JPH03501211A - 核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ここ２０年間に亘る分子生物学の分野における進歩は、患者又は他の被験者から 採取された検査試料中の特定の核酸塩基配列を検出することを可能にしている。

このような検査試料には、血清、尿、大便、組織、唾液、脳を髄液、羊水、及び その他の体液を含む。特定の核酸の塩基配列の検出は、人間における病原菌によ る疾患及びウィルス性関連疾患の存在を識別するだけでなく、遺伝子異常又は遺 伝病を識別するために使用される。

特定の遺伝子の存在は、癌及び腫瘍遺伝子検査並びに法医学に使用される遺伝子 情報を得るためだけでなく、移植拒絶反応の原因となる抗原をコードする遺伝子 の存在のような他の関連的な遺伝子情報を得るためにも使用される。

特定の遺伝子の塩基配列を検出するための最も一般的な技術は、核酸ハイブリッ ド形成［ｎｎｃｌｓｉｃ　５ｃｉｄ　ｈ７ｂｒｉｄｉｚ＊目ｏｎ）として知られ る現象を利用する。ハイブリッド形成とは、非共育結合によって二本鎖核酸又は デニブレックスを形成する、特定タイプの、相補的塩基配列による一本鎖ヌクレ オチド塩基配列の組換え又はアニーリングを意味する。通常は二本鎖である最初 のＤＮＡ　（デオキシリボ核酸）分子鎖が組換えする場合には、その組換えプロ セスは再生（ｒｅ＋＋ｓｌｒ＊ｊｉｏｏ）と呼ばれる。分子混合が生じる場合に は、そのプロセスはハイブリッド形成と呼ばれる。ハイブリッド形成は、二本鎖 型及び−重鎖型でともに自然界に頻繁に見出されるＲＮＡ　（リボ核酸）の場合 にも起こる。

ＤＮＡ　：　ＤＮＡ及びＲＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッドだけでなく、ＤＮＡ　 ：　ＲＮＡハイブリッドもハイブリッド形成によって形成され得る。

典型的なハイブリッド形成技術では、標的核酸塩基配列の一本鎖形にアニーリン グ又はハイブリッド形成することによって、興味の対象である遺伝子又は核酸の 塩基配列を捜し出すために、−重鎖のプローブ塩基配列が使用される。自然界に 発生するＤＮＡが典型的にそうであるように、検査試料中の核酸が二本鎖である 場合には、そのＤＮＡは、あらゆる形の組換えが起こり得る前に、変性されなけ ればならず、即ち一本鎖にされなければならない。標的塩基配列とは、その標的 塩基配列に特に特徴的な、探索されるべき核酸塩基配列の選択部分である。プロ ーブは、探しめられる遺伝子の標的ヌクレオチド塩基配列に対して相補的である 一本鎖ヌクレオチド塩基配列であるように選ばれる。このオリゴヌクレオチドの プローブは検出可能な標識でマークされ、検査試料からの変性核酸（ＤＮＡ又は ＲＮＡ）と接触させられる。

最近まで、水素（３Ｈ）　、リン（３２Ｐ）又はヨウ素（１２５■）のような原 子の放射性同位体が、プローブ標識として主として使用されてきた。しかし、こ れらのような放射性化合物は、放射性材料の不安定性に起因する高額の使用コス トはもちろん、評価分析プロトコルの中に大規模な安全予防策を組み入れる必要 性と、並びに、高価な装置及び特殊な廃棄物手続きの必要性とを含む多くの欠点 を有している。その結果として、放射性同位体標識の欠点を有しない、それに代 わる標識法を開発する努力が、近年になって益々増加してきている。従って現在 では、放射性標識に加えて、非同位体標識が付けられたプローブが使用されるが 、臨床環境では非放射性標識が好ましい。

従来技術の説明 検査試料内に存在する微量の標的塩基配列の検出を改善する努力の中では、最近 、（１）信号を増幅する、即ち、プローブ検出システムの感度を高めること、及 び（２）現在使用可能な放射性及び非放射性の方法を用いて容易に検出が可能な 十分量の標的核酸塩基配列が存在するように、標的核酸塩基配列自体を増幅させ ることという方面で開発が行われて来ている。一般に、標的核酸塩基配列の増幅 は、所与のＤＮＡ又はＲＮＡ標的核酸塩基配列の反復的な再生又は複製を含む。

少量の所与の既存の標的核酸塩基配列から核酸塩基配列の複数のコピーを作り出 す再生又は複製のために、現在では２つの方法が常套的に使用される。その第１ の方法は、その標的核酸塩基配列を適当な宿主系の中にクローン化することを含 む。この方法は、後でその宿主を形質転換するために使用する適当なベクターの 中に所望の核酸を挿入する伝統的なりローニング技術を用いる。その宿主が培養 されると、そのベクターが複製され、さらに所望の標的核酸塩基配列のコピーを 産生ずる。そのベクターの中に挿入される標的核酸塩基配列は、自然に生じたも のであっても合成されたものであってもよい。言い換えれば、米国特許第４．２ ９３．６５２号明細書に開示されるように、所望の標的核酸塩基配列は試験管内 で合成され、その後で、連続的に挿入する前に増殖されたベクターの中に該塩基 配列を挿入することが可能である。

米国特許第４．６８３．１９５号及び第４．６８３．２０２号明細書は、検査試 料からの標的ＤＮＡ又はＲＮＡの量を増幅させるための第２の方法を開示してい る。特にこの方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＢ）と呼ばれている。ＰＣＲ増 幅法は、増幅されるべきＤＮＡ断片の側面に配置する２つのオリゴヌクレオチド ブライマーを使用する。これらのプライマーは標的核酸塩基配列の対向鏡上でそ の相補的な塩基配列へとアニールし、そのアニールされたプライマーの（標的塩 基配列に対して相補的な）伸長生成物が、ＤＮＡポリメラーゼの存在中で形成さ れる。ポリメラーゼによるＤ　Ｎ　Ａ合成がプライマー間の領域を貫いて進行し 、側面にプライマーが配置された標的ＤＮＡ断片の量を効果的に２倍にするよう に、プライマーが配向される。

選択されたアッセイにおいて測定可能な信号を得るのに十分な量の標的核酸塩基 配列が生成されるまで、ＤＮＡの熱変性サイクル、相補的な塩基配列へのプライ マーのアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによるアニールされたプライマー の伸長が繰り返される。伸長生成物もプライマーに対して相補的であり且つプラ イマーを結合することが可能であるため、連続的なサイクルの各々は先行のサイ クルで合成されたＤＮＡの量を本質的に２倍にし、標的核酸塩基配列を指数的に 蓄積する。

ＰＣＲ増幅システムの欠点の１つは、増幅を達成するために酵素の使用を必要と するということである。酵素は、望ましくないヌクレアーゼ汚染物質が存在する ことに加えて、その比較的短い貯蔵寿命及び品質に固有のロフト差を示す。ＤＮ Ａ及びＲＮＡの両方を効率的に増幅することが可能であり、並びに酵素増幅法の 使用に限定されない増幅システムをもつことが有利本発明は、検査試料中に存在 するかもしれない標的核酸塩基配列を検出するための方法に係る。この方法は増 幅法と検出法をともに使用し得る。

増幅は複数の対の核酸増幅プローブを使用することによって実現され、６対の増 幅プローブの構成要素プローブは、鋳型として働く標的核酸塩基配列の所与の部 分に対しても相補的である６対の増幅プローブの少なくとも１つの同一のノ＼イ ブリッド形成構成要素（ｈ７ｂｒｉｄｉ！ｉＢ　ＩＩｔ＋ｍｂｅｒ）と互いに相 補的である。６対の増幅プローブのハイブリッド形成構成要素の核酸塩基配列う に選択され、ハイブリッド形成増幅プローブは隣接的な仕方で、指定された長さ の標的塩基配列をカバーすることが重要である。ハイブリッド形成増幅プローブ は、そのプローブが互いに結合し得るのに十分量いに隣接している標的塩基配列 と／へイブリッド形成する。

ハイブリッド形成増幅プローブが結合されると、完成された増幅生成物を変性に よって分離することが可能であり、及びこのプロセスは残りのプローブによって 又は新たなプローブの供給によって繰り返すことが可能である。連結された増幅 生成物の熱変性サイクル、増幅プローブのその相補的塩基配列へのアニーリング 、及びアニールされたプローブの連結反応は、選択されたアッセイにおいて測定 可能な信号を生じさせるのに十分な量の標的核酸塩基配列が生成されるまで繰り 返される。

３つ以上の対の増幅プローブを使用する場合には、特に２つ以上の検出プローブ を使用してその増幅生成物を検出してもよく、各々の検出プローブは、その増幅 生成物内の隣接した位置にある２つの増幅プローブ断片の各々の部分に対して相 補的である。適正に結合された増幅生成物は、増幅法において標的核酸塩基配列 によって果たされるのと同一の仕方で鋳型として働く。不適正に結合された生成 物は、この方法において鋳型として機能することが不可能である。検出プローブ は、ハイブリッド形成される検出プローブとの間に相互作用を生起させ得るのに 十分互いに隣接している増幅生成物とハイブリッド形成する０適正に結合された 増幅生成物の量を検出するのに使用する標識が、選択された検出プローブに担持 されている。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の増幅法を使用する、二本鎖の標的塩基配列の増幅を示す図で あり、 第２図は、固定化抗体を使用する検出生成物の分離を行なえるように抗原を検出 プローブ標識として使用する、本発明の検出生成物の実施態様の１つを説明する 図であり、第３図は、実施例２〜８で使用される合成ヌクレオチド塩基配列の図 であり、 第４図は、２対の増幅プローブを使用する３０マ一増幅塩基配列の１０サイクル の増幅から得られた生成物を示すオートラジオグラムであり、 第５図は、３対の増幅プローグを使用する４５マ一増幅塩基配列の１０サイクル の増幅から得られた生成物を示すオートラジオグラムであり、 第６図は、４５マーの増幅生成物を検出するために、１つの非標識検出プローブ と組み合わされた、放射性標識を有する１つの検出プローブを使用して得られた 検出生成物を示すオートラジオグラムである。

発明の詳細な説明 検査試料中に存在するかもしれない標的核酸塩基配列を検出するための方法の１ つが、本発明により提供される。本発明の方法は増幅法及び検出法の双方を使用 し得る。

本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。

増幅プローブは、（１）二本鎖の増幅塩基配列の１つの鎖部分に対して相補的な 、又は（２）−重鎖の増幅塩基配列部分に対して同一もしくは相補的な核酸塩基 配列である。増幅プローブは、プローブが互いに結合し得るのに十分互いに隣接 している増幅塩基配列とハイブリッド形成する。各々の増幅プローブの長さは１ つのヌクレオチドの長さよりも大きい。増幅プローブは、他の増幅プローブと結 合するために、一方の末端において又は両末端において修飾されていてもされて いなくてもよい。

核酸塩基配列は、（１）ホスフェート主鎖に関して、（２）ヌクレオシドに関し て、及び／又は（３）オリゴヌクレオチドの糖部分に関して修飾されていてもよ いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである。核酸塩基配列は標識 を含むことが可能であり、ハイブリッド形成が依然として起こり得る限りは、他 の化学部分（ｅｈｅｍｉＣ＊ｌ　ｍｏｉｔ＋ｉ！ａ）によって断続されてもよ（ １゜相補的とは、ハイブリッド形成を起こし得るのに十分な相補性を意味する。

完全な相補性は必要とされない。

複数の対の増幅プローブの同一の構成要素とは、他の「同一の構成要素」と共に 、完全な増幅生成物を累積的に形成することが可能な各プローブ対の構成要素を 意味する。増幅プローブ対の構成要素は、表示の構成要素が下側の鎖から生じる 場合には、プライム符号（′）で表わされる。

増幅生成物とは、増幅塩基配列と隣接的にハイブリッド形成する一連の増幅プロ ーブとの連結反応から生成される、連結された核酸塩基配列である。

連結反応とは、２つ以上の増幅プローブ又は検出プローブの結合を意味する。連 結反応は、それだけに限定されるわけではないが、化学反応、光化学反応（例え ば光結合）、熱付加環化反応、及びレドックス反応を含む化学プロセスに加えて 、例えばリガーゼを利用する酵素法を含む。

隣接的とは隣りの又は近接のという意味である。隣接的にハイブリッド形成され るプローブの場合には、そのプローブの末端は互いに隣接する必要はないが、実 際には、間隔を開けて離れていてもよく、又はある程度型なり合っていてもよい 。

標的塩基配列とは探索されるべき核酸塩基配列である。

増幅塩基配列は、増幅プローブの鋳型として働く、指定された長さの標的塩基配 列である。増幅塩基配列は標的塩基配列の全長から成っていてもよく、又はそれ を代表する部分から成っていてもよい。

鋳型塩基配列は、複数の増幅プローブ又は複数の検出プローブとハイブリッド形 成する核酸塩基配列である。増幅法の第１サイクルでは、増幅塩基配列は鋳型塩 基配列として作用する。

増幅法の後続のサイクルにおいて及び検出法において、増幅生成物も鋳型塩基配 列として働く。

増幅プローブ断片とは、単一の増幅プローブによって生じた増幅生成物の断片的 部分である。

ハイブリッド形成プローブは、鋳型塩基配列にハイブリッド形成する増幅プロー ブ又は検出プローブである。一般的に、−重鎖増幅塩基配列の増幅の第１サイク ルにおける幾つかの増幅プローブを除いて、全ての増幅プローブ及び全ての検出 プローブはハイブリッド形成プローブである。

検出プローブは、増幅生成物の中に隣接して置かれた２つの増幅プローブ断片の 各々の部分に対して相補的である核酸塩基配列である。検出プローブは、ハイブ リッド形成される検出プローブとの間で相互作用を生起し得るのに十分互いに隣 接している増幅生成物とハイブリッド形成する。

検出生成物は、一連の隣接的にハイブリッド形成された検出プローブから生成さ れた核酸塩基配列である。この検出生成物は連結される必要はない。

偽の増幅副産物又は副産物は、本来の増幅塩基配列によっては得られない、増幅 プローブの連結反応の結果として生じる生成物である。

標識とは、同一の標識の付いたプローブを他のプローブから区別するために、検 出プローブ又は増幅プローブに結合された部分である。標識は信号発生標識であ る必要はないが、例えば、測定されるべき生成物の分離手段及び／又は検出可能 な標識を後で結合するための手段を提供してもよい。

検出可能な標識は、１つの基質（酵素の場合）、１つの光源（蛍光化合物の場合 ）、もしくは光電子増倍管（放射性もしくは化学発光化合物の場合）のような物 質との相互作用を通して、又は直接的に、検出が可能な信号発生標識である。

隣接標識（ｐｒｏ！五ｍ１ｔｙ　１ｘｂＣ１）とは、そうした標識が、−緒にさ れる場合に互いに相互反応して検出可能な信号を発生させる、少なくとも２つの 標識の１つである。典型的には、第１及び第２の２つの隣接標識が互いに隣接し ている条件の下で検出可能な信号を発生するために、第１隣接標識が対応する第 ２隣接標識と組み合わせて使用される。

二本鎖増幅塩基配列を使用する、本発明の増幅法の具体例の１つが、第１図に示 されている。第１図に関しては、その増幅法は複数の対の増幅プローブ［（Ｂ） 　（１１及びＦＢ）（２）］を使用する。

増殖プローブの長さは好ましくは１０〜３０ヌクレオチドであるが、１つのヌク レオチドより大きければ、どんな長さであってもよい。多対の増幅プローブの構 成要素は互いに相補的であるように選ばれ、プローブの多対の少なくとも１つの 同一の構成要素［（Ｂ）　（１）又は（Ｂ）（２）］も、鋳型として作用する増 幅塩基配列［（Ａ）　（１）及び（＾）（２）］の指定された断片に対して相補 的である。

増幅プローブの多対のハイブリッド形成構成要素の核酸塩基配列は、その増幅塩 基配列の異なる部分に対して相補的であるように選ばれ、従って、ハイブリッド 形成増幅プローブは、その増幅塩基配列とハイブリッド形成する時に、隣接的な 仕方［（Ｃ）　（１）及びｔｃ）（２）］で本質的にその増幅塩基配列の全体の 長さをカバーする。

増幅塩基配列が二本鎖である場合には必ず、増幅プローブの多対の画構成要素は 、その増幅塩基配列の相補鎖の対向部分に対して相補的であろう、即ち、増幅プ ローブＡ　Ｐ　Ｉ。

ＡＰ　及びＡＰ３　［（ＢＮＩ）コが増幅塩基配列ＡＳ’　［（Ａ）（２）］に 対して相補的であり、並びに、増幅プローブＡＰＩ、、ＡＰ２゜及びＡ　Ｐ　、 、　［（Ｂ）　（２）］が増幅塩基配列Ａ　Ｓ　［（Ａ／）　（１）］に対して 相補的である。

ハイブリッド形成増幅プローブは、増幅プローブの末端が連結されるのを可能に するのに十分互いに隣接した増幅塩基配列とハイブリッド形成する。そのプロー ブの連結反応をもたらすことが可能な１つのタイプの反応は、その５′末端でリ ン酸化されているプローブに対してリガーゼを酵素的に作用させることである。

連結反応の他の方法も可能である。一般的に、これらの方法は連結反応試薬の使 用を必要とし、この試薬は化学試薬でも、（リガーゼのような）酵素でも、光で も又は熱であってもよい。

１つの実施態様では、単一の化学部分が増幅プローブの結合末端に取り付けられ る。連結反応は第２の部分の形成によって連結された増幅生成物を生成するため に連結反応試薬を使用することによって行ってもよい。例えば、第１化学部分に 結合された２つの増幅プローブが鋳型にハイブリッド形成される場合のように、 第１化学部分の２つが非常に隣接している場合には、連結反応試薬は第１化学部 分の構造を変えるだけであるのが好ましい。このタイプの連結反応を実施するた めに第１化学部分を使用することの一興体例は、酸化によってジスルフィド結合 （−３−Ｓ−）の生成を達成する連結反応においてスルフヒドリル基（−Ｓ　Ｈ ）を使用することである。

別の実施態様では、第１化学部分が１つの増幅プローブの接続末端に取り付けら れ、及び、第２化学部分が、連結されるべき別の増幅プローブの対向する末端に 取り付けられる。連結反応は第３化学部分の形成によって生じ、場合によっては 、この第３化学部分は改変された第１又は第２化学部分とみなされてもよい。

連結反応は、ただ１つの化学部分を使用してそのプローブの接続末端を修飾する 場合と同じ仕方で、連結反応試薬を使用することによって行うことが可能である 。２つの異なった化学部分を使用する場合には、連結反応試薬は第１又は第２化 学部分のどちらとでも相互作用することができるが、その２つの化学。

部分がハイブリッド形成による場合のように非常に隣接しないと、この連結反応 試薬はどちらの化学部分の構造も改変しない。

光を連結反応試薬として使用する場合には、電気的に励起された分子を生じるた めに、２つの第１化学部分の１つだけがその光と相互作用する必要があり、その 後で、この励起された分子は、ぺり環状反応によってその対応する化学部分と反 応して、結合する第３化学部分を生成させる。前記２つの化学部分がきわめて隣 接した状態にある場合にだけ、この活性化学部分がその対応する化学部分と反応 するように、この活性化学部分が短寿命の励起状態を有することが好ましい。

又、例えば請求核試薬（Ｎ：）が１つの増幅プローブの１つの接続末端に取り付 けられ、及び、連結されるべき別の増幅プローブの対向末端に脱離基が取り付け られる場合には、連結反応試薬が無くても連結反応を行うことが可能である。連 結反応は、修飾された核試薬（−Ｎ−）の形成によりて生じる。この場合には、 連結反応は、Ｎ：と選ばれた脱離基との（例えば、ハイブリッド形成による）著 しい接近だけによって生じる。或いは、連結反応を促進するために、その脱離基 は光又は酵素のような試薬によって活性化されてもよい。このタイプの連結反応 の一例は、Ｎ：がスルフヒドリル基であり、及び脱離基がヨウドアセチル基上の ヨウ素である場合であろう。これは、Ｎ：がアミン基であり且つ脱離基が活性エ ステルである場合の、ペプチド及びタンパク質の調製に使用されるタイプの化学 と同様である。

ヒドロキシル基（第１化学部分）をリン酸基（第２化学部分）に結合して、リン 酸エステル結合（第３の化学部分）を生じさせるために、連結反応試薬として酵 素リガーゼを使用することは、連結反応に必要な２つの異なった化学部分の１つ （即ち、ヒドロキシル基）が核酸プローブに内在的であるが故に、好ましい連結 反応方法である。リガーゼを用いてリン酸化されたプローブを結合する場合には 、そのプローブの１つの末端だけを修飾する必要がある。

その個々の増幅プローブが連結されると、その結果得られた増幅生成物は、−末 鎖増幅塩基配列の場合にはその増幅生成物［ＣＤ）　（１）又は（Ｄ）（２）コ の変性によって、また二本鎖増幅塩基配列の場合にはその増幅生成物［（Ｄ）（ １）及び（Ｄ）（２）］の変性によって分離され、即ち一本鎖にされる。そして 、このプロセスは残りのプローブによって、又は増幅プローブの新たな供給によ って反復される。

このプロセスの第１の反復（第２サイクル）では、その増幅生成物自体が追加の 又は残余の増幅プローブのための鋳型塩基配列として働く。例えば、−末鎖増幅 塩基配列の増幅の第２サイクルでは、Ａ　Ｐ　１．、ＡＰ２．及びＡ　Ｐ　３． 　［（Ｄ）　（１）コから形成される増幅生成物が、ＡＰｌ、ＡＰ２及びＡＰ３ 増幅プローブＣ（Ｂ）　（１）　］の鋳型として働く。二本鎖増幅塩基配列の場 合には、ＡＰｌ、ＡＰ２及びＡＰ３ｒ（Ｄ）（２）］から形成される増幅生成物 も、ＡＰ、、Ａ　Ｐ　２．及びＡＰ３．増幅プローブ［（Ｂ）　（２）コの鋳型 として働く。その後続のサイクルでは、（Ｄ）（１）及び（Ｄ）　（２）増幅生 成物の両方が、−末鎖増幅塩基配列又は二本鎖増幅塩基配列のどちらの増幅にお いても鋳型として働く。後続サイクルにおいて鋳型として作用する追加の増幅生 成物の反復的な生成は、増幅生成物の指数的蓄積を可能にする。

鋳型塩基配列からの増幅生成物の変性、追加の又は残余の増幅プローブの、鋳型 塩基配列上のその相補的塩基配列へのアニーリング、及びそのアニールされた増 幅プローブの連結反応から成るサイクルは、選ばれたアッセイにおいて測定可能 な信号を生じさせるのに十分なだけの量の増幅生成物が生成されるまで繰り返さ れる。熱変性を使用する場合には、熱安定リガーゼを使用することが好ましい。

通常用いられる２段階法を使用して増幅生成物を直接測定してもよい。この方法 は、（１）連結されていない及び不完全にしか連結されていない残余の増幅プロ ーブからの増幅生成物を（サイズに従って）分離するための、変性ポリアクリル アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）と、及びそれに続く、（２）分離された核酸生 成物を視覚化するためのオートラジオグラフィーとを含む。１つ以上の増幅プロ ーブを３２Ｐのような放射性同位体で標識する場合に、この方法を使用すること ができる。

本発明の増幅法に固有の問題の１つは、上述の２段階アッセイ法のようなサイズ による分離に基づくアッセイ結果に逆効果をもたらすかもしれない偽の増幅副生 成物を生成する可能性があるということである。最初は、偽の増幅副生成物は、 鋳型塩基配列の介在しない増幅プローブの連結反応の結果として生じる。平滑末 端連結反応（ｂｌｎｎｌ　ｅｎｄ　ｌｉｇｘｌｉｏｎ）としても公知なこのプロ セスは、増幅塩基配列の増幅のために過剰に与えられた増幅プローブが、そのプ ローブが連結されるのを可能にするのに十分なだけ互いに隣接して偶然に配列さ れる場合には、溶液中で起こり得る。偽の増幅副生成物が、相補的な対を成す増 幅プローブの両方の構成要素の連結反応から生成される場合には、その副生成物 はその副生酸物自体を指数的に再生することが可能である。偽の増幅副生成物は 、分析下の検査試料において標的塩基配列の存在を示さない。

偽の増幅副生成物の大半は、適正にそのプローブを配列させる増幅鋳型による最 初の関与がないために、非特異的な仕方で配向される。本発明の検出法は、適正 に結合された連結生成物と非適正に結合された連結生成物とを識別することが可 能であり、従って、最終的なアッセイ結果に対する偽の増幅生成物の影響を、完 全には取り除かないものの、最小化する。これは、本発明方法のような識別方法 が、正しく連結された偽の増幅生成物と、鋳型から誘導された正しく結合された 真の増幅生成物とを依然として識別できないからである。

しかし、偽の増幅副生成物の有害な影響は、増幅プローブの対の数を増加して使 用することによって更に最小化することが可能である。増幅プロセスで使用され るプローブの対の数を増加させることは、偽の連結反応に適した仕方でそのプロ ーブが偶然に配列する機会を統計学的に減少させる。例えば、指数的に増大する 偽の増幅副生成物だけを考慮するならば、３対のプローブを使用する増幅システ ムでは、その偽の増幅副生成物の１７１６だけが、形成された正しい結合の生成 物として計算される。

４対のプローブを使用する増幅システムでは、正しい結合の偽の増幅生成物対形 成される偽の増幅生成物全体の比は、１：３５２となるだろう 正しく結合された副生成物の数は、追加のプローブ対を含ませることによって劇 的に減少する。例えば５対のプローブを使用する場合には、正しい結合の偽の増 幅生成物対偶の増幅生成物全体の比は、１：１３．８４２まで低下する。さらに 、鋳型によって誘導された増幅生成物の全長（ｌｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ）に達す る偽の増幅生成物の数も、増幅プローブ対の数が増加するにつれて減少するだろ う。

本発明の検出法によれば、少なくとも２つの検出プローブが使用される。検出プ ローブは、正しく結合された増幅生成物内の２つの増幅プローブ断片の継目を繋 ぐように設計される。従って、少なくとも３つの増幅プローブ断片を有する増幅 生成物を生成するために、少なくとも３対の増幅プローブが本発明の増幅法で使 用されなければならない。検出プローブの長さは増幅プローブの長さに匹敵する ことが好ましい。

検出可能な量の増幅生成物を生成するのに十分なサイクリングの後で、正しく結 合された増幅生成物が本発明の検出法に従って検出されてよい。その増殖法は２ つの相補的な増幅生成物を生成し、その両方又はどちらか一方が検出法に従って 検出されてよい。相補的な増幅生成物の１つの存在を検出するために本発明の検 出法を使用する１つの具体例が、第２図に示される。

第２図に関しては、本発明の検出法は少なくとも２つの検出プローブ［（Ｅ）］ を使用し、各々の検出プローブは、増幅生成物の、隣接した位置にある２つの増 幅プローブ断片の各々の部分本発明の検出法では、増幅生成物［（Ｄ）　（１） 及び／又は（Ｄ）（２）］は、増幅法の第１サイクルにおける増幅塩基配列によ って並びに後続のサイクルにおける増幅塩基配列及び増幅生成物によって果たさ れるものと同様の仕方で鋳型として働く。第２図に示す検出法は、検出プローブ 用の鋳型塩基配列として、１つの増幅生成物［（Ｄ）　（１）］だけを示してい る。その検出プローブは、ハイブリッド形成されたプローブ間で相互作用を生起 させ得るのに十分互いに隣接した［（Ｆ）］、指定された増幅生成物にＩ＼イブ リッド形成する。その相互作用は、増幅プローブの連結反応に関して前述したよ うなあらゆる仕方で検出プローブの末端を互いに結合する連結反応であってもよ い。連結された検出生成物が形成される場合には［第２図の（Ｇ）１、その連結 された生成物は、その後で、変性によって増幅生成物鋳型から分離されてもよい 。しかし、この分離は必須なものではない。

正しく結合された増幅生成物の存在をめるあらゆる検出手段が利用されてよい。

１つの検出プローブが３２Ｐで標識される場合には、連結された検出生成物の存 在をＰＡＧＥを用いてアッセイし、その後オートラジオグラムを用いて解析する ことができる。２つの検出プローブを使用する場合には、その２つの検出プロー ブの各々に標識を付けてもよい。

２つの標識検出プローブを使用する１つの実施態様では、一方の検出プローブは 検出可能な標識に結合され、他方の検出プローブには、対応する固定化された特 定の結合相手にその後で結合する配位子のような検出生成物を溶液から取り出す ための手段が与えられる。第２図に示される検出法では、その検出プローブの１ つが、固定化抗体［（Ｈ）］の使用によって検出生成物の取出しを可能にする抗 原に結合される。その後で、検出生成物を不溶性の担体［（１）１上に捕獲する ことによって、その検出生成物を溶液から取り出すことができる。標識された検 出生成物を溶液から取り出すこの方法も、その検出生成物が依然として増幅生成 物にハイブリッド形成されている間に行ってよい。

別の実施態様では、第１検出プローブが第１隣接標識に結合され、第２検出プロ ーブが対応する第２隣接標識に結合される。

その標識された検出プローブは、検出可能な信号を生じるように、その２つの隣 接標識が互いに相互作用するのを可能にするのに十分なだけ隣接してハイブリッ ド形成する。例えば、その第１隣接標識は、第２酵素の基質として働く生成物を 生成する第１酵素であってよい。その第２酵素は第２隣接標識として第２検出プ ローブに結合されてよい。その２つの酵素標識された検出プローブが隣接する場 合には、第１酵素からの生成物がバルク溶液の中へ逃散する前に、第２酵素がそ の生成物に作用して検出され得る第２生成物を生成する。

或いは、蛍光化合物又は化学発光化合物のようなエネルギー供与体を、第１隣接 標識として使用してもよ（、ローダミー／のようなエネルギー受容体を第２隣接 標識として利用してもよい。

標識された２つの検出プローブを隣接させる場合には、エネルギー移動反応がそ の２つの隣接標識の間で起こり、その結果、測定可能なエネルギー放出を生じる 。形成された検出生成物の量を測定するための更に他の方法は、当業者には明ら かであろう。

検出法は、検出プローブを結合させるための鋳型として働く増幅生成物の存在に 依存して設計されている。しかし、単一の非連結増幅プローブがその２つの検出 プローブの双方の部分に対して相補的である場合には、そうした単一の非連結増 殖プローブ（例えば、第２図のＡＰ２．）が単独で２つの検出プローブを結合す ることを可能にする。この現象は「架橋（ｂｒｉｄｇｉＢ）　Ｊ効果と呼ぶこと ができる。従って、検出プローブと非連結Ａ　Ｐ　２−プローブとの重なりの度 合いが最小化されるように、Ａ　Ｐ　２−プローブの長さを制限することが好ま しい。これは、非連結ＡＰ２、プローブが単独で２つの検出プローブを結合する 「架橋」を形成する傾向を減少させる。「架橋」効果による検出生成物の形成を 最小化するために、高温、低イオン強度緩衝液、及び／又はホルムアミドや尿素 のような変性剤を、短い増幅プローブの代替物として連結反応に使用してもよい 。

検出法は、増幅法と組み合わせて使用するために比較的単純である。検出法はさ らに２つのプローブ試薬とハイブリッド形成のさらに１つのサイクルだけを必要 とする。検出プローブのハイブリッド形成の後に連結反応が続き、幾つかの事例 では、選ばれた特定のアッセイに応じて、適宜変性段階も続く。それに続く固体 担体上への固定化は急速であり、僅かしか実施時間を必要としない。

選ばれた特定のアッセイにおいて最大の感度を達成するように選択された方法を 適合させるために、多数のパラメータを調整することが可能な独特の能力の故に 、本発明は特に有利である。例えば、ＰＡＧＥ及びそれに続くオートラジオグラ フィーの２段階法と組み合わせた本発明の増幅法を使用するアッセイの感度を改 善するために、増幅プローブの対の数を調整することが可能である。

本発明の増幅法と組み合わせて検出法を使用することによって、さらに操作用の パラメータを得ることができる。増幅法と検出法の双方を同一の方法に組み入れ る場合には、偽の増幅副生成物が偶然生成することの影響は、増幅プローブの対 の数を増加して使用しその検出方法の識別能力を利用することによって、著しく 最小化される。

本発明の試薬（増幅プローブ及び検出プローブ）は、当業者に公知の多数の利用 可能な従来技術のオリゴヌクレオチド合成方法のいずれか１つを使用して、合成 されてもよい。好ましい方法の１つは、市販の試薬及び自動合成装置を使用する ４段階法である。この４段階法は、（１）ポリマー結合によって保護された出発 ヌクレオシド（塩基配列中の第１の核酸）の脱保護と、（２）その脱保護された 出発ヌクレオシドと、保護されたヌクレオシドホスホラミシト（ｎｕｃｌｅｏｓ ｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｓｍｉｄＨｅ）　（塩基配列中の第２の核酸）との縮 合と、（３）そのヌクレオシドの未反応５′−ヒドロキシル基のキャップ形成（ ｃｓｐｐｉｎｇ）と、それに続く、（４）新たに形成されたホスファイト結合の 酸化とを含む。

それに続いて、部分的に合成されたポリマー結合オリゴヌクレオチド塩基配列に 更に核酸を付加するために、望ましいヌクレオチドが完成するまで、これらの４ つの段階が繰り返される。

そのプロセスの各々の反復において、最後に付加されたヌクレオシドホスホラミ シトがその次のサイクルにおける出発ヌクレオシドとなる。

最終的な合成オリゴヌクレオチド鎖をそのポリマーから抽出するために、得られ たオリゴヌクレオチドを、合成のためのアンカーとして働いたポリマーから先ず 最初に分離しなければならない。そのオリゴヌクレオチドの分離は、室温で、新 鮮な濃アンモニアを用いて処理することによって実施し得る。そのポリマーから オリゴヌクレオチド溶液をデカントした後、典型的には、密封されたチューブの 中で長時間、濃アンモニア溶液を加熱してそのヌクレオシド保護基を除去する。

その後、そのオリゴヌクレオチド溶液を、ｌ−ブタノール及びエチルエーテルの ような有機溶剤を用いて抽出し、更に、合成されたオリゴヌクレオチドの濃度を 決定するために、その溶液の各々の光学密度を２６０ｎｍで分光学的に測定する 。それに続いて、調製用電気泳動又はカラムクロマトグラフィー法という公知の 方法を使用して精製及び脱塩するために、オリゴヌクレオチド溶液を乾燥しても よい。

リガーゼを用いてハイブリッド形成されたプローブを結合する場合には、増幅プ ローブ及び検出プローブを、使用可能な公知の方法のいずれかを使用してリン酸 化してもよい。好ましい方法の１つは、ポリヌクレオチドキナーゼを触媒とする リンの取り込みである。別の好ましい方法は、オリゴヌクレオチドをその担体か ら取り出す前に、そのオリゴヌクレオチドプローブが合成ポリマーに依然として 固着されている間に化学合成によって行うものである。又、リン酸化のために放 射性リンを使用することは、増幅生成物をその後でオートラジオグラフィーによ って即ち放射性標識によって・視覚化するための手段をも提供する。

本発明のプローブは又、他の標識を結合するために、公知の方法に従って他の標 識を与えてもよい。例えば、核酸プローブは２段階法を用いてその５′末端にフ ルオレセインで標識してもよく、この方法ではアミノ基が合成の間に最初に結合 される。

担体からのオリゴアミンの除去の後に、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシア ネート）のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶液を使用して、フルオレセイン をアミン修飾オリゴヌクレオチドに結合する。

実施例　１ 本発明の効果を実証するために、幾つかの異なった合成増幅塩基配列を使用した 。第３図に示すように、合成増幅塩基配列は、ＨＴＬＶ−１の５１塩基対Ｐｓｔ ｌ断片の中に含まれる。増幅プローブ及び検出プローブも、第３図に示した核酸 塩基配列に対応するように合成された。

全てのオリゴヌクレオチド塩基配列（増幅プローブ、検出プローブ、及び合成増 幅塩基配列）は、後述するように、数回の中間洗浄を伴う４段階法を使用して合 成した。合成は、市販の試薬を使用し、＾ｐｐｌｉｅ＋ｌ　Ｂｉｏｓ７ｓｌｔｍ ｉ社（ＡＢＩ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔ７゜Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）のＭｏｄｅ ｌ　３８０自動合成装置を用いて行った。

最初に、担体カラム内のポリマー結合ジメトキシルトリチルによって保護された ヌクレオシド（塩基配列中の第１核酸）から、ジクロロメタン中にトリクロロ酢 酸を３％含む溶液を１分間そのカラム中を通過させることによって、その５′− ジメトキシトリチル保護基が除去された。その後で、そのポリマーをアセトニト リルで洗浄し、次いで乾燥アセトニトリルですすいだ。

その後、脱保護されたヌクレオシドを含むそのポリマーは、次の（縮合）段階に 進む前に、アルゴン下に置かれた。

縮合段階は、最初にそのポリマーをアセトニトリル中のテトラゾールで処理する ことによって行った。次に、ポリマーを結合した脱保護ヌクレオシドを、アセト ニトリル中で、保護されたシアノエチルヌクレオシドホスホラミシト（塩基配列 中の第２核酸；　ＡＢＩ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１１７，Ｃａ１ｉ！ｏｒｎｉｔ） と反応した。この縮合反応を２．０分間実施し、その後で反応物を濾過によって 取り出した。

縮合後、ＴＨＦ　（テトラヒドロフラン）中に無水酢酸及び２．６−ルチジンを 含む、Ａ　Ｂ　Ｉ　（Ｆｏｕｌｅｒ　ＣＨｙ、　Ｃｘ１ｉｔｏｒｎｉ＊）から市 販の混合物１部と、ＴＨＦ中の１−メチルイミダゾールｆＡＢＩ。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉ＋７．Ｃａ１ｉｏｒｎｉｔから市販）１部とを混合すること によって調製した溶液を、該カラムの中を１分間に亘って通過させることによっ て、ヌクレオシドの未反応５′−ヒドロキシル基をキャップした。

キャップ形成溶液を取り出した後、そのポリマーを１．５分間に亘って酸化溶液 （Ｈ２Ｏ中の０．１Ｍ　Ｉ　２／　２．６−ルチジン／ＴＨＦ、　１：１０：４ ０）で処理した。この後、アセトニトリルですすいだ。トリクロロ酢酸／塩化メ チレン脱保護からサイクルが再び始まり、所望のオリゴヌクレオチド塩基配列が 得られるまでこのサイクルを繰り返した。

最終のポリマー結合オリゴヌクレオチド鎖を新鮮な濃アンモニアを用いて室温で ２時間処理した。そのポリマーから溶液をデカントした後、密閉チューブ中でそ の濃アンモニア溶液を６０℃で１６時間加熱した。

オリゴヌクレオチド溶液の各々を１−ブタノール及びエチルエーテルを用いて抽 出した。抽出された各々の溶液の濃度を、２６０ｎｍでの吸収を測定することに よって分光学的に測定した。

５、ＧＯ，Ｄ、単位の合成オリゴヌクレオチドを含む各抽出溶液のアリコートを 調製用電気泳動に掛けるために濃縮し、１５％ポリアクリルアミド７モル尿素ゲ ル中に載置した。電気泳動後、生成物バンドをＵ、　ｌ’、シャドウィングによ って視覚化し、前記ゲルから切り取り、溶離緩衝液（３００ｍＭ酢酸ナトリウム （ＮＩＯＡＣ）　。

２、５ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｔｌ（Ｊ、　ｐＦＩ　 ８．０）を用いて抽出し、その後、ＴＥＡＢ溶離液（重炭酸トリエチルアンモニ ウム）を使用して、Ｇ−５０５ｅｐｈｘ＋ｌｓｘ■（Ｐｈｘｔｍａｃｉ己ＫＢ　 Ｂｉｏｌｅｅｈ、Ｉｎ（。

Ｐｉｔｅ１ｔ＊ｖ＊７．Ｎｅｗ　Ｊｚｒｓｔ７）カラムで脱塩し、精製オリゴヌ クレオチドを得た。

実施例　２ ２対のプローブを用いた、５サイクルの増幅２対の増幅プローブ及び酵素による 連結反応を使用する、５サイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するために、 ２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のように確定した。

増４１！塩基配列の量 反応Ｉ：各ＩＱｆｍｏｌのＡＳ　及びＡ　Ｓ　１−２Ｉ０反応■：増幅塩基配列 なし。

添加試薬： Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＥＬＢ）が、５００ｍＭ　Ｔｒｉｉ−Ｈ Ｃｌ２（ｐＨ８，ＯＬ　４θｍｌＪ　ＭｇＣＪ２．１０ｍＭＥＤＴＡ　（ｚチレ ンジアミン四酢酸）　、　、５０ｍＶＤ　Ｔ　Ｔ　（ジチオスレイトール）、及 び５００履／ｄのＢＳＡ　（牛血清アルブミン）を含むように、ｌｏＸ濃度で調 製された。

リガーゼ／ＮＡＤ　（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）試薬が、１ ３０μＭ　ＮＤＡを含むようにＥＬＢ中で１！濃度で調製され、その試薬の２Ｉ ｊｉは１．６単位のＥ、ｃｏｌｉ　Ｌｉｌｔｓｅ（ＢｏｅｂｒｉｎｇｅｒＭ＊ｎ ｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｂｓｍｉｃｘｌｓ、　ｌ＋ｄｉｓｎ＊ｐｏｌｉｓ、　１ｎ ｄｉｔ＋ｕ）を含んだ。この試薬を増幅サイクルの持続時間の間は濡れた氷の上 に保存した。

ＥＤＴＡ／染料試薬カ、１１．８ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　６．３Ｍ尿素、０． ０２％ブロモフェノールブルー、及び０．０２％キシレンシアツールを含むよう に調製された。

増幅プローブＡ　Ｐ　ｓ、及びＡ　Ｐ　２を、約７００Ｃｉ／ｍｍｏｌ（７）比 活性を有するように（低温リンで）調整されたγ−３２Ｐ−ＡＴＰ（アデノシン −５゛−三リン酸）と、ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｃｈｒｉｎｇｓｒ　Ｍ ｔｎｎｈｔｉｍ　Ｂｉｏｃｈｚｍｉｅａｌｉ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎ ｄｉｘｎｔ）とを用いてリン酸化した。リン酸化のために放射性リンを使用する ことは、２つの役割を、即ち（１）連結反応に必要な増幅プローブ末端をリン酸 化して増幅生成物を形成すること、及び（２）それに続く、オートラジオグラフ ィーによる増幅生成物の視覚化のための手段を提供することという２つの役割を 果たした。

反応混合物の各々を、ゴム製０リング付きのスクリュートップ式１，５ｄポリプ ロピレンマイクロチユーブ（Ｓａ＋＋ｔｅｄｔ。

Ｉｎｃ、、Ｐｒ１ｎｃｚｊｏｎ、　Ｎｅｗ　ＪｔｒｓＢ）中容量１３成で、ＥＬ Ｂ中１．１５１濃度で開始し、このとき、上記の増幅塩基配列の量に加えて、各 １．５ｐｍｏｌの増幅プローブＡＰ　、　Ｐ−ＡＰ、、　Ｐ−工Ｉ ＡＰ２及びＡ　Ｐ　２．を含有させた。

反応ｌ及び■を、次のような５つのサイクルの増幅に掛けた。

１、前記ポリプロピレンマイクロチューブを密封し、試験管ラックに固定し、そ の後で、５分間、９０℃の水浴の中に入れた。

２、次いで、前記反応チューブを水浴から取り出し、室温に５分間静置し、その 後、そのチューブをエツペンドルフミクロ遠心機で短時間（数秒）遠心した。

３、　２．０Ａｅのりガーゼ／ＮＡＤ試薬を各々のチューブに加え、その内容物 を軽い撹拌によって混合した。連結反応を室温で５分間進行させて、増幅サイク ルを完了させた。

４、前記ポリプロピレンマイクロチューブを再びエツベンドルフミクロ遠心機で 短時間遠心し、段階１〜３を４回繰り返して５つのサイクルの増幅を完了させた 。

最終サイクルの後、２３１１１のＥＤＴＡ／染料試薬を加えることによって、そ の反応を止めた。止められた反応混合物を、その後、９０℃で５分間インキュベ ーションし、次に氷上で急冷した。

増幅によって得られた生成物を、当業者に公知の標準的な技術を用いて、変性作 用のある１５％ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）上の試料を電気泳動により 移動させることによって分析し、及び放射性標識された生成物をオートラジオグ ラフィーによって視覚化した。

反応効率は、ＵｌｊｒｏＳｃｘｎ　”　ＸＬレーザーデンシトメーター（Ｐｈｔ ｒｍｘｃ目ＬＫＢ　Ｂｉｏｌｅｃｈ、ｌｎｅ、、　Ｐｉ＋ｅｔ＋ｘｖｒｙ、　Ｎ ｓｖ　Ｉｅｒｓｕ）を用いてレーザーデンシトメトリーを走査し信号を積分する ことによって測定される場合の、残存している１５７−非連結増幅プローブの量 を、得られた３０マ一増幅生成物の量と比較することによって概算された。

反応ｌは、出発増幅塩基配列の１０ｆｍｏｌという最初の量から、１４５ｆａｏ ｌの３０マ一増幅生成物を生成し、理論的に可能な３２倍の増幅に対して１４． ５倍の増幅をもたらし、即ち、サイクル当たり７１％という平均効率をもたらし た。

反応■、３０マ一増幅生成物は全く検出されなかった（出発増幅塩基配列Ａ　Ｓ 　１−２及びＡ　Ｓ　、−２，を含有しない対照である）。

実施例　３ ２対のプローブを用いる、１Ｇサイクルの増幅２対の増幅プローブ及び酵素によ る連結反応を使用する、１゜サイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するため に、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のように確定した。

増幅塩基配列の量 反応Ｉ：各１！ｍｏｌのＡ　Ｓ　ｔ　−２及びＡ　Ｓ　１−２．。

反応■：増幅塩基配列なし。

添加試薬： Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＥＬＢ）、リガーゼ／ＮＡＤ試薬、及び ＥＤＴＡ／染料を実施例２の場合と同様に調製した。

増幅プローブＡＰ、及びＡＰ　を、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキ ナーゼ（ＢｏｅｈｒｉＢｅｒ　ＭＩｎｎｈｅｉ＋＋　Ｂｉｏｅｂｅｍｉｃｘ１３ １ｎｄｉｇｎｚｐｏｌｉｓ、Ｉｏｌｉ目ｎｇｌとを用いて、約７００Ｃｉ／ｍｍ ｏｌの比活性でリン酸化した。

反応混合物の各々を、スクリュートップ式ポリプロピレンマイクロチューブ中容 量１３成で、ＥＬＢ中１．１５ｘ１１１度で開始し、このとき、上記の増幅塩基 配列の量に加えて、各２．［ｌｐｍｏｌの増幅プローブＡＰ　、Ｐ−ＡＰ　、Ｐ −ＡＰ２．及びＡ　Ｐ　２．を１１′ 含ませた。

反応Ｉ及び■を、段階１〜３を９回繰り返したということを除いて、実施例２に 記載した手順に従う１０サイクルの増幅に掛けた。

最終サイクルの後、３３ｊｊｊのＥＤＴＡ／染料試薬を加えることによって、そ の反応を止め、その後９０℃で５分間加熱し、氷上で急冷した。増幅によって得 られた生成物を、変性作用のある１５％ＰＡＧＥ上の反応混合物を泳動すること によって分析し、及びオートラジオグラフィーによって視覚化した（第４図）。

生成物の収率は、走査レーザーデンシトメトリーからの積分信号によって測定さ れる場合の、得られた３０マ一増幅生成物の相対強度を、残存している１５マ一 非連結増幅プローブのものと比較することによって決定された（注：得られた２ つの鎖ＡＳ　及びＡ　Ｓ　１−２−の異なった塩基組成に起因する２つの３０マ ーバンドが存在した）。

反応Ｉは、出発増幅塩基配列１＋ｍｏｌという最初の量から、２８８ｆａｏｌの ３０マ一増幅生成物を生成した。達成された２８８倍の増幅は、計算により７６ ％の全平均効率を表わす。

反応■（増幅塩基配列を含有しない対照である）のオートラジオグラムは、１時 間の照射後、検出可能な３０マ一増幅生成物を全く示さなかった。しかし、−晩 （１６時間）照射したオートラジオグラムは反応■において微量の３０マー生成 物を示し、増幅塩基配列の非存在中での平滑末端連結反応による生成物形成を示 した。この生成物の量は、レーザーデンシトメトリーを走査することにより約１ ４１ｍｏｌと概算された。

３対の増幅プローブ及び酵素による連結反応を使用する、５つのサイクルの増幅 を伴う増幅法の効率を評価するために、２つの反応を実施した。可変的な反応物 を次のように確定した。

増幅塩基配列の量 反応Ｉ：各５１ｍｏｌのＡＳ　及びＡ　Ｓ　ｔ−３，。

反応■：増幅塩基配列なし。

添加試薬： Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｅ　Ｌ　Ｂ）及びＥＤＴＡ／染料を実施 例２の場合と同様に調製した。

リガーゼ／ＮＡＤ試薬を１３０μＭ　ＮＤＡを含むようにＥＬＢ中で１ｘ濃度で 調製し、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｌｉｇｘｓｅ（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｃｄｉｃ畠１ｓ、Ｉｎ ｃ、。

ＣｏｓｊｘＭｅ■、　Ｃ＊ＩＮｏｒ＋＋ｉｓ）の濃度は２５単位／１１１とした 。この試薬は増幅サイクルの持続時間中温れた氷の上に保存された。

この実施例では、非放射性ホスホリル基を５′−末端に導入することによって増 幅プローブＡＰ１．．ＡＰ２．ＡＰ２．及びＡＰ３をリン酸化し、更に、ＰＡＧ Ｅオートラジオグラフィーによって増幅後に得られた生成物を視覚化するために 使用される放射性標識を、別の手段によって与えられた。この非放射性ホスホリ ル基を増幅プローブＡＰ　、ＡＰ　、ＡＰ２゜１′２ 及びＡＰ３に化学的に導入し、この間それらのプローブは、５’−Ｃｈｅｍｉｃ ｘｌ　ＰｂｏｓｐｈｏＴｙ！ａ＋ｉＢ　ＲｅＢ＋ｌ　（Ｇｌ！ｎ　Ｒｅ＋ｓｇｒ ｃｈＣｏｒｐｏｊｘｔｉｏｎ、Ｈｔｒｎｄｏｎ、　Ｖｏｒｇｉｎｉｘ）を使用す るヌクレオチド脱保護前には、依然として合成樹脂上にあった［Ｈｏ　ｒ　ｎ、 　Ｔ、ら、ＴｅｔｒａｂｅｒｏＩＩ　Ｌｅｌ、、２７．　４７Ｄ５ｆ１９８６） コ　。

その後でオートラジオグラフィーによって増幅生成物を視覚化するための手段を 提供するために、増幅プローブＡＰＩ及びＡＰ３．を、約７００［ＩＣｉ／ｍｍ ｏｌの比活性で放射性リンを使用するγ−３２Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチド キナーゼ（Ｂｏｅｂ＋ｉｎｇｅｒＬｎａｈ！ｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｇｌｓ、 Ｉｎｄｉｇａｇｐｏｌｉ＋、Ｉｎｄｉａｎｓ）を用いて、リン酸化した。

リン酸化に続いて、所望の最終比活性７００Ｃｉ／ｍｏｏｔを達成するために、 ３２Ｐ−ＡＰ　及び３２Ｐ−ＡＰ、プローブを、非リン酸化ＡＰ　及びＡＰ３． プローブを用いて１：１０の比に希釈した。

増幅塩基配列の非存在中でのランダム生成物の平滑末端アセンブリへの増幅プロ ーブ５゛−末端の参入を最小化するために、この方法で増幅プローブを調製した 。即ち、ＡＰＩ及びＡ　Ｐ　３・プローブの１０分の１だけがリン酸化され、従 ってそれだけが連結反応事象に関与することが可能となる。

反応混合物の各々を、スクリュートップ式ポリプロピレンマイクロチューブ中容 量８１１１で、ＥＬＢ中Ｉ中漬Ｘ濃度始し、このとき、上記の増幅塩基配列の量 に加えて、各１．０ｐｍｏｌの増幅プローブ３２Ｐ−ＡＰ　、Ｐ−ＡＰ　、Ｐ− ＡＰ　、Ｐ−ＡＰ、。

１１′２ Ｐ−ＡＰ　及び　Ｐ　Ａ　Ｐ　３−を含有させた。

反応Ｉ及び■を、実施例２で説明したように、５つのサイクルの増幅に掛けた。

最終増幅サイクルの後、１８成のＥＤＴＡ／染料試薬を加えることによってその 反応を止めた。それに続き、この停止されて反応混合物を９０℃で５分間加熱し 、その後で氷上で急冷した。

次に、各々の反応チューブ内の内容物を、変性作用のある１５％−によって視覚 化した。その収率は、レーザーデンシトメトリーを走査することによって定量す る場合の、残存する！５７−増幅プローブ対４５７一連結増幅生成物の比から概 算された。

反応工は、出発増幅塩基配列５ｔｍｏｌから、６４．５ｔｍｏｌの４５マ一増幅 生成物を生成し、１２．９倍の増幅をもたらし、即ち、サイクル当たり６７％と いう平均効率をもたらした。反応■は、夜通しのオートラジオグラフィーの後で さえ、４５７−増幅生成物を全く示さなかった。

実施例　５ ３対のプローブを用いた、１Ｇサイクルの増幅３対の増幅プローブ及び酵素によ り連結反応を使用する、ＩＯプサイルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するため に、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のように確定した。

増幅塩基配列の量 反応工：各２ｆｏｌのＡＳ　及びＡ　Ｓ　１−３．。

反応■：増幅塩基配列なし。

添加試薬： Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｅ　Ｌ　Ｂ）及びＥＤＴＡ／染料を実施 例２の場合と同様に調製した。

リガーゼ／　Ｎ　Ａ　Ｄ試薬を、１３０μＭ　ＮＤＡを含むようにＥＬＢ中でＩ ！濃度で調製し、ε、ｃｏｌｉ　Ｌｉｇｓｅ　（Ｎｅｗ　ＥＢｌ＆ｎｄＢｉｏｌ Ｊｂｓ　Ｉｎｃ、、Ｂｅｙｔｒ１７．　Ｍ＊ｓ＋ａｃｈｕｓｓＮｓ）の濃度を１ 単位／成とし、この試薬は増幅サイクルの持続時間中温れた氷の上に保存された 。

すべての増幅プローブを実施例４で説明した通りにリン酸化した。

反応混合物の各々を、スクリュートップ式ポリプロピレンマイクロチューブ中容 量８成で、ＥＬＢ中１ｘ濃度で開始し、このとき、上記の増幅塩基配列の量に加 えて、各１．０ｐｌＩｏｌの増幅ブ０−ブ　Ｐ−ＡＰ　、Ｐ−ＡＰｌ、、Ｐ−Ａ Ｐ２．Ｐ−ＡＰ２．。

Ｐ−ＡＰ　及び　Ｐ　−Ａ　Ｐ　、、を含ませた。

両方の反応を実施例３で説明した通りにｌＧサイクルの増幅を掛けた。最後のサ イクルの後で２８Ｉｉ１のＥＤＴＡ／染料試薬を加えることによってその反応を 止め、その後９０℃で５分間加熱し、更に、氷上で急冷した。

反応混合物を、変性作用のある１５％ＰＡＧＥ上を泳動させ、それに続いて、オ ートラジオグラフィーによって視覚化した（第５図）。反応工は、前述の走査レ ーザーデンシトメトリー技術によって測定されるように、２４４　ｆ＠ｏｌの４ ５７−増幅生成物を生成した。この１２２倍の増幅はサイクル当たり６２％の全 平均効率に相当する。

夜通しのオートラジオグラフィーは反応■からの微量の４５７−増幅生成物を示 した。隣接するレーンが反応■からの４５７−増幅生成物のデンシトメトリー測 定を妨害したけれども、その４５マー生成物の量は視覚的に約０．４　＋ｎｏｌ と概算された。これは、２対のプローブを使用する１０サイクルの増幅から得ら れた約１４！ｍｏｌの３０マー平滑末端生成物（第３図）とは非常に対照的であ る。従りて、増幅法における３つのプローブの使用は、２つのプローブの使用に 比べて、ＳＮ比（ｓｉｇ■ｌ　ｔｏ　ｌ１ｏｉｓｔ　＋ｘ＋ｉｏ）において約３ ５倍の利益を与えた。

実施例　６ １つの標識された検出プローブを使用する検出法１つの標識された検出プローブ と連結された検出生成物を生成するための検出プローブの酵素的連結反応とを使 用する本発明の検出システムを実証するために、２つの反応を実施した。

可変的な反応物を次のように確定した。

増幅生成物の量 反応１　：　１（１，ｏｌｅｏｌのＡ　Ｓ　１−３．。

反応ｆｆ　：　ＩＧＨｆｍｏｌのＡＰ２゜添加試薬： リガーゼ／ＮＡＤ試薬を実施例５の場合と同様に調製した。

ＥＤＴＡ／染料試薬を、２０　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、　６．１Ｍ尿素、０． ０２％ブロモフェノールブルー、及び００２％キシレンシアツールを含むように 調製した。

検出プローブＤＰ２を、γ−Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍｘｎｎｂｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ＊ｌｓ。

１ｎｄｉ１ｎｘｐｏｌｉ＋、Ｉｎｄｉｌｎｔ）を用いて、約７０ＯＯＣｉ／ｍｍ ｏｌの比活性にリン酸化した。

反応工及び反応■の双方を、容量２３１１！で、ＥＬＢ中１．０９を濃度で開始 し、このとき検出プローブＤＰ　及び３２Ｐ　−Ｄ　Ｐ　の各々をＩＮ　！ｍｏ ｌずつその２つの反応混合物に加えた。

その反応混合物を、９０℃で５分間インキュベーションし、その後、室温で１５ 分間アニーリングした。２．０１１１のりガーゼ／ＮＡＤ試薬を各ポリプロピレ ンマイクロチューブに加え、その内容物を軽い撹拌によって混合した。連結反応 を室温で５分間進行させて検出生成物の生成を完了させた。２５Ｊ１１のＥＤＴ Ａ／染料試薬を加えることによって反応を止めた。次いで、停止させた反応混合 物を９０℃で５分間加熱し、氷上で急冷した。その後、その放射性生成物を、変 性作用のある！５％ＰＡＧＥ上で反応混合物を泳動することによって分離し、そ の放射性生成物をオートラジオグラフィーによって視覚化した（第６図）。反応 ｌは、予想された３０マー検出生成物を生成した。反応■では、連結された物質 の徴候は無かった。

実施例　７ フルオレセインを用いたプローブの標識化増幅プローブＡＰ、の５′末端を、２ 段階法を用いてフルオレセインで標識し、このとき合成の最終サイクルに５’　 −Ａｍ１ｎｏ　−Ｍｏｄｉｌｉｅｒ　Ｃ３（Ｇｌｔｎ　Ｒｅ５ｔ＊ｒＣｂ　Ｃｏ ｒｐｏｒｘｊｉｏｎ、　１ｌｅｒｎｄｏｎ、　Ｖｉｒｇｉｍｉｘ）を使用して、 合成の間に最初に１つのアミン基を結合させた［Ｂ、Ａ、Ｃｏｎｎｏ１７．　Ｎ １ｃｌｓｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｓｓ、、１５．　３１３１（１９ｇ？）］　ａその ５′−アミノ修飾剤はβ−シアノエチルホスホラミシトであり、これは（例えば ＩＢ−テトラゾールによって）活性化されると、ヌクレオシドホスホラミシトと オリゴヌクレオチドとの結合と同様の仕方でオリゴヌクレオチドの５′末端と結 合する。第１アミン基はモノメトキシトリチル基で保護され、その後で、このモ ノメトキシトリチル基は、トリクロロ酢酸を使用する脱保護サイクルの中で取り 除かれる。（実施例１で説明したよ−うに）結合、酸化、脱保護、及び担体から のオリゴアミンの除去の後で、フルオレセインを後述のようにして結合させた。

４．００．Ｄ、単位の粗オリゴヌクレオチドを、５ｐｅｔｄＶｘｃ　。

Ｅｖｍｐｏｒｘ＋ｏｒ（Ｓｘｖａｌ　Ｉｎ１ｒ■ｃｎｔｓ、ｌ＋ｃ、、Ｆ＊ｒｍ ｉｎｇｄｔｌｅ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ）で蒸発乾固した。その後、８０％エタノー ル５１Ｍをその残留物に加え、次いでその試料を再び蒸発させた。その粗オリゴ アミン残留物を、ｐＨ９，５に調整された１００　ｍＭ炭酸水素ナトリウム／炭 酸ナトリウム（Ｎ２２（Ｃｏ３／Ｎａ２Ｃｏ３）緩衝液２５４ｅに溶解した。こ れに、濃度１Ｇ、ｈ＋ｇ／ｄでＦ　Ｉ　Ｔ　ＣｆＡＩＩｒｉｃｈ　ＣｂｅｒＢｉ ｃ＊Ｉ　Ｃｏｍｐ＊Ｂ、Ｉｎｃ、、　Ｍｉ１ｖｍｕｋｅ！、Ｗｉｓｅｏｎｓｉｃ ）のＤＭＳＯ溶液２５成を加えた。得られた混合物を数秒間激しく撹拌し、その 後で数秒間遠心し、更に、室温で１５分間、暗所で反応させた。

フルオレセインで標識されたオリゴヌクレオチドの収率を最大ニスルタメニ、更 ニ２５ｄノＮｉＨＣＯ３／Ｎ１２Ｃｏ３（ｐｌ＋　９．５）緩１［ｒ液１！に２ ５ｄのＦ　Ｉ　ＴＣのＤＭＳＯ溶液（ｌｏ■／ｄ）とを加えることによって、繰 り返しＦＩＴＣと反応させた。反応を室温で１５分間行った。最終処理において は１５分間ではなくて１．５時間その反応を進行させたことを除けば同じ仕方で 、この反応を更に２回繰り返した。

フルオレセインで標識した生成物を、２２１１１０３Ｍ　）１１０Ａｔ及び９０ ０１１１の１００％エタノールを加えることによって沈澱させ、その後で一２０ ℃で２０分間冷却し、それに続いて４℃で２０分間遠心し、最後に上滑をデカン トした。次に、その沈澱生成物を１５０成の８０％エタノールで洗浄し、真空下 で短時間乾燥し、更に、５０ｕｉの試料載置用（変性）緩衝液（６，３Ｍ尿素、 ０．０２％ブロモフェノールブルー、及び０．０２％キシレンシアツール）中に 再懸濁した。その混合物を５分間煮沸することによって変性させ、その後で水浴 で急冷し、更に、１５％の調製用ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。そのフ ルオレセイン標識生成物を長波長の紫外線下の蛍光によって視覚化し、そのゲル から切り取り、更に、３００１Ｍ　ＮｔＯＡｅ　、　２．５ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　 Ａ及び１００ｍＭ　丁ｒｉｓ−ＨＣＪをｐＨ８，０で含む溶離緩衝液を使用して 、室温で３６時間溶離した。その精製された生成物を、１０ｍＭＴＥＡＢを溶離 剤として使用するＧ５０１５０５ｓｐｈａｄｅｘ■カラム（Ｓｉｇｍｉ　Ｃｈｔ ｍｉｃｘｌ　ＣｏｍｐｘＢ。

Ｓｔ、　Ｌｏｎｉｓ、旧＋５ｏｕｒｉ）上にその上清を流すことによって脱塩し た。［２６％ｍでのｎ、　ｖ、吸収によって測定される）オリゴヌクレオチドを 含む画分を集めて、蒸発させ、及び丁ｒｉ＋−Ｈα／ＥＤＴＡ（ＩＱｍＭ　Ｔｒ ｉｓ−Ｈ（Ｊ、　０．１ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　ｐＨ８，０）中に再懸濁した 。

得られた溶液の濃度をＥｌ、　Ｖ、吸収によって決定し、そのオリゴヌクレオチ ド上のフルオレセインの存在を４９５１でのＵ、　Ｖ、吸収によって確認した。

２つの標識された検出プローブと連結された検出生成物を生成するための検出プ ローブの酵素的連結反応とを使用する、本発明の検出システムを実証するために 、４つの反応を行った。

（例えば、ｒＡｇＪがフルオレセインであり及びｒＡｂＪが抗フルオレセイン抗 体である第２図を参照のこと）。

その可変的な反応物を次のように確定した。

増殖生成物の量 反応Ｉ　：　１０℃ｍｏｌのＡ　Ｓ　１−２．。

反応１１：１ｊｍｏｌのＡ　Ｓ　Ｉ−２，。

反応ｎ［：　Ａ　Ｓ　ｌ−２，なしく対照）。

反応Ｎ　：　１００１００ＧｊのＤＰＩ、。

添加試薬： リガーゼ／ＮＡＤ試薬を、１３０μＭ　ＮＡＤを含むようにＥＬＢ中１ｘ濃度で 調製し、このとき２成のその試薬は２．０単位のＥ、ｃｏｌｉ　Ｌｉｇｓ＋ＣＣ Ｎｅｖ　ＥＢｌｘｎｄ　Ｂｉｏｌｘｂｓ、Ｉｎｃ、、Ｂｅｙｃｒｌｙ。

ＭｌｏｘｅｈｕｓｅＮｓ）を含んだ０ ＥＤＴＡ／染料試薬を実施例６と同様に調製した。

１！の５ＳＰＥ及びＡＴＣ［アルカリ処理カゼイン；　Ｌｉｖｅｓ’。

１、　Ｆｌ、及びＤｏｎ＊ｌｄ、Ｒ，Ａ、、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｊａ、１ ２３１９３（１９ｇ２）１０．０１％を含む捕獲緩衝液（ｃａｐｔｕｒｅ　ｂｕ ｔｌｅｒ）を、８．７ｇのＮｇＣ７！、　１．３８ｇの一塩基性Ｎｔ１１２Ｐ０ ４　・　Ｂ２ｏ、３７０■のＥＤＴＡ及び１００■のＡＴＣを８００ａｅの８２ ０中に溶解することによって調製した。

その溶液を５Ｎ　Ｎ！ＯＨでｐＨ６，８に調整し、その後容量をＩＩ２とした。

増幅プローブＡＰ２を、γ−３２Ｐ　−Ａ　Ｔ　Ｐ及びポリヌクレオチドキナー ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ＊ｎｎｂ！ｉｍ　Ｂｉｏｅｂｅｍｉｃｓｌｓ。

１ｎｄｉｔｎ＊ｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎｓ）を用いて、約７＋ＩＱθＣｉ／ｍ ＋ａｏｌの比活性にリン酸化した。

増幅プローブＡ　Ｐ　１を、実施例７に記載した方法を用いて、その５′末端上 にフルオレセインで標識した。

磁性ヒツジ抗フルオレセイン微小球状体をＡｄ■ｎｔｅｄＭＢｎｅｔｉｃＩ１１ ａＣ，、Ｃｓａｂｒｉｄｇｅ、Ｌｓｓ、から得た。

この実施例では、Ｆｌ−ＡＰｌ及び　ＰＡ　Ｐ　２はＡ　Ｓ　ｌ−２゜の測定の ために使用される検出プライマーとして働く。Ｄ　Ｐ　１゜は潜在的な「架橋」 として働く。

各反応をｌｕｌの出発容量で二重に行い、このときそれらの反心理合物は、各々 　１０ＧｔｍｏｌのＦｌ−ＡＰ　及び　Ｐ−ＡＰ２を含み、並びにＥＬＢ中１． ２５１であるという点で同一であった。

それらの反応混合物のすべてを９０℃で５分間インキュベーションすることによ って変性し、その後、その核酸塩基配列を室温で５分間アニーリングした。ハイ ブリッド形成された検出プローブを連結するために、２．０ｍのりカーゼ／ＮＡ Ｄ試薬を各ポリプロピレンマイクロチューブに加えて、その内容物を軽く撹拌し て混合した。室温で５分間、連結反応を進行させた。その後で、３００１１１の 捕獲緩衝剤を加えることによってその連結反応を止めた。

抗フルオレセイン抗体で被覆した磁性微小球状体（ビーズ）を７５Ｘ　１２＋ｍ 試験管の中に入れ、このとき各々の試験管にはそのビーズ５０Ｉ１１を含有させ た。次に、５００１１１の捕獲Ｗｉ衝剤を加え及び数秒間その溶液を撹拌するこ とによって、該ビーズを２回洗浄し、その後、該ビーズを含む洗浄溶液をＣｏｒ ｎｉｎｇ　ＭＢｎｅｌｉｃＳ！ｐＩｒ＊ｌｏｒ　Ｕｎｉｔ　（Ｃｉｂ暑−Ｃｏｒ ｎｉｎｇ　Ｄｉ＊ｇａｏｔ目ｃｉ、Ｍｅｄｔｉｔｌｄ。

Ｌ＋ｓ＊ｃｈｎｓｅＮｓ）内に室温で５分間放置することによって該ビーズを清 澄させた。次いで、その試験管内に該ビーズを残したままその洗浄溶液の水性部 分をピペットで除去した。

反応を停止させた反応混合物の各々を、該ビーズを含む試験管の１つの中にピペ ット注入し、そのビーズは、間欠的に撹拌されながら５０℃で約１５分間、フル オレセイン標識生成物を捕獲した。フルオレセイン標識生成物を含むビーズをそ の上清から分離し、その後で、前記抗フルオレセイン抗体被覆ビーズを洗浄した のと同じ仕方で２回洗浄した。次いで、フルオレセイン標識生成物を含む洗浄さ れたビーズを３００ｔ１１の捕獲緩衝液の中に懸濁させ及びその懸濁液をポリプ ロピレンマイクロチューブの中にピペット注入することによって、該ビーズをポ リプロピレンマイクロチューブに移した。その試料はＢｅｃｋｍｘｎ　ＬＳ−６ ８００液体シンチレーシジンカウンターを使用して１分間計数された。

その結果を表１に示す。

Ｉ　１０１ｍｏｌのＡｓ１−２１１２．０６５　土　７６７ＩＩ　ｌｆｍｏｌの ＡＳｌ−２，１，１５８±　２８ｍ　ＡＳ、２．なしく対照）６３　±　２３Ｉ Ｖ　１００［ＩＬｍｏｌのＤＰｌ、　１３４　±　２８データから分かるように 、存在する増幅生成物の量に呼応した直線的応答がこのアッセイから得られた。

潜在的な「架橋」の存在（反応■）は幾らかの信号を生成したが、その信号の量 は、検出プローブのための標的として１．ｆｉ　ｔＩＩｏｌの増幅生成物を使用 して得られる信号（反応■）と比較して極微であった。

本発明の開示内容を理解した後には、本発明の思想及び範囲から逸脱しない様々 な他の実施例並びに前述の説明及び実施例の変更が当業者には明らかであろうし 、またそのような実施例又は変更のすべてが添付の請求の範囲内に含まれること を意図するものである。

浄書（応答に変更なし） Ａｓ Ｓｌ ぐ し− 手続補正書坊式） 平成２年１２月２８日　・造

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．標的核酸塩基配列の増幅塩基配列を増幅する方法であって、（ａ）複数の対 の増幅プローブの各対の構成要素プローブが互いに相補的であり、及びプローブ の各対の少なくとも１つの同一のハイブリッド形成構成要素もまた前記増幅塩基 配列部分と相補的である、複数の対の増幅プローブと前記増幅塩基配列とを接触 させること、 （ｂ）前記増幅プローブの前記ハイブリッド形成構成要素を前記増幅塩基配列の 異なる部分とハイブリッド形成させ、このとき前記増幅プローブを前記増幅塩基 配列と隣接的な仕方で結合させること、 （ｃ）前記のハイブリッド形成された増幅プローブを互いに結合させて増幅生成 物を形成すること、 （ｄ）前記標的塩基配列から前記増幅生成物の分離を行うこと、並びに （ｅ）段階（ａ）〜（ｄ）を繰り返すことを包含する方法。
2. ２．前記のハイブリッド形成された増幅プローブを酵素の作用によって互いに結 合する請求項１に記載の方法。
3. ３．前記酵素がリガーゼである請求項２に記載の方法。
4. ４．前記のハイブリッド形成された増幅プローブを化学反応によって互いに結合 する請求項１に記載の方法。
5. ５．少なくとも３つの対の増幅プローブを使用する請求項１に記載の方法。
6. ６．３つ以上の連結核酸断片を有する核酸塩基配列を検出するための方法であっ て、 （ａ）２つの検出プローブの各々が、前記核酸塩基配列内で隣接した位置にある ２つの前記連結核酸断片の各々の部分に対して相補的である、２つの前記検出プ ローブと前記核酸塩基配列とを接触させること、 （ｂ）前記検出プローブの各々を、隣接した位置にある２つの前記核酸塩基配列 断片とハイブリッド形成させ、このとき前記のハイブリッド形成される検出プロ ーブとの間で相互作用を生起させ得るのに十分互いに隣接している前記核酸塩基 配列に、前記検出プローブを結合させること、及び（ｃ）前記のハイブリッド形 成された検出プローブの存在を検出すること を包含する方法。
7. ７．前記検出プローブの少なくとも１つを標識する請求項６に記載の方法。
8. ８．前記検出プローブの一方を第１隣接標識で標識し、及び前記検出プローブの もう一方を第２隣接標識で標識する請求項７に記載の方法。
9. ９．（ａ）前記のハイブリッド形成された検出プローブを互いに結合させて連結 検出生成物を形成すること、及び（ｂ）前記連結検出生成物の存在を検出するこ とを更に包含する請求項６に記載の方法。
10. １０．前記のハイブリッド形成された検出プローブを酵素の作用によって互いに 結合する請求項９に記載の方法。
11. １１．前記酵素がリガーゼである請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記のハイブリッド形成された検出プローブを化学反応によって互いに結 合する請求項９に記載の方法。
13. １３．前記検出プローブの一方を検出可能な標識で標識し、及び前記検出プロー ブのもう一方を前記連結検出生成物を溶液から取り出すための手段で標識する請 求項９に記載の方法。
14. １４．検査試料中に存在するかもしれない標的核酸塩基配列を検出するための方 法であって、 （ａ）複数の対の増幅プローブの各対の構成要素プローブが互いに相補的であり 、及びプローブの各対の少なくとも１つの同一のハイブリッド形成構成要素もま た前記標的核酸塩基配列の増幅塩基配列と相補的である、複数の対の核酸増幅プ ローブと前記検査試料とを接触させること、 （ｂ）前記増幅プローブの前記ハイブリッド形成構成要素を前記増幅塩基配列の 異なる部分とハイブリッド形成させ、このとき前記増幅プローブを前記増幅塩基 配列と隣接的な仕方で結合させること、 （ｃ）前記のハイブリッド形成された増幅プローブを互いに結合させて増幅生成 物を形成すること、 （ｄ）前記増幅塩基配列から前記増幅生成物の分離を行うこと、（ｅ）２つの検 出プローブの各々が、前記増幅生成物内で隣接した位置にある２つの前記増幅プ ローブ断片の各々の部分に対して相補的である、２つの前記検出プローブと前記 増幅生成物とを接触させること、 （ｆ）前記検出プローブの各々を、隣接した位置にある２つの前記増幅生成物断 片とハイブリッド形成させ、このとき前記のハイブリッド形成される検出プロー ブとの間で相互作用を生起させ得るのに十分互いに隣接している前記増幅生成物 に、前記検出プローブを結合させること、並びに（ｇ）前記のハイブリッド形成 された検出プローブの存在を検出すること を包含する方法。
15. １５．（ａ）前記のハイブリッド形成された検出プローブを互いに待合させて連 結検出生成物を形成すること、及び（ｂ）前記連結検出生成物の存在を検出する ことを更に包含する請求項１４に記載の方法。
16. １６．前記のハイブリッド形成された増幅プローブを酵素の作用によって互いに 結合させる請求項１４に記載の方法。
17. １７．前記酵素がリガーゼである請求項１５に記載の方法。
18. １８．前記のハイブリッド形成された増幅プローブを化学反応によって互いに結 合させる請求項１４に記載の方法。
19. １９．複数の対の核酸増幅プローブを包含する増幅塩基配列の増幅に使用するた めの試薬であって、 増幅プローブの各対の構成要素プローブが互いに相補的であり、及び増幅プロー ブの各対の少なくとも１つの同一のハイブリッド形成構成要素もまた前記増幅塩 基配列の所与の部分と相補的であり、並びに増幅プローブの各対の核酸塩基配列 を前記増幅塩基配列の異なる部分に相補的にであるように選択し、更に前記増幅 プローブが、そのプローブが互いに結合し得るのに十分相互に隣接している前記 増幅塩基配列と、隣接的な仕方でハイブリッド形成することが可能である試薬。
20. ２０．２つの核酸検出プローブを包含する３つ以上の連結核酸断片を有する核酸 塩基配列の検出に使用するための試薬であって、前記検出プローブの各々が、前 記核酸塩基配列内で隣接した位置にある２つの前記連結核酸断片の各々の部分と 相補的であり、前記検出プローブの少なくとも１つが標識を有しており、更に前 記検出プローブが、そのプローブとの間で相互作用を生起し得るのに十分互いに 隣接している前記核酸塩基配列とハイブリッド形成することが可能である試薬。
21. ２１．検査試料中に存在するかもしれない標的核酸塩基配列の検出に使用するた めのキットであって、 （ａ）増幅プローブの各対の構成要素プローブが互いに相補的であり、及び前記 増幅プローブの各対の少なくとも１つの同一のハイブリッド形成構成要素もまた 前記標的核酸塩基配列の増幅塩基配列と相補的であり、並びに、増幅プローブの 各対の核酸塩基配列を前記増幅塩基配列の異なる部分に相補的であるように選択 し、更に前記増幅プローブが、そのプローブが互いに結合して増幅生成物を形成 し得るのに十分互いに隣接している前記増幅塩基配列と、隣接的な仕方でハイブ リッド形成することが可能である、複数の対の増幅プローブと、（ｂ）前記検出 プローブの各々が、前記増幅生成物内に隣接して位置する前記増幅生成物のつの 増幅プローブ断片の各々の部分と相補的であり、及び前記検出プローブの少なく とも１つが標識を有しており、更に前記検出プローブが、前記のハイブリッド形 成される検出プローブとの間で相互作用を生起させ得るのに十分互いに隣接して いる前記増幅生成物とハイブリッド形成することが可能である、２つの検出プロ ーブとを包含するキット。