；（2）提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的外周血基因组DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；（3）根据收集数据绘制高分辨率溶解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的溶解曲线判断待测样本FOXH1基因SNP位点rs750472的基因型。本发明的方法能够有效检测FoxH1基因SNP位点rs750472的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本发明的方法分析结果与测序结果完全一致，能够可用于室间隔缺损型心脏病的辅助判断。

Description

一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法

技术领域

本发明涉及一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法。

背景技术

叉头框（FOX）基因家族作为一种转录因子，广泛存在于生物体中。该基因家族成员功能各异，但它们都具有一个高度保守的叉头DNA结构域，该结构域包括由100多个氨基酸组成的螺旋-转角-螺旋基序，3个α螺旋组成的核心区域和2个可与靶DNA分子相互作用的环组成的翼状结构。该家族基因通过激活或抑制靶基因的转录和表达，对机体的发育、分化、代谢等起关键的调节作用。所有的FOX基因的家族成员都可以通过DNA结构域结合DNA，其功能涉及细胞分化状态的维持、组织特异性基因的表达、胚胎发育、细胞周期调控、糖类及脂类代谢、细胞凋亡等多个生物学过程，并且其基因突变与发育畸形、肿瘤发生发展密切相关。

先天性心脏病(congenitalheartdiseases,CHDs)有很多种类型，通常将其分为简单和复杂的先天性心脏病。简单的先天性心脏病有以下三种：室间隔缺损(ventricularseptaldefect,VSD）、房间隔缺损(atrialseptaldefect,ASD）、动脉导管未闭(patentductusarteriosus,PDA）。复杂的先天性心脏病主要包括以下几种：法洛四联症(tetralogyofFallot,TOF)、肺动脉瓣狭窄(pulmonarystenosis,PS）、大动脉异位（transpositionofthegreatarteries,TGA）、主动脉缩窄（aorticstenosis,AS)、右室双出口（double-outletrightventricle,DORV），房室传导阻滞（atrioventricularblock,AVB）等。其中室间隔缺损（以下简称为VSD）在新生儿CHDs患者中的发病率约为20%，在儿童中约为30%，是所有CHDs患者中发病率最高的一种。VSD是指胚胎发育时期室间隔发育不全，左右心室之间存在一直接开口，产生左向右分流。VSD可单独发生，形成单纯性室间隔缺损，也可能是某种复杂心脏畸形的组成部分之一，形成非单纯性室间隔缺损。这种心脏缺损会导致左心室的富氧血液流入右心室而非正常流入主动脉。甘肃省六地市2-19岁人群调查结果表明CHDs总患病率为0.571％，其中VSD占52.72％。尽管大多数VSD可通过手术方式来纠正，但手术治疗会给患儿家庭和社会带来沉重的经济负担，而且VSD患者术后发生心脏功能异常的机率较正常人大大增加。因此，寻找和检测VSD相关基因，用于产前诊断和基因治疗，以最大可能地避免VSD患儿出生及纠正遗传缺陷，是当前心血管领域研究重点内容。

高分辨率溶解曲线（highresolutionmelting,HRM)分析技术是于2003年由美国Utah大学Wittwer实验室提出的基于新型饱和突光染料LCGreen发明而进行基因突变检测的一项新技术。HRM分析原理是在常规聚合酶链式反应(PCR)后饱和荧光染枓与双链DNA结合，当通过加热升温使DNA双链解离时，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，由于突变、SNP位点双链碱基间不匹配会使双链DNA在此位点首先解开，通过实时监测升温过程中的荧光强度，从荧光强度与时间轴曲线上就可以判断是否存在突变或SNP，而且不同位点、杂合子与否、GC含量、扩增子长度等都会影响熔解曲线的峰形。因此，HRM分析能够有效区分不同突变位点、SNP位点和拥有不同GC含量的扩增片段。

发明内容

本申请人经研究发现：核转录因子FOXH1基因是DNA结合蛋白wingedhelix转录因子家族的新成员，在VSD信号通路中起到重要的转录调节的作用。在不区分性别的情况下，当FoxH1基因SNP位点rs750472的基因型为GG或TG时，先天性心脏病易感性（VSD）增加。具体实验如下：

选取573名来医院就诊的患者，其中对照组276人，VSD患者组为297人。对照组rs750472位点的TT,GT,GG基因型频率分别为57.6%，35.9%及6.5%；VSD患者中相应基因型频率分别为39.4%，45.5%及15.2%。T，G等位基因频率在VSD病患组中分别为61.6%和38.4%；对照组相对应的等位基因频率分为75.5%和24.5%，详见表1。

表1对照组与VSD患者组的基因型频率及等位基因频率

由表1可知：

以野生等位基因T做为参照，则G等位基因频率在病患组和对照组之间的差异性具有显著的统计学意义，P=0.005,OR=1.883(1.210-2.931)。

以野生基因型TT做为参照，GT基因型频率在病患组和对照组之间有差异性，P=0.047,OR=1.853(1.006-3.412)。GG基因型频率在病患组和对照组之间的差异具有显著的统计学意义，P=0.016,OR=3.397(1.209-9.546)。

为此，本申请人设计了一种检测FoxH1基因SNP位点rs750472基因型的方法，用来检验FoxH1基因SNP位点rs750472的基因型，该结果可用于室间隔缺损型心脏病的辅助判断。

本发明的第一个目的是提供一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法，步骤如下：

（1）构建重组阴性质粒和重组阳性质粒；所述重组阴性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.2；

（2）提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的外周血基因组DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；

作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃90s；60℃30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；

（3）根据收集数据绘制高分辨率溶解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的溶解曲线判断待测样本FOXH1基因SNP位点rs750472的基因型：

与重组阴性质粒的溶解曲线重合则FOXH1基因SNP位点rs750472的基因型为TT；

与重组阳性质粒的溶解曲线重合则FOXH1基因SNP位点rs750472的基因型为GG；

在重组阴性质粒和重组阳性质粒的溶解曲线之间的则FOXH1基因SNP位点rs750472的基因型为TG。

作为优选，所述PCR扩增时所用引物为（1）或（2）中的一种：

（1）上游引物：FOXH1-F5'-ACCAGGGAAGACGGGATAAAGT-3'；

下游引物：FOXH1-R5'-TCTAGTGGGGGCTTCTCCTGA-3'；

（2）与（1）中的互补序列。

上述引物的衍生序列也在本发明的保护范围内，所述衍生序列为向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：

Green-2-GoqPCRMastermix（含EvaGreen）5μl

引物F（10μM）0.1μl

引物R（10μM）0.1μl

模板(50ng/μl)0.5μl

ddH₂O4.3μl

总体积10μl。

作为优选，所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s，60℃退火/延伸20s；40个循环。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的试剂盒，所述试剂盒包括重组阴性质粒、重组阳性质粒和用于扩增质粒的引物；所述重组阴性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.2。

作为优选，所述引物的序列为（1）或（2）中的一种：

（1）上游引物：FOXH1-F5'-ACCAGGGAAGACGGGATAAAGT-3'；

下游引物：FOXH1-R5'-TCTAGTGGGGGCTTCTCCTGA-3'；

（2）与（1）中的互补序列。

作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：

Green-2-GoqPCRMastermix（含EvaGreen）5μl

引物F（10μM）0.1μl

引物R（10μM）0.1μl

模板(50ng/μl)0.5μl

ddH₂O4.3μl

总体积10μl；

作为优选，94℃预变性3min；94℃变性10s，60℃退火/延伸20s；40个循环。

本发明的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，步骤如下：

（1）提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的外周血基因组DNA均进行PCR扩增和HRM分析；

所述HRM分析的条件为：94℃90s；

60℃30s；

83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；

（2）根据收集数据绘制高分辨率溶解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的溶解曲线判断待测样本FOXH1基因SNP位点rs750472的基因型：

本发明的第四个目的是提供序列表中SEQIDNo.1、序列表中SEQIDNo.2在制备检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供序列表中SEQIDNo.1、序列表中SEQIDNo.2、权利要求5-8任一所述的试剂盒在制备辅助判断室间隔缺损型心脏病的试剂中的应用。

本发明的方法能够准确检测FoxH1基因SNP位点rs750472的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本发明的方法对FoxH1基因SNP位点rs750472的基因型的分析结果与测序结果完全一致，能够可用于室间隔缺损型心脏病的辅助判断，对后续研究心脏病相关基因具有重要意义。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为引物和模板体系优化实验结果；其中，a代表引物为0.1μl，模板为0.5μl；b代表引物为0.2μl，模板为0.5μl；c代表引物为0.1μl，模板为1μl；d代表引物为0.2μl，模板为1μl；e代表引物为0.15μl，模板为1.5μl；f代表引物为0.2μl，模板为1.5μl；g代表引物为0.1μl，模板为1μl；h代表引物为0.15μl，模板为0.5μl；i代表引物为0.15μl，模板为1μl；

图2为本发明的HRM方法灵敏度实验结果；其中，a代表突变阳性质粒所占体积百分比例为1%；b代表突变阳性质粒占体积百分比例为5%；c代表突变阳性质粒占体积百分比例为10%；d代表突变阳性质粒占体积百分比例为20%；e代表突变阳性质粒占体积百分比例为50%；

图3为样本用本发明的HRM方法分析结果；其中，a为FOXH1rs750472（c.-314T>G）纯合突变型样本；b为野生型样本；c为杂合突变型样本；

图4为样本的FOXH1rs750472(c.-314T>G)位点测序结果。其中，a代表纯合突变型序列；b代表杂合突变型序列；c代表野生型序列。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方案对本发明做更详细阐述。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物、探针和所用序列合成、测序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。

实施例1FOXH1rs750472标准品的制备

要建立HRM分析方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。本研究合成包含FOXH1rs750472（c.-314T>G）位点野生型和纯合突变型DNA序列，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pUC57中，构建出重组质粒pUC57-rs750472的野生型和纯合突变型，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。

一、重组阴性和阳性质粒pUC57-rs750472的构建和转化

1.合成FOXH1rs750472（c.-314T>G）野生型和纯合突变型DNA序列，本专利合成的序列为200bp，具体序列如下，其中标有下划线的碱基为基因突变位点：

（1）野生型序列

GCCCCACGCCTTGGGAGCTTGGCATGGGCTAAATACTCCCCCATTTGTTAAATGGGGTCCTGAAACCTGACCAGGGAAGACGGGATAAAGTAGCCATGGGTCATCGCAGCCCCTTTGAAGCCGGGCCTGGCCACCCAAAGGCAACTCAGGGGTGGAGACTGAGGCCTCAGGAGAAGCCCCCACTAGAATGCTCTCTGCCC

（2）纯合突变型序列

GCCCCACGCCTTGGGAGCTTGGCATGGGCTAAATACTCCCCCATTTGTTAAATGGGGTCCTGAAACCTGACCAGGGAAGACGGGATAAAGTAGCCATGGGTCATCGCAGCCCCTTGGAAGCCGGGCCTGGCCACCCAAAGGCAACTCAGGGGTGGAGACTGAGGCCTCAGGAGAAGCCCCCACTAGAATGCTCTCTGCCC

2.连接反应：将上述合成的DNA片段与pUC57进行连接，采用如下连接体系进行配制：

pUC571μL

DNA2μL

SolutionI5μL

ddH₂O2μL

总体积10μL。

配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。

3.pUC57-rs750472质粒的转化以及PCR鉴定

（1）从-80℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其解冻；

（2）取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；

（3）42℃水浴中热休克90秒，热休克后立即置冰上冷却2min；

（4）于1.5mlEP管中加入预冷的1ml不含抗性的LB液体培养基吹打混匀后，37℃120rpm轻摇培养90min；

（5）将上述培养液短暂离心，吸去900μl后取剩余的100μl涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；

（6）从平板上挑取单克隆菌落于500μLAmp抗性LB液体培养基的1.5mlEP管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时；

（7）取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定；将鉴定为阳性的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇；

（8）用引物FOXH1-F和FOXH1-R扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物鉴定阳性转化子。

引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：

上游引物：FOXH1-F5'-ACCAGGGAAGACGGGATAAAGT-3'

下游引物：FOXH1-R5'-TCTAGTGGGGGCTTCTCCTGA-3'

PCR反应体系如下：

10×PCRbuffer2μL

dNTP（2.5μM）2μL

引物F（5μM）1.5μL

引物R（5μM）1.5μL

模板2μL

Taq酶（5U）0.5μL

ddH₂O10.5μL。

扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、60℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。

（9）采用百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。

二、标准品的获取和定量

（1）将步骤一得到的冻存的含有重组质粒pUC57-rs750472的大肠杆菌DH5α100μL转种于5mL的LB液体培养基，37℃220rpm过夜摇培；

（2）取1ml培养过夜的菌液转种于30mlLB液体培养基，220rpm增菌培养2-3小时，然后采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒；

（3）利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可见分光光度计（ND5000）对提取的质粒进行测定，测定A₂₆₀、A₂₈₀，根据A₂₆₀/A₂₈₀判断质粒的纯度。

实施例2HRM-PCR检测FOXH1rs750472方法的建立

一、待测样本的制备

提取30例样本的外周血基因组DNA，用作FOXH1基因PCR扩增的模板。

（1）取1ml全血，加入3mlTE，颠倒混匀后静置10min，8000rpm离心5分钟，弃上清液；

（2）重复上述步骤2-3次至沉淀为白色；

（3）加入900μl10%SDS和10μl10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h；

（4）将离心管冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液（酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1，）混匀，12000rpm离心10min；

（5）小心吸取上清后，在上清中再加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液（酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1）混匀，12000rpm离心10min；

（6）取上清，加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清；

（7）加500μl体积百分比为70%的乙醇洗涤沉淀，短暂离心后弃上清，开盖干燥至乙醇完全挥发；

（8）加50μl双蒸水或TE溶解DNA中，-20℃保存。

二、特异性引物的设计与合成

本发明通过对NCBI数据库中FOXH1rs750472基因序列进行检索，选取适合设计引物的片段序列为靶目标，应用Primerexpress3软件、PrimerPremier5软件以及Oligo7软件，设计了一组HRM-PCR引物。

本专利选取的扩增序列如下：

5’-GCCCCACGCCTTGGGAGCTTGGCATGGGCTAAATACTCCCCCATTTGTTAAATGGGGTCCTGAAACCTGACCAGGGAAGACGGGATAAAGTAGCCATGGGTCATCGCAGCCCCTTTGAAGCCGGGCCTGGCCACCCAAAGGCAACTCAGGGGTGGAGACTGAGGCCTCAGGAGAAGCCCCCACTAGAATGCTCTCTGCCC-3’

其中标有下划线的碱基为基因突变位点。

该引物序列如下：

上游引物：FOXH1-F5'-ACCAGGGAAGACGGGATAAAGT-3'；

下游引物：FOXH1-R5'-TCTAGTGGGGGCTTCTCCTGA-3'；

扩增片段大小为：118bp。扩增的核苷酸序列为：

ACCAGGGAAGACGGGATAAAGTAGCCATGGGTCATCGCAGCCCCTTTGAAGCCGGGCCTGGCCACCCAAAGGCAACTCAGGGGTGGAGACTGAGGCCTCAGGAGAAGCCCCCACTAGA。

三、HRM-PCR反应体系和反应条件

以DNA为模板，以上述引物FOXH1-F和FOXH1-R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。

PCR反应体系：

Green-2-GoqPCRMastermix（含EvaGreen）5μl

引物F（10μM）0.1μl

引物R（10μM）0.1μl

模板0.5μl

ddH₂O4.3μl

总体积10μl。

其中引物采用FOXH1-F和FOXH1-R，HRM-PCR采用生工生物（上海），Green-2-GoqPCRMastermix试剂盒，HRM分析仪为百源基因ASA-9600。

PCR扩增程序：

94℃预变性3min；变性94℃10s，退火/延伸60℃20s；40个循环。

HRM分析：

94℃90s；

60℃30s；

83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。

四、HRM-PCR条件优化

以浓度为1.00×10⁶copies/ml的阳性质粒为模板，采用生工生物（上海）Green-2-GoqPCRMastermix试剂盒进行实验，实验采用的实时荧光定量PCR仪为百源基因ASA-9600实时荧光定量PCR仪。反应体系采用10μl体系，其中引物和模板的量采用表2中的组合进行反应。

表2HRM-PCR反应体系中引物和模板不同用量

PCR反应条件为：

94℃预变性3min；94℃变性10s，60℃退火/延伸20s；40个循环。

HRM分析：

94℃90s；

60℃30s；

83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。

结果参照图1，数据显示10μl体系时，引物（10μM）和模板（50ng/μl）分别加入0.1μl和0.5μl时，Ct值最小，荧光信号最强。

五、灵敏度实验

将突变阳性质粒和野生阳性质粒均稀释至50ng/μl，然后二者混合进行梯度稀释，突变阳性质粒体积比例依次为50%、20%、10%、5%和1%，按照下述HRM-PCR反应体系和参数进行扩增，分析突变检出范围，即灵敏度。

PCR反应体系：

Green-2-GoqPCRMastermix（含EvaGreen）5μl

引物F（10μM）0.1μl

引物R（10μM）0.1μl

模板0.5μl

ddH₂O4.3μl

总体积10μl。

PCR反应条件为：

94℃预变性3min；94℃变性10s，60℃退火/延伸20s；40个循环。

HRM分析：

94℃90s；

60℃30s；

83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。

结果参照图2，实验数据显示，当阳性质粒与阴性质粒体积比分别为1:1、1:4、1:9时，能检测出阳性质粒，所以本专利所用HRM检测方法的灵敏度为10%。

实施例3应用本发明的检测方法检测样本基因突变情况

以实施例2步骤四中优化好的检测条件，对30例样本进行HRM分析，与阳性质粒的Tm值对照比较，依此确定样本中的突变类型。HRM分析结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，并根据HRM分析结果针对每种基因型随机挑选1个样本在生工生物（上海）进行Sanger测序验证。

HRM分析结果结果参见表3和图3，数据显示30例样本中FOXH1基因rs750472为T>C杂合突变型有5例，T>C纯合突变型3例，其余22例为野生型。

Sanger测序结果参见图4；其中，a为样本编号4的测序结果，b为样本编号16的测序结果，c为样本编号22的测序结果；与用本发明方法检测的结果完全一致。

表3应用本发明的方法对样本的分析结果

实施例4用于检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的试剂盒

本发明的用于检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的试剂盒包括以下组分：

（1）FOXH1rs750472标准品：按照实施例1中的方法制备；

（2）引物；该引物序列为：

上游引物：FOXH1-F5'-ACCAGGGAAGACGGGATAAAGT-3'；

下游引物：FOXH1-R5'-TCTAGTGGGGGCTTCTCCTGA-3'。

应用该试剂盒检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法与实施例2相同。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>苏州百源基因技术有限公司

<120>一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>200

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gccccacgccttgggagcttggcatgggctaaatactcccccatttgttaaatggggtcc60

tgaaacctgaccagggaagacgggataaagtagccatgggtcatcgcagcccctttgaag120

ccgggcctggccacccaaaggcaactcaggggtggagactgaggcctcaggagaagcccc180

cactagaatgctctctgccc200

<210>2

<211>200

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gccccacgccttgggagcttggcatgggctaaatactcccccatttgttaaatggggtcc60

tgaaacctgaccagggaagacgggataaagtagccatgggtcatcgcagccccttggaag120

ccgggcctggccacccaaaggcaactcaggggtggagactgaggcctcaggagaagcccc180

cactagaatgctctctgccc200

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

accagggaagacgggataaagt22

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tctagtgggggcttctcctga21

<210>5

<211>118

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

accagggaagacgggataaagtagccatgggtcatcgcagcccctttgaagccgggcctg60

gccacccaaaggcaactcaggggtggagactgaggcctcaggagaagcccccactaga118

Claims

1.一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法，其特征在于：步骤如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增时所用引物为（1）或（2）中的一种：

（1）上游引物：FOXH1-F5'-ACCAGGGAAGACGGGATAAAGT-3'；

下游引物：FOXH1-R5'-TCTAGTGGGGGCTTCTCCTGA-3'；

（2）与（1）中的互补序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增时的反应体系为：

Green-2-GoqPCRMastermix（含EvaGreen）5μl

引物F（10μM）0.1μl

引物R（10μM）0.1μl

模板(50ng/μl)0.5μl

ddH₂O4.3μl

总体积10μl。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s，60℃退火/延伸20s；40个循环。

5.一种用于检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括重组阴性质粒、重组阳性质粒和用于扩增质粒的引物；所述重组阴性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.2。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述引物的序列为（1）或（2）中的一种：

（1）上游引物：FOXH1-F5'-ACCAGGGAAGACGGGATAAAGT-3'；

下游引物：FOXH1-R5'-TCTAGTGGGGGCTTCTCCTGA-3'；

（2）与（1）中的互补序列。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增时的反应体系为：

Green-2-GoqPCRMastermix（含EvaGreen）5μl

引物F（10μM）0.1μl

引物R（10μM）0.1μl

模板(50ng/μl)0.5μl

ddH₂O4.3μl

总体积10μl；

作为优选，所述扩增质粒时的PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s，60℃退火/延伸20s；40个循环。

8.权利要求5-7任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤如下：

所述HRM分析的条件为：94℃90s；

60℃30s；

83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；

9.序列表中SEQIDNo.1、序列表中SEQIDNo.2在制备检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的试剂盒中的应用。

10.序列表中SEQIDNo.1、序列表中SEQIDNo.2、权利要求5-8任一所述的试剂盒在制备辅助判断室间隔缺损型心脏病的试剂中的应用。