CN113604558A - 维生素d受体基因snp位点检测试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及维生素D受体基因SNP位点检测试剂。本发明所述的检测试剂包括裂解液和检测引物。其中裂解液中不含有蛋白酶K，在保证提取效果的前提下，缩短裂解液提取样本核酸的周期，降低裂解液成本。并且，本发明针对VDR基因的rs1544410、rs7975232、rs2228570、rs731236四个SNP位点设计引物，四个SNP位点测试使检测结果更为准确、可靠。

Description

维生素D受体基因SNP位点检测试剂
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及维生素D受体基因SNP位点检测试剂。
背景技术
钙是人体骨骼和牙齿的主要成份之一，大部分以离子形式存在，是人体重要的组成物质之一。维生素D被称为“钙的搬运工”，其最主要功能是帮助钙质被人体吸收。在儿童期，适宜剂量的维生素D是保证生长发育的重要因素。所谓的儿童“缺钙”，其实是维生素D缺乏。维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)基因，编码了维生素D的受体蛋白，决定钙的吸收和在骨骼中的储存和流失速度。VDR的表达状态影响儿童骨密度发育，表达不足或异常的人群有骨质疏松的风险。
单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每300个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。同样VDR基因存在大量的SNP位点，据调查研究，部分位点与儿童钙的吸收存在较大的关联，因此检测儿童VDR基因的SNP位点能够对将来可能存在的缺钙情况进行预测，对儿童成长发育过程中钙的补充具有参考指导意义。
目前检测单核苷酸多态性的常用方法有PCR-RFLP、基因芯片等方法，不论哪种方法，对于样品的前处理过程都是非常重要的。儿童取样除其他因素外，还需要考虑儿童的顺应性。相对于其他样品而言，口腔样本取样方便，痛苦较小，适合作为儿童基因检测的样品。但该样品组成较为复杂，前处理不当，所得DNA污染严重或片段不完整都会影响到检测结果的准确性。因此，开发更合理的DNA提取试剂，提高样品的前处理效果，是非常重要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供维生素D受体基因SNP位点检测试剂。所述试剂中的裂解液即便不添加蛋白酶K，也能够对口腔细胞起到良好的裂解效果。
本发明提供的维生素D受体基因SNP位点的检测试剂包括，检测引物和样品裂解液；所述裂解液包括水、Tris-HCl、Tween、Triton X-100和EDTA。
目前常用的裂解液中多含有蛋白酶K成分，利用蛋白酶K对细胞进行裂解需要于37℃孵育，增加了裂解的步骤。且为了维持蛋白酶K的活性，需要低温冷藏和运输给存储和运输带来了不便。而如果在纯化过程中没有完全将蛋白酶K除去，则会影响后期的扩增反应。本发明所述裂解液中不含有蛋白酶K也能够对口腔细胞起到良好的裂解效果。其中，所述Tris-HCl的pH值为8.3。该裂解液中，以吐温和Triton X-100作为去污剂，从而起到良好的裂解作用。经验证，选择吐温-20的裂解效果由于其他吐温系列的表面活性剂。其中吐温-20与Triton X-100的质量比优选为8:1，当吐温-20与Triton X-100在该比例下时，裂解所得产物的扩增效果最优。
本发明中，所述裂解液由水和如下组分组成：
10～30mM Tris-HCl，0.5wt％～1wt％Tween、0.01wt％～1wt％Triton X-100和1～20mM EDTA。
一些实施例中，所述裂解液由水和如下组分组成：20mM Tris-HCl，0.8wt％Tween-20、0.1wt％Triton X-100和10mM EDTA。
本发明中，所述检测引物为靶向VDR基因的rs1544410、rs7975232、rs2228570和/或rs731236SNP位点中至少一种。一些实施例中，所述检测引物包括：如SEQ ID NO:1～2所示的两条长片段引物；和SEQ ID NO:3～4所示的两条长片段引物。具体的，检测引物包括：
长片段引物：F：ACTGCTTGGAGTGCTCCTCAT
R：CTACTTTGCTGGTTTGCAGAGCC
短片段引物：F：AAAGACAGAGACCCACACAGCAAC
R：CATGCTCTGAGCCAGCTATGT
本发明所述的检测试剂中，还包括BSA溶液。所述牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白的浓度为20mg/mL。所述牛血清白蛋白溶液的体积与所述核酸裂解液的体积比为4：200。
本发明所述的检测试剂中，还包括口腔拭子和离心管。
所述口腔拭子用于口腔取样。所述离心管作为前处理的容器。
本发明还提供给了维生素D受体基因SNP位点的检测方法，其以本发明所述的检测试剂对口腔样品进行检测。
本发明所述的检测方法包括样品前处理和PCR扩增两个步骤。
所述前处理包括：将待提取的样品与所述的裂解液混合，经涡旋振荡后，与牛血清白蛋白溶液混合，再次经涡旋振荡后，60～70℃孵育8～12min后，再经90～100℃孵育4～6min，经离心后获得含有核酸的上清液。
本发明中，所述所述待提取样品为口腔拭子，所述核酸为基因组DNA。
在该提取方法中，每份口腔拭子与200μL所述裂解液混合。
所述牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白的浓度为20mg/mL，所述牛血清白蛋白溶液的体积与所述核酸裂解液的体积比为4：200。
所述60～70℃孵育前经瞬时离心；所述90～100℃孵育前也经瞬时离心。所述离心为以12000转/分钟，离心5分钟。
一些实施例中，所述孵育的包括65℃孵育10min后，再经95℃孵育5min。
所述PCR扩增的体系包括：前处理后获得的模板DNA 4μl、5×HS Taq buffer 4μl、F Primer(10μM)0.5μl、R Primer(10μM)0.5μl、HOT Start Taq DNA polymerse 0.1μl、dNTP 0.4μl，灭菌水定容至20μl。
所述PCR扩增的条件包括：
Figure BDA0003202733560000031
本发明所述的检测试剂包括裂解液和检测引物。其中裂解液中不含有蛋白酶K，在保证提取效果的前提下，缩短裂解液提取样本核酸的周期，降低裂解液成本。并且，本发明针对VDR基因的rs1544410、rs7975232、rs2228570、rs731236四个SNP位点设计引物，四个SNP位点测试使检测结果更为准确、可靠。
附图说明
图1示长片段电泳图谱；从左到右，前3个条带为加入蛋白酶K，后3个条带为不加蛋白酶K；
图2示短片段电泳图谱；从左到右，前3个条带为加入蛋白酶K，后3个条带为不加蛋白酶K；
图3示短片段电泳图谱；从左到右，前3个条带为不含10mM EDTA裂解液的电泳条带，后3个条带为含10mM EDTA裂解液的电泳条带。
具体实施方式
本发明提供了维生素D受体基因SNP位点检测试剂。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一种快速提取口腔拭子基因组DNA裂解液的配置：
裂解液组分：Tris-HCl 8.5 20mM，0.8％Tween-20，0.1％Triton X-100，10mMEDTA。
配置10ml裂解液：
(1)移液器吸取1M Tris-HCl 8.5溶液2ml加入干净无菌的15ml离心管中；
(2)稀释Tween-20，先稀释至8％Tween-20，即取80μl Tween-20加入910μl超纯水中，颠倒混匀即可；
(3)移液器吸取1ml步骤(2)中已配置好的8％Tween-20加入到步骤(1)中的15m离心管；
(4)稀释Triton X-100，先稀释至10％Triton X-100，即取100μl Triton X-100加入900μl超纯水中，颠倒混匀即可；
(5)将步骤(4)中获得的10％Triton X-100继续稀释至1％TrionX-100，即取100μl10％Tween-20加入900μl超纯水中，颠倒混匀即可；
(6)移液器吸取1ml步骤(5)中已配置好的1％Triton X-100加入到步骤(1)中的15m离心管；
(7)吸取0.5M的EDTA溶液200μl。
(8)向15ml离心管加入5.8ml超纯水补足至10ml，颠倒混匀，裂解液配置完成。
实施例2
裂解液快速提取口腔拭子基因组DNA的方法：
(1)将口腔拭子样本放入1.5ml离心管中；
(2)向步骤(1)的离心管中加入200μl核酸裂解液，涡旋振荡后；
(3)再向步骤(2)中加入4μl 20mg/mL的牛血清白蛋白，涡旋振荡后，进行瞬时离心；
(4)将离心管放置65℃金属浴中孵育10分钟；
(5)瞬时离心后，将离心管放置95℃金属浴中孵育5分钟；
(6)取出离心管在离心机中常温离心，以12000转/分钟，离心5分钟；
(5)吸取离心管底部上清液到干净1.5ml离心管中，避免吸取到沉淀；
(6)该上清液即为提取的基因组DNA，可将上清液稀释5-10倍进行PCR。
对比例1蛋白酶K加入与否对比测试
(1)取3份口腔拭子样本放入1.5ml离心管中，加入4μl蛋白酶K；另取3份口腔拭子样本放入1.5ml离心管中，不加蛋白酶K。
(2)上述样本都加入200μl核酸裂解液，涡旋振荡后。
(3)加入4μl 20mg/mL的牛血清白蛋白，涡旋振荡后，进行瞬时离心。
(4)将离心管放置65℃金属浴中孵育10分钟。
(5)瞬时离心后，将离心管放置95℃金属浴中孵育5分钟。
(6)取出离心管在离心机中常温离心，以12000转/分钟，离心5分钟。
(7)该上清液即为提取的基因组DNA，将上清液稀释5倍进行PCR扩增VD长片段及短片段。
(8)扩增引物如下
长片段引物：F：ACTGCTTGGAGTGCTCCTCAT
R：CTACTTTGCTGGTTTGCAGAGCC
短片段引物：F：AAAGACAGAGACCCACACAGCAAC
R：CATGCTCTGAGCCAGCTATGT
(9)PCR扩增体系：
PCR组成 体积
模板 4μl
5×HS Taq buffer 4μl
F Primer(10μM) 0.5μl
R Primer(10μM) 0.5μl
HOT Start Taq DNA polymerse 0.1μl
dNTP 0.4μl
灭菌水 up to 20μl
(10)PCR扩增条件：
Figure BDA0003202733560000061
(11)扩增产物进行凝胶电泳分析：经1％凝胶电泳观察扩增的长片段(1377bp)及短片段(616bp)，电泳图如图1～2，由图可知加入蛋白酶K与不加蛋白酶K无明显差异，说明即便不添加蛋白酶K本发明所述的裂解液也能够获得良好的裂解效果。
对比例2 EDTA加入与否对比测试：
(1)取3份口腔拭子样本放入1.5ml离心管中，另取3份口腔拭子样本放入1.5ml离心管中。
(2)前3个样本加入含10mM EDTA的200μl核酸裂解液，后3个样本加入不含10mMEDTA的200μl核酸裂解液，涡旋振荡后，进行瞬时离心。
(3)将离心管放置65℃金属浴中孵育10分钟。
(4)瞬时离心后，将离心管放置95℃金属浴中孵育5分钟。
(5)取出离心管在离心机中常温离心，以12000转/分钟，离心5分钟。
(6)该上清液即为提取的基因组DNA，将上清液稀释5倍进行PCR扩增VD长片段。
(7)扩增引物如下
短片段引物：F：AAAGACAGAGACCCACACAGCAAC
R：CATGCTCTGAGCCAGCTATGT
(8)PCR扩增体系：
PCR组成 体积
模板 4μl
5×HS Taq buffer 4μl
F Primer(10μM) 0.5μl
R Primer(10μM) 0.5μl
HOT Start Taq DNA polymerse 0.1μl
dNTP 0.4μl
灭菌水 up to 20μl
(9)PCR扩增条件：
Figure BDA0003202733560000071
(10)扩增产物进行凝胶电泳分析：经1％凝胶电泳观察扩增的短片段(616bp)，电泳图如图3，由图可知含10mM EDTA的裂解效果比不含含10mM EDTA的裂解液裂解效果更好，故裂解液中含有10mM EDTA时，裂解效果更好。
实施例3
(1)针对VDR基因的rs1544410、rs7975232、rs2228570、rs731236四个SNP位点设计引物，对所采集目标的DNA样本进行聚合酶链式反应(PCR)，引物如下
长片段引物：F：ACTGCTTGGAGTGCTCCTCAT
R：CTACTTTGCTGGTTTGCAGAGCC
短片段引物：F：AAAGACAGAGACCCACACAGCAAC
R：CATGCTCTGAGCCAGCTATGT
(2)PCR扩增体系：
PCR组成 体积
模板 4μl
5×HS Taq buffer 4μl
F Primer(10μM) 0.5μl
R Primer(10μM) 0.5μl
HOT Start Taq DNA polymerse 0.1μl
dNTP 0.4μl
灭菌水 up to 20μl
(3)PCR扩增条件：
Figure BDA0003202733560000081
(4)扩增产物进行凝胶电泳分析：经1％凝胶电泳观察长片段1377bp处有明显扩增条带，短片段616bp处有明显扩增条带符合实验要求；
(5)将扩增条带符合实验要求进行Sanger测序：根据相应基因对应的分型获得该分型相应分值，综合4个位点分值总和情况，获得儿童钙吸收等级情况，共分为六个等级，其中0级儿童钙吸收最佳，6级儿童钙吸收最差。
基因位点分型表：
Figure BDA0003202733560000091
儿童钙吸收等级表：
Figure BDA0003202733560000092
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.维生素D受体基因SNP位点的检测试剂，其包括，检测引物和样品裂解液；所述裂解液包括水、Tris-HCl、Tween、Triton X-100和EDTA。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述裂解液由水和如下组分组成：
10～30mM Tris-HCl，0.5wt％～1wt％Tween、0.01wt％～1wt％Triton X-100和1～20mM EDTA。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述裂解液由水和如下组分组成：20mM Tris-HCl，0.8wt％Tween-20、0.1wt％Triton X-100和10mM EDTA。
4.根据权利要求1～3任一项所述的检测试剂，其特征在于，所述检测引物为靶向VDR基因的rs1544410、rs7975232、rs2228570和/或rs731236SNP位点中至少一种。
5.根据根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述检测引物包括：
如SEQ ID NO:1～2所示的两条长片段引物；
和SEQ ID NO:3～4所示的两条长片段引物。
6.根据权利要求1～3任一项所述的检测试剂，其特征在于，还包括BSA溶液。
7.根据权利要求6任一项所述的检测试剂，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白的浓度为20mg/mL。
8.根据权利要求7所述的检测试剂，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液的体积与所述核酸裂解液的体积比为4：200。
9.根据根据权利要求1～8任一项所述的检测试剂，其特征在于，还包括口腔拭子和离心管。
10.维生素D受体基因SNP位点的检测方法，其特征在于，以权利要求1～9任一项所述的检测试剂对口腔样品进行检测。
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