JPS62240862A - 少なくとも１つの核酸配列を増幅する方法及び装置 - Google Patents
少なくとも１つの核酸配列を増幅する方法及び装置Info
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- C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＤＮＡ或いはＲＮ八（核酸）を増幅するための
連鎖反応の分野に関し、より詳しくは、この方法を温度
循環により自動的に行う機械の分野に関する。
連鎖反応の分野に関し、より詳しくは、この方法を温度
循環により自動的に行う機械の分野に関する。
既存の配列から核酸配列を合成するための従来の方法、
例えばホスホジエステル及びホスホトリエステル法［ナ
ラング等（Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ、） Ｍａｔｈ。
例えばホスホジエステル及びホスホトリエステル法［ナ
ラング等（Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ、） Ｍａｔｈ。
Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８．９０（１９７９） ；及びブラ
ウン等（１３ｒｏｗｎ ｅｔａｌ、）ＭｅＬｈ、Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、６８．１０９（１９７９）をそれぞれ参照］
は多量の核酸配列を製造するためには実用的なものでは
なかった。その様な方法は労力及び時間が嵩み、高価な
装置及び試薬を必要とし、又総括的効率の低いものであ
る。
ウン等（１３ｒｏｗｎ ｅｔａｌ、）ＭｅＬｈ、Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、６８．１０９（１９７９）をそれぞれ参照］
は多量の核酸配列を製造するためには実用的なものでは
なかった。その様な方法は労力及び時間が嵩み、高価な
装置及び試薬を必要とし、又総括的効率の低いものであ
る。
少瞳の既存の配列から多量に核酸配列を製造する方法が
ある。。その様な方法は適当な宿主系内に核酸配列をク
ローン化し、核酸配列が挿入されたヘクターが複製され
る宿主を培養してベクターのコピー従って配列を得るこ
とを含むものである。
ある。。その様な方法は適当な宿主系内に核酸配列をク
ローン化し、核酸配列が挿入されたヘクターが複製され
る宿主を培養してベクターのコピー従って配列を得るこ
とを含むものである。
′Ｉ゛、マニアティス等（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ、）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＣＩｏｎｉＢ
： 八 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ。
ａｌ、）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＣＩｏｎｉＢ
： 八 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ＋ ３９０−４０１（１９８２）；及び米国
特許４，４１６，９８８号及び４，４０３．０３６号各
明細書参照。元の配列は又ベクターに挿入前に有機合成
することもできる。米国特許４，２９３．６５２号明細
書参照。
ａｔｏｒｙ＋ ３９０−４０１（１９８２）；及び米国
特許４，４１６，９８８号及び４，４０３．０３６号各
明細書参照。元の配列は又ベクターに挿入前に有機合成
することもできる。米国特許４，２９３．６５２号明細
書参照。
サイキ等（Ｓａｉｋｉ ａｔ ａｌ、）、５ｃｉｅｎｃ
ｅ ２３０．１５３０−１５３４ （１９８５）により
説明される方法は、プライマー、ヌクレオチドトリホス
フェート、及びＤＮＡポリメラーゼなどの重合用試剤を
用いて１種以上の特定の核酸配列或いはその混合物を増
幅するために工夫されたものである。−・つのプライマ
ーの延長生成物は他のプライマーにハイブリダイスされ
ると所望の特種の核酸配列の製造のための鋳型になり、 又その逆も同様である。この方法を必要なだけ繰返して
所望量の配列が製造される。
ｅ ２３０．１５３０−１５３４ （１９８５）により
説明される方法は、プライマー、ヌクレオチドトリホス
フェート、及びＤＮＡポリメラーゼなどの重合用試剤を
用いて１種以上の特定の核酸配列或いはその混合物を増
幅するために工夫されたものである。−・つのプライマ
ーの延長生成物は他のプライマーにハイブリダイスされ
ると所望の特種の核酸配列の製造のための鋳型になり、 又その逆も同様である。この方法を必要なだけ繰返して
所望量の配列が製造される。
この方法は多量のＤＮＡ或いはＲＮＡが容易に入手可能
でなく、そしてより多くのＤＮＡ及びＲＮＡが試験を行
うために十分な量を得るために調製されなければならな
い場合に、胎児その他の供与者からのＤＮＡ或いはＲＮ
Ａについて臨床試験を行うために特に有用である。特定
の病気に特徴的なりＮＡ或いはＲＮＡの存在は、患者か
らの核酸のサンプルを増幅し、そして試験において検出
される核酸配列の存在を分析するための各種プローブ操
作を用いることにより検出することができる。その様な
試験には上記サイキ等により説明されている鎌状赤血球
貧血の胎児診断があり、この場合にはゲノムＤＮＡの特
定のω−グロビン標的配列の増幅の結果、標的ＤＮＡコ
ピーの指数的増大（２２０、０００倍）が生じ、診断の
感度及び速度を増大すると共にその複雑性を減少させた
。もう一つの試験はその犠牲者の核酸配列を変更させる
と考えられているＡＩＤＳウィルスの診断である。
でなく、そしてより多くのＤＮＡ及びＲＮＡが試験を行
うために十分な量を得るために調製されなければならな
い場合に、胎児その他の供与者からのＤＮＡ或いはＲＮ
Ａについて臨床試験を行うために特に有用である。特定
の病気に特徴的なりＮＡ或いはＲＮＡの存在は、患者か
らの核酸のサンプルを増幅し、そして試験において検出
される核酸配列の存在を分析するための各種プローブ操
作を用いることにより検出することができる。その様な
試験には上記サイキ等により説明されている鎌状赤血球
貧血の胎児診断があり、この場合にはゲノムＤＮＡの特
定のω−グロビン標的配列の増幅の結果、標的ＤＮＡコ
ピーの指数的増大（２２０、０００倍）が生じ、診断の
感度及び速度を増大すると共にその複雑性を減少させた
。もう一つの試験はその犠牲者の核酸配列を変更させる
と考えられているＡＩＤＳウィルスの診断である。
この増幅方法は上記分子クローニング法と幾つかの類似
性を存しているが、しかし、宿主生物体の伝播を含まず
、そこに含まれる危険性及び不都合が回避される。加え
て、この増幅法は目的配列と関連しない核酸配列の合成
を必要とせず、それにより複雑な生物学的混合物からの
生成物の広範な精製の必要性を無くす。最後に、この増
幅は目的配列からの多量の核酸配列を製造するための及
びその様な配列を比較的短時間内に製造するためのその
他の方法よりも効率的である。
性を存しているが、しかし、宿主生物体の伝播を含まず
、そこに含まれる危険性及び不都合が回避される。加え
て、この増幅法は目的配列と関連しない核酸配列の合成
を必要とせず、それにより複雑な生物学的混合物からの
生成物の広範な精製の必要性を無くす。最後に、この増
幅は目的配列からの多量の核酸配列を製造するための及
びその様な配列を比較的短時間内に製造するためのその
他の方法よりも効率的である。
当初上記増幅方法は実験室において手動により行われた
。この手動方法は多数繰返される液体取扱工程及び制御
された温度におけるインキュベーションを含むものであ
る。これは単に時間がかかり退屈であるのみならず、そ
れはヌヒトのオペレータによる緊張のはずれによって生
ずる誤りにもつながるものである。その様な誤りは遺伝
的出産欠陥の診断ミスや不必要な妊娠中絶が行われたり
、或いは出産欠陥が存在する場合に妊娠中絶がなされな
いことなどが生じ得る。更に、その様な誤りの結果鎌状
赤＊球貧血その他の遺伝的障害の誤診を生じ得る。
。この手動方法は多数繰返される液体取扱工程及び制御
された温度におけるインキュベーションを含むものであ
る。これは単に時間がかかり退屈であるのみならず、そ
れはヌヒトのオペレータによる緊張のはずれによって生
ずる誤りにもつながるものである。その様な誤りは遺伝
的出産欠陥の診断ミスや不必要な妊娠中絶が行われたり
、或いは出産欠陥が存在する場合に妊娠中絶がなされな
いことなどが生じ得る。更に、その様な誤りの結果鎌状
赤＊球貧血その他の遺伝的障害の誤診を生じ得る。
更に、ある種の核酸は他のものよりもより効率的に増幅
し、その結果核酸配列増幅のあるものは他のものよりも
より多くの増幅サイクルを必要とする。実験室労働力の
コストは高いことがあり得るので、又実験室が曝される
危険性は誤って増幅を行う場合の誤りにおいて高いので
、この増幅方法を自動化し得る系の必要性が生じた。
し、その結果核酸配列増幅のあるものは他のものよりも
より多くの増幅サイクルを必要とする。実験室労働力の
コストは高いことがあり得るので、又実験室が曝される
危険性は誤って増幅を行う場合の誤りにおいて高いので
、この増幅方法を自動化し得る系の必要性が生じた。
本発明は、熱安定性酵素が用いられる場合に、この増幅
方法を実施するための温度−循環装置を利用するもので
ある。熱安定性酵素の使用は、酵素が熱の存在下におい
て不安定である場合に必要とされる酵素の液体移転の必
要性を回避する。
方法を実施するための温度−循環装置を利用するもので
ある。熱安定性酵素の使用は、酵素が熱の存在下におい
て不安定である場合に必要とされる酵素の液体移転の必
要性を回避する。
より具体的には、本発明は下記手段を含んでなる少なく
とも一つの特定の核酸配列の自動化された増幅を行うた
めの装置に関する： 熱安定性酵素、増幅されるべき核酸配列、４種の異るヌ
クレオチドトリホスフェート及び増幅されるべき各々異
る特定の配列について一つのオリゴヌクレオチドプライ
マーよりなる反応混合物（ここで、各プライマーは、一
つのプライマーから合成される延長生成物がそれがその
相補体から分離された後に他方のプライマーの延長生成
物の合成のための鋳型として役立ち得るように、各特定
の配列の異る鎖に対して実質的に相補的であるように選
ばれる）を保持するための熱伝導性容器、該容器を複数
の所定の（ユーザーにより規定された）温度のいずれか
に加熱、冷却及び維持するための手段であって、且つ該
容器が加熱、冷却、又は維持される該所定温度がいづれ
であるかを制御する制御信号を受取るための入力を存す
る手段、及び 温度レベル、温度変化率勾配、及びある温度レベルにお
けるインキューベーションの時間を制御するために適当
な制御信号を発生するための該加熱及び冷却手段の人力
に連結されたコンビョ、−タ手段。
とも一つの特定の核酸配列の自動化された増幅を行うた
めの装置に関する： 熱安定性酵素、増幅されるべき核酸配列、４種の異るヌ
クレオチドトリホスフェート及び増幅されるべき各々異
る特定の配列について一つのオリゴヌクレオチドプライ
マーよりなる反応混合物（ここで、各プライマーは、一
つのプライマーから合成される延長生成物がそれがその
相補体から分離された後に他方のプライマーの延長生成
物の合成のための鋳型として役立ち得るように、各特定
の配列の異る鎖に対して実質的に相補的であるように選
ばれる）を保持するための熱伝導性容器、該容器を複数
の所定の（ユーザーにより規定された）温度のいずれか
に加熱、冷却及び維持するための手段であって、且つ該
容器が加熱、冷却、又は維持される該所定温度がいづれ
であるかを制御する制御信号を受取るための入力を存す
る手段、及び 温度レベル、温度変化率勾配、及びある温度レベルにお
けるインキューベーションの時間を制御するために適当
な制御信号を発生するための該加熱及び冷却手段の人力
に連結されたコンビョ、−タ手段。
本発明は又１記手段を含んでなる少なくとも一つの特定
の核酸配列の自動化された増幅を行うための装置を提供
するものである： 該増幅されるべき核酸配列、４種の異るヌクレオチドト
リホスフェート、熱安定性酵素及び増幅されるべき各々
の異る特定の配列につき一つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーを含んでなる反応混合物（ここで、各プライマー
は、一つのプライマーから合成される延長生成物がそれ
がその相補体から分離された後に他方のプライマーの延
長生成物の合成のための鋳型として役立ち得るように各
特定の配列の異る鎖に実質的に相補的であるように選ば
れる）を保持するための第一の手段（ここで、該保持は
任意の選ばれた温度或いは複数の温度において行われる
）、及び 該第一の手段にその内容物を第一の期間加熱させ、そし
てその内容物を第二の期間冷却させることを含む所定の
順序の工程を自動的に行うための第二の手段。
の核酸配列の自動化された増幅を行うための装置を提供
するものである： 該増幅されるべき核酸配列、４種の異るヌクレオチドト
リホスフェート、熱安定性酵素及び増幅されるべき各々
の異る特定の配列につき一つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーを含んでなる反応混合物（ここで、各プライマー
は、一つのプライマーから合成される延長生成物がそれ
がその相補体から分離された後に他方のプライマーの延
長生成物の合成のための鋳型として役立ち得るように各
特定の配列の異る鎖に実質的に相補的であるように選ば
れる）を保持するための第一の手段（ここで、該保持は
任意の選ばれた温度或いは複数の温度において行われる
）、及び 該第一の手段にその内容物を第一の期間加熱させ、そし
てその内容物を第二の期間冷却させることを含む所定の
順序の工程を自動的に行うための第二の手段。
又、もう一つの実施態様においては、本発明は下記手段
を含んでなる、アッセイの連続工程の一部に加熱及び冷
却工程を含むアッセイを行うための装置を提供するもの
である： 加熱及び冷却工程が有益である一連の工程を行うための
手段、及び 該加熱及び冷却工程を、アッセイを構成する一連の工程
における適当な時点において行わせるための該手段内の
手段。
を含んでなる、アッセイの連続工程の一部に加熱及び冷
却工程を含むアッセイを行うための装置を提供するもの
である： 加熱及び冷却工程が有益である一連の工程を行うための
手段、及び 該加熱及び冷却工程を、アッセイを構成する一連の工程
における適当な時点において行わせるための該手段内の
手段。
もう一つの実施態様においては、本発明は下記工程を含
んでなる、少なくとも一つの特定の核酸配列を増幅する
ための方法を提供する：コンピューターにより指令され
た機械を用いて、増幅されるべき核酸、４種の異るヌク
レオチドホスフェート、熱安定性酵素、及び増幅される
べき各々の異る特定の配列ついて１個のオリゴヌクレオ
チドプライマーよりなるサンプル（ここで、各プライマ
ーは、一つのプライマーから合成される延長生成物がそ
れが相補体から分離された場合に他のプライマーの延長
生成物の合成のための鋳型として役立ち得るように各特
定の配列の異った鎖に実質的に相補的であるように選ば
れる）（以下混合物という）を所定の温度に所定時間加
熱する工程、及び コンピューターにより指令された機械を用いて、この混
合物をユーザーにより規定された温度に加熱し、そして
この混合物をユーザーにより規定された温度に冷却する
工程。
んでなる、少なくとも一つの特定の核酸配列を増幅する
ための方法を提供する：コンピューターにより指令され
た機械を用いて、増幅されるべき核酸、４種の異るヌク
レオチドホスフェート、熱安定性酵素、及び増幅される
べき各々の異る特定の配列ついて１個のオリゴヌクレオ
チドプライマーよりなるサンプル（ここで、各プライマ
ーは、一つのプライマーから合成される延長生成物がそ
れが相補体から分離された場合に他のプライマーの延長
生成物の合成のための鋳型として役立ち得るように各特
定の配列の異った鎖に実質的に相補的であるように選ば
れる）（以下混合物という）を所定の温度に所定時間加
熱する工程、及び コンピューターにより指令された機械を用いて、この混
合物をユーザーにより規定された温度に加熱し、そして
この混合物をユーザーにより規定された温度に冷却する
工程。
更にもう一つの態様においては、本発明は下記工程を含
んでなる、少なくとも一つの特定の核酸配列を増幅する
だめの方法を提供する：ａ）コンピューターにより指令
された機械を用いて、加熱装置に熱信号を与えて反応室
を所定時間、所定温度まで及び／又は所定温度において
加熱させる工程（ここで、該反応室は前記の混合物を含
む）、 ｂ）コンピューターにより指令された機械を用いて、冷
却装置に冷却信号を与えて該反応室を所定時間所定温度
まで冷却させる工程、及びＣ）これまでに行われたサイ
クル数がユーザーにより規定されたサイクル数より少な
い場合に、能動冷却信号の経過時間がユーザーにより規
定された時間に等しい時に、工程ａ）からＣ）よりなる
ザイクルを繰返す工程。
んでなる、少なくとも一つの特定の核酸配列を増幅する
だめの方法を提供する：ａ）コンピューターにより指令
された機械を用いて、加熱装置に熱信号を与えて反応室
を所定時間、所定温度まで及び／又は所定温度において
加熱させる工程（ここで、該反応室は前記の混合物を含
む）、 ｂ）コンピューターにより指令された機械を用いて、冷
却装置に冷却信号を与えて該反応室を所定時間所定温度
まで冷却させる工程、及びＣ）これまでに行われたサイ
クル数がユーザーにより規定されたサイクル数より少な
い場合に、能動冷却信号の経過時間がユーザーにより規
定された時間に等しい時に、工程ａ）からＣ）よりなる
ザイクルを繰返す工程。
本発明の装置は又一般的に、操作のための電力供給源、
装置の全要素を収用するための構造系統及びオペレータ
ーによる装置の制御を可能にするキーボード及びディス
プレイパネルを含むものである。
装置の全要素を収用するための構造系統及びオペレータ
ーによる装置の制御を可能にするキーボード及びディス
プレイパネルを含むものである。
そこで反応が起こる試薬を保持する受容部はその温度を
ユーザーにより規定されたあるインキュヘーションプロ
フィールに一致するよう゛にコンピュータにより制御さ
れる。３個の循環流体貯蔵器及びソレノイド操作される
バルブ、或いは任意のその他の方法を用いて温度が制御
される。
ユーザーにより規定されたあるインキュヘーションプロ
フィールに一致するよう゛にコンピュータにより制御さ
れる。３個の循環流体貯蔵器及びソレノイド操作される
バルブ、或いは任意のその他の方法を用いて温度が制御
される。
ＭａＬｃｒｉａｌｓ ［１ｌｅｃＬｒｏｎｉｃｓ Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（トレントン、
ニューシャーシー州）から市販されているＰｃ１Ｌｉｅ
ｒ （ベルチェ）ソリッドステートヒートポンプ、並
びにコンピュータにより制御される水熱交換器或いは任
意のその他の加熱及び冷却系も使用されてよい。
ｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（トレントン、
ニューシャーシー州）から市販されているＰｃ１Ｌｉｅ
ｒ （ベルチェ）ソリッドステートヒートポンプ、並
びにコンピュータにより制御される水熱交換器或いは任
意のその他の加熱及び冷却系も使用されてよい。
ソレノイドにより操作されるバルブが用いられる場合に
は、それらは、コンピュータ制御下にある増幅操作中の
適当な時点において、適当な温度の流体が熱伝導性受容
部のための支持構造を通して通過することのできるよう
にコンピュータに連結される。この受容部は、コンピュ
ータ制御下に、受容部の支持構造を通して高温流体或い
は低温流体のいづれかを入れるように工程中の適当な時
点において制御信号をソレノイドにより操作されるバル
ブに送信することにより、二つの温度間にスイッチされ
る。この反応室に温度センサーが連結され、そして実際
の温度を指示する信号を与えるためにコンピューターが
使用される。コンピュータは実際の温度を所望温度と比
較する。この様にして誤差信号が発生され、それを用い
て反応室を加熱及び冷却する装置を制御する。コンピュ
ータは又、この方法おけるインキュベーションを実施す
るための特定の温度における経過時間も追跡する。
は、それらは、コンピュータ制御下にある増幅操作中の
適当な時点において、適当な温度の流体が熱伝導性受容
部のための支持構造を通して通過することのできるよう
にコンピュータに連結される。この受容部は、コンピュ
ータ制御下に、受容部の支持構造を通して高温流体或い
は低温流体のいづれかを入れるように工程中の適当な時
点において制御信号をソレノイドにより操作されるバル
ブに送信することにより、二つの温度間にスイッチされ
る。この反応室に温度センサーが連結され、そして実際
の温度を指示する信号を与えるためにコンピューターが
使用される。コンピュータは実際の温度を所望温度と比
較する。この様にして誤差信号が発生され、それを用い
て反応室を加熱及び冷却する装置を制御する。コンピュ
ータは又、この方法おけるインキュベーションを実施す
るための特定の温度における経過時間も追跡する。
出発物質が反応ウェル内に負荷された後に増幅処決を実
施するために機械が行う基本的操作は水浴を用いる一つ
の実施態様においては以下の通りである。
施するために機械が行う基本的操作は水浴を用いる一つ
の実施態様においては以下の通りである。
反応室の支持構造体を介して高温流体を入れるようにコ
ンピュータがソレノイド操作バルブに信号を出すことに
より反応ウェルの内容物を高温流体の温度まで加熱する
。
ンピュータがソレノイド操作バルブに信号を出すことに
より反応ウェルの内容物を高温流体の温度まで加熱する
。
高温流体が“オン”の状態で入れられる時間は経過時間
カウンタにより測定される。
カウンタにより測定される。
コンピュータは高温流体が“オン”の状態で入れられた
経過時間を記憶中の変数設定値と対比する。好ましい実
施態様においてはこの変数はユーザーインターフェース
を介してユーザーにより変更することができる。他の実
施態様においては、それは固定されていてもよい。
経過時間を記憶中の変数設定値と対比する。好ましい実
施態様においてはこの変数はユーザーインターフェース
を介してユーザーにより変更することができる。他の実
施態様においては、それは固定されていてもよい。
経過時間が高温インキュベーションに対する変数に一致
した場合には、コンピュータはソレノイド操作バルブに
高温流体流れを停止させ、反応容器の支持構造体を通し
て低温流体流れを入れるように信号を送る。
した場合には、コンピュータはソレノイド操作バルブに
高温流体流れを停止させ、反応容器の支持構造体を通し
て低温流体流れを入れるように信号を送る。
高温及び低温流体のために経験的に決定された“オン”
の状態の時間の代りに温度制御フィードバックを用いる
実施態様においては、ユーザーインターフェースを介し
てコンピュータ内に、反応室についての温度プロフィー
ル対時間がプログラムされる。これにより、コンピュー
タが、特定の増幅反応パラメータにより要求される順序
で反応温度或いは反応試薬容器温度を制御する。その様
な実施態様においては、反応室の温度を追跡するために
サーミスタ或いはその他の温度センサーを用い反応室の
実際の温度をユーザーにより規定された温度プロフィー
ルと比較することにより得られる誤差信号が発生する。
の状態の時間の代りに温度制御フィードバックを用いる
実施態様においては、ユーザーインターフェースを介し
てコンピュータ内に、反応室についての温度プロフィー
ル対時間がプログラムされる。これにより、コンピュー
タが、特定の増幅反応パラメータにより要求される順序
で反応温度或いは反応試薬容器温度を制御する。その様
な実施態様においては、反応室の温度を追跡するために
サーミスタ或いはその他の温度センサーを用い反応室の
実際の温度をユーザーにより規定された温度プロフィー
ルと比較することにより得られる誤差信号が発生する。
この誤差信号を用いてヒートポンプその他の加熱及び冷
却装置を制御し、高温加熱及び高温インキュベーション
の際及び冷却及び低温インキュベーションの際に所望の
温度プロフィールを維持する。
却装置を制御し、高温加熱及び高温インキュベーション
の際及び冷却及び低温インキュベーションの際に所望の
温度プロフィールを維持する。
温度フィードハックの態様或いは経験的に決定された時
間の態様のいづれにおいても、コンピュータはタイマー
をスタートさせ、高温或いは低温流体流れに対する経過
時間或いは特定の温度における経過時間を温度プロフィ
ールにおける各セグメント即ちし・フグについての記憶
装置内に貯蔵されたユーザーにより規定された変数と対
比する。
間の態様のいづれにおいても、コンピュータはタイマー
をスタートさせ、高温或いは低温流体流れに対する経過
時間或いは特定の温度における経過時間を温度プロフィ
ールにおける各セグメント即ちし・フグについての記憶
装置内に貯蔵されたユーザーにより規定された変数と対
比する。
好ましい実施態捧においては、これらの変数はユーザー
によりユーザーインターフェイスを介して設定すること
ができる。温度センサーが用いられない場合の実施態様
においては、高温或いは低温流体流れの提案される時間
についての変数は、ユーザーにより経験的に反応容器を
出発温度から所定温度まで加熱或いは冷却するのに必要
な時間プラス所望のインキュベーション時間として決定
される。
によりユーザーインターフェイスを介して設定すること
ができる。温度センサーが用いられない場合の実施態様
においては、高温或いは低温流体流れの提案される時間
についての変数は、ユーザーにより経験的に反応容器を
出発温度から所定温度まで加熱或いは冷却するのに必要
な時間プラス所望のインキュベーション時間として決定
される。
高温及び低温流体貯蔵器及びソレノイド操作バルブを用
いる実施態様のための上記温度プロフィール制御装置及
び方法は反応室に連結されたＰｅｔｔｉｅｒヒートポン
プ或いはその他の形態の加熱及び冷却装置を用いる実施
態様にも同様に適用可能である。
いる実施態様のための上記温度プロフィール制御装置及
び方法は反応室に連結されたＰｅｔｔｉｅｒヒートポン
プ或いはその他の形態の加熱及び冷却装置を用いる実施
態様にも同様に適用可能である。
第１図は熱安定性酵素を使用して核酸増幅方法を実施す
ることのできる機械の一般的ブロック線図である。増幅
されるべき核酸試料及び必要な試薬よりなる出発物質は
先ず熱交換器１０内の反応ウェル４０中に充填される。
ることのできる機械の一般的ブロック線図である。増幅
されるべき核酸試料及び必要な試薬よりなる出発物質は
先ず熱交換器１０内の反応ウェル４０中に充填される。
熱交換器１０は反応ウェル４０を支持し、このものは熱
交換器内に機械工作された凹みであってよいが、しかし
、好ましくは反応に含まれる流体を保持し、且つ熱交換
器１０内に形成された凹みにあるプラスチック容器（以
後時々プレート１と称する）である。好ましい実施態様
においては、熱交換器１ｏは好ましくはアルミニウム製
の与えられた数の０．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管を
その中に嵌込むことができるような大きさの複数の凹み
を形成した熱伝導性ブロックである。
交換器内に機械工作された凹みであってよいが、しかし
、好ましくは反応に含まれる流体を保持し、且つ熱交換
器１０内に形成された凹みにあるプラスチック容器（以
後時々プレート１と称する）である。好ましい実施態様
においては、熱交換器１ｏは好ましくはアルミニウム製
の与えられた数の０．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管を
その中に嵌込むことができるような大きさの複数の凹み
を形成した熱伝導性ブロックである。
これらの管の目的は、同一の反応ウェルが異った核酸配
列を増幅させるために用いられた場合に交差汚染を避け
るように流体を熱交換器ＩＯ内の凹みの壁から分離する
ために反応ウェルを内張すするものである。熱交換器１
０の目的は、管を支持し、そして反応成分がユーザーに
より規定された時間にわたり各種温度においてインキュ
ベートされるように、反応ウェル内の管内に貯蔵された
流体に或いは流体から熱エネルギーを移動させるための
熱交換器として作用することである。
列を増幅させるために用いられた場合に交差汚染を避け
るように流体を熱交換器ＩＯ内の凹みの壁から分離する
ために反応ウェルを内張すするものである。熱交換器１
０の目的は、管を支持し、そして反応成分がユーザーに
より規定された時間にわたり各種温度においてインキュ
ベートされるように、反応ウェル内の管内に貯蔵された
流体に或いは流体から熱エネルギーを移動させるための
熱交換器として作用することである。
その目的のために、熱交換器ｌＯは反応室４０のごとき
反応ウェル内の流体が操作中の適当な時点で、しかも適
当な時間にわたり且つ加熱及び冷却されるような構造を
有していなければならない。
反応ウェル内の流体が操作中の適当な時点で、しかも適
当な時間にわたり且つ加熱及び冷却されるような構造を
有していなければならない。
この加熱及び冷却機能を実行するために、任意の構造成
いは方法、例えば熱交換器内或いはそれに連結された電
気加熱、及び冷蔵装置、例えばヒートポンプ或いはソリ
ッドステートの熱電子クーラーなどが用いられる。この
加熱及び冷却のためには使用される温度を到達しそして
それを維持することのできる装置であれば何であれ用い
られ、又その加熱及び冷却装置がユーザー規定の温度対
時間のプロフィールを達成するものであればよい。
いは方法、例えば熱交換器内或いはそれに連結された電
気加熱、及び冷蔵装置、例えばヒートポンプ或いはソリ
ッドステートの熱電子クーラーなどが用いられる。この
加熱及び冷却のためには使用される温度を到達しそして
それを維持することのできる装置であれば何であれ用い
られ、又その加熱及び冷却装置がユーザー規定の温度対
時間のプロフィールを達成するものであればよい。
第１図に示される好ましい実施態様においては、一つの
その様な電気的に駆動される加熱及び冷却装置はＭｅｌ
ｃｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （）レントン、ニュ
ーシャーシー州）から市販されているＰｅｔｔｉｅｒソ
リッドステート熱電子ヒートポンプ１２である。コンプ
レフサ、エバポレータ及びコンデンサを用いる通常のヒ
ートポンプも又ヒートポンプ１２として有用である。Ｐ
ｅ１Ｌｉｃｒ装置などのソリッドステートヒートポンプ
はバック対バックのＰＮ結合を形成する配向多結晶イン
ゴットの形態において且つセラミック板でインターフェ
イスされた銅バスバーに末端がハンダ付されたＮ及びＰ
型のテルル化ビスマスよりなる。第３図はその様な配置
を示す。これらのヒートポンプは、ヒートシンク１４と
熱交換器１０の間のいづれの方向にも熱を移動させるた
めの既知の方法により、特にそれらの中に電流を通すこ
とにより加熱或いは冷却する。これらのソリッドステー
トヒートポンプはＧｉｌｆｏｒｄＩｎｓＬｒｕｍｅｎＬ
ｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによりギュベットを加熱及
び冷却するために用いられており、１５０ワツトまでの
範囲のワット数が利用可能である。これらの装置はこれ
らに熱的に連結された物質の塊を、）■氏−１５０度乃
至＋１１０度の範囲の温度まで冷却或いは加熱すること
ができる。その様な半導体は熱交換器■０に公知の方法
で熱的に連結することが出来、或いは挿入管或いはウェ
ルに直接熱的に連結することも可能である。その様な半
導体は標単的プロセス制御アルゴリズムに従い、所望の
温度レベルに応じてそれらの中を流れる電流を変調する
ことにより容易に制御して特定の温度を達成し、そして
維持することができる。その様なソリッドステートヒー
トポンプ系の設計方法はＭｅｌｃｏｒ（９９０５ｐｒｕ
ｃｅ ５ＬｒｅｅＬ、 トレントン、ＮＪＯ８６４Ｂ
（６０９） −３９３−４１７８）による出願に開示
されている。
その様な電気的に駆動される加熱及び冷却装置はＭｅｌ
ｃｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （）レントン、ニュ
ーシャーシー州）から市販されているＰｅｔｔｉｅｒソ
リッドステート熱電子ヒートポンプ１２である。コンプ
レフサ、エバポレータ及びコンデンサを用いる通常のヒ
ートポンプも又ヒートポンプ１２として有用である。Ｐ
ｅ１Ｌｉｃｒ装置などのソリッドステートヒートポンプ
はバック対バックのＰＮ結合を形成する配向多結晶イン
ゴットの形態において且つセラミック板でインターフェ
イスされた銅バスバーに末端がハンダ付されたＮ及びＰ
型のテルル化ビスマスよりなる。第３図はその様な配置
を示す。これらのヒートポンプは、ヒートシンク１４と
熱交換器１０の間のいづれの方向にも熱を移動させるた
めの既知の方法により、特にそれらの中に電流を通すこ
とにより加熱或いは冷却する。これらのソリッドステー
トヒートポンプはＧｉｌｆｏｒｄＩｎｓＬｒｕｍｅｎＬ
ｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによりギュベットを加熱及
び冷却するために用いられており、１５０ワツトまでの
範囲のワット数が利用可能である。これらの装置はこれ
らに熱的に連結された物質の塊を、）■氏−１５０度乃
至＋１１０度の範囲の温度まで冷却或いは加熱すること
ができる。その様な半導体は熱交換器■０に公知の方法
で熱的に連結することが出来、或いは挿入管或いはウェ
ルに直接熱的に連結することも可能である。その様な半
導体は標単的プロセス制御アルゴリズムに従い、所望の
温度レベルに応じてそれらの中を流れる電流を変調する
ことにより容易に制御して特定の温度を達成し、そして
維持することができる。その様なソリッドステートヒー
トポンプ系の設計方法はＭｅｌｃｏｒ（９９０５ｐｒｕ
ｃｅ ５ＬｒｅｅＬ、 トレントン、ＮＪＯ８６４Ｂ
（６０９） −３９３−４１７８）による出願に開示
されている。
第２図に図示されたもう一つの実施態様においては、流
体の貯蔵器を一定温度に維持する水浴Ｉ６及び１８が使
用される。ここでも又、熱交換器１０はアルミニウム板
或いは良好な熱伝導特性を有するその他の金属である。
体の貯蔵器を一定温度に維持する水浴Ｉ６及び１８が使
用される。ここでも又、熱交換器１０はアルミニウム板
或いは良好な熱伝導特性を有するその他の金属である。
この熱交換器の金属内に加熱或いは冷却流体がポンプ送
りされる流路が機械工作され或いは成形される。第２図
に図示される機械の一つの実施態様において、熱交換器
１０は管４２に連結した流体入口及び管４４に連結した
流体出口を有する。これらの二本の管は流体マルチプレ
キサ−４６の出力に連結している。
りされる流路が機械工作され或いは成形される。第２図
に図示される機械の一つの実施態様において、熱交換器
１０は管４２に連結した流体入口及び管４４に連結した
流体出口を有する。これらの二本の管は流体マルチプレ
キサ−４６の出力に連結している。
この流体マルチプレキサ−は二対の入口／出口を有する
。一方の対４７は高温流体搬送管４８及び５０に連結さ
れており、そして他方の対４９は低温流体搬送管５２及
び５４に連結されている。各対の口は一つの入口路及び
一つの出口路を有する。
。一方の対４７は高温流体搬送管４８及び５０に連結さ
れており、そして他方の対４９は低温流体搬送管５２及
び５４に連結されている。各対の口は一つの入口路及び
一つの出口路を有する。
例えば第一の対は管４８に連結されたその入口路及び管
５０に連結されたその出口路を有する。同様に流体マル
チプレキサ−４６の出口対は管４２に連結された一つの
出口路及び管４４に連結された一つの入１コ路を有する
。流体マルチプレキサ−４６の目的は第一の入口対、管
４８及び５０、或いは第二の入口対、管５２及び５４の
いづれかを選択的にライン５６上の選択信号に従って出
口対４３に選択的に連結することである。第一の対の口
４７が選ばれるならば、管４８は５ＯＶ−１と示される
ソレノイド操作バルブの形の流体マルチプレキサ−４６
中の内部流体流路を介して流体連通的に管４２に連結さ
れる。同様に、管５０は５ＯＶ２で示されるソレノイド
操作バルブの形の流体制御マルチプレキサ−４６内の内
部流体流路を介して管４４に連結される。第二の対の口
４９が選ばれる場合にも同様な接続が生ずる。
５０に連結されたその出口路を有する。同様に流体マル
チプレキサ−４６の出口対は管４２に連結された一つの
出口路及び管４４に連結された一つの入１コ路を有する
。流体マルチプレキサ−４６の目的は第一の入口対、管
４８及び５０、或いは第二の入口対、管５２及び５４の
いづれかを選択的にライン５６上の選択信号に従って出
口対４３に選択的に連結することである。第一の対の口
４７が選ばれるならば、管４８は５ＯＶ−１と示される
ソレノイド操作バルブの形の流体マルチプレキサ−４６
中の内部流体流路を介して流体連通的に管４２に連結さ
れる。同様に、管５０は５ＯＶ２で示されるソレノイド
操作バルブの形の流体制御マルチプレキサ−４６内の内
部流体流路を介して管４４に連結される。第二の対の口
４９が選ばれる場合にも同様な接続が生ずる。
この様にして、熱交換器１０、及びウェル４０のごとき
反応ウェル内の管に貯蔵された流体の温度は導体５６上
のＴＥＭＰ ５ＥＬＥＣＴ信号の状態により制御される
。一つの実施態様において、流体マルプフレキサ−４６
は適当に管４２ 、４４ 、４８ 、５０ 、５２及び
５４と相互連結された５ＯＶＩ〜４で示される四つのソ
レノイド操作バルブで操作される。しかしながら、上記
流体切替えを行うことのできる任意の装置で十分である
。事実、熱交換器１０の温度の操作に関してソリッドス
テートの或いは通常のヒートポンプ１２が使用されるな
らば、流体マルチプレキサ−４６の必要性及び費用が除
去される。
反応ウェル内の管に貯蔵された流体の温度は導体５６上
のＴＥＭＰ ５ＥＬＥＣＴ信号の状態により制御される
。一つの実施態様において、流体マルプフレキサ−４６
は適当に管４２ 、４４ 、４８ 、５０ 、５２及び
５４と相互連結された５ＯＶＩ〜４で示される四つのソ
レノイド操作バルブで操作される。しかしながら、上記
流体切替えを行うことのできる任意の装置で十分である
。事実、熱交換器１０の温度の操作に関してソリッドス
テートの或いは通常のヒートポンプ１２が使用されるな
らば、流体マルチプレキサ−４６の必要性及び費用が除
去される。
流体マルプフレキサー４６に連結された管内を流れる加
熱及び冷却流体はそれぞれ高温流体貯蔵器１６及び低温
流体貯蔵器１８からポンプ送りされる。これらの貯蔵器
の目的はその様な流体の体積を維持すること或いは一定
温度において凍結防止することである。一般的に、高温
流体は８０〜１５０℃、好ましくは９０〜１００℃の温
度に維持され、及び低温流体は約３５〜６０℃、好まし
くは３７℃〜５０℃の一定温度に維持される。貯蔵器１
６及び１８はそれらがそれらの流体貯蔵器を維持する温
度に関して調整可能である。水浴１８は一３５〜＋１５
０℃の範囲のいづれにおいても貯蔵器温度を達成するこ
とができるように調整可能であるのが好ましい。この水
浴１８は１３１の水容積及び毎分１００℃を越える冷却
速度を有するような迅速な冷却特性を有するのが好まし
い。これは温度安定化時間を最少にするのに役立つ。増
幅操作の期間に亘ってその様な温度を達成しそして維持
することのできる任意の流体加熱及び冷却装置が本発明
の目的のために十分である。好ましい実施態様において
は、ＶＷＩ？ １１３５及びＶＷＲ１１５５水浴が用い
られる。
熱及び冷却流体はそれぞれ高温流体貯蔵器１６及び低温
流体貯蔵器１８からポンプ送りされる。これらの貯蔵器
の目的はその様な流体の体積を維持すること或いは一定
温度において凍結防止することである。一般的に、高温
流体は８０〜１５０℃、好ましくは９０〜１００℃の温
度に維持され、及び低温流体は約３５〜６０℃、好まし
くは３７℃〜５０℃の一定温度に維持される。貯蔵器１
６及び１８はそれらがそれらの流体貯蔵器を維持する温
度に関して調整可能である。水浴１８は一３５〜＋１５
０℃の範囲のいづれにおいても貯蔵器温度を達成するこ
とができるように調整可能であるのが好ましい。この水
浴１８は１３１の水容積及び毎分１００℃を越える冷却
速度を有するような迅速な冷却特性を有するのが好まし
い。これは温度安定化時間を最少にするのに役立つ。増
幅操作の期間に亘ってその様な温度を達成しそして維持
することのできる任意の流体加熱及び冷却装置が本発明
の目的のために十分である。好ましい実施態様において
は、ＶＷＩ？ １１３５及びＶＷＲ１１５５水浴が用い
られる。
増幅方法において用いられる酵素はまず反応ウェル４０
内のその他の試薬に添加される。
内のその他の試薬に添加される。
Ｑｌに用いられる酵素は以下に規定するような核酸鎖を
変性するために用いられる高温に耐えることのできる熱
安定性酵素である。従って、熱安定性酵素を温度プロフ
ィールのいづれかの点において反応ウェルに添加するた
めに液体取扱器は必要ではない。酵素は常時反応ウェル
４０に留まってよい。
変性するために用いられる高温に耐えることのできる熱
安定性酵素である。従って、熱安定性酵素を温度プロフ
ィールのいづれかの点において反応ウェルに添加するた
めに液体取扱器は必要ではない。酵素は常時反応ウェル
４０に留まってよい。
反応容器の温度の制御は第１図の実施態様及び第２図の
実施Ｂ様のいづれの場合にもＣＰＵ２０により維持され
る。ＣＰＵは以下に詳細に説明される制御プログラムを
実行する。基本的には、記憶装置２４に貯蔵されている
制御プログラムはヒートポンプ１２或いは流体マルチプ
レキサ−４６を制御する。ユーザーは、どの温度プロフ
ィールをユーザーが実行したいかに関してＣＰＵ２０及
びディスプレイ／キーボードユーザーインターフェース
２２を介して制御プログラムにより質問される。
実施Ｂ様のいづれの場合にもＣＰＵ２０により維持され
る。ＣＰＵは以下に詳細に説明される制御プログラムを
実行する。基本的には、記憶装置２４に貯蔵されている
制御プログラムはヒートポンプ１２或いは流体マルチプ
レキサ−４６を制御する。ユーザーは、どの温度プロフ
ィールをユーザーが実行したいかに関してＣＰＵ２０及
びディスプレイ／キーボードユーザーインターフェース
２２を介して制御プログラムにより質問される。
ユーザーは所望プロフィール上の温度及びユーザーがそ
れらの温度を達成したいと思う回数を回答する。これら
の回答はユーザーインターフェース２２からＣＰＵ２０
により読取られる。ユーザーへの質問はユーザーインタ
ーフェース２２上のディスプレイに表示されそしてユー
ザーの回答はそのキーボードを介して受取られる。所望
プロフィール上の時間及び温度のチェックポイントの形
態でのユーザーの回答はＲＡＭ ２４内に貯蔵される。
れらの温度を達成したいと思う回数を回答する。これら
の回答はユーザーインターフェース２２からＣＰＵ２０
により読取られる。ユーザーへの質問はユーザーインタ
ーフェース２２上のディスプレイに表示されそしてユー
ザーの回答はそのキーボードを介して受取られる。所望
プロフィール上の時間及び温度のチェックポイントの形
態でのユーザーの回答はＲＡＭ ２４内に貯蔵される。
典型的時間対温度プロフィールを第５図に示す。ｃｒ’
ｕは次いで反応容器４０を所望温度プロフィールに維持
するために熱を熱交換器１０に添加するか或いはそれか
ら除去するための適当な制御信号を発生する。
ｕは次いで反応容器４０を所望温度プロフィールに維持
するために熱を熱交換器１０に添加するか或いはそれか
ら除去するための適当な制御信号を発生する。
第１図に示された実施態様の場合において、ヒートポン
プを制御するためにＣＩ’Ｕ２０により発生される制御
信号はパルス幅変調制御パルスのパルス列より構成され
るものである。これらのパルスはライン５６上のヒート
ポンプインターフェース回路２６に連結される。
プを制御するためにＣＩ’Ｕ２０により発生される制御
信号はパルス幅変調制御パルスのパルス列より構成され
るものである。これらのパルスはライン５６上のヒート
ポンプインターフェース回路２６に連結される。
ヒートポンプインターフェースの回路構成をより詳細に
第４図に示す。このインターフェース回路の目的はパル
ス幅変調制御パルスを論理レベルにおいてＣＰＵからソ
リッドステートヒートポンプ１２を通る同一継続時間の
高電流パルスに変換することである。この目的のために
四つのＮチャンネルＭＯＳＦＵＴパワートランジスタ３
０ 、３２ 、３４及び３６が用いられる。これらのト
ランジスタは負荷としてのソリッドステートヒートポン
プ１２とブリッジ配置で接続される。このブリッジはラ
イン３９及び４０上のＣＰＵからの二つの制御信号の影
響下に負荷１２を通る電流の流れの方向を反転させる。
第４図に示す。このインターフェース回路の目的はパル
ス幅変調制御パルスを論理レベルにおいてＣＰＵからソ
リッドステートヒートポンプ１２を通る同一継続時間の
高電流パルスに変換することである。この目的のために
四つのＮチャンネルＭＯＳＦＵＴパワートランジスタ３
０ 、３２ 、３４及び３６が用いられる。これらのト
ランジスタは負荷としてのソリッドステートヒートポン
プ１２とブリッジ配置で接続される。このブリッジはラ
イン３９及び４０上のＣＰＵからの二つの制御信号の影
響下に負荷１２を通る電流の流れの方向を反転させる。
ライン４０上の冷却制御信号が能動的である場合には、
トランジスタ３４及び３２のスイッチを入れ、そしてト
ランジスタ３ｏ及び３６のスイッチを切る。この理由は
冷却信号がライン５８によりトランジスタ３４のゲート
に連結され、このトランジスタのスイッチを入れるから
である。
トランジスタ３４及び３２のスイッチを入れ、そしてト
ランジスタ３ｏ及び３６のスイッチを切る。この理由は
冷却信号がライン５８によりトランジスタ３４のゲート
に連結され、このトランジスタのスイッチを入れるから
である。
この信号は又ライン６４上のゲート電圧を接地ボテーン
シャルまで引下ろすトランジスタ６２のスイッチを入れ
て、それによりトランジスタ３６のス、インチを切る。
シャルまで引下ろすトランジスタ６２のスイッチを入れ
て、それによりトランジスタ３６のス、インチを切る。
ライン３９」二の熱制御信号は常にライン４ｏ上の冷却
制御信号と同様に反対二元状態にある。冷却が能動的で
ある場合には、トランジスタ３ｏのゲート６６は論理Ｏ
において低く、このトランジスタは切られてしまう。ラ
イン６６上の論理０は又トランジスタ６８のスイッチを
切り、それはライン７０上の→−１５ボルトの電圧をし
てトランジスタ３２のゲート７２を論理ルベルに駆動さ
せる。これがトランジスタ３２のスイッチを入れ、それ
により負荷１２を介して右から左への、即ちライン７０
及び電力供給源からトランジスタ３４のドレイン及びソ
ースを通りライン７６、負荷１２及びライン７８を通り
そしてトランジスタ３２のドレイン及びソースを通り接
地に至る電流経路を完成する。
制御信号と同様に反対二元状態にある。冷却が能動的で
ある場合には、トランジスタ３ｏのゲート６６は論理Ｏ
において低く、このトランジスタは切られてしまう。ラ
イン６６上の論理０は又トランジスタ６８のスイッチを
切り、それはライン７０上の→−１５ボルトの電圧をし
てトランジスタ３２のゲート７２を論理ルベルに駆動さ
せる。これがトランジスタ３２のスイッチを入れ、それ
により負荷１２を介して右から左への、即ちライン７０
及び電力供給源からトランジスタ３４のドレイン及びソ
ースを通りライン７６、負荷１２及びライン７８を通り
そしてトランジスタ３２のドレイン及びソースを通り接
地に至る電流経路を完成する。
熱信号が能動的である場合には、反対の状況が生ずる。
この場合には、トランジスタ３０ 、６８及び３６のス
イッチが入れられ、トランジスタ３４ 、６２及び３２
のスイッチが切られる。
イッチが入れられ、トランジスタ３４ 、６２及び３２
のスイッチが切られる。
第２図に示された実施態様においては第４図のインター
フェース回路は必要ではない。しかしながら、ＣＩ）
Ｕにソレノイド操作バルブを制御させるために幾つかの
ソレノイド駆動器インターフェースが必要である。適当
なインターフェースの設計は当業者によく知られている
。
フェース回路は必要ではない。しかしながら、ＣＩ）
Ｕにソレノイド操作バルブを制御させるために幾つかの
ソレノイド駆動器インターフェースが必要である。適当
なインターフェースの設計は当業者によく知られている
。
第１図或いは第２図のいづれかの実施態様における（Ｊ
’ｔ１２０は数多くの異った種類のコンピュータのいづ
れであってもよい。それは通常コンピュータと称される
もの、ＬＦＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （クリント
ン、マサチューセッツ州）から市販されているコン１−
ローラなどの既製のコントローラであってよく、或いは
それはＩＢＭその他のパーソナルコンピュータ、ミニコ
ンピユータ或いはメインフレームであってよい。いづれ
の種類のコンピュータが使用されても、それはリアルタ
イムにおいて或いはコンピュータが設定される時点のい
づれにおいても所望温度プロフィールに関し、ユーザー
からのデータを許容することのできるものでなければな
らない。第１図及び第２図のセンサー８０のごとき実際
の温度センサーを用いる態様において、「設定点」を計
算するための何等かの機構がなければならない。「設定
点」とは実際の温度と目標温度の間の誤差に基づいて誤
差信号を計算する際に用いることのできるユーザー規定
温度プロフィールからとられる目標温度である。次に第
５図に図示される典型的温度プロフィールを参照する。
’ｔ１２０は数多くの異った種類のコンピュータのいづ
れであってもよい。それは通常コンピュータと称される
もの、ＬＦＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （クリント
ン、マサチューセッツ州）から市販されているコン１−
ローラなどの既製のコントローラであってよく、或いは
それはＩＢＭその他のパーソナルコンピュータ、ミニコ
ンピユータ或いはメインフレームであってよい。いづれ
の種類のコンピュータが使用されても、それはリアルタ
イムにおいて或いはコンピュータが設定される時点のい
づれにおいても所望温度プロフィールに関し、ユーザー
からのデータを許容することのできるものでなければな
らない。第１図及び第２図のセンサー８０のごとき実際
の温度センサーを用いる態様において、「設定点」を計
算するための何等かの機構がなければならない。「設定
点」とは実際の温度と目標温度の間の誤差に基づいて誤
差信号を計算する際に用いることのできるユーザー規定
温度プロフィールからとられる目標温度である。次に第
５図に図示される典型的温度プロフィールを参照する。
典型的ユーザー規定温度プロフィールチェックポイント
が小円として示されている。チェックポイント１は時間
Ｔ０における反応容器４０中の温度レベルＬ０により特
徴付けられる。チェックポイント２はより遅い時間Ｔ、
における温度レベルＬ２により特徴付けられる。チェッ
クポイント３は時間Ｔ２などにおける反応容器４０にお
ける温度レベルＬ２の存在により特徴付けられる。これ
らのチェックポイントの間の区間は「レッグ」と称され
る。
が小円として示されている。チェックポイント１は時間
Ｔ０における反応容器４０中の温度レベルＬ０により特
徴付けられる。チェックポイント２はより遅い時間Ｔ、
における温度レベルＬ２により特徴付けられる。チェッ
クポイント３は時間Ｔ２などにおける反応容器４０にお
ける温度レベルＬ２の存在により特徴付けられる。これ
らのチェックポイントの間の区間は「レッグ」と称され
る。
実際の温度センサーを用いない実施態様においてＣ１１
１１２０は加熱或いは冷却作用が行われる際の時間を追
跡するようにプログラムされなければならない。更に、
ＣＰＵは加熱或いは冷却レッグの際の実際に経過した時
間を対比させる１以上の経験的に求められた時間を貯蔵
することができなければならない。これらの経験的に決
定される時間はユーザーにより実験的に決定されるもの
である。
１１２０は加熱或いは冷却作用が行われる際の時間を追
跡するようにプログラムされなければならない。更に、
ＣＰＵは加熱或いは冷却レッグの際の実際に経過した時
間を対比させる１以上の経験的に求められた時間を貯蔵
することができなければならない。これらの経験的に決
定される時間はユーザーにより実験的に決定されるもの
である。
典型的にはユーザーは第４図のソリッドステートヒート
ポンプのインターフェースの設計に際し、ある種の電流
を設定し、この電流を第１図の実施態様における全ての
加熱及び冷却に用いる。第２図の実施態様の場合におい
ては、ユーザーは高温及び低温貯蔵器１６及び１８の温
度レベルを設定しなければならない。第１図の実施態様
の場合における固定された電流及び第２図の実施態様に
おける貯蔵器の固定された温度レベルは、ある与えられ
た質量の熱交換器１０及び反応容器及び内容物について
ユーザーにより規定される加熱或いは冷却変化率を確立
する。ユーザーは次いで所望のチェックポイントを規定
し、及び固定された加熱或いは冷却速度においてこれら
のチェックポイントまで加熱或いは冷却するまでに必要
な時間を決定する。チェックポイントに到達するまでの
時間が許容可能でない場合には、時間が正しくなるまで
加熱或いは冷却速度を調節しなければならない。
ポンプのインターフェースの設計に際し、ある種の電流
を設定し、この電流を第１図の実施態様における全ての
加熱及び冷却に用いる。第２図の実施態様の場合におい
ては、ユーザーは高温及び低温貯蔵器１６及び１８の温
度レベルを設定しなければならない。第１図の実施態様
の場合における固定された電流及び第２図の実施態様に
おける貯蔵器の固定された温度レベルは、ある与えられ
た質量の熱交換器１０及び反応容器及び内容物について
ユーザーにより規定される加熱或いは冷却変化率を確立
する。ユーザーは次いで所望のチェックポイントを規定
し、及び固定された加熱或いは冷却速度においてこれら
のチェックポイントまで加熱或いは冷却するまでに必要
な時間を決定する。チェックポイントに到達するまでの
時間が許容可能でない場合には、時間が正しくなるまで
加熱或いは冷却速度を調節しなければならない。
勿論、この手法は加熱及び冷却レッグの傾斜が「経験的
種類」の実施態様と称されるこれらの実施態様を用いる
場合には、常に同一でなければならないので加熱或いは
冷却速度がリアルタイムで調整することができない場合
には余り、柔軟性があるとは云えない。
種類」の実施態様と称されるこれらの実施態様を用いる
場合には、常に同一でなければならないので加熱或いは
冷却速度がリアルタイムで調整することができない場合
には余り、柔軟性があるとは云えない。
他の経験タイプの実施態様の種類はｃｐυ２０が各レッ
グ上において異った加熱及び冷却速度を用いるようにプ
ログラムすることである。これは各レッグに異った傾斜
をもたせる。これはパルス幅変調を用いて達成されるが
、しかし第１図及び第２図の実施態様のいづれにおいて
も如何なる温度センサー及び実際の温度フィードバック
をも用いずに達成される（破線部の温度センサーの図示
はこれらの実施態様を示すことを目的としたものである
）。これらの代替的実施態様においては、加熱或いは冷
却電流（即ち第２図の実施態様においては流体流）はパ
ルスの流れである。本来のサイクルはＣｌ１ｌＪ２０に
よってより大きな加熱或いは冷却速度が必要である場合
には、パルスの“オン”時間が延長されるようにＣＰＵ
２０により制御される。加熱或いは冷却速度が残少され
るべき場合には反対か状況が適用される。これらの実施
態様においては経験時間及び加熱及び冷却速度は共にチ
ェックポイントにおける温度レベル間の間隔が所望通り
になるまで調整されるので温度プロフィールを調整する
ためのより大きな自由度を有する。
グ上において異った加熱及び冷却速度を用いるようにプ
ログラムすることである。これは各レッグに異った傾斜
をもたせる。これはパルス幅変調を用いて達成されるが
、しかし第１図及び第２図の実施態様のいづれにおいて
も如何なる温度センサー及び実際の温度フィードバック
をも用いずに達成される（破線部の温度センサーの図示
はこれらの実施態様を示すことを目的としたものである
）。これらの代替的実施態様においては、加熱或いは冷
却電流（即ち第２図の実施態様においては流体流）はパ
ルスの流れである。本来のサイクルはＣｌ１ｌＪ２０に
よってより大きな加熱或いは冷却速度が必要である場合
には、パルスの“オン”時間が延長されるようにＣＰＵ
２０により制御される。加熱或いは冷却速度が残少され
るべき場合には反対か状況が適用される。これらの実施
態様においては経験時間及び加熱及び冷却速度は共にチ
ェックポイントにおける温度レベル間の間隔が所望通り
になるまで調整されるので温度プロフィールを調整する
ためのより大きな自由度を有する。
−Ｃ的に、これは好ましい実施態様よりもユーザー側に
より多くの作業を要求し、余り正確ではない。その理由
は、一度ユーザーが各レッグに対して固定された加熱或
いは冷却速度を確立すると、その速度がそのレッグに対
して固定され、変化する条件をバ１酌するためにリアル
タイムに変更することができない。即ち、これらの実施
態様においては、変化する周囲条件或いはその他の変化
を補正するためにＣＩＩＵ２０はリアルタイムで加熱及
び冷却速度を変更しない。
より多くの作業を要求し、余り正確ではない。その理由
は、一度ユーザーが各レッグに対して固定された加熱或
いは冷却速度を確立すると、その速度がそのレッグに対
して固定され、変化する条件をバ１酌するためにリアル
タイムに変更することができない。即ち、これらの実施
態様においては、変化する周囲条件或いはその他の変化
を補正するためにＣＩＩＵ２０はリアルタイムで加熱及
び冷却速度を変更しない。
好ましい実施態様は加熱及び冷却速度を制御するために
実際の温度フィードバック及び閉ループ制御系を用いる
。これはリアルタイム誤差信号発生により所望温度プロ
フィールに実際の温度プロフィールを一致させることを
可能にする。好ましい実施態様を実施するために、ＣＩ
’Ｕ２０はユーザーに所望の温度プロフィールについて
「チェックポイント」を入れさせるようにプログラムさ
れる。
実際の温度フィードバック及び閉ループ制御系を用いる
。これはリアルタイム誤差信号発生により所望温度プロ
フィールに実際の温度プロフィールを一致させることを
可能にする。好ましい実施態様を実施するために、ＣＩ
’Ｕ２０はユーザーに所望の温度プロフィールについて
「チェックポイント」を入れさせるようにプログラムさ
れる。
次いでＣＰＵ２０は経過時間を測定するために時計の進
行を開始し、そしてチェックポイントにより定義された
所望の温度プロフィールに基づいて「設定点」を定期的
に計算する。これらの計算された設定点は達成目標であ
り、誤差信号を発生するためにもう一つのソフトウェア
ルーチンにおいて使用される。
行を開始し、そしてチェックポイントにより定義された
所望の温度プロフィールに基づいて「設定点」を定期的
に計算する。これらの計算された設定点は達成目標であ
り、誤差信号を発生するためにもう一つのソフトウェア
ルーチンにおいて使用される。
誤差信号発生ルーチンは温度センサー８０からの反応室
の実際の温度を読取りそれを設定点により定義された所
望温度と対比する。第５図の温度プロフィールについて
計算された典型的な設定点はチェックポイント１及び２
の間のレッグｌ上の三つのＸ印により示されている。こ
の比較は誤差信号をもたらし、それはパルス幅変調ルー
チンにより用いられて加熱及び冷却装置による反応室の
加熱或いは冷却を引起こす制御信号を発生する。
の実際の温度を読取りそれを設定点により定義された所
望温度と対比する。第５図の温度プロフィールについて
計算された典型的な設定点はチェックポイント１及び２
の間のレッグｌ上の三つのＸ印により示されている。こ
の比較は誤差信号をもたらし、それはパルス幅変調ルー
チンにより用いられて加熱及び冷却装置による反応室の
加熱或いは冷却を引起こす制御信号を発生する。
このパルス幅変調ルーチンは加熱及び冷却制御信号のた
めの必要な“オン”時間即ちデユーティサイクルを計算
し、そしてこれらの二つの制御信号のいづれが能動的で
あるべきかを決定する。次に、適当な制御信号が発生さ
れ、ソリッドステートヒートポンプインターフェース２
６或いは流体マルチプレキサ−その他の加熱及び冷却装
置に書込まれる。
めの必要な“オン”時間即ちデユーティサイクルを計算
し、そしてこれらの二つの制御信号のいづれが能動的で
あるべきかを決定する。次に、適当な制御信号が発生さ
れ、ソリッドステートヒートポンプインターフェース２
６或いは流体マルチプレキサ−その他の加熱及び冷却装
置に書込まれる。
第１図及び第２図に示された実施態様のためにセンサー
８０を用いない経験時間実施態様についてこの機械が行
わなければならない増幅方法は第６図におけるフローチ
ャート形式に与えられている。この方法はブロック７４
においてユーザーからの増幅処理をスタートさせるコマ
ンドでスタートする。この時間前にユーザーは熱交換器
１０内の反応室４０中に適当な酵素を増幅されるべき核
酸配列及び以下に規定する適当な試薬と共に充填してお
かねばならない。ある実施態様においては、熱交換器１
０内の反応室７０には米国特許４．４７８．０９４号に
より説明されているＣｅｔｕｓ Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉ
ｏｎ （エメリービル、カリフォルニア州）からの液体
取扱器などの通常の液体取扱器（図示せず）により自動
的に適当な出発物質が装填される。
８０を用いない経験時間実施態様についてこの機械が行
わなければならない増幅方法は第６図におけるフローチ
ャート形式に与えられている。この方法はブロック７４
においてユーザーからの増幅処理をスタートさせるコマ
ンドでスタートする。この時間前にユーザーは熱交換器
１０内の反応室４０中に適当な酵素を増幅されるべき核
酸配列及び以下に規定する適当な試薬と共に充填してお
かねばならない。ある実施態様においては、熱交換器１
０内の反応室７０には米国特許４．４７８．０９４号に
より説明されているＣｅｔｕｓ Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉ
ｏｎ （エメリービル、カリフォルニア州）からの液体
取扱器などの通常の液体取扱器（図示せず）により自動
的に適当な出発物質が装填される。
このスタートコマンドを受取ると、ＣＰＵ７０は工程８
２において第一のチェックポイントデータを検索し、そ
して第２図の温度選択ライン５６上に適当な信号を与え
（第６図の操作方法は第１図に示された実施態様にも同
様に適用可能である）、ＳＯＶ対４６の開口部に熱交換
器ＩＯを以下において温度変数り、と称するユーザー規
定レベルに等しい高温に加熱査せる。
２において第一のチェックポイントデータを検索し、そ
して第２図の温度選択ライン５６上に適当な信号を与え
（第６図の操作方法は第１図に示された実施態様にも同
様に適用可能である）、ＳＯＶ対４６の開口部に熱交換
器ＩＯを以下において温度変数り、と称するユーザー規
定レベルに等しい高温に加熱査せる。
幾つかの実施態様においては、温度変数り、は変数では
なく、５高温貯蔵器１６の温度において固定された定数
である。その他の実際の温度フィ−Ｉハックデータを用
いる非−経験的実施態様においては変数ＬＨはユーザー
規定のものであり、ＣＰＵ７０ば反応室４０の温度を監
視し、温度制御装置（ソレノイド−操作バルブプラス貯
蔵器或いはヒートボンプインターフェースプラスヒート
ボンブ）に適当なコマンド信号を発して所望の温度に達
するまでそれに熱交換器１０を加熱させ、次いで温度制
御装置に適当なコマンドを発して所望温度を維持させる
。現在説明されている経験的実施態様においては、ＣＰ
Ｕ２０によっては熱交換器１０の温度の監視は行われな
い。しかしながら、好ましい実施態様においては熱交換
器１０及び反応容器の温度はＣＰＵ４０により監視され
、及び誤差信号が実際の温度をユーザー−規定チェック
ポイントからの計算された設定点と対比することにより
発生され、ユーザー−規定時間対温度プロフィールに従
って熱交換器１０の温度を制御する。
なく、５高温貯蔵器１６の温度において固定された定数
である。その他の実際の温度フィ−Ｉハックデータを用
いる非−経験的実施態様においては変数ＬＨはユーザー
規定のものであり、ＣＰＵ７０ば反応室４０の温度を監
視し、温度制御装置（ソレノイド−操作バルブプラス貯
蔵器或いはヒートボンプインターフェースプラスヒート
ボンブ）に適当なコマンド信号を発して所望の温度に達
するまでそれに熱交換器１０を加熱させ、次いで温度制
御装置に適当なコマンドを発して所望温度を維持させる
。現在説明されている経験的実施態様においては、ＣＰ
Ｕ２０によっては熱交換器１０の温度の監視は行われな
い。しかしながら、好ましい実施態様においては熱交換
器１０及び反応容器の温度はＣＰＵ４０により監視され
、及び誤差信号が実際の温度をユーザー−規定チェック
ポイントからの計算された設定点と対比することにより
発生され、ユーザー−規定時間対温度プロフィールに従
って熱交換器１０の温度を制御する。
この高温インキュベーション時の反応室４０の温度は８
０〜１０９ ”Ｃ５好ましくは９０〜１００℃に維持さ
れるべきである。変性過程が生ずる最小温度は８０℃で
ある。温度ＬＨまでの温度上昇プロフィールは可能な限
り迅速であるべきであり、１サイクル内の全完結時間に
おける時間を節約するために通常０．５〜５分間、より
好ましくは１〜３分間である。
０〜１０９ ”Ｃ５好ましくは９０〜１００℃に維持さ
れるべきである。変性過程が生ずる最小温度は８０℃で
ある。温度ＬＨまでの温度上昇プロフィールは可能な限
り迅速であるべきであり、１サイクル内の全完結時間に
おける時間を節約するために通常０．５〜５分間、より
好ましくは１〜３分間である。
勿論全てのこれらが起こる前にユーザーはチェックポイ
ントデータを入れなければならない。ユーザーにチェッ
クポイントの人力をうながし、その様に入れられたデー
タを貯蔵し、そしてそれを順次設定点の計算のために検
索する工程は通常のものであり、本発明の方法に重要な
ものではなく、従ってそれらは示されない。
ントデータを入れなければならない。ユーザーにチェッ
クポイントの人力をうながし、その様に入れられたデー
タを貯蔵し、そしてそれを順次設定点の計算のために検
索する工程は通常のものであり、本発明の方法に重要な
ものではなく、従ってそれらは示されない。
これらの経験的時間の実施態様の増幅方法は加熱のスタ
ートからインキュベーションの終りまでのユーザーによ
り規定された経験的に決定された時間の高温インキュベ
ーション期間を用いる。インキュベーションの実施のた
めに、コンピュータは工程８４において時計をスタート
させ、加熱の開始から温度レベルＬＨに向って経過時間
を測り、この経過時間を工程８６により表示されている
ようにユーザーにより入れられた高温インキュベーショ
ン時間Ｔ、ｌと対比する。好ましい実施態様においては
、インキュベーション時間変数はユーザーによりリアル
タイムに任意の非経験的値に設定されてよい。
ートからインキュベーションの終りまでのユーザーによ
り規定された経験的に決定された時間の高温インキュベ
ーション期間を用いる。インキュベーションの実施のた
めに、コンピュータは工程８４において時計をスタート
させ、加熱の開始から温度レベルＬＨに向って経過時間
を測り、この経過時間を工程８６により表示されている
ようにユーザーにより入れられた高温インキュベーショ
ン時間Ｔ、ｌと対比する。好ましい実施態様においては
、インキュベーション時間変数はユーザーによりリアル
タイムに任意の非経験的値に設定されてよい。
その他の実施態様においては、時間Ｔ□ （加熱及び高
温インキュベーション時間）は実験的に決定され次いで
永久貯蔵のためにＲＯＭ中に「焼付けられる」固定時間
であってよい。ある実施態様においては、ＣＰＵ２０は
、第１図の熱交換器１０に結合されライン８１を介して
ＣＰＵ２０に連結されている温度センサー８０などを使
用して熱交換器１０の温度を監視し、そしてプレート１
が温度変数ｌ、□の温度に到達する時点で高温インキュ
ベーション時間の計時を開始してよい。
温インキュベーション時間）は実験的に決定され次いで
永久貯蔵のためにＲＯＭ中に「焼付けられる」固定時間
であってよい。ある実施態様においては、ＣＰＵ２０は
、第１図の熱交換器１０に結合されライン８１を介して
ＣＰＵ２０に連結されている温度センサー８０などを使
用して熱交換器１０の温度を監視し、そしてプレート１
が温度変数ｌ、□の温度に到達する時点で高温インキュ
ベーション時間の計時を開始してよい。
第６図の実施態様において、ユーザーはプレートｌが所
望温度り、に達するのに必要な時間プラス温度り、にお
ける高温インキュベーションのための所望時間を含む経
験的に確立された時間における変数ＴＨを設定する。コ
ンピュータが、所望温度り、Ｉが達成された時にのみ経
過時間の追跡をスタートする場合即ち温度センサー８０
が用いられる場合の実施態様においては、変数ＴＨはユ
ーザーによりプレート１が温度Ｌｌｌに到達するに必要
な時間の量を考慮することなく温度Ｌ１１における高温
インキュベーションに所望な時間に設定されてよい。好
ましい実施態様においては、温度ＬＨは９０−１００℃
に固定される。
望温度り、に達するのに必要な時間プラス温度り、にお
ける高温インキュベーションのための所望時間を含む経
験的に確立された時間における変数ＴＨを設定する。コ
ンピュータが、所望温度り、Ｉが達成された時にのみ経
過時間の追跡をスタートする場合即ち温度センサー８０
が用いられる場合の実施態様においては、変数ＴＨはユ
ーザーによりプレート１が温度Ｌｌｌに到達するに必要
な時間の量を考慮することなく温度Ｌ１１における高温
インキュベーションに所望な時間に設定されてよい。好
ましい実施態様においては、温度ＬＨは９０−１００℃
に固定される。
経過時間が工程８８により決定された所望インキュベー
ション時間に等しい場合には、ＣＰＵ２０は加熱及び冷
却装置に適当なコマンドを送り、プレート１をユーザー
により設定された低温インキュベーション温度ＬＬの方
向に冷却させる。これは工程９０により表示されている
。工程９０は、第２図の実施態様の場合においては、チ
ューブ５２及び５４を選択してチューブ４２及び４４に
連絡するための、ＣＰＵ２０によるコマンドの流体制御
マルチプレキサ−４９への伝達を表わし、この様にして
ユーザーにより手動的にＬＬに設定された低温流体貯蔵
器１８の温度の流体が熱交換器１０を通って流れ始める
。その他の実施態様においては、ＣＩ’ Ｕ ２０は単
に加熱及び冷却装置にＰｅ１ｔｉｅｒヒートポンプ１２
のごときプレート１に熱的に連結している電気的に駆動
される冷蔵装置のスイッチを入れるためのコマンドを送
るのみでよい。良結果をもって用いられる高温から低温
への冷却速度の範囲はバランスを考慮して決定される。
ション時間に等しい場合には、ＣＰＵ２０は加熱及び冷
却装置に適当なコマンドを送り、プレート１をユーザー
により設定された低温インキュベーション温度ＬＬの方
向に冷却させる。これは工程９０により表示されている
。工程９０は、第２図の実施態様の場合においては、チ
ューブ５２及び５４を選択してチューブ４２及び４４に
連絡するための、ＣＰＵ２０によるコマンドの流体制御
マルチプレキサ−４９への伝達を表わし、この様にして
ユーザーにより手動的にＬＬに設定された低温流体貯蔵
器１８の温度の流体が熱交換器１０を通って流れ始める
。その他の実施態様においては、ＣＩ’ Ｕ ２０は単
に加熱及び冷却装置にＰｅ１ｔｉｅｒヒートポンプ１２
のごときプレート１に熱的に連結している電気的に駆動
される冷蔵装置のスイッチを入れるためのコマンドを送
るのみでよい。良結果をもって用いられる高温から低温
への冷却速度の範囲はバランスを考慮して決定される。
極めて迅速な冷却例えばドライアイスを用いて反応室の
温度を直らに低下させることは増幅方法を阻害或いは停
止させる。他方、遅い冷却は１サイクルの全完結時間を
長引かせる。好ましくは、冷却速度は約０．５〜５分間
、好ましくは１〜３分間の範囲である。好ましい実施態
様においては約３５〜６０℃の範囲の固定温度がユーザ
ーにより低温流体貯蔵器１８の手動調整により設定され
、第２図の実施態様の場合にこの温度を維持する。第１
図の実施態様の場合においては、ＣＰＵ２０がＬＬにつ
いてユーザーの入れたデータに基づき電流の適当な方向
及びデユーティサイクルを確立する。デユーティサイク
ルは特定のレッグについてユーザー規定データに基づい
ても良く、或いはいづれかのタイプの実施態様において
固定されてよい。この増幅方法において用いられる熱安
定性酵素に対しては約３５〜６０℃の温度範囲が最適温
度である。この増幅方法が首尾よ〈実施され得る広範囲
の温度は約３０−３５℃乃至１０５℃である。
温度を直らに低下させることは増幅方法を阻害或いは停
止させる。他方、遅い冷却は１サイクルの全完結時間を
長引かせる。好ましくは、冷却速度は約０．５〜５分間
、好ましくは１〜３分間の範囲である。好ましい実施態
様においては約３５〜６０℃の範囲の固定温度がユーザ
ーにより低温流体貯蔵器１８の手動調整により設定され
、第２図の実施態様の場合にこの温度を維持する。第１
図の実施態様の場合においては、ＣＰＵ２０がＬＬにつ
いてユーザーの入れたデータに基づき電流の適当な方向
及びデユーティサイクルを確立する。デユーティサイク
ルは特定のレッグについてユーザー規定データに基づい
ても良く、或いはいづれかのタイプの実施態様において
固定されてよい。この増幅方法において用いられる熱安
定性酵素に対しては約３５〜６０℃の温度範囲が最適温
度である。この増幅方法が首尾よ〈実施され得る広範囲
の温度は約３０−３５℃乃至１０５℃である。
次の工程は工程９２により示され、経過時間を測定しそ
れをユーザー設定低温時間と対比する過程である。温度
ＬＬに到達するのに必要な最適時間は正確には知られて
いないが、しかし、約１〜３分間が有効であることが知
られている。経験的実施態様においては、ＣＰＵ２０は
プレートｌの温度を追跡しない。それは単にプレー１−
１を冷却する旨のコマンドが発生された後で経過時間を
追跡するに過ぎない。ユーザーは経験的にプレート１の
温度を温度ＬＬまで減少させるのにどれ位時間がかかる
かを決定しなければならない。工程９２におけるＣＰＵ
２０は常に実際に経過した時間をユーザー−規定時１ｉ
１ Ｔ Ｌと対比する。必要な時間が経過すると、処理
は工程９４に進行する。
れをユーザー設定低温時間と対比する過程である。温度
ＬＬに到達するのに必要な最適時間は正確には知られて
いないが、しかし、約１〜３分間が有効であることが知
られている。経験的実施態様においては、ＣＰＵ２０は
プレートｌの温度を追跡しない。それは単にプレー１−
１を冷却する旨のコマンドが発生された後で経過時間を
追跡するに過ぎない。ユーザーは経験的にプレート１の
温度を温度ＬＬまで減少させるのにどれ位時間がかかる
かを決定しなければならない。工程９２におけるＣＰＵ
２０は常に実際に経過した時間をユーザー−規定時１ｉ
１ Ｔ Ｌと対比する。必要な時間が経過すると、処理
は工程９４に進行する。
工程９４ば低温インキュベーションの完了に対する監視
の過程を表す。ある実施態様において、コンピュータＣ
Ｉ’Ｕ２０は、温度ＬＬが達成されると経過時間の追跡
を開始する。工程９４はコンピュータが実際の経過時間
を低温インキュベーション時間、すなわちユーザー設定
変数ＴＬと対比する過程である。ある実施態様において
はこの変数はリアルタイムにコンピュータの記憶装置内
に貯蔵されたユーザー規定時間であるのに対し、他の実
施態様においては、時間ＴＬは固定され経験的に決定さ
れた後永久に貯蔵される。
の過程を表す。ある実施態様において、コンピュータＣ
Ｉ’Ｕ２０は、温度ＬＬが達成されると経過時間の追跡
を開始する。工程９４はコンピュータが実際の経過時間
を低温インキュベーション時間、すなわちユーザー設定
変数ＴＬと対比する過程である。ある実施態様において
はこの変数はリアルタイムにコンピュータの記憶装置内
に貯蔵されたユーザー規定時間であるのに対し、他の実
施態様においては、時間ＴＬは固定され経験的に決定さ
れた後永久に貯蔵される。
経過時間が所望低温インキュベーション時間ＴＬに等し
くなるや否や、工程９４は処理を工程９６に進行させ、
この工程はソフトウェアサイクルカウンタを増して第一
サイクルの終りをマークする。実際の経過時間が時間Ｔ
Ｌに等しくならない場合は、処理はライン９８上を工程
９２に進み、もう一度経過時間を所望時間ＴＬと対比す
る。工程９６の後、ＣＰＵ２０は工程１００に進む。
くなるや否や、工程９４は処理を工程９６に進行させ、
この工程はソフトウェアサイクルカウンタを増して第一
サイクルの終りをマークする。実際の経過時間が時間Ｔ
Ｌに等しくならない場合は、処理はライン９８上を工程
９２に進み、もう一度経過時間を所望時間ＴＬと対比す
る。工程９６の後、ＣＰＵ２０は工程１００に進む。
工程１００及び工程１０２はサイクルカウント数を所望
サイクル数を表わす記憶装置内のユーザー規定変数と対
比する過程である。ある実施態様においては、所望サイ
クル数は固定された数であるが、しかし好ましい実施態
様においては所望サイクル数はユーザー−規定数である
。これはユーザーに以下に更に説明する異る核酸配列の
増幅の異る効率をＷ↓酌するために行われる増幅のサイ
クル数を変化させる柔軟性を与える。サイクルカウント
数が所望サイクル数に一致しない場合には処理はライン
１０４を介して工程１０６に進み、経過時間時計を再セ
ットし、そしてそこから処理はライン１０８を介して工
程８２に進み、そこでもう一つのサイクルが開始される
。所望サイクル数が行われたならば、次いで処理は工程
１０８に進む。そこでユーザーがもう一つの「ファイル
」即ちデータベースに貯蔵されているもう一つの温度プ
ロフィールを運転することを望むかどうかが決定される
。ユーザーにより入れられるいづれの温度プロフィール
もリンクデーターフィールドを有し、これには実行され
るべき次のファイル即ち温度プロフィールがある場合に
はそのファイル特定が貯蔵されている。このリンクフィ
ールドの内容は工程１０８におい”ζ読取られる。ユー
ザーがリンクフィールドに何も入れていない場合には、
次いで処理は工程１１０に進み、終了メソセージが表示
される。工程＋０８がリンクフィールドにファイル番号
を見出す場合には、次いで処理は工程１１２に進む。こ
の工程は経過時間時計を再設定し、そして新しいファイ
ルからの第一のチェックポイントを検索する。
サイクル数を表わす記憶装置内のユーザー規定変数と対
比する過程である。ある実施態様においては、所望サイ
クル数は固定された数であるが、しかし好ましい実施態
様においては所望サイクル数はユーザー−規定数である
。これはユーザーに以下に更に説明する異る核酸配列の
増幅の異る効率をＷ↓酌するために行われる増幅のサイ
クル数を変化させる柔軟性を与える。サイクルカウント
数が所望サイクル数に一致しない場合には処理はライン
１０４を介して工程１０６に進み、経過時間時計を再セ
ットし、そしてそこから処理はライン１０８を介して工
程８２に進み、そこでもう一つのサイクルが開始される
。所望サイクル数が行われたならば、次いで処理は工程
１０８に進む。そこでユーザーがもう一つの「ファイル
」即ちデータベースに貯蔵されているもう一つの温度プ
ロフィールを運転することを望むかどうかが決定される
。ユーザーにより入れられるいづれの温度プロフィール
もリンクデーターフィールドを有し、これには実行され
るべき次のファイル即ち温度プロフィールがある場合に
はそのファイル特定が貯蔵されている。このリンクフィ
ールドの内容は工程１０８におい”ζ読取られる。ユー
ザーがリンクフィールドに何も入れていない場合には、
次いで処理は工程１１０に進み、終了メソセージが表示
される。工程＋０８がリンクフィールドにファイル番号
を見出す場合には、次いで処理は工程１１２に進む。こ
の工程は経過時間時計を再設定し、そして新しいファイ
ルからの第一のチェックポイントを検索する。
処理は次いで工程８２においてスタートし、新しいファ
イルのチェックポイントにより決定される温度プロフィ
ールの実行に進む。
イルのチェックポイントにより決定される温度プロフィ
ールの実行に進む。
第６図の制御方法は温度プロフィールのための二つのチ
ェックポイントのみを示す。他の実施態様においては、
一般的に高温のインキュベーション及び一般的に低温の
インキュベーションが適当な温度において十分な時間行
われることを条件としてより多くのチェックポイントが
使用されてよい。
ェックポイントのみを示す。他の実施態様においては、
一般的に高温のインキュベーション及び一般的に低温の
インキュベーションが適当な温度において十分な時間行
われることを条件としてより多くのチェックポイントが
使用されてよい。
第７図に示された方法を実行する好ましい非経験的「閉
鎖ループ」実施態様においては、工程８１におけるＣＰ
Ｕ２０はユーザー規定温度プロフィールのレッグ１のた
めの加熱をデフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）速度でスター
トさせ、そして工程８３における時計をスタートさせる
。ＣＰｔ１２０は次いで工程８５において目標温度とし
て設定点を計算し、そして工程８７においてプレート１
の温度を監視し、それをユーザー−設定温度プロフィー
ル上の設定点と対比する。工程８５は、温度プロフィー
ルの勾配をユーザー−設定チェックポイント間で計算し
、そしてその勾配と計算時における経過時間とに基づき
新しい設定点を計算することにより定期的に設定点に改
訂する。比較に基づく誤差信号は工程８９においてＣＰ
Ｕ２０により発生することができる。この誤差信号を次
いで工程９１において、適当な制御信号に転換して加熱
及び冷却装置を制御する。ソリッドステートヒートポン
プの場合には、誤差信号はデユーティサイクルを変更す
るのに用いられる。この改訂された制御信号を次いでラ
イン５６上に出力し、加熱及び冷却装置に反応室温度を
調整させる。プレート１がある特定の設定点について所
望プロフィールよりも熱くなったならば、次いで低温流
体のスイッチを入れ、それを第２図の実施態様において
冷却する。第１図の実施態様の場合にはソリッドステー
トヒートポンプを通る電流の方向を減少させるか或いは
熱パルス必須サイクルの“オン”時間を減少させて誤差
信号の大きさをゼロの方向に減少させることが可能であ
る。
鎖ループ」実施態様においては、工程８１におけるＣＰ
Ｕ２０はユーザー規定温度プロフィールのレッグ１のた
めの加熱をデフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）速度でスター
トさせ、そして工程８３における時計をスタートさせる
。ＣＰｔ１２０は次いで工程８５において目標温度とし
て設定点を計算し、そして工程８７においてプレート１
の温度を監視し、それをユーザー−設定温度プロフィー
ル上の設定点と対比する。工程８５は、温度プロフィー
ルの勾配をユーザー−設定チェックポイント間で計算し
、そしてその勾配と計算時における経過時間とに基づき
新しい設定点を計算することにより定期的に設定点に改
訂する。比較に基づく誤差信号は工程８９においてＣＰ
Ｕ２０により発生することができる。この誤差信号を次
いで工程９１において、適当な制御信号に転換して加熱
及び冷却装置を制御する。ソリッドステートヒートポン
プの場合には、誤差信号はデユーティサイクルを変更す
るのに用いられる。この改訂された制御信号を次いでラ
イン５６上に出力し、加熱及び冷却装置に反応室温度を
調整させる。プレート１がある特定の設定点について所
望プロフィールよりも熱くなったならば、次いで低温流
体のスイッチを入れ、それを第２図の実施態様において
冷却する。第１図の実施態様の場合にはソリッドステー
トヒートポンプを通る電流の方向を減少させるか或いは
熱パルス必須サイクルの“オン”時間を減少させて誤差
信号の大きさをゼロの方向に減少させることが可能であ
る。
第７図の好ましい実施態様の制御方法においては、ＣＰ
Ｕ２０は、工程８１において、温度制御装置にプレート
１を高温インキュベーションレベルに加熱することを開
始するコマンドが送られると同時に経過時間の計時を開
始する。工程９１ （或いは誤差がない場合には工程８
９）が第７図において行われた後、工程９３を実行して
実際に経過した時間を記憶装置内に貯蔵されたユーザー
設定時間（その時点で次のチェックポイントが達成され
なければならない）と対比する。経過時間がチェックポ
イント時間に等しいか或いはより大きい場合には、処理
は工程９５に進み、次のチェックポイントの時間及び温
度データを検索する。
Ｕ２０は、工程８１において、温度制御装置にプレート
１を高温インキュベーションレベルに加熱することを開
始するコマンドが送られると同時に経過時間の計時を開
始する。工程９１ （或いは誤差がない場合には工程８
９）が第７図において行われた後、工程９３を実行して
実際に経過した時間を記憶装置内に貯蔵されたユーザー
設定時間（その時点で次のチェックポイントが達成され
なければならない）と対比する。経過時間がチェックポ
イント時間に等しいか或いはより大きい場合には、処理
は工程９５に進み、次のチェックポイントの時間及び温
度データを検索する。
経過時間が次のチェックポイントへの時間より短い場合
には、処理はライン９７上を第７図の工程８７に戻る″
。次いで、次の設定点が計算され、そして処理はＦ記と
同様に継続される。
には、処理はライン９７上を第７図の工程８７に戻る″
。次いで、次の設定点が計算され、そして処理はＦ記と
同様に継続される。
工程８９の誤差信号計算は任意の公知の比例的制御アル
ゴリズムを用いてなされる。その様なアルゴリズムは良
く知られており、シンスキー（Ｓｈｉｎｓｋｅｙ）、Ｐ
ｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ５ｙｓｔｅ＋ｗｓ第２
版第１章（ＭｃＧｒａ−旧ＩＩ １９７９） ｌ５ＢＮ
０−０７−０５６８９１ｘに記載されている。
ゴリズムを用いてなされる。その様なアルゴリズムは良
く知られており、シンスキー（Ｓｈｉｎｓｋｅｙ）、Ｐ
ｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ５ｙｓｔｅ＋ｗｓ第２
版第１章（ＭｃＧｒａ−旧ＩＩ １９７９） ｌ５ＢＮ
０−０７−０５６８９１ｘに記載されている。
次のチェックポイントについての時間及び温度データの
検索後、ＣＰＵは工程９９において完全な温度プロフィ
ールが処理された否かを決定する。
検索後、ＣＰＵは工程９９において完全な温度プロフィ
ールが処理された否かを決定する。
このサイクルが完結されていなかった場合には処理はラ
イン９７上を工程８７に戻り次の設定点を計算する。処
理は工程８７から次いで上記の如く＠Ｉ続される。
イン９７上を工程８７に戻り次の設定点を計算する。処
理は工程８７から次いで上記の如く＠Ｉ続される。
温度プロフィールが完結されたならば、次いで工程＋０
１を実行してザイクルカウンター（ソフトウェアカウン
ター）を増加して温度プロフィールを通じて一つの完全
なサイクルが完結されたことを示す。次に、ＣＰＵ２０
は記憶装置から全完結された特定の温度プロフィールの
所望サイクル数を示す値をデータベース中のデータフィ
ールドから検索する。これは工程１０３により示される
。この値はユーザーにより第１図及び第２図のユーザー
インターフェースにより供給されそしてＲＡＭ ２４に
貯蔵されているチェックポイントデータ及びその他の情
報が充填されているデータベースから検索される。工程
１０５においては、完結されたサイクル数がユーザー規
定所望サイクル数と対比される。
１を実行してザイクルカウンター（ソフトウェアカウン
ター）を増加して温度プロフィールを通じて一つの完全
なサイクルが完結されたことを示す。次に、ＣＰＵ２０
は記憶装置から全完結された特定の温度プロフィールの
所望サイクル数を示す値をデータベース中のデータフィ
ールドから検索する。これは工程１０３により示される
。この値はユーザーにより第１図及び第２図のユーザー
インターフェースにより供給されそしてＲＡＭ ２４に
貯蔵されているチェックポイントデータ及びその他の情
報が充填されているデータベースから検索される。工程
１０５においては、完結されたサイクル数がユーザー規
定所望サイクル数と対比される。
所望サイクル数が完結されていない場合には次いで処理
はライン１０７上工程８１に戻る。同一のプロフィール
における第一のチェックポイントを次いで検索し、そし
て現在の温度プロフィールにおける同一チェックポイン
トの処理が再び上記の如く開始される。
はライン１０７上工程８１に戻る。同一のプロフィール
における第一のチェックポイントを次いで検索し、そし
て現在の温度プロフィールにおける同一チェックポイン
トの処理が再び上記の如く開始される。
工程１０５が、温度プロフィールによる所望のサイクル
数が完結されたことを示す場合には、次いで工程１０９
を実行してファイルリンケージを決定する。ユーザーの
うちあるものは一つの温度プロフィールを幾つかのサイ
クル数Ｘ回運転し、そして次いで異った温度プロフィー
ルを異ったサイクル数７回運転するなど、各温度プロフ
ィールについて異ったサイクル数を運転することを希望
することがある。各温度プロフィールデータベースはフ
ァイル特定番号が与えられ、そして各ファイルはそのプ
ロフィールのためのデータベース中にリンクフィールド
を有する。このリンクフィールドの内容が工程１０９に
おいて検索され、次の温度プロフィールのファイル番号
が実行される。即ち次のファイルが「運転」される、こ
のリンクフィールドの内容がゼロ或いは何等かの他の所
定の暗号である場合には次いでリンキンクは行われず、
ディスプレイ上にその旨表示されて処理が停止される。
数が完結されたことを示す場合には、次いで工程１０９
を実行してファイルリンケージを決定する。ユーザーの
うちあるものは一つの温度プロフィールを幾つかのサイ
クル数Ｘ回運転し、そして次いで異った温度プロフィー
ルを異ったサイクル数７回運転するなど、各温度プロフ
ィールについて異ったサイクル数を運転することを希望
することがある。各温度プロフィールデータベースはフ
ァイル特定番号が与えられ、そして各ファイルはそのプ
ロフィールのためのデータベース中にリンクフィールド
を有する。このリンクフィールドの内容が工程１０９に
おいて検索され、次の温度プロフィールのファイル番号
が実行される。即ち次のファイルが「運転」される、こ
のリンクフィールドの内容がゼロ或いは何等かの他の所
定の暗号である場合には次いでリンキンクは行われず、
ディスプレイ上にその旨表示されて処理が停止される。
リンケージがある場合には、工程１１１が行われ、新し
いプロフィールの第一のチェックポイントを検索し、処
理は上記の如く工程８１から継続する。このリンキンク
操作は次の温度プロフィールの終りにおいて繰返され、
リンキンクアドレスがなくなるまで続けられる。処理は
次いで完了する。
いプロフィールの第一のチェックポイントを検索し、処
理は上記の如く工程８１から継続する。このリンキンク
操作は次の温度プロフィールの終りにおいて繰返され、
リンキンクアドレスがなくなるまで続けられる。処理は
次いで完了する。
贈１Ｌ杭汰
本発明により自動化される増幅方法は熱安定性酵素を用
いる現存する核酸配列の増幅方法である。
いる現存する核酸配列の増幅方法である。
具体的には、この増幅方法は、核酸或いは核酸混合物に
含有される少な（とも一つの特定の核酸配列を増幅する
ことを含むものであって、その核酸が二本鎖である場合
には、それは二本の等しい或いは等しくない長さの分離
された相補的鎖よりなるものであり、下記工程を含んで
なるものである： （ａ）各核酸鎖を四種の異るヌクレオチドトリホスフェ
ート及び増幅されるべき各々の異る特定の配列について
一つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程
であって、各プライマーが一つのプライマーから合成さ
れる延長生成物がそれがその相補体から分離された場合
に他のプライマーの延長生成物の合成のための鋳型とし
て役立ち得るように各特定の配列の異った鎖に実質的に
相補的であるように選ばれ、該接触が各プライマーのそ
の相補的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する
温度において行われる工程、（ｂ）各核酸鎖を、工程（
ａ）と同時に或いはその後にヌクレオチドトリホスフェ
ートの結合を触媒して各核酸の各鎖に相補的なブライマ
ー延長生成物を形成する熱安定性酵素と接触させる工程
、（ｃ）工程（ｂ）からの混合物を有効時間にわたり且
つ有効温度において加熱して、酵素の活性を促進し、そ
して増幅されるべき各々の異る配列について、各核酸鎖
の鋳型に対して相補的である各プライマーの延長生成物
を合成するが、しかし、各延長生成物をその相補的核酸
鎖から分離する程高温には加熱しない加熱工程、 （ｄ）工程（ｃ）からの混合物を有効時間にわたり且つ
有効温度において加熱してプライマー延長生成物をそれ
らが合成された鋳型から分離して一本鎖分子を生成する
が、しかし不可逆的に酵素を変性させる程高温には加熱
しない加熱工程、（０）工程（ｄ）からの混合物を有効
時間にわたり且つ各プライマーの工程（ｄ）において、
生成された一本鎖分子の各々へのハイブリダイゼーショ
ンを促進する有効温度に冷却する工程、及び（「）工程
（ｅ）からの混合物を有効時間にわたり且つ酵素の活性
を促進して増幅されるべき各々の異る配列について、工
程（ｄ）において生成された各核酸鎖鋳型に相補的であ
る各プライマーの延長生成物を合成するに有効な温度に
加熱するがしかし、延長生成物をその相補的鎖鋳型から
分離する程の高温には加熱しない加熱工程（但し工程（
ｅ）〜（ｆ）は同時に或いは逐次行われてよい）。
含有される少な（とも一つの特定の核酸配列を増幅する
ことを含むものであって、その核酸が二本鎖である場合
には、それは二本の等しい或いは等しくない長さの分離
された相補的鎖よりなるものであり、下記工程を含んで
なるものである： （ａ）各核酸鎖を四種の異るヌクレオチドトリホスフェ
ート及び増幅されるべき各々の異る特定の配列について
一つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程
であって、各プライマーが一つのプライマーから合成さ
れる延長生成物がそれがその相補体から分離された場合
に他のプライマーの延長生成物の合成のための鋳型とし
て役立ち得るように各特定の配列の異った鎖に実質的に
相補的であるように選ばれ、該接触が各プライマーのそ
の相補的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進する
温度において行われる工程、（ｂ）各核酸鎖を、工程（
ａ）と同時に或いはその後にヌクレオチドトリホスフェ
ートの結合を触媒して各核酸の各鎖に相補的なブライマ
ー延長生成物を形成する熱安定性酵素と接触させる工程
、（ｃ）工程（ｂ）からの混合物を有効時間にわたり且
つ有効温度において加熱して、酵素の活性を促進し、そ
して増幅されるべき各々の異る配列について、各核酸鎖
の鋳型に対して相補的である各プライマーの延長生成物
を合成するが、しかし、各延長生成物をその相補的核酸
鎖から分離する程高温には加熱しない加熱工程、 （ｄ）工程（ｃ）からの混合物を有効時間にわたり且つ
有効温度において加熱してプライマー延長生成物をそれ
らが合成された鋳型から分離して一本鎖分子を生成する
が、しかし不可逆的に酵素を変性させる程高温には加熱
しない加熱工程、（０）工程（ｄ）からの混合物を有効
時間にわたり且つ各プライマーの工程（ｄ）において、
生成された一本鎖分子の各々へのハイブリダイゼーショ
ンを促進する有効温度に冷却する工程、及び（「）工程
（ｅ）からの混合物を有効時間にわたり且つ酵素の活性
を促進して増幅されるべき各々の異る配列について、工
程（ｄ）において生成された各核酸鎖鋳型に相補的であ
る各プライマーの延長生成物を合成するに有効な温度に
加熱するがしかし、延長生成物をその相補的鎖鋳型から
分離する程の高温には加熱しない加熱工程（但し工程（
ｅ）〜（ｆ）は同時に或いは逐次行われてよい）。
工程（ｄ）〜（「）は配列の所望レベルの増幅が得られ
る迄繰返されてよい。
る迄繰返されてよい。
この増幅方法は既存の完全に特定された核酸配列の多量
製造のみならず、存在することは知られているが完全に
は特定されていない核酸配列の製造にも有用である。い
づれの場合においても、増幅されるべき配列の最初のコ
ピーが利用可能でなければならないが、それは純粋な或
いは個々の分子である必要はない。
製造のみならず、存在することは知られているが完全に
は特定されていない核酸配列の製造にも有用である。い
づれの場合においても、増幅されるべき配列の最初のコ
ピーが利用可能でなければならないが、それは純粋な或
いは個々の分子である必要はない。
本発明において用いられる「オリゴヌクレオチド」とい
う用語は２個以上好ましくは３個を越えるデオキシリボ
ヌクレオチド類或いはりボスクレオチド類よりなる分子
と定義される。その正確な大きさは数多くの要因に依存
するが、それらの要因は又オリゴヌクレオチドの究極的
機能或いは用途に応じて異る。このオリゴヌクレオチド
は合成的に或いはクローニングによって誘導されてよい
。
う用語は２個以上好ましくは３個を越えるデオキシリボ
ヌクレオチド類或いはりボスクレオチド類よりなる分子
と定義される。その正確な大きさは数多くの要因に依存
するが、それらの要因は又オリゴヌクレオチドの究極的
機能或いは用途に応じて異る。このオリゴヌクレオチド
は合成的に或いはクローニングによって誘導されてよい
。
本発明において用いられる「プライマー」という用語は
、生成された制限消化物に天然において存在するか或い
は合成的に製造されたかを問わず、核酸鎖に相補的であ
るプライマー延長生成物の合成が誘発される条件下、即
ち適当な温度及びｐｔｔにおいて四種の異ったヌクレオ
チドトリホスフェート及び熱安定性酵素の存在下に置か
れた際に合成の開始点として作用することのできるオリ
ゴヌクレオチドを指す。
、生成された制限消化物に天然において存在するか或い
は合成的に製造されたかを問わず、核酸鎖に相補的であ
るプライマー延長生成物の合成が誘発される条件下、即
ち適当な温度及びｐｔｔにおいて四種の異ったヌクレオ
チドトリホスフェート及び熱安定性酵素の存在下に置か
れた際に合成の開始点として作用することのできるオリ
ゴヌクレオチドを指す。
プライマーは、増幅における最大効率のためには一本鎖
であるのが好ましいが、或いは又二本鎖であってもよい
。二本鎖の場合には、プライマーは先ず処理されてその
鎖を分離してから延長生成物を調製するために用いられ
る。好ましくはプライマーはオリゴデオキシリボヌクレ
オチドである。
であるのが好ましいが、或いは又二本鎖であってもよい
。二本鎖の場合には、プライマーは先ず処理されてその
鎖を分離してから延長生成物を調製するために用いられ
る。好ましくはプライマーはオリゴデオキシリボヌクレ
オチドである。
プライマーは熱安定酵素の存在下において延長生成物の
合成を開始するのに十分に長くなければならない。プラ
イマーの正確な長さは温度、プライマーの由来及び使用
される方法などの多くの要因に応じて異る。例えば、目
標配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマ
ーは典型的に１５〜２５或いはそれ以上のヌクレオチド
を含有するが、それは更に少ないヌクレオチドを含むも
のであってもよい。短いプライマー分子は一般的に鋳型
と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためには
より低温を必要とする。
合成を開始するのに十分に長くなければならない。プラ
イマーの正確な長さは温度、プライマーの由来及び使用
される方法などの多くの要因に応じて異る。例えば、目
標配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマ
ーは典型的に１５〜２５或いはそれ以上のヌクレオチド
を含有するが、それは更に少ないヌクレオチドを含むも
のであってもよい。短いプライマー分子は一般的に鋳型
と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためには
より低温を必要とする。
本発明におけるプライマーは増幅されるべき各特定の配
列の異る鎖に「実質的に」相補的であるように選ばれる
。これはプライマーがそれらのそれぞれの鎖とハイブリ
ダイズするように十分に相補的でなければならないこと
を意味する。従って、プライマー配列は鋳型の正確な配
列を反映する必要はない。例えば非−相補的ヌクレオチ
ド断片がプライマーの５′末端に結合し、プライマー配
列の残部が鎖と相補的であってよい。或いは又、そのプ
ライマー配列が増幅される鎖の配列とそれとハイブリダ
イズするに十分な相補性を有して他のプライマーの延長
生成物の合成のための鋳型を形成するならば、非相補的
塩基或いはより長い配列をプライマー中に散在させるこ
とができる。しかしながら、検出目的のためには、特に
標識配列に特異的なプローブを用いる場合には、最良の
結果を得るためにプライマーは典型的に正確な相補性を
有する。
列の異る鎖に「実質的に」相補的であるように選ばれる
。これはプライマーがそれらのそれぞれの鎖とハイブリ
ダイズするように十分に相補的でなければならないこと
を意味する。従って、プライマー配列は鋳型の正確な配
列を反映する必要はない。例えば非−相補的ヌクレオチ
ド断片がプライマーの５′末端に結合し、プライマー配
列の残部が鎖と相補的であってよい。或いは又、そのプ
ライマー配列が増幅される鎖の配列とそれとハイブリダ
イズするに十分な相補性を有して他のプライマーの延長
生成物の合成のための鋳型を形成するならば、非相補的
塩基或いはより長い配列をプライマー中に散在させるこ
とができる。しかしながら、検出目的のためには、特に
標識配列に特異的なプローブを用いる場合には、最良の
結果を得るためにプライマーは典型的に正確な相補性を
有する。
本発明において用いられる［制限エンドヌクレアーゼ」
及び「制限酵素」という用語はその各々がある特定のヌ
クレオチド配列において或いはその近辺において二本鎖
ＤＮＡを切断する細菌酵素を指す。
及び「制限酵素」という用語はその各々がある特定のヌ
クレオチド配列において或いはその近辺において二本鎖
ＤＮＡを切断する細菌酵素を指す。
本発明において用いられる「熱安定性酵素」とは熱に安
定であり且つ耐熱性であり、そして適当な方法でヌクレ
オチドの結合を触媒（容易化して）して各核酸鎖に相補
的なプライマー延長生成物を形成する酵素を指す。一般
的に合成は各プライマーの３′末端から開始され合成が
終了して異る長さの分子を生成するまで鋳型鎖に沿って
５′方向に進行する。しかしながら、上記同一方法を用
いて５′末端から合成を開始して他の方向に進行する熱
安定性酵素もある。
定であり且つ耐熱性であり、そして適当な方法でヌクレ
オチドの結合を触媒（容易化して）して各核酸鎖に相補
的なプライマー延長生成物を形成する酵素を指す。一般
的に合成は各プライマーの３′末端から開始され合成が
終了して異る長さの分子を生成するまで鋳型鎖に沿って
５′方向に進行する。しかしながら、上記同一方法を用
いて５′末端から合成を開始して他の方向に進行する熱
安定性酵素もある。
本発明における熱安定性酵素は増幅反応に対して有効で
なければならないという一つ標準を満足しなければなら
ない。即ちこの酵素は二本鎖核酸の変性を行うのに必要
な時間高温に曝された場合に不可逆的に変性（不活性化
）されてはならない。
なければならないという一つ標準を満足しなければなら
ない。即ちこの酵素は二本鎖核酸の変性を行うのに必要
な時間高温に曝された場合に不可逆的に変性（不活性化
）されてはならない。
本発明における目的のための不可逆的変性とは酵素活性
の永久的且つ完全な喪失を指す。変性に必要な加熱条件
は例えば緩衝塩濃度及び変性される核酸の長さ及びヌク
レオチド組成などに応じて異るが、典型的には約９０〜
約１０５℃でその時間は主として温度及び核酸長さに応
じて異るが、典型的には約０．４〜４分間である。緩衝
液潤度及び／又は核酸のＧＣ組成が増大されるにつれて
より高温が許容可能となる。好ましくは酵素は約９０〜
１００℃において可逆的に変性されないのがよい。
の永久的且つ完全な喪失を指す。変性に必要な加熱条件
は例えば緩衝塩濃度及び変性される核酸の長さ及びヌク
レオチド組成などに応じて異るが、典型的には約９０〜
約１０５℃でその時間は主として温度及び核酸長さに応
じて異るが、典型的には約０．４〜４分間である。緩衝
液潤度及び／又は核酸のＧＣ組成が増大されるにつれて
より高温が許容可能となる。好ましくは酵素は約９０〜
１００℃において可逆的に変性されないのがよい。
本発明における熱安定性酵素は、それが機能する最適温
度を、プライマーの鋳型へのハイブリダイゼーションが
それ未満で促進される温度である約４０℃よりも高温に
有するのが好ましい。酵素のための最適温度が高ければ
高い程、プライマー指令延長過程の特異性及び／又は選
択性がより太き（なる。しかしながら、４０℃未満例え
ば３７℃において、活性である酵素も又それらが熱−安
定性である限り本発明の範囲内に含まれる。好ましくは
最適温度は約５０〜８０℃、より好ましくは６０〜８０
℃の範囲である。
度を、プライマーの鋳型へのハイブリダイゼーションが
それ未満で促進される温度である約４０℃よりも高温に
有するのが好ましい。酵素のための最適温度が高ければ
高い程、プライマー指令延長過程の特異性及び／又は選
択性がより太き（なる。しかしながら、４０℃未満例え
ば３７℃において、活性である酵素も又それらが熱−安
定性である限り本発明の範囲内に含まれる。好ましくは
最適温度は約５０〜８０℃、より好ましくは６０〜８０
℃の範囲である。
文献に耐熱性であると報告された酵素の具体例としては
、熱安定性ポリメラーゼ類、例えば好熱性細菌サーマス
・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サー
マス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ ）
、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏ ｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフ
ィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ Ｌｅｒ＋ ｒｏ ｔｈ吐
賎匝■４） （これは掲げられた他のものよりも幾分よ
り低い最適温度を有する）、サーマス・アクアティクス
（Ｔｈｅｒａ＋ｕｓ ■胆旦ＣＵＳ ）、サーマス・
ラフテラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｉａｃｔｅｕｓ ）、
サーマス・ルーベンス（Ｔｈｅｒ＋ｗｕｓ ｒｕｂｅ
ｎｓ）及びメタノサーマス・フエルビドウス（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｔｈｅｒｗ＋ｕｓｒｅｒｖｉｄｕｓ）などが挙げ
られる。
、熱安定性ポリメラーゼ類、例えば好熱性細菌サーマス
・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サー
マス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ ）
、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏ ｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフ
ィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ Ｌｅｒ＋ ｒｏ ｔｈ吐
賎匝■４） （これは掲げられた他のものよりも幾分よ
り低い最適温度を有する）、サーマス・アクアティクス
（Ｔｈｅｒａ＋ｕｓ ■胆旦ＣＵＳ ）、サーマス・
ラフテラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｉａｃｔｅｕｓ ）、
サーマス・ルーベンス（Ｔｈｅｒ＋ｗｕｓ ｒｕｂｅ
ｎｓ）及びメタノサーマス・フエルビドウス（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｔｈｅｒｗ＋ｕｓｒｅｒｖｉｄｕｓ）などが挙げ
られる。
本発明において好ましい熱安定性酵素はサーマス・アク
アティクスＹＴ−１株から単離されたＤＮＡポリメラー
ゼであり、次の様に精製されたものである：サーマス・
アクアティクスの細胞を増殖せしめ、そしてこのポリメ
ラーゼを単離し、粗製抽出液からカレディン等（Ｋａｌ
ｅｄｉｎ ｅｔ ａｌ、）Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ、 ４
５．６４４−６５１ （１９８０）により示された最初
の五つの工程を用いて精製した。第５工程（ｐ）１７．
５におけるＤＥＡＥカラム）の際に汚染デオキシリボヌ
クレアーゼ（エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアー
ゼ）についてアッセイを行い、ポリメラーゼ活性を有し
、最少のヌクレアーゼ汚染を有する画分のみをプールし
た。最終のクロマトグラフィ精製工程はチェノ等（Ｃｈ
ｉｅｎ ｅＬ ａｌ、） Ｊ、Ｂａｃｔ−ｅｒｉｏｌ、
１２７ ： １５５０−１５５７（１９７６）により
示唆されたホスホセルロースカラムを用いるものである
。ヌクレアーゼ及びポリメラーゼ活性のアッセイを行い
、最少ヌクレアーゼ汚染のポリメラーゼ画分のみをプー
ルした。
アティクスＹＴ−１株から単離されたＤＮＡポリメラー
ゼであり、次の様に精製されたものである：サーマス・
アクアティクスの細胞を増殖せしめ、そしてこのポリメ
ラーゼを単離し、粗製抽出液からカレディン等（Ｋａｌ
ｅｄｉｎ ｅｔ ａｌ、）Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ、 ４
５．６４４−６５１ （１９８０）により示された最初
の五つの工程を用いて精製した。第５工程（ｐ）１７．
５におけるＤＥＡＥカラム）の際に汚染デオキシリボヌ
クレアーゼ（エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアー
ゼ）についてアッセイを行い、ポリメラーゼ活性を有し
、最少のヌクレアーゼ汚染を有する画分のみをプールし
た。最終のクロマトグラフィ精製工程はチェノ等（Ｃｈ
ｉｅｎ ｅＬ ａｌ、） Ｊ、Ｂａｃｔ−ｅｒｉｏｌ、
１２７ ： １５５０−１５５７（１９７６）により
示唆されたホスホセルロースカラムを用いるものである
。ヌクレアーゼ及びポリメラーゼ活性のアッセイを行い
、最少ヌクレアーゼ汚染のポリメラーゼ画分のみをプー
ルした。
カレディン等（Ｋａｌｅｄｉｎ ｅｔ ａｌ、）及びチ
ェノ（Ｃｈｉｅｎ）等は６２−６３ ｋダルトンの分子
量を有する精製酵素を報告しているが、上記精製方法を
用いたデータは約８６〜９０にダルトンの分子量を示唆
する。
ェノ（Ｃｈｉｅｎ）等は６２−６３ ｋダルトンの分子
量を有する精製酵素を報告しているが、上記精製方法を
用いたデータは約８６〜９０にダルトンの分子量を示唆
する。
−ｉ的に、本発明の増幅方法は含まれる反応工程の数に
対し、て指数的量において少なくとも一つの特定の核酸
配列を製造する連鎖反応を含むものであるが、その前提
として（ａ）必要とされる配列の末端がそれらにハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドが合成できるように十
分に詳細に知られていること、及び（ｂ）連鎖反応を開
始するために小量の配列が利用可能であること、が挙げ
られる。この連鎖反応の生成物は、用いられた特定のプ
ライマーの末端に対応する末端を有する個々の核酸二本
鎖である。
対し、て指数的量において少なくとも一つの特定の核酸
配列を製造する連鎖反応を含むものであるが、その前提
として（ａ）必要とされる配列の末端がそれらにハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドが合成できるように十
分に詳細に知られていること、及び（ｂ）連鎖反応を開
始するために小量の配列が利用可能であること、が挙げ
られる。この連鎖反応の生成物は、用いられた特定のプ
ライマーの末端に対応する末端を有する個々の核酸二本
鎖である。
任意の核酸配列を、それが所望の特定の核酸配列を含有
するか或いは含有すると想像される限り、精製或いは非
精製形態において、出発核酸として利用することができ
る。即ち、本発明の方法は例えばＤＮＡ、或いはメツセ
ンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを使用してよく、そのＤＮ
Ａ或いはＲＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよ
い。更に各々の一本鎖を含有するＤＮＡ −ＲＮＡハイ
ブリッドを利用してもよい、これらの核酸の任意の混合
物も又使用され、或いは本発明のものと同一の或いは異
るプライマー用いる前増幅反応から生成された核酸もそ
の様に利用されてよい。増幅される特定の核酸配列は大
分子の一部分のみであってよく、或いは当初から個別の
分子として存在し、その結果特定の配列が全核酸を構成
していてもよい。
するか或いは含有すると想像される限り、精製或いは非
精製形態において、出発核酸として利用することができ
る。即ち、本発明の方法は例えばＤＮＡ、或いはメツセ
ンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを使用してよく、そのＤＮ
Ａ或いはＲＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよ
い。更に各々の一本鎖を含有するＤＮＡ −ＲＮＡハイ
ブリッドを利用してもよい、これらの核酸の任意の混合
物も又使用され、或いは本発明のものと同一の或いは異
るプライマー用いる前増幅反応から生成された核酸もそ
の様に利用されてよい。増幅される特定の核酸配列は大
分子の一部分のみであってよく、或いは当初から個別の
分子として存在し、その結果特定の配列が全核酸を構成
していてもよい。
増幅される配列は当初純粋な形態で存在する必′要はな
い。即ち、それは複雑な混合物の少部分であってよい。
い。即ち、それは複雑な混合物の少部分であってよい。
すなわち、全ヒトＤＮＡに含まれるβ−グロビン遺伝子
の一部（例えば上記サイキ等の論文に例示されるような
）でもよく、或いはその生物体が特種の生物学的試料の
極めて少部分のみを構成するが故に核酸配列の一部など
であってよい。出発核酸配列は１より多くの同−或いは
異った所望の特定の核酸配列を含有してよい。従って、
本発明の増幅方法は多量の一つの特定の核酸配列を製造
するのみならず、同一の或いは異る核酸分子上に位：ｌ
する一つより多くの異る特定の核酸配列を増幅するため
にも有用である。
の一部（例えば上記サイキ等の論文に例示されるような
）でもよく、或いはその生物体が特種の生物学的試料の
極めて少部分のみを構成するが故に核酸配列の一部など
であってよい。出発核酸配列は１より多くの同−或いは
異った所望の特定の核酸配列を含有してよい。従って、
本発明の増幅方法は多量の一つの特定の核酸配列を製造
するのみならず、同一の或いは異る核酸分子上に位：ｌ
する一つより多くの異る特定の核酸配列を増幅するため
にも有用である。
核酸は任意の由来、例えばｐＢＲ３２２などのプラスミ
ドから、クローン化されたＤＮＡ或いはＲＮＡから、或
いは任意の由来例えば細菌、酵母、ウィルス、オルガネ
ル及び植物或いは動物などの高等動物を含む任意の起源
からの天然ＤＮＡ或いはＲＮＡから得られる。ＤＮＡ或
いはＲＮＡは各種技術例えばマニアティス等（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＣＩｏ
ｎｉｎｇ（１９８２） 、８０−２８１に記載されてい
る技術により血液、絨毛膜絨毛或いは羊膜細胞などの組
織材料から抽出されてよい。
ドから、クローン化されたＤＮＡ或いはＲＮＡから、或
いは任意の由来例えば細菌、酵母、ウィルス、オルガネ
ル及び植物或いは動物などの高等動物を含む任意の起源
からの天然ＤＮＡ或いはＲＮＡから得られる。ＤＮＡ或
いはＲＮＡは各種技術例えばマニアティス等（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＣＩｏ
ｎｉｎｇ（１９８２） 、８０−２８１に記載されてい
る技術により血液、絨毛膜絨毛或いは羊膜細胞などの組
織材料から抽出されてよい。
増幅される配列に対して特異的でありその後検出される
プローブが用いられる場合には、細胞を低張緩衝液に懸
濁させ細胞溶解及び細胞内成分の分散が起こるまで通常
１〜１５分間約分間−１００℃に加熱されるならば核酸
の抽出なしに細胞を直接使用してもよい。加熱工程後増
幅試薬は直接に溶解細胞に添加されてよい。
プローブが用いられる場合には、細胞を低張緩衝液に懸
濁させ細胞溶解及び細胞内成分の分散が起こるまで通常
１〜１５分間約分間−１００℃に加熱されるならば核酸
の抽出なしに細胞を直接使用してもよい。加熱工程後増
幅試薬は直接に溶解細胞に添加されてよい。
任意の特定の核酸配列を本発明の増幅方法により製造す
ることができる。所望配列の異る鎖にハイブリダイズす
る二つのオリゴヌクレオチドブライマーが配列に沿って
一つのプライマーから合成される延長生成物がそれがそ
の鋳型（補体）から分離された場合に他のプライマーを
一定長さの核酸配列に延長するための鋳型として役立ち
得るような相対的位置において調製することができるよ
うに十分に詳細に配列の十分な数の塩基が知られている
ことのみが必要である。配列の両末端の塩基についての
知識が多ければ多い程、目標核酸配列に対するプライマ
ーの特異性従って方法の効率が増大する。
ることができる。所望配列の異る鎖にハイブリダイズす
る二つのオリゴヌクレオチドブライマーが配列に沿って
一つのプライマーから合成される延長生成物がそれがそ
の鋳型（補体）から分離された場合に他のプライマーを
一定長さの核酸配列に延長するための鋳型として役立ち
得るような相対的位置において調製することができるよ
うに十分に詳細に配列の十分な数の塩基が知られている
ことのみが必要である。配列の両末端の塩基についての
知識が多ければ多い程、目標核酸配列に対するプライマ
ーの特異性従って方法の効率が増大する。
以下に用いられる「プライマー」という用語は特に増幅
されるべき断片の末端配列に関する情報において何等か
の曖昧さがある場合にはｌより多くのプライマーを指す
ことが理解されるであろう。
されるべき断片の末端配列に関する情報において何等か
の曖昧さがある場合にはｌより多くのプライマーを指す
ことが理解されるであろう。
例えば核酸配列が蛋白質配列情報から推定される場合に
おいて、遺伝暗号の縮重に基づくあらゆる可能性のある
コドン変化を表わす配列を含むプライマーの集合体が各
鎖に対して用いられる。この集合体からの一つのプライ
マーは増幅されるべき所望配列の末端と相同である。
おいて、遺伝暗号の縮重に基づくあらゆる可能性のある
コドン変化を表わす配列を含むプライマーの集合体が各
鎖に対して用いられる。この集合体からの一つのプライ
マーは増幅されるべき所望配列の末端と相同である。
オリゴヌクレオチドプライマーは任意の適当な方法例え
ば上記ホスホトリエステル及びホスホジエステル方法或
いはそれらの自動化された実施態様などにより調製され
る。一つのその様な自動化された実施Ｂ様において、ジ
エチルホスホルアミダイトが出発材料として用いられ、
ビューケージ等（Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｌ ａｌ、）
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１）
２２ ： １８５９−１８６２により記載されるように
して合成される。修飾された固体支持体上でオリゴヌク
レオチドを合成する一つの方法は米国特許４，４５８，
０６６号明細書に記載されている。又、細菌源から単離
されたプライマー（例えば制限エンドヌクレアーレ消化
物）を用いることも可能である。
ば上記ホスホトリエステル及びホスホジエステル方法或
いはそれらの自動化された実施態様などにより調製され
る。一つのその様な自動化された実施Ｂ様において、ジ
エチルホスホルアミダイトが出発材料として用いられ、
ビューケージ等（Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｌ ａｌ、）
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１）
２２ ： １８５９−１８６２により記載されるように
して合成される。修飾された固体支持体上でオリゴヌク
レオチドを合成する一つの方法は米国特許４，４５８，
０６６号明細書に記載されている。又、細菌源から単離
されたプライマー（例えば制限エンドヌクレアーレ消化
物）を用いることも可能である。
１．１定の核酸配列はその配列を鋳型として含有する核
酸を用いることにより製造される。第一の工程は各核酸
鎖を四種のヌクレオチドトリボスフエート及び増幅され
或いは検出されるべき各界る核酸配列につき一つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーと接触させることを含む。増
幅或いは検出されるべき核酸がＤＮＡであるならば、ヌ
クレオチドトリボスフエートはｄＡＴＰ 、 ｄＣＴＰ
、 ｄＧＴＰ及びＴＴＰである。
酸を用いることにより製造される。第一の工程は各核酸
鎖を四種のヌクレオチドトリボスフエート及び増幅され
或いは検出されるべき各界る核酸配列につき一つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーと接触させることを含む。増
幅或いは検出されるべき核酸がＤＮＡであるならば、ヌ
クレオチドトリボスフエートはｄＡＴＰ 、 ｄＣＴＰ
、 ｄＧＴＰ及びＴＴＰである。
これらの核酸鎖は追加の核酸鎖の合成のための鋳型とし
て使用される。この合成は任意の適当な方法を用いて行
うことができる。一般的には、それは緩衝化水溶液中に
おいて好ましくはρ］１７〜９、最も好ましくは８にお
いて行われる。好ましくは、モル濃度過剰（クローン化
核酸に対しては通常約１０００：１のプライマ一対鋳型
、及びゲノム核酸に対しては通常１０’：１のプライマ
一対鋳型）の二つのオリゴヌクレオチドプライマーが分
＾１ｔされた鋳型鎖を含有する緩衝液に添加される。し
かしながら、相補開鎖の量は本発明における方法が診断
用途に用いられるならば知られていないことがあり、そ
の結果相補開鎖の計に対するプライマーの量は確実に決
定することができないことが理解される。しかしながら
、実際問題として、添加されるプライマーの世は一般的
に増幅される配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物中に含有
されている場合には相補開鎖（鋳型）の量に対しである
モル濃度過剰である。この方法の能率を改良するために
は大きなモル濃度過剰が好ましい。
て使用される。この合成は任意の適当な方法を用いて行
うことができる。一般的には、それは緩衝化水溶液中に
おいて好ましくはρ］１７〜９、最も好ましくは８にお
いて行われる。好ましくは、モル濃度過剰（クローン化
核酸に対しては通常約１０００：１のプライマ一対鋳型
、及びゲノム核酸に対しては通常１０’：１のプライマ
一対鋳型）の二つのオリゴヌクレオチドプライマーが分
＾１ｔされた鋳型鎖を含有する緩衝液に添加される。し
かしながら、相補開鎖の量は本発明における方法が診断
用途に用いられるならば知られていないことがあり、そ
の結果相補開鎖の計に対するプライマーの量は確実に決
定することができないことが理解される。しかしながら
、実際問題として、添加されるプライマーの世は一般的
に増幅される配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物中に含有
されている場合には相補開鎖（鋳型）の量に対しである
モル濃度過剰である。この方法の能率を改良するために
は大きなモル濃度過剰が好ましい。
得られた溶液を次いで増幅或いは検出されるべき核酸が
二本鎖であるか或いは一本鎖であるかに従って処理する
。核酸が一本鎖である場合には、変性工程を使用する必
要がな（、反応液をプライマーのその相補的目標（鋳型
）配列へのハイブリダイゼーションを促進する温度に保
つ。その様な温度は通常約３５〜約６５℃より好ましく
は約り７℃〜約５０℃であり、有効時間通常１．５〜５
分、好ましくは１〜３分間行う。
二本鎖であるか或いは一本鎖であるかに従って処理する
。核酸が一本鎖である場合には、変性工程を使用する必
要がな（、反応液をプライマーのその相補的目標（鋳型
）配列へのハイブリダイゼーションを促進する温度に保
つ。その様な温度は通常約３５〜約６５℃より好ましく
は約り７℃〜約５０℃であり、有効時間通常１．５〜５
分、好ましくは１〜３分間行う。
元の一本鎖核酸に対する相補体は１個或いは２個のオリ
ゴヌクレオチドプライマーをそれに添加することにより
合成される。適当な単一プライマーが添加されるならば
、プライマー延長生成物がプライマー、熱安定性酵素及
びヌクレオチドトリボスフエートの存在下において合成
される。この生成物は一本鎖核酸に対して部分的に相補
的であり、核酸鎖とハイブリダイズして長さの等しくな
い鎖の二本鎖を形成し、これは次いで上記の如く一本鎖
に分離され、二本の単一の分離された相補開鎖を生成す
る。或いは又、二つの適当なプライマーを一本鎖核酸に
添加して反応を行ってもよい。
ゴヌクレオチドプライマーをそれに添加することにより
合成される。適当な単一プライマーが添加されるならば
、プライマー延長生成物がプライマー、熱安定性酵素及
びヌクレオチドトリボスフエートの存在下において合成
される。この生成物は一本鎖核酸に対して部分的に相補
的であり、核酸鎖とハイブリダイズして長さの等しくな
い鎖の二本鎖を形成し、これは次いで上記の如く一本鎖
に分離され、二本の単一の分離された相補開鎖を生成す
る。或いは又、二つの適当なプライマーを一本鎖核酸に
添加して反応を行ってもよい。
核酸が二本の鎖を含有する場合には、それを鋳型として
使用する前に核酸の鎖を分離する必要がある。この鎖分
離は物理的、化学的或いは酵素的手段を含む任意の適当
な変性方法により達成することができる。一つの好まし
い核酸の鎖を分離する物理的方法は核酸をそれが完全に
（〉９９％）変性されるまで加熱することを含むもので
ある。
使用する前に核酸の鎖を分離する必要がある。この鎖分
離は物理的、化学的或いは酵素的手段を含む任意の適当
な変性方法により達成することができる。一つの好まし
い核酸の鎖を分離する物理的方法は核酸をそれが完全に
（〉９９％）変性されるまで加熱することを含むもので
ある。
典型的な熱変性は約９０〜１０５℃の範囲の温度を通常
約０．５〜５分間の範囲の時間含むものである。
約０．５〜５分間の範囲の時間含むものである。
好ましくは有効な変性温度は０．５〜３分間の間の９０
〜１００℃である。鎖分離は又ヘリカーゼ頚部ち酵素Ｒ
ｅｃＡ、として知られているへりカーゼ活性を有し、そ
してｒｉｂｏＡＴＰの存在下においてＤＮＡを変性する
ことが知られている種類の酵素からの酵素により誘発さ
れる。核酸の鎖をヘリカーゼ類を用いて分離するために
適した反応条件はターンホフマンーベーリング（Ｋｕｈ
ｎ ｌｉｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ）Ｃ５ＩＩ−
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４３
： ６３（１９７８）に記載されており、そしてＲｅｃ
Ａを用いる技術はＣ，ラッディング（Ｃ，Ｒ＋＋ｄｄｉ
ｎｇ）＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６ ：４
０５−３７ （１９Ｂ２）に総説されている。この変性
は等しい或いは等しくない長さの二本の分離された相補
開鎖を生成する。
〜１００℃である。鎖分離は又ヘリカーゼ頚部ち酵素Ｒ
ｅｃＡ、として知られているへりカーゼ活性を有し、そ
してｒｉｂｏＡＴＰの存在下においてＤＮＡを変性する
ことが知られている種類の酵素からの酵素により誘発さ
れる。核酸の鎖をヘリカーゼ類を用いて分離するために
適した反応条件はターンホフマンーベーリング（Ｋｕｈ
ｎ ｌｉｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ）Ｃ５ＩＩ−
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４３
： ６３（１９７８）に記載されており、そしてＲｅｃ
Ａを用いる技術はＣ，ラッディング（Ｃ，Ｒ＋＋ｄｄｉ
ｎｇ）＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６ ：４
０５−３７ （１９Ｂ２）に総説されている。この変性
は等しい或いは等しくない長さの二本の分離された相補
開鎖を生成する。
二本鎖核酸が熱により変性されたならば、反応液を存在
する各プライマーのその相補的目標（鋳型）配列へのハ
イブリダイゼーションを促進する温度に冷却させる。こ
の温度は通常約３５〜６５℃以上、好ましくは約３７°
Ｃ〜約５０℃であり、有効時間通常０．５〜５分間、好
ましくは１〜３分間維持される。実際的には、温度は単
に約９５℃から約６５℃或いは３７℃程度の低温に低下
され、ハイブリダイゼーションはこの範囲の温度におい
て起こる。
する各プライマーのその相補的目標（鋳型）配列へのハ
イブリダイゼーションを促進する温度に冷却させる。こ
の温度は通常約３５〜６５℃以上、好ましくは約３７°
Ｃ〜約５０℃であり、有効時間通常０．５〜５分間、好
ましくは１〜３分間維持される。実際的には、温度は単
に約９５℃から約６５℃或いは３７℃程度の低温に低下
され、ハイブリダイゼーションはこの範囲の温度におい
て起こる。
核酸が一本鎖であると或いは二本鎖であるとを問わず、
熱安定性酵素は変性工程において或いは温度がハイブリ
ダイゼーションを促進する範囲に低下しているか或いは
範囲にある時点において添加されてよい。反応液を次い
で酵素の活性が促進されるか或いは最適化される温度即
ちハイブリダイズされたブライマー及び鋳型からプライ
マー延長生成物の合成を容易にするように酵素の活性を
増大させるのに十分な温度に加熱する。この温度は実際
に各核酸鋳型に相補的である各プライマーの延長生成物
を合成するのに十分でなければならないが、しかし、そ
の相補的鋳型からの各延長生成物を変性する程高くあっ
てはならない（即ち、ＩＸＡ度は通常約８０〜９０°Ｃ
未／Ｘｌｊである）。
熱安定性酵素は変性工程において或いは温度がハイブリ
ダイゼーションを促進する範囲に低下しているか或いは
範囲にある時点において添加されてよい。反応液を次い
で酵素の活性が促進されるか或いは最適化される温度即
ちハイブリダイズされたブライマー及び鋳型からプライ
マー延長生成物の合成を容易にするように酵素の活性を
増大させるのに十分な温度に加熱する。この温度は実際
に各核酸鋳型に相補的である各プライマーの延長生成物
を合成するのに十分でなければならないが、しかし、そ
の相補的鋳型からの各延長生成物を変性する程高くあっ
てはならない（即ち、ＩＸＡ度は通常約８０〜９０°Ｃ
未／Ｘｌｊである）。
主として用いられる酵素及び核酸の種類に応して、この
合成反応に有効な典型的温度は約４０〜８０℃、好まし
くは５０〜７０℃の範囲である。サーマス・アクアティ
カス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ７ユ）からのポリメラーゼが
用いられる場合には温度はより好ましくは約６０〜６５
℃の範囲である。この合成に必要とされる時間は、主と
して温度、核酸の長さ、酵素及び核酸混合物の複雑性に
応じて約０．５〜４０分以上の範囲であるが、好ましく
は１〜３分間である。核酸がより長ければより長い時間
が一般的に必要とされる。好ましくは、増幅された生成
物の検出を容易にするのに十分な量のジメチルスルホキ
シド（Ｄ？１ＳＯ）も又反応液中に存在するのがよい。
合成反応に有効な典型的温度は約４０〜８０℃、好まし
くは５０〜７０℃の範囲である。サーマス・アクアティ
カス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ７ユ）からのポリメラーゼが
用いられる場合には温度はより好ましくは約６０〜６５
℃の範囲である。この合成に必要とされる時間は、主と
して温度、核酸の長さ、酵素及び核酸混合物の複雑性に
応じて約０．５〜４０分以上の範囲であるが、好ましく
は１〜３分間である。核酸がより長ければより長い時間
が一般的に必要とされる。好ましくは、増幅された生成
物の検出を容易にするのに十分な量のジメチルスルホキ
シド（Ｄ？１ＳＯ）も又反応液中に存在するのがよい。
ＤＭＳＯは本発明の方法のいづれの工程において添加さ
れてもよいが、好ましくはこの工程及び全ての引続く工
程において存在するのがよい。最も好ましくは５〜１０
容量％のＤＭＳＯが存在する。
れてもよいが、好ましくはこの工程及び全ての引続く工
程において存在するのがよい。最も好ましくは５〜１０
容量％のＤＭＳＯが存在する。
新たに合成された鎖及びその相補的核酸鎖は以下の工程
において用いられる二本鎖分子を形成する。次の段階に
おいて、二本鎖分子の鎖は分子を変性するのに有効であ
るが、しかし熱安定性酵素が完全且つ不可逆的に変性或
いは不活性化されるようには高くない温度において熱変
性により分離される。主として酵素の種類及び核酸の長
さに応してこの温度は通常９０〜１０５℃、より好まし
くは９０〜＋００°Ｃの範囲であり、そして変性の時間
は主として温度及び核酸の長さに応じて典型的に０．５
〜４分の範囲である。
において用いられる二本鎖分子を形成する。次の段階に
おいて、二本鎖分子の鎖は分子を変性するのに有効であ
るが、しかし熱安定性酵素が完全且つ不可逆的に変性或
いは不活性化されるようには高くない温度において熱変
性により分離される。主として酵素の種類及び核酸の長
さに応してこの温度は通常９０〜１０５℃、より好まし
くは９０〜＋００°Ｃの範囲であり、そして変性の時間
は主として温度及び核酸の長さに応じて典型的に０．５
〜４分の範囲である。
この時間の後、前工程から生成されたその相補的一本鎖
分子（鋳型）へのブライマーのハイブリダイゼーション
を促進するレベルに温度を低下せしめる。その様な温度
は上記の通りである。
分子（鋳型）へのブライマーのハイブリダイゼーション
を促進するレベルに温度を低下せしめる。その様な温度
は上記の通りである。
このハイプリダイゼーション工程の後、或いはハイプリ
ダイゼーション工程の代りに（或いは同時に）、温度を
熱安定性酵素の活性を促進して鋳型として前の工程から
新たに合成された鎖を用いてブライマー延長生成物の合
成を可能にするのに有効である温度に調整する。この温
度も又前記の如く延長生成物をその鋳型から分離（変性
）する程高くあってはならない（通常４０〜８０℃で０
．５〜４０分間、好ましくは５０〜７０℃で１〜３分間
）。
ダイゼーション工程の代りに（或いは同時に）、温度を
熱安定性酵素の活性を促進して鋳型として前の工程から
新たに合成された鎖を用いてブライマー延長生成物の合
成を可能にするのに有効である温度に調整する。この温
度も又前記の如く延長生成物をその鋳型から分離（変性
）する程高くあってはならない（通常４０〜８０℃で０
．５〜４０分間、好ましくは５０〜７０℃で１〜３分間
）。
この工程の際に、ハイブリダイゼーションが起こること
があり、その結果変性後の先の冷却工程は必要とされな
い。同時工程を用いるその様な場合には、５０〜７０℃
の温度範囲が好ましい。
があり、その結果変性後の先の冷却工程は必要とされな
い。同時工程を用いるその様な場合には、５０〜７０℃
の温度範囲が好ましい。
これらの鎖分離、ハイブリダイゼーション、及び延長生
成物合成の加熱及び冷却工程は必要な回数繰返して究極
的用途に応じて所望量の特定の核酸配列を製造すること
ができる。唯一の制限は存在するプライマー、熱安定性
酵素及びヌクレオチドトリホスフェートの量である。好
ましくは、これらの工程は少なくとも一回繰返すのがよ
い。検出に使用するためには、サイクル数は例えば試料
の性質に応じて異る。例えば、増幅されるべきサンプル
が純粋である場合にはより少ないサイクル数ですむ。サ
ンプルが核酸の複雑な混合物であるならばその検出シグ
ナルを十分に増幅するためにはより多くのサイクルが必
要とされるであろう。
成物合成の加熱及び冷却工程は必要な回数繰返して究極
的用途に応じて所望量の特定の核酸配列を製造すること
ができる。唯一の制限は存在するプライマー、熱安定性
酵素及びヌクレオチドトリホスフェートの量である。好
ましくは、これらの工程は少なくとも一回繰返すのがよ
い。検出に使用するためには、サイクル数は例えば試料
の性質に応じて異る。例えば、増幅されるべきサンプル
が純粋である場合にはより少ないサイクル数ですむ。サ
ンプルが核酸の複雑な混合物であるならばその検出シグ
ナルを十分に増幅するためにはより多くのサイクルが必
要とされるであろう。
−ｉ的増幅及び検出のためには、好ましくはこの方法が
少なくとも２０回繰返される。
少なくとも２０回繰返される。
標識された配列特異的プローブが以下の如く用いられる
場合には、これらの工程は少なくとも５回繰返されるの
が好ましい。ヒトゲノムＤＮＡをその様なプローブと共
に用いる場合には、この方法は明確に検出可能なシグナ
ルが生成されるために、即ちハックグラウンドノイズが
検出を妨害しないように配列を十分に増幅するために１
５〜３０回繰返すのが好ましい。
場合には、これらの工程は少なくとも５回繰返されるの
が好ましい。ヒトゲノムＤＮＡをその様なプローブと共
に用いる場合には、この方法は明確に検出可能なシグナ
ルが生成されるために、即ちハックグラウンドノイズが
検出を妨害しないように配列を十分に増幅するために１
５〜３０回繰返すのが好ましい。
更に詳細に以下に説明される如く、生成される特定の核
酸配列の量は指数的に蓄積する。
酸配列の量は指数的に蓄積する。
酵素が不可逆的に変性或いは不活性化されていない限り
、最初の添加後追加のヌクレオチド、プライマー或いは
熱安定性酵素を追加する必要なく、不活性化される場合
には各変性工程の後酵素を補給する必要がある。しかし
ながら、各工程においてその様な物質を添加することは
反応に悪影響を及ぼさない。
、最初の添加後追加のヌクレオチド、プライマー或いは
熱安定性酵素を追加する必要なく、不活性化される場合
には各変性工程の後酵素を補給する必要がある。しかし
ながら、各工程においてその様な物質を添加することは
反応に悪影響を及ぼさない。
第一の核酸或いは核酸の混合物から一つより多くの特定
の核酸配列を生成した場合には、適当な数のＷっだオリ
ゴヌクレオチドプラ・イマーがｉｌｌ用される。例えば
、２種の異る特定の核酸配列が製造されるべき場合には
、４個のプライマーが利用される。これらのプライマー
の２個は特定の核酸配列の一方に対して特異的であり、
他の２個のプライマーは第二の特定の核酸配列に１．Ｙ
異的である。
の核酸配列を生成した場合には、適当な数のＷっだオリ
ゴヌクレオチドプラ・イマーがｉｌｌ用される。例えば
、２種の異る特定の核酸配列が製造されるべき場合には
、４個のプライマーが利用される。これらのプライマー
の２個は特定の核酸配列の一方に対して特異的であり、
他の２個のプライマーは第二の特定の核酸配列に１．Ｙ
異的である。
この様にして、２種の異る特定の配列の各々を本発明の
方法により指数的に製造することができる。
方法により指数的に製造することができる。
適当な長さの時間が経過して所望量の特定の核酸配列を
製造した後、任意の公知の方法で酵素を不活性化するこ
とにより或いは反応の成分を分離することにより反応を
停止してよい。
製造した後、任意の公知の方法で酵素を不活性化するこ
とにより或いは反応の成分を分離することにより反応を
停止してよい。
増幅工程を模式的に後記する。ここで、相補的な鎖〔Ｓ
°〕及び〔Ｓ−〕を含んで成る所望の配列（Ｓ）を含有
する２本鎖ＤＮＡが核酸として使用される。第１の及び
これに続く各反応サイクルの間、もとの鋳型上での各オ
リゴヌクレオチドプライマーの延長が、プライマーの１
つのみにより停止する無限長の新しい、、ＤＮＡ分子生
成物を生成する。今後“長生酸物”と称するこれらの生
成物は直線的に蓄積するであろう。すなわち、ある数の
サイクルの後に存在する量がサイクル数に比例するであ
ろう。
°〕及び〔Ｓ−〕を含んで成る所望の配列（Ｓ）を含有
する２本鎖ＤＮＡが核酸として使用される。第１の及び
これに続く各反応サイクルの間、もとの鋳型上での各オ
リゴヌクレオチドプライマーの延長が、プライマーの１
つのみにより停止する無限長の新しい、、ＤＮＡ分子生
成物を生成する。今後“長生酸物”と称するこれらの生
成物は直線的に蓄積するであろう。すなわち、ある数の
サイクルの後に存在する量がサイクル数に比例するであ
ろう。
こうして生成された長生酸物は、その後のサイクルの間
一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型と
して機能し、そして所望の配列〔Ｓ°〕又は〔Ｓ−〕の
分子を生成するであろう。
一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型と
して機能し、そして所望の配列〔Ｓ°〕又は〔Ｓ−〕の
分子を生成するであろう。
これらの分子もまた、一方又は他方のオリゴヌクレオチ
ドプライマーの鋳型として機能してさらに〔Ｓ°〕及び
（Ｓ−）を生成し、そしてそれ故に、サイクル数に対し
て指数的速度での（Ｓ）の蓄積をもたらずであろう鎖反
応が継続され得る。
ドプライマーの鋳型として機能してさらに〔Ｓ°〕及び
（Ｓ−）を生成し、そしてそれ故に、サイクル数に対し
て指数的速度での（Ｓ）の蓄積をもたらずであろう鎖反
応が継続され得る。
意図されるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによ
り生成される副産物は自己触媒的ではなく、そしてそれ
故に直線的速度で蓄積する。
以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによ
り生成される副産物は自己触媒的ではなく、そしてそれ
故に直線的速度で蓄積する。
以下余白
増幅されるべき特異的配列
Ｃ３）
を次の様に模式的に表すことができる。
［Ｓ”） ５
（Ｓ−〕３
へへへΔへへへへへへＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＣ３’ＴＴＴＴ１’ＴＴＴＴＴＶＹＹＹＹＹＹ
ＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ５’対応するオリゴヌ
クレオチドプライマーは次の通りであろう。
ＣＣＣＣＣ３’ＴＴＴＴ１’ＴＴＴＴＴＶＹＹＹＹＹＹ
ＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ５’対応するオリゴヌ
クレオチドプライマーは次の通りであろう。
プライマー１ ： ３’ ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
５’ブライマー２ ： ５′ へへへへへＡＡ
ＡＡＡ ３”従って、（Ｓ）を含有するＤＮＡ ： 、’＋ 、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ＾八八八
ＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸへへへＣＣＣＣＣＣＣＣＣ
Ｃｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、、、。
５’ブライマー２ ： ５′ へへへへへＡＡ
ＡＡＡ ３”従って、（Ｓ）を含有するＤＮＡ ： 、’＋ 、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ＾八八八
ＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸへへへＣＣＣＣＣＣＣＣＣ
Ｃｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、、、。
、 、 、 、 ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、 、 、
。
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、 、 、
。
が単鎖に分離され、そしてその単鎖がプライマーｌ及び
２とハイブリダイズし、４種類のデオキシリボヌクレオ
シドトリホスフェートの存在下、ＤＮＡポリメラーゼの
存在下で次の延長反応が触媒され得る。
２とハイブリダイズし、４種類のデオキシリボヌクレオ
シドトリホスフェートの存在下、ＤＮＡポリメラーゼの
存在下で次の延長反応が触媒され得る。
３° ５′
延 長 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
Ｇプライマーｌ、、 、、ＺＺ２ＺＺＺＺＺ２Ｚ２ＺＺ
ＺＺＺＡΔΔ八＾八＾ＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、
、 、。
Ｇプライマーｌ、、 、、ＺＺ２ＺＺＺＺＺ２Ｚ２ＺＺ
ＺＺＺＡΔΔ八＾八＾ＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、
、 、。
もとの鋳型類′
もとの鋳型類−
、、、、ＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺ２ＺＺＺブライマー２ Ａ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ八 延 長５＋
３＋ 生成した２つのデュプレックスの変性の後、次の生成物
が生ずる。
ＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺ２ＺＺＺブライマー２ Ａ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ八 延 長５＋
３＋ 生成した２つのデュプレックスの変性の後、次の生成物
が生ずる。
３５′
、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＶＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
新たに合成された長生酸物ｌ 以１・−六白 ５”
３′０．、、ｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＡＡＡＡ＾八ＡＡＡＡＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣへＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚ、、、 。
ＴＴＴＴＴＶＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
新たに合成された長生酸物ｌ 以１・−六白 ５”
３′０．、、ｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＡＡＡＡ＾八ＡＡＡＡＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣへＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚ、、、 。
もとの鋳型類。
３°
５゛、 、 、 、
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、 、 、 。
５゛、 、 、 、
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、 、 、 。
もとの鋳型類−
５”
３゛八八八ＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚ、、、。
３゛八八八ＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸ
ＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚ、、、。
新たに合成された長生酸物２
次のサイクルにおいて、これら４つの鎖をプライマー１
及び２とハイブリダイズせしめれば、重合用試薬は次の
反応を触媒するであろう。
及び２とハイブリダイズせしめれば、重合用試薬は次の
反応を触媒するであろう。
ブライマー２５°＾ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ここまで延長３’ 、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴＴＴＴＴ’ｒＴＹＹＹＹ
ＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ５’新たに合成さ
れた長生酸物 延 長 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
５°ブライマー１５’ 、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚ＾八ＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸへＸＸＸＸ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、
、、。
ここまで延長３’ 、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴＴＴＴＴ’ｒＴＹＹＹＹ
ＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ５’新たに合成さ
れた長生酸物 延 長 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
５°ブライマー１５’ 、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚ＾八ＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸへＸＸＸＸ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、
、、。
もとの鋳型類゛
ブライマー２５°八ＡＡＡ八八ＡＡＡ＾
延長３’ 、、、、ｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴ’「ＴＴ’ｒＴＴＴＹ
ＹＹＹＹ’／ＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚ、、、。
延長３’ 、、、、ｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴ’「ＴＴ’ｒＴＴＴＹ
ＹＹＹＹ’／ＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚ、、、。
もとの鋳型類−
５′
ここまで延長 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
Ｇ ５”プライマー１５’ ＡＡＡ＾＾ＡＡＡＡＡＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、 。
Ｇ ５”プライマー１５’ ＡＡＡ＾＾ＡＡＡＡＡＸＸ
ＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、 。
新たに合成された長生酸物２
以下全白
上記４種類のデュプレックスが分離されれば次の鎖が生
ずる。
ずる。
ＡＡＡＡＡＡＡＡ八ＡＸＸＸＸＸへＸＸＸＸＣＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＣ新たに合成された〔Ｓ゛〕 ３’ 、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚＴＴＴＴＴＴ’門ゴ’ｒＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧ第１サイクルで合成された長生酸物１ ３’ 、１．、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚ’ｒＴＴＴＴ１’ＴＴ’ｌ’ＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹ
ＹＧＧ［：ＧＧＧＧＧＧＧ新たに合成された長生酸物１ ５゜ ５’ 、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚＡＡＡＡＡ八ＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣ
ＣＣＣＣＣへＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、、、。
ＣＣＣＣＣ新たに合成された〔Ｓ゛〕 ３’ 、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚＴＴＴＴＴＴ’門ゴ’ｒＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧ第１サイクルで合成された長生酸物１ ３’ 、１．、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
ｚｚ’ｒＴＴＴＴ１’ＴＴ’ｌ’ＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹ
ＹＧＧ［：ＧＧＧＧＧＧＧ新たに合成された長生酸物１ ５゜ ５’ 、、、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
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ＣＣＣＣＣへＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、、、。
もとの鋳型類゛
３′
５’ ＡＡＡＡＡ＾＾八八ＡＸＸＸへへＸＸＸＸＸＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
、、 。
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ
、、 。
新たに合成された長生酸物２
３′
３’ 、、ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＴＴＴＴＴ
’ｒＴＴＴＴｖｖＹＹＹＹＹｖＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
Ｇｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、、。
’ｒＴＴＴＴｖｖＹＹＹＹＹｖＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
Ｇｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、、。
もとの鋳型類
５゛
３’ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧ新たに合成された〔Ｓ−〕 ５゜ ５’ ＡＡＡＡ八＾Δへ八八へへへＸＸＸＸＸＸＸＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、
、。
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧ新たに合成された〔Ｓ−〕 ５゜ ５’ ＡＡＡＡ八＾Δへ八八へへへＸＸＸＸＸＸＸＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ、
、。
第１サイクルで合成された長生酸物２
３゜
以下余白
一方のプライマーのオリゴヌクレオチド配列及び他方の
相補的配列で末端を終了する各類が製造されるべき特定
の核酸配列（Ｓ）であることが判る。
相補的配列で末端を終了する各類が製造されるべき特定
の核酸配列（Ｓ）であることが判る。
元の核酸の量はそれは複製されないので全過程において
一定に留まる。長生酸物の量はそれらが元の核酸のみか
ら製造されるので線形的に増大する。特定の配列の量は
指数的に増大する。この様に、特異的配列が支配的種と
なる。これは下表に例示され、それは各サイクルにおい
て１００％の効率を想定してｎナイクル後に理論的に存
在するこれらの種の相対的量を示すものである：以下余
白 一木鎖核酸が鋳型として用いられる場合には、１個のみ
の長生酸物が毎サイクル形成される。
一定に留まる。長生酸物の量はそれらが元の核酸のみか
ら製造されるので線形的に増大する。特定の配列の量は
指数的に増大する。この様に、特異的配列が支配的種と
なる。これは下表に例示され、それは各サイクルにおい
て１００％の効率を想定してｎナイクル後に理論的に存
在するこれらの種の相対的量を示すものである：以下余
白 一木鎖核酸が鋳型として用いられる場合には、１個のみ
の長生酸物が毎サイクル形成される。
ある与えられた配列内の配列はある与えられた数の増幅
後に増幅されて少なくともｌサイクルの増幅後に増幅さ
れる配列の内部配列（末端にあるものではない）に相補
的である一組のブライマーを添加することにより反応の
より大きな特異性を得ることができる。その様なプライ
マーは任意の段階において添加されてよく、より短い増
幅された断片を提供する。或いは又、より長い断片を非
−相補的末端を有するが、しかし、増幅において先に利
用されたプライマーと何等かの重複を有するプライマー
を用いることにより調製することができる。
後に増幅されて少なくともｌサイクルの増幅後に増幅さ
れる配列の内部配列（末端にあるものではない）に相補
的である一組のブライマーを添加することにより反応の
より大きな特異性を得ることができる。その様なプライ
マーは任意の段階において添加されてよく、より短い増
幅された断片を提供する。或いは又、より長い断片を非
−相補的末端を有するが、しかし、増幅において先に利
用されたプライマーと何等かの重複を有するプライマー
を用いることにより調製することができる。
この増幅方法を利用して適当な発現ベクター中に挿入す
るための特種の核酸配列がクローニングされる。このベ
クターを用いて組換えＤＮＡ技術の標準的方法により適
当な宿主生物体を形質転換してこの配列の遺伝子生成物
が製造される。その様なりローニングは平滑−末端連結
を用いたベクター中への直接連結成いはプライマー内に
含まれる部位において切断するための制限酵素の使用を
含むものである。
るための特種の核酸配列がクローニングされる。このベ
クターを用いて組換えＤＮＡ技術の標準的方法により適
当な宿主生物体を形質転換してこの配列の遺伝子生成物
が製造される。その様なりローニングは平滑−末端連結
を用いたベクター中への直接連結成いはプライマー内に
含まれる部位において切断するための制限酵素の使用を
含むものである。
加えて、本発明の増幅方法はｉｎνｉ ｔｒｏの突然変
異誘発に使用することができる。オリゴデオキシリボヌ
クレオチドプライマーは増幅されるＤＮＡ配列に正確に
相補的である必要はない。それらは熱安定性酵素により
よく延長されるように十分に配列にハイブリダイズする
能力があればよい。用いられたプライマーが元の鋳型に
正確に相補的でない増幅反応の生成物は鋳型以外のプラ
イマーの配列を含有し、それによりｉｎ ｖｉｔｒｏの
突然変異を導入する。更にサイクルを重ねるとこの突然
変異は更に不適当な対のプライミングが必要とされない
ので減少されない効率をもって複製される。この様に製
造された突然変異体は標卓的分子生物学的技術により適
当なベクター中に挿入され、このベクターに例えば変更
された蛋白質の製造の潜在能力などの変異特性を与える
可能性がある。
異誘発に使用することができる。オリゴデオキシリボヌ
クレオチドプライマーは増幅されるＤＮＡ配列に正確に
相補的である必要はない。それらは熱安定性酵素により
よく延長されるように十分に配列にハイブリダイズする
能力があればよい。用いられたプライマーが元の鋳型に
正確に相補的でない増幅反応の生成物は鋳型以外のプラ
イマーの配列を含有し、それによりｉｎ ｖｉｔｒｏの
突然変異を導入する。更にサイクルを重ねるとこの突然
変異は更に不適当な対のプライミングが必要とされない
ので減少されない効率をもって複製される。この様に製
造された突然変異体は標卓的分子生物学的技術により適
当なベクター中に挿入され、このベクターに例えば変更
された蛋白質の製造の潜在能力などの変異特性を与える
可能性がある。
上記変更ＤＮＡ配列を作成する方法を異るプライマーを
用いて変更されたＤＮＡに繰返して更に配列変化を誘発
することが可能である。この様にして、一連の突然変異
配列を徐々に製造して各々の新しい添加が最後のものか
らは少ししか異ならないが、しかし元のＤＮＡ源配列か
らは次第に大きく異るものとされる。この様にして極め
て深刻に不適当な組合せのプライマーが機能することが
できないために、単一工程では実現不能であった変更を
究極的に行うことが可能である。
用いて変更されたＤＮＡに繰返して更に配列変化を誘発
することが可能である。この様にして、一連の突然変異
配列を徐々に製造して各々の新しい添加が最後のものか
らは少ししか異ならないが、しかし元のＤＮＡ源配列か
らは次第に大きく異るものとされる。この様にして極め
て深刻に不適当な組合せのプライマーが機能することが
できないために、単一工程では実現不能であった変更を
究極的に行うことが可能である。
加えて、増幅されるべき鎖に相補的である配列を十分な
世のプライマーが含有するならば、プライマーはその配
列の一部として非−相補的配列を含有することができる
。例えば鋳型配列に相補的でないヌクレオチド配列（例
えば、プロモータ、リンカ−、コード配列など）をプラ
イマーの一方或いは両方の５′末端に結合し、そしてこ
れによって増幅工程の生成物に付加してもよい。延長プ
ライマーの添加後、十分なサイクルを実施してこの非相
補的ヌクレオチドインサートを含有する所望量の新しい
鋳型が達成される。これは単純な技術を用いて比較的短
時間（例、２時間以下）に大量の組合された断片の製造
を可能にする。
世のプライマーが含有するならば、プライマーはその配
列の一部として非−相補的配列を含有することができる
。例えば鋳型配列に相補的でないヌクレオチド配列（例
えば、プロモータ、リンカ−、コード配列など）をプラ
イマーの一方或いは両方の５′末端に結合し、そしてこ
れによって増幅工程の生成物に付加してもよい。延長プ
ライマーの添加後、十分なサイクルを実施してこの非相
補的ヌクレオチドインサートを含有する所望量の新しい
鋳型が達成される。これは単純な技術を用いて比較的短
時間（例、２時間以下）に大量の組合された断片の製造
を可能にする。
本発明の増幅方法は又感染症、遺伝的障害或いは癌など
に関連する特定の核酸配列例えば腫瘍形成遺伝子の検出
及び／又は特性化を可能にするために用いられてよい。
に関連する特定の核酸配列例えば腫瘍形成遺伝子の検出
及び／又は特性化を可能にするために用いられてよい。
分析に利用可能な核酸の量が例えば胎児の細胞から得ら
れるＤＮＡを用いる繊状赤血球貧血の胎児期の診断にお
けるように極めて少ない場合に増幅が有用である。この
増幅は、その様な分析が本来感度の低い非−放射性検出
技術を用いる少量の試料についてなされる場合、或いは
放射性技術が用いられても迅速な検出が望ましい場合に
は特に有用である。
れるＤＮＡを用いる繊状赤血球貧血の胎児期の診断にお
けるように極めて少ない場合に増幅が有用である。この
増幅は、その様な分析が本来感度の低い非−放射性検出
技術を用いる少量の試料についてなされる場合、或いは
放射性技術が用いられても迅速な検出が望ましい場合に
は特に有用である。
この検討の目的のためには、遺伝病としては、任意の生
物体からのゲノムＤＮＡにおける特異的欠失及び／又は
突然変異、例えば繊状赤血球貧血、α−サラセミア、β
−サラセミアなどが挙げられる。繊状赤血球貧血は例え
ばＥＰ特許公開１６４．０５４号明細書（１９８５年１
２月１１日公開）に記載されているようなオリゴマー制
限分析を介して或いは増幅法による適当なりＮＡ配列の
増幅に従ったＲＦＬＰ 一様分析を介して容易に検出す
ることができる。
物体からのゲノムＤＮＡにおける特異的欠失及び／又は
突然変異、例えば繊状赤血球貧血、α−サラセミア、β
−サラセミアなどが挙げられる。繊状赤血球貧血は例え
ばＥＰ特許公開１６４．０５４号明細書（１９８５年１
２月１１日公開）に記載されているようなオリゴマー制
限分析を介して或いは増幅法による適当なりＮＡ配列の
増幅に従ったＲＦＬＰ 一様分析を介して容易に検出す
ることができる。
α−サラセミアはある配列の不存在によりそしてβ−サ
ラセミアは病気を引起こす突然変異に密接に関連した多
型性制限部位の存在により検出することができる。
ラセミアは病気を引起こす突然変異に密接に関連した多
型性制限部位の存在により検出することができる。
これらの遺伝病の全ては適当な配列を増幅し、及びそれ
を放射性プローブを用いることなくＳｏｕ ｔｈｅｒｎ
プロットにより分析することにより検出される。その様
な方法において、例えば、ＤＮＡしてＳｏｕ ｔｈｅｒ
ｎブロッティング技術により分析する。
を放射性プローブを用いることなくＳｏｕ ｔｈｅｒｎ
プロットにより分析することにより検出される。その様
な方法において、例えば、ＤＮＡしてＳｏｕ ｔｈｅｒ
ｎブロッティング技術により分析する。
非−放射性プ１１−ブの使用は高レベルの増幅されたシ
グナルにより容易にされる。
グナルにより容易にされる。
もう一つの実施態様において、ＤＮＡの小サンプルを便
利な１ノベルまで増幅し、次いで容易に検出可能なヌク
Ｉ／オチド誘導体（例えば３２ｐ＝標識或いはビオヂン
ー標識ヌクレオチドトリホスフェート）が制限処理及び
電気泳動分離或いは任意の他の適当な方法により分析さ
れる最終ＤＮＡ生成吻り弓こ直接に導入されるように更
に延長反応のサイクルが行われる。
利な１ノベルまで増幅し、次いで容易に検出可能なヌク
Ｉ／オチド誘導体（例えば３２ｐ＝標識或いはビオヂン
ー標識ヌクレオチドトリホスフェート）が制限処理及び
電気泳動分離或いは任意の他の適当な方法により分析さ
れる最終ＤＮＡ生成吻り弓こ直接に導入されるように更
に延長反応のサイクルが行われる。
更に一つの実施態様においては、核酸は増幅前に特定の
制限エンドヌクレアーゼに曝されてよい。
制限エンドヌクレアーゼに曝されてよい。
その様な切断された配列は増幅することができないので
ＤＮＡサンプルの前の制限処理にも拘らず増幅断片が出
現することは増幅配列内のエンドヌクレアーゼに対する
部位の不存在を意味する。増幅配列の存在或いは不存在
は適当な方法により検出することができる。
ＤＮＡサンプルの前の制限処理にも拘らず増幅断片が出
現することは増幅配列内のエンドヌクレアーゼに対する
部位の不存在を意味する。増幅配列の存在或いは不存在
は適当な方法により検出することができる。
この増幅技術の一つの実用的応用即ちオリゴマー制限技
術［上記ＩＥＰ １６４，０５４号明細書、及びサイキ
等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ、３． ｐ
ｐｌｏ０８ １０１２（１９８５）に記載］による繊状
赤血球貧血の検出を容易にすることにおける応用は、上
記サイキ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ）の記事に詳細に記載され
ている。その５ｃｉｅｎｃｅの記事において、ある特種
の増幅方法がβ−グロビン遺伝子セグメントを用いて例
示されている。
術［上記ＩＥＰ １６４，０５４号明細書、及びサイキ
等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ、３． ｐ
ｐｌｏ０８ １０１２（１９８５）に記載］による繊状
赤血球貧血の検出を容易にすることにおける応用は、上
記サイキ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ）の記事に詳細に記載され
ている。その５ｃｉｅｎｃｅの記事において、ある特種
の増幅方法がβ−グロビン遺伝子セグメントを用いて例
示されている。
本発明における増幅方法は又配列−特異的オリゴヌクレ
オチドを用いて核酸配列（例えばゲノムＤＮＡにおける
）単一のヌクレオチド変化を直接検出するために用いら
れてもよい。簡単に述べると、この方法においては、増
幅されたサンプルを直接に一連の膜上にスポットし、各
膜を異る標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブとハイブリダイズせしめる。ハイブリダイゼーショ
ン後、サンプルを洗浄し、標識を検出する。この技術は
特にＤＮＡ多型性を検出するのに特に有用である。
オチドを用いて核酸配列（例えばゲノムＤＮＡにおける
）単一のヌクレオチド変化を直接検出するために用いら
れてもよい。簡単に述べると、この方法においては、増
幅されたサンプルを直接に一連の膜上にスポットし、各
膜を異る標識された配列特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブとハイブリダイズせしめる。ハイブリダイゼーショ
ン後、サンプルを洗浄し、標識を検出する。この技術は
特にＤＮＡ多型性を検出するのに特に有用である。
各種感染病は臨床サンプルにおける原因微生物に特徴的
な特定のＤＮＡ配列の存在により診断することができる
。これらにはサルモネラ（Ｓａｌｍｏ−ｎｅｌｌａ ）
、クラミジア（い士１回Ｉ−）、ネイセリア（Ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａ ）などの細菌類、肝炎ウィルスなどのウ
ィルス類及びマラリアの原因であるプラスモジウＬ （
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）などの寄生虫などが挙げられる
。米国特許再審査証明書８１４，３５８．５３５号（１
９８６年５月１３日ファルコウ等（Ｆａｌｋｏｗ ｅｔ
ａｌ、）に発行）は感染病の診断のための特異的ＤＮ
Ａハイブリダイゼーションプローブの使用を記載してい
る。感染した患者からの臨床サンプルには比較的少数の
病原生物体が存在するにすぎず、又これらから抽出され
たＤＮＡがサンプル中の全ＤＮＡの極めて僅かの部分を
構成するにすぎない場合がある。ＤＮＡサンプルのハイ
ブリダイゼーションによる固定化及び検出に先立つ疑い
をもたれた配列の特定の増幅は伝統的操作の感度及び特
異性を大きく改良することが可能である。
な特定のＤＮＡ配列の存在により診断することができる
。これらにはサルモネラ（Ｓａｌｍｏ−ｎｅｌｌａ ）
、クラミジア（い士１回Ｉ−）、ネイセリア（Ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａ ）などの細菌類、肝炎ウィルスなどのウ
ィルス類及びマラリアの原因であるプラスモジウＬ （
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）などの寄生虫などが挙げられる
。米国特許再審査証明書８１４，３５８．５３５号（１
９８６年５月１３日ファルコウ等（Ｆａｌｋｏｗ ｅｔ
ａｌ、）に発行）は感染病の診断のための特異的ＤＮ
Ａハイブリダイゼーションプローブの使用を記載してい
る。感染した患者からの臨床サンプルには比較的少数の
病原生物体が存在するにすぎず、又これらから抽出され
たＤＮＡがサンプル中の全ＤＮＡの極めて僅かの部分を
構成するにすぎない場合がある。ＤＮＡサンプルのハイ
ブリダイゼーションによる固定化及び検出に先立つ疑い
をもたれた配列の特定の増幅は伝統的操作の感度及び特
異性を大きく改良することが可能である。
感染症の診断のためのＤＮＡプローブの日常的な臨床的
使用は非−放射性標識プローブがウォード（Ｗａｒｄ）
のＥＰ ６３，８７９号明細書に記載されたように用い
ることができれば相当に簡素化されるであろう。この操
作において、ビオチン−含’［ＤＮＡがアビジン或いは
ビオチン−特異的抗体に結合した発色性酵素により検出
されている。このタイプの検出は便利であるが、しかし
比較的感度が悪い。
使用は非−放射性標識プローブがウォード（Ｗａｒｄ）
のＥＰ ６３，８７９号明細書に記載されたように用い
ることができれば相当に簡素化されるであろう。この操
作において、ビオチン−含’［ＤＮＡがアビジン或いは
ビオチン−特異的抗体に結合した発色性酵素により検出
されている。このタイプの検出は便利であるが、しかし
比較的感度が悪い。
本発明による特定のＤＮＡ増幅と安定に標識されたプロ
ーブの使用の組合わせはファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）等
及びウォード（Ｗａｒｄ）の操作を日常的な臨床的設定
において有用とするために必要とされる便利さ及び感度
を与える可能性がある。
ーブの使用の組合わせはファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）等
及びウォード（Ｗａｒｄ）の操作を日常的な臨床的設定
において有用とするために必要とされる便利さ及び感度
を与える可能性がある。
この増幅技術の特別の用途はＡＩＤＳウィルスを検出或
いは監視するためのものである。簡単に述べると、この
増幅及び検出方法をＡＩＤＳウィルス内の核酸中に実質
的に保存され、そしてＡＩＤＳウィルス内の核酸に特異
的である核酸配列をそれぞれ増幅及び検出するように設
計されたプライマー及びプローブと共に用いられる。即
ち、被検出配列は重合を好ましくは室温において酵素及
びヌクレオチドトリホスフェートの存在下において開始
させるためにＡＩＤＳウィルス内の核酸に対して十分に
相補的でなければならない。
いは監視するためのものである。簡単に述べると、この
増幅及び検出方法をＡＩＤＳウィルス内の核酸中に実質
的に保存され、そしてＡＩＤＳウィルス内の核酸に特異
的である核酸配列をそれぞれ増幅及び検出するように設
計されたプライマー及びプローブと共に用いられる。即
ち、被検出配列は重合を好ましくは室温において酵素及
びヌクレオチドトリホスフェートの存在下において開始
させるためにＡＩＤＳウィルス内の核酸に対して十分に
相補的でなければならない。
この増幅方法を利用して又エチジウムブロマイドなどの
単純な非−特異的ＤＮＡ染色による検出がＤＮＡを診断
するために直接に用いることが出来るように単一コピー
のヒト遺伝子からのＤＮＡを十分な型製造することが出
来る。
単純な非−特異的ＤＮＡ染色による検出がＤＮＡを診断
するために直接に用いることが出来るように単一コピー
のヒト遺伝子からのＤＮＡを十分な型製造することが出
来る。
感染症及び生物体のゲノムにおける病理学的異常に加え
て、この増幅方法を用いて如何なる病理学的状態をも伴
なわないＤＮＡ多型性を検出することもできる。
て、この増幅方法を用いて如何なる病理学的状態をも伴
なわないＤＮＡ多型性を検出することもできる。
要約すると、この増幅方法は引続き更にプライマー延長
反応の鋳型として作用することのできるプライマー延長
生成物が生成される連鎖反応及び熱安定性酵素を用いて
１以上の特定の核酸配列を増幅するだめの方法を提供す
ることが見られた。
反応の鋳型として作用することのできるプライマー延長
生成物が生成される連鎖反応及び熱安定性酵素を用いて
１以上の特定の核酸配列を増幅するだめの方法を提供す
ることが見られた。
この方法は極めて生計でのみ当初存在する核酸配列の検
出において特に有用である。
出において特に有用である。
以下の実施例は例示を目的としてのみ提供されるもので
あり、本発明の特許請求の範囲を制限するものでは決っ
してない。これらのサンプルにおいて、全てのパーセン
トは固体に対しては重量基ｒ４？、であり、液体に対し
ては容量基準であり、全ての温度は１■氏度で与えられ
ている。
あり、本発明の特許請求の範囲を制限するものでは決っ
してない。これらのサンプルにおいて、全てのパーセン
トは固体に対しては重量基ｒ４？、であり、液体に対し
ては容量基準であり、全ての温度は１■氏度で与えられ
ている。
天上１土
１、プライマーの合成
次の二つのオリゴヌクレオチドプライマーを下記方法に
より製造した： ５′−へＣＡＣへへＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−３
’ （ＰＣＯ３）５゛−ＣへへＣＴＴＣＡＴＣＣＡ
ＣＧＴＴＣＡＣＣ−３′ （ＰＣＯ４）これらの共に
２０−ｍａｒのプライマーはゲノムＤＮＡの反対の鎖と
１１０塩基対の距離で分離されたそれらの５′末端でア
ニールする。
より製造した： ５′−へＣＡＣへへＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−３
’ （ＰＣＯ３）５゛−ＣへへＣＴＴＣＡＴＣＣＡ
ＣＧＴＴＣＡＣＣ−３′ （ＰＣＯ４）これらの共に
２０−ｍａｒのプライマーはゲノムＤＮＡの反対の鎖と
１１０塩基対の距離で分離されたそれらの５′末端でア
ニールする。
Δ、自動化合成操作； ビューケージ及びカルザース（
ＢｅａｕｃａｌＨｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）
（ＴｅｔｒａｈｃｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ （１９８１
）２２ ： １８５９−１８６２）に従って合成された
ジエチルホスホルアミダイトを逐次ヌクレオシドで誘導
体化された制御された多孔ガラス支持体にＢｉｏｓｅａ
ｒｃｈ ＳＡＭ−１を用い“ζ縮合せしめた。この操作
はジクロロメタン中トリクロロ酢酸を用いる脱トリチル
化、活性化プロトン供与体としてベンゾトリアゾールを
用いる縮合及びテトラヒドロフラン及びピリジン中無水
酢酸及びジメチルアミノピリジンによるキャッピングを
含むものであった。サイクル時間は約３０分であった。
ＢｅａｕｃａｌＨｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）
（ＴｅｔｒａｈｃｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ （１９８１
）２２ ： １８５９−１８６２）に従って合成された
ジエチルホスホルアミダイトを逐次ヌクレオシドで誘導
体化された制御された多孔ガラス支持体にＢｉｏｓｅａ
ｒｃｈ ＳＡＭ−１を用い“ζ縮合せしめた。この操作
はジクロロメタン中トリクロロ酢酸を用いる脱トリチル
化、活性化プロトン供与体としてベンゾトリアゾールを
用いる縮合及びテトラヒドロフラン及びピリジン中無水
酢酸及びジメチルアミノピリジンによるキャッピングを
含むものであった。サイクル時間は約３０分であった。
各工程における収率は木質的に定量的であり、脱トリチ
ル化中に放出されたジメトキシトリチルアルコールの収
集及び分光学的検査により決定した。
ル化中に放出されたジメトキシトリチルアルコールの収
集及び分光学的検査により決定した。
Ｂ、オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱係８Ｗ及び精
製操作： 固体支持体をカラムから取り出し、閉じられ
た管内で１ｒｒｌの濃水酸化アンモニウムに室温におい
て４時間曝した。次いでこの支持体を濾過により除去し
、部分的に保護されたオリゴヌクレオチドを５５℃に５
時間置いた。アンモニアを除去し、残渣を分収用ポリア
クリルアミドゲルにかけた。電気泳動を３０ポルト／Ｃ
ｍで９０分間行い、その後生成物を含有するバンドを蛍
光板のＵＶシャドーイングにより同定した。このバンド
を切出し、１ｍｇの蒸留水で４℃において一晩溶出した
。この溶液をＡｌｔｅｃｈ ＲＰ１８カラムにかけ、ｐ
Ｈ６，０において１％酢酸アンモニウム緩衝液中アセト
ニトリルの７−１３％勾配で溶出させた。溶出は２６０
ｎｍにおけるＵＶ吸光度により追跡し、そして適当な両
分を集め、固体容量内のＵＶ吸光度により定量し、そし
て真空遠心分離器内で室温で蒸発乾固させた。
製操作： 固体支持体をカラムから取り出し、閉じられ
た管内で１ｒｒｌの濃水酸化アンモニウムに室温におい
て４時間曝した。次いでこの支持体を濾過により除去し
、部分的に保護されたオリゴヌクレオチドを５５℃に５
時間置いた。アンモニアを除去し、残渣を分収用ポリア
クリルアミドゲルにかけた。電気泳動を３０ポルト／Ｃ
ｍで９０分間行い、その後生成物を含有するバンドを蛍
光板のＵＶシャドーイングにより同定した。このバンド
を切出し、１ｍｇの蒸留水で４℃において一晩溶出した
。この溶液をＡｌｔｅｃｈ ＲＰ１８カラムにかけ、ｐ
Ｈ６，０において１％酢酸アンモニウム緩衝液中アセト
ニトリルの７−１３％勾配で溶出させた。溶出は２６０
ｎｍにおけるＵＶ吸光度により追跡し、そして適当な両
分を集め、固体容量内のＵＶ吸光度により定量し、そし
て真空遠心分離器内で室温で蒸発乾固させた。
Ｃ，オリゴデオキシリボヌクレオチドの特徴付け： 精
製オリゴヌクレオチドの試験アリコートをポリヌクレオ
チドキナーゼ及びγ−３２ｐ−ΔＴＰを用いてｉｚｐ標
識した。この標識化合物を５０ボルト／ｃＩ１１におけ
る４５分間の電気泳動後に１４〜２０％のポリアクリル
アミドゲルのオートラジオグラフィにより検査した。こ
の操作は分子量を立証するものである。塩基組成は毒液
ジエステラ−ゼ及び細菌アルカリホスファターゼを用い
るオリゴデオキシリボヌクレオチドのヌクレオシドへの
消化及び引続く逆用ＩＩ Ｐ Ｌ Ｃカラム及び１０％
アセトニトリル、１％酢酢酸アンモニウム可動金用いる
得られたヌクレオシドの分離及び定量により決定した。
製オリゴヌクレオチドの試験アリコートをポリヌクレオ
チドキナーゼ及びγ−３２ｐ−ΔＴＰを用いてｉｚｐ標
識した。この標識化合物を５０ボルト／ｃＩ１１におけ
る４５分間の電気泳動後に１４〜２０％のポリアクリル
アミドゲルのオートラジオグラフィにより検査した。こ
の操作は分子量を立証するものである。塩基組成は毒液
ジエステラ−ゼ及び細菌アルカリホスファターゼを用い
るオリゴデオキシリボヌクレオチドのヌクレオシドへの
消化及び引続く逆用ＩＩ Ｐ Ｌ Ｃカラム及び１０％
アセトニトリル、１％酢酢酸アンモニウム可動金用いる
得られたヌクレオシドの分離及び定量により決定した。
■、細胞系からのヒトゲノムＤＮＡの単離高分子量ゲノ
ムＤＮＡを本質的にマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）
２８０−２８１３の方法を用いてｌｌｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ ＭｕＬａｎｔ Ｃｅ１ｌ Ｄｅｐ−ｏｓＨｏ
ｒｙ にュージャージ州、カムデン）からＧＭ２２１
９Ｃとして取得可能な正常なβ−グロビンについてホモ
接合性のＴ細胞系Ｍｏ１Ｌ４から単離した。
ムＤＮＡを本質的にマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）
２８０−２８１３の方法を用いてｌｌｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ ＭｕＬａｎｔ Ｃｅ１ｌ Ｄｅｐ−ｏｓＨｏ
ｒｙ にュージャージ州、カムデン）からＧＭ２２１
９Ｃとして取得可能な正常なβ−グロビンについてホモ
接合性のＴ細胞系Ｍｏ１Ｌ４から単離した。
■、ササ−ス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｂ
肛ａｔｉｃｕｓ）からのポリメラーゼの精製アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
） （１２３０１パークローンドライブ、ロックビル、
メリーランド州）から＾ＴＣＣＮｏ、２５．１０４とし
て制限なしに取得可能なサーマス・アクアティカス株Ｙ
ＴＩを次の培地中においてフラスコ内で増り１なせしめ
た。
肛ａｔｉｃｕｓ）からのポリメラーゼの精製アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
） （１２３０１パークローンドライブ、ロックビル、
メリーランド州）から＾ＴＣＣＮｏ、２５．１０４とし
て制限なしに取得可能なサーマス・アクアティカス株Ｙ
ＴＩを次の培地中においてフラスコ内で増り１なせしめ
た。
クエン酸ナトリウム １ｍＭリン酸カル
シウム、ρ１１７．９ ５ｍＭ塩化アンモニウ
ム １０ｍＭ硫酸マグネシウム
０．２ｗＭ塩化カルシウム ０．
１ｍＭ塩化ナトリウム Ｉｇ／ｎ酵母エ
キス １ｇ／２トリプトン
Ｉｇ／ｊ！グルコース ２
ｇ／ｌ硫酸第一鉄 ０．０１ｍＭ（
ｐＨは殺菌前に８．０に調整した。）１０ｅファーメン
タ−に、上記培地中で７０℃で一晩培養した種フラスコ
から接種した。種フラスコからの総１６００ｍｚを用い
て１（ｌの同一培地に接種した。ｐＨを水酸化アンモニ
ウムにより８．０に、溶存酸素量を４０％に、温度を７
０ ’Ｃに、そして撹拌速度を４００ｒｐｎ＋に調整し
た。
シウム、ρ１１７．９ ５ｍＭ塩化アンモニウ
ム １０ｍＭ硫酸マグネシウム
０．２ｗＭ塩化カルシウム ０．
１ｍＭ塩化ナトリウム Ｉｇ／ｎ酵母エ
キス １ｇ／２トリプトン
Ｉｇ／ｊ！グルコース ２
ｇ／ｌ硫酸第一鉄 ０．０１ｍＭ（
ｐＨは殺菌前に８．０に調整した。）１０ｅファーメン
タ−に、上記培地中で７０℃で一晩培養した種フラスコ
から接種した。種フラスコからの総１６００ｍｚを用い
て１（ｌの同一培地に接種した。ｐＨを水酸化アンモニ
ウムにより８．０に、溶存酸素量を４０％に、温度を７
０ ’Ｃに、そして撹拌速度を４００ｒｐｎ＋に調整し
た。
細胞の増殖後、上記力レディン（Ｋａｌｅｄｉｎ）等の
方法（僅かに修正）の最初の５段階を用い、且つ第６段
階のために異った方法を用いてそれらを精製した。６エ
程の全てを４℃において行った。カラム上の分別速度は
０．５力ラム容／時間であり溶出時の勾配の容量は１０
カラム容であった。
方法（僅かに修正）の最初の５段階を用い、且つ第６段
階のために異った方法を用いてそれらを精製した。６エ
程の全てを４℃において行った。カラム上の分別速度は
０．５力ラム容／時間であり溶出時の勾配の容量は１０
カラム容であった。
簡単に説明すると、上記Ｔ、アクアティカス細胞の培養
液を９時間の培養後、後期対数期において１．４ｇ乾燥
重量／ｌの細胞密度において遠心分離により採集した。
液を９時間の培養後、後期対数期において１．４ｇ乾燥
重量／ｌの細胞密度において遠心分離により採集した。
２０ｇの細胞を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７，５
，０，１ｍＭ ＥＤＴ＾よりなる８０ｍ１の緩衝液中に
再懸濁した。細胞を溶解し、そして溶解物をローター内
において４℃で３５．０００ｒｐｎ＋にて２時間遠心分
離した。上澄液を集め（画分Ａ）、４５〜７５％飽和度
の硫酸アンモニウムの間で沈澱する蛋白質画分を集め、
０．２Ｍリン酸カリウム（ａｌ１６．５） 、１０ｓ＋
Ｍ２−メルカプトエタノール及び５％グリセリンよりな
る緩衝液中に溶解し、最終的に同一緩衝液に対して透析
して画分Ｂを得た。
，０，１ｍＭ ＥＤＴ＾よりなる８０ｍ１の緩衝液中に
再懸濁した。細胞を溶解し、そして溶解物をローター内
において４℃で３５．０００ｒｐｎ＋にて２時間遠心分
離した。上澄液を集め（画分Ａ）、４５〜７５％飽和度
の硫酸アンモニウムの間で沈澱する蛋白質画分を集め、
０．２Ｍリン酸カリウム（ａｌ１６．５） 、１０ｓ＋
Ｍ２−メルカプトエタノール及び５％グリセリンよりな
る緩衝液中に溶解し、最終的に同一緩衝液に対して透析
して画分Ｂを得た。
百分Ｂを上記緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ−セルロー
スの２．２Ｘ３０ＣＩＩｌカラムにかけた。カラムを次
いで同一緩衝液で洗浄し、蛋白質を含有する両分（２８
０ｎｍにおける吸光度により測定）を集めた。
スの２．２Ｘ３０ＣＩＩｌカラムにかけた。カラムを次
いで同一緩衝液で洗浄し、蛋白質を含有する両分（２８
０ｎｍにおける吸光度により測定）を集めた。
−緒にした蛋白質画分を０．０１Ｍリン酸カリウム（ａ
ｌ１７．５） 、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール及
び５％グリセリンを含有する第二の緩衝液に対して透析
して百分Ｃを得た。
ｌ１７．５） 、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール及
び５％グリセリンを含有する第二の緩衝液に対して透析
して百分Ｃを得た。
百分Ｃを第二の緩衝液で平衡化されたヒドロキシアパタ
イトの２．６Ｘ２１（Ｊカラムにかけた。カラムを次い
で洗浄し、１０ｍＭメルカプトエタノール及び５％グリ
セリンを含む０．０１−０．５ Ｍリン酸カリウム緩衝
液の線形勾配で酸素を溶出した。
イトの２．６Ｘ２１（Ｊカラムにかけた。カラムを次い
で洗浄し、１０ｍＭメルカプトエタノール及び５％グリ
セリンを含む０．０１−０．５ Ｍリン酸カリウム緩衝
液の線形勾配で酸素を溶出した。
ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む両分（９０〜１８０＋＋
Ｍリン酸カリウム）を−緒にし、＾＋ｗｉｃｏｎ攪拌セ
ル及びＹ旧０膜を用いて４倍にｆｌ縮し、第二の緩衝液
に対して透析して画分りを得た。
Ｍリン酸カリウム）を−緒にし、＾＋ｗｉｃｏｎ攪拌セ
ル及びＹ旧０膜を用いて４倍にｆｌ縮し、第二の緩衝液
に対して透析して画分りを得た。
画分りを第二の緩衝液で平衡化されたＤＥＡＲ−セルロ
ースの１．６ Ｘ ２８ ｃｖａカラムにかけた。カラ
ムを洗浄し、ポリメラーゼを第二緩衝液中のｏ、ｏｉ−
０，５Ｍリン酸カリウムの線形勾配で溶出した。画分を
過剰のＯＮ八へリメラーゼと共にインキュベーションし
た後（エンドヌクレアーゼについて）、及びＤＮＡを数
個の断片に切断する制限酵素により処理した後（エキソ
ヌクレアーゼについて）、ファージスＤＮＡ或いはスー
パコイル血Ｗｉ Ｄ Ｎ Ａの分子量変化を電気泳動的
に検出することにより汚染エンドヌクレアーゼ及び液相
ヌクレアーゼのアッセイを行った。最少のヌクレアーゼ
汚染を有するＤＮＡポリメラーゼ画分のみ（６５−９５
ｍＭリン酸カリウム）をプールした。このプールに殺菌
したゼラチンを２５０ μｇ／ｍｌで添加し、透析を第
二の緩衝液に対して行い、画分Ｅを得た。
ースの１．６ Ｘ ２８ ｃｖａカラムにかけた。カラ
ムを洗浄し、ポリメラーゼを第二緩衝液中のｏ、ｏｉ−
０，５Ｍリン酸カリウムの線形勾配で溶出した。画分を
過剰のＯＮ八へリメラーゼと共にインキュベーションし
た後（エンドヌクレアーゼについて）、及びＤＮＡを数
個の断片に切断する制限酵素により処理した後（エキソ
ヌクレアーゼについて）、ファージスＤＮＡ或いはスー
パコイル血Ｗｉ Ｄ Ｎ Ａの分子量変化を電気泳動的
に検出することにより汚染エンドヌクレアーゼ及び液相
ヌクレアーゼのアッセイを行った。最少のヌクレアーゼ
汚染を有するＤＮＡポリメラーゼ画分のみ（６５−９５
ｍＭリン酸カリウム）をプールした。このプールに殺菌
したゼラチンを２５０ μｇ／ｍｌで添加し、透析を第
二の緩衝液に対して行い、画分Ｅを得た。
画分Ｅを９ｍＪのホスホセルロースカラムにかけ、１０
０ｍ１の勾配（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐｌ＋７
．５中０．０１−０．４ ＭＫＣＮ （７）勾配）で溶
出Ｌ ｆ、＝。
０ｍ１の勾配（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐｌ＋７
．５中０．０１−０．４ ＭＫＣＮ （７）勾配）で溶
出Ｌ ｆ、＝。
これらの両分について上記の如く汚染エンド／工；ドソ
ヌクレアーゼ並びにポリメラーゼ活性（カレディン等の
方法により）のアッセイを行い次いでプールした。プー
ルした両分を第二の緩衝液に対して透析し、次いで５０
％グリセリン及び第二の緩（ｊｉ液に対する透析により
濃縮した。
ヌクレアーゼ並びにポリメラーゼ活性（カレディン等の
方法により）のアッセイを行い次いでプールした。プー
ルした両分を第二の緩衝液に対して透析し、次いで５０
％グリセリン及び第二の緩（ｊｉ液に対する透析により
濃縮した。
このポリメラーゼの分子量をＳＯ３ＰＡＧＥにより求め
た。マーカー蛋白質（低分子量標準）はホスホリラーゼ
（９２，５００）、ウシ血清アルブミン（６６、２００
）、オハルブミン（４５，０００）、炭素アンヒドラー
ゼ（３１，０００）、大豆トリプシン阻害因子（２１，
５００）及びリゾチーム（１４，４００）であった。
た。マーカー蛋白質（低分子量標準）はホスホリラーゼ
（９２，５００）、ウシ血清アルブミン（６６、２００
）、オハルブミン（４５，０００）、炭素アンヒドラー
ゼ（３１，０００）、大豆トリプシン阻害因子（２１，
５００）及びリゾチーム（１４，４００）であった。
予備的データはこのポリメラーゼは文献に報告される６
２，０００〜６３，０００ダルトン（例えばカレディン
等による）ではなく、約８６，０００〜９０ 、０００
ダルトンの分子量を有することを示唆する。
２，０００〜６３，０００ダルトン（例えばカレディン
等による）ではなく、約８６，０００〜９０ 、０００
ダルトンの分子量を有することを示唆する。
■、増幅反応
１、ｃｚｇの上記ゲノムＤＮＡを２５ｄ Ｔｒｉｓ −
！ＩＣ１（ｐＨ８，０） 、５０ ｍＭＫｃｌ、１０ｎ
＋Ｍ ＦＩｇＣｌｚ 、５ｍＭジチオスレイトール、２
００μｇ／ｍｌゼラチン、１μＭのプライマーＰＣＯ３
、ｌμＭのプライマーｒ’ｃＯ４、１，５＋Ｍ ｄＡ
ＴＰ 、 １．５ｍＭ ｄＣＴＰ 、 １．
５ｍＭ ｄＧＴＰ及び１．５ ｍＭ ＴＴＰを含有す
る当初１００μ２の水性反応液中に稀釈した。このサン
プルを９８℃で１０分間加熱して、ゲノムＤＮＡを変性
し、次いで室温に冷却した。サーマス・アクアティカス
からの４μｅのポリメラーゼを反応液に添加し、１００
μｌの鉱油キャップを重層した。サンプルを次いで液体
取扱い及び加熱器具のアルミニウム加熱ブロック内に入
れた。
！ＩＣ１（ｐＨ８，０） 、５０ ｍＭＫｃｌ、１０ｎ
＋Ｍ ＦＩｇＣｌｚ 、５ｍＭジチオスレイトール、２
００μｇ／ｍｌゼラチン、１μＭのプライマーＰＣＯ３
、ｌμＭのプライマーｒ’ｃＯ４、１，５＋Ｍ ｄＡ
ＴＰ 、 １．５ｍＭ ｄＣＴＰ 、 １．
５ｍＭ ｄＧＴＰ及び１．５ ｍＭ ＴＴＰを含有す
る当初１００μ２の水性反応液中に稀釈した。このサン
プルを９８℃で１０分間加熱して、ゲノムＤＮＡを変性
し、次いで室温に冷却した。サーマス・アクアティカス
からの４μｅのポリメラーゼを反応液に添加し、１００
μｌの鉱油キャップを重層した。サンプルを次いで液体
取扱い及び加熱器具のアルミニウム加熱ブロック内に入
れた。
このＤＮＡＮノナンにつき、次のプログラムサイクルを
繰返して機械内で２０サイクルの増幅を行った： ■）加熱ブロック内における２、５分に亘る３７℃から
９８℃への加熱、及び ２）プライマー及びＤＮＡをアニールさせるための３分
間に亘る９８℃から３７℃への冷却。
繰返して機械内で２０サイクルの増幅を行った： ■）加熱ブロック内における２、５分に亘る３７℃から
９８℃への加熱、及び ２）プライマー及びＤＮＡをアニールさせるための３分
間に亘る９８℃から３７℃への冷却。
最終サイクル後、サンプルを５５℃で更に１０分間イン
キュベートして最終延長反応を完結させた。
キュベートして最終延長反応を完結させた。
■、オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブの合成及
びリン酸化 下記配列のＲ５２４と称される標識されたＤＮＡプロー
ブを調整した： 以下余白 ５゛−“ ＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡ
ＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧ−３’
（ＲＳ２４）（ばに＊は標識を示す）。このプローブは
４０個の塩基長さであり、遺伝子の４番目〜１７番目の
コドンに亘りそして正常β−グロビン対立遺伝子（βＡ
）に相補的である。
びリン酸化 下記配列のＲ５２４と称される標識されたＤＮＡプロー
ブを調整した： 以下余白 ５゛−“ ＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡ
ＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧ−３’
（ＲＳ２４）（ばに＊は標識を示す）。このプローブは
４０個の塩基長さであり、遺伝子の４番目〜１７番目の
コドンに亘りそして正常β−グロビン対立遺伝子（βＡ
）に相補的である。
プライマー及びプローブの概略図を以下に示ず；β−グ
ロビン Ｔひ１ １Ω「 −π面 このプローブは実施例１の分節ｌで説明した操作に従っ
て合成した。このプローブはその２０ｐｍｏ ｌを７０
ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１７，６） 、１０ｍＭ ＭｇＣ
１ｚ、１．５ｍＭスバーミン及び１０ｏ＋Ｍジチオスレ
イトールを含有する４０μｌの反応液中３７℃において
６０分間４ノ１位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び
約４０ ｐｍｏ６のｒ−” ｐ−ＡＴＰ （約７０００
Ｃｉ／ｍｍｏｆｆｃ）と接触させることにより標識した
。
ロビン Ｔひ１ １Ω「 −π面 このプローブは実施例１の分節ｌで説明した操作に従っ
て合成した。このプローブはその２０ｐｍｏ ｌを７０
ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１７，６） 、１０ｍＭ ＭｇＣ
１ｚ、１．５ｍＭスバーミン及び１０ｏ＋Ｍジチオスレ
イトールを含有する４０μｌの反応液中３７℃において
６０分間４ノ１位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び
約４０ ｐｍｏ６のｒ−” ｐ−ＡＴＰ （約７０００
Ｃｉ／ｍｍｏｆｆｃ）と接触させることにより標識した
。
全容量を次いで２５ｍＭ ＥＤＴ八で１００μｌに調整
し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ） 緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ 、０．１ｍＭ１ｉＤＴＡ、ａｌｌ ８．０
）で平衡化された１ｍｆｆのスピン透析カラム上でマニ
アティス等［ＭａｎｉａＬｉｓ ｅＬ ａｌ。
し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ） 緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ 、０．１ｍＭ１ｉＤＴＡ、ａｌｌ ８．０
）で平衡化された１ｍｆｆのスピン透析カラム上でマニ
アティス等［ＭａｎｉａＬｉｓ ｅＬ ａｌ。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２） ４
６６−４６７ ］の方法に従って積装した。反応生成物
のＴＣΔ沈澱は＋１５２４について比活性は４．３μＣ
ｉ／ ｐｍｏｌｅであり、最終濃度は０．１１８ｐｍｏ
ｌ ｅ ／ メｔ ｌであることを示した。
６６−４６７ ］の方法に従って積装した。反応生成物
のＴＣΔ沈澱は＋１５２４について比活性は４．３μＣ
ｉ／ ｐｍｏｌｅであり、最終濃度は０．１１８ｐｍｏ
ｌ ｅ ／ メｔ ｌであることを示した。
■、ドットブ１コツトハイブリダイゼーション分節ｌか
らの増幅サンプル４μｌ及び７０ 、７５ 。
らの増幅サンプル４μｌ及び７０ 、７５ 。
８０ 、８５ 、９０ 、９５、及びｉｏｏ％の増幅効
率を表わすように計算された適当な稀釈率のβ−グロビ
ンプラスミドＤＮＡ５．６ｐＨを２００μｍの０．４
Ｎ ＮａＯＨ１２５ｍＭ ＵＤＴＡで稀釈し、リード及
びマン（Ｒｅｅｄａｎｄ Ｍａｎｎ） ［Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １３＋７２０２
−７２２１ （１９８５）］に開示されるように、先ず
フィルターを水で濡らし、フィルターを所定位置に保持
するドツトプロット作成用装置内にフィルターを入れ、
サンプルを適用しそして各ウェルを０，１ｍｌの２０
Ｘ５ＳＰＥ （３，６Ｍ ＮａＣ１、２００ｍＭ Ｎａ
１ｌｚＰＯ＊、２０ｍＭ ＥＤＴ＾）で濯ぐことにより
ナイロンフィルター上にスポットした。次いでフィルタ
ーを取出し、２０ Ｘ５ＳＰＥ中で濯ぎ真空オープン中
において８０℃で３０分間焼付けた。
率を表わすように計算された適当な稀釈率のβ−グロビ
ンプラスミドＤＮＡ５．６ｐＨを２００μｍの０．４
Ｎ ＮａＯＨ１２５ｍＭ ＵＤＴＡで稀釈し、リード及
びマン（Ｒｅｅｄａｎｄ Ｍａｎｎ） ［Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １３＋７２０２
−７２２１ （１９８５）］に開示されるように、先ず
フィルターを水で濡らし、フィルターを所定位置に保持
するドツトプロット作成用装置内にフィルターを入れ、
サンプルを適用しそして各ウェルを０，１ｍｌの２０
Ｘ５ＳＰＥ （３，６Ｍ ＮａＣ１、２００ｍＭ Ｎａ
１ｌｚＰＯ＊、２０ｍＭ ＥＤＴ＾）で濯ぐことにより
ナイロンフィルター上にスポットした。次いでフィルタ
ーを取出し、２０ Ｘ５ＳＰＥ中で濯ぎ真空オープン中
において８０℃で３０分間焼付けた。
焼付は後各フィルターを３ｘＳＳＰＥ、５×デンハルト
溶液（１ｘ＝０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０
２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ウシ血清アルブミン、０
．２ｍＭ Ｔｒｉｓ 、 ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ 、
ｐＨ８，０） 、０．５％ＳＤＳ、及び３０％ホルムア
ミドよりなる１５ｒｒｌのハイブリダイゼーション溶液
と接触させ、４２℃で２時間インキュベートした。次い
で２ｐＨ１０１ｅのプローブＲ５２４をこのハイブリダ
イゼーション溶液に添加し、フィルターを４２℃で２時
間インキュベートした。
溶液（１ｘ＝０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０
２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ウシ血清アルブミン、０
．２ｍＭ Ｔｒｉｓ 、 ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ 、
ｐＨ８，０） 、０．５％ＳＤＳ、及び３０％ホルムア
ミドよりなる１５ｒｒｌのハイブリダイゼーション溶液
と接触させ、４２℃で２時間インキュベートした。次い
で２ｐＨ１０１ｅのプローブＲ５２４をこのハイブリダ
イゼーション溶液に添加し、フィルターを４２℃で２時
間インキュベートした。
最後に、各ハイブリダイズされたフィルターを１００
ｍｌの２ＸＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳで室温において
１０分間２回洗浄した。次いでフィルターを１００ｍ１
の２ ｘＳＳｔ’Ｅ、 ０．１％ＳＤＳで６０℃におい
て１０分間１回処理した。
ｍｌの２ＸＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳで室温において
１０分間２回洗浄した。次いでフィルターを１００ｍ１
の２ ｘＳＳｔ’Ｅ、 ０．１％ＳＤＳで６０℃におい
て１０分間１回処理した。
各フィルターを次いでオートラジオグラフにかけたとこ
ろ、シグナルは２時間後に容易に明らかとなった。
ろ、シグナルは２時間後に容易に明らかとなった。
■、オートラジオダラムの説明
ドツトプロットのオートラジオグラフは２時間後に分析
され、上記サイキ等（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ。
され、上記サイキ等（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ。
５ｃｉｅｎｃｅ）により説明されるようにＨａｅｕＩ／
Ｍａｅ Ｉ−消化ｐＢＲ：βＡ （β＾は野性種の対
立遺伝子である）を用い−ご調製された標準的逐次稀釈
β−グロビン再構成液に対して強度を対比した。反応生
成物の分析は総括増幅効率が約９５％であり、β−グロ
ビン目標配列における６３０．０００倍の増大に対応す
ることを示した。
Ｍａｅ Ｉ−消化ｐＢＲ：βＡ （β＾は野性種の対
立遺伝子である）を用い−ご調製された標準的逐次稀釈
β−グロビン再構成液に対して強度を対比した。反応生
成物の分析は総括増幅効率が約９５％であり、β−グロ
ビン目標配列における６３０．０００倍の増大に対応す
ることを示した。
１崖■↓
■、増幅反応
実施例Ｉと同様のＭｏｊｔ４１ｔｌ胞系統から抽出され
た二つの１μｇのゲノムＤＮＡのサンプルをそれぞれ５
０＋ｗＭ ＫＣＩＩ 、 ２５＋＋ｌ’ｌ Ｔｒｉｓ
・ＩＩｃＩｔ（ａｌｌ、８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣ
Ｉｔｚ 、１ ｐＭのプライマーＰＣＯ３，１ｐＭのプ
ライ？−ＰＣＯ４，２００μｇ／ｍｌゼラチン、１０％
ジメチルスルホキシド（容量％）、１．５ｍＭｄＡＴＰ
、 １．５ｍＭ ｄＣＴＰ 、 １．５＋ｓＭ ｄＧＴ
Ｐ 、及び１．５ ｍＭＴＴＰを含イ１する１００μｌ
の反応液中に稀釈した。
た二つの１μｇのゲノムＤＮＡのサンプルをそれぞれ５
０＋ｗＭ ＫＣＩＩ 、 ２５＋＋ｌ’ｌ Ｔｒｉｓ
・ＩＩｃＩｔ（ａｌｌ、８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣ
Ｉｔｚ 、１ ｐＭのプライマーＰＣＯ３，１ｐＭのプ
ライ？−ＰＣＯ４，２００μｇ／ｍｌゼラチン、１０％
ジメチルスルホキシド（容量％）、１．５ｍＭｄＡＴＰ
、 １．５ｍＭ ｄＣＴＰ 、 １．５＋ｓＭ ｄＧＴ
Ｐ 、及び１．５ ｍＭＴＴＰを含イ１する１００μｌ
の反応液中に稀釈した。
この混合物を９８℃で１０分間加熱して、ゲノムＤＮＡ
を変性後、サンプルを室温に冷却し、実施例１と同様の
サーマス・アクアティスからのポリメラーゼ４ｐＨを各
サンプルに添加した。これらのサンプルに鉱油を重層し
て濃縮及び蒸発損失を防止した。
を変性後、サンプルを室温に冷却し、実施例１と同様の
サーマス・アクアティスからのポリメラーゼ４ｐＨを各
サンプルに添加した。これらのサンプルに鉱油を重層し
て濃縮及び蒸発損失を防止した。
サンプルの一方を実施例Ｉと同様の機械の加熱ブロック
内に入れ、次のプログラムサイクルを繰返して２５サイ
クルの増幅に付した： （１）２．５分間に亘る３７℃から９３℃への加熱、（
２）ブライマー及びＤＮＡをアニールさせるための３分
間に亘る９３℃から３７℃への冷却、及び （３）２分間に亘る３７℃における維持。
内に入れ、次のプログラムサイクルを繰返して２５サイ
クルの増幅に付した： （１）２．５分間に亘る３７℃から９３℃への加熱、（
２）ブライマー及びＤＮＡをアニールさせるための３分
間に亘る９３℃から３７℃への冷却、及び （３）２分間に亘る３７℃における維持。
最終サイクル後、サンプルを更に６０℃で１０分間イン
キエベートして最終延長反応を完結させた。
キエベートして最終延長反応を完結させた。
第二のサンプルは上記により詳細に説明した機械の熱伝
導性容器内に入れた。この熱伝導性容器は温度を上方、
及び下方、に調整するＰｅｔｔｉｅｒヒ−トポンブ及び
マイクロプロセッサコントローラに結合して自動的に増
幅順序、温度レベル、温度勾配及び温度のタイミングを
制御した。
導性容器内に入れた。この熱伝導性容器は温度を上方、
及び下方、に調整するＰｅｔｔｉｅｒヒ−トポンブ及び
マイクロプロセッサコントローラに結合して自動的に増
幅順序、温度レベル、温度勾配及び温度のタイミングを
制御した。
第二の試料は次のプログラムサイクルを繰返して２５サ
イクルの増幅に付した： （１）３分間に亘る３７℃から９５℃への加熱、（２）
変性を起こすための０．５分間の９５℃における維持、 （３）１分間に亘る９５℃から３７℃への冷却、及び （４）１分間の３７℃における維持。
イクルの増幅に付した： （１）３分間に亘る３７℃から９５℃への加熱、（２）
変性を起こすための０．５分間の９５℃における維持、 （３）１分間に亘る９５℃から３７℃への冷却、及び （４）１分間の３７℃における維持。
■９分析
分析のために二つの試験、すなわちドツトプロット及び
アガロースゲル分析を行った。
アガロースゲル分析を行った。
ドツトプロット分析のためには、下記配列のＲ５１８と
称される標識ＤＮＡプローブを調製した：５°−”ＣＴ
ＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３’ （Ｒ
ＳｌＢ）（＊は標識を示す）。このプローブは１５個の
塩基長であり、遺伝子の第４番目乃至第１７番目のコド
ンに亘りそして正常なβ−グロビン対立遺伝子（βＡ）
に相補的である。ブライマー及びプローブの概略図を下
記に示す： β−グロビン ＰＣＯ３Ｒ５１８ＰＣＯ４ このプローブは実施例Ｉの分節■に示した操作に従って
合成した。このプローブはその１０ｐｍｏ ｌ ｅを４
単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び約４０ｐｍｏ
ｊ２ｅのｒ−” ｐ−ＡＴＰ （約７０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏ６ｅ）と７０ｍＭ Ｔｒｔｓ １ｔＣ１（ｐＨ７，
６）、１０ｍＭ ＨｇＣ１ｚ 、１．５ｍＭスバーミン
及び１０ｍＭジチオスレイトールを含有する４０μｌの
反応液中において３７℃で６０分間接触させることによ
り標識した。次いで全容量を２５ｍＭ ＥＤＴＡで１０
０μｌに調整し、そしてマニアティス等［Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ （１９８２） ４６６−４６７
１の操作に従ってＴｒｉｓ −ＥＤＴＡ （ＴＥ） Ｉ
Ｉ衝液（１０ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ ・ＩＩ（Ｊ緩衝液、
０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）で平衡化された
１ｍＭのスピン透析カラム上で精製した。反応生成物の
ＴＣＡ沈澱はＲ５１８について比活性は４．６μＣｉ
／ｐｍｏ ＩＩ ｅであり、最終濃度は０．１１４ｐｍ
ｏ ｌ ｅ ／μｌであることを示した。
称される標識ＤＮＡプローブを調製した：５°−”ＣＴ
ＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ−３’ （Ｒ
ＳｌＢ）（＊は標識を示す）。このプローブは１５個の
塩基長であり、遺伝子の第４番目乃至第１７番目のコド
ンに亘りそして正常なβ−グロビン対立遺伝子（βＡ）
に相補的である。ブライマー及びプローブの概略図を下
記に示す： β−グロビン ＰＣＯ３Ｒ５１８ＰＣＯ４ このプローブは実施例Ｉの分節■に示した操作に従って
合成した。このプローブはその１０ｐｍｏ ｌ ｅを４
単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び約４０ｐｍｏ
ｊ２ｅのｒ−” ｐ−ＡＴＰ （約７０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏ６ｅ）と７０ｍＭ Ｔｒｔｓ １ｔＣ１（ｐＨ７，
６）、１０ｍＭ ＨｇＣ１ｚ 、１．５ｍＭスバーミン
及び１０ｍＭジチオスレイトールを含有する４０μｌの
反応液中において３７℃で６０分間接触させることによ
り標識した。次いで全容量を２５ｍＭ ＥＤＴＡで１０
０μｌに調整し、そしてマニアティス等［Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ （１９８２） ４６６−４６７
１の操作に従ってＴｒｉｓ −ＥＤＴＡ （ＴＥ） Ｉ
Ｉ衝液（１０ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ ・ＩＩ（Ｊ緩衝液、
０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）で平衡化された
１ｍＭのスピン透析カラム上で精製した。反応生成物の
ＴＣＡ沈澱はＲ５１８について比活性は４．６μＣｉ
／ｐｍｏ ＩＩ ｅであり、最終濃度は０．１１４ｐｍ
ｏ ｌ ｅ ／μｌであることを示した。
分節■で得られた増幅サンプル、及び熱安定性酵素の代
りに巳、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｄ Ｎ Ａポリメラー
ゼｒのフレノウ断片を用いた以外は上記と同様にして増
幅したサンプル５μＥを１９５μｌの０．４ ＮＮａ０
１１．２５ｍＭ ｌ０ＴＡで稀釈し、リード及びマン［
Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍａｎｎ＋ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋１３＋７２０２
−７２２１（１９８５） ］に開示されるように先ずフ
ィルターを水で濡らし、それらをフィルターを所定位置
に保持するドツトプロア）作成用装置内に置き、サンプ
ルを適用し、そして各ウェルを０．４ｍＭの２０ Ｘ５
ＳＰＥ （３，６Ｍ Ｍａｃｌ、 ２００ ｍＭ Ｎａ
１ｌｚＰＯｎ。
りに巳、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｄ Ｎ Ａポリメラー
ゼｒのフレノウ断片を用いた以外は上記と同様にして増
幅したサンプル５μＥを１９５μｌの０．４ ＮＮａ０
１１．２５ｍＭ ｌ０ＴＡで稀釈し、リード及びマン［
Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍａｎｎ＋ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋１３＋７２０２
−７２２１（１９８５） ］に開示されるように先ずフ
ィルターを水で濡らし、それらをフィルターを所定位置
に保持するドツトプロア）作成用装置内に置き、サンプ
ルを適用し、そして各ウェルを０．４ｍＭの２０ Ｘ５
ＳＰＥ （３，６Ｍ Ｍａｃｌ、 ２００ ｍＭ Ｎａ
１ｌｚＰＯｎ。
２０＋Ｍ ＥＤＴＡ）で濯ぐことにより２個のレプリカ
ナイロンフィルター上にスポットした。次いでこれらの
フィルターを取出し、２０ Ｘ５ＳＰＥ中で濯ぎそして
真空オーブン内で８０℃において３０分間焼付けた。
ナイロンフィルター上にスポットした。次いでこれらの
フィルターを取出し、２０ Ｘ５ＳＰＥ中で濯ぎそして
真空オーブン内で８０℃において３０分間焼付けた。
焼付後、各フィルターを次いで６ｍｌ１の５×５ＳＰＥ
、 ５ ｘデンハルト溶液（ＩＸ＝０．０２％ポリビニ
ルピロリドン、０．０２％Ｆｉｃｏ［Ｉ、０．０２％ウ
シ血清アル）゛ミン、０．２ｍＭ Ｔｒｉｓ 、 ０．
２ｍＭ ＥＤＴＡ 、ｐＨ８，０）及び０．５％ＳＤＳ
よりなる６ｍＭのハイブリダイゼーション溶液と接触さ
せ５５℃で６０分間インキュベートした。次いで、５μ
ｌのプローブＲ５１８をハイブリダイゼーション溶液に
添加し、フィルターを５５℃で６０分間インキュベート
した。
、 ５ ｘデンハルト溶液（ＩＸ＝０．０２％ポリビニ
ルピロリドン、０．０２％Ｆｉｃｏ［Ｉ、０．０２％ウ
シ血清アル）゛ミン、０．２ｍＭ Ｔｒｉｓ 、 ０．
２ｍＭ ＥＤＴＡ 、ｐＨ８，０）及び０．５％ＳＤＳ
よりなる６ｍＭのハイブリダイゼーション溶液と接触さ
せ５５℃で６０分間インキュベートした。次いで、５μ
ｌのプローブＲ５１８をハイブリダイゼーション溶液に
添加し、フィルターを５５℃で６０分間インキュベート
した。
最後に各ハイブリダイズされたフィルターを１００ ｍ
ｌ （７） ２ Ｘ５ＳＰＥ及び０．１％ｓＤｓで室温
ニオいて１０分間２回洗浄した０次いで、フィルターを
それぞれ１００ ｍｌの５ Ｘ５ＳＰＥ、 ０．１％Ｓ
Ｏ３で６０℃において１）１分間及び２）３分間の２回
処理した。
ｌ （７） ２ Ｘ５ＳＰＥ及び０．１％ｓＤｓで室温
ニオいて１０分間２回洗浄した０次いで、フィルターを
それぞれ１００ ｍｌの５ Ｘ５ＳＰＥ、 ０．１％Ｓ
Ｏ３で６０℃において１）１分間及び２）３分間の２回
処理した。
次いで各フィルターをオートラジオグラフィにかけたと
ころ、シグナルは９０分後に容易に明らかとなった。
ころ、シグナルは９０分後に容易に明らかとなった。
アガロースゲル分析において、各５μｌの増幅反応液を
１ｘＴＢＥ１１衝液（０，０８９Ｍ Ｔｒｉｓホウ酸塩
、０．０８９Ｍホウ酸、及び２１１１ＭＥＤＴ＾）中の
０．５％アガロースゲルに負荷し、１００ Ｖで６０分
１７１電気泳動させた。エチジウムブロマイドで染色後
、ＤＮＡをＵＶ蛍光により可視化した。
１ｘＴＢＥ１１衝液（０，０８９Ｍ Ｔｒｉｓホウ酸塩
、０．０８９Ｍホウ酸、及び２１１１ＭＥＤＴ＾）中の
０．５％アガロースゲルに負荷し、１００ Ｖで６０分
１７１電気泳動させた。エチジウムブロマイドで染色後
、ＤＮＡをＵＶ蛍光により可視化した。
これらの結果は、実施例Ｉ及び本例で用いた機械はＤＮ
Ａの増幅に同様に有効であり、所望配列に対応する同様
な強度の個々の高密度の１１０塩基対バンド並びにはる
かに低い強度の僅かのその他の個々のバンドを示した。
Ａの増幅に同様に有効であり、所望配列に対応する同様
な強度の個々の高密度の１１０塩基対バンド並びにはる
かに低い強度の僅かのその他の個々のバンドを示した。
これに対して、各サイクル後にＥ、コリポリメラーゼＩ
のフレノウ断片を用いる試薬移転を含む増幅方法は多く
の非関連ＤＮＡ配列の非−特異的増幅から生ずるＤＮＡ
スメアを与えた。
のフレノウ断片を用いる試薬移転を含む増幅方法は多く
の非関連ＤＮＡ配列の非−特異的増幅から生ずるＤＮＡ
スメアを与えた。
１１ＬＡ−ＤＱ、、Ｄ Ｉ’？及びＤＰ領領域評価にお
いても同様の増幅及び検出における改良が達成されるこ
とが期待される。
いても同様の増幅及び検出における改良が達成されるこ
とが期待される。
ヒトβ−ヘモグロビン遺伝子上の１１９塩基対断片の増
幅のために、上記の如（、Ｍｏ１ｔ４細胞系或イハＧＭ
２０６４細１１ｔｉ系（β−及びΔ−ヘモグロビン領域
の示モ接合性削除を表わし、ｌｌｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃＭｕｔａｎｔ Ｃｅ１ｌ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、
ニュージャージ州カムデンから取得可能）から単離さ
れたヒトゲノムＤＮ’Ａのそれぞれ総量１１１ ｇを、
５０ｍＭ ＫＣｌ。
幅のために、上記の如（、Ｍｏ１ｔ４細胞系或イハＧＭ
２０６４細１１ｔｉ系（β−及びΔ−ヘモグロビン領域
の示モ接合性削除を表わし、ｌｌｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃＭｕｔａｎｔ Ｃｅ１ｌ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、
ニュージャージ州カムデンから取得可能）から単離さ
れたヒトゲノムＤＮ’Ａのそれぞれ総量１１１ ｇを、
５０ｍＭ ＫＣｌ。
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ 何ＩＣＩ ｐｌ＋ ８．１０ｍ
Ｍ ＭｇＣ１ｚ 、２００μｇ／ｍｅゼラチン、５ＩＩ
ＩＭベーターメルカプトエタノール、１．５ｍＭ ｄＡ
ＴＰ 、 １．５ｍＭ ｄＣＴＰ 、 １．５ｍＭｄＴ
ＴＰ、、１．５ｍＭ ｄＧＴｒ’ 、及び１．ｃｒＭの
下記プライマーの各々を含有する１００μｌの反応液中
で増幅させた： ５′−ＣＴＴＣＴＧｃａｇＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣ
ＴＡＧＣ−３” （Ｇｌ１１８）５′−ＣＡＣａＡｇ
ＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ−３’
（ＧＩ１１９）（蔵に小文字は制限酵素部位を創出す
ための野性様配列からのミスマツチを示す）。
Ｍ ＭｇＣ１ｚ 、２００μｇ／ｍｅゼラチン、５ＩＩ
ＩＭベーターメルカプトエタノール、１．５ｍＭ ｄＡ
ＴＰ 、 １．５ｍＭ ｄＣＴＰ 、 １．５ｍＭｄＴ
ＴＰ、、１．５ｍＭ ｄＧＴｒ’ 、及び１．ｃｒＭの
下記プライマーの各々を含有する１００μｌの反応液中
で増幅させた： ５′−ＣＴＴＣＴＧｃａｇＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣ
ＴＡＧＣ−３” （Ｇｌ１１８）５′−ＣＡＣａＡｇ
ＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ−３’
（ＧＩ１１９）（蔵に小文字は制限酵素部位を創出す
ための野性様配列からのミスマツチを示す）。
Ｇ１１１８は９Ｌ鎖に相補的な２６塩基オリゴヌクレオ
チドであり、内部Ｐｓｔ １部位を含有する。Ｇ１１
１９は玉鎖に相補的である２３塩凸オリゴヌクレオチド
であり、内部旧ｎｄｎ［認識部位を含有する。これらの
プライマーは先ずバタテリオファージＭ１３のＰｓｔ
Ｉ及びＨｉｎｄＩ［［制限部位に対する相同性のため
の遺伝子の領域をスクリーニングすることにより選択さ
れた。次いでプライマーが実施例Ｉと同様にして調製さ
れた。
チドであり、内部Ｐｓｔ １部位を含有する。Ｇ１１
１９は玉鎖に相補的である２３塩凸オリゴヌクレオチド
であり、内部旧ｎｄｎ［認識部位を含有する。これらの
プライマーは先ずバタテリオファージＭ１３のＰｓｔ
Ｉ及びＨｉｎｄＩ［［制限部位に対する相同性のため
の遺伝子の領域をスクリーニングすることにより選択さ
れた。次いでプライマーが実施例Ｉと同様にして調製さ
れた。
上記反応液を９５℃において１０分間加熱し、次いで室
温に冷却した。実施例Ｉにおいて記載したポリメラーゼ
の総量４μｌを各反応液に添加し、次いで各混合液に鉱
油を重層した。これらの反応液を次のプログラムで３０
サイクルの増幅に対した： ２５分間勾配、３７から９８℃ ３分間勾配、９８から３７℃ ２分間浸漬、３７℃。
温に冷却した。実施例Ｉにおいて記載したポリメラーゼ
の総量４μｌを各反応液に添加し、次いで各混合液に鉱
油を重層した。これらの反応液を次のプログラムで３０
サイクルの増幅に対した： ２５分間勾配、３７から９８℃ ３分間勾配、９８から３７℃ ２分間浸漬、３７℃。
最終サイクル後、反応混合物を次いで６５℃で２０分間
インキエベートして最終延長を完結させた。鉱油をクロ
ロホルムで抽出し、反応液を２０℃で貯蔵した。
インキエベートして最終延長を完結させた。鉱油をクロ
ロホルムで抽出し、反応液を２０℃で貯蔵した。
総量ＬＯｐｌの増幅生成物を［ｌｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
−Ｍａｎｎｈｅｉｍから市販されているＭ１３ｍｐｌＯ
クローニングベクター０．５８ｇと共に５０ ｍＭ Ｎ
ａＣ１，１０ｍＭＴｒｉｓ ・１１（Ｊ 、 ｐＨ？、
８．１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ 、２０単位のＰｓｔ Ｉ
及び２６単位の旧ｎｄｌｌＩを含有する５０μｌ容の液
中で３７℃において９０分間消化した。
−Ｍａｎｎｈｅｉｍから市販されているＭ１３ｍｐｌＯ
クローニングベクター０．５８ｇと共に５０ ｍＭ Ｎ
ａＣ１，１０ｍＭＴｒｉｓ ・１１（Ｊ 、 ｐＨ？、
８．１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ 、２０単位のＰｓｔ Ｉ
及び２６単位の旧ｎｄｌｌＩを含有する５０μｌ容の液
中で３７℃において９０分間消化した。
２０℃に冷却することにより反応を停止させた。
容量をＴＥ緩衝液で１１０μｌに調整し、１ｍ１Ｂｉｏ
Ｇｅｌ Ｐ −４スピン透析カラム上に負荷したく１０
０μｌ）。一つの０．１ｍＩｔ画分を集めエタノール沈
澱させた。
Ｇｅｌ Ｐ −４スピン透析カラム上に負荷したく１０
０μｌ）。一つの０．１ｍＩｔ画分を集めエタノール沈
澱させた。
（この時点において、ＧＭ２０６４サンプル中にはβ−
グロビン増幅生成物があることが見出された。
グロビン増幅生成物があることが見出された。
引続く実験はＧ１１１８或いはＧＨ１９のいづれかのプ
ライマーに対する汚染源を追跡した。その他のプライマ
ー源は利用可能でなかったので、実験はプライマー中の
汚染ＤＮＡから何等かのクローン化された配列に由来す
るとの理解をもって継続された。）エタノールベレット
を１５μｌの水に再懸濁し、次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＩＩ（Ｊ 、ｐＨ？、 ８．１０ｎ＋ＭＭｇＣ１
ｌ ｚ 、０．５ｍＰＩ ＡＴ、Ｐ、 Ｉ ０ｍＭジ
チオスレイトール及び４００単位のりガーゼを含有する
２０１１１容量に調整した。この混合物を１６℃で３時
間インキュベートした。
ライマーに対する汚染源を追跡した。その他のプライマ
ー源は利用可能でなかったので、実験はプライマー中の
汚染ＤＮＡから何等かのクローン化された配列に由来す
るとの理解をもって継続された。）エタノールベレット
を１５μｌの水に再懸濁し、次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＩＩ（Ｊ 、ｐＨ？、 ８．１０ｎ＋ＭＭｇＣ１
ｌ ｚ 、０．５ｍＰＩ ＡＴ、Ｐ、 Ｉ ０ｍＭジ
チオスレイトール及び４００単位のりガーゼを含有する
２０１１１容量に調整した。この混合物を１６℃で３時
間インキュベートした。
Ｍｏ１Ｌ４ＤＮＡを含有する１０μβの結合反応液をＢ
ＲＬ （メリーランド州、ヘテスダ）から市販されてい
るＥ、コリ株Ｊ旧０３コンピテント細胞中に形質転換し
た。形質転換株を調製するために従った操作はメソシン
グ、Ｊ、 ［Ｍｃｓｓｉｎｇ、 Ｊ、（１９８１）［
巨大分子についての第三回クリーブランドシンポジウム
二組換えＤＮＡ（Ｔｈｉｒｄ Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ Ｓ
ｙｍｐ−ｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃ
ｕｌｅｓ ： ＲａｃｏｍｂｉｎａｎＬ ＤＮＡ
）Ｊ八、 Ｗａ Ｉ ｔｏｎ編、エルセピア、アムステ
ルダム、１４３−１５３］に説明されている。全部で６
５１個の無色プラーク（及び０個の青色プラーク）が得
られた。
ＲＬ （メリーランド州、ヘテスダ）から市販されてい
るＥ、コリ株Ｊ旧０３コンピテント細胞中に形質転換し
た。形質転換株を調製するために従った操作はメソシン
グ、Ｊ、 ［Ｍｃｓｓｉｎｇ、 Ｊ、（１９８１）［
巨大分子についての第三回クリーブランドシンポジウム
二組換えＤＮＡ（Ｔｈｉｒｄ Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ Ｓ
ｙｍｐ−ｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃ
ｕｌｅｓ ： ＲａｃｏｍｂｉｎａｎＬ ＤＮＡ
）Ｊ八、 Ｗａ Ｉ ｔｏｎ編、エルセピア、アムステ
ルダム、１４３−１５３］に説明されている。全部で６
５１個の無色プラーク（及び０個の青色プラーク）が得
られた。
これらのうち１１９個は（＋）−鎖インサート１８％）
を有し、そして１９個は（−）−鎖インサート（３％）
を存した。これは反応が２５℃で２分間進行され、その
後２分間１００℃に加熱、冷却、フレノウ断片の添加、
及び反応を行う工程が９回繰返される、Ｅ、コリポリメ
ラーゼＩのフレノウ断片を用いる増幅技術から得られる
プライマー−陽性プラーク内のβ−グロビン陽性プラー
クのパーセント割合に対する殆んど２０倍の増大である
。これらの結果は本発明の熱安定性酵素を用いる増幅反
応の改良された特異性を確認するものである。
を有し、そして１９個は（−）−鎖インサート（３％）
を存した。これは反応が２５℃で２分間進行され、その
後２分間１００℃に加熱、冷却、フレノウ断片の添加、
及び反応を行う工程が９回繰返される、Ｅ、コリポリメ
ラーゼＩのフレノウ断片を用いる増幅技術から得られる
プライマー−陽性プラーク内のβ−グロビン陽性プラー
クのパーセント割合に対する殆んど２０倍の増大である
。これらの結果は本発明の熱安定性酵素を用いる増幅反
応の改良された特異性を確認するものである。
その後のＧＭ２０６４及び汚染プライマーを用いるクロ
ーニング実験においては、５１０個の無色プラークのう
ら４３個（８％）は（＋）−鎖インサートを有した。こ
れはＭｏ１ｔ４からの１１９個のクローンのうち約半分
が汚染配列を含有することを示唆する。
ーニング実験においては、５１０個の無色プラークのう
ら４３個（８％）は（＋）−鎖インサートを有した。こ
れはＭｏ１ｔ４からの１１９個のクローンのうち約半分
が汚染配列を含有することを示唆する。
Ｍｏ１ｔ４からの１０個の（＋）−鎖クローンを配列決
定した。５個は正常の野性種配列であり、そして５個は
遺伝子の第二のコドンの第３番目の位置において単一の
ＣからＴへの変異を存した（ＣＡＣからＣＡＴへ）。Ｇ
Ｍ２０６４からの４個の汚染クローンを配列決定したと
ころ、四つとも全て正常であった。
定した。５個は正常の野性種配列であり、そして５個は
遺伝子の第二のコドンの第３番目の位置において単一の
ＣからＴへの変異を存した（ＣＡＣからＣＡＴへ）。Ｇ
Ｍ２０６４からの４個の汚染クローンを配列決定したと
ころ、四つとも全て正常であった。
制限部位修飾プライマーを用いてヒｌ−Ｎ−ｒａｓオン
コーゲンを増幅及びクローン化し、そして部分的に配列
決定し、そして上記技術を用いてＨＬＡＤＱ−α、ＤＱ
−β及びＤＲ−β遺伝子の塩基対セグメントをクローン
化することもできる。これらの増幅反応の全ては１０容
量％のジメチルスルホキシドの存在下において行われる
。
コーゲンを増幅及びクローン化し、そして部分的に配列
決定し、そして上記技術を用いてＨＬＡＤＱ−α、ＤＱ
−β及びＤＲ−β遺伝子の塩基対セグメントをクローン
化することもできる。これらの増幅反応の全ては１０容
量％のジメチルスルホキシドの存在下において行われる
。
プレートヒ びスクＩ−ニング
増幅及びクローニングから生ずるインサートのパーセン
トを決定するためにプライマーＰＣＯ４を用いてフィル
ターをプローブした。増幅プライマー−陽性プラーク内
のβ−グロビン陽性プラークのパーセントは約２０％で
あった。これは反応が２５℃で２分間行われ、その後２
分間の１００℃への加熱、冷却、フレノウ断片の添加、
及び反応の工程が９回繰返されるＥ、コリポリメラーゼ
Ｉのフレノウ断片を用いる増幅技術からのプライマー−
陽性プラーク内のβ−グロビン陽性ブラークツパーセン
トに対して２０倍の増大である。これらの結果は本発明
の熱安定性酵素を用いる増幅反応の改良された特異性を
確認するものである。
トを決定するためにプライマーＰＣＯ４を用いてフィル
ターをプローブした。増幅プライマー−陽性プラーク内
のβ−グロビン陽性プラークのパーセントは約２０％で
あった。これは反応が２５℃で２分間行われ、その後２
分間の１００℃への加熱、冷却、フレノウ断片の添加、
及び反応の工程が９回繰返されるＥ、コリポリメラーゼ
Ｉのフレノウ断片を用いる増幅技術からのプライマー−
陽性プラーク内のβ−グロビン陽性ブラークツパーセン
トに対して２０倍の増大である。これらの結果は本発明
の熱安定性酵素を用いる増幅反応の改良された特異性を
確認するものである。
制限部位−変成プライマーを用いてヒトＮ−ｒａｓオン
コーゲンを増幅及びクローン化及び部分的に配列決定し
、及び上記技術を用いてＨＬＡ ＤＱ−α、ＤＱ−β
及びＤＲ−β遺伝子の塩基対セグメントをクローン化す
ることもできる。これらの増幅反応の全てはＩＯ容量％
のジメチルスルホキシドの存在下において行われる。
コーゲンを増幅及びクローン化及び部分的に配列決定し
、及び上記技術を用いてＨＬＡ ＤＱ−α、ＤＱ−β
及びＤＲ−β遺伝子の塩基対セグメントをクローン化す
ることもできる。これらの増幅反応の全てはＩＯ容量％
のジメチルスルホキシドの存在下において行われる。
要約すると、本発明は温度−Ｖａ環連鎖反応及び熱安定
性酵素を含む１種以上の核酸配列の自動化増幅を行うた
めの装置を提供するものであり、その装置は試薬のため
の熱−伝導容器、容器を任意の与えられた温度まで或い
はその温度において加熱、冷却及び維持するための手段
、及び温度レベルを制御する信号を発生するコンピュー
タ手段を有する。この増幅方法の結果、増幅生成物の増
大した収率、より大きな特異性が生じ、及び従来開示さ
れたものに比べて操作を実施するために必要な工程数が
少なくなる。
性酵素を含む１種以上の核酸配列の自動化増幅を行うた
めの装置を提供するものであり、その装置は試薬のため
の熱−伝導容器、容器を任意の与えられた温度まで或い
はその温度において加熱、冷却及び維持するための手段
、及び温度レベルを制御する信号を発生するコンピュー
タ手段を有する。この増幅方法の結果、増幅生成物の増
大した収率、より大きな特異性が生じ、及び従来開示さ
れたものに比べて操作を実施するために必要な工程数が
少なくなる。
第１図は熱安定性酵素及び反応容器の温度を循環させる
ためのＰｅ１Ｌｉｅｒヒートポンプを用いて増幅方法を
行うことのできる機械の一般的ブロック線図である。 第２図は反応容器の温度を循環させるための水浴を用い
る本発明における熱安定性酵素増幅方法を行うことので
きる機械の一般的ブロック線図である。 第３図はソリッドステートヒートポンプ及び反応室熱交
換器構造体の図面である。 第４図はソリッドステートヒートポンプのためのインタ
ーフムースユニットの外機図である。 第５図は典型的なユーザーにより規定される温度プロフ
ィールの図面である。 第６Ａ図及び第６Ｂ図は実際の反応室温度のフィードバ
ックを用いない経験的実施態様のための制御ソフトウム
アのための流れ図よりなる。 第７Ａ図及び第７Ｂ図は反応室の実際の温度を監視し、
そしてそれを所望温度プロフィールに対比する実際の温
度フィードバック信号を用いる好ましい実施態様のため
の制御ソフトウェアのための流れ図よりなる。 １ご↓下余白 屈 −１４ｄ 問 工程８２へ 第６８図
ためのＰｅ１Ｌｉｅｒヒートポンプを用いて増幅方法を
行うことのできる機械の一般的ブロック線図である。 第２図は反応容器の温度を循環させるための水浴を用い
る本発明における熱安定性酵素増幅方法を行うことので
きる機械の一般的ブロック線図である。 第３図はソリッドステートヒートポンプ及び反応室熱交
換器構造体の図面である。 第４図はソリッドステートヒートポンプのためのインタ
ーフムースユニットの外機図である。 第５図は典型的なユーザーにより規定される温度プロフ
ィールの図面である。 第６Ａ図及び第６Ｂ図は実際の反応室温度のフィードバ
ックを用いない経験的実施態様のための制御ソフトウム
アのための流れ図よりなる。 第７Ａ図及び第７Ｂ図は反応室の実際の温度を監視し、
そしてそれを所望温度プロフィールに対比する実際の温
度フィードバック信号を用いる好ましい実施態様のため
の制御ソフトウェアのための流れ図よりなる。 １ご↓下余白 屈 −１４ｄ 問 工程８２へ 第６８図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、反応混合物を保持するための熱伝導性容器、該容器
を複数のユーザーにより規定された温度の内の任意の温
度へ又はその温度において加熱及び冷却するための手段
であって、該容器が加熱されるか或いは冷却されるかを
制御する制御信号を受取る制御入力を有する手段、及び 該手段の該制御入力に連結された、複数の温度及び該温
度が達成されるべき回数を規定するユーザーからのチェ
ックポイントデータを受取りそして貯蔵して、それによ
り温度プロフィールを規定し、そしてユーザーからのコ
マンドの受取り時に該チェックポイントデータをアクセ
スし、そして前記加熱及び冷却手段の制御入力における
制御信号をそれから発生させて、ユーザーにより規定さ
れた温度プロフィールを該容器において達成させるため
のコンピュータ手段、を有してなることを特徴とする反
応混合物の温度循環を行うための装置。 ２、前記加熱及び冷却手段がソリッドステートのヒート
ポンプであるか、又はその中に形成された流体流路を有
するアルミニュウ板であってこのチャンネルはポンプに
流体連結されており、このポンプは流体容器に貯蔵され
た流体を循環させるものであり、この流体容器は一定の
ユーザーにより規定される温度に該流体を保持するため
の加熱素子及び冷却素子をその中に有している、特許請
求の範囲第１項記載の装置。 ３、該コンピュータ手段が、温度プロフィールを規定す
る各組のチェックポイントについてユーザーから入れら
れるリンクデータを該コンピュータ手段により貯蔵され
た各々の該温度プロフィールに関連するデータベース内
のリンクデータフィールド内に受取りそして貯蔵するた
めの手段、及び各々が自身のリンクデータ項目を有する
、複数の温度プロフィールを規定するためのユーザーに
より入力された複数の組のチェックポイントを受取りそ
して貯蔵するための手段を含み、そして該コンピュータ
手段がさらに、ユーザーにより特定された任意の特定の
温度プロフィールを実行し、そしてその完結後に、もし
特定されれば、特定された温度プロフィールをその実行
された温度プロフィールのリンクデータフィールド内で
実行し、そして実行される各温度プロフィールに関連す
るリンクデータフィールド内において特定された温度プ
ロフィールを実行するこの操作を最早温度プロフィール
が特定されなくなるまで継続する手段を含む特許請求の
範囲第１項又は第２項記載の装置。 ４、少なくとも一つの特定の核酸配列の自動化された増
幅を行うための装置であって、 該被増幅されるべき核酸、４種の異なるヌクレオチドト
リホスフェート、熱安定性酵素及び増幅されるべき各々
異る特定の配列について１個のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを含んでなる反応混合物を保持するための第一の
手段であって、各プライマーが、一つのプライマーから
合成される延長生成物がその相補体から分離された際に
他のプライマーの延長生成物の合成のための鋳型として
役立ち得るように各特定の配列の異る鎖に実質的に相補
的であるように選ばれ、該保持が任意の選ばれた温度或
いは複数の温度において行われる手段、及び 該第一の手段にその内容物を第一の期間加熱させ、そし
てその内容物を第二の期間冷却させる所定の順序の工程
を自動的に行うための第二の手段、を有しなることを特
徴とする装置。 ５、該第一の手段がその中に貯蔵された前記液体を二つ
の温度のいづれかにおいて保持し、そして該第二の手段
が該第一の手段にその内容物を第一の温度においてユー
ザーにより規定された期間保持させ、次いで冷却期間を
置かせ、そしてユーザーにより規定された期間第二の温
度における低温インキュベーションを行わせる、特許請
求の範囲第４項記載の装置。 ６、前記第一の装置が、流体をユーザーにより規定され
る一定の温度に保つための加熱及び冷却素子を有する流
体貯蔵器内に貯蔵された流体を循環させるポンプと流体
連通された流体流路がその中に形成されているアルミニ
ウム板に熱的に連結された反応室である特許請求の範囲
第５項記載の装置。 ７、少なくとも一つの特定の核酸配列の自動化された増
幅を行う装置であって、 反応室、 該反応室に熱的に連結されたソリッドステートのヒート
ポンプ、 熱制御信号を受取るための熱制御信号入力及び冷却制御
信号を受取るための冷却制御信号入力を有し、且つ該熱
及び冷却制御信号に指示された通りに加熱或いは冷却の
いづれかを引起こす正しい性質を有する、該熱及び冷却
制御信号を該ソリッドステートのヒートポンプを流れる
電流に変換するための、該ソリッドステートのヒートポ
ンプに連結された電力出力を有するインタフェイス、及
び１以上の温度プロフィールを規定する１組以上のチェ
ックポイントを受取りそして貯蔵する（ここで、各チェ
ックポイントはユーザーにより入れられ、そしてそれが
関連する温度プロフィールの特定の時点において達成さ
れるべき或いは維持されるべき特定の温度を規定する）
ための、及びその温度プロフィールが何回実行されるべ
きかを規定する各温度プロフィールに対するサイクル数
データフィールドを受取りそして貯蔵するための、及び
該ユーザーからリンクデータを受取りそれを実行される
べき次の温度プロフィールを指示するリンクデータフィ
ールド内に貯蔵するための、熱及び冷却制御信号を供給
するために該インターフェイス手段に連結された熱及び
冷却制御信号出力を有するコンピュータ手段であって、 該コンピュータ手段はさらに、前記ユーザーから開始の
コマンド及び温度プロフィール特定を受取った後に、ユ
ーザーにより規定された温度プロフィールが前記反応室
において実現するように前記加熱及び冷却シグナルを適
切な順序で発生せしめることにより前記サイクル数デー
ターフィールド中に特定された回数だけ特定された温度
プロフィールを実行するための、そして所望のサイクル
数の完結後、完結された温度プロフィールのリンクデー
タフィールドをアクセスし、そしてもし存在すれば該リ
ンクデータフィールド内に特定された温度プロフィール
を実行し、そしてこのリンクされた温度プロフィールの
操作をすぐ前に完結された温度プロフィールのリンクフ
ィールドが実行されるべき他の温度プロフィールを特定
しなくなるまで継続するための手段、 を包含することを特徴とする装置。 ８、下記工程を含んでなることを特徴とする少なくとも
一つの特定の核酸配列を増幅するための方法： コンピューターにより指令された機械を用いて、増幅さ
れるべき核酸、四種の異るヌクレオチドトリホスフェー
ト、熱安定性酵素及び増幅されるべき各々の異る特定の
配列について１個のオリゴヌクレオチドプライマーより
なるサンプル（ここで各プライマーが一つのプライマー
から合成される延長生成物がそれが相補体から分離され
た場合に他のプライマーの延長生成物の合成のための鋳
型として役立ち得るように各特定の配列の異る鎖に実質
的に相補的であるように選ばれる）（以下、混合物とい
う）を所定の温度に所定時間加熱する工程、及び コンピューターにより指令された機械を用いてこの混合
物をユーザーにより規定された温度に加熱し、そしてこ
の混合物をユーザーにより規定された温度に冷却する工
程。 ９、冷却工程後にコンピューターにより指令された機械
を用いて該混合物を所定温度に所定時間維持する特許請
求の範囲第８項記載の方法。 １０、加熱工程後及び冷却工程前に、コンピューターに
より指令された機械を行いて該混合物を所定の最高温度
に所定時間維持する特許請求の範囲第８項又は第９項記
載の方法。 １１、更に操作における全工程を通じて時間、温度及び
サイクル数の幾つか或いは全てを制御する所望パラメー
タに関し、コンピューターにより指令された機械にユー
ザーに質問させる工程を含む特許請求の範囲第８項記載
の方法。 １２、コンピューターにより指令された機械を用いて多
数の試料を、一度に一個ずつ、核酸増幅過程を通じて処
理することを含んでなる特許請求の範囲第１１項記載の
方法。 １３、下記工程を含んでなる少なくとも一つの特定の核
酸配列を増幅する方法： ａ）コンピューターにより指令された機械を用いて、加
熱装置に熱信号を与えて反応室を所定時間、所定温度ま
で及び／又は所定温度において加熱させる工程であって
、該反応室が増幅されるべき核酸、四種の異るヌクレオ
チドトリホスフェート、熱安定性酵素及び増幅されるべ
き各々の異る特定の配列について１個のオリゴヌクレオ
チドプライマーからなる試料（各プライマーが、一つの
プライマーから合成された延長生成物がそれがその相補
体から分離された際に他のプライマーの延長生成物の合
成の鋳型として役立ち得るように各特定の配列の異る鎖
に実質的に相補的であるように選ばれる）を含有してい
る、工程、 ｂ）コンピューターにより指示された機械を用いて、冷
却装置に冷却信号を与え該反応室を所定時間所定温度ま
で冷却させる工程、及び ｃ）これまでに行われたサイクル数がユーザーにより規
定されたサイクル数より少ない場合に、能動冷却信号の
経過時間がユーザーにより規定された時間に等しい時に
、工程ａ）からｂ）よりなるサイクルを繰返す工程。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01197498A (ja) * | 1987-12-23 | 1989-08-09 | Orion Yhtymae Oy | 核酸の増幅のための装置、装置部およびその方法 |
| JPH037571A (ja) * | 1989-02-03 | 1991-01-14 | Eastman Kodak Co | Ｐｃｒ用の封入キュベットおよびその使用方法 |
| JPH03501211A (ja) * | 1988-06-24 | 1991-03-22 | アムジエン・インコーポレーテツド | 核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬 |
| JPH07303468A (ja) * | 1986-02-25 | 1995-11-21 | Perkin Elmer Corp:The | ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルを実施するための熱サイクリングシステム |
| JP2005519381A (ja) * | 2002-03-06 | 2005-06-30 | サムスン エレクトロニクス カンパニー リミテッド | 重合酵素連鎖反応（ｐｃｒ）チップを駆動するための温度制御方法及びその装置 |
| JP2006262903A (ja) * | 1990-11-29 | 2006-10-05 | Applera Corp | 温度制御を用いたポリメラーゼ連鎖反応の自動実施装置 |
| WO2009157353A1 (ja) * | 2008-06-23 | 2009-12-30 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析装置、自動分析装置、及び分析方法 |
| JP2012502651A (ja) * | 2008-09-23 | 2012-02-02 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | サーモサイクルデバイス |
| JP2014100145A (ja) * | 2013-12-18 | 2014-06-05 | Koninklijke Philips Nv | サーモサイクルデバイス |
Families Citing this family (87)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL86724A (en) * | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| AU622426B2 (en) * | 1987-12-11 | 1992-04-09 | Abbott Laboratories | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
| EP0359789B1 (en) * | 1988-01-21 | 1993-08-04 | Genentech, Inc. | Amplification and detection of nucleic acid sequences |
| US5024934A (en) * | 1988-03-14 | 1991-06-18 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Detection of minimal numbers of neoplastic cells carrying DNA translocations by DNA sequence amplification |
| DE3808942A1 (de) * | 1988-03-17 | 1989-09-28 | Bio Med Gmbh Ges Fuer Biotechn | Inkubator, insbes. fuer die polymerase-ketten-methode |
| GB2233476B (en) * | 1988-03-26 | 1992-01-29 | Peter Duncan Goodearl Dean | Reaction temperature control |
| GB8807297D0 (en) * | 1988-03-26 | 1988-04-27 | Dean P D G | Intelligent heating block |
| GB8814962D0 (en) * | 1988-06-23 | 1988-07-27 | Lep Scient Ltd | Biochemical reaction machine |
| US5066584A (en) * | 1988-09-23 | 1991-11-19 | Cetus Corporation | Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction |
| US5075216A (en) * | 1988-09-23 | 1991-12-24 | Cetus Corporation | Methods for dna sequencing with thermus aquaticus dna polymerase |
| US4865986A (en) * | 1988-10-06 | 1989-09-12 | Coy Corporation | Temperature control apparatus |
| GB8826364D0 (en) * | 1988-11-10 | 1988-12-14 | Sykes B C | Improvements in/relating to temperature sequencing |
| GB8917963D0 (en) * | 1989-08-05 | 1989-09-20 | Scras | Apparatus for repeated automatic execution of a thermal cycle for treatment of biological samples |
| WO1991007504A1 (en) * | 1989-11-21 | 1991-05-30 | Kindconi Pty. Ltd. | Improved dna polymerisation device |
| US5935522A (en) * | 1990-06-04 | 1999-08-10 | University Of Utah Research Foundation | On-line DNA analysis system with rapid thermal cycling |
| US7273749B1 (en) | 1990-06-04 | 2007-09-25 | University Of Utah Research Foundation | Container for carrying out and monitoring biological processes |
| US7081226B1 (en) | 1996-06-04 | 2006-07-25 | University Of Utah Research Foundation | System and method for fluorescence monitoring |
| US6716580B2 (en) | 1990-06-11 | 2004-04-06 | Somalogic, Inc. | Method for the automated generation of nucleic acid ligands |
| AT394911B (de) * | 1990-09-12 | 1992-07-27 | Vaillant Gmbh | Elektronischer raumtemperatur-regler |
| US6703236B2 (en) | 1990-11-29 | 2004-03-09 | Applera Corporation | Thermal cycler for automatic performance of the polymerase chain reaction with close temperature control |
| FR2672301A1 (fr) * | 1991-02-01 | 1992-08-07 | Larzul Daniel | Procede et dispositif pour amplifier le nombre d'une sequence definie d'acide nucleique dans un echantillon biologique. |
| US5270183A (en) * | 1991-02-08 | 1993-12-14 | Beckman Research Institute Of The City Of Hope | Device and method for the automated cycling of solutions between two or more temperatures |
| CA2065719A1 (en) | 1991-04-30 | 1992-10-31 | John B. Findlay | Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle |
| US5994056A (en) * | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
| EP0584238A1 (en) * | 1991-05-17 | 1994-03-02 | Chiron Corporation | INHIBITOR OF NF-$g(k)B TRANSCRIPTIONAL ACTIVATOR AND USES THEREOF |
| WO1992020778A1 (en) * | 1991-05-24 | 1992-11-26 | Kindconi Pty Limited | Biochemical reaction control |
| DK0519338T3 (da) | 1991-06-20 | 1996-10-28 | Hoffmann La Roche | Forbedrede fremgangsmåder til nukleinsyreamplifikation |
| CA2218875C (en) * | 1991-07-23 | 2000-11-07 | The Research Foundation Of State University Of New York | Improvements in the in situ pcr |
| FI915731A0 (fi) * | 1991-12-05 | 1991-12-05 | Derek Henry Potter | Foerfarande och anordning foer reglering av temperaturen i ett flertal prov. |
| US5348853A (en) * | 1991-12-16 | 1994-09-20 | Biotronics Corporation | Method for reducing non-specific priming in DNA amplification |
| US6033854A (en) * | 1991-12-16 | 2000-03-07 | Biotronics Corporation | Quantitative PCR using blocking oligonucleotides |
| US5567583A (en) * | 1991-12-16 | 1996-10-22 | Biotronics Corporation | Methods for reducing non-specific priming in DNA detection |
| ATE208658T1 (de) * | 1993-07-28 | 2001-11-15 | Pe Corp Ny | Vorrichtung und verfahren zur nukleinsäurevervielfältigung |
| CA2130013C (en) * | 1993-09-10 | 1999-03-30 | Rolf Moser | Apparatus for automatic performance of temperature cycles |
| CA2130517C (en) * | 1993-09-10 | 1999-10-05 | Walter Fassbind | Array of reaction containers for an apparatus for automatic performance of temperature cycles |
| US5597694A (en) * | 1993-10-07 | 1997-01-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Interspersed repetitive element-bubble amplification of nucleic acids |
| US5622822A (en) | 1994-09-13 | 1997-04-22 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Methods for capture and selective release of nucleic acids using polyethyleneimine and an anionic phosphate ester surfactant and amplification of same |
| US5582988A (en) | 1994-09-15 | 1996-12-10 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same |
| US5705366A (en) | 1994-09-15 | 1998-01-06 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor |
| GB9501234D0 (en) * | 1995-01-23 | 1995-03-15 | Marshall Biotech Ltd | Thermoregulator |
| PT912766E (pt) | 1996-06-04 | 2009-07-16 | Univ Utah Res Found | Monitorização da hibridização durante a pcr |
| US7133726B1 (en) | 1997-03-28 | 2006-11-07 | Applera Corporation | Thermal cycler for PCR |
| EP2090366B1 (en) * | 1997-03-28 | 2012-12-19 | Life Technologies Corporation | Improvements in thermal cycler for PCR |
| US6893877B2 (en) | 1998-01-12 | 2005-05-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for screening substances in a microwell array |
| EP1054056A4 (en) * | 1998-02-10 | 2006-10-04 | Toyo Kohan Co Ltd | APPARATUS FOR IMMOBILIZED GENOTHEQUE PREPARATION, APPARATUS FOR GENE AMPLIFICATION, TEMPERATURE CONTROL METHOD, AND METHOD FOR SYSTEMATIC COMPARISON OF GENES |
| CA2360748A1 (en) * | 1999-01-19 | 2000-07-27 | Larry Gold | Method and apparatus for the automated generation of nucleic acid ligands |
| AU756982B2 (en) | 1999-03-19 | 2003-01-30 | Life Technologies Corporation | Multi-through hole testing plate for high throughput screening |
| US7014994B1 (en) | 1999-03-19 | 2006-03-21 | Cornell Research Foundation,Inc. | Coupled polymerase chain reaction-restriction-endonuclease digestion-ligase detection reaction process |
| JP2001136954A (ja) * | 1999-08-31 | 2001-05-22 | Toshiba Corp | 核酸処理器及び核酸処理方法 |
| DE19946427C2 (de) * | 1999-09-28 | 2002-07-04 | Lange Gmbh Dr Bruno | Verfahren und Vorrichtung zum definierten gleichzeitigen Wärmebehandeln von mehreren Probenbehältern |
| DE29917313U1 (de) * | 1999-10-01 | 2001-02-15 | Mwg Biotech Ag | Vorrichtung zur Durchführung chemischer oder biologischer Reaktionen |
| CA2400644C (en) | 2000-02-18 | 2009-07-14 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Apparatus and methods for parallel processing of micro-volume liquid reactions |
| US7727479B2 (en) | 2000-09-29 | 2010-06-01 | Applied Biosystems, Llc | Device for the carrying out of chemical or biological reactions |
| WO2003000419A2 (en) * | 2001-06-21 | 2003-01-03 | Hybaid Limited | Sample well plate |
| GB0205455D0 (en) | 2002-03-07 | 2002-04-24 | Molecular Sensing Plc | Nucleic acid probes, their synthesis and use |
| US8277753B2 (en) | 2002-08-23 | 2012-10-02 | Life Technologies Corporation | Microfluidic transfer pin |
| EP1608952B1 (en) | 2002-12-20 | 2016-08-10 | Life Technologies Corporation | Assay apparatus and method using microfluidic arrays |
| US8676383B2 (en) | 2002-12-23 | 2014-03-18 | Applied Biosystems, Llc | Device for carrying out chemical or biological reactions |
| DE60319151T2 (de) * | 2003-03-31 | 2008-12-04 | Council Of Scientific And Industrial Research | Schnelles, hitze-vermitteltes verfahren für elisa |
| AU2005222618A1 (en) | 2004-03-12 | 2005-09-29 | Biotrove, Inc. | Nanoliter array loading |
| EP1710016A3 (en) | 2005-03-30 | 2011-03-30 | Roche Diagnostics GmbH | Device having a self sealing fluid port |
| DE602005021967D1 (de) | 2005-09-06 | 2010-08-05 | Roche Diagnostics Gmbh | Vorrichtung mit komprimierbarer Matrix und homogenem Strömungsprofil |
| US8232091B2 (en) | 2006-05-17 | 2012-07-31 | California Institute Of Technology | Thermal cycling system |
| US9133504B2 (en) | 2006-06-05 | 2015-09-15 | California Institute Of Technology | Real time microarrays |
| US11001881B2 (en) | 2006-08-24 | 2021-05-11 | California Institute Of Technology | Methods for detecting analytes |
| EP1886727A1 (en) | 2006-07-14 | 2008-02-13 | Roche Diagnostics GmbH | Analytical device |
| JP4918409B2 (ja) | 2006-07-26 | 2012-04-18 | 西川ゴム工業株式会社 | 核酸配列の増幅方法 |
| US11525156B2 (en) | 2006-07-28 | 2022-12-13 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US8048626B2 (en) | 2006-07-28 | 2011-11-01 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US11560588B2 (en) | 2006-08-24 | 2023-01-24 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| EP1962084A1 (en) | 2007-02-21 | 2008-08-27 | Roche Diagnostics GmbH | Apparatus for emitting and detecting beams of light |
| EP2127751B1 (en) | 2008-05-19 | 2012-05-16 | Roche Diagnostics GmbH | Improved cooler / heater arrangement with solid film lubricant |
| US8987685B2 (en) | 2009-09-09 | 2015-03-24 | Pcr Max Limited | Optical system for multiple reactions |
| SG184539A1 (en) | 2010-04-09 | 2012-11-29 | Life Technologies Corp | Improved thermal uniformity for thermal cycler instrumentation using dynamic control |
| US9376709B2 (en) | 2010-07-26 | 2016-06-28 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing DNA and RNA in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| EP2598661B1 (en) | 2010-07-26 | 2017-09-27 | Biomatrica, INC. | Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| US9725703B2 (en) | 2012-12-20 | 2017-08-08 | Biomatrica, Inc. | Formulations and methods for stabilizing PCR reagents |
| US20160214110A1 (en) | 2013-09-16 | 2016-07-28 | Life Technologies Corporation | Apparatuses, Systems and Methods for Providing Thermocycler Thermal Uniformity |
| KR20160123356A (ko) | 2014-02-18 | 2016-10-25 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 스케일러블 유전자증폭기를 제공하고 열전 장치를 격리시키기 위한 장치, 시스템 및 방법 |
| JP6661554B2 (ja) | 2014-06-10 | 2020-03-11 | バイオマトリカ，インク． | 周囲温度における血小板の安定化 |
| EP2985603A1 (en) | 2014-08-13 | 2016-02-17 | Yantai AusBio Laboratories Co., Ltd. | Method for carrying out a ligand binding assay and device for carrying out such a method |
| US9708647B2 (en) | 2015-03-23 | 2017-07-18 | Insilixa, Inc. | Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays |
| US9499861B1 (en) | 2015-09-10 | 2016-11-22 | Insilixa, Inc. | Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification |
| SG11201804776SA (en) | 2015-12-08 | 2018-07-30 | Biomatrica Inc | Reduction of erythrocyte sedimentation rate |
| WO2017155858A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-14 | Insilixa, Inc. | Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension |
| EP3937780A4 (en) | 2019-03-14 | 2022-12-07 | InSilixa, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR TIMED FLUORESCENCE-BASED DETECTION |
| CN113467539B (zh) * | 2021-06-09 | 2023-03-14 | 上海闻泰信息技术有限公司 | 基于余热回收的温控系统、控温方法和电子设备 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5526435A (en) * | 1978-08-16 | 1980-02-25 | Hitachi Ltd | Programmer |
| JPS59100905A (ja) * | 1982-12-01 | 1984-06-11 | Omron Tateisi Electronics Co | プログラム制御装置 |
| JPH0467957A (ja) * | 1990-07-09 | 1992-03-03 | Fujitsu Ltd | プリンタのインパクトドット印字ヘッド |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3505023A (en) * | 1967-11-13 | 1970-04-07 | Research Corp | Thermally conditioned spot plate |
| US3847200A (en) * | 1972-05-01 | 1974-11-12 | Brinkmann Instr Inc | Apparatus for concentrating laboratory specimens by evaporation |
| FR2360846A1 (fr) * | 1976-06-21 | 1978-03-03 | Luce Joseph | Etuve-refrigerateur a organe unique de chauffe et de refrigeration |
| FR2413708A1 (fr) * | 1977-12-30 | 1979-07-27 | Poudres & Explosifs Ste Nale | Procede et installation de regulation de la temperature d'un corps a partir d'un fluide |
| DD157983A3 (de) | 1980-08-19 | 1982-12-22 | Dieter Baumert | Anordnung zur aufschaltung einer stoergroesse fuer die regelung der heiz-u.kuehlleistung einer peltierbatterie eines thermostaten |
| DE3266735D1 (en) * | 1981-02-18 | 1985-11-14 | Eisai Co Ltd | An enzyme immuno-assay for simultaneously measuring a plurality of samples and test vessel for carrying out this method |
| JPS5875064A (ja) * | 1981-10-30 | 1983-05-06 | Eisai Co Ltd | 生化学的検査や免疫反応に用いられる測定装置 |
| DE3149624A1 (de) * | 1981-12-15 | 1983-06-23 | Georg 6050 Offenbach May | Vorrichtung zur regelung der temperatur von stoffen |
| DE3238535A1 (de) * | 1982-10-18 | 1984-04-19 | Planer Products Ltd., Sunbury-on-Thames, Middlesex | Verfahren und apparat zum gesteuerten kuehlen eines produktes |
| JPS59112254A (ja) * | 1982-12-20 | 1984-06-28 | Komatsu Electron Kk | 試料の加熱冷却装置 |
| US4683194A (en) * | 1984-05-29 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences |
| JPS6130597A (ja) * | 1984-07-20 | 1986-02-12 | Nippon Zeon Co Ltd | ポリヌクレオチド合成装置 |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| DK171161B1 (da) * | 1985-03-28 | 1996-07-08 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve |
| CA1339653C (en) * | 1986-02-25 | 1998-02-03 | Larry J. Johnson | Appartus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps |
-
1987
- 1987-01-30 CA CA000528641A patent/CA1339653C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-24 NZ NZ219388A patent/NZ219388A/xx unknown
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- 1987-02-25 JP JP62040524A patent/JP2613877B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-04-29 AU AU76092/91A patent/AU653932B2/en not_active Expired
-
1992
- 1992-12-30 GR GR92300087T patent/GR920300087T1/el unknown
-
1994
- 1994-12-07 JP JP6303979A patent/JPH07303468A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5526435A (en) * | 1978-08-16 | 1980-02-25 | Hitachi Ltd | Programmer |
| JPS59100905A (ja) * | 1982-12-01 | 1984-06-11 | Omron Tateisi Electronics Co | プログラム制御装置 |
| JPH0467957A (ja) * | 1990-07-09 | 1992-03-03 | Fujitsu Ltd | プリンタのインパクトドット印字ヘッド |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07303468A (ja) * | 1986-02-25 | 1995-11-21 | Perkin Elmer Corp:The | ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルを実施するための熱サイクリングシステム |
| JPH01197498A (ja) * | 1987-12-23 | 1989-08-09 | Orion Yhtymae Oy | 核酸の増幅のための装置、装置部およびその方法 |
| JPH03501211A (ja) * | 1988-06-24 | 1991-03-22 | アムジエン・インコーポレーテツド | 核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬 |
| JPH037571A (ja) * | 1989-02-03 | 1991-01-14 | Eastman Kodak Co | Ｐｃｒ用の封入キュベットおよびその使用方法 |
| JP2006262903A (ja) * | 1990-11-29 | 2006-10-05 | Applera Corp | 温度制御を用いたポリメラーゼ連鎖反応の自動実施装置 |
| JP2005519381A (ja) * | 2002-03-06 | 2005-06-30 | サムスン エレクトロニクス カンパニー リミテッド | 重合酵素連鎖反応（ｐｃｒ）チップを駆動するための温度制御方法及びその装置 |
| WO2009157353A1 (ja) * | 2008-06-23 | 2009-12-30 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析装置、自動分析装置、及び分析方法 |
| JP2010002353A (ja) * | 2008-06-23 | 2010-01-07 | Hitachi High-Technologies Corp | 核酸分析装置，自動分析装置、及び分析方法 |
| US8574891B2 (en) | 2008-06-23 | 2013-11-05 | Hitachi High-Technologies Corporation | Nucleic acid analyzer, automatic analyzer, and analysis method |
| JP2012502651A (ja) * | 2008-09-23 | 2012-02-02 | コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ | サーモサイクルデバイス |
| JP2014100145A (ja) * | 2013-12-18 | 2014-06-05 | Koninklijke Philips Nv | サーモサイクルデバイス |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3752057T2 (de) | 1997-09-25 |
| AU612316B2 (en) | 1991-07-11 |
| DK97887A (da) | 1987-08-26 |
| IE81124B1 (en) | 2000-03-22 |
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| AU6918087A (en) | 1987-08-27 |
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| IL103039A (en) | A method for amplifying the detection and / or cloning of specific sequences of nucleic acids by using an enzyme that was heat stable |
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