CN105219873B - 一种鉴定猪脊椎数相关性状的方法及专用引物 - Google Patents
一种鉴定猪脊椎数相关性状的方法及专用引物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鉴定猪脊椎数相关性状的方法及专用引物。本发明提供了猪基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性在鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状中的应用;所述SNP位点为:以猪基因组DNA为模板,采用由序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得产物的自5’末端起第118位核苷酸;所述SNP位点处的核苷酸为A或G。实验证明,GG基因型的猪的脊椎数显著大于AG基因型的猪的脊椎数显著大于AA基因型猪的脊椎数。利用本发明可对猪进行早期筛选,有效解决实际生产中的选取优良种猪时间长的问题,降低育种花费,且准确度高,检测费用低,并可实现自动化检测,在猪育种方面具有很高的实践应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种鉴定猪脊椎数相关性状的方法及专用引物。
背景技术
猪脊椎数是猪的重要经济性状,脊椎数的变异可影响猪的体长,据报道,脊椎数量每额外增加1节,体长可增加约8cm(King JWB,Roberts RC.Carcass length in the baconpig:its association with vertebrae numbers and prediction from radiographs ofthe young pig.Anim Prod.1960,2:59-65.)。猪的脊椎可分为颈椎、胸椎、腰椎、荐椎和尾椎,其中胸椎和腰椎在不同猪种中存在变异,其它椎体数量固定,因此,一般提到脊椎数是指胸腰椎数。中国地方猪种的脊椎数一般有19-20节,而西方商业猪种一般有20-22节(Mikawa S,Hayashi T,Nii M,Shimanuki S,Morozumi T,Awata T.Two quantitativetrait loci on Sus scrofa chromosones 1and 7affecting the number ofvertebrae.J Anim Sci.2005,83:2247-2254.)。因此,影响脊椎数变异的主效基因研究成为了研究热点之一。
基于猪脊椎数相关性状的重要性,针对其开展育种工作成为当前育种工作的一个重点。但是,由于传统育种方法速度慢、准确程度低,分子育种以其准确性和快速性等特点已经成为当前育种工作的主要技术手段。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种与猪脊椎数相关的SNP位点及其应用。
本发明所提供的应用具体可为如下中的任一种:(1)猪基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性在鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状中的应用;(2)用于检测猪基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状中的应用。
所述SNP位点为:以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸;所述SNP位点处的核苷酸为A或G。
该SNP位点位于TGFB3基因内,具体为国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第105182819个核苷酸位点A>G突变(记为g.105182819A>G)。
本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的试剂。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的试剂,是用于检测猪基因组中SNP位点(g.105182819A>G)的单核苷酸多态性的物质;
所述“用于检测猪基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质”可以能够鉴定SNP位点(g.105182819A>G)的单核苷酸多态性的任何物质,如为如下(a)或(b)所示的引物对:
(a)由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对;
(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的,且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。
本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的试剂盒。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的试剂盒,含有所述试剂。
所述试剂或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的方法,具体可包括如下步骤:检测待测猪的基因组中SNP位点(g.105182819A>G)处的核苷酸为A还是G还是A和G,以确定所述待测猪的基因型是AA还是GG还是AG,根据所述待测猪的基因型按照如下确定待测猪的脊椎数相关性状:GG基因型的待测猪的脊椎数多于或候选多于AG基因型的待测猪;AG基因型的待测猪的脊椎数多于或候选多于AA基因型的待测猪;
所述GG基因型为以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得的扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸为G的纯合型(即国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第105182819个核苷酸为G的纯合型);即扩增产物只有一种,为序列表中序列4所示DNA片段。
所述AA基因型为以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸为A的纯合型(即国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第105182819个核苷酸为A的纯合型);即扩增产物只有一种,为序列表中序列3所示DNA片段。
所述AG基因型为以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸为A和G的杂合型(即国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第105182819个核苷酸为A和G的杂合型);即扩增产物有两种,分别为序列表中序列3所示DNA片段和序列表中序列4所示DNA片段。
在所述方法中,所述“检测待测猪的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为A还是G还是A和G”的方法可为测序分析;所述测序分析可包括PCR扩增和对所述PCR扩增所得产物进行测序两个步骤;所述PCR扩增的模板为所述待测猪的基因组DNA,所用的引物对满足如下条件:以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增所得扩增产物含有所述SNP位点处的核苷酸;
具体的,所述引物对可为如上所述(a)或所述(b)所示的引物对。
当采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增时,根据待测猪的基因组DNA的不同,扩增得到的DNA片段如序列表中序列3所示或如序列表中序列4所示。其中,序列3的第118位核苷酸为A;序列4的第118位核苷酸为G。
所述试剂或所述试剂盒或所述方法在猪育种中的应用也属于本发明的保护范围。
在所述方法中,进行所述PCR扩增时采用的退火温度为56-60℃(如58.5℃)。
进一步,进行所述PCR扩增时采用的扩增程序具体为:95℃预变性5min;95℃变性20s,58.5℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环;最后72℃延伸10min。
进一步,所述PCR反应体系具体为:模板DNA 200ng,10×PCR扩增缓冲液5μl,dNTPs终浓度为10mM,上、下游引物各50ng,Taq DNA聚合酶0.75U,Mg2+2.5mmol/L,用ddH2O补足体系至50μl。
本发明的第五个目的是提供如下(A)或(B)的方法:
(A)培育多脊椎数的猪的方法,包括选择GG基因型的猪进行育种的步骤;所述GG基因型为以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸为G的纯合型(即国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第105182819个核苷酸为G的纯合型);
(B)培育少脊椎数的猪的方法,包括选择AA基因型的猪进行育种的步骤;所述GG基因型为以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸为A的纯合型(即国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第105182819个核苷酸为A的纯合型)。
在本发明中,所述猪为大民杂交猪;所述大民杂交猪具体由大白猪和民猪杂交得到。
在本发明中,所述脊椎数是指胸椎数和腰椎数的总和。
实验证明,GG基因型的猪的脊椎数显著大于AG基因型的猪的脊椎数,AG基因型的猪的脊椎数显著大于AA基因型猪的脊椎数,GG基因型猪的脊椎数比AA基因型猪的脊椎数多约0.66节(P<0.001)。所以SNP位点(g.105182819A>G)可作为猪脊椎数相关性状的分子育种标记。本发明提供的方法可对待选猪进行早期筛选,有效地解决实际生产中的选取优良种猪时间长的问题,降低了育种花费,有效减少或增加实际生产中的猪的脊椎数,该方法准确度高,检测费用低,并可实现自动化检测,在猪的育种方面具有很高的实践应用价值。
附图说明
图1为AA基因型个体(对应序列3)和GG基因型个体(对应序列4)猪TGFB3基因g.105182819A>G多态性位点附近序列的测序结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的大民杂交猪(Sus scrofa),由大白猪和民猪杂交获得,具体为大白猪×民猪的F2代,按照文献中的方法获得:Luo W,Cheng D,Chen S,Wang L,Li Y,Ma X,Song X,Liu X,Li W,Liang J,Yan H,ZhaoK,Wang C,Wang L,Zhang L.Genome-wideassociation analysis of meat quality traits in a porcine Large White×Minzhuintercross population.Int J Biol Sci.2012,8:580-595。具体方法如下:四头大白猪分别交配16头民猪,获得F1代群体,此F1代群体中的9头公猪交配46头母猪,三个胎次共生产了592头F2代个体。
实施例1、鉴定猪的脊椎数多少
一、猪TGFB3基因g.105182819A>G多态性位点的确定
(一)以两头大民杂交猪为实验材料,分别提取其耳缘组织的基因组DNA。
(二)引物的设计与合成
根据猪TGFB3基因的国际猪基因组10.2版本参考序列(http://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index),设计并合成如下引物:
U(上游引物):5’-ACTGAGCCCTTCTTTAATGGAA-3’(序列1);
D(下游引物):5’-GAAATCCCAATGCCGATTTAGC-3’(序列2)。
(三)PCR扩增
分别以步骤(一)得到的大民杂交猪的基因组DNA为模板,以U和D为引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物,分别命名为产物1和产物2。
PCR扩增体系:基因组DNA 200ng,10×PCR扩增缓冲液5μl,dNTPs终浓度为10mM,上、下游引物各50ng,Taq DNA聚合酶0.75U,Mg2+2.5mmol/L,用ddH2O补足体系至50μl。
PCR扩增程序:95℃预变性5min;95℃变性20s,58.5℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环;最后72℃延伸10min。
(四)测序及序列分析
将产物1和产物2进行测序,得到产物1的序列(如序列表中序列3所示)和产物2的序列(如序列表中序列4所示)。序列3和序列4只存在一个碱基的差异,均为序列3和序列4中自5’末端起第118位,该处的碱基为在序列3中为A,在序列4中为G,如图1中箭头所示,该位点为国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上的自5′末端起第105182819位,因此将该位点命名为g.105182819A>G。
将在国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上的自5′末端起第105182819位的碱基(即步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基)为A的纯合型个体的基因型命名为AA;将在国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上的自5′末端起第105182819位的碱基(即步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基)为G纯合型个体的基因型命名为GG;将在国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上的自5′末端起第105182819位的碱基(即步骤(三)得到的PCR扩增产物自5’末端起第118位的碱基)为A和G的杂合型个体的基因型命名为AG。
二、猪TGFB3基因g.105182819A>G多态性位点与猪的脊椎数的关联性分析
为确定g.105182819A>G多态性位点与猪的脊椎数是否相关,以592头大民杂交猪为实验材料,进行如下试验:
(一)提取每头猪的耳缘组织的基因组DNA,分别按照步骤一中(三)的方法进行PCR扩增,得到各PCR扩增产物,按照步骤一中(四)的方法确定每头猪的基因型是AA、AG还是GG。
(二)用屠宰后胸腰椎数计数法检测每头猪的脊椎数。即所述脊椎数是指胸椎数和腰椎数的总和。
(三)对猪的基因型与脊椎数开展关联分析,具体方法可参见文献“Zhang L,WangL,Li Y,Li W,Yan H,Liu X,Zhao K,Wang L.A substitution within erythropoietinreceptor gene D1domain associated with litter size in Beijing Black pig,Susscrofa.Anim Sci J.2011,82(5):627-632”。
所用模型如下:
Y=S+G+e
其中,Y为性状测定值,S为性别效应,G为基因型效应,e为残差效应。
结果如表1所示。
表1 猪的基因型与猪的脊椎数的关联性分析
基因型 | 数量 | 脊椎数 |
AA | 139 | 26.32±0.05A |
AG | 305 | 26.60±0.04B |
GG | 148 | 26.98±0.0.05C |
注:同列上标不同字母表示差异显著(P<0.001)。
从表1可见,在猪的脊椎数性状中,GG基因型的猪的脊椎数显著大于AG基因型的猪的脊椎数,AG基因型的猪的脊椎数显著大于AA基因型猪的脊椎数,GG基因型猪的脊椎数比AA基因型猪的脊椎数多约0.66节(P<0.001)。
结果表明,用TGFB3基因内的国际猪基因组10.2版本参考序列自5’末端起第105182819位单核苷酸多态性可用于鉴定猪的脊椎数相关性状。在实际的猪育种中,为获得更多脊椎数的猪,最好选择GG基因型的猪进行育种;为获得更少脊椎数的猪,最好选择AA基因型的猪进行育种。
Claims (3)
1.一种鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的方法,包括如下步骤:检测待测猪的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为A还是G还是A和G,以确定所述待测猪的基因型是AA还是GG还是AG,根据所述待测猪的基因型按照如下确定待测猪的脊椎数相关性状:GG基因型的待测猪的脊椎数多于或候选多于AG基因型的待测猪;AG基因型的待测猪的脊椎数多于或候选多于AA基因型的待测猪;
所述SNP位点为:以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸;所述SNP位点处的核苷酸为A或G;
所述GG基因型为以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得的扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸为G的纯合型;
所述AA基因型为以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸为A的纯合型;
所述AG基因型为以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸为A和G的杂合型;
所述“检测待测猪的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为A还是G还是A和G”的方法为测序分析;所述测序分析包括PCR扩增和对所述PCR扩增所得产物进行测序两个步骤;所述PCR扩增的模板为所述待测猪的基因组DNA,所述引物对为由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对;
所述猪为大民杂交猪;所述大民杂交猪具体由大白猪和民猪杂交得到。
2.权利要求1所述方法在猪育种中的应用;
所述猪为大民杂交猪;所述大民杂交猪具体由大白猪和民猪杂交得到。
3.如下(A)或(B)的方法:
(A)培育多脊椎数的猪的方法,包括选择GG基因型的猪进行育种的步骤;所述GG基因型为以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸为G的纯合型;
(B)培育少脊椎数的猪的方法,包括选择AA基因型的猪进行育种的步骤;所述GG基因型为以猪基因组DNA为模板,采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增得到的扩增产物的自5’末端起第118位核苷酸为A的纯合型;
所述猪为大民杂交猪;所述大民杂交猪具体由大白猪和民猪杂交得到。
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