CN108342455B - 一种从母体外周血检测胎儿非整倍体染色体的方法及其试剂盒 - Google Patents

一种从母体外周血检测胎儿非整倍体染色体的方法及其试剂盒 Download PDF

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    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明涉及一种从母体外周血检测胎儿非整倍体染色体的方法，所述方法包括从母体外周血中获得胎儿和母体游离DNA，筛选待测靶标区域，挑选靶向区域，设计相应的引物对和探针，进行多重微滴式数字PCR扩增和结果定量分析，根据不同荧光染料标记的阳性PCR产物液滴数的比例，来判断母体外周血样本中胎儿是否存在非整倍体染色体。

Description

一种从母体外周血检测胎儿非整倍体染色体的方法及其试 剂盒
技术领域
本发明涉及数字PCR技术领域，具体涉及一种从母体外周血检测胎儿非整倍体染色体的方法及其试剂盒。
背景技术
二代测序(NGS)技术已经广泛用于从母体外周血DNA中检测胎儿非整倍体染色体异常的临床产前筛查当中。该技术大幅度取代了抽取14周后孕妇羊水或绒毛等传统的侵入性检查方法，有效规避了感染和流产带来的医疗风险与心理压力，代表了当前产前诊断和防止先天性缺陷儿出生的最新发展方向。但二代测序费用相对较高，从而极大的限制了受惠人群。同时测序技术的操作流程比较复杂，需要进行建库和测序等多个步骤，而且由于通常母体外周血的胎儿DNA含量较低(5-20％)，常规建库测序方法使得血浆中低含量的胎儿DNA异常会淹没在母体DNA背景噪声中，建库过程原始信息丢失严重将成为其限制因素。为了避免假阴性的产生，在检测中会降低Z-score的判读标准，从而造成基于NGS的无创产前筛查技术存在假阳性高的问题。同时，由于NGS技术专业要求高、检测流程及信息解读标准化、检测时间过长等原因也限制了其临床应用，目前只有比较专业的临床检验机构例如医学检验所等进行检测，普通临床实验室难以进行实验操作和数据分析。因此需要一种更简便、成本低廉的方法用于无创产前筛查领域。
发明内容
在本发明的一种实施方式中，提供一种从母体外周血检测胎儿非整倍体染色体的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：从母体外周血中获得胎儿和母体游离DNA；步骤2：筛选待测染色体和参照染色体的待测靶标区域；步骤3：在步骤2中筛选的待测靶标区域中分别挑选间隔大于200bp的相同数量的靶向区域；步骤4：对步骤3中挑选的靶向区域设计相应的引物对和探针，待检染色体的探针和参照染色体的探针分别用不同的荧光基团进行标记；步骤5：对步骤3中挑选的靶向区域进行多重微滴式数字PCR扩增和进行结果定量分析；和步骤6：根据所述待测染色体和所述参照染色体的不同荧光染料标记的阳性PCR产物液滴数的比例，来判断母体外周血样本中胎儿是否存在非整倍体染色体。待测染色体包括常见的染色体非整倍体疾病所涉及到的染色体，例如，其中21号染色体三体会导致唐氏综合征，又名21-三体综合征或先天愚型，这是由于多出一条21号染色体所导致的疾病，发病率约为1/600-800。其它的染色体非整数倍体疾病还有，18-三体综合征又称爱德华氏综合征，发病率约为1/4000-5000；13-三体综合征又称帕陶氏综合征，发病率为1/5000-7600。参照染色体一般是指通常不产生染色体倍增或部分倍增、或染色体缺失的染色体，例如1-12号染色体。
在一种实施方式中，所述非整倍体染色体是单倍体、部分单倍体、三倍体、部分三倍体或五倍体。
在一种实施方式中，中所述待测染色体是人的13号染色体、18号染色体、21号染色体、X染色体或Y染色体；和所述参照染色体是人的1-12号染色体中任一个。
在一种实施方式中，步骤2中的待测靶标区域不含有SNP位点、GC含量为40-60％和无重复序列。
在一种实施方式中，步骤3中的靶向区域的数量至少为5、10、20、50、100、200、300、400或500个。
在一种实施方式中，步骤3中每个靶向区域的多核苷酸序列的长度是从20个碱基到500个碱基，优选地为从50个碱基到200个碱基。
在一种实施方式中，步骤4中的引物对退火温度为50-60℃，所述引物对产生60-120bp长度的PCR产物。
在一种实施方式中，步骤4中待测染色体的检测探针5’末端用6-FAM进行标记，3’末端用萃灭基团BHQ1或BHQ2标记；所述参照染色体的检测探针在5’末端用VIC或TET进行标记，3’末端用萃灭基团BHQ1或BHQ2标记。
在一种实施方式中，步骤6中通过Z检验方法判断母体外周血样本中胎儿是否存在非整倍体染色体。
在一种实施方式中，本发明提供在上述任一种方法中使用的试剂盒。
本发明提供了一种不同于目前基于二代测序无创产筛的新型无创产前DNA检测技术，该技术既保证了无创产前DNA检测的准确性，又具有操作简单比二代测序简单，易于常规临床实验室开展，成本也比二代测序低的明显优势，是今后无创产前DNA检测的新方向。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是描述本发明方法通过数字PCR检测胎儿是否存在非整倍体染色体的基本原理示意图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1数字PCR检测胎儿检测胎儿非整倍体染色体的基本流程
如图1所示，其描述了本发明基于数字PCR对染色体非整倍体进行检测的基本方法。
第一步：筛选待测染色体(例如13号染色体、18号染色体、21号染色体)和参照染色体(例如1-12号染色体)的待测靶标区域。基于核苷酸多态(SNP)位点、GC含量和序列重复信息来筛选上述染色体中的待测靶标区域；筛选的标准是所述区域中不含有SNP位点，GC含量高(例如40-60％)和无重复序列。
第二步：在待检染色体(例如13、18、21号染色体)和参照染色体(例如1-12号染色体)上挑选靶区域之间的距离间隔大于200bp(目的是保证不同的靶向区域不位于同一个游离DNA上)的相同数量的靶向区域，例如5，10，20，50，100，200，500个靶向区域。
第三步：对上述选择的靶向区域设计相应的引物对和探针。设计的引物对退火温度通常在50-60℃；设计的引物可以产生大约60-120bp长度的PCR产物。另外，为了保证有效的PCR扩增，所有候选靶向区域的引物自身不能形成发卡结构，引物之间不能形成二聚体。对选择的靶向扩增区域设计检测探针，所有待测染色体上的检测探针用同一种荧光染料(例如6-FAM)在5’末端进行标记，3’末端标记萃灭基团(例如BHQ1或BHQ2)；同时，对参照染色体(例如1-12号染色体)按照上述原则设计引物和配套的探针，所有探针用不同于上述荧光染料的另外同一种荧光染料(例如VIC或TET)在5’末端进行标记，3’末端标记萃灭基团(例如BHQ1或BHQ2)。
第四步：样品的微滴式数字PCR(ddPCR)扩增和结果定量分析。提取胎儿基因组DNA或母体外周血游离DNA，并加入Taq DNA聚合酶及相应组分，配制多重PCR扩增体系，进行ddPCR反应，反应结束后，进行定量分析，根据筛选到的待测染色体和待检染色体的两种不同荧光染料标记的阳性PCR产物的比例来判断待检测样本的胎儿DNA中是否存在非整倍体染色体。
实施例2数字PCR检测胎儿21号染色体的三倍体
样本选择：使用确诊为21三体的流产组织和正常人基因组DNA(Promega，G1521)来模拟母体游离DNA，提取流产组织的基因组DNA(使用Thermo Fisher，37011D试剂盒进行提取)，然后进行qubit定量，并超声打断到200-400bp，同时将正常人基因组DNA超声打断到200-400bp，打断后的DNA片段再进行qubit定量，然后将打断的流产组织DNA与正常人基因组DNA按不同比例(3％、5％、10％、0％)进行混合，制备模板样本。制备的模板核酸于-20℃保存，长期保存于-80℃。
靶向区域选择及引物探针设计：根据上述实施例1中所述的原理在待测染色体21号染色体和参照染色体(8号染色体)上筛选靶向区域，如表1中所示的靶区域位置即为筛选到的靶向区域，然后，在靶向区域中根据实施例1中的引物探针设计原则进行引物设计和探针设计，设计的扩增引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；设计的探针序列见表1，由Theromo Fisher公司合成，对于待测染色体21号染色体的探针的羧基端均标记FAM荧光物质，而对于参照染色体8号染色体的探针的羧基端均标记TET荧光物质，所有探针的羟基端用无荧光的猝灭基团NFQ或BHQ修饰，并通过MGB基团增强探针稳定性，提高探针Tm值。
表1.选择的靶向区域以及引物探针
Figure BDA0001331405360000051
数字PCR反应：体系配制包括1×PCR反应缓冲液(含50mmol/L Tris.HCl PH8.3,10mmol/L氯化钾，5mmol/L硫酸铵，2.5mmol/L氯化镁)；脱氧核糖核苷三磷酸dNTP，其终浓度均为200nmol/L，用于扩增靶多核苷酸的上游引物及下游引物，引物浓度均为200nM，探针浓度均为100nM。然后加入上述混合DNA样本10ng作为扩增模板，进行数字PCR反应。
微液滴生成：通过Raindance微液滴生成仪(Source)和微流控芯片将上述PCR反应体系产生微液滴。具体操作如下：
打开气瓶，气体要求是氩气或者氮气，调节输出压90-120psi。打开电脑，只是开机，不开启任何应用软件。
打开Source机身后面的电源开关，等待约1min，期间听到两次仪器发出的滴答滴的声音。
双击运行软件ICS。
输入用户名和密码。
运行仪器初始化。
初始化结束后，开始新建一个实验项目。
依次填写界面中的各个输入框：包括:Run name,设置A-H样品名称。
扫描芯片二维码，点击Scan。
在Source仪器中放入一个新的、空的8联排PCR管。
将配好的PCR反应体系25-50μl加入到Source芯片的A-H 8个孔中。
将芯片放入Source仪器，并检查是否需要注油。
点击Start Run，开始制备油包水液滴。
Source运行结束后，打开Source盖子，取出芯片放在一旁。8联排硅胶盖将PCR管密封严实。
将制备好油滴的PCR管置于PCR仪上，进行扩增。反应程序为：95℃10min；95℃20sec，60℃1min，40cycle；98℃10min；4℃hold。
微液滴检测：使用Raindance微液滴检测器(Sense)和检测芯片对PCR后的微液滴进行检测，具体操作如下：
打开气瓶，气体要求是氩气或者氮气，调节输出压90-120psi。
打开电脑，只是开机，不开启任何应用软件。
打开Sense机身后面的电源开关，等待约1min，期间听到两次仪器发出的滴答滴的声音。
双击运行软件ICS。
输入用户名和密码。
运行仪器初始化。
初始化完成后，建立一个新的运行。
填写界面中的每一个文本框，包括Runname，样品名称。
将扩增完成的PCR管放入Sense仪器，注意PCR管的左右顺序。
扫描芯片二维码，点击Scan。
将Sense芯片放入仪器，并压好金属板。
点击Insert PCR Tube按钮，告诉软件PCR管已经放好。
点击Start Run，运行油滴检测。
Sense检测完成后，系统显示Run completion。
将芯片及PCR管取出，装好丢弃。
数据分析
微液滴检测结果如表2所示。
表2.基于Raindance‐数字PCR系统的检测结果
Figure BDA0001331405360000071
结果表明，液滴计数结果稳定，重复性好，按不同浓度比例掺入T21阳性样本后，FAM/VIC阳性液滴数的比例与掺入比例具有明显的梯度关系，计算的FAM/VIC阳性液滴数比例与预期结果相符(预期结果，掺入量为3％、5％和10％比例的T21样本后的FAM/VIC比例分别为1.015、1.025及1.05)。
为了检测待测样本是否为胎儿非整倍体染色体，本发明通过数字PCR技术平台对每个样本测定4-5万个阳性液滴(在本实施例中，待测染色体和参照染色体均采用20重PCR扩增，DNA模板量为10ng)，然后根据荧光标记信号对其进行染色体定位，计算出待测样本中FAM/VIC比例数值。在每个样本测定4-5万个阳性液滴的基础上，其FAM/VIC染色体的比例数值在一个非常固定的范围。因此，本发明只需要通过测定该比值是否偏离标准量(即通过大量正常孕妇进行测定得到的FAM/VIC比值)，即可以推断出胎儿是否是非整倍体染色体胎儿。为了获得足够大的统计能力，设定3倍的标准差作为阳性的临界值，通过Z检验来计算测定出的染色体比例数值的偏移量，即Z的临界值为3，Z大于3就意味着在统计上有99.9％的概率可以确定为阳性样本。对大量正常孕妇的FAM/VIC比值进行测定，确定该比值的标准量，从而用于计算Z值，对未知样本进行检测。在实际检测应用中，通过不断扩大临床样本的检测量，进一步修正FAM/VIC比值的标准量，达到更加精确检测未知样本的目的。
通过用Z检验来计算染色体比例数值的偏移量，将Z值的临界值设为3，以保证在统计上有99.9％的概率可以确定待测样本为阳性样本。本实施例中阳性掺入样本其Z值均大于3，判断为待测样本为T21阳性，而未掺入阳性样本的正常人DNA的Z值小于3，这些结果均与预期结果相符合。综上表明，本系统可对含3％及以上比例的胎儿DNA的母体血浆游离DNA进行准确检测。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (2)

1.一种引物及探针组合在制备从母体外周血检测胎儿非整倍体染色体的试剂盒中的应用，所述引物及探针组合包括40对引物及40条探针，所述40对引物及40条探针的序列如下：
序号 靶区域位置 上游引物序列(5'-3') 下游引物序列(5'-3') 染色体 探针序列(5'-3') 探针5'端标记 1 chr21:15931780-15932608 agagagtggggctctctcagt gcccatgagttcaatgctg chr21 cccaggctggaattc 5'6-FAM 2 chr21:17081260-17081448 gggggagagagagagtcactg tcacatctgtgaatagacactcca chr21 cccaggctggaatg 5'6-FAM 3 chr21:18083690-18084279 ttcaggagagaaaaacaaatgtctc gccaagatcctgccactg chr21 cacccaggctggagt 5'6-FAM 4 chr21:19203434-19203996 tttgtttttgtttttggtagagaca acagtgatgtgcctctgcat chr21 cacccaggctggaat 5'6-FAM 5 chr21:22366652-22367169 gtattcggctcacagttctgg ccactatgtaatgaggcagctaag chr21 cccaggctggtgaa 5'6-FAM 6 chr21:23533965-23534454 tttagtttgagatgtgttcttgctc tcttgagccaaggatttcaag chr21 cccaggctggtctt 5'6-FAM 7 chr21:27200572-27200772 cctctgggaaatgctaagga gttgcagtaagccgagatcc chr21 ctcgctctgtcgccc 5'6-FAM 8 chr21:28121160-28121503 ttttcgagacagagcctcact gccaaactcgagccaaca chr21 cacccaggctggag 5'6-FAM 9 chr21:29824419-29824574 tgcttgttatttctactgtgacaaga cctcacatgatgcctctcac chr21 ctaccccaggctgg 5'6-FAM 10 chr21:29881190-29882007 ctttcatctgaaacctgctttg agtagtttatccggagttctgtaagg chr21 cccaggctggccctt 5'6-FAM 11 chr21:30474805-30474921 ttaaacacagggtctcgctatg actttgagaggcggaggag chr21 cccaggctggtctg 5'6-FAM 12 chr21:30748730-30749235 agtgggggtgctcactgat gaacccacatatgtactccaagaa chr21 cccaggctggttcct 5'6-FAM 13 chr21:30772722-30773442 ttgtagagaggtgagtcttgctatg atgggaaggcactgagagttat chr21 cccaggctggtcatg 5'6-FAM 14 chr21:31629913-31630128 tttgacacagggtctcactcc tgagccgtgatctcactactgt chr21 ccgtcacccaggctg 5'6-FAM 15 chr21:32375968-32376659 tggttgctaaagcttagaaaaatg gagaggtgagctgctggttt chr21 ccccaggctggcttc 5'6-FAM 16 chr21:32638964-32639831 gagcgggaagtgtgcttg gtcaacatgtagagcacgagtttt chr21 ccccaggctggcatg 5'6-FAM 17 chr21:32639958-32641039 ggggtaactcatacagacaccag gtgtgacctggtggggaata chr21 cccaggctggaatat 5'6-FAM 18 chr21:32898907-32899174 tttgtttgtgacagagtctcccta gctgagatcatgcccctcta chr21 ccctatgtcaccca 5'6-FAM 19 chr21:32947219-32947524 tttttaacccaatgactggaca tcttatcacgtccgatcacg chr21 ctcgctctgtcaccca 5'6-FAM 20 chr21:34156655-34156920 ttctagaacagtctatccgttcttttt ccgagatcttgccactgc chr21 ccaggctggactgca 5'6-FAM 21 chr8:130541496-130542399 gcactcacagtaggaggcaac agtctatgctgataggctggatct chr8 cccacctccaaggaa 5'TET 22 chr8:25130964-25131785 tcagttttccaaaatggttctg gacacaaggtgacaatgacctc chr8 cccacctccataatga 5'TET 23 chr8:106682717-106682913 gcgccttcatccttgtca tgtacagggtagaggcttattgc chr8 ccacctcccagtaaa 5'TET 24 chr8:131033497-131033926 cccgatgacctaatcacctc aaatcctaagcccgcaatgt chr8 ccccacctcctaatac 5'TET 25 chr8:28350297-28350669 tggcgatcatttctacgtca ctgtcaggaatgagacacatcat chr8 cccacctcccgatgt 5'TET 26 chr8:29218885-29219623 tggagatacccatcctgactg ggatggagtagagggagcgta chr8 caccctagccacctc 5'TET 27 chr8:32626305-32626623 aacctgagacttcccaccaa gaggagccataactaggtaataggaa chr8 ccacctccatctgtg 5'TET 28 chr8:35073361-35073625 tgcctattttgtctacatcggtat gaaaaagatagttcatgcaaatggt chr8 ccacctccgctctctt 5'TET 29 chr8:37569772-37570598 ctgtgctggtgccttaaacc ctgggaagacagggaaacag chr8 ctctagactctgttc 5'TET 30 chr8:94371550-94372269 ccgccctcataagagtcaac attggtaactcaagcaaagaagc chr8 cccacctccctgtgc 5'TET 31 chr8:21714205-21714553 agggaatccagactccatcc ctgtatccacgcatctcagg chr8 cctccccacctcca 5'TET 32 chr8:34571398-34572803 gatccaattgtctcccacca tgtgtccccacaaaatctca chr8 cccacctccaacatt 5'TET 33 chr8:123316886-123317261 cattgaaccagcctgcaat caagtcctgtagcttgggtttt chr8 cccacctcctaaggtc 5'TET 34 chr8:22686979-22687570 cttctgctgcagcccttg gtgtgatgaggattggaaaaca chr8 caccacctccatgtc 5'TET 35 chr8:24765594-24766196 cagtatttaggcctgactagaccac gaggaatgtcatcatgaagctg chr8 acctccagctgtcac 5'TET 36 chr8:25408220-25408908 ggcctacaacaccctgcat ttagcagggaggccagtg chr8 ccccacctcctact 5'TET 37 chr8:35574229-35574863 tggcagggcactttgtatc catagaaggccaggtaacaagc chr8 caccacctcctgtgc 5'TET 38 chr8:35874839-35875092 aagaattgtgtttcgtgaatttgt caacagcattgtagatcccaaa chr8 cacctcaattcccac 5'TET 39 chr8:80960649-80961250 gcacttagcaaaaggagcctac tttgagtgttacaattccagcaa chr8 ccacctccatggga 5'TET 40 chr8:99453205-99454637 gcacagtgtggttgtatcaaagt ggaagatattgcccacctca chr8 ccacctccttctgat 5'TET
所述应用包括以下步骤：
步骤1：从母体外周血中获得胎儿和母体游离DNA；
步骤2：筛选待测染色体和参照染色体的待测靶标区域，其中所述待测染色体是人的21号染色体，和所述参照染色体是人的8号染色体；待测靶标区域不含有SNP位点、GC含量为40-60％和无重复序列；
步骤3：在步骤2中筛选的待测靶标区域中分别挑选间隔大于200bp的相同数量的靶向区域；
步骤4：从所述步骤3中挑选的靶向区域以及设计的引物探针如下：
序号 靶区域位置 上游引物序列(5'-3') 下游引物序列(5'-3') 染色体 探针序列(5'-3') 探针5'端标记 1 chr21:15931780-15932608 agagagtggggctctctcagt gcccatgagttcaatgctg chr21 cccaggctggaattc 5'6-FAM 2 chr21:17081260-17081448 gggggagagagagagtcactg tcacatctgtgaatagacactcca chr21 cccaggctggaatg 5'6-FAM 3 chr21:18083690-18084279 ttcaggagagaaaaacaaatgtctc gccaagatcctgccactg chr21 cacccaggctggagt 5'6-FAM 4 chr21:19203434-19203996 tttgtttttgtttttggtagagaca acagtgatgtgcctctgcat chr21 cacccaggctggaat 5'6-FAM 5 chr21:22366652-22367169 gtattcggctcacagttctgg ccactatgtaatgaggcagctaag chr21 cccaggctggtgaa 5'6-FAM 6 chr21:23533965-23534454 tttagtttgagatgtgttcttgctc tcttgagccaaggatttcaag chr21 cccaggctggtctt 5'6-FAM 7 chr21:27200572-27200772 cctctgggaaatgctaagga gttgcagtaagccgagatcc chr21 ctcgctctgtcgccc 5'6-FAM 8 chr21:28121160-28121503 ttttcgagacagagcctcact gccaaactcgagccaaca chr21 cacccaggctggag 5'6-FAM 9 chr21:29824419-29824574 tgcttgttatttctactgtgacaaga cctcacatgatgcctctcac chr21 ctaccccaggctgg 5'6-FAM 10 chr21:29881190-29882007 ctttcatctgaaacctgctttg agtagtttatccggagttctgtaagg chr21 cccaggctggccctt 5'6-FAM 11 chr21:30474805-30474921 ttaaacacagggtctcgctatg actttgagaggcggaggag chr21 cccaggctggtctg 5'6-FAM 12 chr21:30748730-30749235 agtgggggtgctcactgat gaacccacatatgtactccaagaa chr21 cccaggctggttcct 5'6-FAM 13 chr21:30772722-30773442 ttgtagagaggtgagtcttgctatg atgggaaggcactgagagttat chr21 cccaggctggtcatg 5'6-FAM 14 chr21:31629913-31630128 tttgacacagggtctcactcc tgagccgtgatctcactactgt chr21 ccgtcacccaggctg 5'6-FAM 15 chr21:32375968-32376659 tggttgctaaagcttagaaaaatg gagaggtgagctgctggttt chr21 ccccaggctggcttc 5'6-FAM 16 chr21:32638964-32639831 gagcgggaagtgtgcttg gtcaacatgtagagcacgagtttt chr21 ccccaggctggcatg 5'6-FAM 17 chr21:32639958-32641039 ggggtaactcatacagacaccag gtgtgacctggtggggaata chr21 cccaggctggaatat 5'6-FAM 18 chr21:32898907-32899174 tttgtttgtgacagagtctcccta gctgagatcatgcccctcta chr21 ccctatgtcaccca 5'6-FAM 19 chr21:32947219-32947524 tttttaacccaatgactggaca tcttatcacgtccgatcacg chr21 ctcgctctgtcaccca 5'6-FAM 20 chr21:34156655-34156920 ttctagaacagtctatccgttcttttt ccgagatcttgccactgc chr21 ccaggctggactgca 5'6-FAM 21 chr8:130541496-130542399 gcactcacagtaggaggcaac agtctatgctgataggctggatct chr8 cccacctccaaggaa 5'TET 22 chr8:25130964-25131785 tcagttttccaaaatggttctg gacacaaggtgacaatgacctc chr8 cccacctccataatga 5'TET 23 chr8:106682717-106682913 gcgccttcatccttgtca tgtacagggtagaggcttattgc chr8 ccacctcccagtaaa 5'TET 24 chr8:131033497-131033926 cccgatgacctaatcacctc aaatcctaagcccgcaatgt chr8 ccccacctcctaatac 5'TET 25 chr8:28350297-28350669 tggcgatcatttctacgtca ctgtcaggaatgagacacatcat chr8 cccacctcccgatgt 5'TET 26 chr8:29218885-29219623 tggagatacccatcctgactg ggatggagtagagggagcgta chr8 caccctagccacctc 5'TET 27 chr8:32626305-32626623 aacctgagacttcccaccaa gaggagccataactaggtaataggaa chr8 ccacctccatctgtg 5'TET 28 chr8:35073361-35073625 tgcctattttgtctacatcggtat gaaaaagatagttcatgcaaatggt chr8 ccacctccgctctctt 5'TET 29 chr8:37569772-37570598 ctgtgctggtgccttaaacc ctgggaagacagggaaacag chr8 ctctagactctgttc 5'TET 30 chr8:94371550-94372269 ccgccctcataagagtcaac attggtaactcaagcaaagaagc chr8 cccacctccctgtgc 5'TET 31 chr8:21714205-21714553 agggaatccagactccatcc ctgtatccacgcatctcagg chr8 cctccccacctcca 5'TET 32 chr8:34571398-34572803 gatccaattgtctcccacca tgtgtccccacaaaatctca chr8 cccacctccaacatt 5'TET 33 chr8:123316886-123317261 cattgaaccagcctgcaat caagtcctgtagcttgggtttt chr8 cccacctcctaaggtc 5'TET 34 chr8:22686979-22687570 cttctgctgcagcccttg gtgtgatgaggattggaaaaca chr8 caccacctccatgtc 5'TET 35 chr8:24765594-24766196 cagtatttaggcctgactagaccac gaggaatgtcatcatgaagctg chr8 acctccagctgtcac 5'TET 36 chr8:25408220-25408908 ggcctacaacaccctgcat ttagcagggaggccagtg chr8 ccccacctcctact 5'TET 37 chr8:35574229-35574863 tggcagggcactttgtatc catagaaggccaggtaacaagc chr8 caccacctcctgtgc 5'TET 38 chr8:35874839-35875092 aagaattgtgtttcgtgaatttgt caacagcattgtagatcccaaa chr8 cacctcaattcccac 5'TET 39 chr8:80960649-80961250 gcacttagcaaaaggagcctac tttgagtgttacaattccagcaa chr8 ccacctccatggga 5'TET 40 chr8:99453205-99454637 gcacagtgtggttgtatcaaagt ggaagatattgcccacctca chr8 ccacctccttctgat 5'TET
步骤5：对步骤4中挑选的所述靶向区域利用步骤4中所述设计的引物对和探针进行多重微滴式数字PCR扩增和进行结果定量分析；和
步骤6：根据所述待测染色体和所述参照染色体的不同荧光染料标记的阳性PCR产物液滴数的比例，来判断母体外周血样本中胎儿是否存在非整倍体染色体。
2.根据权利要求1所述的应用，其中步骤6中通过Z检验方法判断母体外周血样本中胎儿是否存在非整倍体染色体，在所述Z检验中Z值的临界值为3，Z大于3就意味着在统计上有99.9％的概率可以确定为阳性样本。
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