CN111549150A - 一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：P1‑F：5’‑GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAAC TCGCTTCAGGTTCAG‑3’；P1‑R：3’‑TTGTGAGCGGA TAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG‑5’；引物所扩增的目的片段长度为477bp；PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：Probe：5'‑FAM‑CCGTCTACACCCGGGCGCC‑TAMRA‑3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。该用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法灵敏度高，对于低浓度的克雷伯菌样品也能够准确检测出来，使用高特异性的引物和Taqman探针，保证准确的检出融合基因且假阳性低，全程监控。
Description
技术领域
本发明属于克雷伯菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法。
背景技术
肺炎克雷伯菌(Kpn)属于革兰氏阴性杆菌，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一，为呼吸道感染的重要病原体，对人的致病性较强，常引起重症肺炎，多发于住院的衰弱患者；当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或者小叶融合性实变，以上叶较为多见，病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。
传统的细菌检验方法主要通过涂片镜检和分离培养的方法对细菌生理化特征进行分类。涂片镜检的方法需要有丰富经验的技术工作者根据细菌形态、排列方式和染色性作出初步诊断，分离培养需要较长的时间才能进行结果判读，不利于及时诊断病原。患者有病情恶化蔓延的风险。荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、稳定性好、无污染、实时和准确等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。而传统的肺炎克雷伯氏菌检测方法具有检出率低、准确性低缺点。所以我们需要一款新型的用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：
P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；
P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为477bp；
PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：
Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
优选的，所述PCR反应液包括缓冲液、140-160μM dNTP 100μL、13-15μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl2溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶。
优选的，PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA 5μL。
优选的，PCR反应循环参数为：
先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。
优选的，所述阴性对照品为去核酸水。
优选的，所述阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板。
一种用于检测肺炎克雷伯菌方法，按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：样本细胞培养，培养条件为37℃、5％CO2；
步骤二：样本细胞核算提取，取待测样本2μL，加入相应5倍体积的DNA提取液，均匀混合后置于水浴锅中，以5℃/min的速率进行升温，达到60℃停止升温且放置30min，取出后震荡10min，然后再放入60℃的水浴锅中10min，取出后加入等体积的异丙醇，室温放置2min，12000rpm离心5min后弃上清，加入20μL无菌水溶解制得所述样品DNA，备用；
步骤三：逆转录，使用Promega GoScriptTM Reverse Transcriptase试剂盒，按照试剂盒说明书操作来获得cDNA；
步骤四：按照25μL体系来配置PCR检测液，分别获得阳性对照品、样本以及阴性对照品；
步骤五：荧光PCR检测，将阳性对照品、样本和阴性对照品放入PCR仪中进行检测，查看检测结果。
本发明的技术效果和优点：该用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法灵敏度高，对于低浓度的克雷伯菌样品也能够准确检测出来，使用高特异性的引物和Taqman探针，保证准确的检出克雷伯菌且假阳性低，全程监控。
附图说明
图1为本发明肺炎克雷伯菌检测的荧光扩增曲线，横坐标为阈值循环数Ct值，纵坐标为相对荧光值，其中1代表阳性对照，2和3为待测样品，4为阴性对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，阴性对照品为去核酸水，阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：
P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；
P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为477bp；
PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：
Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；
PCR反应液包括缓冲液、140μM dNTP 100μL、13μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl2溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶；
PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA 5μL；
PCR反应循环参数为：
先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。
实施例二：
一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，阴性对照品为去核酸水，阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：
P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；
P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为477bp；
PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：
Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；
PCR反应液包括缓冲液、140μM dNTP 100μL、14μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl2溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶；
PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA 5μL；
PCR反应循环参数为：
先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。
实施例三：
一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，阴性对照品为去核酸水，阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：
P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；
P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为477bp；
PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：
Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；
PCR反应液包括缓冲液、140μM dNTP 100μL、15μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl2溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶；
PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA 5μL；
PCR反应循环参数为：
先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。
实施例四：
一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，阴性对照品为去核酸水，阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：
P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；
P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为477bp；
PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：
Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；
PCR反应液包括缓冲液、150μM dNTP 100μL、13μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl2溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶；
PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA 5μL；
PCR反应循环参数为：
先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。
实施例五：
一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，阴性对照品为去核酸水，阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：
P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；
P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为477bp；
PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：
Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；
PCR反应液包括缓冲液、150μM dNTP 100μL、14μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl2溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶；
PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA 5μL；
PCR反应循环参数为：
先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。
实施例六：
一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，阴性对照品为去核酸水，阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：
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引物所扩增的目的片段长度为477bp；
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PCR反应循环参数为：
先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。
实施例七：
一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，阴性对照品为去核酸水，阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：
P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；
P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为477bp；
PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：
Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；
PCR反应液包括缓冲液、160μM dNTP 100μL、13μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl2溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶；
PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA 5μL；
PCR反应循环参数为：
先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。
实施例八：
一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，阴性对照品为去核酸水，阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：
P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；
P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为477bp；
PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：
Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；
PCR反应液包括缓冲液、160μM dNTP 100μL、14μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl2溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶；
PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA 5μL；
PCR反应循环参数为：
先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。
实施例九：
一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，阴性对照品为去核酸水，阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：
P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；
P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为477bp；
PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：
Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；
PCR反应液包括缓冲液、160μM dNTP 100μL、15μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl2溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶；
PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA 5μL；
PCR反应循环参数为：
先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。
实施例十：
按照本发明的一种人类腺病毒通用核酸检测试剂盒及其方法的另一实施例，其构成、组分以及条件与实施例一至七任一实施例相同，不同的是：
本实施例中检测顺序和要求非常重要，具体为一种人类腺病毒通用核酸检测方法，按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：样本细胞培养，培养条件为37℃、5％CO2；
步骤二：样本细胞核算提取，取待测样本2μL，加入相应5倍体积的DNA提取液，均匀混合后置于水浴锅中，以5℃/min的速率进行升温，达到60℃停止升温且放置30min，取出后震荡10min，然后再放入60℃的水浴锅中10min，取出后加入等体积的异丙醇，室温放置2min，12000rpm离心5min后弃上清，加入20μL无菌水溶解制得样品DNA，备用；
步骤三：逆转录，使用Promega GoScriptTM Reverse Transcriptase试剂盒，按照试剂盒说明书操作来获得cDNA；
步骤四：按照25μL体系来配置PCR检测液，分别获得阳性对照品、样本以及阴性对照品；
步骤五：荧光PCR检测，将阳性对照品、样本和阴性对照品放入PCR仪中进行检测，查看检测结果。
荧光定量PCR检测肺炎克雷伯菌方法的特异性验证：将肺炎克雷伯氏菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、溶血葡萄球菌菌液在LB培养基中37℃过夜培养，提取菌液基因组DNA。将提取的上述菌基因组DNA作为模板，灭菌去离子水作为阴性对照，进行Taqman探针法荧光定量PCR反应。结果显示，肺炎克雷伯氏菌模板扩增曲线呈S行，Ct值为16，屎肠球菌、粪肠球菌、金黄色葡糖球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、溶血葡萄球菌及阴性对照无扩增曲线，结果与预期一致。
检测肺炎克雷伯菌的试剂盒的应用：发明人收集50例培养的待测菌液，用上述实施例的检测方法进行荧光PCR检测，结果为50例样品中有15例含有雷伯菌。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中包括样品DNA提取液、克雷伯菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照品、阴性对照品，PCR反应液中用于DNA扩增反应的引物序列如下：
P1-F：5’-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3’；
P1-R：3’-TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为477bp；
PCR反应液中用于荧光信号检测的探针序列如下：
Probe：5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液包括缓冲液、140-160μM dNTP 100μL、13-15μM Taq DNA聚合酶50μL、标准的MgCl2溶液混合物以及防止PCR过程受污染的UNG酶。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：PCR反应体系为25μL，包括PCR反应液19.7μL、Taq酶0.3μL样品DNA5μL。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法，其特征在于：PCR反应循环参数为：
先经过50℃，2min的UNG反应，然后95℃，10min；进入循环阶段，再95℃变性15sec，60℃退火30sec，共反应45个循环。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法，其特征在于：所述阴性对照品为去核酸水。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测肺炎克雷伯菌的试剂盒和方法，其特征在于：所述阳性对照品为克雷伯菌标准阳性模板。
7.一种根据权利要求1所述的用于检测肺炎克雷伯菌方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：样本细胞培养，培养条件为37℃、5％CO2；
步骤二：样本细胞核算提取，取待测样本2μL，加入相应5倍体积的DNA提取液，均匀混合后置于水浴锅中，以5℃/min的速率进行升温，达到60℃停止升温且放置30min，取出后震荡10min，然后再放入60℃的水浴锅中10min，取出后加入等体积的异丙醇，室温放置2min，12000rpm离心5min后弃上清，加入20μL无菌水溶解制得所述样品DNA，备用；
步骤三：逆转录，使用Promega GoScriptTM Reverse Transcriptase试剂盒，按照试剂盒说明书操作来获得cDNA；
步骤四：按照25μL体系来配置PCR检测液，分别获得阳性对照品、样本以及阴性对照品；
步骤五：荧光PCR检测，将阳性对照品、样本和阴性对照品放入PCR仪中进行检测，查看检测结果。
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| CN113621722A (zh) * | 2021-08-17 | 2021-11-09 | 汉唐和元(武汉)科技有限公司 | 一种猪源肺炎克雷伯菌检测试剂盒及应用 |
| CN115369179A (zh) * | 2022-10-08 | 2022-11-22 | 深圳盛源生物技术有限公司 | 一种用于快速检测kpc-2的试剂盒及方法 |
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