JPH037571A - Pcr用の封入キュベットおよびその使用方法 - Google Patents
Pcr用の封入キュベットおよびその使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明はPCR技術を利用して、核酸の増幅および検
出を、増幅された核酸を環境に露出することなく、実施
することができるキュベツト(cuve−tte)に関
する。
出を、増幅された核酸を環境に露出することなく、実施
することができるキュベツト(cuve−tte)に関
する。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)はDNA等の、単一の
細胞のように小さなものから頻繁に抽出される核酸材料
が数億という複製悔に増幅されるのを可能とする。これ
は、PCR技術の開発の前は、単一のDNAのストラン
ドを検出するということは夢にも考えられなかったこと
であるから、重要なことである。しかしながら、単一の
DNAストランド(例えば、ヒトの免疫欠陥ビールス(
HIVといい、AIDSを引き起すものとして知られて
いる))のDNAが選定されたDNAを増幅する増幅試
薬に加えられると、そのDNAの何億という複写物が比
較的に短期間のうちに得られる。それどころか、増幅さ
れた核酸材料(例えばDNA)の検出のため、選定され
た増幅材料にハイブリッダイズするプローブを使用する
ことを可能とし、そのようなプローブは固体支持体(例
えば、フィルタ膜)に固定若しくは固定可能にされてお
り、酵素もしくは他の成分を使用して検出するためラベ
ル(標識)を付けられている。
細胞のように小さなものから頻繁に抽出される核酸材料
が数億という複製悔に増幅されるのを可能とする。これ
は、PCR技術の開発の前は、単一のDNAのストラン
ドを検出するということは夢にも考えられなかったこと
であるから、重要なことである。しかしながら、単一の
DNAストランド(例えば、ヒトの免疫欠陥ビールス(
HIVといい、AIDSを引き起すものとして知られて
いる))のDNAが選定されたDNAを増幅する増幅試
薬に加えられると、そのDNAの何億という複写物が比
較的に短期間のうちに得られる。それどころか、増幅さ
れた核酸材料(例えばDNA)の検出のため、選定され
た増幅材料にハイブリッダイズするプローブを使用する
ことを可能とし、そのようなプローブは固体支持体(例
えば、フィルタ膜)に固定若しくは固定可能にされてお
り、酵素もしくは他の成分を使用して検出するためラベ
ル(標識)を付けられている。
通常はこれは、封止されたプラスチックコンテナ内で、
所望の数の複製が得られるまで、核酸材料を増幅するこ
とにより達成される。その後、キュベツトは封止を破る
ことに−より再度開けられ、増幅された複写体が取り出
され検知装置に送られるか、又は検知剤が増幅を行った
コンテナに印加され、検出は同一のコンテナ内で実施さ
れる。
所望の数の複製が得られるまで、核酸材料を増幅するこ
とにより達成される。その後、キュベツトは封止を破る
ことに−より再度開けられ、増幅された複写体が取り出
され検知装置に送られるか、又は検知剤が増幅を行った
コンテナに印加され、検出は同一のコンテナ内で実施さ
れる。
この方法はPCR技術を簡便に広範に使用するには不充
分であり、それはエーロゾルが開封若しくは流体の搬送
の過程で発生することによる。エーロゾルは増幅された
核酸材料(即ちDNA )を幾分含んでいる。そして、
エーロゾルは環境中に分散されることになる。環境中の
そのような微量の分子についてはあまり注意が払われて
いなかった。
分であり、それはエーロゾルが開封若しくは流体の搬送
の過程で発生することによる。エーロゾルは増幅された
核酸材料(即ちDNA )を幾分含んでいる。そして、
エーロゾルは環境中に分散されることになる。環境中の
そのような微量の分子についてはあまり注意が払われて
いなかった。
しかしながら、たった一つのDNA分子であっても検出
に未使用の他の増幅コンテナを破壊するおそれがある。
に未使用の他の増幅コンテナを破壊するおそれがある。
即ち、オペレータの不注意により、連出してきたDNA
分子が検査の未了のコンテンナに浮遊し、もしくは運ば
れて(ると、そのたった一つの分子が次の増幅を行わし
めるのに必要なりNAとなる。言うまでもないことであ
るが、次の試験のポイントで特定のDNAが存在してい
るのが(例えば旧Vの存在)分かったら・、そしてこれ
が連出DNAが原因であり、患者のそれが原因でないこ
とが分かっただけで、その試験は無駄になってしまうこ
とになる。即ち、DNA複製の能力が高いことが誤試験
の主たる原因となるのである。実際問題としてどの研究
施設でも、サンプルが既に増幅されたコンテナの封止が
されていないことが汚染の原因であることが認められて
いる。そのような問題は熟練度の高い人を使用し、エー
ロゾルの発生を最小となるように努力することで、避け
ることはできようが、そのような熟練労働が必要なこと
はこの技術を一般的な応用するためには障害となる。
分子が検査の未了のコンテンナに浮遊し、もしくは運ば
れて(ると、そのたった一つの分子が次の増幅を行わし
めるのに必要なりNAとなる。言うまでもないことであ
るが、次の試験のポイントで特定のDNAが存在してい
るのが(例えば旧Vの存在)分かったら・、そしてこれ
が連出DNAが原因であり、患者のそれが原因でないこ
とが分かっただけで、その試験は無駄になってしまうこ
とになる。即ち、DNA複製の能力が高いことが誤試験
の主たる原因となるのである。実際問題としてどの研究
施設でも、サンプルが既に増幅されたコンテナの封止が
されていないことが汚染の原因であることが認められて
いる。そのような問題は熟練度の高い人を使用し、エー
ロゾルの発生を最小となるように努力することで、避け
ることはできようが、そのような熟練労働が必要なこと
はこの技術を一般的な応用するためには障害となる。
従って、この発明の目的は、周囲の環境を汚染すること
なく核酸材料の増幅及び検出を行うことができる装置及
び方法を提供することにある。
なく核酸材料の増幅及び検出を行うことができる装置及
び方法を提供することにある。
この発明の他の目的は検知工程を自動化し、オペレータ
の介入の必要性を最小とすることにある。
の介入の必要性を最小とすることにある。
増幅した核酸材料を運搬したり、検知試薬を印加したる
することは自動化を困難とするものである。
することは自動化を困難とするものである。
この発明は次のことを基本解決原理とするもので、それ
は、どのような増幅核酸材料といえどもこれが逃れるこ
とができないようにキュベツトに増幅試薬及び増幅核酸
を閉じ込めておくことにより汚染を防止することができ
るということである。
は、どのような増幅核酸材料といえどもこれが逃れるこ
とができないようにキュベツトに増幅試薬及び増幅核酸
を閉じ込めておくことにより汚染を防止することができ
るということである。
更に特定すると、この発明の目的を達成する、この発明
の一つの実現形態である、核酸材料の増幅および検出を
実施するための閉鎖した、使いすて型のキュベツトは、
核酸材料と増幅試薬とを含宵した反応室を含んだ複数の
隔室と、約30℃から約95℃の範囲の温度を通じて前
記反応室の内容物を能動的に若しくは受動的に循環せし
める手段と、少なくとも一つの検出材料と共に使用する
ように前記反応室に近接して位置する少なくとも一つの
収納室と、圧力が反応室の内容物に印加されたときに前
記隔室を所定の順序で相互に流体的に連結する手段とを
具備しており、前記隔室は全てキュベツトの外側の位置
に対して流体に対して閉鎖されており、前記隔室の少な
くとも一つはその中の検出地点において増幅の後の検出
のため核酸材料を不動にするための手段を具備しており
、増幅された核酸の検出を増幅された核酸材料による他
のキュベツトもしくは装置の汚染なしに行うことができ
ることを特徴とする。この構成の効果は増幅した核酸材
料の検出を、濃縮された核酸材料によりコンテナもしく
は装置の汚染なしに、実行することができることである
。
の一つの実現形態である、核酸材料の増幅および検出を
実施するための閉鎖した、使いすて型のキュベツトは、
核酸材料と増幅試薬とを含宵した反応室を含んだ複数の
隔室と、約30℃から約95℃の範囲の温度を通じて前
記反応室の内容物を能動的に若しくは受動的に循環せし
める手段と、少なくとも一つの検出材料と共に使用する
ように前記反応室に近接して位置する少なくとも一つの
収納室と、圧力が反応室の内容物に印加されたときに前
記隔室を所定の順序で相互に流体的に連結する手段とを
具備しており、前記隔室は全てキュベツトの外側の位置
に対して流体に対して閉鎖されており、前記隔室の少な
くとも一つはその中の検出地点において増幅の後の検出
のため核酸材料を不動にするための手段を具備しており
、増幅された核酸の検出を増幅された核酸材料による他
のキュベツトもしくは装置の汚染なしに行うことができ
ることを特徴とする。この構成の効果は増幅した核酸材
料の検出を、濃縮された核酸材料によりコンテナもしく
は装置の汚染なしに、実行することができることである
。
上記において、この発明の目的を達成するため前記反応
室の試薬成分は核酸材料、ポリメラーゼ酵素、プライマ
ー核酸およびニュークレオチドより成る。
室の試薬成分は核酸材料、ポリメラーゼ酵素、プライマ
ー核酸およびニュークレオチドより成る。
この発明の目的を達成する、この発明の他の実現形態で
ある、DNAを増幅および検出する装置において、(1
)複数の隔室と、これを少なくとも一つの他の隔室に相
互に製造するための手段とを有するキュベツトを有し、
該キュベツトは(a)DNAストランドを増幅するため
の少なくとも一つの反応室と、(b)増幅されたDNA
を検出し、検出地点を具備する少なくとも一つの検出室
と、(c)検出された材料を増幅されたDNA−ストラ
ンドに伝達する手段とを備え、(ii)約30℃から約
90℃の温度範囲を通して反応室の内容物の積極的若し
くは受動的な循環を許容する手段を具備し、(iii)
増幅のためサンプルDNAを前記反応室に対する注入を
許容するため、前記少なくとも一つの反応室にのみ連結
される液体アクセス手段を具備し、(iv)サンプルD
NAの注入の後にDNAの通過に対して前記キュベツト
を遮断する手段を具備し、更に少くとも検出材料および
DNAストランドを検出室におよび検出部位に移動する
手段を具備する。一旦DNAサンプルが隔室に導入され
アクセス開口が閉鎖されると、隔室内の流体内容物は運
転者及び環境との接触が起こらないようにに増幅期間及
び検出反応の期間は拘束される。
ある、DNAを増幅および検出する装置において、(1
)複数の隔室と、これを少なくとも一つの他の隔室に相
互に製造するための手段とを有するキュベツトを有し、
該キュベツトは(a)DNAストランドを増幅するため
の少なくとも一つの反応室と、(b)増幅されたDNA
を検出し、検出地点を具備する少なくとも一つの検出室
と、(c)検出された材料を増幅されたDNA−ストラ
ンドに伝達する手段とを備え、(ii)約30℃から約
90℃の温度範囲を通して反応室の内容物の積極的若し
くは受動的な循環を許容する手段を具備し、(iii)
増幅のためサンプルDNAを前記反応室に対する注入を
許容するため、前記少なくとも一つの反応室にのみ連結
される液体アクセス手段を具備し、(iv)サンプルD
NAの注入の後にDNAの通過に対して前記キュベツト
を遮断する手段を具備し、更に少くとも検出材料および
DNAストランドを検出室におよび検出部位に移動する
手段を具備する。一旦DNAサンプルが隔室に導入され
アクセス開口が閉鎖されると、隔室内の流体内容物は運
転者及び環境との接触が起こらないようにに増幅期間及
び検出反応の期間は拘束される。
この発明の目的を達成する、更に別の実現形態である、
環境を汚染するエーロゾルが外部に流出することを許容
することなしに閉鎖キュベツトにおいて核酸材料を増幅
しかつ検出する方法は、(a)核酸材料のサンプルをキ
ュベツトに注入し、該キュベツトは、増幅試薬が存在−
する反応室と、検知材料と共に使用する収納室と、検知
地点を含む少なくとも一つの室とを含む多数の隔室並び
に流体の伝達を行わしめるため前記隔室を相互に連結す
る手段を具備し、(b)核酸材料を包含する前記キュベ
ツトの部分を恒久的に遮断し、全ての核酸をそのキュベ
ツトに封入し、(c)前記試薬が有効となる所定の温度
変化にわたってキュベツトを循環させることにより核酸
材料を増幅し、(d)増幅された核酸材料を前記反応室
から前記検知地点に流体的に搬送し、(e)検知材料を
前記検知点に流体提供に搬送し、並びに(f)前記地点
において増幅された核酸材料を前記検知材料と共に検出
し、同時に核酸材料は前記キュベツト中に封入維持する
ことを特徴とする。
環境を汚染するエーロゾルが外部に流出することを許容
することなしに閉鎖キュベツトにおいて核酸材料を増幅
しかつ検出する方法は、(a)核酸材料のサンプルをキ
ュベツトに注入し、該キュベツトは、増幅試薬が存在−
する反応室と、検知材料と共に使用する収納室と、検知
地点を含む少なくとも一つの室とを含む多数の隔室並び
に流体の伝達を行わしめるため前記隔室を相互に連結す
る手段を具備し、(b)核酸材料を包含する前記キュベ
ツトの部分を恒久的に遮断し、全ての核酸をそのキュベ
ツトに封入し、(c)前記試薬が有効となる所定の温度
変化にわたってキュベツトを循環させることにより核酸
材料を増幅し、(d)増幅された核酸材料を前記反応室
から前記検知地点に流体的に搬送し、(e)検知材料を
前記検知点に流体提供に搬送し、並びに(f)前記地点
において増幅された核酸材料を前記検知材料と共に検出
し、同時に核酸材料は前記キュベツト中に封入維持する
ことを特徴とする。
この発明を以下特に好ましい構造のキュベツトを使用し
てDNAの増幅及び検出をするPCR技術に使用する場
合について説明する。しかしながら、核酸の増幅のどの
ような方法に応用したとしても有効であり、いかなるキ
ュベツトであっても、どのようなソースからであっても
、増幅した核酸材料がいかなる構造かを問わずキュベツ
トから逃げるのを防止する装置若しくは方法である限り
は、どのようなソースからも核酸材料の増幅を行うこと
ができる。核酸材料は、例えば、プラスミド若しくはク
ローン化されたDNA若しくはRNA、又は天然のDN
A若しくはいかなるソースからであるとをとわずDNA
から得ることができ、そのようなソースとしてはバクテ
リア、イースト、ビールス、ビールスやバクテリアに侵
された細胞、植物若しくは動物である。DNA若しくは
RNAは血液若しくは組織の材料から抽出することがで
きる。転写に基ずく増幅と称され、PCR法は異なった
方法もこの発明の封入キュベツトの利益を享受すること
ができ、この転写に基ず(増幅方法は1989年1月の
米国の c Natl Aad ci 誌11
73−1177頁(Biochemistry)に記載
されである。
てDNAの増幅及び検出をするPCR技術に使用する場
合について説明する。しかしながら、核酸の増幅のどの
ような方法に応用したとしても有効であり、いかなるキ
ュベツトであっても、どのようなソースからであっても
、増幅した核酸材料がいかなる構造かを問わずキュベツ
トから逃げるのを防止する装置若しくは方法である限り
は、どのようなソースからも核酸材料の増幅を行うこと
ができる。核酸材料は、例えば、プラスミド若しくはク
ローン化されたDNA若しくはRNA、又は天然のDN
A若しくはいかなるソースからであるとをとわずDNA
から得ることができ、そのようなソースとしてはバクテ
リア、イースト、ビールス、ビールスやバクテリアに侵
された細胞、植物若しくは動物である。DNA若しくは
RNAは血液若しくは組織の材料から抽出することがで
きる。転写に基ずく増幅と称され、PCR法は異なった
方法もこの発明の封入キュベツトの利益を享受すること
ができ、この転写に基ず(増幅方法は1989年1月の
米国の c Natl Aad ci 誌11
73−1177頁(Biochemistry)に記載
されである。
」■肢歪
核酸増幅技術は一般的にいえば特定のプロトコルを介し
て進められている。最も有益なプロトコルは米国特許第
4.683.195号に示されるものである。半焼にい
うと、このプロトコルはDNAの増幅を次のステップか
ら行うものである。
て進められている。最も有益なプロトコルは米国特許第
4.683.195号に示されるものである。半焼にい
うと、このプロトコルはDNAの増幅を次のステップか
ら行うものである。
(1) 関心のある配列を持つ少なくとも一つの特定
の核酸を含有する候補となるサンプルを得る。
の核酸を含有する候補となるサンプルを得る。
(2) サンプルを変性させ、ストランドを分離する
。
。
(3) サンプルをプライマー、ポリメラーゼ等の延
長 酵素、核酸の複製に有益な増幅成分と接触させる。
長 酵素、核酸の複製に有益な増幅成分と接触させる。
(4) 上記2及び3のステップを必要な回数だけ繰
り返えす。
り返えす。
(5) 増幅されたDNAを検出する。
このクラスにおける好ましいプロトコルは次のようにな
っている。
っている。
(1) 適当な制限酵素を使用することにより完全な
りNA二重らせんを必要に応じてで化学的に切断し、関
心のある部分を分離する。
りNA二重らせんを必要に応じてで化学的に切断し、関
心のある部分を分離する。
(2) 分離された核酸の部分(ここではDNA)及
びニュークレオチドは加熱を受け、かつある時間(約1
0分より長くない時間)これを維持され、二つの核酸の
ストランドを変性させ、即ちこれらストランドをほどき
、分離し、テンプレートを形成する。
びニュークレオチドは加熱を受け、かつある時間(約1
0分より長くない時間)これを維持され、二つの核酸の
ストランドを変性させ、即ちこれらストランドをほどき
、分離し、テンプレートを形成する。
(3) それから溶液が30℃−60℃の範囲で冷却
され、プライマーをアニールし、もしくは二つの各テン
プレートストランドを結合する。このため溶液は“培養
”領域において適当な温度、例えば55℃1に約15秒
の間保持される。
され、プライマーをアニールし、もしくは二つの各テン
プレートストランドを結合する。このため溶液は“培養
”領域において適当な温度、例えば55℃1に約15秒
の間保持される。
(4) 次いで、溶液は加熱され70℃に維持され、
延長 酵素(好ましくは熱に安定なポリメラーゼ酵素)
は、そこに存在するデオキシリボニュークレオチドを使
用することで、プライマーの境界をテンプレートストラ
ンドまで延長せしめる。
延長 酵素(好ましくは熱に安定なポリメラーゼ酵素)
は、そこに存在するデオキシリボニュークレオチドを使
用することで、プライマーの境界をテンプレートストラ
ンドまで延長せしめる。
(5) 完成した新規なストランド対は再び92℃−
95℃に約10−15秒にわたって加熱を受けこの対は
分離せしめられる。
95℃に約10−15秒にわたって加熱を受けこの対は
分離せしめられる。
(6) ステップ(3)−(5)が適当な数のストラ
ンドが得られるまで何回も繰り返えされる。繰り返えし
が多いほど生成される核酸(ここではDNA)の増幅数
が多くなる。好ましい設定により、所望の濃度の核酸濃
度を最小時間で達成することができ、各サイクルが1秒
で起る。しかしながら、1サイクルを5分のように長い
時間で行うことができる。
ンドが得られるまで何回も繰り返えされる。繰り返えし
が多いほど生成される核酸(ここではDNA)の増幅数
が多くなる。好ましい設定により、所望の濃度の核酸濃
度を最小時間で達成することができ、各サイクルが1秒
で起る。しかしながら、1サイクルを5分のように長い
時間で行うことができる。
ここで使用されるプライマーという用語は天然にあるも
のであると、合成されたものであるとを問わず、オリゴ
ニュークレオチドのことであり、核酸ストランドに相補
的なプライマー延長生成物の合成が惹起される条件にお
かれたとき合成を開始する開始点として挙動することが
できるものである。そのような条件はニュークレオチド
(例えば4つの標準のデオキシリボニュークレオチドト
リフオスフェート)及びDNAポリメラーゼのような重
合試薬の存在と、適当な温度並びにpHが必要である。
のであると、合成されたものであるとを問わず、オリゴ
ニュークレオチドのことであり、核酸ストランドに相補
的なプライマー延長生成物の合成が惹起される条件にお
かれたとき合成を開始する開始点として挙動することが
できるものである。そのような条件はニュークレオチド
(例えば4つの標準のデオキシリボニュークレオチドト
リフオスフェート)及びDNAポリメラーゼのような重
合試薬の存在と、適当な温度並びにpHが必要である。
−船釣にいって、この発明において使用される各プライ
マーは15から40のニュークレオチドを具備しており
、そして好ましくは20から25のニュークレオチドを
具備している。
マーは15から40のニュークレオチドを具備しており
、そして好ましくは20から25のニュークレオチドを
具備している。
以上の全ては、キュベツト(cuvette)内で、約
30℃と95℃との間の温度の時間を使用して行われた
。この発明のキュベツートはPCR技術を技能者によっ
てその技能が低くても正確に日常的に行わしめる実質的
なアプローチを提供することにある。
30℃と95℃との間の温度の時間を使用して行われた
。この発明のキュベツートはPCR技術を技能者によっ
てその技能が低くても正確に日常的に行わしめる実質的
なアプローチを提供することにある。
この発明の完全な理解のため、この発明で実施されたP
CR技術の詳細をまず説明する。
CR技術の詳細をまず説明する。
どのようなりNAであっても数億回もの複製が実行され
る。適当なプライマー核酸ストランドを設定することに
より、最適条件の下で、選定されたDNAが第1に複製
されることを確保することができる。好ましくは、全て
のプライマーはキュベツトに組み込まれるときビオチン
化され、以下述べるように進行するのが検出される。今
はプライマーに付着される目標のDNAを延長酵素の存
在の下で加熱することにより選定されたDNAの複製を
具備する二重ストランドが生成される。かくして形成さ
れた新規な対は次に高温度の短時間の変性を行うことに
より分離される。これらは、一つの反応室で行われるが
、その際、プライマー、デオキシリボニュークレオチド
及び延長酵素がDNAに印加される予め組み込まれる試
薬としてか、又はサンプルの印加時に存在してい−るこ
とが必、要である。
る。適当なプライマー核酸ストランドを設定することに
より、最適条件の下で、選定されたDNAが第1に複製
されることを確保することができる。好ましくは、全て
のプライマーはキュベツトに組み込まれるときビオチン
化され、以下述べるように進行するのが検出される。今
はプライマーに付着される目標のDNAを延長酵素の存
在の下で加熱することにより選定されたDNAの複製を
具備する二重ストランドが生成される。かくして形成さ
れた新規な対は次に高温度の短時間の変性を行うことに
より分離される。これらは、一つの反応室で行われるが
、その際、プライマー、デオキシリボニュークレオチド
及び延長酵素がDNAに印加される予め組み込まれる試
薬としてか、又はサンプルの印加時に存在してい−るこ
とが必、要である。
組み込まれているとき、試薬は噴霧もしくは乾燥によっ
て印加することができ、ポリメラーゼ、塩基、バッファ
、安定剤、及び複製に必要なニュークレオチドが含めら
れる。
て印加することができ、ポリメラーゼ、塩基、バッファ
、安定剤、及び複製に必要なニュークレオチドが含めら
れる。
ポリメラーゼ酵素はそのソースに拘わらず有益である。
好ましくは、以後TAQと称するサーモスアクアテック
ス(thermus acuaticus)から天然に
製造されるもの、もしくはEPO公報第258.017
号に例えば記載されるように、遺伝学を下に工業的に作
られるどのような合成的な等個物とすることができる。
ス(thermus acuaticus)から天然に
製造されるもの、もしくはEPO公報第258.017
号に例えば記載されるように、遺伝学を下に工業的に作
られるどのような合成的な等個物とすることができる。
酵素の存在は熱循環を急速に行わせ、高温度での滞在時
間が短縮される必要があることに注意されたい。92℃
から95℃の変性温度は酵素の反応を停止する温度に近
く、長い加熱時間となる。
間が短縮される必要があることに注意されたい。92℃
から95℃の変性温度は酵素の反応を停止する温度に近
く、長い加熱時間となる。
その後、複製されたDNAが特定されるが、これはDN
Aを、適当な検出印加若しくは包含された検出室に移動
することによって行われる。公知技術では、複製された
[4Aのそのような“移動”ないしは検出プローブとし
ての試薬の添加によりDNAを含む反応室の再開放が必
要となり、上述のエーロゾルの問題を発生せしめる。こ
の検出方式では複製されたDNAストランドにニューク
レオチドの相補的な配列を介して接合することができる
通常の材料を使用している。そのような材料は検出点、
例えば検出室、でDNAをトラップしかつ保持するのに
使用される適当な手段を包含する。好ましくはそのよう
な手段はトラップされる膜ないしはビードの構造をもっ
ている。
Aを、適当な検出印加若しくは包含された検出室に移動
することによって行われる。公知技術では、複製された
[4Aのそのような“移動”ないしは検出プローブとし
ての試薬の添加によりDNAを含む反応室の再開放が必
要となり、上述のエーロゾルの問題を発生せしめる。こ
の検出方式では複製されたDNAストランドにニューク
レオチドの相補的な配列を介して接合することができる
通常の材料を使用している。そのような材料は検出点、
例えば検出室、でDNAをトラップしかつ保持するのに
使用される適当な手段を包含する。好ましくはそのよう
な手段はトラップされる膜ないしはビードの構造をもっ
ている。
検出においては一般的にいって固定材料および信号発生
材料が必要である。好ましくはDNAの複製に使用され
るプライマーはビオチン化が既にされており、不動材料
もしくは信号発生材料のどちらかに付着されるアビデイ
ンと反応することができる。もしアビデインがビードの
ような不動材料に付着されると(以後アビデイン−ビー
ド捕捉方法)検知プローブが複製されたプライマーとハ
イブリッダイズするニュークレオチド配列とともに使用
することができ、この複製プライマーは放射性となるこ
となどによって自・ら信号を発生しもしくは信号を発生
する試薬と反応する。例えば、いかなるものでもよいが
適当な信号発生成分に検出プローブは取り付けることが
でき、そのような信号発生成分としては、検知可能な信
号(例えば色変化)を生成する無色(leuko)染料
と反応することができる西洋ワサビパーオキシダーゼ仙
orseradish peroxidase)等の酵
素が好ましい。信号発生成分もしくは固定材料を3′も
しくは5°末端でプローブに付着させる技術は公知であ
る。例えば、Nucleic Re5earch誌、v
ol 15.5303頁(1987年)の”Effic
ient Methods for attachme
nt of Th[olProbe to the 3
’ End of 5ynthetic Oligod
eoxy−ribOnuCleOl 1des”という
文献である。この文献で述べられている5゛末端結合は
枝葉であり、つぎのもの、Analytical Bi
ochemistryのvol、 164、第336頁
(1987)の”Introduction of 5
’ TermminalFunctional Gro
ups、、、、、”だけが重要なものである。容易に明
らかなことは3゛もしくは5“端部のいずれもが不動材
料の信号発生成分に付着するのに使用できることである
。
材料が必要である。好ましくはDNAの複製に使用され
るプライマーはビオチン化が既にされており、不動材料
もしくは信号発生材料のどちらかに付着されるアビデイ
ンと反応することができる。もしアビデインがビードの
ような不動材料に付着されると(以後アビデイン−ビー
ド捕捉方法)検知プローブが複製されたプライマーとハ
イブリッダイズするニュークレオチド配列とともに使用
することができ、この複製プライマーは放射性となるこ
となどによって自・ら信号を発生しもしくは信号を発生
する試薬と反応する。例えば、いかなるものでもよいが
適当な信号発生成分に検出プローブは取り付けることが
でき、そのような信号発生成分としては、検知可能な信
号(例えば色変化)を生成する無色(leuko)染料
と反応することができる西洋ワサビパーオキシダーゼ仙
orseradish peroxidase)等の酵
素が好ましい。信号発生成分もしくは固定材料を3′も
しくは5°末端でプローブに付着させる技術は公知であ
る。例えば、Nucleic Re5earch誌、v
ol 15.5303頁(1987年)の”Effic
ient Methods for attachme
nt of Th[olProbe to the 3
’ End of 5ynthetic Oligod
eoxy−ribOnuCleOl 1des”という
文献である。この文献で述べられている5゛末端結合は
枝葉であり、つぎのもの、Analytical Bi
ochemistryのvol、 164、第336頁
(1987)の”Introduction of 5
’ TermminalFunctional Gro
ups、、、、、”だけが重要なものである。容易に明
らかなことは3゛もしくは5“端部のいずれもが不動材
料の信号発生成分に付着するのに使用できることである
。
ここに使用する“プローブという用語は、プライマーの
ようには挙動しないが、ハイブリッダイズ製造物を形成
するように一つ若しくはそれ以上の核酸の配列と実質的
に相補的となるように意図された、天然にある若しくは
合成されたオリゴノニュークレオチドのことをいう。さ
らに、プローブとは得られたハイブリット製造物の“捕
捉”もしくは“検出”のいずれをも−船釣には意図して
いる。
ようには挙動しないが、ハイブリッダイズ製造物を形成
するように一つ若しくはそれ以上の核酸の配列と実質的
に相補的となるように意図された、天然にある若しくは
合成されたオリゴノニュークレオチドのことをいう。さ
らに、プローブとは得られたハイブリット製造物の“捕
捉”もしくは“検出”のいずれをも−船釣には意図して
いる。
これとは別に、検出プローブおよび不動プローブは同一
のものとすることができ、前述のAnaly−tica
l Biochemistryの開示技術を使用して、
例えば5°末端だけに結合することができる。
のものとすることができ、前述のAnaly−tica
l Biochemistryの開示技術を使用して、
例えば5°末端だけに結合することができる。
上述のように、アビデインは、西洋ワサビパーオキシダ
ーゼ等の、以後“オリゴキャプチャー(oligo c
apture)”方法と称する信号発生材料に結合され
る。このような場合、DNAの固定化は好ましくは固定
プローブにより行われ、ここに固定プローブは、複製さ
れたビオチン化プライマーとハイブリッダイズするニュ
ークレオチド配列である固定プローブにより達成するの
が好ましく、そのような配列はポリマービードに結合さ
れる。
ーゼ等の、以後“オリゴキャプチャー(oligo c
apture)”方法と称する信号発生材料に結合され
る。このような場合、DNAの固定化は好ましくは固定
プローブにより行われ、ここに固定プローブは、複製さ
れたビオチン化プライマーとハイブリッダイズするニュ
ークレオチド配列である固定プローブにより達成するの
が好ましく、そのような配列はポリマービードに結合さ
れる。
かくして、ここに述べた“検出材料”とは複製された、
ビオチン化プライマー上のプローブを意味し、このプロ
ーブは検出可能な信号をそれ自体で発生するか、検知可
能な信号を生成するため試薬と反応するものである。こ
の後者の場合は検出材料はそのような試薬も含有する。
ビオチン化プライマー上のプローブを意味し、このプロ
ーブは検出可能な信号をそれ自体で発生するか、検知可
能な信号を生成するため試薬と反応するものである。こ
の後者の場合は検出材料はそのような試薬も含有する。
全の検出材料を含有したキュベツトは増幅をされたDN
Aと共に撹伴され若しくは振動され、混合を促進する。
Aと共に撹伴され若しくは振動され、混合を促進する。
目標DNAへのプローブのアニーリングは通常の温度循
環により達成される。
環により達成される。
DNAへのプローブのハイブリッダイズは、トランスフ
ァーに先立ちもしくはその後に検出地点(もしこれが設
けられていればの話であるが)に対して行われる。
ァーに先立ちもしくはその後に検出地点(もしこれが設
けられていればの話であるが)に対して行われる。
その後金の液体は検出地点から取り出される。
この点において検出材料のある程度は複製されたDNA
ストランドの一部であり、DNAは膜の表面によって補
足される。どんなりNAストランドでもこれを固定する
手段を欠如したものは膜を越えて通過してしまう。
ストランドの一部であり、DNAは膜の表面によって補
足される。どんなりNAストランドでもこれを固定する
手段を欠如したものは膜を越えて通過してしまう。
最終ステップは検出隔室に対して膜上に捕捉されたDN
Aストランドから突出する検知材料と反応することがで
きる無色染料もしくは他の染料前駆体を含有する検出隔
室に注入する。有益な無色染料としては、ポリ(ビニー
ルピロリドン)等の可溶性のポリマーと好ましくは組み
合せされる、米国特許第4.089.747号に説明さ
れるものがある。
Aストランドから突出する検知材料と反応することがで
きる無色染料もしくは他の染料前駆体を含有する検出隔
室に注入する。有益な無色染料としては、ポリ(ビニー
ルピロリドン)等の可溶性のポリマーと好ましくは組み
合せされる、米国特許第4.089.747号に説明さ
れるものがある。
染料の好ましい例は2−(4−ヒドロキシ−3,5−デ
メトキシフェニール)−4,5−ビス(4−メトキシフ
ェニール)イミダゾールであり、というのはこれは西洋
ワサビバーオキスダーゼの1分子に対して1000個の
染料分子を付加することができるからである。
メトキシフェニール)−4,5−ビス(4−メトキシフ
ェニール)イミダゾールであり、というのはこれは西洋
ワサビバーオキスダーゼの1分子に対して1000個の
染料分子を付加することができるからである。
上に述べたようにDNAはビード上においてプローブ結
合もしくはハイブリッダイズすることができる。ビード
は検出膜によって捕捉されるべく選定される。そのよう
なビードの有益な材料としてはDNAにハイブリッダイ
ズするアビデインもしくはプローブのどちらかに結合さ
れる有効な反応グループを持つどのようなポリマーをも
含むことができる。そのようなポリマー上の活性なハロ
ゲン原子、2−置換活性エチルスルフオニールもしくは
ビニルスルフオニール介したアビデインの通常の共有結
合が公知である。か(してm及びp−(2−クロロエチ
ルスルフォニールメチール)スチレンのコーポリマー等
がビードのために有効である。
合もしくはハイブリッダイズすることができる。ビード
は検出膜によって捕捉されるべく選定される。そのよう
なビードの有益な材料としてはDNAにハイブリッダイ
ズするアビデインもしくはプローブのどちらかに結合さ
れる有効な反応グループを持つどのようなポリマーをも
含むことができる。そのようなポリマー上の活性なハロ
ゲン原子、2−置換活性エチルスルフオニールもしくは
ビニルスルフオニール介したアビデインの通常の共有結
合が公知である。か(してm及びp−(2−クロロエチ
ルスルフォニールメチール)スチレンのコーポリマー等
がビードのために有効である。
上記の工程を実際的とするこの発明の二つの鍵となる点
がある。その第1は有効な熱伝達を使用し、反応室の内
容物が迅速に加熱され、それから迅速に冷却されるよう
にすることである。積極的もしくは受動的な加熱もしく
は冷却を行わしめる手段は、積極的もしくは受動的な循
環を行う場合には有効である。即ち。ベルチェ(Pel
itier)の装置を、該室を区切る熱伝達壁を提供す
るように反応室に取り付けることができる。しかしなが
ら、好ましくは、熱伝達は受動的な手段により達成する
ことができ、この場合は、熱伝達材料は反応室の主要平
面である。次いで、熱ソースもしくはシンク最も好まし
くはキュベラ斗の両面にある外部ソースから供給される
。
がある。その第1は有効な熱伝達を使用し、反応室の内
容物が迅速に加熱され、それから迅速に冷却されるよう
にすることである。積極的もしくは受動的な加熱もしく
は冷却を行わしめる手段は、積極的もしくは受動的な循
環を行う場合には有効である。即ち。ベルチェ(Pel
itier)の装置を、該室を区切る熱伝達壁を提供す
るように反応室に取り付けることができる。しかしなが
ら、好ましくは、熱伝達は受動的な手段により達成する
ことができ、この場合は、熱伝達材料は反応室の主要平
面である。次いで、熱ソースもしくはシンク最も好まし
くはキュベラ斗の両面にある外部ソースから供給される
。
第2の鍵となる点はキュベツトの隔室を増幅された核酸
が逃れるのを防止するように構成することである。即ち
、隔室は増幅の発生後は環境に対して漏曳しないように
シールする必要がある。好ましい構成は、隔室にDNA
の導入の前に全の試薬を予め組み込み、かつ固定手段に
よりDNAの導入の後の漏曳に対するキュベツトのロッ
クをする。
が逃れるのを防止するように構成することである。即ち
、隔室は増幅の発生後は環境に対して漏曳しないように
シールする必要がある。好ましい構成は、隔室にDNA
の導入の前に全の試薬を予め組み込み、かつ固定手段に
よりDNAの導入の後の漏曳に対するキュベツトのロッ
クをする。
この実施例では、好ましくは印加圧力を使用して閉鎖さ
れたキュベツト内における隔室間で液体連通せしめ、必
要な反応を得るための手段が設けられる。
れたキュベツト内における隔室間で液体連通せしめ、必
要な反応を得るための手段が設けられる。
1罰Ii
第1に好ましい熱伝達機構、即ち隔室の壁面による受動
的な熱伝達、を考慮すると、壁の材料は高い熱エネルギ
伝達係数を提供する所定の熱路長及び熱抵抗が得られる
ように選定される。最も好ましくは、そのような進路は
約0.3mmより大きくはなく1平方cmの断面積での
熱抵抗はワット当たり約5.0℃より太き(ない−。こ
れらの性質は熱伝達壁をプラスチック、もしくはプラス
チックおよび厚みが0.05mmのアルミニューム等の
金属のラミネートにより構成することにより容易に達成
さIIる。そのようなアルミニュームは厚みχ/(熱伝
導率に×表面積A)として計算される、約0.003”
C/wattとして計算される熱抵抗Rを具備してい
る。(これらの値は、約0.24℃/ワットの熱抵抗を
持つ同一の厚みの通常のグラスと対比することができる
。プラスチックは好ましくは熱シール可能なポリエステ
ル、例えばポリ(エチレンテレフタレート)、であり、
その片側もしくは両側に中間の密度のポリエチレンが被
覆してあり、好ましい厚みである0、 005cmで1
.06℃の熱抵抗を持っている。
的な熱伝達、を考慮すると、壁の材料は高い熱エネルギ
伝達係数を提供する所定の熱路長及び熱抵抗が得られる
ように選定される。最も好ましくは、そのような進路は
約0.3mmより大きくはなく1平方cmの断面積での
熱抵抗はワット当たり約5.0℃より太き(ない−。こ
れらの性質は熱伝達壁をプラスチック、もしくはプラス
チックおよび厚みが0.05mmのアルミニューム等の
金属のラミネートにより構成することにより容易に達成
さIIる。そのようなアルミニュームは厚みχ/(熱伝
導率に×表面積A)として計算される、約0.003”
C/wattとして計算される熱抵抗Rを具備してい
る。(これらの値は、約0.24℃/ワットの熱抵抗を
持つ同一の厚みの通常のグラスと対比することができる
。プラスチックは好ましくは熱シール可能なポリエステ
ル、例えばポリ(エチレンテレフタレート)、であり、
その片側もしくは両側に中間の密度のポリエチレンが被
覆してあり、好ましい厚みである0、 005cmで1
.06℃の熱抵抗を持っている。
熱伝達壁は適当などのような手段によっても他のキュベ
ラ平面に固定することができる。そのような手段の一つ
は初期接着剤(primiB adhesive)であ
り、これは例えば通常の高温度のアクリル系接着剤に通
常のポリエステル接着剤の層が継続したものである。こ
れらの層は熱伝達変速機の表面領域にわたって延びてお
り、そのような延長部はアルミニュームを使用している
場合はキュベツトの内部で起る反応と干渉することを防
止することができる。これとは別にプラスチック層をア
ルミニューム上に被覆することができる。
ラ平面に固定することができる。そのような手段の一つ
は初期接着剤(primiB adhesive)であ
り、これは例えば通常の高温度のアクリル系接着剤に通
常のポリエステル接着剤の層が継続したものである。こ
れらの層は熱伝達変速機の表面領域にわたって延びてお
り、そのような延長部はアルミニュームを使用している
場合はキュベツトの内部で起る反応と干渉することを防
止することができる。これとは別にプラスチック層をア
ルミニューム上に被覆することができる。
そのような熱搬送壁により構成されたキュベツトは約2
00μlの液体容積のために、約10秒より長くない熱
時定数(τ)を得ることができると分かった。最も好ま
しくはτが3−8秒の程度である。
00μlの液体容積のために、約10秒より長くない熱
時定数(τ)を得ることができると分かった。最も好ま
しくはτが3−8秒の程度である。
即ち、水で充たされたこのキュベツトが熱伝達壁の外部
に沿って加熱されるとき、かつその温度がその熱伝達壁
の他側の反応隔室の内部の点で計測されたとすると、熱
反応曲線を28℃から103.9℃の最終的温度まで発
生させることができる。
に沿って加熱されるとき、かつその温度がその熱伝達壁
の他側の反応隔室の内部の点で計測されたとすると、熱
反応曲線を28℃から103.9℃の最終的温度まで発
生させることができる。
その中の液体が76℃の温度(差(103,9−28)
の63%>に達するのに要する時間はτの値である。こ
れは良く知られた次の熱反応式(1)からほぼ得ること
ができる。
の63%>に達するのに要する時間はτの値である。こ
れは良く知られた次の熱反応式(1)からほぼ得ること
ができる。
温度T(t)・最終温度+(初期温度−最終温度) X
e −1/τ(1)かくして、その時間間隔tがτに
等しければ、e−1々#0.37となる。そのような場
合、t=τでのT(t)は初期温度の合計に(最終温度
−初期温度)の6Bをプラスしたものに等しい温度にな
る。そのような値からキュベツトにおける液体のための
τは3.5秒でなければないことが判明した。反応室内
のアルミニュームと液体の間の中間層を使用した好まし
い配置の場合、時定数τはキュベツト内の液体が水のと
きは10秒より依然として大きくない。
e −1/τ(1)かくして、その時間間隔tがτに
等しければ、e−1々#0.37となる。そのような場
合、t=τでのT(t)は初期温度の合計に(最終温度
−初期温度)の6Bをプラスしたものに等しい温度にな
る。そのような値からキュベツトにおける液体のための
τは3.5秒でなければないことが判明した。反応室内
のアルミニュームと液体の間の中間層を使用した好まし
い配置の場合、時定数τはキュベツト内の液体が水のと
きは10秒より依然として大きくない。
これとは別に熱源はデフォーカス(defocuse)
されたレーザとすることができる。熱伝達壁としての透
明なポリエステルを使用することはそのような場合に好
ましく、染料はレーザにとって適当な吸収波長を具備す
る反応隔室に組み込まれる。
されたレーザとすることができる。熱伝達壁としての透
明なポリエステルを使用することはそのような場合に好
ましく、染料はレーザにとって適当な吸収波長を具備す
る反応隔室に組み込まれる。
封入
この発明の他の特徴に目を向けると、増幅されたDNA
はキュベツト中に拘束しなければならないことである。
はキュベツト中に拘束しなければならないことである。
この実現のために増幅に必要な試薬(即ち、プライマー
ストランドであるデオキシリボニュークレオチドおよび
延長酵素)は核酸材料のサンプルの添加に先立ってもし
くは核酸材料がサンプルと一緒に添加されるに先立って
キュベツトに予め組み込まれるでいる。最も好ましくは
検出材料はサンプルの添加に先立って組み込まれ、サン
プルの添加後で増幅の前にキュベツトは漏曳に対して遮
断され、それ以上のアクセスの必要がない。しかしなが
ら、この代わりに、キュベツトに検出材料が以下の条件
の下に増幅のあとに収納室に印加されるのを許容するよ
うに構成してもよく、ここにその条件とは(1)検出材
料が印加される収納室は増幅に使用される反応室から分
離しなければならず、(2)収納室が試薬を増幅核酸に
供給するのを許容し、しかし増幅された核酸が収納室に
供給するのは禁止する一路チェック弁のような手段を設
ける必要がある。
ストランドであるデオキシリボニュークレオチドおよび
延長酵素)は核酸材料のサンプルの添加に先立ってもし
くは核酸材料がサンプルと一緒に添加されるに先立って
キュベツトに予め組み込まれるでいる。最も好ましくは
検出材料はサンプルの添加に先立って組み込まれ、サン
プルの添加後で増幅の前にキュベツトは漏曳に対して遮
断され、それ以上のアクセスの必要がない。しかしなが
ら、この代わりに、キュベツトに検出材料が以下の条件
の下に増幅のあとに収納室に印加されるのを許容するよ
うに構成してもよく、ここにその条件とは(1)検出材
料が印加される収納室は増幅に使用される反応室から分
離しなければならず、(2)収納室が試薬を増幅核酸に
供給するのを許容し、しかし増幅された核酸が収納室に
供給するのは禁止する一路チェック弁のような手段を設
ける必要がある。
この発明の別の特徴によれば、キュベツトは収納室と検
知室との連通を提供するための手段を具備している。一
つの実施例では、そのような連通手段は試薬を収納室か
ら検出地点、例えば分離した検出室に移動させるための
手段を具備する。そして最も好ましくは、この代わりに
、加圧手段をキュベツトの外部に設け、キュベツトの壁
面は外部から内部に圧力を伝達するのに充分な可撓性を
具備しており、キュベツトの内部で試薬の加圧および移
動が可能である。どのような外部圧力源でも使用可能で
あり、外部圧力源は、例えば、圧力ローラ若し空気シリ
ンダからのピストンである。
知室との連通を提供するための手段を具備している。一
つの実施例では、そのような連通手段は試薬を収納室か
ら検出地点、例えば分離した検出室に移動させるための
手段を具備する。そして最も好ましくは、この代わりに
、加圧手段をキュベツトの外部に設け、キュベツトの壁
面は外部から内部に圧力を伝達するのに充分な可撓性を
具備しており、キュベツトの内部で試薬の加圧および移
動が可能である。どのような外部圧力源でも使用可能で
あり、外部圧力源は、例えば、圧力ローラ若し空気シリ
ンダからのピストンである。
ユベ の
この発明のキュベツトlOの特徴はフレキシブルな隔室
(第1図)であり、この隔室は外部の加圧手段(例えば
、ローラ)と協働して、この発明の装置全体を構成する
。もっと特定すると、キュベツト10は二枚の薄いシー
ト12.14を具備し、このシートはモールディングに
より作られ、ポケットもしくは隔室に共に係合しかつ接
触するシート(第2図)の平面から突出する通路を接続
するようになっている。シートは少なくともその外周1
6において、好ましくは隔室もしくは通路を包囲する全
の点で、熱もしくは超音波圧着により合着されている。
(第1図)であり、この隔室は外部の加圧手段(例えば
、ローラ)と協働して、この発明の装置全体を構成する
。もっと特定すると、キュベツト10は二枚の薄いシー
ト12.14を具備し、このシートはモールディングに
より作られ、ポケットもしくは隔室に共に係合しかつ接
触するシート(第2図)の平面から突出する通路を接続
するようになっている。シートは少なくともその外周1
6において、好ましくは隔室もしくは通路を包囲する全
の点で、熱もしくは超音波圧着により合着されている。
熱応動型の接着剤、例えば、エチレンビニールアセテー
トがそのような接合に適している。液体注入孔22の−
ところはシール16が破れており例外となっており、こ
の孔22にピペット24が嵌合使用される。孔22はそ
こに延びる剛直な縁23(第4図)を持っており、その
内部にピペット24が着座する。
トがそのような接合に適している。液体注入孔22の−
ところはシール16が破れており例外となっており、こ
の孔22にピペット24が嵌合使用される。孔22はそ
こに延びる剛直な縁23(第4図)を持っており、その
内部にピペット24が着座する。
隔室は次のように構成される。隔室26は反応室であり
、必要に応じて、液状もしくは乾燥状の予め組み込まれ
る増幅試薬28を具備している(第2図)。隔室30(
第1図)予め組み込まれた試薬としての洗浄水を具備し
た第1の洗浄室としての収納室を具備する。隔室32は
収納室であり、予め組み込まれた検出材料の少なくとも
一つ、即ち増幅されたDNA 、に結合される相補的な
ニュークレオチドを末端に有するビオチン化プローブを
包含するとともに、信号発生成分、例えば前記した西洋
ワサビパーオキサイドに結合されるアビイデン等を包含
しているのが好ましい。収納室32は第2の洗浄水含有
収納室であり、収納室32の容積よりもっと大きい容積
を具備しているのが好ましい。収納室36は残りの検出
剤、例えばパーオキサイドと、ルーフ染料、例えば2−
(4−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニール)−
4,5−ビス(4−メトキシフェニール)イミダゾール
を、好ましくは安定剤としてのポリビニールピロリドン
との組み合せの形で具備している。収納室38は予め内
部に停止溶液を含有しており、これは過多の無色染料が
染料、例えばナトリウムアジドに変化されるのを防止す
るためである。
、必要に応じて、液状もしくは乾燥状の予め組み込まれ
る増幅試薬28を具備している(第2図)。隔室30(
第1図)予め組み込まれた試薬としての洗浄水を具備し
た第1の洗浄室としての収納室を具備する。隔室32は
収納室であり、予め組み込まれた検出材料の少なくとも
一つ、即ち増幅されたDNA 、に結合される相補的な
ニュークレオチドを末端に有するビオチン化プローブを
包含するとともに、信号発生成分、例えば前記した西洋
ワサビパーオキサイドに結合されるアビイデン等を包含
しているのが好ましい。収納室32は第2の洗浄水含有
収納室であり、収納室32の容積よりもっと大きい容積
を具備しているのが好ましい。収納室36は残りの検出
剤、例えばパーオキサイドと、ルーフ染料、例えば2−
(4−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニール)−
4,5−ビス(4−メトキシフェニール)イミダゾール
を、好ましくは安定剤としてのポリビニールピロリドン
との組み合せの形で具備している。収納室38は予め内
部に停止溶液を含有しており、これは過多の無色染料が
染料、例えばナトリウムアジドに変化されるのを防止す
るためである。
隔室40はこの実施例の前記した検知点(サイト)であ
り、隔室42は廃棄室であり、好ましくはは初期は収縮
しており、液体がその内部に圧送されるに従って膨張す
るようになっている。隔室42は隔室40と通路44を
介して連通ずる。必要に応じてであるが、−路チェック
弁(図示しない)を通路44に設けることができ、これ
は洗浄液が隔室40に逆流することにより不所望の背景
色が付(ことを防止している。
り、隔室42は廃棄室であり、好ましくはは初期は収縮
しており、液体がその内部に圧送されるに従って膨張す
るようになっている。隔室42は隔室40と通路44を
介して連通ずる。必要に応じてであるが、−路チェック
弁(図示しない)を通路44に設けることができ、これ
は洗浄液が隔室40に逆流することにより不所望の背景
色が付(ことを防止している。
相互連結は以下の通りである。通路21は注入開口22
を隔室26と接続じ、通路44は反応室26を検知室4
0と接続し、但し、46の箇所に一時的なシールが設け
られ、圧力がローラ60により発生されるまで、隔室2
6内に導入DNAをを維持する。通路48は隔室30を
、通路49は隔室32を、通路50は隔室34を、通路
52は隔室36を、通路54は隔室38を、夫々検出室
40に接続し、各通路は第2図のような一時的なシール
56を具備するのが好ましく、この−時的シールはロー
ラ60がシールを破るまで夫々の隔室からの流出を阻止
する。通路54は他の通路(48,4950及び52)
が接合される本線となる。
を隔室26と接続じ、通路44は反応室26を検知室4
0と接続し、但し、46の箇所に一時的なシールが設け
られ、圧力がローラ60により発生されるまで、隔室2
6内に導入DNAをを維持する。通路48は隔室30を
、通路49は隔室32を、通路50は隔室34を、通路
52は隔室36を、通路54は隔室38を、夫々検出室
40に接続し、各通路は第2図のような一時的なシール
56を具備するのが好ましく、この−時的シールはロー
ラ60がシールを破るまで夫々の隔室からの流出を阻止
する。通路54は他の通路(48,4950及び52)
が接合される本線となる。
前進するに従って各隔室は適当な順序で隔室40に向か
って排出される。即ち、第1に増幅されたDNAが隔室
40に圧送され、次に第1の洗浄液が、次に隔室32か
らの検出プローブが、それから第2の洗浄液が、次いで
無色染料溶液が、最後に停止溶液が圧送される。ある場
合には無色染料溶液からの染料の発生は暗所で行われ、
これは例えば染料が光によって退色する場合である。夫
々の通路は好ましくはローラにより圧搾されるように構
成され、即ち、進路Aにおいて矢印62に対していつも
直角より小さい角度をなすように構成する。
って排出される。即ち、第1に増幅されたDNAが隔室
40に圧送され、次に第1の洗浄液が、次に隔室32か
らの検出プローブが、それから第2の洗浄液が、次いで
無色染料溶液が、最後に停止溶液が圧送される。ある場
合には無色染料溶液からの染料の発生は暗所で行われ、
これは例えば染料が光によって退色する場合である。夫
々の通路は好ましくはローラにより圧搾されるように構
成され、即ち、進路Aにおいて矢印62に対していつも
直角より小さい角度をなすように構成する。
もしローラに対する角度が直角を形成するとすると、ロ
ーラは通路を圧搾することがなくその代わり通路の上を
飛び越でいまうことになろう。
ーラは通路を圧搾することがなくその代わり通路の上を
飛び越でいまうことになろう。
シート12および14の双方がローラ60により圧潰可
能であるということは本質的ではなく、その少なくとも
一方が170g/cmの圧力の下で圧潰可能であるだけ
でも良い。1500g/cmのように高い圧力も使用可
能である。第5図において、シート12は圧潰可能な比
較的フレキシブルなシート、例えば、熱シール可能なポ
リエステル(例えば3M社により製造された5coto
chpakTl′という商標の熱シール式の第229号
フィルムにて作られ、一方シート14はその可撓性はよ
り小さくかつ圧潰性も少なく、又はシート12と同一程
度のフレキシビリティを持たせることができる。
能であるということは本質的ではなく、その少なくとも
一方が170g/cmの圧力の下で圧潰可能であるだけ
でも良い。1500g/cmのように高い圧力も使用可
能である。第5図において、シート12は圧潰可能な比
較的フレキシブルなシート、例えば、熱シール可能なポ
リエステル(例えば3M社により製造された5coto
chpakTl′という商標の熱シール式の第229号
フィルムにて作られ、一方シート14はその可撓性はよ
り小さくかつ圧潰性も少なく、又はシート12と同一程
度のフレキシビリティを持たせることができる。
少なくとも隔室26についてはシート14は外側にアル
ミニューム箔のラミネート64(第5図)を有し、内側
にポリマー層66、好ましくはシート12のようなポリ
エステル層を具備している。
ミニューム箔のラミネート64(第5図)を有し、内側
にポリマー層66、好ましくはシート12のようなポリ
エステル層を具備している。
アルミニューム箔は好ましくは約0.0013cmと約
0、026cmの間の厚みを持ち、最も好ましくは厚み
は約0.005cmである。層S6は約0.0013c
mと約0.03cmの間の厚みを持ち、最も好ましくは
0.005Cmである。層66が存在している場合は隔
室26の熱進路長は約0.3mmより大きいことはなく
、熱抵抗は約5,0℃/wattを越えることがない。
0、026cmの間の厚みを持ち、最も好ましくは厚み
は約0.005cmである。層S6は約0.0013c
mと約0.03cmの間の厚みを持ち、最も好ましくは
0.005Cmである。層66が存在している場合は隔
室26の熱進路長は約0.3mmより大きいことはなく
、熱抵抗は約5,0℃/wattを越えることがない。
プラスチックの単一のシートとういラミネート構造の利
点は、隔室が一旦ローラによって圧潰されると、アルミ
ニュームは再度の膨脹の抵抗になることである。そのよ
うな膨脹が起るとすると下流の圧力で液体の逆流が起る
。この理由で、シート14はキュベツト10の全長にわ
たってラミネートを構成するのが好ましい。
点は、隔室が一旦ローラによって圧潰されると、アルミ
ニュームは再度の膨脹の抵抗になることである。そのよ
うな膨脹が起るとすると下流の圧力で液体の逆流が起る
。この理由で、シート14はキュベツト10の全長にわ
たってラミネートを構成するのが好ましい。
好ましくは、隔室から噴射された液体は、さらに下流に
ある他の隔室を排除するのに使用される通路に逆流しな
いようになグている。この目的を達成するために、ロー
ラ60が第1図の左側から右側に前進するとき、キュベ
ツトIOに向け下降する挟み手段が使用され、以下のよ
うに通路を挟着する。
ある他の隔室を排除するのに使用される通路に逆流しな
いようになグている。この目的を達成するために、ロー
ラ60が第1図の左側から右側に前進するとき、キュベ
ツトIOに向け下降する挟み手段が使用され、以下のよ
うに通路を挟着する。
ローラ60が隔室26を横切ったとき挟着は点P1にお
いて実行される。隔室30を横切って移動する際にピン
チングは点P2の箇所で実行され、同様に隔室32につ
いてはピンチングはP3の隔室で実行され、隔室34に
ついてはP4で、隔室36についてはピンチングはP5
において実行される。
いて実行される。隔室30を横切って移動する際にピン
チングは点P2の箇所で実行され、同様に隔室32につ
いてはピンチングはP3の隔室で実行され、隔室34に
ついてはP4で、隔室36についてはピンチングはP5
において実行される。
以上の代わりに予備洗浄室を第6図のように設けること
ができ、この室は全ての出口通路が第1に水で充填され
ることを確保し、その結果、上流の隔室が下流の隔室の
ための通路に対して逆流しな(なる。以前に説明された
と同一の部品は同一の番号を使用するが区別するためサ
フィックスAが付加される。
ができ、この室は全ての出口通路が第1に水で充填され
ることを確保し、その結果、上流の隔室が下流の隔室の
ための通路に対して逆流しな(なる。以前に説明された
と同一の部品は同一の番号を使用するが区別するためサ
フィックスAが付加される。
(以下余白)
第6図において、ローラ60が最初に出合う隔室は収納
隔室61であり、この隔室61は洗浄水を具備し、通路
62を介して共通配管54Aに洗浄水が排出される。残
りの通路44A、 48A、 49A、 50A及び5
2Aは前記と同様に夫々の隔室から接続される。
隔室61であり、この隔室61は洗浄水を具備し、通路
62を介して共通配管54Aに洗浄水が排出される。残
りの通路44A、 48A、 49A、 50A及び5
2Aは前記と同様に夫々の隔室から接続される。
注入通路21Aおよび開口22Aは隔室61のためにキ
ュベツト10Aの対抗側に配置される。隔室61および
通路62の機能はローラがこの隔室を圧潰したとき洗浄
水で全の隔室の通路を溢れさせさることである。したが
って、一連の各隔室がローラにより圧潰されたときに、
隔室26A内の増幅されたDNAが通路48a、 49
A、 50Aもしくは52Aのいづれにも押し込まれる
恐れはない。それは水がすでにそこに存在しているから
である。そのような水は各隔室の内容物を検出室に伝達
することに悪影響はない。
ュベツト10Aの対抗側に配置される。隔室61および
通路62の機能はローラがこの隔室を圧潰したとき洗浄
水で全の隔室の通路を溢れさせさることである。したが
って、一連の各隔室がローラにより圧潰されたときに、
隔室26A内の増幅されたDNAが通路48a、 49
A、 50Aもしくは52Aのいづれにも押し込まれる
恐れはない。それは水がすでにそこに存在しているから
である。そのような水は各隔室の内容物を検出室に伝達
することに悪影響はない。
隔室61はその付加的な利益として隔室32.36およ
び38内に収納された乾燥試薬の再構成を可能とするこ
とがある。即ち、各隔室の夫々の通路への出口を閉鎖す
る軽熱シールが省略され、これらの試薬がその隔室で乾
燥され、それから隔室61がローラ61によった加圧さ
れ、キュベツトに水を溢れさせた場合に、隔室61の水
は乾燥試薬を再構成する。その補助のためキュベツトを
必要に応じて振ることができる。この再構成ステップは
サンプルを反応室に注入の前、後もしくは反応室内での
増幅の前、後に起る。
び38内に収納された乾燥試薬の再構成を可能とするこ
とがある。即ち、各隔室の夫々の通路への出口を閉鎖す
る軽熱シールが省略され、これらの試薬がその隔室で乾
燥され、それから隔室61がローラ61によった加圧さ
れ、キュベツトに水を溢れさせた場合に、隔室61の水
は乾燥試薬を再構成する。その補助のためキュベツトを
必要に応じて振ることができる。この再構成ステップは
サンプルを反応室に注入の前、後もしくは反応室内での
増幅の前、後に起る。
上述の実施例は各隔室を逐次的に加圧することが特徴で
ある。しかしながら、挟みポイントP−P5を使用した
場合は全ての液体含有隔室を同時的に加圧することがが
できる。即ち、通路44を除いて出口通路を閉鎖するた
めP+−Psの全に圧力が印加した場合に圧力が全ての
隔室26.30.32.36及び38に同時的に(例え
ば適当に配置された空気ピストンによって)加わる。し
かしながら、通路44だけが閉塞されているため、増幅
されたDNAのみが伝達されることになる。次にポイン
トP1のみが開放され、洗浄流体が通路49を介して送
られ、このようにして挟みポイントP、が最終的に解放
されるに至る。注意すべきは印加圧力は液体を夫々の隔
室及び通路に閉じ込める縫い目の破裂に要する圧力より
小さいことである。 検出隔室40(第1.3図)は検
出部材39を具備する流通型隔室であり、この検出部材
39は支持シート41であり、同シート41上にパイル
43.43’ 、 43“および43”が配置される。
ある。しかしながら、挟みポイントP−P5を使用した
場合は全ての液体含有隔室を同時的に加圧することがが
できる。即ち、通路44を除いて出口通路を閉鎖するた
めP+−Psの全に圧力が印加した場合に圧力が全ての
隔室26.30.32.36及び38に同時的に(例え
ば適当に配置された空気ピストンによって)加わる。し
かしながら、通路44だけが閉塞されているため、増幅
されたDNAのみが伝達されることになる。次にポイン
トP1のみが開放され、洗浄流体が通路49を介して送
られ、このようにして挟みポイントP、が最終的に解放
されるに至る。注意すべきは印加圧力は液体を夫々の隔
室及び通路に閉じ込める縫い目の破裂に要する圧力より
小さいことである。 検出隔室40(第1.3図)は検
出部材39を具備する流通型隔室であり、この検出部材
39は支持シート41であり、同シート41上にパイル
43.43’ 、 43“および43”が配置される。
もしオリゴキャプチャー法が使用される場合は各パイル
はポリマービードより成り、そのビード上に上記したよ
うなプローブが不動に結合され、検出すべきDNAとハ
イブリッダイズされる。最も好ましくは各ビードは異な
ったDNAのための異なった検知プローブであり、もし
充分な異なったビードのパイル(例えば8から10)が
存在するとすれば、どのビードが隔室からの染料からの
色を変化せしめたかとついことを基づいた組織判別を実
行することができる。そのためのラテッスピードは普通
である。
はポリマービードより成り、そのビード上に上記したよ
うなプローブが不動に結合され、検出すべきDNAとハ
イブリッダイズされる。最も好ましくは各ビードは異な
ったDNAのための異なった検知プローブであり、もし
充分な異なったビードのパイル(例えば8から10)が
存在するとすれば、どのビードが隔室からの染料からの
色を変化せしめたかとついことを基づいた組織判別を実
行することができる。そのためのラテッスピードは普通
である。
シート41はビードのパイルに接合する材料から選定さ
れ、製造の間にデポジットされかつ乾燥されるとき所定
位置に保持される。有益な例としてはPa11社により
製造されるニトロセルロース、多孔性ナイロン膜であり
、最も好ましくはラテッスでコーティングした紙である
。そのようなラテッスコーティング紙は次のようなもの
である。即ち、中間値で紙の重量は約54g/am2で
約6.0mmの厚みであり、約8Bの硬材にて作られ、
紙の表面に糊付けされ、次いで平均約7g/cm”でラ
テッスがコーティングされ、コーティングはその成分と
して通常の工業用グレードのラテッス、20重ffi%
のNaOH1分散剤としてのTSPP、シリコンデイオ
キサイドおよびチタニウムデイオキサイド等の不透明材
、水溶性粘度(hydrasperse clay)お
よび残りの希釈水を具備する。
れ、製造の間にデポジットされかつ乾燥されるとき所定
位置に保持される。有益な例としてはPa11社により
製造されるニトロセルロース、多孔性ナイロン膜であり
、最も好ましくはラテッスでコーティングした紙である
。そのようなラテッスコーティング紙は次のようなもの
である。即ち、中間値で紙の重量は約54g/am2で
約6.0mmの厚みであり、約8Bの硬材にて作られ、
紙の表面に糊付けされ、次いで平均約7g/cm”でラ
テッスがコーティングされ、コーティングはその成分と
して通常の工業用グレードのラテッス、20重ffi%
のNaOH1分散剤としてのTSPP、シリコンデイオ
キサイドおよびチタニウムデイオキサイド等の不透明材
、水溶性粘度(hydrasperse clay)お
よび残りの希釈水を具備する。
シート12及び14は次のように準備され組立られる。
シート14は第1図、第2図に示すように形成された隔
室凹部を予め成型している。シート14を上下さかさと
し、カップを形成する凹部とともに、試薬が印加され、
ここに試薬とは乾燥試薬28及び隔室30.32.34
.36及び38への液体等である。次に、この時点で上
側シートであるシート12が第2図の26”で示す係合
凹みの箇所を除いて本質的に平担に重ねられる。それか
らこの二つのシートは、通路21と隔室26との接合点
を除き第1図の斜線をもって示す各隔室の外周で軽く合
体される。例えば、軽微な熱シールにより、各隔室の夫
々の流出通路に対する出口を含めたこれらの部分で二つ
のプラスチックシートを合体することができる。これは
導入時に隔室から流出する液体に対する一時的なブロッ
クとなり、このブロックはローラ60が印加されるとき
は破られる。
室凹部を予め成型している。シート14を上下さかさと
し、カップを形成する凹部とともに、試薬が印加され、
ここに試薬とは乾燥試薬28及び隔室30.32.34
.36及び38への液体等である。次に、この時点で上
側シートであるシート12が第2図の26”で示す係合
凹みの箇所を除いて本質的に平担に重ねられる。それか
らこの二つのシートは、通路21と隔室26との接合点
を除き第1図の斜線をもって示す各隔室の外周で軽く合
体される。例えば、軽微な熱シールにより、各隔室の夫
々の流出通路に対する出口を含めたこれらの部分で二つ
のプラスチックシートを合体することができる。これは
導入時に隔室から流出する液体に対する一時的なブロッ
クとなり、このブロックはローラ60が印加されるとき
は破られる。
(このような−時的なブロックは第2図の通路48゜4
9、52及び54の断面において破線として現れており
、液体が隔室から圧送され、この−時的なシールに導か
れたとき分離する箇所を表している。)その後に、強固
なシール(熱シール)が各隔室およびその流出通路の周
囲において加えられ、しか−しながら隔室に対する通路
の接合部を横断するようにはシールは行われないように
配慮されている。外周にも熱シールがされる。隔室の周
囲のシールは、隔室から押し出された液体が夫々の通路
に沿ってのみ流れ、シート12と14との間の他の部分
には流れないことを補償するものである。
9、52及び54の断面において破線として現れており
、液体が隔室から圧送され、この−時的なシールに導か
れたとき分離する箇所を表している。)その後に、強固
なシール(熱シール)が各隔室およびその流出通路の周
囲において加えられ、しか−しながら隔室に対する通路
の接合部を横断するようにはシールは行われないように
配慮されている。外周にも熱シールがされる。隔室の周
囲のシールは、隔室から押し出された液体が夫々の通路
に沿ってのみ流れ、シート12と14との間の他の部分
には流れないことを補償するものである。
キュベツト10を使用する場合は患者サンプル5は孔2
2のピペット24を介して第5図の隔室26に注入され
る。これは凹んだ部分26′ が飛び出し、第2図の破
線、第5図の実線で示すシート12の残りの部分と面一
となるに至る。
2のピペット24を介して第5図の隔室26に注入され
る。これは凹んだ部分26′ が飛び出し、第2図の破
線、第5図の実線で示すシート12の残りの部分と面一
となるに至る。
その代わりに部分26° はシート12の休止平面を越
えて飛び出し、第19図に示す対向膨張部26”を形成
させることができる。さらに、第19図に示すようにシ
ート12及び14は金属的な成分もしくは層を全く持た
ず、全体をプラスチックによって構成することができる
。即ち、プラスチックだけでもプラスチック相当は充分
な熱伝達速度を提供することができる。
えて飛び出し、第19図に示す対向膨張部26”を形成
させることができる。さらに、第19図に示すようにシ
ート12及び14は金属的な成分もしくは層を全く持た
ず、全体をプラスチックによって構成することができる
。即ち、プラスチックだけでもプラスチック相当は充分
な熱伝達速度を提供することができる。
本質的なことは第1図および第4図の開口22は、増幅
ステップに先立ってピペット24が引き抜かれた後に閉
鎖可能であることである。これは閉鎖された開口を熱シ
ールする、開口を適当な方法(例えば強固なシール機能
を持った熱シールストリップ12及び14による)、も
しくは図示しない−路弁をもったリム23を構成するこ
とによって行うことができる。孔22を熱シールする場
合はリム23はシールすることができ、ピペット24は
単にこの孔に直接的に押し込むことができる。どのよう
なモードの閉鎖手段が採用されたとしてもPCR増幅も
しく−は液体搬送の間に形成されるどのような圧力にも
有効に抵抗できるものでなければならない。熱シールは
好ましい方法である。
ステップに先立ってピペット24が引き抜かれた後に閉
鎖可能であることである。これは閉鎖された開口を熱シ
ールする、開口を適当な方法(例えば強固なシール機能
を持った熱シールストリップ12及び14による)、も
しくは図示しない−路弁をもったリム23を構成するこ
とによって行うことができる。孔22を熱シールする場
合はリム23はシールすることができ、ピペット24は
単にこの孔に直接的に押し込むことができる。どのよう
なモードの閉鎖手段が採用されたとしてもPCR増幅も
しく−は液体搬送の間に形成されるどのような圧力にも
有効に抵抗できるものでなければならない。熱シールは
好ましい方法である。
上記のように、加熱および冷却により必要な熱PCR循
環が好ましくは隔室26で一つもしくは双方のストリッ
プ12および14を加熱することによって起る。
環が好ましくは隔室26で一つもしくは双方のストリッ
プ12および14を加熱することによって起る。
増幅されたDNAが隔室40に侵入するとき、DNAは
そこに短い時間保持され、一方熱はストリップ14を介
して印加され、ハイブリッダイズが行われる。好ましく
はストリップ14は隔室40で透明であり、適当な波長
の放射(可視波長光)の伝達を許容し、内容物の試験が
可能となる。隔室42は膨脹することにより液体流入流
束及び空気流入流束を収容するよう膨脹することができ
る。
そこに短い時間保持され、一方熱はストリップ14を介
して印加され、ハイブリッダイズが行われる。好ましく
はストリップ14は隔室40で透明であり、適当な波長
の放射(可視波長光)の伝達を許容し、内容物の試験が
可能となる。隔室42は膨脹することにより液体流入流
束及び空気流入流束を収容するよう膨脹することができ
る。
予め使用の前に膨脹されているからである。その代わり
に、キュベツトを処理するのに使用される器具に真空プ
レートを具備せしめることができ、これは無駄容積が必
要な場合にバキュームによって隔室42を第3図に示す
ような膨張形状に成形する。
に、キュベツトを処理するのに使用される器具に真空プ
レートを具備せしめることができ、これは無駄容積が必
要な場合にバキュームによって隔室42を第3図に示す
ような膨張形状に成形する。
増幅の際およびその後に全の隔室30−38が雰囲気か
らシールされていることは(第7図、第8図)もし増幅
されたDNAが逆流によって隔室に侵入することを防止
できるように構成されている限りは本質的なことではな
い。以前に説明したのと同様な部品は同一の参照番号と
し、区別のためのサフィックスBが追加されている。
らシールされていることは(第7図、第8図)もし増幅
されたDNAが逆流によって隔室に侵入することを防止
できるように構成されている限りは本質的なことではな
い。以前に説明したのと同様な部品は同一の参照番号と
し、区別のためのサフィックスBが追加されている。
即ち、キュベツトIOBは全て前と同様に隔室268、
30B、 32B、 34B、 38B、 40B及−
び42Bを具備し、その通路はこれらの隔室を相互に連
結し、前と同様に機能する。しかしながら、各隔室はそ
の周囲において液体注入量ロア0を具備し、連結通路7
2と共に雰囲気から夫々の隔室に対する流体通路を提供
する。このような構成により、DNAの増幅のときに隔
室26Bだけが液体、即ちサンプルDNAと増幅試薬と
を具備する。(その注入開口22Bはこの時点では閉鎖
される。)他の隔室は開いたままとすることができる。
30B、 32B、 34B、 38B、 40B及−
び42Bを具備し、その通路はこれらの隔室を相互に連
結し、前と同様に機能する。しかしながら、各隔室はそ
の周囲において液体注入量ロア0を具備し、連結通路7
2と共に雰囲気から夫々の隔室に対する流体通路を提供
する。このような構成により、DNAの増幅のときに隔
室26Bだけが液体、即ちサンプルDNAと増幅試薬と
を具備する。(その注入開口22Bはこの時点では閉鎖
される。)他の隔室は開いたままとすることができる。
それは−時的な熱シールがその出口通路との接合点で形
成されることによる。
成されることによる。
付加的な安全策として、チエツク弁80が通路54Bに
設けられ、DNAがこれらの隔室に逆流するのを防止す
ることができる。そのようなバルブは通常のものであり
、例えば、第8図に示すようにシート82と、ボール8
4とを具備し、このボールが上流に押し戻されると、シ
ート82上に着座し、流れを止める。ボール82はフリ
ーであるが小さなストッパ86に突き当たるまで動くこ
とができる。
設けられ、DNAがこれらの隔室に逆流するのを防止す
ることができる。そのようなバルブは通常のものであり
、例えば、第8図に示すようにシート82と、ボール8
4とを具備し、このボールが上流に押し戻されると、シ
ート82上に着座し、流れを止める。ボール82はフリ
ーであるが小さなストッパ86に突き当たるまで動くこ
とができる。
バルブ80は本線上に位置するのが好ましく、それはこ
れにより一つのバルブで全ての収納室をまかなうことが
できるからであり、かつ進路Aから外れており、加圧ロ
ーラの進行に対する障害とな何らならないのである。
れにより一つのバルブで全ての収納室をまかなうことが
できるからであり、かつ進路Aから外れており、加圧ロ
ーラの進行に対する障害とな何らならないのである。
各収納隔室がその適当な液体をピペット(第6図)から
受は取った後で、加圧ローラが進路へを移動する前に、
各開ロア0は開口22Aの場合と同様に密閉される。こ
れとは別に開ロア0は予め組み込まれる全ての試薬を充
填するのに使用することができる。
受は取った後で、加圧ローラが進路へを移動する前に、
各開ロア0は開口22Aの場合と同様に密閉される。こ
れとは別に開ロア0は予め組み込まれる全ての試薬を充
填するのに使用することができる。
他の残りの実施例では、隔室の圧潰可能なフレキシブル
壁の代替として、増幅されたDNA及び検出材料等を含
む液体を移動させるため(もしくは全ての隔室を流体的
に相互に手段は適当な隔室を形成するため)ピストン室
内にピストンが設けられる。即ち、ピストンは隔室のフ
レキシブル壁の等個物である。
壁の代替として、増幅されたDNA及び検出材料等を含
む液体を移動させるため(もしくは全ての隔室を流体的
に相互に手段は適当な隔室を形成するため)ピストン室
内にピストンが設けられる。即ち、ピストンは隔室のフ
レキシブル壁の等個物である。
即ち、第9−12図において、キュベツト100(第9
図)は熱伝達壁114(第10図)を具備する反応隔室
126と、検出材料収納室132(第9図)と、洗浄液
収納隔室134と、無色染料収納室136と、停止液収
納室138と、ほかの洗浄液収納室139と、夫々の隔
室に導く通路144.149.150.152.154
及び156とを具備する。平面114は前の実施例と同
様に構成するのが好ましい。各隔室はピストン室とじて
機能し、各室には隔室内の試薬の外側に配置される夫々
のピストン113 もしくは115がある。好ましくは
、ピストンは図示のように二重シール型でありその隔室
用の駆動アクチュエータ(図示しない)と確実係合する
スロット(図示しない)のごとき手段を具備している。
図)は熱伝達壁114(第10図)を具備する反応隔室
126と、検出材料収納室132(第9図)と、洗浄液
収納隔室134と、無色染料収納室136と、停止液収
納室138と、ほかの洗浄液収納室139と、夫々の隔
室に導く通路144.149.150.152.154
及び156とを具備する。平面114は前の実施例と同
様に構成するのが好ましい。各隔室はピストン室とじて
機能し、各室には隔室内の試薬の外側に配置される夫々
のピストン113 もしくは115がある。好ましくは
、ピストンは図示のように二重シール型でありその隔室
用の駆動アクチュエータ(図示しない)と確実係合する
スロット(図示しない)のごとき手段を具備している。
そして、通路149及び150は第9及び12図の隔室
126と通路151を形成するように接続している。流
入DNAサンプルは、外部肩部123を具備する液体侵
入開口122から通路121を介して隔室126にも供
給される。
126と通路151を形成するように接続している。流
入DNAサンプルは、外部肩部123を具備する液体侵
入開口122から通路121を介して隔室126にも供
給される。
通路152.154及び156は第12図で示すように
通路155で合体接続され、この通路155に通路14
4は隔室126からの供給を行う。通路155はそれか
ら隔室140への通路157肩部123内の159の点
で流出する通気通路を構成する−ように分岐する。肩部
123は内部にねじ(図示しない)を切っており、外ね
じを切ったストッパを受は取ることができ、その結果双
方の流入開口122及び通気開口159はストッパによ
りシールされる。
通路155で合体接続され、この通路155に通路14
4は隔室126からの供給を行う。通路155はそれか
ら隔室140への通路157肩部123内の159の点
で流出する通気通路を構成する−ように分岐する。肩部
123は内部にねじ(図示しない)を切っており、外ね
じを切ったストッパを受は取ることができ、その結果双
方の流入開口122及び通気開口159はストッパによ
りシールされる。
膨脹のためのフレキシブルな平面は存在しないので、別
のピストンチャンバ182 とピストン184とが設け
られ、検知隔室140(第9.10及び12図)からの
空気の膨脹を可能としている。チャンバ182は通路1
85を介して隔室140の底部に接続される。これはそ
のチャンバ内の手動引き抜きピストン184により行う
ことができる。ステム187はピストン184から突出
しており、そのピストンを引き出すのが容易になる。
のピストンチャンバ182 とピストン184とが設け
られ、検知隔室140(第9.10及び12図)からの
空気の膨脹を可能としている。チャンバ182は通路1
85を介して隔室140の底部に接続される。これはそ
のチャンバ内の手動引き抜きピストン184により行う
ことができる。ステム187はピストン184から突出
しており、そのピストンを引き出すのが容易になる。
第9図に着目すると、流通室140は上部190を具備
し、流体が他の隔室に搬送されるときにこの上部に最初
に流体が流入され、更に流通室140は下部192(第
10図)を具備し、この下部192は通気性の膜194
によって上部から分離される。下部192は吸収剤19
4によって実質的に実質的されていて、隔室140に流
入する過剰液体は全て吸収することができる。膜194
は成型、製織、もしくは電気光学的切削による微粒透過
膜であるのが好ましい。どのような適当な材料も吸収剤
として使用可能であるが、例えばセルロースアセテート
がある。
し、流体が他の隔室に搬送されるときにこの上部に最初
に流体が流入され、更に流通室140は下部192(第
10図)を具備し、この下部192は通気性の膜194
によって上部から分離される。下部192は吸収剤19
4によって実質的に実質的されていて、隔室140に流
入する過剰液体は全て吸収することができる。膜194
は成型、製織、もしくは電気光学的切削による微粒透過
膜であるのが好ましい。どのような適当な材料も吸収剤
として使用可能であるが、例えばセルロースアセテート
がある。
膜194はDNAにハイブリッダイズされたものからフ
リーな未反応の検出ラベルを分離するのを助けるもので
ある。即ち、隔室132内の検出プローブは、一旦液体
が隔室140に到達すれば隔室126内の増幅されたD
NAをハイブリッダイズすると共に膜194に(もしく
は膜にトラップされたビードに)係合される。そのよう
なプローブは西洋わさびパーオキシダーゼのようなラベ
ルを具備しており、これらの材料が隔室140に到達す
る無色染料と反応して過酸化物を形成する。隔室132
.134136及び138の充填は液体を印加し、それ
からピストンを挿入することにより達成される。その代
わりに予めパッケージとしたアンプルが挿入され、次い
でピストンが挿入される。アンプルは脆弱に作られてい
るのでアンプルは破断し、液体は放出される。
リーな未反応の検出ラベルを分離するのを助けるもので
ある。即ち、隔室132内の検出プローブは、一旦液体
が隔室140に到達すれば隔室126内の増幅されたD
NAをハイブリッダイズすると共に膜194に(もしく
は膜にトラップされたビードに)係合される。そのよう
なプローブは西洋わさびパーオキシダーゼのようなラベ
ルを具備しており、これらの材料が隔室140に到達す
る無色染料と反応して過酸化物を形成する。隔室132
.134136及び138の充填は液体を印加し、それ
からピストンを挿入することにより達成される。その代
わりに予めパッケージとしたアンプルが挿入され、次い
でピストンが挿入される。アンプルは脆弱に作られてい
るのでアンプルは破断し、液体は放出される。
キュベツト内での液体の伝達は全てピストン113、1
15及び184により制御され、ピストン184は他の
ピストンが前進するのを許容するバキュームを発生する
のに使用される。
15及び184により制御され、ピストン184は他の
ピストンが前進するのを許容するバキュームを発生する
のに使用される。
この代わりに、図示しないが、付加的な隔室およびそれ
に関連するピストンが具備され、付加的な酵素を隔室1
26に供給し、変性ステップによる酵素のどのような非
活性化に対してもより大量の酵素を追加することにより
対向することができる。
に関連するピストンが具備され、付加的な酵素を隔室1
26に供給し、変性ステップによる酵素のどのような非
活性化に対してもより大量の酵素を追加することにより
対向することができる。
キュベツト100は次にように使用される。最初にピス
トンは第9図の図示のように位置され、サンプルDNA
はピペットを介して開口122に導入される。通路12
1を通過するときにサンプルは隔室126に入り、隔室
126には増幅試薬がすでに存在しているかDNAと共
に増幅試薬が導入される。通気開口159及び通路15
5は隔室126内の空気が前進する液体により押し出さ
れるのを許容する。以後、ストッパが肩部123に挿入
され、開口122及び159をシールする。熱循環が所
望のDNAの増幅が達成されるまで熱伝達壁114を介
して行われる。
トンは第9図の図示のように位置され、サンプルDNA
はピペットを介して開口122に導入される。通路12
1を通過するときにサンプルは隔室126に入り、隔室
126には増幅試薬がすでに存在しているかDNAと共
に増幅試薬が導入される。通気開口159及び通路15
5は隔室126内の空気が前進する液体により押し出さ
れるのを許容する。以後、ストッパが肩部123に挿入
され、開口122及び159をシールする。熱循環が所
望のDNAの増幅が達成されるまで熱伝達壁114を介
して行われる。
このポイントまでピストンは動かない。
次に隔室132のピストン113が前進され、隔室13
2の検出材料を隔室126に押し出す。即ち、アビデイ
ン−ビード捕捉方法の場合は、隔室126の内容物は好
ましくはポリマービードを具備し、ポリマービードにア
ビデインを介してビオチン化プライマーが係合されてお
り、このビオチン化プライマーはアニーリングステップ
において増幅されたDNAと共に延長することができ、
これにより増幅されたDNAの複製を行う。隔室はまた
検出プローブを具備し、検出プローブはニュークレオチ
ドであり、西洋わさびパーオキシダーゼのような試薬と
結合してハイブリッダイズするように構成される。隔室
134からの洗浄液はピストン115により押圧され、
必要であれば全ての検出試薬が隔室126に存在するこ
とを補償する。それから混合が通常の手段によりキュベ
ツト全体を撹伴することにより行われる。検出プローブ
はそれから隔室12B内で通常のステップにしたがって
熱制御を壁面114を介して42℃で例えば5分間行う
ことにより増幅DNAにハイブリッダイズされる。
2の検出材料を隔室126に押し出す。即ち、アビデイ
ン−ビード捕捉方法の場合は、隔室126の内容物は好
ましくはポリマービードを具備し、ポリマービードにア
ビデインを介してビオチン化プライマーが係合されてお
り、このビオチン化プライマーはアニーリングステップ
において増幅されたDNAと共に延長することができ、
これにより増幅されたDNAの複製を行う。隔室はまた
検出プローブを具備し、検出プローブはニュークレオチ
ドであり、西洋わさびパーオキシダーゼのような試薬と
結合してハイブリッダイズするように構成される。隔室
134からの洗浄液はピストン115により押圧され、
必要であれば全ての検出試薬が隔室126に存在するこ
とを補償する。それから混合が通常の手段によりキュベ
ツト全体を撹伴することにより行われる。検出プローブ
はそれから隔室12B内で通常のステップにしたがって
熱制御を壁面114を介して42℃で例えば5分間行う
ことにより増幅DNAにハイブリッダイズされる。
次に、付加的な洗浄溶液が隔室134から押圧され、ハ
イブリッダイズされた液体を隔室126から検出室に押
し流す。またピストン115は隔室139から通路15
6および155を通して押し流すように前進され、通路
155に依然残留しているハイブリッダイズされた流体
を隔室140に押し流し、通路144における残留され
たハイブリッダイズ流体を次に来る無色染料から分離す
る。充分な洗浄液が隔室126及び140を通され、全
ての材料、トラップ手段に結合されなかったフリーな検
出プローブ等が膜194を通して吸収剤196に通過さ
れる。この洗浄ステップにおいてはピストン184は引
っ込む必要があり、これは背圧が隔室126から隔室1
40への液体の搬送に抵抗することを防止するものであ
る。
イブリッダイズされた液体を隔室126から検出室に押
し流す。またピストン115は隔室139から通路15
6および155を通して押し流すように前進され、通路
155に依然残留しているハイブリッダイズされた流体
を隔室140に押し流し、通路144における残留され
たハイブリッダイズ流体を次に来る無色染料から分離す
る。充分な洗浄液が隔室126及び140を通され、全
ての材料、トラップ手段に結合されなかったフリーな検
出プローブ等が膜194を通して吸収剤196に通過さ
れる。この洗浄ステップにおいてはピストン184は引
っ込む必要があり、これは背圧が隔室126から隔室1
40への液体の搬送に抵抗することを防止するものであ
る。
次に、隔室136の第1の無色染料が、次いで隔室13
8のストッパ溶液が夫々のピストン113を前進させる
ことにより通路155および157に、それから隔室1
40に運ばれる。これは、適当なりNAがそこに存在し
ているとすれば、膜194で適当な染料を形成せしめる
。(もし存在していない場合は、フリーな検出材料は全
て既に吸収剤196に押し流されていることから、色は
全く形成されることがなく、試験は否定的な表示を行う
ことになる。)検出箇所を構成するために別体の検出隔
室を特に設ける必要は本質的にはない。次の実施例に関
して説明するように、検出サイトは反応室と同居するこ
とができる。前に説明したと同様の部品は同一の参照番
号を付すものとし、区別のためサフィックスCを付ける
ものとする。
8のストッパ溶液が夫々のピストン113を前進させる
ことにより通路155および157に、それから隔室1
40に運ばれる。これは、適当なりNAがそこに存在し
ているとすれば、膜194で適当な染料を形成せしめる
。(もし存在していない場合は、フリーな検出材料は全
て既に吸収剤196に押し流されていることから、色は
全く形成されることがなく、試験は否定的な表示を行う
ことになる。)検出箇所を構成するために別体の検出隔
室を特に設ける必要は本質的にはない。次の実施例に関
して説明するように、検出サイトは反応室と同居するこ
とができる。前に説明したと同様の部品は同一の参照番
号を付すものとし、区別のためサフィックスCを付ける
ものとする。
第13図において、キュベツト100Cは隔室126c
。
。
132c、 134C,138C,138c及びこれら
の隔室への又は隔室からの、さらには流入開口122c
からの通路を以前と同様に具備する。ピストン113c
、 115C,184Cは前と同様に同様の工程で得ら
れるDNAの増幅の後の液体の搬送に使用される。しか
しながら、隔室132cは検出試薬として磁性充填剤を
含有するポリマーから形成される磁性ビードを具備して
おり、符号したDNA連鎖を持つハイブリッダイズ材料
がこの磁性充填剤に結合される。これは、増幅されたD
NAの一端等にハイブリッダイズさせるためのものであ
る。増幅DNAの他端は前述のように西洋わさびパーオ
キシダーゼを担持した検出プローブにハイブリッダイズ
させるためのものである。
の隔室への又は隔室からの、さらには流入開口122c
からの通路を以前と同様に具備する。ピストン113c
、 115C,184Cは前と同様に同様の工程で得ら
れるDNAの増幅の後の液体の搬送に使用される。しか
しながら、隔室132cは検出試薬として磁性充填剤を
含有するポリマーから形成される磁性ビードを具備して
おり、符号したDNA連鎖を持つハイブリッダイズ材料
がこの磁性充填剤に結合される。これは、増幅されたD
NAの一端等にハイブリッダイズさせるためのものであ
る。増幅DNAの他端は前述のように西洋わさびパーオ
キシダーゼを担持した検出プローブにハイブリッダイズ
させるためのものである。
この実施例では、DNAに未だハイブリッダイズされて
いないフリーな検出プローブをハイブリッダイズされた
ものから分離するため次のことが行われる。洗浄溶液が
隔室134Cから注入されたとき磁場が隔室126Cの
下側に印加され、ビード試薬および増幅DNAにハイブ
リッダイズされる検出プローブを保持する。これはフリ
ーな検出プローブ及びそれらのラベルを隔室126Cか
ら隔室182Cに押し流し、隔室182Cではピストン
184Cは収縮し、そのための室を形成する。磁場は維
持され、無色染料およびストッパ液体が運びこまれ、反
応室である隔室126C内に増幅DNAが存在するので
あれば色が生成される。
いないフリーな検出プローブをハイブリッダイズされた
ものから分離するため次のことが行われる。洗浄溶液が
隔室134Cから注入されたとき磁場が隔室126Cの
下側に印加され、ビード試薬および増幅DNAにハイブ
リッダイズされる検出プローブを保持する。これはフリ
ーな検出プローブ及びそれらのラベルを隔室126Cか
ら隔室182Cに押し流し、隔室182Cではピストン
184Cは収縮し、そのための室を形成する。磁場は維
持され、無色染料およびストッパ液体が運びこまれ、反
応室である隔室126C内に増幅DNAが存在するので
あれば色が生成される。
第8−12図のキュベツトの代わりの他の実施例として
、隔室132.134.138.182もしくはそのC
を付した対応部分が延長され、その結果これらの隔室は
キュベツトにL字型を付与する第8図の平面(図示しな
い)から90°突出する。このような配置はモールドの
構造及び製造を単基にする利点がある。
、隔室132.134.138.182もしくはそのC
を付した対応部分が延長され、その結果これらの隔室は
キュベツトにL字型を付与する第8図の平面(図示しな
い)から90°突出する。このような配置はモールドの
構造及び製造を単基にする利点がある。
この発明のキュベツトにおいてセル内でDNAを抽出す
ることがキュベツトの使用に先立った段階で抽出する代
わりに可能である。このような場合はキュベツトは第1
4図のように構成するのが好ましい。以前に説明したの
と同様な部品は同一の番号を付するものとし、区別する
ためサフィックスDを付する。
ることがキュベツトの使用に先立った段階で抽出する代
わりに可能である。このような場合はキュベツトは第1
4図のように構成するのが好ましい。以前に説明したの
と同様な部品は同一の番号を付するものとし、区別する
ためサフィックスDを付する。
キュベツト10DDは前と同様の隔室126D、 13
2D。
2D。
134d、 1380を具備しており、かつピストン1
13Dが収納室内において使用される。肩部1230は
液体流入間口1220を保護し、検出は以前と全て同様
であり膜(図示しない)のところで行われる。しかしな
がら、通路121Dはピペットにて注入されたサンプル
を反応室である隔室126Dに搬送する代わりに、サン
プルを抽出隔室200に搬送する。この場合の液体サン
プルはそのままの血液もしくは血液細胞であり、これら
のサンプルからDNAの抽出が行われる。液体サンプル
がキュベツトに印加される時点において、以下説明する
抽出剤がオプション的に印加することができる。この代
わりに抽出剤を隔室200に予め組み込みすることがで
きる。
13Dが収納室内において使用される。肩部1230は
液体流入間口1220を保護し、検出は以前と全て同様
であり膜(図示しない)のところで行われる。しかしな
がら、通路121Dはピペットにて注入されたサンプル
を反応室である隔室126Dに搬送する代わりに、サン
プルを抽出隔室200に搬送する。この場合の液体サン
プルはそのままの血液もしくは血液細胞であり、これら
のサンプルからDNAの抽出が行われる。液体サンプル
がキュベツトに印加される時点において、以下説明する
抽出剤がオプション的に印加することができる。この代
わりに抽出剤を隔室200に予め組み込みすることがで
きる。
他の類似の隔室と同様にピストン113Dが隔室200
に使用され、但し、異なったところは、図示のように完
全に引っ込むことができ、導入されるサンプルのために
最大の空間を付与することができる。通路121Dはピ
ストン113Dの直下のポイント201で隔室200に
入る。
に使用され、但し、異なったところは、図示のように完
全に引っ込むことができ、導入されるサンプルのために
最大の空間を付与することができる。通路121Dはピ
ストン113Dの直下のポイント201で隔室200に
入る。
隔室200の対向端202で通路204は中間室206
に流体的に接続され、この室206に隔室126Dへの
液体が通過するフィルタ208が配置される。フィルタ
208の孔寸法はフィルタ内の細胞の断片を保持するが
抽出されたDNAは通過させるような寸法とする。例え
ば、フィルタを、約0.45ミクロンの孔寸法のナイロ
ンもしくはポリプロピレンにて形成することが特に好ま
しい。
に流体的に接続され、この室206に隔室126Dへの
液体が通過するフィルタ208が配置される。フィルタ
208の孔寸法はフィルタ内の細胞の断片を保持するが
抽出されたDNAは通過させるような寸法とする。例え
ば、フィルタを、約0.45ミクロンの孔寸法のナイロ
ンもしくはポリプロピレンにて形成することが特に好ま
しい。
隔室206から通路210は抽出されたDNA及び溶媒
(例えば水)を隔室126Dに運ぶ。
(例えば水)を隔室126Dに運ぶ。
使用時に、液体サンプルは隔室200に好ましくは抽出
剤と一緒に注入される。どのようなりNA抽出プロトコ
ルも表面活性材のような共有抽出剤と共に使用すること
ができる。最も好ましいものは溶液を約5分に渡り95
℃の温度まで単純に加熱することである。そのような加
熱は蛋白質を変性し、細胞を分離するのに有効である。
剤と一緒に注入される。どのようなりNA抽出プロトコ
ルも表面活性材のような共有抽出剤と共に使用すること
ができる。最も好ましいものは溶液を約5分に渡り95
℃の温度まで単純に加熱することである。そのような加
熱は蛋白質を変性し、細胞を分離するのに有効である。
この抽出方法の補助としてデキストランが必要に応じ3
重量パーセント、10重量パーセントのTX−1oo溶
液と共に印加され、ここにTX−100はRoh++
−and Haas社から入手することができる非イオ
ン性の表面活性剤である。隔室200の加熱は、アルミ
ニュームから隔室の平面の少なくとも一部220を構成
することによってより一層急速に行うことができる。こ
のアルミニュームはキュベツトの底部外側(別の表面と
しては図示してない)まで延びている。隔室200に近
接してキュベツトの底面に熱を印加することにより隔室
200を有効に加熱することができる。
重量パーセント、10重量パーセントのTX−1oo溶
液と共に印加され、ここにTX−100はRoh++
−and Haas社から入手することができる非イオ
ン性の表面活性剤である。隔室200の加熱は、アルミ
ニュームから隔室の平面の少なくとも一部220を構成
することによってより一層急速に行うことができる。こ
のアルミニュームはキュベツトの底部外側(別の表面と
しては図示してない)まで延びている。隔室200に近
接してキュベツトの底面に熱を印加することにより隔室
200を有効に加熱することができる。
適当な培養期間の経過の後に、隔室200の内容物はピ
ストン113Dを前進することによりフィルタ208に
押し込まれる。
ストン113Dを前進することによりフィルタ208に
押し込まれる。
ある場合には、検出室において積極的若しくは消極的な
制御を選定されたDNAの検出サイトに沿って行うこと
が好ましいことがある。第15.16図はこのことを行
う変形例を図示する。以前に説明したのと同様の部品は
同一の参照番号を使用するものとし、区別のためサフィ
ックスEを付す。
制御を選定されたDNAの検出サイトに沿って行うこと
が好ましいことがある。第15.16図はこのことを行
う変形例を図示する。以前に説明したのと同様の部品は
同一の参照番号を使用するものとし、区別のためサフィ
ックスEを付す。
第15図において、以前と同様にキュベツト100Eは
隔室126E、 136E、 138E、 182Eを
具備し、加えて、適当なピストン184E等を具備する
。通路121Eは開口122Eから反応室126Eに液
体サンプルに運び、通路151Eは液体をその隔室に運
搬する。ビオチン化されたプライマーは適当な位置から
運ばれ、無色染料及びストッパ溶液は検出サイトに導か
れる通路157Eに通路157Eを介して搬送される。
隔室126E、 136E、 138E、 182Eを
具備し、加えて、適当なピストン184E等を具備する
。通路121Eは開口122Eから反応室126Eに液
体サンプルに運び、通路151Eは液体をその隔室に運
搬する。ビオチン化されたプライマーは適当な位置から
運ばれ、無色染料及びストッパ溶液は検出サイトに導か
れる通路157Eに通路157Eを介して搬送される。
通路144Eは隔室126Eに生成されるDNA生成物
にその通路155E、 157Eでアクセスせしめるた
めのものである。
にその通路155E、 157Eでアクセスせしめるた
めのものである。
通路157Eから来る液体は吸収剤196E(第16図
)に接触するように配置される検出膜194Eと出合い
、これは前の実施例と同様である。
)に接触するように配置される検出膜194Eと出合い
、これは前の実施例と同様である。
しかしながら、前の実施例と特に異なっているのはサン
プルDNA検出のため膜194Eに別の領域Sがあり、
正の制御のため“+”の符号が負の制御のため“−”の
符号が付されている。正の制御の目的は DNAが存在
している場合に試薬がDNAの信号(好ましくは色)を
発生することを補償し、即ち使用者に、“)”領域で信
号を発生するのに失敗したということからいずれにして
も試薬が欠陥があるということを知らしめることができ
る。負の制御の目的はサンプル色を比較すべき背景色を
使用者に知らしめることである。即ち何らかの理由によ
り試薬内において背景色の変化が起り、正の読み取りが
その試験の結果であると決定する前にサンプル色は密度
がこれより有意に大きくすることができる点で重要であ
る。
プルDNA検出のため膜194Eに別の領域Sがあり、
正の制御のため“+”の符号が負の制御のため“−”の
符号が付されている。正の制御の目的は DNAが存在
している場合に試薬がDNAの信号(好ましくは色)を
発生することを補償し、即ち使用者に、“)”領域で信
号を発生するのに失敗したということからいずれにして
も試薬が欠陥があるということを知らしめることができ
る。負の制御の目的はサンプル色を比較すべき背景色を
使用者に知らしめることである。即ち何らかの理由によ
り試薬内において背景色の変化が起り、正の読み取りが
その試験の結果であると決定する前にサンプル色は密度
がこれより有意に大きくすることができる点で重要であ
る。
これを行うための幾つかの′方法がある。第15゜16
図の実施例では使用された実施例はアビデイン−ビード
キャプチャーである。この方法の特徴はビードに供給結
合されたアビデインもしくはストレプトアビデイン(s
treptavidin)、ビオチン化プライマー、検
出材料の一部としてのラベルを付けたプローブを使用す
ることである。好ましくは、少なくともプローブは収納
隔室250.252.254に保持される。各隔室は単
一タイプの検出プローブに割り当てられており、隔室2
50はサンプルDNAプローブ、252負の制御プロー
ブ、254正の制御プローブを具備する。ピストン26
0は夫々の隔室を好ましくは同時に加圧するのに使用さ
れ、その内容物を、夫々の通路262.264.266
を介して、各プローブ及び各プローブ通路に関連する検
知室268゜270、272に付勢するものである。か
くして、各検出室は内部にそのプローブのみ有し、ほか
の二つは全く持たない。
図の実施例では使用された実施例はアビデイン−ビード
キャプチャーである。この方法の特徴はビードに供給結
合されたアビデインもしくはストレプトアビデイン(s
treptavidin)、ビオチン化プライマー、検
出材料の一部としてのラベルを付けたプローブを使用す
ることである。好ましくは、少なくともプローブは収納
隔室250.252.254に保持される。各隔室は単
一タイプの検出プローブに割り当てられており、隔室2
50はサンプルDNAプローブ、252負の制御プロー
ブ、254正の制御プローブを具備する。ピストン26
0は夫々の隔室を好ましくは同時に加圧するのに使用さ
れ、その内容物を、夫々の通路262.264.266
を介して、各プローブ及び各プローブ通路に関連する検
知室268゜270、272に付勢するものである。か
くして、各検出室は内部にそのプローブのみ有し、ほか
の二つは全く持たない。
増幅されたDNA及び他の試薬の全ての3つの検出隔室
に対して供給を行うため、通路157Eは好ましくは3
のブランチ274.276、278に分離され、これら
のブランチは検出隔室と接続される。
に対して供給を行うため、通路157Eは好ましくは3
のブランチ274.276、278に分離され、これら
のブランチは検出隔室と接続される。
容易に理解することができようが3つのうちの二つのプ
ローブは適当なりNAと相補的な遺伝学的材料を持つ。
ローブは適当なりNAと相補的な遺伝学的材料を持つ。
サンプルのためのプローブはサンプルの目標DNAの遺
伝学的な相補物である。正のプローブは常に存在するD
NA材料のだめの遺伝学的相補物であり、少なくとも血
液細胞の場合はベーターグロビンである。負のプローブ
はサンプルから未知の増幅DNAと合う遺伝学的相補物
である。これを最も容易に行うのはプローブ相補物をそ
の遺伝学的符号が連鎖においてランダムであり、無意味
コードを構成することである。
伝学的な相補物である。正のプローブは常に存在するD
NA材料のだめの遺伝学的相補物であり、少なくとも血
液細胞の場合はベーターグロビンである。負のプローブ
はサンプルから未知の増幅DNAと合う遺伝学的相補物
である。これを最も容易に行うのはプローブ相補物をそ
の遺伝学的符号が連鎖においてランダムであり、無意味
コードを構成することである。
以上のことから容易に理解することができようが、この
プロセスは以下のように行われる。アビデイン担持ビー
ドは好ましくは隔室250.25.2及び254に収納
される。増幅されたDNAは通路274゜276、27
8を介して夫々の検出膜してに供給され、ピストン26
0は前進され、適当なプローブおよびビードを検出室に
押し出す。これらの隔室は適当に加熱され、増幅された
DNAは特に隔室268及び272において隔室250
および254から適当なプローブにハイブリッダイズれ
る。好ましくは、検出室270にはハイブリッダイズが
起らない。それは負の制御プローブと反応する無意味D
NAが存在すべきでないからである。その後、洗浄溶液
が検出隔室を介して押圧され、膜194Eを通して未ハ
イブリッダイズのラベルされた即ちビードに結合しない
プローブを吸収剤196Hに押し流す。この押し流しの
後に無色染料液との接触ついでストッパ溶液との接触が
行われる。
プロセスは以下のように行われる。アビデイン担持ビー
ドは好ましくは隔室250.25.2及び254に収納
される。増幅されたDNAは通路274゜276、27
8を介して夫々の検出膜してに供給され、ピストン26
0は前進され、適当なプローブおよびビードを検出室に
押し出す。これらの隔室は適当に加熱され、増幅された
DNAは特に隔室268及び272において隔室250
および254から適当なプローブにハイブリッダイズれ
る。好ましくは、検出室270にはハイブリッダイズが
起らない。それは負の制御プローブと反応する無意味D
NAが存在すべきでないからである。その後、洗浄溶液
が検出隔室を介して押圧され、膜194Eを通して未ハ
イブリッダイズのラベルされた即ちビードに結合しない
プローブを吸収剤196Hに押し流す。この押し流しの
後に無色染料液との接触ついでストッパ溶液との接触が
行われる。
もう一つの実施例は所謂オリゴキャプチャー技術を使用
するものである。その場合第17.18図に示すように
ラベルを付したプローブは増幅DNAの導入に先立ち検
出膜上に不動の形態で収納されている。以前に説明した
のと同様の部品は同一の参照番号を付与するものとし、
区別のためサフィックスFが付けられる。
するものである。その場合第17.18図に示すように
ラベルを付したプローブは増幅DNAの導入に先立ち検
出膜上に不動の形態で収納されている。以前に説明した
のと同様の部品は同一の参照番号を付与するものとし、
区別のためサフィックスFが付けられる。
この実施例において使用されるオリゴキャプチャ一方法
はプローブが膜、もしくは膜上にもしくは内にトラップ
されたビード上に不動とされており、そのプローブは適
当なりNAに相補的な遺伝学的材料を具備する。他の隔
室(139F)では増幅されたDNA上でビオチンと反
応するためのラベルDNAは例えば西洋わさびパーオキ
シダーゼとすることができる。
はプローブが膜、もしくは膜上にもしくは内にトラップ
されたビード上に不動とされており、そのプローブは適
当なりNAに相補的な遺伝学的材料を具備する。他の隔
室(139F)では増幅されたDNA上でビオチンと反
応するためのラベルDNAは例えば西洋わさびパーオキ
シダーゼとすることができる。
第17および18図においてキュベツト100Fは検出
室190F及び収納室139F(第19図)に何が収納
されているか以外は第9図の実施例と同一である。
室190F及び収納室139F(第19図)に何が収納
されているか以外は第9図の実施例と同一である。
もっと特定すると、サンプル[lNAプローブは膜19
4Fの部分Sで不動とされており、正の制御プローブは
“十″の部分で不動にされており、負のプローブは“−
”の部分で不動とされている。そのようなプローブを担
持する膜の各部分194Fは好ましくは他の部分と接触
しない。
4Fの部分Sで不動とされており、正の制御プローブは
“十″の部分で不動にされており、負のプローブは“−
”の部分で不動とされている。そのようなプローブを担
持する膜の各部分194Fは好ましくは他の部分と接触
しない。
この場合のプロセスでは増幅DNAは通路157Fを介
して検出室190Fに導かれ、膜194Fの表面全体の
上を流される。適当な加熱により増幅DNAは特定にハ
イブリダイズされ、かくしてSi4域のプローブに結合
し、そこに散在したDNAは“+”領域においてプロー
ブに結合され、“−”領域では好ましくは全(ハイブリ
ツダイズしない。洗浄溶液は隔室190Fに134F又
は他の部分から付勢され、次いでアビデイン−ラベルが
ビオチン化生成物と反応し、ハイブリツダイズされて増
幅目標DNAもしくは正の制御DNAとなる。その後、
洗浄溶液が印加され、それから無色染料が印加される。
して検出室190Fに導かれ、膜194Fの表面全体の
上を流される。適当な加熱により増幅DNAは特定にハ
イブリダイズされ、かくしてSi4域のプローブに結合
し、そこに散在したDNAは“+”領域においてプロー
ブに結合され、“−”領域では好ましくは全(ハイブリ
ツダイズしない。洗浄溶液は隔室190Fに134F又
は他の部分から付勢され、次いでアビデイン−ラベルが
ビオチン化生成物と反応し、ハイブリツダイズされて増
幅目標DNAもしくは正の制御DNAとなる。その後、
洗浄溶液が印加され、それから無色染料が印加される。
羞果
この発明の技術的効果はこの発明のキュベツトおよび方
法により得られた増幅核酸はその得られた増幅核酸によ
り環境を汚染するおそれがなく、それは核酸を入れたキ
ュベツトの領域を再度開ける必要がないことによる。
法により得られた増幅核酸はその得られた増幅核酸によ
り環境を汚染するおそれがなく、それは核酸を入れたキ
ュベツトの領域を再度開ける必要がないことによる。
ほかの効果としてキュベツトは比較的に未熟なものでも
増幅作業をすることができる。
増幅作業をすることができる。
また、この発明のキュベツトおよび方法は自動処理に対
処することができる。
処することができる。
第1図はこの発明のキュベツトの平面図。
第2図は第1図のII−II線に沿って表される断面図
。 第3図は第1図のIII−III線に沿って表される断
面図。 第4図は第1図のVl−Vl線に沿って表される部分的
断面図(但しピペットは省略)。 第5図は第1図のv−v線に沿って表される拡大部分的
断面図。 第6図は第1図と類似するが他の実施例を説明する部分
的平面図。 第7図は第1図と類似するが他の実施例を示す平面図。 第8図は第7図のVlll−Vlll線に沿う断面図。 第9図は第1図と類似するが、他の実施例を示す部分的
断面平面図(第11図のIX−IX線に沿って表した断
面図)。 第10図、第11図、第12図は第9図の夫々X−X線
、Xl−H線、X1l−Xll線に沿って表される断面
図。 第13図は第9図と類似するが他の実施例を示す部分的
断面平面図。 第14図及び第15図は第9図と類似するが夫々性の実
施例を示す一部断面で表した部分的平面図。 第16図は第15図のXVI−XVI線に沿って表す断
面図。 第17図は第9図と類似するが他の実施例を示す一部を
破断して示す部分的平面図。 第18図は第17図(7)XVIII−XVIII i
、:沿ッテ表される断面図。 第19図は第5図と類似するが他の実施例を説明する断
面図。 10、100. LOOC,100d、 100E・・
・キュベツト26、26A、 26B・・・反応室 30、3OA、 30B・・・収納室 32、32A、 32B・・・収納室 34、34A、 304B・・・収納室36、36A、
36B・・・収納室 3B、 38A、 38B・・・収納室40、40A、
40B・・・検出室(検出サイトを具備)60・・・
外部圧力源(可動手段) 113、113C,1130・・・ピストン移動手段1
15、115C,1150・・・ピストン移動手段12
6、126A、 126B、 126c、 126D、
126ト・・反応室132、132A、 132B、
132c、 1320.132E・・・収納室134
、 L34A、 134B、 134C,1340,1
34E・・・収納室136、136A、 136B、
136C,1360,136E・・・収納室138、1
38A、 138B、 138C,1380,138E
・・・収納室139、139A、 139B、 139
C,1390,139E・・・収納室140・・・検出
室、 184、184c、 184E・・・ピストン移動手段
126c、 194B、 194F・・・検出サイト2
60・・・ピストン移動手段
。 第3図は第1図のIII−III線に沿って表される断
面図。 第4図は第1図のVl−Vl線に沿って表される部分的
断面図(但しピペットは省略)。 第5図は第1図のv−v線に沿って表される拡大部分的
断面図。 第6図は第1図と類似するが他の実施例を説明する部分
的平面図。 第7図は第1図と類似するが他の実施例を示す平面図。 第8図は第7図のVlll−Vlll線に沿う断面図。 第9図は第1図と類似するが、他の実施例を示す部分的
断面平面図(第11図のIX−IX線に沿って表した断
面図)。 第10図、第11図、第12図は第9図の夫々X−X線
、Xl−H線、X1l−Xll線に沿って表される断面
図。 第13図は第9図と類似するが他の実施例を示す部分的
断面平面図。 第14図及び第15図は第9図と類似するが夫々性の実
施例を示す一部断面で表した部分的平面図。 第16図は第15図のXVI−XVI線に沿って表す断
面図。 第17図は第9図と類似するが他の実施例を示す一部を
破断して示す部分的平面図。 第18図は第17図(7)XVIII−XVIII i
、:沿ッテ表される断面図。 第19図は第5図と類似するが他の実施例を説明する断
面図。 10、100. LOOC,100d、 100E・・
・キュベツト26、26A、 26B・・・反応室 30、3OA、 30B・・・収納室 32、32A、 32B・・・収納室 34、34A、 304B・・・収納室36、36A、
36B・・・収納室 3B、 38A、 38B・・・収納室40、40A、
40B・・・検出室(検出サイトを具備)60・・・
外部圧力源(可動手段) 113、113C,1130・・・ピストン移動手段1
15、115C,1150・・・ピストン移動手段12
6、126A、 126B、 126c、 126D、
126ト・・反応室132、132A、 132B、
132c、 1320.132E・・・収納室134
、 L34A、 134B、 134C,1340,1
34E・・・収納室136、136A、 136B、
136C,1360,136E・・・収納室138、1
38A、 138B、 138C,1380,138E
・・・収納室139、139A、 139B、 139
C,1390,139E・・・収納室140・・・検出
室、 184、184c、 184E・・・ピストン移動手段
126c、 194B、 194F・・・検出サイト2
60・・・ピストン移動手段
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、核酸材料の増幅および検出を実施するための閉鎖し
た、使いすて型のキュベットにおいて、核酸材料と増幅
試薬とを含有した反応室を含んだ複数の隔室と、約30
℃から約95℃の範囲の温度を通じて前記反応室の内容
物を能動的に若しくは受動的に循環せしめる手段と、少
なくとも一つの検出材料と共に使用するように前記反応
室に近接して位置する少なくとも一つの収納室と、圧力
が反応室の内容物に印加されたときに前記隔室を所定の
順序で相互に流体的に連結する手段とを具備しており、
前記隔室は全てキュベットの外側の位置に対して流体に
対して閉鎖されており、前記隔室の少なくとも一つはそ
の中の検出地点において増幅の後の検出のため核酸材料
を不動にするための手段を具備しており、増幅された核
酸の検出を増幅された核酸材料による他のキュベットも
しくは装置の汚染なしに行うことができることを特徴と
する使いすて型の閉鎖キュベット。 2、請求項1に記載の発明において、前記反応室は核酸
材料、ポリメラーゼ酵素、プライマー核酸およびニュー
クレオチドを具備していることを特徴とする使いすて型
の閉鎖キュベット。 3、請求項1に記載の発明において、前記反応室は核酸
材料、TAQポリメラーゼ、プライマー核酸およびニュ
ークレオチドを具備していることを特徴とする使いすて
型の閉鎖キュベット。 4、DNAを増幅および検出する装置において、(1)
複数の隔室と、これを少なくとも一つの他の隔室に相互
に製造するための手段とを有するキュベットを有し、該
キュベットは(a)DNAストランドを増幅するための
少なくとも一つの反応室と、(b)増幅されたDNAを
検出し、検出地点を具備する少なくとも一つの検出室と
、(c)検出された材料を増幅されたDNAストランド
に伝達する手段とを備え、(ii)約30℃から約90
℃の温度範囲を通して反応室の内容物の積極的若しくは
受動的な循環を許容する手段を具備し、(iii)増幅
のためサンプルDNAを前記反応室に対する注入を許容
するため、前記少なくとも一つの反応室にのみ連結され
る液体アクセス手段を具備し、(iv)サンプルDNA
の注入の後にDNAの通過に対して前記キュベットを遮
断する手段を具備し、更に少くとも検出材料およびDN
Aストランドを検出室におよび検出部位に移動する手段
を具備し、一旦DNAサンプルが隔室に導入されアクセ
ス開口が閉鎖されると、隔室内の流体内容物は運転者及
び環境との接触が起こらないように増幅期間及び検出反
応の全期間は拘束されることを特徴とする装置。 5、請求項4に記載の発明において、前記移動手段は前
記キュベット中に取り付けされたピストンより成り、か
つピストンは、該ピストンの移動時に前記検出材料及び
DNAストランドをして前記検出地点に向け動くように
付勢するべく構成される通路により連結されてることを
特徴とする装置。 6、請求項5に記載の発明において、前記移動手段は前
記キュベット中に設けたピストンを更に具備し、該ピス
トンは通路によって前記検知地点に流体的に連結される
第2のピストンを具備し、第2のピストンが収縮したと
きに前記検知地点での圧力を緩和することができること
を特徴とする装置。 7、環境を汚染するエーロゾルが外部に流出することを
許容することなしに閉鎖キュベットにおいて核酸材料を
増幅しかつ検出する方法において、(a)核酸材料のサ
ンプルをキュベットに注入し、該キュベットは、増幅試
薬が存在する反応室と、検知材料と共に使用する収納室
と、検知地点を含む少なくとも一つの室とを含む多数の
隔室並びに流体の伝達を行わしめるため前記隔室を相互
に連結する手段を具備し、(b)核酸材料を包含する前
記キュベットの部分を恒久的に遮断し、全ての核酸をそ
のキュベットに封入し、(c)前記試薬が有効となる所
定の温度変化にわたってキュベットを循環させることに
より核酸材料を増幅し、(d)増幅された核酸材料を前
記反応室から前記検知地点に流体的に搬送し、(e)検
知材料を前記検知点に流体提供に搬送し、並びに(f)
前記地点において増幅された核酸材料を前記検知材料と
共に検出し、同時に核酸材料は前記キュベット中に封入
維持することを特徴とする閉鎖キュベット内の核酸材料
の増幅および検出方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US30673589A | 1989-02-03 | 1989-02-03 | |
US33992389A | 1989-04-17 | 1989-04-17 | |
US339923 | 1989-04-17 | ||
US306735 | 1989-04-17 |
Publications (2)
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