JP6585117B2 - 胎児の染色体異数性の診断 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、一般に、さまざまな核酸配列間のアンバランスを判断することによる胎児の染色体異数性の診断検査に関し、より特定的には、血液などの母体サンプルを検査することによって１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体および／またはＹ染色体において異数性を特定することに関する。

発明の概論
異数性とは、染色体（または染色体の一部）の数が異常であることを指し、先天性欠損の一般的原因である。異数性では、遺伝子はコピーが３つある場合（「トリソミー」）、またはコピーが１つしかない場合（「モノソミー」）がある。減数分裂中の染色体の不分離によって起こるこれらの染色体数の変化は、罹患した人に対して著しい影響を及ぼし、周知の症候群をもたらす。トリソミーおよびモノソミーの大半は、胎児を死に至らせ、自然流産または出生直後の死亡を引起す。しかし、いくつかの異数性は存立し得て、症候群をもたらす。生児出生の中で最も多く発生する異数性は、２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体トリソミーおよび性染色体の数の歪みである。乳児が生き延びることができる最も一般的な常染色体異数性は、２１トリソミー（ダウン症候群）であり、これは８００回の出生のうち１回の割合で発症する。１８トリソミー（エドワード症候群）は、６，０００回の出生のうち１回の割合で発症し、１３トリソミー（パトー症候群）は、１０，０００回の出生のうち１回の割合で発症する。性染色体異数性（ＳＣＡ）は、４００人の新生児のうち１人の割合で発症し、したがって全体としてダウン症候群よりもよく起こる。ＳＣＡはさまざまな性染色体の異常を含むが、群を抜いてよく発生するＳＣＡは、Ｘ染色体の欠失（４５，Ｘ−ターナー症候群）またはＸもしくはＹ染色体の付加（４７，ＸＸＹ−クラインフェルター症候群、４７，ＸＹＹ、４７，ＸＸＸ）である。これらの症状のうち、ターナー症候群のみが、容易に特定可能な物理的表現型をもたらす。しかし、ほとんどのタイプのＳＣＡにおいてわずかな言語障害および学習障害が認められてきた。異数性の最も重要な危険因子は母体年齢である。なぜなら、異数性を患う子供の大半が３５歳以上の母親の子として生まれており、そのため出産を遅らせることを選択する女性または出産を遅らせる必要がある女性が多くなるにつれて、罹患率が増加しているためである。現代の出生前スクリーニングプログラムは、通常、よく起こる胎児の２１番、１８番および１３番染色体異数性を含んでいる。妊娠のリスクは、いくつかの手段によって評価される。染色体異数性については、超音波検査に基づく非侵襲的なスクリーニング検査および母体血清におけるマーカーの測定が、妊娠の最初の３ヶ月（第１１〜１４週）において高リスク妊娠を特定するために実施されてきた。ソノグラムは、赤ちゃんの首の後ろに沿って皮膚の下の流体を測定し、これは項部浮腫測定（nuchal translucency：ＮＴ）と呼ば
れる。また、ソノグラムは、赤ちゃんの鼻骨が存在するか否かも判断する。全ての妊娠した女性の血液に見られる遊離βヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）および妊娠関連血漿タンパク質−Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）と呼ばれる２つの血清マーカーを分析するために、母体血液サンプルが用いられる。異数性妊娠では、赤ちゃんの首の後ろに余分な流体があり、および／または、ｈＣＧおよびＰＡＰＰ−Ａの結果が平均よりも高いかまたは低い。加えて、染色体異常を伴う妊娠の中には、赤ちゃんの鼻骨がない場合もある。年齢に関連するリスクをＮＴ測定、鼻骨データおよび血液マーカーと組合わせることにより、ダウン症候群のリスク値および１３トリソミーまたは１８トリソミーの１つのリスク値が提供される。第一期のスクリーンの検出率は約９０％であり、赤ちゃんがダウン症候群を患う妊娠の偽陽性率は５％であり、１３トリソミーまたは１８トリソミーを伴う妊娠ではいくぶん高い。項部浮腫測定ソノグラムは、ｈＣＧおよびＰＡＰＰ−Ａを測定することなく実施可能
である。しかし、この場合には、異数性検出率は約７０％に減少する。

出生前診断は、産科業務の不可欠な部分である。出生前に遺伝子診断を行うためには、まだ生まれていない胎児からの遺伝物質が必要である。従来から、胎児のＤＮＡは、羊水穿刺または絨毛膜標本採取などの侵襲的手順によってサンプリングされる。これらの手順は、それぞれ０．５％および１〜２％の流産のリスクを伴う。したがって、異数性リスクのスクリーニングを受ける全ての女性のうちの約５〜１０％に相当する、異数性リスクが高いと推定される妊娠のために、当該侵襲的診断手順を取っておくことが普通である。従来の出生前診断の手順に関連するリスクを考慮して、胎児の遺伝子解析を非侵襲的に行うことができれば理想的であろう。したがって、非侵襲的な出生前診断を行うために、胎児に害を及ぼすことなく胎児の遺伝物質のソースが必要とされる。この目的に対する主な打開策は、ロー等（１９９７）^１および母体血漿中の浮動性胎児ＤＮＡの存在について記載したＷＯ９８／３９４７４によって報告された。それらは、後に、胎児由来ＤＮＡが母体血漿中の浮動性ＤＮＡの〜１０％を占めることを示した。胎児のＤＮＡは、受胎後数週間は母体血漿中に検出されることができ、分娩後数時間以内に母体血漿から急速に除去されて消失する。その結果、母体血漿中の浮動性胎児ＤＮＡは、非侵襲的な出生前検査の開発のための胎児遺伝物質の前途有望なソースである。しかし、胎児のＤＮＡは、血漿中の浮動性ＤＮＡ全体のわずかな部分に相当するに過ぎず、ＤＮＡの残りの部分は母親によって占められ、主に母体の白血球に由来する。

膨大な可能性を考慮して、過去１０年の間に、異数性検出のためのいくつかの非侵襲的手法が説明されてきた。１つの方法は、母体血漿中で胎児特異的である核酸分子の分析に焦点を当て、それによって背景の母体のＤＮＡが引起す干渉を克服するというものである。対象の染色体から生じる胎盤発現ｍＲＮＡまたは胎盤特異的なエピジェネティックシグネチャーの検出がターゲットにされ得る。２０００年以来の一連の開発の中で、出生前診断ツールとしての血漿ＲＮＡの基準が確立されてきた。プーン等（２０００）^２は、Ｙ染色体から転写されるｍＲＮＡが、男性胎児を妊娠している女性の血漿中に検出され得ることを示した。後に、胎盤は、一例としてヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのためのヒト胎盤性ラクトゲンｍＲＮＡおよびｍＲＮＡコーディングを用いた母体血漿中の胎児由来ＲＮＡの主なソースであることが示された^３。

２００７年に、２１番染色体に位置する遺伝子から転写される胎盤特異ｍＲＮＡ、すなわちＰＬＡＣ４が、マイクロアレイベースのアプローチを用いて特定され、母体血漿中で検出可能であり、胎児の分娩後に除去されることが分かった^４。母体血漿中のＰＬＡＣ４
ｍＲＮＡを用いて２１番染色体の用量を求めるために、ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子比率アプローチが用いられた。この方法は、ＰＬＡＣ４遺伝子のコーディング領域にＳＮＰが存在することに基づいている。胎児がこのＳＮＰに対してヘテロ接合である場合、胎児はＤＮＡ配列によって区別可能な２つの対立遺伝子を有している。胎児が正倍数体である場合、これら２つのＳＮＰ対立遺伝子の比率は１：１である。逆に、胎児が２１トリソミーを患っている場合、ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子比率は１：２または２：１になるであろう。ロー等（２００７）^４は、胎児の２１番染色体トリソミー状態を非侵襲的に判断するためにこの方策を適用できることを証明した。同様に、ＲＮＡ−ＳＮＰアプローチは、ＳＥＲＰＩＮＢ２ ｍＲＮＡの対立遺伝子比率の分析による１８トリソミーの非侵襲的検出にも適用された。

しかし、ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子比率アプローチの主な制約は、分析されるＳＮＰに対してヘテロ接合である胎児のみを上手く診断できることである。例えば、ＰＬＡＣ４における単一のＳＮＰを用いた場合、約４５％の胎児がヘテロ接合であり、そのためこのアプローチを用いて診断可能であると予想される。その結果、診断範囲が全体に及ぶようにするためにはいくつかのマーカーが必要である。この目的のために、数人の研究者は、こ
のアプローチを用いて分析可能な新たな多型ＳＮＰマーカーについて説明してきた。１つの予備報告書は、アメリカの一般大衆の９５％までをカバーする複合ヘテロ接合率を有する１０個のマーカーについて説明している^６。大規模な臨床試験でのこれらのマーカーの評価が、今後数年にわたって期待される。

対象の胎児の染色体から生じるＤＮＡメチル化などの胎盤特異的なエピジェネティックシグネチャーについても調査されてきた。身体の組織はさまざまな遺伝子発現プロファイルを有しているので、特定の遺伝子のメチル化状態は、組織特異的なパターンも示す。母体血漿中の胎児のＤＮＡが胎盤から生じ、母体ＤＮＡ背景が母体の血球に由来することを証拠は示している。したがって、エピジェネティックな胎児ＤＮＡマーカーを開発する１つの方法は、メチル化状態が胎盤組織と母体の血球との間で異なる遺伝子を特定するというものである。チム等（２００５）^７は、ＳＥＲＰＩＮＢ５（マスピン）プロモータのメチル化プロファイルを研究し、それが胎盤組織においては低メチル化されるが母体の血球においては高メチル化されることを示した。メチル化特異的なＰＣＲを用いて、母体血漿中の母体由来の高メチル化分子から、胎盤由来の低メチル化ＳＥＲＰＩＮＢ５を検出し、区別することができる。これにより、１８番染色体に位置するＳＥＲＰＩＮＢ５、すなわち胎児の性別および遺伝子型に関わらず全ての妊娠に用いることができる初めての普遍的な循環胎児ＤＮＡマーカーが作られた。ＳＥＲＰＩＮＢ５遺伝子は１８番染色体に位置しているので、ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子比率アプローチに類似の方策、すなわちいわゆるエピジェネティックな対立遺伝子比率アプローチの開発を可能にした。したがって、胎児がＳＥＲＰＩＮＢ５のプロモータ領域に位置するＳＮＰに対してヘテロ接合である場合、遺伝子の低メチル化バージョンにおけるＳＮＰ対立遺伝子の比率を測定することにより、胎児の１８トリソミー状態の把握が可能になる。

しかし、メチル化特異的なＰＣＲは、非メチル化シトシンをウラシルヌクレオチドに変質させる亜硫酸水素塩変換の使用を必要とする。しかし、亜硫酸水素塩変換は、サンプル中のＤＮＡ分子の９５％までを分解するため、母体血漿サンプル中の胎児のＤＮＡの量を実質的に減少させ、偽陰性検出を発生させる恐れがある。その結果、研究者は、亜硫酸水素塩変換の必要なく母体血漿中で検出可能な胎児のエピジェネティックなマーカーを開発した。この目的のために、チャン等（２００６）^８は、胎盤組織においては高メチル化されるが母体の血球においては低メチル化される、３番染色体に位置するＲＡＳＳＦ１のプロモータを用いた。その結果、母体の血球に由来する低メチル化ＲＡＳＳＦ１配列は、メチル化感受性制限酵素消化を用いて母体血漿から取除くことができる。実際、制限酵素消化後、胎児のＲＡＳＳＦ１配列は、分娩前には母体血漿中で検出可能であるが、分娩後２４時間以内に母体血漿から完全に消失する。チャン等（２００６）^９は、５４人の妊娠初期のＲｈＤ陰性の女性について、非侵襲的な出生前胎児ＲｈＤ血液型判定において胎児のＤＮＡを検出するための陽性対照として、ＲＡＳＳＦ１プロモータの特異なメチル化パターンを用いた。

ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子比率アプローチおよびＤＮＡメチル化アプローチは、分子の態様で母体血漿中に存在する核酸分子のサブセットをターゲットにしている。代替例は物理的方法を用いるものであり、これは、母体血漿中に存在する胎児のＤＮＡの相対的な濃縮をもたらす。

最近になって^９、母体血漿中の浮動性胎児ＤＮＡの長さが、母体由来の浮動性ＤＮＡよりも〜２０ｂｐだけ短いことが分かった。したがって、ゲル電気泳動などのサイズ分画法により、血漿ＤＮＡのサイズ分画およびより短い胎児ＤＮＡ断片の濃縮が可能になる。このアプローチは、浮動性胎児ＤＮＡを濃縮するために上手く用いられてきた。このアプローチは、疾患を引起す突然変異、例えばβサラセミアを引起す突然変異の定性的検出には有用であることが実験的に分かったが、染色体用量の定量的測定を必要とする胎児の染色
体異数性の検出にとって濃縮度合いが十分であり得るか否かはまだ分かっていない。ダラン等（２００６）^１０は、母体血漿中の胎児のＤＮＡの濃縮のための別のアプローチを報告した。彼らは、母体血漿中の母体由来の浮動性ＤＮＡのかなりの部分が瀉血後に母体の白血球によって放出されると仮定した。したがって、ホルムアルデヒドを用いて母体の有核血球を固定できれば、この母体血漿中の胎児のＤＮＡの希釈を回避できる、ということが提案された。ダラン^１０は、６０人の妊娠している女性を含む実験において胎児ＤＮＡ平均割合が３４％であることを示す、２１トリソミーの非侵襲的な出生前診断のためのこのアプローチの利点を証明した。しかし、いくつかの他のグループは、ホルムアルデヒド処理の有益な効果を再現することができなかった。

上記のアプローチは、母体血漿中の胎児のＤＮＡの分画濃度が低いことにより、胎児の染色体異数性の直接検出を追及することが困難になるという想定に基づいている。これは、例えばリアルタイムＰＣＲによって胎児のＤＮＡの検出を循環させるための従来の方法の精度が限られていることに基づいている。最近になって単一分子カウンティング技術を利用できるようになったことで、母体血漿中の胎児特異的な核酸に分析を限定する必要なく胎児の異数性の検出が可能になっている。デジタルＰＣＲも大規模並列シークエンシングも単一分子カウンティング法であり、これらは、分子をカウントすることによって核酸の定量化を可能にし、従来のＰＣＲベースの検出方法と比較して優れた分析精度を有している。デジタルＰＣＲとは、各ＰＣＲが一般に単一の標的分子を含むかまたは標的分子を含まない複数のＰＣＲを並列に実行することを指す。増幅の終了時に陽性反応の数をカウントすることにより、入力された標的分子の数を求めることができる。したがって、それらは、異数性染色体に由来するＤＮＡ分子の総量（母体対胎児）のわずかな増加を正確に定量化することができる。実際、ロー等（２００７）^１１は、トリソミーＤＮＡがわずかな（１０％）部分として存在している場合であっても異数性状態の検出が可能であることを証明した。胎児ＤＮＡ濃度が低くなるにつれて、異数性染色体ＤＮＡの量の期待増加量は小さくなる。デジタルＰＣＲでは、行われるＰＣＲ分析の数が増えるにつれて定量的な精度が向上する。ロー等（２００７）^１１は、胎児のＤＮＡを２５％含む母体血漿サンプルにおいて胎児の２１トリソミーを正確に検出するには、約８０００回のデジタルＰＣＲを行う必要があり、臨床の現場で自動プラットフォームを用いる必要があることを示した。マイクロ流体工学を用いたこのような自動プラットフォームは、入手可能である（例えばフリューダイム社）が高価である。いくつかのグループは、胎児の２１トリソミーの非侵襲的な検出が大規模並列または次世代シークエンシングを用いることにより実現可能であることを証明した（例えばＷＯ２００９／０１３４９６）。大規模並列シークエンサは、各運転において数百万〜数十億個のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の分析を可能にする。したがって、アイデンティティに加えて、分析されるサンプル中のＤＮＡ分子の度数分布を得ることができる。母体血漿中の浮動性ＤＮＡは事実上断片化しているので、各ＤＮＡ分子の染色体起点を特定し、場合によっては異数性の染色体に由来する分子の割合を求めるために母体血漿中の浮動性ＤＮＡを直接用いることができる。いくつかのグループは、２１トリソミー胎児を妊娠している女性の血漿中の２１番染色体ＤＮＡ分子の割合が正倍数体妊娠のものと比較して高くなることを示した。このアプローチは、小さな妊娠群の中で母体血漿から胎児の２１トリソミーを直接検出する場合に非常に正確であった。

最近になって、上記の方法を適用する２つの臨床検証研究が行われた。１つの研究では、４４９人のサンプルが分析され、そのうち３９人が２１番染色体についてトリソミーであった^１２。第２の研究では、侵襲的な出生前手順を受ける前にアメリカの１３個の臨床場所で収集されたリスク妊娠状態の１０１４人からの血液サンプルが分析された^１３。これらのうち、１１９人のサンプルが大規模並列ＤＮＡシークエンシングを受けた。シークエンシング処理された５３人のサンプルが、異常な胎児核型を有していると正しく分類された。臨床検証研究は両方とも、優れた感度および特異性を示した。これらのデータは、血漿ＤＮＡシークエンシングが胎児の２１トリソミーの非侵襲的な検出のための実行可能
な方法であり、より大規模な多施設研究での臨床検証を保証することを証明している。

一方、２１番染色体よりもＧＣ含有率が高いかまたは低い染色体に由来する配列の比例量の測定はロバストではないことが分かった。したがって、１８番染色体および１３番染色体の測定は、それほど正確ではなく、２１トリソミープロトコルを用いて定量的バイアスを受けることになる。そのため、信頼性のある１８トリソミーおよび１３トリソミーの非侵襲的検出を実現するためには、染色体ＧＣ含有率の影響をそれほど受けないシークエンシングおよびデータ分析プロトコルを開発し、さらに有効化する必要がある。最近の研究は、非反復マスク化リファレンスゲノムおよびバイオインフォマティクスアプローチを用いてシークエンシングデータにおけるＧＣ含有率バイアスを補正することにより上記の問題を部分的に解決した^１４。このアプローチを用いて、全ての１３トリソミー胎児（２５人のうち２５人）を９８．９％の特異性で検出し、１８トリソミー胎児の９２％（３７人のうち３４人）を９８．０％の特異性で検出した。これらのデータは、適切なバイオインフォマティクス分析により、母体血漿ＤＮＡシークエンシングによる１３トリソミーおよび１８トリソミーの非侵襲的な出生前診断が２１トリソミーほど信頼性のあるものではないことを示している。

また、大規模並列シークエンシングのコストは高く、処理量は低い。運転当たりに分析できる事例はわずかに過ぎず、数日間かかる。処理量がより高い、費用対効果がより高いプロトコルを開発するためにはさらなる研究が必要である。

最近になって、より効率的かつ費用対効果の高い大規模並列シークエンシングアプローチを得るために標的濃縮が用いられるようになった^１５。この研究では、血漿ＤＮＡから選択されたゲノム領域を濃縮する際の適用可能性およびこのアプローチの定量的性能が調査された。当該実験は、濃縮されたサンプルの平均配列カバレージが、濃縮されていないサンプルのものよりも〜２００倍高く、より重要なことに、母体ＤＮＡ分子と胎児ＤＮＡ分子とが均等に濃縮されることを示した。さらに、ＳＮＰデータを用いることによって、著者は、標的領域内の胎児特異的な対立遺伝子のカバレージが３．５％から９５．９％に上昇することを示すことができた。概して、母体血漿ＤＮＡの標的シークエンシングは、効率的かつバイアスのない胎児対立遺伝子の検出を可能にし、母体血漿サンプル中の胎児のＤＮＡの割合を測定するための有力な方法である。この１つの学術論文に基づいて、標的濃縮は、シークエンシングコストを大幅に下げることができるので非常に有望である。同時に、標的濃縮には余分な濃縮ステップが必要であり、これによって、最終検査に余分なコストが追加されることになり、典型的な濃縮プロトコルが完了までに約２４〜３６時間かかるので検査を遅らせることにもなる。

発明の概要
本発明は、シークエンシング技術との併用で、少なくとも１つのＳＮＰを含む特定のＤＮＡ配列（すなわち標的）の多重ＰＣＲベースの増幅を組合わせることによる、２１番染色体および／または１８番染色体および／または１３番染色体および／またはＸ染色体および／またはＹ染色体の異数性検出のための非侵襲的診断ＤＮＡ検査を提供する。

別の局面において、本発明は、シークエンシング技術との併用で、少なくとも１つのＳＮＰを含む特定のＤＮＡ配列（すなわち標的）の多重ＰＣＲベースの増幅を組合わせることによる、２１番染色体および１８番染色体および１３番染色体およびＸ染色体およびＹ染色体の異数性検出のための非侵襲的診断ＤＮＡ検査を提供する。

簡潔に言うと、本発明は、母体遺伝物質と胎児遺伝物質との混合物において標的配列の
予め定められた組を分別検出する方法に向けられる。したがって、本明細書に記載されている方法および材料は、母親および胎児の双方からのＤＮＡの混合物である、浮動性ＤＮＡを含む生体サンプル（好ましくは血清または血漿）に含まれる数多くの核酸を分析し、正倍数体胎児と三倍体胎児との間の統計的有意差の検出を可能にするための技術を適用する。特に１３番染色体について十分な感度および特異性を実現しない、ゲノム全体または濃縮されたサンプルに基づく現在の大規模並列シークエンス方法とは対照的に、本発明は、１３番、１８番、２１番、ＸおよびＹ染色体異数性を同時検出する場合に特異性および感度が１００％に近い（それぞれ、特異性が９９．９９％、感度が９９．５％）非侵襲的な診断分析を提供する。本発明を特定の理論または説明に限定することなく、非侵襲的な診断異数性検査の開発の際に多重ＰＣＲがこれまで検討されなかった１つの理由は、特に１３番染色体に、ＧＣを多量に含んでいる領域が存在するからである。さらに別の理由は、ＵＳ２０１０／０１１２５９０において、主要な発明者のうちの１人（すなわちデニス・ロー）が多重ＰＣＲの使用を思いとどまらせたからである。実際、最近の出願の１１６〜１１７段落において、例えば本発明の方法によって行われる標的増幅などの遺伝子座依存的な分析ではなく、遺伝子座独立的な分析を適用することが推奨されている。

したがって、１つの局面において、本発明は、上記母体生体サンプルからの浮動性ＤＮＡに存在する胎児の核酸および母体の核酸を含む生体サンプルにおいて胎児異数性の有無を判断し、定量的な（すなわち、増幅されたＤＮＡが元のテンプレートＤＮＡ比率を再現しているようにテンプレートＤＮＡを増幅する）多重ＰＣＲ反応において、標的ＤＮＡ配列の選択された組を増幅し、上記増幅された標的ＤＮＡ配列の選択された組のＤＮＡシークエンシングを行って、上記ＤＮＡ配列の配列を求め、得られた配列データを用いて、上記母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの混合物中の少なくとも１つの第１の染色体に由来する増幅された配列の量と、上記母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの混合物中の少なくとも１つの第２の染色体に由来する増幅されたＤＮＡ配列の量とを比較する方法であって、上記少なくとも１つの第１の染色体は、胎児において正倍数性であると推定され、上記少なくとも１つの第２の染色体は、胎児において異数性であることが疑われ、それによって上記胎児異数性の有無を判断する方法を提供する。

別の局面において、本発明は、上記母体生体サンプルからの（浮動性ＤＮＡなどの）胎児の核酸および母体の核酸を含む生体サンプルにおいて胎児異数性の有無を判断し、定量的な多重ＰＣＲ反応において、標的ＤＮＡ配列の選択された組を増幅する方法であって、妊娠している女性が、インフォーマティブであると考えられる少なくとも１つのＳＮＰに対してヘテロ接合である場合に、各々の増幅されたＤＮＡ配列はこのＳＮＰを含み、上記増幅された標的ＤＮＡ配列の選択された組のＤＮＡシークエンシングを行って、上記ＤＮＡ配列の配列を求め、得られた配列データを用いて、上記母体由来ＤＮＡと胎児由来ＤＮＡとの混合物中の少なくとも１つの第１の染色体に由来するインフォーマティブなＳＮＰを担持する増幅された配列の量と、上記母体由来ＤＮＡと胎児由来ＤＮＡとの混合物中の少なくとも１つの第２の染色体に由来するインフォーマティブなＳＮＰを担持する増幅されたＤＮＡ配列の量とを比較する方法であって、上記少なくとも１つの第１の染色体は、胎児において正倍数性であると推定され、上記少なくとも１つの第２の染色体は、胎児において異数性であることが疑われ、それによって上記胎児異数性の有無を判断する、および／または、上記求められたＤＮＡ配列においてインフォーマティブなＳＮＰの対立遺伝子比率を求める方法であって、対立遺伝子比率の歪みは、上記妊娠している女性に胎児の染色体異数性が存在することを示す、方法を提供する。

正倍数体胎児と比較したときのトリソミー胎児の用量指数（Dosage Quotients：ＤＱ）を示す図であって、網掛けされている領域は、胎児のＤＮＡの期待パーセンテージを示す。 マイナー対立遺伝子頻度（Minor Allele Frequency：ＭＡＦ）当たりに表示される、所与の数のインフォーマティブなＳＮＰを最小限生成するために必要なＳＮＰの数を示す図であって、９９％の最小確率で計算がなされる。 ダウン症候群（２１トリソミー）ＤＮＡサンプル（四角）および４個の正倍数体ＤＮＡサンプル（円）における２１番染色体についての期待される正規化読取カウント対観察された正規化読取カウントのグラフである。 ２個のＡＴＰサンプル（２０％の２１トリソミーに相当）のＤＮＡサンプル（四角）および４個の正倍数体ＤＮＡサンプル（円）についての期待される正規化読取カウント対観察された正規化読取カウントのグラフである。 ＭＡＳＴＲ分析手順の第１の多重ＰＣＲ反応の概略図であって、逆方向および順方向プライマは、アンプリコン特異的なプライマであり、組込むためにＭＡＳＴＲ分析手順の第２のＰＣＲ反応において用いられるタグ１およびタグ２は、普遍的シークエンシングである。 ＭＡＳＴＲ手順の第２のＰＣＲ反応の概略図であって、このステップにおいて、ＭＩＤ配列（バーコード）ならびに（４５４エマルジョンＰＣＲのための）ＡおよびＢアダプタが、第１のＰＣＲ反応から、結果として生じるアンプリコンに組込まれる。

発明の詳細な説明
先行技術は、浮動性ＤＮＡベースの異数性検査のための分析プラットフォームとしての大規模並列シークエンシングの実現可能性を示してきた。しかし、現行のプロトコルは、分子診断ツールとして用いられる場合には検査が高価になり、かつ、処理量が低くなる。この主な理由は、現行の検査が浮動性ＤＮＡの全ゲノムシークエンシングに基づいており、その結果、莫大なシークエンシングデータセットが生成され、そのうちのわずかな部分（〜５％）のみが胎児の倍数性状態を判断するために用いられるという事実のためである。この全ゲノムアプローチにより、大規模並列シークエンサの容量のかなりの部分を用いなければならず、その結果、シークエンシングが運転当たり限られた数の個体に対して行われ、完了するのに数日間かかることになる。さらに、個体当たり莫大なシークエンシングデータセットが生成され、効率的なデータ記憶および分析を妨げる。

本発明は、多重ＰＣＲベースのアプローチを用いていくつかの選択された染色体領域を増幅することによって、この問題に対する解決策を提供する。選択された染色体領域は、異数性であると推定される１つ以上の染色体から多重ＰＣＲ反応において増幅され、染色体領域の選択された組は、正倍数体であると推定される１つ以上の染色体から、好ましくは同一の多重ＰＣＲ反応において増幅される。さらに、本明細書では、正倍数体であると推定される染色体は「基準染色体」と称される。

したがって、本発明は、第１の実施の形態において、妊娠している女性において胎児の染色体異数性を検出する方法であって、ｉ）上記妊娠している女性から生体サンプルを受取るステップと、ｉｉ）上記生体サンプルから核酸を調製するステップと、ｉｉｉ）定量的な多重ＰＣＲ反応において、標的ＤＮＡ配列の選択された組を増幅するステップとを備え、妊娠している女性が、インフォーマティブであると考えられる少なくとも１つのＳＮＰに対してヘテロ接合である場合、少なくとも１つの増幅されたＤＮＡ配列はこのＳＮＰを含み、上記方法はさらに、ｉｖ）増幅された標的ＤＮＡ配列のシークエンシングを行うステップと、ｖ）胎児の染色体異数性の存在を示すセットスコアを統計的方法によって求めるために、基準染色体の全ての増幅されたＤＮＡ配列についての読取カウントの合計に対して、疑わしい染色体異数性の全ての増幅されたＤＮＡ配列についての読取カウントの合計を計算し、続いて正規化を行う、および／または、インフォーマティブなＳＮＰの対立遺伝子比率を求めるステップとを備え、対立遺伝子比率の歪みは、上記妊娠している女性に胎児の染色体異数性が存在することを示す、方法を提供する。

本明細書において用いられる「生体サンプル」という用語は、被験者（例えば妊娠している女性または妊娠している婦人）から採取される任意のサンプルを指し、対象の１つ以上の核酸分子を含む。

したがって、生体サンプルは、例えば血液、痰、尿、脳脊髄液（cerebrospinal fluid
：ＣＳＦ）、涙、血漿、血清、唾液または経頸部洗浄液を含む。

「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、および一本鎖もしくは二本鎖の形態のそのポリマーを指す。特に限定のない限り、当該用語は、基準核酸と類似の結合特性を有し、かつ、天然のヌクレオチドと類似の態様で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変された変形体（例えば縮重コドン置換体）、対立遺伝子、相同分子種、ＳＮＰ、および相補配列、ならびに明示的に示される配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合基および／またはデオキシイノシン残渣と置換される配列を生成することによって実現され得る。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、小分子非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、および遺伝子または遺伝子座によってコードされる短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と交換可能に用いられる。

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。「遺伝子」という用語は、コード領域の前後の領域（リーダおよびトレーラ）、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。本明細書において用いられる「反応」という用語は、対象の特定のポリヌクレオチド配列の有無を示す化学作用、酵素作用または物理作用を伴う任意のプロセスを指す。「反応」の一例は、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）、好ましくは多
重ＰＣＲ反応などの増幅反応である。「反応」の別の例は、合成またはライゲーションによるシークエンシング反応である。本明細書において用いられる「臨床的に関連のある核酸配列」という用語は、アンバランスの可能性が検査されているより大きなゲノム配列のセグメントまたはそのより大きなゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列を指し得る。例としては、１８番染色体、１３番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体が挙げられる。さらに他の例としては、胎児がその両親のうちの片方または両方から受け継ぐ可能性のある突然変異遺伝子配列または遺伝的多型またはコピー数のバリエーションが挙げられる。本明細書において用いられる「背景核酸配列」という用語は、母親から生じる核酸配列または特定の分析において異数性を検査されない染色体から生じる核酸配列を指し得る。

「浮動性ＤＮＡ」という用語は、ゲノムＤＮＡに由来するＤＮＡであり、浮動性ＤＮＡは、実際には、分解されたゲノムＤＮＡであり、細胞外の空間で生じる。したがって、浮動性ＤＮＡは、体液（例えば血清、血漿、痰）から分離可能である。本明細書において用いられる「定量的データ」という用語は、１つ以上の反応から得られ、かつ、１つ以上の数値を提供するデータを意味する。本明細書において用いられる「パラメータ」という用語は、定量的データセットおよび／または定量的データセット間の数値的関係を特徴付ける数値を意味する。例えば、第１の量の第１の核酸配列と第２の量の第２の核酸配列とのの比率（または比率の関数）がパラメータである。

本明細書において用いられる「カットオフ値」という用語は、生体サンプルについての２つ以上の分類状態（例えば罹患状態と非罹患状態との）間を仲裁するために用いられる数値を意味する。例えば、パラメータがカットオフ値よりも大きい場合には、定量的デー
タの第１の分類がなされ（例えば罹患状態）、またはパラメータがカットオフ値未満である場合には、定量的データの異なる分類がなされる（例えば非罹患状態）。

本明細書において用いられる「アンバランス」という用語は、ある量の臨床的に関連のある核酸配列における、少なくとも１つのカットオフ値によって規定される、基準量からの任意の相当なずれを意味する。

本明細書において用いられる「染色体異数性」という用語は、二倍体ゲノムからの染色体の定量的な量の変化を意味する。当該変化は、獲得または喪失であり得る。当該変化は、１つの染色体全体または染色体のある領域に関係し得る。染色体異数性の例は、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体に由来する。

本明細書において用いられる「ランダムシークエンシング」という用語は、シークエンシング処理される核酸断片を、シークエンシング手順以前は具体的に特定していなかった、または対象にしていなかったシークエンシングを指す。ランダムシークエンシングが適用される場合、特定の遺伝子座を対象にするための配列特異的なプライマは必要とされない。シークエンシング処理される核酸のプールは、サンプルによって異なり、さらに同一のサンプルでは分析によって異なる。ランダムシークエンシングにおいて、シークエンシング処理された核酸のアイデンティティは、多重ＰＣＲ増幅ヌクレオチド配列のシークエンシングとは対照的に、生成されたシークエンシング出力からのみ明らかにされる。

本発明の実施の形態は、臨床的に関連のある染色体領域の増加または減少（罹患状態）が非罹患状態と比較して存在するか否かを判断するための方法、システムおよび装置を提供する。この判断は、生体サンプル内の他の臨床的に関連のない染色体領域（背景領域）に対する臨床的に関連のある染色体領域の量のパラメータを用いることによってなされ得る。ゲノムの一部がシークエンシング処理されるように生体サンプルの核酸分子がシークエンシング処理され、当該量は当該シークエンシングの結果から求められ得る。例えば２つの染色体領域（または領域の組）の量の比率に関して、基準量と比較した変化が存在するか否か（すなわちアンバランス）を判断するために、１つ以上のカットオフ値が選択される。

基準量に検出される変化は、他の臨床的に関連のない配列に対する臨床的に関連のある核酸配列の関係における（上方向または下方向の）任意のずれであり得る。したがって、基準状態は、（例えば１対１の対応関係以外の）任意の比率または他の量であり得て、変化を示す測定された状態は、１つ以上のカットオフ値によって決定される、基準量とは異なる任意の比率または他の量であり得る。

臨床的に関連のある染色体領域（臨床的に関連のある核酸配列または疑わしい異数性染色体もしくは染色体領域とも呼ばれる）および背景核酸配列は、第１のタイプの細胞および１つ以上の第２のタイプの細胞によってもたらされ得る。例えば、胎児／胎盤細胞から生じる胎児の核酸配列は、母体細胞から生じる母体の核酸配列の背景を含む母体血漿などの生体サンプルに存在している。優先的には、母体の核酸配列および胎児の核酸配列は、浮動性ＤＮＡに由来する。１つの実施の形態において、カットオフ値は、少なくとも一部には、生体サンプル中の第１のタイプの細胞のパーセンテージに基づいて決定される。なお、サンプル中の胎児配列のパーセンテージは、いかなる胎児由来の遺伝子座によっても決定され得て、臨床的に関連のある核酸配列の測定に限定されるものではない。

別の実施の形態において、本発明の方法は、妊娠している女性から受取られる生体サンプルに存在する核酸の調製に細胞（例えば血球）安定化薬品を用いる。実際、母体血液からの浮動性胎児ＤＮＡを用いる際の主な技術的課題のうちの１つは、サンプルに存在する
胎児のＤＮＡの割合が低いことである。この割合は一般に、異数性ＤＮＡ検査が最も良く行われる段階に相当する妊娠第一期（第１１〜１４週）においては１０〜２０％である。このように胎児のＤＮＡの割合が低いことは、分子カウンティング法の場合でさえ、検査の感度および特異性に関して困難な状況である。したがって、胎児／母体の浮動性ＤＮＡの比率を最大化することが重要である。本発明は、この問題に対するさまざまな解決策を提供する。

特定の実施の形態において、生物材料、特に血漿分離前の母体血液サンプルの収集、保管または輸送中は、有核血球の分裂を防止する。これは、胎児のＤＮＡの希釈を防止し、その結果、胎児／母体の浮動性ＤＮＡの比率の減少を防止するために重要である。少なくとも１４日間にわたって室温で血球を安定化させ、好都合なサンプル収集、輸送および保管を可能にするいくつかの市販の細胞安定化血液収集管が入手可能である（例えばwww.streck.comで入手可能）。

さらに別の特定の実施の形態において、母体の核酸および胎児の核酸を調製するために本発明の方法においてサイズ分画が用いられる。

実際、先行技術は、胎児の浮動性ＤＮＡと母体の浮動性ＤＮＡとが異なるサイズ分布を有することを示している。胎児の浮動性ＤＮＡは一般に、母体の浮動性ＤＮＡよりも２０ｂｐだけ短く、この観察結果は、この小さなサイズの部分が母体部分から特に分離される場合に胎児の浮動性ＤＮＡ部分をさらに濃縮させるために用いられ得る。これを達成する１つの方法は、ゲル電気泳動によるものである。特定の実施の形態において、セージサイエンス社（www.sagescience.com）によって販売されるゲル電気泳動ベースのサイズ分画
装置が用いられる。この装置は、厳格なサイズ選択および高い回収率を可能にする、完全に自動化されたシステムである。さらに、サイズ分画プロセス全体にわたって全てのサンプルが互いに分離されるので、この装置は二次汚染リスクを完全に排除する。

特定の実施の形態において、本発明の方法における定量的な多重ＰＣＲ反応において得られる増幅されたＤＮＡ配列は、塩基対が８０〜１４０個のサイズを有する。胎児の浮動性ＤＮＡ集団および母体の浮動性ＤＮＡ集団のサイズ分布を考慮して、増幅されたＤＮＡ配列長さを１４０ｂｐ未満に保って、より短い胎児の浮動性ＤＮＡ部分の効率的な増幅を確実にすることが不可欠である。

好ましい増幅されたＤＮＡ配列長さは、塩基対が８０〜１４０個である。
さらに別の実施の形態において、１回の単一の多重ＰＣＲ反応において得られる増幅されたＤＮＡ配列は３０〜６０個である。

さらに別の実施の形態において、１回の単一の多重ＰＣＲ反応において得られる増幅されたＤＮＡ配列は６０〜８０個である。

さらに別の実施の形態において、１回の単一の多重ＰＣＲ反応において得られる増幅されたＤＮＡ配列は７０〜８０個である。

好ましくは、本発明の方法を実施するために定量的な多重ＰＣＲ反応が１回だけ適用される。

さらに別の実施の形態において、標的ＤＮＡ配列（すなわち、定量的な多重ＰＣＲ反応で増幅されるＤＮＡ配列）のＧＣ含有率は、３０％〜７０％である。我々の実験データは、本発明の方法の１００％に近い感度および特異性には４０％〜６０％の範囲のＧＣが最適であることを指摘している。

本発明の方法における不可欠なステップは、増幅された標的ＤＮＡ配列のシークエンシングである。各運転において各サンプルから数十万〜数百万、さらには恐らくは数億または数十億程度の多数のシークエンシング読取を理論的には生成することができるので、結果として生じるシークエンシング処理された読取は、元の生体サンプルにおける核酸種の混合物の代表的なプロファイルを構成する。しかし、当業者は、（生体サンプル中の胎児の浮動性ＤＮＡの量に相関付けられる）妊娠の段階に基づいて、および妊娠している女性に由来する生体サンプルの起点に基づいて、何回運転を行うべきかを知るであろう。最も重要な局面は、高い度合いの統計的信頼度が得られることである。統計的信頼度を向上させるために、混合物に存在する胎児のＤＮＡのパーセンテージに応じて、多数の読取、好ましくは１０，０００〜１００，０００回またはそれ以上の読取を行うことが好ましい。非常に有意な結果が望ましい場合に一般的に用いられる統計的有意性の基準は、ｐ＜０．０１、すなわちカイ二乗またはｔ検査に基づく９９％信頼区間である。

好ましい実施の形態において、大規模並列シークエンシング方法が用いられる。特定の実施の形態において、シークエンシングは、大規模並列シークエンシングを用いてなされる。例えば４５４プラットフォーム（ロシュ社）（マーギュリーズ，Ｍ等、２００５年、ネイチャー、４３７、３７６〜３８０）、イルミナ・ゲノム・アナライザ（またはＳｏｌｅｘａプラットフォーム）またはＳＯＬｉＤシステム（アプライド・バイオシステムズ社）またはヘリコス・トゥルー単一分子ＤＮＡシークエンシング技術（ハリス Ｔ Ｄ等、２００８年、サイエンス、３２０、１０６〜１０９）、パシフィック・バイオサイエンス社の単一分子リアルタイム（single molecule, real-time：ＳＭＲＴ（登録商標））技術、およびナノ細孔シークエンシング（ソニ Ｇ Ｖおよびメラー Ａ、２００７年、Clin
Chem、５３：１９９６〜２００１）などの大規模並列シークエンシングは、並列の態様
での、高次の多重化での、試料から分離された多くの核酸分子のシークエンシングを可能にする。これらのプラットフォームの各々は、核酸断片のクローン的に拡張された単一分子またはさらには増幅されていない単一分子をシークエンシング処理する。

本発明の方法によって生成される増幅されたヌクレオチド配列の限定された組の重要な利点は、４５４ジュニア（ロシュ社）、ＰＧＭ（ライフ・テクノロジーズ社）またはＭｉＳｅｑ（イルミナ社）などの、低コストかつ低容量の新たな大規模並列シークエンサを使用可能であることである。本発明の方法と低価格のシークエンサとを組合わせることにより、検査当たりの所要時間が速くなる。なぜなら、これらのプラットフォームは一般に、シークエンシング運転当たり数時間しかかからないからである。また、低コスト化も、先行技術において用いられる方法に対する重要な改善点である。

特定の実施の形態において、カウントされる疑わしい染色体異数性の全ての増幅されたＤＮＡ配列（例えば、２１番染色体および／または１３番染色体および／または１８番染色体および／またはＸ染色体および／またはＹ染色体に由来する全ての増幅されたＤＮＡ配列）についての読取カウントの合計（すなわち、特定の増幅された染色体配列が生体サンプルに存在する回数）を計算することによって、大規模並列シークエンシングデータが分析される。次いで、特定の疑わしい異数性染色体（例えば、１３番染色体または１８番染色体または２１番染色体またはＸ染色体またはＹ染色体）に由来する増幅されたＤＮＡ配列についての読取カウントの合計は、基準染色体（すなわち、異数性が報告されない染色体）に由来する増幅されたＤＮＡ配列についての読取カウントの合計に対して正規化される。このようにして、多重ＰＣＲは、妊娠している女性と胎児との間の（標的領域読取カウント、すなわち疑わしい異数性染色体または染色体領域）／（対照領域読取カウント、すなわち基準染色体または染色体領域）比率を比較することによる用量指数（ＤＱ）の計算を可能にする。胎児のＤＮＡのパーセンテージの関数としてのＤＱが図１に示されている。

本発明の方法の不可欠な要素は、増幅された標的ＤＮＡ配列が、生体サンプル中の母体の浮動性核酸の量および胎児の浮動性核酸の量の同一の比率を反映しており、そのため、当該方法が定量的増幅を必要とすることである。多重ＰＣＲ分析およびサンプルを増幅するために用いられるＰＣＲ条件（限られた数のサイクル）に基づいて、我々は、テンプレートＤＮＡが定量的に増幅されることをすでに示した^１６。２つの読取カウント間に正規分布が存在する場合に、スコア（例えばＺ−スコアまたは用量指数）が得られる。Ｚ−スコアが１であることは、疑わしい異数性染色体に異数性がないことを意味する。Ｚ−スコアが１よりも高いこと、優先的には２よりも高いこと、より優先的には３よりも高いことは、染色体の異数性が存在することを示している。Ｚ−スコアは、標的ＤＮＡ配列の選択された組が本発明の方法によって得られる全ての疑わしい異数性染色体について求められる、ということが理解される。Ｚ−スコアの正規化および計算は、統計的方法を用いることによって支援される。本発明の文脈で用いられ得る有用な統計的方法としては、ベイズタイプの尤度法、逐次確率比試験（sequential probability ratio testing：ＳＰＲＴ）、偽発見、信頼区間、および受信者操作特性（receiver operating characteristic：Ｒ
ＯＣ）が挙げられる。

さらに別の特定の実施の形態において、増幅された標的ＤＮＡ配列の大規模並列シークエンシングデータは、インフォーマティブなＳＮＰの対立遺伝子比率の決定に基づいて分析され、比率の歪みは、妊娠している女性に胎児の染色体異数性が存在することを示す。対立遺伝子比率は、異数性染色体上のインフォーマティブなＳＮＰに対して歪む。この歪みは、母親が所与のＳＮＰ（本明細書では「インフォーマティブなＳＮＰ」と称される）に対してヘテロ接合である場合に測定され得る。したがって、ＭＡＳＴＲ分析の配列分析は、上記の分子カウンティングによる胎児の倍数性状態の判断に加えて、胎児の倍数性状態を判断するために用いられ得るいくつかのインフォーマティブなＳＮＰをもたらすことになる。図２は、マイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）が０．２５〜０．５０である場合の、９９％の確率でのインフォーマティブなＳＮＰの数の計算結果を示す。この計算に基づいて、ＭＡＦが最小の０．２５であるときには、３５個の増幅された標的ＤＮＡ配列の組に少なくとも７個のインフォーマティブなＳＮＰが存在するのに対して、ＭＡＦが０．５０であるときには、ＳＮＰについて１０個のインフォーマティブなＳＮＰが特定されることが図２に示されている。

さらに別の特定の実施の形態において、増幅された標的ＤＮＡ配列の大規模並列シークエンシングデータは、カウントされる疑わしい染色体異数性の全ての増幅されたＤＮＡ配列（例えば、２１番染色体および／または１３番染色体および／または１８番染色体および／またはＸ染色体および／またはＹ染色体に由来する全ての増幅されたＤＮＡ配列）についての読取カウントの合計（すなわち、特定の増幅された染色体配列が生体サンプルに存在する回数）を計算することと組合わせた、インフォーマティブなＳＮＰの対立遺伝子比率の決定に基づいて分析され、比率の歪みは、妊娠している女性に胎児の染色体異数性が存在することを示す。

さらに別の実施の形態において、本発明の方法の実施に基づいて、１つ以上の疑わしい異数性染色体に胎児の染色体異数性が存在するか否かの分類がなされる。１つの実施の形態において、分類は、確定的イエスまたはノーである。さらに別の実施の形態において、分類は、分類不可能または不確実であり得る。さらに別の実施の形態において、分類は、例えば医師によって後日解釈されるスコアであり得る。

特定の実施の形態において、妊娠している女性から得られた生体サンプルが異数性染色体または染色体領域を宿しているか正倍数体胎児を宿しているかを判断するために用いられるバイオインフォマティクスアプローチ、計算アプローチおよび統計的アプローチは、
シークエンシング出力からパラメータを求めるために用いられるコンピュータプログラム製品にまとめられ得る。コンピュータプログラムの動作は、場合によっては異数性の染色体から定量的な量を求めること、および１つ以上の他の染色体から量を求めることを伴うであろう。場合によっては異数性の染色体に胎児の染色体異数性が存在するか否かを判断するために、パラメータが求められ、適切なカットオフ値と比較されるであろう。

さらに別の実施の形態において、本発明は、本発明の方法を実施するための診断キットを提供する。このような診断キットは、標的母体核酸および標的胎児核酸を増幅するために少なくともプライマの組を含み、これらの標的核酸は、１３番染色体および／または１８番染色体および／または２１番染色体および／またはＸ染色体および／またはＹ染色体に由来する。優先的には、当該キットは、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体に由来する標的核酸を増幅するためのプライマを含む。また、当該診断キットは、基準染色体または基準染色体部の標的ＤＮＡ配列を特定することができるプライマの組を含む。このような基準染色体またはその一部は正倍数体染色体であることが理解される。正倍数体とは、正常な数の染色体を指す。診断キットに任意に含まれ得る他の試薬は、定量的なポリメラーゼ多重ＰＣＲ反応を実施するための取扱説明書およびポリメラーゼおよび緩衝剤である。

実施例
以下の実施例は、クレームされている発明を限定する目的ではなく例示する目的で提供されている。

１．胎児の２１トリソミーの出生前診断
本実施例において用いられるＤＮＡサンプルは、（母体ＤＮＡを表す）女性由来の二倍体ＤＮＡサンプルを、２１番染色体についての男性ＤＮＡサンプル正倍数体（人工的な正倍数体妊娠またはＡＥＰと称される）または２１番染色体についての男性ＤＮＡサンプル三倍体（人工的なトリソミー妊娠またはＡＴＰと称される）と混合することによって調製されるサンプルである。各々の人工的なサンプルは、８０％の母体ＤＮＡと２０％の男性ＤＮＡとの混合物から成っていた。また、２１番染色体のコピーを３つ有しているダウン症候群患者に由来するＤＮＡサンプルが分析に含まれていた。

４個のＡＥＰサンプル、２個のＡＴＰサンプルおよび１個のダウン症候群ＤＮＡサンプルに対して測定が行われた。各測定ごとに、標準的な２ステップＭＡＳＴＲ分析ＰＣＲ増幅手順（「材料および方法」を参照）において約５０ｎｇのＤＮＡが用いられた。胎児の２１番染色体のＭＡＳＴＲ分析は、２１番染色体に由来する２０個のプライマ対と、１８番染色体に由来する１０個のプライマ対とから成っている。各々のＭＡＳＴＲ増幅された個々のＤＮＡサンプルからの結果として生じたアンプリコンは、特定のバーコードを含んでいた。各ＤＮＡサンプルの結果として生じたバーコードアンプリコンは、製造者によって記載されるように、等モルで混合され、４５４ジュニアエマルジョンＰＣＲプロトコルにかけられた。エマルジョンＰＣＲの後、製造者のプロトコルに従って、ビーズが分離されて４５４ジュニアに装填された。十分な読取を得て３００〜５００のアンプリコン当たりのカバレージに達するように、合計２回の４５４ジュニアの運転が行われた。

ダウン症候群ＤＮＡサンプルは２１番染色体のコピーを３つ含んでいるので、ＡＥＰサンプルよりも５０％多く２１番染色体読取をもたらすはずである。これを計算するために、ダウン症候群サンプルおよびＡＥＰサンプルに対して以下の計算ステップが行われた：
（ｉ）１８番染色体および２１番染色体アンプリコンの各々についての読取カウントを、１８番染色体由来の読取カウントの総数で除算した
（ｉｉ）１８番染色体および２１番染色体アンプリコンの各々について、さまざまなＡ
ＥＰサンプルに対する平均読取カウントを計算した
（ｉｉｉ）１８番染色体および２１番染色体アンプリコンの各々について、（ｉ）を（ｉｉ）で除算した
（ｉｖ）各染色体および各サンプルについて、（ｉｉｉ）の平均値を計算した
（ｖ）（ｉｖ）のもとでＡＥＰおよびＡＴＰ当たり計算された平均値を除算することによって、観察された正規化２１番染色体／１８番染色体比率を計算した。

図３は、ダウン症候群ＤＮＡサンプルの２１番染色体アンプリコンについての読取カウントの観察された（上記のように計算された）数および期待される（すなわち理論値）数のグラフを示す。

これらのデータは、正常な正倍数体ＤＮＡサンプルとトリソミー（すなわちダウン症候群）２１番染色体ＤＮＡサンプルとが明確に区別できることを示している。

（人工的なＡＥＰサンプルによって表される）正倍数体サンプルと２０％の２１番染色体トリソミー由来ＤＮＡを含む人工的な２１番染色体異数性サンプルとを区別することができる可能性を評価するために、ＡＥＰサンプルに関連して、ＡＴＰサンプルに対して上記の計算が行われた。

２０％のトリソミーＤＮＡがＡＴＰサンプルに存在することにより、ＡＥＰサンプルと比較して、２１番染色体アンプリコン読取カウントが１０％増加するはずである。実際、上記の計算を用いて、図４は、２つのＡＴＰサンプルにおける２１番染色体の約１０％の増加を反映した、ＡＥＰサンプルとＡＴＰサンプルとの明確な区別を示す。

材料および方法
１．実施例において用いられるプライマ配列

２．ＭＡＳＴＲ分析原理
まず、プライマ当たり１０ｐｍｏｌを用いて、２０ｎｇのゲノムＤＮＡに対して、単性ＰＣＲ反応においてプライマ対を検査した。他のパラメータは、多重ＰＣＲのものと同等であった。各ｄＮＴＰ（カリフォルニア州カールズバッドのインビトロゲン社）の最終濃度が０．２５ｍＭであるＴｉｔａｎｉｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝剤（カリフォルニア州パロアルトのクロンテック社）と合計０．１２５ｍｌのＴｉｔａｎｉｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック社）とを含む２５ｍｌ反応において、５０ｎｇのゲノムＤＮＡに対して多重ＰＣＲ反応が行われた。プライマ濃度は、最適化され、０．０５ｐｍｏｌ／ｍｌ〜０．２ｐｍｏｌ／ｍｌの最終濃度の間で変更された。

全てのＤＮＡサンプルを増幅するために、最終多重分析（ＭＡＳＴＲ分析）が用いられた。５０ｎｇのＤＮＡに対して第１のＰＣＲ反応が以下の状況で行われた。すなわち、最初に９５℃で１０分間サンプル変性を行い、その後、各々が９５℃で４５秒間、６０℃で４５秒間および６８℃で２分間からなるサイクルを２０回行い、最後に７２℃で１０分間の最終伸長ステップを行った（図５参照）。

結果として生じたＰＣＲ断片を１０００倍に希釈し、その後、第２のＰＣＲステップを行って個々のバーコードを組込んだ。このステップのＰＣＲ条件は、第１のＰＣＲステップの条件と同一である（図６参照）。

結果として生じたバーコードアンプリコンは、製造者（ロシュ・ダイアグノスティックス社）によって記載されるように、等モルで混合され、エマルジョンＰＣＲ反応に用いられる。

[参照文献]

Claims (13)

1. 妊娠している女性において胎児の染色体異数性を検出する方法であって、
   ｉ）前記妊娠している女性からの生体サンプルから浮動性ＤＮＡを調製するステップと、
   ｉｉ）少なくとも１回の定量的な多重ＰＣＲ反応において、異数性であると疑われる少なくとも１つの染色体から標的ＤＮＡ配列の選択された組を増幅し、正倍数性であると推定される少なくとも１つの基準染色体から標的ＤＮＡ配列の選択された組を増幅するステップとを備え、前記方法はさらに、
   ｉｉｉ）増幅された標的ＤＮＡ配列のシークエンシングを行うステップと、
   ｉｖ）胎児の染色体異数性の存在を示すセットスコアを統計的方法によって求めるために、前記異数性であると疑われる少なくとも１つの染色体の全ての増幅されたＤＮＡ配列についての読取カウントの合計を計算し、続いて前記正倍数性であると推定される少なくとも１つの基準染色体の全ての増幅されたＤＮＡ配列についての読取カウントの合計に対して正規化を行うステップとを備え、前記セットスコアが、前記異数性であると疑われる少なくとも１つの染色体の全ての増幅されたＤＮＡ配列についての読取カウントの正規化された合計の増加を反映する場合に、前記妊娠している女性における胎児の染色体異数性の存在を示す、方法。
2. ｉｉ）において、少なくとも１つの増幅されたＤＮＡ配列は、少なくとも１つのＳＮＰを含み、前記少なくとも１つのＳＮＰに対して女性はヘテロ接合である、請求項１に記載の方法。
3. 前記セットスコアが、浮動性ＤＮＡ中の胎児配列のパーセンテージに少なくとも一部基づいて決定される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記胎児の染色体異数性は、１３番染色体および／または１８番染色体および／または２１番染色体および／またはＸ染色体および／またはＹ染色体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記生体サンプルは、母体血液、血漿、尿、脳脊髄液、血清、唾液または経頸部洗浄液である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 増幅されたＤＮＡ配列は、塩基対が３０〜１８０個のサイズを有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記浮動性ＤＮＡの調製には細胞安定化薬品が用いられる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 標的ＤＮＡ配列のＧＣ含有率は、２０〜７０％である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記浮動性ＤＮＡの調製にはサイズ分画が用いられる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
10. 増幅されたＤＮＡ配列は、単一のＰＣＲ反応において得られる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記単一の多重ＰＣＲ反応において、４０個以上の増幅されたＤＮＡ配列が得られる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記単一の多重ＰＣＲ反応において、６０個以上の増幅されたＤＮＡ配列が得られる、請求項１０に記載の方法。
13. 請求項１から１２に記載の方法のいずれかにおいて行われるステップｉｉ）を実行するために用いられる、プライマを含むキット。