CN111074009B - 一种快速检测2019-nCoV复制试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测2019‑nCoV复制试剂盒，选择2019‑nCoV复制后核酸的两个位点进行检测，其中包括一个2019‑nCoV特异性位点，大大提高了检测的精确性；缩短了检测时长，快速检测时间低至1h左右。特异性高，与其感染部位相同或感染症状相似且常见的其它病原体及人类白细胞的总核酸无交叉反应。仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线和熔解曲线，根据两者实现即时结果的判断，能较好的诊断处于潜在复制的病毒，检测结果可用于病程进展分析及临床辅助诊断，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测2019-nCoV复制试剂盒及应用。
背景技术
新型的冠状病毒感染患者临床表现为发热、乏力等全身症状，伴有干咳，呼吸困难等，该病毒引发的肺炎可迅速发展为重症肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克、多器官功能衰竭、严重酸碱代谢紊乱等，甚至危及生命。2020年1月12日被世界卫生组织命名为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。
目前，实验室检测方法目前主要有病毒分离、核酸检测等。在本发明之前，有关病毒检测试剂主要对病毒进行定性的分析，对病毒的复制涉猎较少，难以诊断处于潜在复制的病毒，且难以开展病程进展分析。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供了一种快速检测2019-nCoV复制试剂盒及应用，用于新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸的复制检测。本试剂盒采用实时荧光PCR技术和SYBR水解荧光探针技术在同一反应管中实现一种或多种病原体在核酸水平上的定性检测，操作简单，全程不开盖减少污染，检测后无活性病毒残余，具有一定的生物安全性。仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，和熔解曲线，根据两者实现即时结果的判断，能较好的诊断处于潜在复制的病毒，检测结果可用于病程进展分析及临床辅助诊断，具有重要的应用价值。
具体技术方案如下：
本发明的目的之一是提供一种快速检测2019-nCoV复制试剂盒。
包括两对引物：引物1与引物2；
其中，引物1为针对2019-nCoV特异性位点设计的引物；
所述的引物1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为ATGGCAGACGGGCGATTT；
所述的引物1的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为TTTTGGGGTAAGTAACCACAAGTAGT；
所述的引物2的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为TACTATTAAGTGTTTGCCTAGGTTCTTTA；
所述的引物2的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为AAAACACCTAAAGCAGCGGTTGAGT。
以上方向均为5’-3’。
引物1的目的基因如SEQ ID NO.5所示，其相应的DNA基因片段为2019-nCoV的特异性逆转录片段；
引物2的目的基因如SEQ ID NO.6所示，在已知基因中，其相应的通过逆转录获得的DNA基因片段仅存在于2019-nCoV与下述基因组：
严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株(WIV05 Severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2isolate WIV05,complete genome)；
蝙蝠冠状病毒分离株RaTG13(Bat coronavirus isolate RaTG13,completegenome)；
蝙蝠SARS样冠状病毒分离株Bat-SL-CoVZXC21(Select seq MG772934.1BatSARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZXC21,complete genome)；
急性呼吸综合征冠状病毒2分离株BetaCoV/huanzhou/IPBCAMS-WH-(Severeacute respiratory syndrome coronavirus 2isolate BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-)；
蝙蝠SARS样冠状病毒分离株Bat-SL-CoVZC45(Select seq MG772933.1Bat SARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZC45,complete genome)。
进一步，试剂盒还包括PCR反应体系、阳性对照与阴性对照。
其中，所述的PCR反应体系包括SYBR水解荧光探针、DNA聚合酶与DNA聚合酶缓冲液；引物1或引物2添加于所述的PCR反应体系中；
所述的阳性对照包括引物1与引物2分别针对的两段2019-nCoV的逆转录片段，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6所示；即为引物1与引物2的目的基因；
所述的阴性对照为人cDNA。
进一步，试剂盒还包括样本处理液，所述的样本处理液包括苯酚、氯仿与异戊醇。所述的苯酚为Tris饱和酚。
本发明的另一个目的是公开上述试剂盒在2019-nCoV检测中的应用。
进一步，采用qRT-PCR扩增检测。
以AB Applied Biosystems，StepOne Real-Time PCR System为例，选择2-△△CT法；荧光染料设置，选择SYBR(或none，根据机器选择)；
数据分析：引物1与引物2扩增的体系的Ct值区间应同时≤30，可判断为阳性；检测精度：至少可低至100拷贝。
熔解曲线：最高峰应在75℃-85℃，如果其他位置出现峰值且高于75℃-85℃处峰值，可判断为阴性。
本发明的有益效果如下：
(1)检测2019-nCoV复制后核酸情况，为病程进展提供参考资料。
(2)操作简单，减少了交叉污染的可能，所用到的试剂种类少，价格低。
(3)大大缩短了检测时长，快速检测时间低至1h左右。
(4)特异性高。选择2019-nCoV复制后核酸的两个位点进行检测，其中包括一个2019-nCoV特异性位点，大大提高了检测的精确性；特异性高，与其感染部位相同或感染症状相似且常见的其它病原体(冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒HKUI型、冠状病毒NL63型、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、博卡病毒、鼻病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌)以及人类白细胞的总核酸无交叉反应。
(5)检测后无活性病毒残余，具有一定的生物安全性。
(6)经相关医院检测验证，效果好。
附图说明
图1为程序设置界面；
图2为实施例1中检测1的阳性结果扩增曲线；
图3为实施例1中检测1的阳性结果熔解曲线；
图4为实施例1中检测2的阳性结果扩增曲线；
图5为实施例1中检测2的阳性结果熔解曲线。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种快速检测2019-nCoV复制试剂盒，其组成成分如下表所示：
其中，样本处理液包括体积比为25：24：1的Tris饱和苯酚、氯仿与异戊醇。
qRT-PCR反应液I由引物1正、反向引物各10Pmol以及PCR反应体系组成，所述的PCR反应体系包括1×SYBR水解荧光探针、1×PCR buffer、150μmol/L dNTP、2.5mmol/L Mg2+和2.0U DNA聚合酶。
其中，引物1的正向引物RT1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为ATGGCAGACGGGCGATTT；引物1的反向引物RT1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为TTTTGGGGTAAGTAACCACAAGTAGT(方向均为5’-3’)；
引物1的目的基因如SEQ ID NO.5所示，其相应的DNA基因片段为2019-nCoV的特异性逆转录片段；
qRT-PCR反应液II由引物2正、反向引物各10Pmol以及PCR反应体系组成，其PCR反应体系与qRT-PCR反应液I相同。
其中，引物2的正向引物RT2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为TACTATTAAGTGTTTGCCTAGGTTCTTTA；引物2的反向引物RT2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为AAAACACCTAAAGCAGCGGTTGAGT(方向均为5’-3’)；
引物2的目的基因如SEQ ID NO.6所示，在已知基因中，其相应的通过逆转录获得的DNA基因片段仅存在于2019-nCoV与下述基因组：
严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离株(WIV05 Severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2isolate WIV05,complete genome)；
蝙蝠冠状病毒分离株RaTG13(Bat coronavirus isolate RaTG13,completegenome)；
蝙蝠SARS样冠状病毒分离株Bat-SL-CoVZXC21(Select seq MG772934.1BatSARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZXC21,complete genome)；
急性呼吸综合征冠状病毒2分离株BetaCoV/huanzhou/IPBCAMS-WH-(Severeacute respiratory syndrome coronavirus 2isolate BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-)；
蝙蝠SARS样冠状病毒分离株Bat-SL-CoVZC45(Select seq MG772933.1Bat SARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZC45,complete genome)。
阳性对照包括引物1与引物2分别针对的两段2019-nCoV的逆转录片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6所示；
阴性对照为人cDNA；
本实施例中的试剂盒的检测原理如下：
本试剂盒采用实时荧光PCR技术和水解探针技术在同一反应管中实现一种或多种病原体在核酸水平上的定性检测，操作简单，全程不开盖减少污染，检测后无活性病毒残余，具有一定的生物安全性。仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线和熔解曲线，根据两者实现即时结果的判断。本试剂盒内设置有阳性对照。建议对待测祥本的采集、运输和提取过程中进行密切监控，避免检测结果的假阴性或假阳性。
上述试剂盒的储存条件及有效期如下：
样品处理液：避光常温保存；qRT-PCR反应液：-20℃贮存，反复冻融5次对效期没有影响；试剂盒的有效期为12个月；
上述试剂盒的适用仪器为AB Applied Biosystems、StepOne Real-Time PCRSystem、ABI7500、QuantStudio、Roche LightCyeler*480、Bio-RadCFX96、上海宏石SLAN-96P/S等荧光定量PCR仪。
实施例2
使用实施例1中的试剂盒进行2019-nCoV检测，具体方法如下：
(1)样本处理：取咽拭子、鼻咽抽取物、痰液、支气管灌洗液或肺泡灌洗液3ml，或可直接加到含3ml Trizol的10ml试管中，彻底混匀静置2min以上；可冷藏于-20℃。
取上述液体100μl，加入样本反应液200μl，混匀后12000rpm离心5min；
取上清液1μl，加99μl超纯水混匀。
(2)加样：使用加样器每管20μL：分别取qRT-PCR反应液I(检测1)、qRT-PCR反应液II(检测2)各19μL加入2个不同的管中，然后各加入样本1微升(阳性或阴性对照)，盖紧管盖，瞬时低速离心。
(3)qRT-PCR扩增检测：以AB Applied Biosystems，StepOne Real-Time PCRSystem为例，选择2-△△CT法；
荧光染料设置，选择SYBR(或none，根据机器选择)；
程序设置：95℃-5min，1个循环；95℃-15s，60℃-50s-35个循环；95℃-60℃进行熔解曲线分析。
程序设置界面见图1。
(4)数据分析：
Ct值：检测1、检测2的Ct值区间应同时≤30，可判断为阳性；检测精度：至少低至100拷贝。
熔解曲线：最高峰应在75℃-85℃，如果其他位置出现峰值且高于75℃-85℃处峰值，可判断为阴性。
检测1(反应液I)的阳性检测结果见图2-3；图2为检测1的扩增曲线，图3为检测1的熔解曲线；
检测2(反应液II)阳性检测结果见图4-5；图4为检测2的扩增曲线，图5为检测2的熔解曲线。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 滨州医学院
<120> 一种快速检测2019-nCoV复制试剂盒及应用
<141> 2020-03-10
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggcagacg ggcgattt 18
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ttttggggta agtaaccaca agtagt 26
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<212> DNA
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tactattaag tgtttgccta ggttcttta 29
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<211> 25
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<213> Artificial Sequence
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aaaacaccta aagcagcggt tgagt 25
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<212> DNA
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catggcagac gggcgatttt gttaaagcca cttgcgaatt ttgtggcact gagaatttga 60
ctaaagaagg tgccactact tgtggttact taccccaaaa t 101
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<212> DNA
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attataattt ggtttttact attaagtgtt tgcctaggtt ctttaatcta ctcaaccgct 60
gctttaggtg ttttaatgtc taatttaggc atgc 94
Claims (6)
1.一种快速检测2019-nCoV复制试剂盒，其特征在于，包括两对引物：引物1与引物2；
所述的引物1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
所述的引物1的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
所述的引物2的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；
所述的引物2的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.根据权利要求1所述的快速检测2019-nCoV复制试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应体系、阳性对照与阴性对照。
3.根据权利要求2所述的快速检测2019-nCoV复制试剂盒，其特征在于，
所述的PCR反应体系包括SYBR水解荧光探针、DNA聚合酶与DNA聚合酶缓冲液；引物1或引物2添加于所述的PCR反应体系中；
所述的阳性对照包括引物1与引物2分别针对的两段2019-nCoV的逆转录片段，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO. 5与SEQ ID NO. 6所示；
所述的阴性对照为人cDNA。
4.根据权利要求1-3任一项所述的快速检测2019-nCoV复制试剂盒，其特征在于，还包括样本处理液，所述的样本处理液中包括苯酚、氯仿与异戊醇。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的快速检测2019-nCoV复制试剂盒在2019-nCoV检测中的非诊断应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，使用qRT-PCR检测，当引物1与引物2扩增的体系的Ct值区间同时≤30，且熔解曲线的最高峰均位于75℃-85℃时，判断为2019-nCoV阳性。
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| 15例COVID-19患者治疗后痰、粪便标本新型冠状病毒核酸检测结果比较;李宝林等;《中国感染控制杂志》;20200309;239-244 * |
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