CN106755440A - 用于检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的试剂盒 - Google Patents

用于检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的试剂盒 Download PDF

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CN106755440A
CN106755440A CN201611245638.7A CN201611245638A CN106755440A CN 106755440 A CN106755440 A CN 106755440A CN 201611245638 A CN201611245638 A CN 201611245638A CN 106755440 A CN106755440 A CN 106755440A
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restructuring
notch3
plasmid
genotype
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谢小冬
车团结
王莉
尤崇革
李琳
李亚鹏
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Suzhou Baiyuan Gene Technology Co Ltd
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Abstract

本发明提供用于检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的试剂盒，该试剂盒包括引物对和PCR检测反应试剂；其中，引物对为（1）或（2）中的一种：（1）上游引物：NOTCH3‑F 5'‑ AATGGGAGCCAGGGCAGAT‑3'；下游引物：NOTCH3‑R 5'‑ GAAGAGAAAGTACCACTCAGGCAG‑3'；（2）与（1）中的互补序列。本发明的方法能够准确检测NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本发明的方法对NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于辅助判断非综合征唇腭裂的易患性。

Description

用于检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的试剂盒
技术领域
本发明涉及用于检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的试剂盒。
背景技术
NOTCH信号通路是参与胚胎及器官发育的信号通路之一。NOTCH通路的生理功能体现在调节细胞分化与组织发育上。NOTCH信号通路的作用是抑制细胞分化，维持其幼稚状态，从而使一些诱导性的因素更易引起细胞的多样性变化。因为它具有这种调节细胞分化命运的能力，所以NOTCH与多个系统的组织发育有紧密的关系。
在哺乳动物胚胎的器官形成过程中，NOTCH受体与配体大量表达，并对三个胚层分化为各组织起到很重要的作用：内胚层（如胰腺）、中胚层（如造血系统、乳腺、脉管系统）、外胚层（如神经系统，口腔鼻腔上皮细胞）。此外，它还调节个体的组织发育。
非综合征性唇腭裂（NSCLP）是人类最常见的颅面部发育缺陷和出生缺陷之一。有研究表明NOTCH3基因上的rs12082位点的A等位基因频率与非综合征性唇腭裂（NSCLP)易患性呈现统计学相关性。
发明内容
本发明提供了用于检测NOTCH3基因rs12082基因型的试剂盒，检测结果能够用于非综合唇腭裂易患性的辅助分析。
本发明的第一个目的是提供用于检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的试剂盒，所述试剂盒包括引物对和PCR检测反应试剂；其中，所述引物对为（1）或（2）中的一种：
（1）上游引物：NOTCH3-F 5'- AATGGGAGCCAGGGCAGAT-3'
下游引物：NOTCH3-R 5'- GAAGAGAAAGTACCACTCAGGCAG-3'；
（2）与（1）中的互补序列。
上述引物的衍生序列也在本发明的保护范围，所述衍生序列为向5’端和/或3’端方向延伸一致数个碱基或删减一致数个碱基得到的序列。
作为优选，所述PCR检测反应试剂包括含EvaGreen 的Green-2-GoqPCRMastermix。
作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：
Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl
引物F（10μM） 0.1μl
引物R（10μM） 0.1μl
模板（50ng/μl） 0.5μl
ddH2O 4.3μl
总体积 10μl。
作为优选，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品为重组阴性质粒和重组阳性质粒，所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2。
本发明的第二个目的是提供一种检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的方法，步骤如下：
（1）构建重组阴性质粒和重组阳性质粒：所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2；
（2）构建PCR扩增时的引物对，所述引物对为a或b中的一种：
a、上游引物：NOTCH3-F 5'- AATGGGAGCCAGGGCAGAT-3'
下游引物：NOTCH3-R 5'- GAAGAGAAAGTACCACTCAGGCAG-3'；
b、与a中的互补序列；
（3）提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均使用步骤（2）所述引物，且在同一条件下进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；
作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃ 90s；60℃ 30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；
（4）根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型：
与重组阴性质粒的熔解曲线重合则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为GG；
与重组阳性质粒的熔解曲线重合则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为AA；
在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为GA。
作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：
Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl
引物F（10μM） 0.1μl
引物R（10μM） 0.1μl
模板（50ng/μl） 0.5μl
ddH2O 4.3μl
总体积 10μl。
作为优选，所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。
本发明的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，步骤如下：
（1）提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均使用相同引物，且在同一条件下进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；
所述HRM分析的条件为：94℃ 90s；60℃ 30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；
（2）根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型：
与重组阴性质粒的熔解曲线重合则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为GG；
与重组阳性质粒的熔解曲线重合则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为AA；
在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为GA。
本发明的第四个目的是提供上述试剂盒在制备辅助诊断非综合征唇腭裂的试剂中的应用。
本发明的试剂盒能够准确检测NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本发明的试剂盒对NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于辅助判断非综合征唇腭裂的易患性。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的HRM方法灵敏度实验结果。
图2为样本用本发明的HRM方法分析结果。
图3为样本的NOTCH3 rs12082（c.*837G>A）位点的测序结果；其中a代表野生型序列，b代表纯合突变型序列，c为杂合突变序列。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。本申请所用引物和所用序列合成及测序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
实施例1 NOTCH3 rs12082标准品的制备
要建立HRM分析方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守和特异性的序列，要保证反应的高特异性。本发明合成包含NOTCH3 rs12082（c.*837G>A）位点的野生型和纯合突变型DNA序列，利用基因重组技术将其克隆到pMD18-T载体中，构建出重组质粒pMD18-T-rs12082的野生型和纯合突变型重组质粒，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量后作为待建立方法的标准品：野生型重组质粒为重组阴性质粒，纯合突变型重组质粒为重组阳性质粒，为下一步的方法及评估奠定基础。
一、重组阴性质粒和重组阳性质粒pMD18-T-rs12082的构建和转化
1.合成NOTCH3 rs12082（c.*837G>A）野生型和纯合突变型DNA序列，本发明合成的序列250bp，序列如下：
（1）野生型序列
TGCCCCAGCCCCACCCTTGGCCATCTCCCTTTGGGAACTAGGGGGCTGCTGGTGGGAAATGGGAGCCAGGGCAGATGTATGCATTCCTTTGTGTCCCTGTAAATGTGGGACTACAAGAAGAGGAGCTGCCTGAGTGGTACTTTCTCTTCCTGGTAATCCTCTGGCCCAGCCTCATGGCAGAATAGAGGTATTTTTAGGCTATTTTTGTAATATGGCTTCTGGTCAAAATCCCTGTGTAGCTGAATTCCCA
（2）纯合突变型序列
TGCCCCAGCCCCACCCTTGGCCATCTCCCTTTGGGAACTAGGGGGCTGCTGGTGGGAAATGGGAGCCAGGGCAGATGTATGCATTCCTTTGTGTCCCTGTAAATGTGGGACTACAAGAAAAGGAGCTGCCTGAGTGGTACTTTCTCTTCCTGGTAATCCTCTGGCCCAGCCTCATGGCAGAATAGAGGTATTTTTAGGCTATTTTTGTAATATGGCTTCTGGTCAAAATCCCTGTGTAGCTGAATTCCCA
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
2.连接反应：将上述合成的DNA片段与pMD18-T进行连接，采用如下连接体系进行配制：
pMD18-T 1μL
DNA 2μL
SolutionI 5μL
ddH2O 2μL
总体积 10μL
配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。
3. pMD18-T-rs12082质粒的转化以及PCR鉴定
（1）从-80℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其解冻；
（2）取步骤2得到的连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；
（3）42℃水浴热激90秒，热激后立即置冰上冷却2min；
（4）于1.5ml EP管中加入预冷的1ml的不含抗性的LB液体培养基吹打混匀后，37℃ 120转/分轻摇培养90min；
（5）将上述培养液短暂离心吸去900μl后取剩余的100μl涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；
（6）从平板上挑取单克隆菌落于500μL Amp抗性LB液体培养基的1.5ml EP管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时；
（7）取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇；
（8）用引物NOTCH3-F和NOTCH3-R扩增上述稀释菌液，PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物鉴定阳性转化子。
引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：
上游引物：NOTCH3-F 5'- AATGGGAGCCAGGGCAGAT-3'
下游引物：NOTCH3-R 5'- GAAGAGAAAGTACCACTCAGGCAG-3' 。
体系如下：
10×PCR buffer 2μL
dNTP（2.5μM） 2μL
引物F（5μM） 1.5μL
引物R（5μM） 1.5μL
模板 2μL
Taq酶（5U） 0.5μL
ddH2O 10.5μL
总体积 20μL。
扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30sec，35个循环；72℃ 10min。
4.重组阴性质粒和重组阳性质粒的提取
采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取10μl纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
二、标准品的获取和定量
（1）将步骤一得到的冻存的含有重组质粒pMD18-T-rs12082的大肠杆菌DH5α 100μl接种于15ml氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃ 220rpm培养14-16h；
（2）采用北京百泰克生物科技有限公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒；
（3）利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可见分光光度计（ND5000）对提取的质粒测定浓度，根据A260/A280判断质粒的纯度。A260/A280=1.82。
实施例2 HRM-PCR检测NOTCH3 rs12082方法的建立
一、待测样本的制备
提取30例样本的外周血基因组DNA，用作NOTCH3基因PCR扩增的模板。具体提取方法为：
（1）取1ml全血，加入3ml TE，颠倒混匀后静置10min，8000rpm离心5分钟，弃上清液；
（2）重复上述步骤2-3次至沉淀为白色；
（3）加入900μl 10%SDS和10μl 10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h；
（4）将离心管冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，12000rpm离心10min；
（5）小心吸取上清后再加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，12000rpm离心10min；
（6）取上清，加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清；
（7）加500μl 70%的乙醇洗涤沉淀，短暂离心后弃上清，开盖干燥至乙醇完全挥发；
（8）加50μl双蒸水或TE溶解DNA中，-20℃保存。
二、特异性引物的设计与合成
本发明通过对NCBI数据库中NOTCH3 rs12082基因序列进行检索，选取适合设计引物的片段序列为靶目标，设计了一组HRM-PCR引物。
本发明选取的扩增序列如下：
其中标有下划线的碱基为基因突变位点。
该引物序列如下：
上游引物：NOTCH3-F 5’- AATGGGAGCCAGGGCAGAT-3’
下游引物：NOTCH3-R 5’- GAAGAGAAAGTACCACTCAGGCAG-3’。
扩增片段大小为：92bp。扩增的核苷酸序列为：
三、HRM-PCR反应体系和反应条件
分别以待测样本DNA、重组阴性质粒和重组阳性质粒为模板，以上述引物NOTCH3-F和NOTCH3-R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。
PCR反应体系：
Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl
引物F（10μM） 0.1μl
引物R（10μM） 0.1μl
模板（50ng/μl） 0.5μl
ddH2O 4.3μl
总体积 10μl。
其中引物采用NOTCH3-F和NOTCH3-R，HRM-PCR采用生工生物（上海），Green-2-GoqPCRMastermix试剂盒。HRM分析仪为百源基因ASA-9600实时荧光定量PCR仪。
PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环；
HRM分析：
94℃ 90s
60℃ 30sec
83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。
四、结果分析
根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型：
与重组阴性质粒的熔解曲线重合则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为GG；
与重组阳性质粒的熔解曲线重合则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为AA；
在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为GA。
五、灵敏度实验
将重组阳性质粒和重组阴性质粒均稀释至50ng/μl，然后二者混合进行梯度稀释，重组阳性质粒占比依次为50%、25%、12.5%、5%、2%和1%，按照上述HRM-PCR反应体系和参数进行扩增，分析突变检出范围，即灵敏度。
反应体系如下：
Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl
引物F（10μM） 0.1μl
引物R（10μM） 0.1μl
模板（50ng/μl） 0.5μl
ddH2O 4.3μl
总体积 10μl。
PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环；
HRM分析：
94℃ 90s
60℃ 30sec
83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。
结果见图1，实验数据显示，当重组阳性质粒与重组阴性质粒体积比分别为1:1、1:3、1:7、1:19、1:49时，能检测出重组阳性质粒，所以本发明的HRM检测方法的灵敏度为2%。
实施例3 应用本发明的检测方法检测样本基因突变
以实施例2步骤中的检测试剂盒和检测方法，对30例样本进行HRM分析，与重组阳性质粒和重组阴性质粒的熔解曲线对照比较，依此确定样本中的突变类型，并根据HRM分析结果针对每种基因型随机挑选1个样本在生工生物（上海）进行Sanger测序验证。
HRM分析结果参见表1和图2，数据显示30例样本中NOTCH3基因rs12082为G>A杂合突变型有7例，G>A纯合突变型4例，其余19例为野生型。
Sanger测序结果参见图3：其中a为样本编号1的测序结果，b为样本编号23的测序结果，c为样本编号15的测序结果；与本发明方法检测的结果完全一致。
表1 应用本发明的方法对样本的分析结果
实施例4 用于检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的试剂盒
本发明的用于检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的试剂盒包括以下组分：
（1）NOTCH3rs12082标准品：重组阴性质粒和重组阳性质粒，按照实施例1中的方法制备；
（2）引物：该引物序列为：
上游引物：NOTCH3-F 5'- AATGGGAGCCAGGGCAGAT-3'
下游引物：NOTCH3-R 5'- GAAGAGAAAGTACCACTCAGGCAG-3'；
（3）含有饱和荧光染料Eva Green的PCR扩增试剂。
应用该试剂盒检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的方法与实施例2相同。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州百源基因技术有限公司
<120> 用于检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的试剂盒
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgccccagcc ccacccttgg ccatctccct ttgggaacta gggggctgct ggtgggaaat 60
gggagccagg gcagatgtat gcattccttt gtgtccctgt aaatgtggga ctacaagaag 120
aggagctgcc tgagtggtac tttctcttcc tggtaatcct ctggcccagc ctcatggcag 180
aatagaggta tttttaggct atttttgtaa tatggcttct ggtcaaaatc cctgtgtagc 240
tgaattccca 250
<210> 2
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgccccagcc ccacccttgg ccatctccct ttgggaacta gggggctgct ggtgggaaat 60
gggagccagg gcagatgtat gcattccttt gtgtccctgt aaatgtggga ctacaagaaa 120
aggagctgcc tgagtggtac tttctcttcc tggtaatcct ctggcccagc ctcatggcag 180
aatagaggta tttttaggct atttttgtaa tatggcttct ggtcaaaatc cctgtgtagc 240
tgaattccca 250
<210> 3
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggaaatggg agccagggca gatgtatgca ttcctttgtg tccctgtaaa tgtgggacta 60
caagaagagg agctgcctga gtggtacttt ctcttcctgg taatcctctg gcccagcctc 120
atggcagaat agaggtattt ttaggctatt tttgtaatat ggcttctgg 169
<210> 4
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aatgggagcc agggcagatg tatgcattcc tttgtgtccc tgtaaatgtg ggactacaag 60
aagaggagct gcctgagtgg tactttctct tc 92

Claims (9)

1.用于检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物对和PCR检测反应试剂；其中，所述引物对为（1）或（2）中的一种：
（1）上游引物：NOTCH3-F 5'- AATGGGAGCCAGGGCAGAT-3'，
下游引物：NOTCH3-R 5'- GAAGAGAAAGTACCACTCAGGCAG-3'；
（2）与（1）中的互补序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR检测反应试剂包括含EvaGreen的Green-2-Go qPCRMastermix。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增时的反应体系为：
Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl
引物F（10μM） 0.1μl
引物R（10μM） 0.1μl
模板（50ng/μl） 0.5μl
ddH2O 4.3μl
总体积 10μl。
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品，所述标准品为重组阴性质粒和重组阳性质粒，所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表SEQ IDNo.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2。
5.一种检测NOTCH3基因SNP位点rs12082基因型的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）构建重组阴性质粒和重组阳性质粒：所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2；
（2）构建PCR扩增时的引物对，所述引物对为a或b中的一种：
a、上游引物：NOTCH3-F 5'- AATGGGAGCCAGGGCAGAT-3'
下游引物：NOTCH3-R 5'- GAAGAGAAAGTACCACTCAGGCAG-3'；
b、与a中的互补序列；
（3）提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均使用步骤（2）所述引物，且在同一条件下进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；
作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃ 90s；60℃ 30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；
（4）根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型：
与重组阴性质粒的熔解曲线重合则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为GG；
与重组阳性质粒的熔解曲线重合则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为AA；
在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为GA。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增时的反应体系为：
Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl
引物F（10μM） 0.1μl
引物R（10μM） 0.1μl
模板（50ng/μl） 0.5μl
ddH2O 4.3μl
总体积 10μl。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。
8.权利要求1-4任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤如下：
（1）提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均使用相同引物，且在同一条件下进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；
所述HRM分析的条件为：94℃ 90s；60℃ 30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；
（2）根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型：
与重组阴性质粒的熔解曲线重合则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为GG；
与重组阳性质粒的熔解曲线重合则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为AA；
在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型为GA。
9.权利要求1-4任一所述的试剂盒在制备辅助诊断非综合征唇腭裂的试剂中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016496A (zh) * 2019-03-22 2019-07-16 大连医科大学 利用荧光定量pcr法检测fut2基因类型的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070065865A1 (en) * 2005-09-08 2007-03-22 Affymetrix, Inc. Polymorphisms Associated with Coronary Artery Disease
CN103305594A (zh) * 2012-03-09 2013-09-18 上海市肺科医院 一种检测结核易感性的检测标靶、引物及试剂
CN103589785A (zh) * 2013-09-05 2014-02-19 谢小冬 Notch3和jag2基因snp位点的用途
CN104498611A (zh) * 2014-12-22 2015-04-08 西北农林科技大学 检测黄牛 Notch1 基因 SNP 位点的 RFLP 方法及试剂盒
CN105441545A (zh) * 2015-12-17 2016-03-30 苏州百源基因技术有限公司 一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070065865A1 (en) * 2005-09-08 2007-03-22 Affymetrix, Inc. Polymorphisms Associated with Coronary Artery Disease
CN103305594A (zh) * 2012-03-09 2013-09-18 上海市肺科医院 一种检测结核易感性的检测标靶、引物及试剂
CN103589785A (zh) * 2013-09-05 2014-02-19 谢小冬 Notch3和jag2基因snp位点的用途
CN104498611A (zh) * 2014-12-22 2015-04-08 西北农林科技大学 检测黄牛 Notch1 基因 SNP 位点的 RFLP 方法及试剂盒
CN105441545A (zh) * 2015-12-17 2016-03-30 苏州百源基因技术有限公司 一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REUBEN SABA ET AL.: ""A Functional SNP Catalog of Overlapping miRNA-Binding Sites in Genes Implicated in Prion Disease and Other Neurodegenerative Disorders"", 《HUMAN MUTATION》 *
张婷婷: ""中国西北人群NOTCH3，JAG2基因多态性与非综合征性唇腭裂的关联研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016496A (zh) * 2019-03-22 2019-07-16 大连医科大学 利用荧光定量pcr法检测fut2基因类型的方法

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