CN109628578A - 一种基于通用探针检测胎儿染色体变异的方法 - Google Patents

一种基于通用探针检测胎儿染色体变异的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于通用探针检测胎儿染色体变异的方法，所述方法包括以下步骤：提取胎儿染色体变异的待测样本中的游离DNA和/或细胞DNA；筛选至少一种待测染色体和至少一种参考染色体的待测靶标区域；设计扩增引物对与通用探针；扩增和检测，和通过待测染色体和参考染色体的待测靶标区域检测到荧光信号的相对比例，确定待测染色体的变异情况。本发明方法具有更简单的操作流程，利于临床应用，将是产前检测领域的新方向。

Description

一种基于通用探针检测胎儿染色体变异的方法
技术领域
本发明涉及明涉及体外诊断检测领域，具体涉及一种基于通用探针检测胎儿染色体变异的方法。
背景技术
数字PCR作为一种能够对核酸进行绝对定量分析的方法，被提出用于检测胎儿染色体变异，如非整倍体变异。基于数字PCR的检测方法具有简单、快速和低成本的潜力，但是其临床应用受到限制：需要大量的PCR阳性反应单元以达到准确可靠的检测结果。使用多重数字PCR可以提供足够多的PCR阳性反应单元，且而无需添加额外的操作流程或增加DNA投入量。然而，当数字PCR的重数逐渐增加时，需要相应大量的探针来实现多重的数字PCR，这将导致背景荧光升高而影响阳性信号的检测，因而无法实现足够重数的数字PCR检测。因此，需要一种低背景荧光信号的多重数字PCR检测方法用于产前检测领域。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种基于通用探针检测胎儿染色体变异的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1，提取胎儿染色体变异的待测样本中的游离DNA和/或细胞DNA；步骤2，筛选至少一种待测染色体和至少一种参考染色体的待测靶标区域，待测染色体和参考染色体的待测靶标区域数量相同且至少各为二个；步骤3，根据步骤2筛选的待测染色体和参考染色体的待测靶标区域分别设计相应扩增引物对与通用探针；对于每个待测染色体和每个参考染色体各自的待测靶标区域分别设置一条通用探针，待测染色体的通用探针靶向待测染色体的所有待测靶标区域，参考染色体的通用探针靶向参考染色体的所有待测靶标区域；两条通用探针的核酸序列不相同，并使用不同的荧光基团进行标记；步骤4，对步骤2中挑选的靶标区域利用步骤3的引物和探针进行扩增和检测，每种待测染色体和每种参考染色体的待测靶标区域进行检测时分别产生一种不同的荧光信号；和步骤5，通过待测染色体和参考染色体的待测靶标区域检测到荧光信号的相对比例，确定待测染色体的变异情况。
在一种实施方式中，所述染色体变异包括染色体非整倍变异、染色体缺失变异、染色体重复变异。
在一种实施方式中，所述待测样本包括母体外周血、羊水、绒毛膜组织、脐静脉血、宫颈内胎儿细胞。
在一种实施方式中，步骤2所述的每条染色体的待测靶标区域数量5-500个，优选为10-200个，更优选为20-100个；待测靶标区域之间的间隔大于200bp，待测靶标区域中不含有SNP位点、GC含量为40-60％和无重复序列。
在一种实施方式中，步骤2的所述通用探针为一段与待测靶标区域互补的长度为8-25nt的寡核苷酸，通用探针至少一个碱基具有LNA或MGB或PNA标记。
在一种实施方式中，所述待测染色体是人的13号染色体、18号染色体、21号染色体、X染色体或Y染色体；和所述参照染色体是人的1-12号染色体中任一个。
在一种实施方式中，步骤2所述的通用探针5′端标记荧光基团，3′端标记淬灭基团；所述荧光基团包括FAM、FITC、Cy3、VIC、HEX、ROX、TED、NED、Cy5、Cy5.5；所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3。
在一种实施方式中，所述方法基于多重数字PCR的方法。
在一种实施方式中，所述待测染色体是人的21号染色体，所述参考染色体是人的5号染色体；21号和5号染色体靶标区域数量分别为5个；21号染色体的通用探针序列为C+C+CT+G+CCT+CT，5号染色体的通用探针序列为C+C+CA+C+CTC+CA，其中+表示锁核酸标记。
本发明提供了一种利用通用探针进行多重数字PCR以检测胎儿染色体变异的方法，经LNA等特别标记的通用探针能够降低背景的荧光信号，LNA等标记使探针的特异性和亲和力提高，保证通用探针的扩增效率。由此，基于多重数字PCR的胎儿染色体变异检测方法能够保证检测的准确性，同时具有更简单的操作流程，利于临床应用，将是产前检测领域的新方向。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明方法的基本原理示意图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1本发明方法的基本流程
如图1所示，第一步提取胎儿染色体变异的待测样本中的游离DNA和/或细胞DNA。
第二步，提取筛选待测染色体(例如13号染色体、18号染色体、21号染色体)和参考染色体(例如1-12号染色体)的待测靶标区域。基于核苷酸多态(SNP)位点、GC含量和序列重复信息来筛选上述染色体中的待测靶标区域；筛选的标准是所述区域中不含有SNP位点，GC含量高(例如40-60％)和无重复序列。筛选的待测靶标区域间隔大于200bp(目的是保证不同的靶标区域不位于同一条游离DNA上)。待测染色体和参考染色体的靶标区域数量相同且至少各为2个，例如各2，10，20，50，100个靶标区域。
第三步，对上述选择的靶标区域设计相应的引物对和通用探针。设计的引物对退火温度通常在50-60℃；设计的引物可以产生大约60-120bp长度的PCR产物。设计的通用探针至少一个碱基做锁核酸(LNA)标记，通用探针的长度介于8-25nt。靶向待测染色体所有待测靶标区域的通用探针核酸序列相同，并使用同一种荧光染料(例如6-FAM)在5′端进行标记，3′末端标记淬灭基团(例如BHQ1或BHQ2)；同时，靶向参考染色体所有待测靶标区域的通用探针核酸序列相同，但与待测染色体的通用探针核酸序列不同，靶向参考染色体区域的通用探针使用不同于上述荧光染料的另外同一种荧光染料(例如VIC或TET)在5′末端进行标记，3′末端标记淬灭基团(例如BHQ1或BHQ2)。
第四步，对样品进行微液滴数字PCR(ddPCR)扩增与检测扩增后液滴的荧光信号，进行定量。提取样品中的DNA(例如母体外周血中的游离DNA)，加入Taq DNA聚合酶、引物、通用探针等扩增所需的材料与试剂，配制多重PCR扩增体系，进行ddPCR反应。反应结束后，检测荧光信号，得到具有不同荧光信号的液滴的数量，然后进行统计分析，确定待测染色体和参考染色体的初始模板拷贝数。
第五步，计算待测染色体和参考染色体的初始模板拷贝数的相对比例，进而确定检测样品的胎儿DNA是否存在染色体非整倍体变异。理论上，若胎儿DNA不存在染色体非整倍体变异，则比例为1；若存在染色体非整倍体变异则比例不为1。
实施例2本发明方法检测胎儿21-三体综合征
待测样本：使用确诊为21-三体的流产组织和正常人基因组DNA(Promega，G1521)来模拟母体游离DNA，提取流产组织的基因组DNA(使用Thermo Fisher，37011D试剂盒进行提取)，然后进行qubit定量，并超声打断到200-400bp，同时将正常人基因组DNA超声打断到200-400bp，打断后的DNA片段再进行qubit定量，然后将打断的流产组织DNA与正常人基因组DNA按不同比例(0％、2％、4％、10％)进行混合，制备模板样。
靶向区域选择：根据上述实施例1中所述的原理在待测染色体21号染色体和参考染色体5号染色体上筛选各5个靶标区域，如表1中所示的位置即为筛选到的靶标区域。
引物和通用探针设计：根据上述实施例1中所述的原理进行引物设计和通用探针设计。设计的扩增引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。设计的通用探针序列为21号染色体C+C+CT+G+CCT+CT；5号染色体：C+C+CA+C+CTC+CA，其中+表示LNA标记。21号染色体探针5′端标记FAM荧光染料，5号染色体探针5′端标记VIC荧光染料，所有探针的3′端标记淬灭基团BHQ。通用探针由Thermo Fisher公司合成。
表1.选择的靶标区域以及引物
微液滴数字PCR反应，包括以下步骤：
步骤1：体系配制，包括1×PCR反应缓冲液(含50mmol/L Tris.HCl pH 8.3,10mmol/L氯化钾，5mmol/L硫酸铵，2.5mmol/L氯化镁)；脱氧核糖核苷三磷酸dNTP，其终浓度均为200nmol/L，引物浓度均为200nM，探针浓度均为100nM。然后加入上述混合DNA样本10ng作为扩增模板，进行数字PCR反应。
步骤2：微液滴生成，通过Raindance微液滴生成仪(Source)和微流控芯片将上述PCR反应体系产生微液滴。具体操作如下：打开气瓶，调节输出压90-120psi。打开电脑，打开Source机身后面的电源开关，双击运行软件ICS。输入用户名和密码，运行仪器初始化，新建一个实验项目。依次填写界面中的各个输入框，扫描芯片二维码，点击Scan。在Source仪器中放入一个新的、空的8联排PCR管。将配好的PCR反应体系25-50μl加入到Source芯片的A-H8个孔中。将芯片放入Source仪器，点击Start Run，开始制备油包水液滴。Source运行结束后，打开Source盖子，取出芯片放在一旁。8联排硅胶盖将PCR管密封严实。
步骤3：PCR，将制备好油滴的PCR管置于PCR仪上，进行扩增。反应程序为：95℃10min；95℃20sec，60℃1min，40cycle；98℃10min；4℃hold。
步骤4：微液滴检测，使用Raindance微液滴检测器(Sense)和检测芯片对PCR后的微液滴进行检测，具体操作如下：打开气瓶，调节输出压90-120psi。打开电脑，打开Sense机身后面的电源开关，双击运行软件ICS。输入用户名和密码，运行仪器初始化，建立一个新的运行。填写界面中的每一个文本框，将扩增完成的PCR管放入Sense仪器，扫描芯片二维码，点击Scan。将Sense芯片放入仪器，并压好金属板。点击Insert PCR Tube按钮，点击StartRun，运行油滴检测。Sense检测完成后，系统显示Run completion。将芯片及PCR管取出，装好丢弃。
步骤5：使用RainDrop Analyst数据分析软件对聚类图的数据进行光谱补偿和分析，微液滴检测结果如表2所示。
表2.多重数字PCR检测结果
结果表明，液滴计数结果稳定，重复性好，按不同浓度比例掺入T21阳性样本后，FAM/VIC阳性液滴数的比例与掺入比例具有明显的梯度关系，计算的FAM/VIC阳性液滴数比例与预期结果相符(预期结果，掺入量为2％、4％和10％比例的T21样本后的FAM/VIC比例分别为1.01、1.02及1.05)。使用经LNA标记的通用探针能够降低背景荧光信号，提高探针的亲和力与热稳定性，使检测结果更准确。
为了检测待测样本是否为胎儿非整倍体染色体，本发明通过数字PCR技术平台对每个样本测定约10000个阳性液滴(在本实施例中，待测染色体和参照染色体均采用5重PCR扩增，DNA模板量为10ng)，然后根据荧光标记信号对其进行染色体定位，计算出待测样本中FAM/VIC比例数值。在每个样本测定10000个阳性液滴的基础上，其FAM/VIC染色体的比例数值在一个非常固定的范围。因此，本发明只需要通过测定该比值是否偏离标准量(即通过大量正常孕妇进行测定得到的FAM/VIC比值)，即可以推断出胎儿是否是非整倍体染色体胎儿。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (9)

1.一种基于通用探针检测胎儿染色体变异的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，提取胎儿染色体变异的待测样本中的游离DNA和/或细胞DNA；
步骤2，筛选至少一种待测染色体和至少一种参考染色体的待测靶标区域，待测染色体和参考染色体的待测靶标区域数量相同且至少各为二个；
步骤3，根据步骤2筛选的待测染色体和参考染色体的待测靶标区域分别设计相应扩增引物对与通用探针；对于每个待测染色体和每个参考染色体各自的待测靶标区域分别设置一条通用探针，待测染色体的通用探针靶向待测染色体的所有待测靶标区域，参考染色体的通用探针靶向参考染色体的所有待测靶标区域；两条通用探针的核酸序列不相同，并使用不同的荧光基团进行标记；
步骤4，对步骤2中挑选的靶标区域利用步骤3的引物和探针进行扩增和检测，每种待测染色体和每种参考染色体的待测靶标区域进行检测时分别产生一种不同的荧光信号；和
步骤5，通过待测染色体和参考染色体的待测靶标区域检测到荧光信号的相对比例，确定待测染色体的变异情况。
2.根据权利要求1所述的方法，所述染色体变异包括染色体非整倍变异、染色体缺失变异、染色体重复变异。
3.根据权利要求1中所述的方法，所述待测样本包括母体外周血、羊水、绒毛膜组织、脐静脉血、宫颈内胎儿细胞。
4.根据权利要求1中所述的方法，步骤2所述的每条染色体的待测靶标区域数量5-500个，优选为10-200个，更优选为20-100个；待测靶标区域之间的间隔大于200bp，待测靶标区域中不含有SNP位点、GC含量为40-60％和无重复序列。
5.根据权利要求1中所述的方法，步骤2的所述通用探针为一段与待测靶标区域互补的长度为8-25nt的寡核苷酸，通用探针至少一个碱基具有LNA或MGB或PNA标记。
6.根据权利要求1中所述的方法，其中所述待测染色体是人的13号染色体、18号染色体、21号染色体、X染色体或Y染色体；和所述参照染色体是人的1-12号染色体中任一个。
7.根据权利要求1中所述的方法，步骤2所述的通用探针5′端标记荧光基团，3′端标记淬灭基团；所述荧光基团包括FAM、FITC、Cy3、VIC、HEX、ROX、TED、NED、Cy5、Cy5.5；所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3。
8.根据权利要求1所述的方法，所述方法基于多重数字PCR的方法。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，所述待测染色体是人的21号染色体，所述参考染色体是人的5号染色体；21号和5号染色体靶标区域数量分别为5个；21号染色体的通用探针序列为C+C+CT+G+CCT+CT，5号染色体的通用探针序列为C+C+CA+C+CTC+CA，其中+表示锁核酸标记。
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