CN104059981A - 一种frm1基因cgg序列重复的检测方法及应用 - Google Patents
一种frm1基因cgg序列重复的检测方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种FRM1基因CGG序列重复的检测方法及应用。其特征在于，其包括如下实现步骤：设计了两对引物，内参引物和检测引物，一对内参引物位于CGG重复区的5’端，另外一对检测引物跨越整个CGG重复区。当此检测引物覆盖区域内的CGG重复数在0至200之间，会扩增出一条（470+3n）bp（n为CGG重复数）的片段；当此检测引物覆盖区域内的CGG序列重复数超过200时，实验条件限制反应，扩增不出任何的片段的；此技术在同一个反应体系中同时扩增两条不同的产物，根据和DNA标记之间的比对来鉴定样本基因型。本发明的方法可用于检测FRM1基因CGG序列重复，可以辅助快速方便地查出脆性X染色体综合征致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断、阻止患儿出生，降低脆性X综合症的发病率。
Description
技术领域
本发明属生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，聚合酶链式反应。
背景技术
FMR1基因位于X染色体的q27.3，序列长度约38kb，由17个外显子和16个内含子组成，编码脆性X智力残疾基因蛋白（FMRP）。FMR1基因是一个高度保守的基因，其5’端外显子上的非翻译区内有一个（CGG）n三核苷酸串联重复序列，（CGG）n片段在重复模式上存在多态性，并且可以遗传，在其上游大约250bp处有一个CpG岛。正常FMR1基因（CGG）n中n的数值介于7至54之间。当n增加到54至200时，携带者表型虽正常，但在传代过程中易发生进一步扩展，这种FMR1基因的突变称为FMR1基因的前突变。前突变的FMR1基因中的CpG岛一般不甲基化，FMR1基因具有正常的转录和蛋白质水平，不表现出临床症状。当n扩展达200以上时，男性表型100%表现为典型的脆性X染色体综合征（Fragile X Syndrome），女性中也有30%-50%表型表现轻重程度不等的智力残疾（Martin-Bell 综合征），这种FMR1基因的突变称全突变。前突变至全突变的扩展是严格母系的遗传，全突变（CGG）n重复序列大量扩展，引起FMR1基因5’端CGG序列重复区一侧的CpG岛异常甲基化，使FMR1基因失，导致FMRP的缺失引起智力残疾。
FMR1基因突变可以导致脆性X染色体综合征，是智力残疾的主要因素之一。脆性X染色体综合征是一种发病率仅次于先天愚型的遗传性智能低下综合征，发病率占全部儿童的0.05%，呈X连锁遗传，占X连锁智能低下的40%。其外显率因性别不同有差异，男性80%，女性30%。95%以上的脆性X染色体综合征患者发病的分子遗传学基础是FMR1基因（CGG）n结构扩展的动态突变引起的，约5%以下则是由于FMR1基因的错义突变和缺失型突变影响了FMRP的正常结构导致的。脆性X染色体综合征发病率高，临床表现复杂，遗传规律明确，目前无有效的治疗方法，要降低其发病率，关键是查出携带者及病人，然后通过遗传咨询、产前诊断、阻止患儿出生。
目前针对FMR1基因的检测方法主要为RFLP连锁分析、DNA杂交分析、PCR扩增等方法，但是由于FMR1基因CGG序列重复区和CpG岛中高含量的CG使FMR1基因的DNA解链以及引物的延伸都变得非常困难。
鉴于以上的问题，一种可操作性更强的检测方法的发明是一种趋势的。
发明内容
本发明要解决的技术问题主要是：
FMR1基因其5’端外显子上的非翻译区CGG序列重复区和CpG岛中有高含量的CG，这使FMR1基因的DNA解链以及引物延伸变得非常困难，这使得针对FMR1基因的PCR扩增和测序反应的一次成功率很低，失败率高。
已有的报道中所采用的检测方法是采用一种针对高GC含量的PCR扩增方法，但是，针对CG含量如此高的序列在实际操作中并不容易实现，失败的几率非常高，不能开发为针对FMR1基因中CGG序列重复数的稳定检测手段。
为了解决以上问题，本发明技术提供了一种检测FRM1基因CGG序列重复的方法，其包括如下实现步骤：
在FMR1基因CGG序列重复区设定一对内参引物：正向引物F和反向引物M，扩增的片段作大小约为220bp，用于验证PCR反应是可行的和为计算CGG序列重复数提供基准。
所述扩增的内参引物序列为：
SEQ NO.1 F：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’
SEQ NO.2 M：5’-CGCTGCGGGTGTAAACACTGAAACCACGTC -3’
在FMR1基因CGG序列重复区下游设定一对引物：正向引物F1和反向引物R，扩增片段大小约为（470+3n）bp（n代表CGG重复数），用于确定CGG序列重复数所在的区域。
所述扩增的反向引物序列为：
SEQ NO.3 F1：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’
SEQ NO.4 R：5’-AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA -3’
所述具体处理步骤如下：
（1）DNA 提取，取200μL DNA样本溶液用试剂盒提取DNA，采用核酸分析仪或分光光度计进行DNA浓度及纯度鉴定；
（2）反应体系的配置，在每一个反应孔中加入一定的反应体系；
（3）按一定的程序进行扩增；
（4）电泳检测扩增结果。
所述反应体系以下：
所述按以下程序进行扩增：
95℃ 10min；
80℃ 8min；
向每个反应孔中加入5.0U的DNA扩增酶；
95℃ 45sec → 58℃ 1min → 72℃ 4min，10 个循环；
95℃ 15sec → 58℃ 1min → 72℃ 5min，20 个循环。
所述电泳检测扩增结果步骤如下：
配1.5％琼脂糖凝胶，取9μL扩增的产物与10倍浓度上样缓冲液混匀后上样，同时在相邻泳道中加入DNA标记，120V 电泳30min，紫外判断PCR 结果
（1）在同一泳道出现两条条带，一条在DNA标记220处，另一条在DNA标记220和640bp之间，则表明样本的CGG序列重复数小于54，样本结果为正常；
（2）在同一泳道出现两条条带，一条在DNA标记220处，另一条在DNA标记640和1077bp之间，则表明样本的CGG序列重复数在54和200之间，样本结果为前突变；
（3）在同一泳道出现一条条带，这条条带在DNA标记220处。样本结果为全突变。
（4）非阴性样本的扩增产品在同一泳道未任何条带出现时，表明DNA提取出现问题，需要重新进行试验。
本发明的有益效果是：此技术在同一个反应体系中同时扩增两条不同的产物，定性鉴定样本CGG序列重复数量。而且扩增片段长度适中，扩增条件范围宽泛，使用仪器简单。
附图说明
图1 为本发明所诉两对引物所在位置的示意图；
图2 为本发明不同CGG序列重复结果的电泳示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
如图1 所示，本发明为了解决以上问题，设计了一对内参引物：正向引物F和反向引物M，扩增的片段作大小约为220bp，用于验证PCR反应是可行的和计算CGG重复数的基准。
FMR1基因CGG序列重复区下游设定一对检测引物，正向引物F1和反向引物R，扩增片段大小约为（470+3n）bp（n代表CGG重复数），用于确定CGG序列重复数所在的区域。
SEQ NO.1 F：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’
SEQ NO.2 M：5’-CGCTGCGGGTGTAAACACTGAAACCACGTC -3’
SEQ NO.3 F1：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’
SEQ NO.4 R：5’-AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA -3’
具体处理步骤如下：
1、样本4份，都已经使用“DNA 提取-PCR 扩增- 测序”的技术方法对FRM1基因CGG重复数测序检测，四个待检样本分别为：
1号样本：CGG序列的重复数在7至54之间，为正常样本；
2号样本：CGG序列的重复数在54至200之间，为前突变样本；
3号样本：CGG序列的重复数在200以上，为全突变样本；
4号样本：没有任何DNA残留的阴性样本
2、检材的基因组DNA 提取
使用市场上销售的针对血样采集卡进行DNA抽提的试剂盒进行DNA提取，提取后采用核酸分析仪或分光光度计进行DNA浓度及纯度鉴定。
3、扩增和扩增产物的检测分析
3.1 PCR 扩增体系：
3.2 PCR 扩增程序：
95℃ 10min；
80℃ 8min；
向每个反应孔中加入5.0U的DNA扩增酶；
95℃ 45sec → 58℃ 1min → 72℃ 4min，10 个循环；
95℃ 15sec → 58℃ 1min → 72℃ 5min，20 个循环。
4、电泳分析扩增产物结果步骤如下：
配1.5％琼脂糖凝胶，取9μL扩增的产物与10倍浓度上样缓冲液混匀后上样，同时在相邻泳道中加入DNA标记，120V 电泳30min，紫外判断PCR 结果
5、结论
本发明分型结果清晰可判读，如图2 所示。
1号样本：在1号泳道出现两条条带，一条条带大小在DNA标记220bp处，另一条条带大小在DNA标记220bp和640bp之间，则表明样本的CGG序列重复数小于54，样本结果为正常；
2号样本：在2号泳道出现两条条带，一条条带大小在DNA标记220bp处，另一条条带大小在DNA标记640bp和1077bp之间，则表明样本的CGG序列重复数在54和200之间，样本结果为前突变；
3号样本：在3号泳道出现一条条带，这条条带条带大小在DNA标记220bp处。表明为全突变。
4号样本：在4号泳道中未任何出现条带，表明反应体系没有收到相关DNA的污染。
与测序方法相比较：对同一来源的样本的相同基因分型结果是一致的。
与传统的测序法比，结果直观，一次成功率高。所使用试剂为市场销售的通用试剂。
<110> 上海中优医药高科技有限公司
<120>一种FRM1基因CGG序列重复的检测方法及应用
<160>4
<210>1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于FMR1基因序列扩增的正向引物。
<400>1
cgacctgtca ccgcccttca gccttcc 27
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于FMR1基因序列扩增的反向引物。
<400>2
agccccgcac ttccaccacc agctcctcca 30
<210>3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于FMR1基因序列扩增的内参正向引物。
<400>3
cgacctgtca ccgcccttca gccttcc 27
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于FMR1基因序列扩增的内参反向引物。
<400>4
cgctgcgggt gtaaacactg aaaccacgtc 30
Claims (9)
1.一种FRM1基因CGG序列重复的检测方法及应用，其特征在于，其包括如下实现步骤：
设计了两对引物，内参引物以及检测引物，一对内参引物位于CGG重复区的5’端；另外一对检测引物跨越整个CGG重复区；
所述扩增的内参引物序列为：
SEQ NO.1 F：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’
SEQ NO.2 M：5’-CGCTGCGGGTGTAAACACTGAAACCACGTC -3’
所述扩增的检测引物序列为：
SEQ NO.3 F1：5’-CGACCTGTCACCGCCCTTCAGCCTTCC -3’
SEQ NO.4 R：5’-AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA -3’。
2.根据权利1所述的FRM1基因序列CGG重复的检测方法，检测的引物可以采用相同或不同的荧光染料标记。
3.根据权利要求1 所述的FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于: 所述方法的具体处理步骤如下：
（1）DNA 提取，取200μL DNA样本溶液用试剂盒提取DNA，采用核酸分析仪或分光光度计进行DNA浓度及纯度鉴定；
（2）反应体系的配置，在每一个反应孔中加入一定的反应体系；
（3）按一定的程序进行扩增；
（4）电泳检测扩增结果。
4. 根据权利要求3 所述的FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）反应体系如下：
10×扩增缓冲液 5.0 ul；25mM Mg2+ 4.0 ul；10mM dATP 1.0 ul；10mM dTTP 1.0 ul；10mM dCTP 1.0 ul；10mM dGTP 1.0 ul；10mM 7-deza-dGTP 2.0 ul；二甲亚砜 3.0 ul；引物（SEQ NO.1 20 pmol/ul） 1.5 ul；引物（SEQ NO.2 20 pmol/ul） 1.0 ul；引物（SEQ NO.3 20 pmol/ul） 2.0 ul；无菌水 30.0 ul；模板DNA（10 ng/ul）2.0 ul。
5. 根据权利要求3 所述的检测FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）
按以下程序进行扩增：
95℃ 10min；
80℃ 8min；
向每个反应孔中加入5.0U的DNA扩增酶；
95℃ 45sec → 58℃ 1min → 72℃ 4min，10 个循环；
95℃ 15sec → 58℃ 1min → 72℃ 5min，20 个循环。
6. 根据权利要求3 所述的检测FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于：所述电泳检测扩增结果步骤如下：配1.5% 琼脂糖凝胶，取9μL 扩增的产物与10 倍浓度上样缓冲液混匀后上样，120V 电泳30min，紫外判断PCR 结果。
7. 根据权利要求3 所述的检测FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征还在于通过凝胶电泳、毛细电泳等电泳方法分析样本中FRM1基因序列CGG重复和拷贝数。
8. 根据权利要求3 所述的检测FRM1基因序列CGG重复的检测方法，其特征在于：结果判读的标准如下
（1）在同一泳道出现两条条带，一条条带大小在DNA标记220bp处，另一条条带大小在DNA标记220bp和640bp之间，则表明样本的CGG序列重复数小于54，样本结果为正常；
（2）在同一泳道出现两条条带，一条条带大小在DNA标记220bp处，另一条条带大小在DNA标记640bp和1077bp之间，则表明样本的CGG序列重复数在54和200之间，样本结果为前突变；
（3）在同一泳道出现一条条带，这条条带大小在DNA标记220bp处；样本结果为全突变；
（4）在同一泳道未任何条带出现时，表明DNA提取出现问题，需要重新进行试验。
9. 根据权利要求1 ～ 8任一项所述的检测方法在检测FRM1基因序列CGG序列重复数中应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 200444, building 4, block E, 3100 Hu Tai Road, Shanghai, Yangpu District Applicant after: Shanghai Zhongyou Medicine High-tech Co., Ltd. Address before: 200433, room 11, 705-706 Cathay Pacific Road, Shanghai, Yangpu District Applicant before: Shanghai Zhongyou Medicine High-tech Co., Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 200433 YANGPU, SHANGHAI TO: 200444 YANGPU, SHANGHAI |
|
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140924 |