FI94360B - Polymeraasiketjureaktiossa käytettävä suljettu kyvetti sekä sen käyttömenetelmä - Google Patents

Polymeraasiketjureaktiossa käytettävä suljettu kyvetti sekä sen käyttömenetelmä Download PDF

Info

Publication number
FI94360B
FI94360B FI900535A FI900535A FI94360B FI 94360 B FI94360 B FI 94360B FI 900535 A FI900535 A FI 900535A FI 900535 A FI900535 A FI 900535A FI 94360 B FI94360 B FI 94360B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
compartment
cuvette
dna
detection
compartments
Prior art date
Application number
FI900535A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI94360C (fi
FI900535A0 (fi
Inventor
John Bruce Findlay
Paul Nicholas Schnipelsky
Leonard Joseph Seaberg
Jeffrey Allen Wellman
Charles Cullis Hinckley
William Harold Donish
Original Assignee
Eastman Kodak Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eastman Kodak Co filed Critical Eastman Kodak Co
Publication of FI900535A0 publication Critical patent/FI900535A0/fi
Publication of FI94360B publication Critical patent/FI94360B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI94360C publication Critical patent/FI94360C/fi

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/069—Absorbents; Gels to retain a fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0867—Multiple inlets and one sample wells, e.g. mixing, dilution
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/087—Multiple sequential chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0478—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure pistons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0481—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure squeezing of channels or chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

94360
Polymeraasiketjureaktiossa käytettävä suljettu kyvetti sekä sen käyttömenetelmä Tämä keksintö liittyy kyvettiin, jossa suoritetaan 5 reaktioita nukleiinihappojen vahvistamiseksi ja detektoi-miseksi, käyttäen PKR teknologiaa, asettamatta ympäristöä alttiiksi vahvistetulle nukleiinihapolle.
Polymeeraasiketjureaktio (PKR) teknologia sallii, että nukleiinihappomateriaali, kuten DNA, usein uutettuna 10 niin pienestä kuin yksittäisestä solusta, vahvistetaan sadoiksi miljooniksi kopioiksi. Tämä on tärkeää koska ennen PKR teknologiaa oli tosiasiassa mahdotonta detektoida yksittäistä DNA säiettä. Kuitenkin, kun yksittäinen DNA säie, kuten ihmisen immuunivajausviruksen (HIV, joka tie-15 detään myös aiheuttavan AIDS:ia) DNA, lisätään vahvistus-reagensseihin, jotka vahvistavat valikoitua DNA:ta, aikaansaadaan satoja miljoonia kopioita tästä DNA:sta suhteellisen lyhyessä ajassa. Teknologia sallii lisäksi, vahvistetun nukleiinihappomateriaalin (esim. DNA:n) detektoi-20 miseksi, että käytetään koettimia, jotka hybridisoituvat valitun vahvistetun aineen kanssa, ja nämä koettimet vuorostaan on tehty liikkumattomiksi tai voidaan tehdä liikkumattomiksi vankkarakenteiselle alustalle, kuten suoda-tinkalvolle, ja/tai ne on merkitty detektointia varten 4 · · '251 käyttäen entsyymejä tai muita osia.
Tavanomaisesti tämä on tehty vahvistamalla nukleii-nihappoainetta tulpalla varustetussa muovisäiliössä kunnes toivottu määrä kopioita on muodostunut. Tämän jälkeen on säiliö avattu, kuten esimerkiski tulpanpoistolla, ja joko 30 vahvistetut kopiot on poistettu ja siirretty detektoivaan laitteeseen, tai detektoivia reagensseja on voitu lisätä vahvistamiseen käytettyyn säiliöön, niin että detektointi tehdään samassa säiliössä.
On havaittu, että tällainen tekniikka on epätyydyt-35 tävä PKR teknologian vaivattomaan ja yleiseen käyttöön, 94360 2 koska aerosoleja muodostuu tulpanpoistovalheessa ja/tai nesteiden siirtovaiheessa. Tällaiset aerosolit sisältävät hiukan vahvistettuja nukleiinihappomateriaaleja, esim. DNA:ta. Aerosolit alkavat sitten hajota ympäristöön. Ta-5 vallisesti tällaiset muutamat molekyylit ympäristössä eivät ole kovin merkittäviä. Kuitenkin, vain yksi DNA molekyyli tarvitaan saastuttamisella pilamaan muita vahvis-tussäiliöitä, joita vielä käytetään detektointiin. So. mikäli harhaileva DNA molekyyli kuljeksii tai joku ope-10 raattori kantaa sen, epähuomiossa, toiseen vahvistussäi-liöön, jota tullaan vielä käyttämään, on tämä yksi molekyyli kaikkea mitä tarvitaan seuraavaan vahvistukseen tarvittavan DNA:n järjestämiseksi. On sanomattakin selvää, että mikäli seuraavan testin tarkoitus on katsoa onko 15 siinä tietty DNA (esim. HIV:n kohdalla), ja se detektoi-daan vain harhailevan DNA:n takia, on testi pilalla. Täten testien potentiaalisesta pilalle menon lähteestä tulee DNA:n vahvistamisen todellinen voima. On todistettu, että itse asiassa kokonainen laboratorio on tullut saastutetuk-20 si poistettaessa tulppaa vain muutamasta säiliöstä, jossa näyte on jo vahvistettu. Vaikka tällainen ongelma on vältettävissä käyttämällä erittäin taitavaa ja koulutettua henkilökuntaa, joka huolellisesti minimoi tuotettuja aerosoleja, tällaisen työvoiman tarve tekee teknologian 25 epäkäytännölliseksi yleiseen käyttöön.
Täten, on ollut ongelma, ennen tätä keksintöä, järjestää laite ja menetelmä nukleiinihappoaineiden vahvistamiseksi, saastuttamatta ympäröivää ympäristöä.
Vielä toinen ongelma on ollut, ennen tätä keksin-30 töä, automatisoida detektointivaiheet, so. minimoida ope-raattorin väliintulotarve. Tarve siirtää vahvistettuja nukleiinihappomateriaaleja tai lisätä detektointireagens-seja tekee tällaisen automatisoinnin vaikeaksi.
Edellä olevat ongelmat on osoitettu laitteella ja 35 menetelmällä jotka ratkaisevat yllä mainitut tarpeet. Kek- 1 94360 3 sintö perustuu tajuamiseen, että saastuttaminen voidaan estää sulkemalla vahvistavat reagenssit ja vahvistettu nukleiinihappo kyvettiin niin, että on mahdotonta yhdellekään nukleiinihappomolekyylille karata.
5 Tarkemmin, yhtäpitävästi keksinnön yhden näkökan nan kanssa, yllä mainitut ongelmat on huomioitu suljetulla, kertakäyttöisellä kyvetillä nukleiinihappoaineen vahvistamiseksi ja detektoimiseksi, joka käsittää: lukuisia lokeroita, jotka sisältävät reaktiolokeron, välineet, jot-10 ka sallivat reaktiolokeron sisällön aktiivisen tai passiivisen vuorottelun lämpötila-alueen n. 30 °C - n. 95 °C läpi; ainakin yhden säilytyskammion, joka on sijoitettu reaktiolokeron viereen käytettäväksi ainakin yhden detek-tointimateriaalin kanssa; ja välineet määrätyssä järjes-15 tyksessä olevien lokeroiden yhdistämiseksi nestemäisesti kun kohdistetaan painetta lokeron sisältöön; jolloin kaikki lokerot on suljettu nestevirtauksilta säiliön ulkopuolisiin paikkoihin ja mainittu reaktiolokero sisältää nuk-leiinihappoainetta ja reagoimatonta vahvistusreagenssia; 20 vähintään yhden lokeron sisältäessä detektointipaikassa sen sisällä välineet nukleiinihappoaineen liikkumattomaksi tekemiseksi vahvistuksen jälkeistä detektointia varten, niin, että tapahtuu vahvistetun nukleiinihappoaineen de-tektointi saastuttamatta muita säiliöitä tai laitteita 25: vahvistetulla nukleiinihappoaineella. Tulos on, että vah vistetun nukleiinihappoaineen detektointi tapahtuu saastuttamatta muita säiliöitä tai laitteita vahvistetulla nukleiinihappoaineella. Keksinnön mukaiselle kyvetille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. 30 Keksinnön vielä yhden aspektin mukaan, yllä olevat ongelmat on huomioitu suljetulla kyvetillä edellisen kappaleen kuvauksen mukaan, jossa reaktiolokeron reagenssi sisältää polymeeristä entsyymiä, alkuperäistä nukleiinihappoa ja deoksiribonukleotidia.
4 94360
Yhtäpitävästi keksinnön vielä yhden aspektin kanssa, yllä olevat ongelmat on huomioitu laitteella DNA:n vahvistamiseksi ja detektoimiseksi, joka käsittää kyvetin sisältäen i) lukuisia lokeroita ja välineet jokaisen loke-5 ron yhdistämiseksi vähintään toiseen lokeroon, ja lokerot sisältävät a) vähintään yhden reaktiolokeron DNA:n säikeiden vahvistamiseksi, b) vähintään yhden detektointilokeron vahvistetun DNA:n detektoimiseksi ja sisältäen detektoin-tipaikan, ja c) välineet detektointiaineen toimittamiseksi 10 vahvistetun DNA:n säieille; ii) välineet reaktiolokeron sisällön aktiivisen tai passiivisen vuorottelun sallimiseksi lämpötila-alueen noin 30 °C - noin 95 °C läpi; ja iii) nesteen sisäänpääsyvälineet, jotka on liitetty vain vähintään yhteen reaktiolokeroon vahvistettavan DNA näyt-15 teen reaktiolokeron sisään tapahtuvan ruiskutuksen sallimiseksi, jolloin kyvetti sisältää lisäksi iv) välineet kyvetin sulkemiseksi DNA:n läpäisyltä, sen jälkeen kun DNA näyte on ruiskutettu sisään; ja laite käsittää lisäksi välineet vähintään detektointiaineen ja DNA:n säikeen 20 siirtämiseksi detektointilokeroon ja detektointipaikkaan; niin, että heti kun DNA näyte on ruiskutettu lokeroiden sisään ja sisäänpääsyaukko on suljettu, on lokeroiden nes-tesisältö suojattu operaattorin tai ympäristön kontaktilta, koko vahvistuksen ja detekto-intireaktion aikana. Kek- 1 · · 25 sinnön mukaiselle laitteelle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa 26 ja 27 esitetään.
Vielä yhdessä keksinnön aspektissa on yllä olevat ongelmat huomioitu menetelmällä nukleiinihappoaineen vahvistamiseksi ja detektoimiseksi suljetussa kyvetissä sal- 30 limatta aerosolien poistumista siitä saastuttamaan ympä-• · ristöä, menetelmän sisältäessä vaiheet a) nukleiinihappo-ainenäytteen ruiskuttaminen kyvettiin käsittäen, lukuisia lokeroita sisältäen reaktiolokeron, jossa on vahvistavia reagensseja, ja säilytyslokeron käytettäväksi detektointi-35 aineen kanssa, vähintään yhden lokeron sisältäessä detek- li 94360 tointipaikan, ja välineet lokeroiden yhdistämiseksi neste-siirron aikaansaamiskesi; b) nukleiinihappoainetta sisältävien kyvettiosien pysyvä sulkeminen kaiken nukleiinihapon sulkemiseksi kyvettiin; c) nukleiinihappoaineen vah- 5 vistaminen vuorottelemalla kyvetti esivalittujen lämpöti- lamuutosten läpi, mikä aikaansaa tehokkaita reagenssejä; d) vahvistetun nukleiinihappoaineen nestemäinen siirto reaktiokammiosta detektointipaikkaan; e) detektointiaineen nestemäinen siirto detektointipaikkaan; ja f) vahvistetun 10 nukleiinihappoaineen detektointi detektointipaikassa de- tektointiaineella, kaiken nukleiinihappoaineen pysyessä suojattuna kyvetin sisällä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 28 esitetään.
15 Keksinnön hyödyllisenä erikoisuutena on, että on järjestetty kyvetti nukleiinihappojen vahvistamiseksi, joka välttää riskit ympäristön saastuttamisesta vahvistetulla nukleiinihapolla, koska se välttää tällaista nukleiinihappoa sisältävän kyvettialueen jälleenavaamista.
20 Keksinnön läheisesti yhteenkuuluvana hyödyllisenä erikoisuutena on, että on järjestetty kyvetti, jota suhteellisen kokematon työvoima voi käyttää tällaiseen vahvistamiseen.
Keksinnön vielä yhtenä hyödyllisenä erikoisuutena • · 25 on, että on järjestetty sellainen kyvetti, joka on sopiva automatisoidulle käsittelylle.
Kysymyksessä oleva keksintö kuvataan nyt esimerkkien muodossa viitaten oheisiin piirustuksiin joissa:
Kuvio 1 on tasokuva keksinnön mukaisesti konstruoi- 30 dusta kyvetistä; « · .: Kuvio 2 on leikkauskuva, joka yleisesti on otettu pitkin kuvion 1 viivaa II-II;
Kuvio 3 on leikkauskuva, joka yleisesti on otettu pitkin kuvion 1 viivaa III-III; 35 Kuvio 4 on pirstoleikkauskuva, joka on otettu pit kin kuvion 1 viivaa IV-IV, mutta ilman pipettiä; 94360 6
Kuvio 5 on suurennettu pirstoleikkauskuva, joka on otettu pitkin kuvion 1 viivaa V-V;
Kuvio 6 on pirstotasokuva, joka on yhdenmukainen kuvion 1 kanssa, mutta esittää vaihtoehtoisen suoritusmuo-5 don;
Kuvio 7 on tasokuva, joka on yhdenmukainen kuvion 1 kanssa, mutta esittää vaihtoehtoisen suoritusmuodon;
Kuvio 8 on leikkauskuva, joka on otettu pitkin kuvion 7 viivaa VIII-VIII; 10 Kuvio 9 on osittain leikattu tasokuva, joka on yh denmukainen kuvion 1 kanssa, mutta esittää vaihtoehtoista suoritusmuotoa, leikkaustason ollessa yleisesti otettuna pitkin kuvion 11 viivaa IX-IX;
Kuviot 10, 11 ja 12 ovat leikkauskuvia, jotka ylei-15 sesti on otettu vastaavasti pitkin kuvion 9 viivoja X-X, XI-XI, XII-XII;
Kuvio 13 on osittain leikattu tasokuva, joka on yhdenmukainen kuvion 9 kanssa, mutta esittää vielä toisen suoritusmuodon; 20 Kuviot 14 ja 15 ovat pirstotasokuvia, osittain lei kattuina, yhdenmukaisia kuvion 9 kanssa, mutta esittää vaihtoehtoisia suoritusmuotoja;
Kuvio 16 on leikkauskuva, joka yleisesti on otettu pitkin kuvion 15 viivaa XVI-XVI; • · 25 Kuvio 17 on osittain leikattu pirstotasokuva, joka on yhdenmukainen kuvion 9 kanssa, mutta esittää vielä toisen suoritusmuodon;
Kuvio 18 on leikkauskuva, joka yleisesti on otettu pitkin kuvion 17 viivaa XVIII-XVIII; ja 3 0 Kuvio 19 on leikkauskuva, joka on yhdenmukainen kuvion 5 kanssa, mutta esittää vaihtoehtoisen suoritusmuodon.
Keksintö kuvataan tästä lähtien ensisijaisesti ottaen huomioon PKR teknologian käyttö DNA:n vahvistamisek-35 si ja detektoimiseksi, käyttäen tiettyjä parempina pidet- Qλ τζη
7 ' Η ο U U
tyjä kyvettimuotoja. Lisäksi, on käyttökelpoista vahvistaa, millä tahansa nukleiinihapon vahvistamismenetelmällä, nukleiinihappoa mistä tahansa lähteestä, mihin tahansa kyvettiin, niin kauan kuin laite ja menetelmä estävät vah-5 vistetun nukleiinihapon missään muodossa poiston kyvetis-tä. Nukleiinihappoa voidaan hankkia, esim. plasmideista tai kloonatusta DNA:sta tai RNA:sta, tai luonnollisesta DNA:sta tai RNA:sta mistä tahansa lähteestä, mukaan lukien bakteerit, hiivat, virukset, virusten tai bakteerien tar-10 tuttamat solut, kasveista tai eläimistä. DNA:ta tai RNA:ta voidaan uuttaa veri- tai kudosaineista. Toista vahvistusmenetelmää, jota kutsutaan transkriptiopohjäiseksi vahvistukseksi ja joka on erilainen kuin PKR, joka voi hyötyä tämän keksinnön suojakyvetistä, on kuvattu julkaisussa 15 Proc. Natl. Acad. Sei. USA. Volume 86, sivuilla 1173-1177, helmikuu, 1989 (Biochemistry).
PKR teknologia
Yleisesti nukleiinihappovahvistus etenee erityisen menettelyn kautta. Yksi käyttökelpoinen menettely on jul-20 kaistu U.S. Pat. No. 4,683,195 patenttijulkaisussa. Tämä menettely esittää lyhyesti, DNA:n vahvistuksen suhteen, vaiheet: 1) Näytteen hankkiminen, jota epäillään sisältävän vähintään yhden mielenkiintoisen tarkoin määrätyn nukleii- • · 25: nihappoket jun; 2) Näytteen denaturointi säikeiden erottelemiseksi; 3) Näytteen koskettaminen alukkeilla, jatkoentsyy- millä kuten polymeraasilla ja muilla käyttökelpoisilla 30 vahvistuskomponenteilla nukleiinihapon kopioimiseksi; • « 4) Vaiheiden #2 ja #3 toistaminen niin monta kertaa kuin on tarpeen; ja 5) Vahvistetun DNA:n detektointi.
Parempana pidetty menettely, samassa luokassa, on 35 seuraava: Q/7 cr\ 8 /4Juu 1) Täydellinen DNA kaksoisspiraali poistetaan valinnanvaraisesti kemiallisesti, käyttäen tarkoituksenmukaista restriktioentsyymiä (restriktioentsyymejä), kiinnostavan alueen eristämiseksi.
5 2) Eristetyn nukleiinihappo-osan (tässä, DNA) ja nukleotidien liuos lämmitetään 92 °C - 95 °C:een ja pidetään siinä tietyn ajan, esim. ei kauemmin kuin noin 10 minuuttia kahden nukleiinihapposäikeiden denaturoimiseksi; so. aikaansaadaan niiden kiertyminen auki ja separoiminen 10 ja mallin muodostaminen.
3) Liuos jäähdytetään viemällä se 30 °C - 60 °C:een vyöhykkeen läpi, alukkeen hitaan jäähtymisen tai molempien mallien säikeisiin tapahtuvan "kiinnittymisen" aikaansaamiseksi. Jotta tämä varmasti tapahtuisi pidetään liuos 15 tarkoituksenmukaisessa lämpötilassa, kuten n. 55 °C:ssa n.
15 sekunnin ajan, "inkubaatio" vyöhykkeessä.
4) Liuos lämmitetään sitten n. 70 °C:een ja pidetään siinä, jotta aikaansaataisiin, että jatkoentsyymi, mieluimmin lämmönkestävä polymeraasientsyymi, jatkaisi 20 mallien säikeisiin sidottuja alukkeita käyttämällä läsnä olevia deoksiribonukleotidejä.
5) Täydennetty uusi säiepari lämmitetään 92 °C - 95 °C:een uudestaan, n. 10-15 sekunnin ajan, tämän parin separoinnin aikaansaamiseksi.
• · 25 6) Toistetaan vaiheet 3) - 5) muutaman kerran kun nes on hankittu tarkoituksenmukainen määrä säikeitä. Mitä useampi toisto, sitä suurempi määrä nukleiinihappokerran-naisia (tässä, DNA) tuotetaan. Nukleiinihapon toivottu konsentraatio saavutetaan mieluimmin minimiäjassa, jossa 30 jokainen sykli kestää vähemmän kuin minuutti. Voidaan • 4 kuitenkin, niin paljon kuin viisi minuuttia, käyttää yhteen sykliin.
Tässä käytettynä, termi "aluke" viittaa oligo-nuk-leotidiin, joko luonnollisesti esiintyvänä tai synteetti-35 sesti tuotettuna, joka pystyy toimimaan synteesin alulle- li 94360 panopisteenä, kun se asetetaan olosuhteisiin, joihin indusoidaan nukleiinihapposäikeitä täydentävän alukkeen jat-kotuotteen synteesiä. Näihin olosuhteisiin sisältyvät nukleotidien (kuten neljä vakiodeoksiribonukleotiditrifos-5 faatteja) ja polymerointiaineen kuten DNA-polymeraasin sekä sopivan lämpötilan ja pH:n läsnäolo. Tässä keksinnössä käytetyllä jokaisella alukkeella tulee tavallisesti olla 15 - 40 nukleotidejä, ja mieluimmin sillä on 20 - 25 nukleotidejä.
10 Kaikki tämä tehdään mieluimmin kyvetissä, käyttäen lämpötilavuorottelua n. 30 °C:en ja n. 95 °C:en välillä. Tämän keksinnön kyvetti tarjoaa käytännöllisen johdatuksen PKR teknologian sallimiseksi tekniikan taitajille, ja niille, jotka ovat vähemmän taitavia, rutiiniomaiseksi 15 harjoittamiseksi, täsmällisellä tavalla. Keksinnön täydelliseksi ymmärtämiseksi luetellaan ensin enemmän yksityiskohtia PKR teknologiasta niin kuin sitä harjoitetaan tällä keksinnöllä.
Jokainen DNA voidaan selektiivisesti kopioida sato-20 ja miljoonia kertoja. Tarkoituksenmukaisten alukenukleii-nihapposäikeiden valinta takaa, että parhaiden olosuhteiden vallitessa, tulee pääasiallisesti valittu DNA kertautumaan. Edullisesti kaikki alukkeet biotinyloidaan kun ne liitetään kyvettiin detektoinnin sallimiseksi edistyen • · 25ί jäljempänä kuvatulla tavalla. Nyt alukkeeseen tarttuneen kohde DNA:n lämmittäminen, jatkoentsyymin läsnäollessa, tuottaa kaksinkertaisen säikeen, joka sisältää valitun DNA:n kopion. Näin muodostettu uusi pari separoidaan kor-kealämpötiladenaturoinnin erittäin lyhyillä jaksoilla, ja 30 menetelmä toistetaan. Kaikki tämä tehdään reaktiolokerossa !: varmistaen, että alukkeet, deoksiribonukleotidit ja jatko- entsyymit ovat läsnä kun näyte lisätään, joko esisekoitet-tuina reagensseinä tai reagensseinä, joihin on lisätty DNA. Mikäli reagenssit on esisekoitettu voidaan ne siirtää 35 suihkuttamalla ja kuivaamalla, ja ne voivat sisältää, po- 10 94360 lymeraasin, suoloja, puskurlaineita, stabiloivia aineita, ja kopiointiin tarvittavia nukleotidejä.
Polymeraasientsyymi on käyttökelpoinen riippumatta sen lähteestä. Se on mieluimmin luonnollisesti tuotettu 5 polymeraasi Thermus aauaticuksesta. jäljempänä "TAQ", tai mikä tahansa synteettinen vastine kuten se, joka on geneettisesti johdettu, kuten on kuvattu, esim. EPO julkaisussa 25S 017.
Entsyymien läsnäolo tähdentää nopeiden lämpösyk-10 lien, ja korkeassa lämpötilassa tapahtuvien lyhyiden ol-eskeluaikojen tarpeen. 92 °C - 95 °C:een denaturointiläm-pötila on lähellä entsyymien deaktivointilämpötilaa, aiheuttaen täten epätyydyttävän pitkiä lämpöjaksoja.
Tämän jälkeen identifioidaan kopioitu DNA, siirtä-15 mällä se mieluimmin detektointilokeroon, johon lisätään sopiva detektointimateriaali tai se on suljettu sen sisään. Aikaisemman taidon menetelmissä, kopioidun DNA: n tällainen "siirto", ja/tai reagenssien lisääminen kuten detektointikoetinten, on tehnyt välttämättömäksi DNA:ta 20 sisältävän reaktiolokeron jälleenavaamisen, synnyttäen aikaisemmin mainitut aerosoliongelmat. Detektointi saattaa osalliseksi kopioituun DNA säikeeseen sitomaan, täydentävän nukleotidijakson kautta, pystyvien tavanomaisten aineiden käytön. Näihin aineisiin sisällytetään myös tavan-2f? omaiset välineet, joita voidaan käyttää DNA:n vangitsemiseen detektointipaikkaan ja paikallaanpitämiseen siinä, jollainen on detektointilokerossa. Tällaisia tarkoituksenmukaisia välineitä esittävät vangittu kalvo ja/tai helmi.
Detektointi tarvitsee tavallisesti liikkumattomaksi 20 tekevän ja signaalia tuottavan aineen. Pidetään parempana, että DNA:n kopiointiin käytettyä aluketta on jo biotiny-loitu, niin että se reagoi avidiinin kanssa, joka on kiinnitetty joko liikkumattomaksi tekevään materiaaliin tai signaalia tuottavaan aineeseen. Mikäli avidiini on kiinni-35 tetty liikkumattomaksi tekevään materiaaliin (kuten hei-
II
94360 11 meen), jäljempänä, "avidiinihelmisieppaus" menetelmä, silloin käytetään detektointikoetinta, jossa on nukleotidi-ketju, joka hybridisoituu kopioidun alukkeen kanssa ja joka, joko itse tuottaa signaalin (esim. radioaktiivise-5 na) , tai reagoi reagenssin kanssa, joka tuottaa signaalin. Esim. detektointikoetin voidaan yhdistää mihin tahansa tarkoituksenmukaiseen osaan, mieluimmin entsyymiin, esim. piparjuuriperoksidaasiin, joka pystyy reagoimaan leukovä-rin kanssa detektoitavissa olevan signaalin (esim. väri-10 muutoksen) tuottamiseksi. Teknologia signaalia tuottavan osan tai liikkumattomaksi tekevän materiaalin yhdistämiseksi 3' tai 5' päätteen koetin tunnetaan. Esim. julkaisussa "Efficient Methods for Attachment of Thiol Specific Probes to the 3' End of Synthetic Oligodeoxyribonucleo-15 tides", Vol. 15/Nucleic Acids Research, sivulla 5303 (1987), käsitellään käyttökelpoisia 3' päätteen liittämisiä. Artikkelit, jotka käsittelevät 5/ päätteen liittämisiä, ovat lukemattomat, joita ainoastaan seuraava edustaa: "Introduction of 5' Terminal Functional Groups.....", Voi.
20 164/Analytical Biochemistry, sivu 336 (1987) . On ilman muuta selvää, että joko 3' tai 5'päätettä voidaan käyttää signaalia tuottavan osan liitämiseksi liikkumattomaksi tekevään materiaaliin.
Täten, kuten sitä tässä on käytetty termi "koetin" ‘ · « 2i> viittaa luonnollisesti esiintyvään tai synteettisesti tuotettuun oligonukleotidiin, joka ei toimi alukkeen tavoin, mutta joka on suunniteltu pääasiallisesti täydentäväksi yhdelle tai useammalle nukleiinihapposekvenssille hybridi-soidun tuotteen muodostamiseksi. Lisäksi, koetin on ta- 20 vallisesti rakennettu, joko syntyvän hybridisoidun tuot-*# *ί teen "sieppausta" tai "detektointia" varten.
Vaihtoehtoisesti voi detektoiva koetin ja liikkumattomaksi tekevä koetin olla yksi ja sama, liitettynä esim. juuri 5' päätteen kohdalla, käyttäen tekniikkaa, jo-35 ta edellä mainitussa Analytical Biochemistrvn artikkelissa opetettiin.
94360 12
Edellä mainitun mukaan, voidaan avidiini yhdistää signaalia tuottavaan aineeseen, kuten piparjuuriperoksi-daasiin, jäljempänä ,,oligosieppaus"-menetelmä. Näin ollen, DNA:n liikkumattomaksi tekeminen aikaansaadaan mieluummin 5 liikkumattomaksi tekevällä koettimella, joka on nukleoti-diketju, joka hybridisoi kopioidun biotinyloidun alukkeen kanssa, tällaisen ketjun yhdistyessä polymeeriseen hel-meen.
Täten, kuten sitä tässä on käytetty, "detektointi-10 aine" käsittää koettimen kopioidusta, biotinyloidusta alukkeesta, joka joko itse tuottaa detektoitavissa olevan signaalin tai reagoi reagenssin kanssa detektoitavissa olevan signaalin tuottamiseksi. Detektointiaine käsittää, jälkimmäisessä tapauksessa, myös sellaisen reagenssin.
15 Kaikkia detektointiaineitä, kuten myös vahvistet tua DNA:ta sisältävää kyvettiä, voidaan ravistella tai heiluttaa sekoituksen edistämiseksi, ja koettimien kiinnittyminen kohde-DNA:han saavutetaan, tavanomaisella läm-pöt ilavuorottelulla.
20 DNA:n koettimen hybridisointi voidaan tehdä ennen siirtoa mahdolliseen detektointipaikkaan tai siirron jälkeen.
Tämän jälkeen juoksutetaan kaikki nesteet pois de-tektointipaikasta. Muutama detektointimateriaali on tässä 2*5' pisteessä osana kopioitua DNA säiettä tai on hybridisoitu DNA säikeeseen, ja DNA:n sieppaa kalvon pinta-ala. Jokainen DNA säie, josta puuttuu välineet sen tekemiseksi liikkumattomaksi, kulkee kalvon yli.
Viimeinen vaihe on ruiskuttaa detektointilokeroon 30 neste, joka sisältää leukovärin tai jonkun muun emänukli-• · divärin, joka pystyy reagoimaan kalvolle siepattujen DNA-säikeiden projisoiman detektointiaineen kanssa. Käyttökelpoiset leukovärit käsittävät ne, jotka on julkaistu U.S-patentissa No 4 089 747, mieluimmin yhdessä liukoistuvan 35 polymeerin kanssa, kuten poly(vinyylipyrrolidoni). Väriai- 94360 13 neen suosittuna esimerkkinä on 2-(4-hydroksi-3,5-dimetok-s i f enyy1i)-4,5-bi s(4-metoksyy1ifenyyli)imidatso1i, koska tämä antaa noin 1 000 väriainemolekyylejä piparjuuriperok-sidaasen molekyyliltä.
5 Kuten on huomattu, DNA voi kiinnittyä tai hybridi- soitua koettimen helmessä. Helmet on valittu loukutettaviksi detektointikalvolla. Käyttökelpoinen materiaali tällaisille helmille käsittää minkä tahansa polymeerin, jolla on käyttökelpoiset reaktiokykyiset ryhmät avidiinisidosta 10 varten ja DNA:ksi hybridisoituvan koettimen sidosta varten. Avidiinin tavanomaiset kovalenssikiinnitykset aktiivisten halogeeniatomien, 2-substituoidun aktivoidun etyy-lisulfonyylin, tai vinyylisulfonyyliryhmien kautta tällaisiin polymeereihin tunnetaan. Täten m ja p-(2-kloorietyy-15 lisulfonyylimetyyli)styreenikopolymeerit ovat esim. käyttökelpoiset tällaisia helmiä varten.
On olemassa kaksi keksinnön avainaspektia, jotka tekevät edellä kuvatun menetelmän käytännölliseksi. Ensimmäinen on käyttää tehokasta lämmönsiirtoa niin, että reak-20 tiolokeron sisältö lämpiää nopeasti ja jäähtyy nopeasti. Välineet, jotka sallivat joko aktiivista tai passiivista lämmitystä, ovat käyttökelpoiset, järjestäen aktiivista tai passiivista jaksoittaista vaihtelua. So., Peltier laite voidaan asentaa reaktiolokeroon lokeroon rajoittuvan 2<5 lämmönsiirtoseinän järjestämiseksi. Mieluummin aikaansaa daan kuitenkin lämmönsiirto passiivisilla välineillä, joissa lämmönsiirtomateriaali on reaktiolokeron suuri seinäpinta-ala. Lämmönlähdettä tai lämpöallasta syötetään sitten, ulkopuolisesta lähteestä, mieluimmin kyvetin mo-30 lemmin puolin.
• · I
Toinen avainaspekti on konstruoida kyvettilokerot niin, että estetään nukleiinihapon pakoonpääseminen. So., lokeroiden täytyy olla suljettu vuodoilta ympäristöön, heti kun vahvistus tapahtuu. Suosittu konstruktio on se, 35 jonka lokeroihin on esi-sisällytetty kaikki reagenssit en- 94360 14 nen DNA:n sisäänvientiä, ja lukitusvälineitä käytetään kyvetin sulkemiseksi vuodoilta DNA:n sisäänviennin jälkeen. Tällaisissa suoritusmuodoissa, järjestetään välineitä nes-tesiirron aikaansaamiseksi lokeroiden välillä suljetun 5 kyvetin sisällä, käyttäen mieluummin sovellettua painetta, tarvittavan reaktion saavuttamiseksi.
Lämpövuorottelu
Ottaen ensin huomioon parempana pidetyn lämmönsiir-tomekanismin, nimittäin lokeron passivisen siirtoseinän, 10 valitaan tällaisen seinän materiaali esimäärätyn lämpörei-tin ja suuren määrän lämmönsiirtoenergiaa antavan lämpö-vastuksen järjestämiseksi. Tällaisen reitin pituus ei ole etusijaisesti suurempi kuin noin 0,3 mm, ja lämpövastus yhtä cm2 poikkipinta-alaa kohti ei ole suurempi kuin noin 15 5,0 °C/W. Nämä ominaisuudet aikaansaadaan helposti kons truoimalla lämmönsiirtoseinä muovista, tai muovista ja metallista koostuvasta laminaatista, kuten alumiinista, joka on noin 0,05 mm paksu. Tällaisen alumiinin lämpövastus on R, joka lasketaan paksuus x/(lämmönjohtokyky K · 20 pinta-ala A), joka on noin 0,003 °C/W. (Nämä arvot voidaan asettaa vastakohdiksi samanpaksuiselle tavalliselle lasille, jonka lämpövastus on noin 0,24 °C/W.) Muovin, joka mieluummin on lämmöllä suljettavissa oleva, päällystetty polyesteri kuten poly(eteenitereftalaatti) päällystetty 2·5' toisella puolella tai molemmilla puolilla keskitiheällä polyeteenillä, lämpövastus on noin 1,06 °C/W etusijalle asetetun paksuuden ollessa noin 0,005 cm.
Lämmönsiirtoseinä voi olla kiinnitettynä kyvetin-toisiin seiniin millä tahansa sopivalla keinolla. Yksi 30 tällainen keino on pohjustuslilmakerros, joka käsittää esim. tavallisen korkealämpötila-akryyliliiman, jota seuraa tavallinen polyesteriliima. Nämä liimapintakerrokset voivat ulottua lämmönsiirtoseinän pinta-alan yli, koska tällaiset jatkeet voivat estää alumiinin, mikäli sitä 35 käytetään, interferoimasta kyvetin sisällä tapahtuvien 15 94360 reaktioiden kanssa. Vaihtoehtoisesti voi muovikerros peittää alumiinin.
On todettu, että kyvetti, joka on konstruoitu tällaisella lämmönsiirtoseinällä, tuottaa noin 200 μ1:η nes-5 tetilavuudelle lämpöäikavakion tau (r), joka ei ole suurempi kuin noin 10 sekuntia. Suosituimmat ovat ne, joiden t on suuruusluokkaa 3-8 sekuntia. So.,kun tällainen kyvetti, täynnä vettä, lämmitetään pitkin lämmönsiirtosei-nän ulkopuolta, ja sen lämpötila mitataan pisteessä, joka 10 on reaktiolokeron sisäpuolella tämän seinän toisella puolella, voidaan tuottaa lämmöntoistokäyrä 28 °C:esta pääte-lämpötilaan 103,9 °C. Aika, jota neste sen sisällä käyttää lämpötilan 76 °C (63 % erotuksesta (103,9 - 28)) saavuttamiseksi on taun (r) arvo. Tämä on peräisin (osapuil-15 leen) hyvin tunnetusta lämmöntoistoyhtälöstä: 1) Lämpötila T (t) = Päätelämpötila + (Alkulämpötila -Päätelämpötila) · e'^ Täten, mikäli kysymyksessä oleva ajanjakso t on yhtä suuri kuin tau, niin = e'1 » 0,37. Näin ollen, T (t) (jossa 20 t = tau) on lämpötila, joka on sama kuin alkulämpötilan summa, ynnä 63 % (Päätelämpötila - Alkulämpötila). Tällaisista arvoista osoittautuu, että kyvetissä olevan nesteen tau on noin 3,5 sekuntia. Suositussa muodossa, käyttäen alumiinin ja reaktiolokeron välissä olevaa kerrosta, ei 29 tau, lämpöaikavakio, edelleen ole suurempi kuin noin 10 sekuntia kun neste kyvetissä on vettä.
Vaihtoehtoisesti, voi lämpölähde olla defokusoitu laser. Vain puhtaan polyesterikerroksen käyttö lämmönsii-rtoseinänä pidetään tässä tapauksessa parempana, ja reak- 30 tiolokeron sisään vietävän väriaineen absorptioaallonpit-uus on sopiva laserille.
Suojaus
Nyt suuntaudutaan keksinnön toiseen aspektiin, vahvistetun DNA:n on oltava suljettuna kyvetin sisään. 35 Tämä tarkoittaa, että vahvistukseen tarvittavat reagens- 16 94360 sit, so., alukesäikeet, deoksiribonukleotidit ja jatkoent-syymit, on joko esisisäänviety kyvettiin ennen nukleiini-happoainenäytteen lisäämistä, tai ne lisätään näytteen mukana. Detektointiaine on mieluummin esisisäänviety ennen 5 näytteen lisäämistä, niin, että näytteen lisäämisen jälkeen ja ennen vahvistusta, kyvetti on suljettu tiiviisti vuotoilta, kun lisäpääsyjä ei ole tarvittu. Vaihtoehtoisesti voidaan kyvetti kuitenkin rakentaa niin, että se sallii detektointiaineen lisäämisen säilytyslokeroon vah-10 vistuksen jälkeen, mikä edellyttää seuraavia varotoimenpiteitä: 1) säilytyslokeron (-lokeroiden), johon (joihin) ne lisätään täytyy olla erillään vahvistukseen käytetystä reaktiolokerosta, ja 2) täytyy olla järjestetty välineet kuten yksisuuntaiset takaiskuventtiilit, jotka sallivat 15 säilytyslokeroiden reagenssisyötön vahvistettuun nukleiinihappoon, mutta ei vahvistettua nukleiinihappoa säilytys-lokeroihin.
Keksinnön lisäaspektin mukaan, kyvetti varustetaan välineillä yhteyden järjestämiseksi säilytyslokeroiden ja 20 detektointilokeron väliin. Yhdessä suoritusmuodossa, täl laiset yhteysvälineet käsittävät välineet kuten paineistavat osat reagenssien siirtämiseksi säilytyslokerosta de-tektointipaikkaan, esim., erilliseen detektointilokeroon.
Vaihtoehtoisesti, ja mieluimmin, ovat paineistavat 25‘ osat kyvetin ulkopuolella, ja kyvetin seinät ovat tarpeeksi joustavat paineen välittämiseksi ulkopuolelta sisäpuolelle, paineistaen ja siirtäen täten reagenssit kyvetin sisällä. Mitä tahansa ulkopuolista painelähdettä voidaan käyttää, esim., puristusrullaa tai ilmasylinterin mäntää. 30 Esimerkilliset kvvettisuoritusmuodot
Keksinnön kyvetti 10 voi esittää joustavia lokeroita, kuvio 1, jotka toimivat yhdessä ulkopuolisten paineistavien välineiden 60 kanssa, kuten puristusrullan kanssa, keksinnön kokonaislaitteen järjestämiseksi. Seikkape-35 räisemmin, kyvetti 10 käsittää kaksi suhteellisen ohutta li 94360 levyä 12, 14 muotoiltu sellaisiksi puristemuovauksella ja liittyvät yhteen taskuilla tai lokeroilla ja yhdistävillä käytävillä, jotka työntyvät esiin levyjen kontaktitasosta, Kuvio 2. Levyt on kiinnitetty toisiinsa, ainakin pit-kin 5 niiden ulkoista kehää 16, ja mieluummin kaikissa lo-keroi-ta ja käytäviä ympäröivissä pisteissä, kuten esimer-kiksi lämpö- ja/tai ultraäänipuristuskiinnityksellä. Läm-pöakti-voitavissa oleva sideaine etyylivinyyliasetaatti on käyttökelpoinen tällaiselle yhteenliittämistoimenpiteelle. 10 Nesteen sisäänruiskutusaukko 22 on poikkeus suljetulle kehälle ja sitä käytetään yhteensopivan pipetin kanssa. Tämä aukko 22 käsittää lisäksi sen sisään, kuvio 4, ulottuvan jäykän reunuksen 23, jonka sisään sijoitetaan pipetti 24.
Lokerot ovat seuraavat: lokero 26 on reaktiolokero, 15 johon on valinnanvaraisesti vahvistavat reagenssit 28 esi-sisäänviety, kuvio 2, nestemäisessä tai kuivassa muodossa. Lokero 30, kuvio 1, on säilytyslokero ensimmäistä huuhtelua varten, lokeron sisältäessä huuhteluvettä esi-sisään-vietynä reagenssina. Lokero 32 on säilytyslokero sisältäen 20 ainakin yhden detektointiaineen esisisäänvietynä siihen, nimittäin biotinyloidun koettimen, jonka toisessa päässä on täydentävä, vahvistettuun DNA:hän kiinnittyvä nukeloti-di, ja mieluummin myös signaalia tuottavan osan, esim., avidinin, joka on sidottu edellä kerrottuun piparjuuripe- 25 roksidaasiin. Säilytyslokero 34 on toinen huuhteluvettä sisältävä säilytyslokero, jonka tilavuus on mieluummin paljon suurempi kuin säilytyslokeron 32 tilavuus. Säily-tyslokerossa 36, esisisäänvietynä sen sisään, pysyvät de-tektointireagenssit, nimittäin peroksidi ja leukoväriaine, 30 esim., 2-(4-hydroksi-3,5-dimetoksifenyyli)-4,5-bis(4-me-toksifenyyli)imidatsoli, mieluummin yhdessä stabiloimis-aineen poly(vinyylipyrrolidonin) kanssa. Säilytyslokerossa 38, esisisäänvietynä sen sisään, on pysäytysliuos, esim., natriumatsidiliuos, joka estää liikaleukoväriaineen siir-35 tymästä väriin.
94360 18
Lopuksi, lokero 40 on tämän suoritusmuodon detek-tointipaikka, jota käsitellään jäljempänä, ja lokero 42 on jätelokero, joka mieluummin on alussa tyhjennetty laajenemisen turvaamiseksi kun nestettä puserretaan siihen. Loke-5 ro 42 on yhteydessä lokeroon 40 kanavan 44 kautta. Lisäksi voidaan yksisuuntainen takaiskuventtiili sisällyttää kanavaan 44 jätenesteen estämiseksi takaisinvirtaamasta lokeroon 40, aiheuttaen ei toivottuja taustavärejä.
Väliliitännät ovat seuraavat: kanava 21 yhdistää 10 injektioaukon 22 lokeroon 26, kanava 44 yhdistää reaktio-lokeron 26 detektointilokeroon 40, lukuunottamatta, että tilapäinen sulku on järjestetty paikkaan 46 pitämään si-säänviedyn DNA:n lokerossa 26 kunnes rulla 60 tuottaa painetta. Kanava 48 yhdistää lokeron 30, kanava 49 yhdistää 15 lokeron 32, kanava 50 yhdistää lokeron 34, kanava 52 yhdistää lokeron 36 ja kanava 54 yhdistää lokeron 38, kaikki detektointilokeroon 40, taas jokainen mieluummin tilapäisellä sululla 56, kuvio 2, joka keskeyttää virtausta ulos vastaavista lokeroista kunnes rulla 60 katkaisee su-20 lun. Kanava 54 toimii päälinjana, johon muut (48, 49, 50 ja 52) on liitetty.
Lokerot sijaitsevat harkitusti, kuvio 1, niin, että jokainen tyhjentyy lokeroon 40 oikeassa järjestyksessä rullan 60 edetessä pitkin reittiä A:ta nuolten 62 suunnas-25 sa. Täten, ensin vahvistettu DNA painetaan lokeroon 40, sitten ensimmäinen huuhtelu, sitten detektointikoettimen lokerosta 32, sitten toinen huhtelu, sitten leukoväriaine-liuos ja lopuksi pysäytysliuos. Eräissä tapauksissa värin kehittäminen leukovärlaineesta tehdään pimeässä, esim., 30 mikäli väri helposti haalistuisi valossa. Vastaavat kanavat konstruoidaan mieluummin myös niin, että rullat puristavat niitä - so. , ne konstruoidaan aina muodostaen kulman nuolien 62 kanssa, joka on pienempi kuin suora kulma, reitin A:n sisällä. Mikäli ne muodostaisivat suoran kulman, 35 olisi rullalla taipumus hypätä kanavien yli, mieluummin kuin pusertaa niitä.
94360 19
Ei ole tähdellistä, että molemmat levyt 12 ja 14 ovat rullan 60 kokoonpuserrettavissa - vain, että ainakin toinen niistä on vähintään 170 g/cm:n paineen alaisena. Niinkin korkeat paineet kuin 1500 g/cm ovat käyttökelpoi-5 set. Täten, kuvio 5, levy 12 voi käsittää kokoonpuristet- tavissa olevan, suhteellisen joustavan muovin kuten kuu- . . . ® masaumattavissa olevan polyesterin, esim., Scotchpak polttokuumasaumattavissa olevan kalvon no. 229, joka on 3M:n valmistama, kun taas levy 14 voi olla vähemmän jous-10 tava ja kokoonpuristettavissa, tai se voi olla yhtä joustava kuin levy 12.
Ainakin lokeron 26 suhteen, levy 14 voi käsittää laminaatin alumiinilevystä 64 ulkopuolella, kuvio 5, ja polymeerikerroksen 66 sisäpuolella, mieluummin polyeste-15 rikerroksen, kuten levy 12. Alumiinilevyn paksuus on mieluummin noin 0,0013 cm:n ja noin 0,026 cm:n välillä, ja mieluimmin noin 0,005 cm. Kerroksen 66 paksuus on noin 0,0013 cm:n ja noin 0,03 cm:n välillä, ja mieluimmin noin 0,005 cm. Jopa kerroksen 66 läsnäollessa, ei lokeron 26 20 lämpöreitin pituus ole enemmän kuin noin 0,3 mm ja lämpö-vastus ei ole suurempi kuin 5,0 °C/W. Laminaattikonstruk-tion paremmuus muoviseen yksilevyyn nähden on se, että heti kun rulla on kokoonpusertanut lokeron, vastustaa alumiini jälleenpaisumista, joka voisi sallia, että myötä-2& virtaan paineen alaisena olevien nesteiden takaisinvirtaa-minen tapahtuu. Tästä syystä, on levy 14 konstruoitu mieluummin laminaattina kyvetin 10 koko pituudelta.
Pidetään parempana, että neste, kun se työnnetään ulos lokerostaan, ei virra takaisin kanavaan, jota käyte-30 tään kauempana myötävirtaan olevan toisen lokeron tyhjentämiseksi. Tätä tarkoitusta varten, kun rulla 60 etenee vasemmalta oikealle, kuvio 1, voidaan käyttää puristavia välineitä, jotka laskeutuvat kyvetin 10 päälle ja puristavat kanavat kiinni seuraavasti: 94360 20
Rullan 60 liikkuessa lokeron 26 yli, tapahtuu puristus pisteessä P,. Sen liikkuessa lokeron 30 yli, tapahtuu puristus pisteessä P2, ja samalla tavalla pisteessä P3 lokeron 32 suhteen, P4 lokeron 34 suhteen ja piste Ps loke-5 ron 36 suhteen.
Vaihtoehtoisesti, voidaan sisällyttää esihuuhtelu- lokero, kuvio 6, jotta varmistettaisiin, että kaikki ulos- pääsykanavat täytettäisin ensin vedellä, niin, että vasta-virtalokerot eivät aiheuttaisi vastavirtausta myötävirta-10 lokeroiden kanavissa. Aikaisemmin kuvatut samanlaiset osat kantavat samoja viitenumerolta, joihin luokitteleva suffiksi "A” on lisätty.
Täten, kuvio 6, ihan ensimmäinen lokero, jonka rulla 60 kohtaa voi olla säilytyslokero 61, joka sisältää 15 huuhteluvettä, joka tyhjentyy kanavan 62 kautta pääjohtoon 54A. Muut kanavat 44A, 48A, 49A, 50A ja 52A yhdistyvät vastaavista lokeroistaan aikaisemmin kuvatulla tavalla. Injektiokanava 21A ja aukko 22A lokeroon 26A siirretään kyvetin 10 vastakkaiselle reunalle, lokeron 61 takia. Lo-20 keron 61 ja kanavan 62 tehtävä on täyttää ääriään myöten kaikkien lokeroiden kaikki kanavat huuhteluvedellä lokerosta 61, rullan painaessa litteäksi ko. lokeron. Tämän jälkeen, kun jokainen perättäinen lokero on litistetty rullalla, ei tule olemaan mitään mahdollisuutta, esim., 25 lokeron 26A vahvistetulla DNA:11a, työntyä johonkin kanavaan 48A, 49A, 50A tai 52A, siinä olevan veden johdosta. Tämä vesi ei tule haitallisesti vaikuttamaan jokaisen lokeron sisällön siirtämiseen detektointilokeroon.
Lokero 61 voi järjestää lisähyödyn sallimalla lo-30 keroissa 32, 36 ja 38 säilytettyjen kuivuneiden reagens-sien jälleenmuodostumisen. So., mikäli jäljempänä kuvattu, jokaisen lokeron uloskäynnin sulkemiseksi, sen vastaavasta kanavasta, käytetty kevyt kuumasulku jätetään pois, ja nämä reagenssit ovat kuivuneet lokeroissaan, sen jälkeen, 35 kun rulla on puristanut lokeron 61 täyttämään kyvetin ve- 94360 21 della, tulee lokeron 61 vesi jälleenmuodostamaan kuivuneet reagenssit. Tämä voidaan lisäksi auttaa ravistelemalla ky-vettiä. Jälleenmuodostamisvaihe voi tapahtua ennen näytteen sisäänruiskutusta reaktiolokeroon tai sen jälkeen, 5 tai ennen vahvistusta reaktiolokerossa tai sen jälkeen.
Edellä kuvatuille suoritusmuodoille on luonteenomaista jokaisen lokeron perättäinen pusertaminen. Lisäksi, kaikkien nestettä sisältävien lokeroiden samanaikaista pusertamista voidaan käyttää edellyttäen, että käytetään 10 puristuspisteitä Pi-P5. So., mikäli painetta ohjataan kaikkiin pisteisiin P,-P5 sulkemaan ulospääsykanavat lukuunottamatta kanavaa 44, voidaan painetta samanaikaisesti ohjata (esim., tarkoituksenmukaisesti sijoitetulla ilma-män-tällä) kaikkiin lokeroihin 26, 30, 32, 34, 36 ja 38. Kui-15 tenkin, koska ainoastaan kanava 44 on sulkematta, tulee vain vahvistettu DNA siirtymään. Tämän jälkeen, päästetään vain puristuspiste P, vapaaksi, joka sallii huuhtelunesteen siirron ulos kanavan 49 kautta, ja niin edespäin kunnes puristuspiste P5 on päästetty lopuksi vapaaksi. Huolta on 20 kannettava varmistamaan, että käytetty paine on pienempi kuin paine, joka on tarpeen saumojen, jotka sulkevat nesteen vastaaviin lokeroihin ja kanaviin, murtumiseen.
Detektointilokero 40, kuviot 1 ja 3, on läpivir-tauslokero, joka käsittää detektointiosan 39, joka on kan-25 tava levy 41, jolle on sijoitettu elementit 43, 43', 43'' ja 43'''. Mikäli käytetään oligosieppausmenetelmää, silloin jokainen elementti käsittää polymeerihelmet, joihin on liikkumattomasti liitetty edellä mainittu detektointi-koetin, joka on konstruoitu hybridisoitumaan detektoitavan 3.0 DNA:n kanssa. Mieluimmin, jokaisella helmellä on eri de-.*· tektointikoetin eri DNA:ta varten, niin, että mikäli riittävästi erilaisia helmielementtejä on läsnä, esim., 8 -10, voidaan kudosmäärittely tehdä perustuen siihen mitkä helmet muuttavat väriä lokeron 36 väriaineesta. Tällaiset 35 lateksihelmet ovat tavanomaiset.
22 94360
Levy 41 valitaan materiaalista, joka sitoo helmi-elementit, pitääkseen ne paikallaan kun ne kerrostetaan ja kuivatetaan valmistuksen yhteydessä. Käyttökelpoiset esimerkit sisältävät selluloosanitraattia, huokoisia nailon-5 kalvoja kuten ne, jotka Pali Corp. valmistaa, ja mieluimmin lateksilla päällystetyn paperin. Esimerkki tällaisesta lateksilla päällystetystä paperista on seuraava: noin 54 g/m2 painava paperin, jonka paksuus on noin 0,6mm, ja sisäinen liimaus on neutraali, ja valmistettu n.80%:sesti 10 kovapuusta, pinta voidaan liimata ja sitten päällystää keskimäärin noin 7 g/m2 painavalla lateksipäällysteellä, ja päällyste koostumusosat ovat tavallinen teollinen laa-tulateksi, 20 painoprosenttinen NaOH, TSPP dispergointi-aineena, samentimia kuten piidioksidi ja titaanidioksidi, 15 hydrasperssinen alumiinioksidi, ja loput tislattua vettä.
Levyt 12 ja 14 on valmistettu ja koottu seuraavasti: levy 14 on esipuristemuovattu muodostetuilla lokero-syvennyksillä kuten näytetään kuviossa 1 ja 2. Levy 14 i * käännettynä ylösalaisin, syvennyksiä muodostavien kuppien 20 kanssa, voidaan reagenssit laittaa paikoilleen, kuten kui-vareagenssit 28 ja lokeroihin 30, 32, 34, 36 ja 38 menevät nesteet. Seuraavaksi, levy 12, nyt "ylälevynä", tuodaan päällekkäisasentoon, pääasiallisesti litteänä, lukuunottamatta toisiinsa liittyvän syvennyksen kohdalla näytettynä 25 pisteessä 26' kuviossa 2. Molemmat levyt kiinnitetään kevyesti toisiinsa jokaisen lokeron kehän kohdalta kuten näytetään ristiviivoituksella, kuvio 1, lukuunottamatta kanavan 21 ja lokeron 26 liitoskohtaa 25. Esim., kevyt kuumasaumaus tulee sitomaan molemmat muovilevyt toisiinsa 39 näissä kohdin, mukaanlukien vastaavaan poistokanavaan me-* nevän lokeron poistoaukko. Tämä aikaansaa tilapäisen tuloksen nesteelle, joka sisäänvietynä lokeroon liikkuu ulos siitä, tukoksen, josta kuitenkin päästään kun rullaa 60 käytetään. (Tällaiset tilapäiset tukokset näkyvät katko-35 viivana kanavien 48, 49, 52 ja 54 poikkileikkauskuvassa, li 23 94360 kuvio 2, ja edustaa separointipaikkaa kun neste puserretaan ulos tähän tilapäiseen tukokseen johtavasta lokerosta) .
Tämän jälkeen saumataan vahvasti, esim., kuumasau-5 mauksella, jokaisen lokeron ja sen poistokanavan ympäri, mutta ei kanavan ja lokeron liitoskohdan yli. Myös ulkoinen periferia 16 kuumasaumataan. Saumaus lokeroiden ympäri varmistaa, että lokeroista puserrettu neste tulee virtaamaan vain pitkin vastaavia kanavia eikä muualle levy-10 jen 12 ja 14 välissä.
Kun kyvettiä 10 käytetään, ruiskutetaan potilasnäy-te 5 aukosta 22 lokeroon 26, kuvio 5, pipetin 24 avulla. Tämä aikaansaa, että alaspainunut osa 26' "ponnahtaa tarpeeksi ulos", jotta se olisi osapuilleen tasapintainen 15 levyn 12 loppuosan kanssa, mikä näytetään ääriviivakuvana kuviossa 2 ja yhtenäisenä viivana, kuviossa 5.
Vaihtoehtoisesti voidaan osa 26' pusertaa "ponnahtamaan ulos" levyn 12 loppuosan tason yli, muodostamaan vastapäisen kuplan 26'', kuvio 19. Lisäksi, kuten näyte-2C tään kuviossa 19, levyissä 12 ja 14 ei tarvitse olla mitään metallista komponenttia tai kerrosta, ja ne voi koostua tyystin muovista. So., jopa vain muovilevy voi järjestää riittävät lämmönsiirtomäärät.
On tärkeää, että aukko 22, kuvio 1 ja 4, on suljetit tavissa pipetin 24 poisvetämisen jälkeen, ennen vahvistusvaihetta. Tämä voidaan toteuttaa kuumasaumaamalla aukko kiinni, tai sulkemalla aukko sopivalla tavalla, kuten kuumasaumaamalla liuskat 12 ja 14 vahvalla saumalla, tai konstruoimalla reunaan 13 takaiskuventtiili, jota ei näy-30 tetä. Mikäli aukko kuumasaumataan, jätetään mieluummin " reuna pois ja pipetti 24 työnnetään yksinkertaisesti suoraan aukkoon. Käytti mitä tahansa sulkemistapaa, sen tulisi olla tehokas vastustamaan kaikkia PKR-vahvistuksen tai nestesiirron aikana kehittyviä paineita. Etusijainen 35 menetelmä on kuumasaumaus.
24 94360
Kuten edellä on todettu, lämmittäminen ja jäähdyttäminen tarvittavan lämpö-PKR-vuorottelun järjestämiseksi tapahtuu lämmittämällä yhtä levyä tai molempia levyjä 12 ja 14 lokeron 26 kohdassa.
5 Kun vahvistettu DNA tunkeutuu lokeroon 40, se pide tään siellä lyhyen ajan, sillä aikaa kun lämpöä suunnataan levyn 14 läpi, hybridisoinnin aikaansaamiseksi. Levy 14 on etusijaisesti läpikuultava lokeron 40 kohdassa sopivan aaltopituuden säteilytransmission sallimiseksi, esimerkik-10 si näkyvien aaltopituuksien, sisällön tutkimiseksi. Lokero 42 voi laajentua, niin että nestevirtaus kuten myös ilmavirtaus mahtuvat, koska se on mieluummin tyhjennetty ennen käyttöä. Vaihtoehtoisesti voivat instrumentit, joita on käytetty kyvetin valmistamiseen, sisältää tyhjiölevyn, 15 joka oikaisee lokeron 42 täyteen puhallettuun muotoonsa, kuten näytetään kuviossa 3, kun hukkatilavuus on tarpeen.
Ei ole tärkeää, että kaikki lokerot on suljettu pois atmosfääristä vahvistuksen aikana ja vahvistuksen jälkeen, kuvio 7 ja 8, edellyttäen että ne on konstruoitu 20 niin, että ne estävät vahvistetun DNA:n takaisinvirtauk-sen tunkeutumasta niihin. Osat, jotka ovat samanlaiset kuin aikaisemmin kuvatut, kantavat samat viitenumerot, joihin on lisätty erottava loppuliite B.
Täten, kyvetissä 10B on kaikki lokerot 26B, 30B, 25 32B, 3.4B, 36B, 38B> 40B ja 42B, kuten aikaisemmin, ja nii den väliset kanavat on kytketty niin, että ne toimivat kuten aikaisemmin. Joka ikisellä on kuitenkin kehässä 16B nesteen sisäänruiskutusaukko 70, joka järjestää, yhdyska-navan 72 kanssa, nestereitin atmosfääristä vastaavaan lo- 30 keroon. Tällaisessa konstruktiossa, ainoastaan lokerossa • · •J 26B on nesteitä DNA-vahvistuksen aikana, nimittäin näyte-DNA ja vahvistusreagenssit. (Sen injektioaukko 22B on kiinni tämän aikana.) Muut lokerot voidaan jättää auki, niiden päästökanavien liitoskohtaan muodostettujen tila-35 päisten lämpösaumojen johdosta. Lisäsuojana, voidaan taka-
II
25 Q Λ 7 <ΤΠ
JUU
iskuventtiili 80 sijoittaa kanavaan 54B, estämään DNA:n takaisinvirtaamisen näihin lokeroihin. Tällainen venttiili on tavanomainen, ja voi sisältää, esim., kuvio 8, istukan 82, ja pallon 84, joka, työnnettäessä sitä vastavir-5 taan, istuutuu istukalle 82 ja pysäyttää virtauksen. Pallo 84 on kuitenkin vapaa virtaamaan myötävirtaan pientä pysäytintä 86 vastaan.
Venttiili 80 sijaitsee etusijaisesti pääkanavassa 54B, koska tämä sallii yhden venttiilin palvelevan kaik-10 kia säilytyslokeroita, ja se on poissa reitistä A, so., se ei edusta estettä puristusrullan kululle.
Sen jälkeen kun jokainen säilytyslokero on saanut tarkoituksenmukaisen nesteen pipetistä, kuvio 6, ja ennen kuin puristusrulla liikkuu reittiä A:ta pitkin, suljetaan 15 jokainen aukko 70 tiiviisti tavalla, joka on samanlainen kuin aukon 22A sulkemisen tapa. Vaihtoehtoisesti voidaan aukkoa 70 käyttää täyttöteknisenä suoritustapana kaikkien reagenssien esi-sisäänviemiseksi.
Jäljellä olevissa suoritusmuodoissa, väline vahvis-20 tetun DNA:n ja detektointimateriaalin siirtämiseksi, tai kaikkien lokeroiden yhdistämiseksi nestemäisesti, lokeroiden kokoonmenevien joustavien seinien asemesta, on mäntä mäntäkammiossa, joka muodostaa tarkoituksenmukaisen lokeron. So., männät ovat lokeroiden joustavien seinien ekvi-25 valenttejä.
Täten, kuviossa 9-12, kyvetti 100, kuvio 9, käsittää reaktiolokeron 126, jossa on lämmönsiirtoseinä 114, kuvio 10, säilytyslokero 132, kuvio 9, detektointiainetta varten, säilytyslokero 134 huuhtelua varten, säilytysloke-30 ro 136 leukoväriainetta varten, säilytyslokero 138 pysäy-tysliuosta varten ja toinen säilytyslokero 139 huuhtelua varten, ja näistä jokaisesta johtaa vastaava kanava 144, 149, 150, 152, 154, ja 156. Seinä 114 on konstruoitu etusi jaisesti kuten aikaisemmissa suoritusmuodoissa. Näissä 35 jokaisessa lokerofunktiossa on mäntäkammio, ja jokaiseen 94360 26 kammioon on asennettu mäntä 113 tai 115, joka on sijoitettu lokeron reagenssin ulkopuolelle. Männät ovat etusijai-sesti kaksinkertaisesti tiivistäviä, kuten näytetään, ja sisältävät välineet, kuten loven (ei näytetty), ohjaus-5 käyttölaitteen pakkokytkemiseksi (ei näytetty). Kanavat 149 ja 150 yhdistyvät lokeroon 126, kuviot 9 ja 12, liittymällä yhteen ja muodostamalla kanavan 151. Sisääntuleva DNA näyte syötetään myös lokeroon 126 kanavan 121 kautta nesteen sisääntuloaukosta 112, joka on varustettu ulkoi-10 sella reunalla 123, kuvio 9.
Kanavat 152, 154 ja 156 yhdistyvät, kuvio 12, kanavaan 155, johon kanava 146 syöttää lokerosta 126, kuvio 9. Kanava 155 haarautuu sitten ja muodostaa kanavan 157, joka johtaa lokeroon 140, ja ulospääsykanavan, joka päät-15 tyy kohtaan 159 reunuksen 123 sisään. Reunus 123 on sisäisesti kierteitetty, ei näytetty, vastaanottamaan ulkoisesti kierteitetyn tulpan, jotta tulppa voisi sulkea pois sekä sisäänvientiaukon 122 että ulospääsykanavan 159.
Koska ei ole olemassa mitään joustavaa laajennus-2C seinää, on järjestetty erillinen mäntäkammio 182 ja mäntä 184, jotka sallivat ilmaekspansion detektointilokerosta 140, kuviot 9, 11 ja 12. Kammio 182 on yhdistetty kanavan 185 kautta lokeron 140 pohjaan. Tämä voidaan tehdä vetämällä manuaalisesti takaisin kammionsa sisällä oleva raän-25 tä 184. Kara 187 voi työntyä esiin männästä 184 helpottaakseen männän ulosvetämistä.
Viitaten erityisesti kuvioon 9, on läpivirtauslo-kerossa 140 ylempi osa 190, johon neste tunkeutuu ensin siirrettäessä sitä muista lokeroista, ja alempi osa 192, 30 kuvio 10, joka on separoitu ylemmästä osasta läpäisevällä
• I
kalvolla 194. Alempi osa 192 täytetään pääasiallisesti imukykyisellä aineella 196, joka on tarkoitettu absorboimaan kaikki liikanesteet, jotka tunkeutuvat lokeroon 140. Kalvo 194 on etusijaisesti valettu, kudottu tai sähköopti-35 sesti työstetty mikrosuodatuskalvo. Absorboivana aineena 27 Q Λ 7 £ n voidaan käyttää kaikkia sopivia aineita, esim., selluloo-sa-asetaattia.
Kalvo 194 toimii auttaakseen vapaan, reagoimattoman detektointimerkkiaineen, separoinnisssa niistä, jotka 5 ovat hybridisoituneet DNArhan. So., detektointikoetinta lokerossa 132 on konstruoitu sekä hydridisoitumaan lokerossa 126 olevaan vahvistettuun DNA:han, että tarttumaan kalvoon 194 (tai kalvon sieppaamiin helmiin) heti kun neste tavoittaa lokeron 140. Tällaiset koettimet sisältävät 10 myös merkkiaineen, kuten piparjuuriperoksidaasin, joka reagoi leukoväriaineen ja peroksidin kanssa, kun nämä materiaalit saavuttavat lokeron 140.
Lokeroiden 132, 134, 136 ja 138 täyttö voidaan aikaansaada lisäämäällä nestettä ja viemällä männät sisään. 15 Vaihtoehtoisesti voidaan esipakattuja ampulleja (ei näytetty) viedä sisään, joita seuraavat männät, ja kun ampullit ovat särkyviä niin mäntien puristaessa ampullit särkyvät ja vapauttavat nesteen.
Nesteen siirto kyvetissä 100 säädetään kaikki män-20 nillä 113, 115 ja 184, ja mäntää 184 käytetään muiden mäntien siirtämisen sallimiseksi tarvittavan tyhjiön kehittämiseen.
Vaihtoehtoisesti (ei näytetty), voidaan lisätä lisä lokero ja mukana seuraava mäntä syöttämään lisäentsyy-25 miä lokeroon 126, niin, että voidaan vastustaa kaikkia denaturointivaiheen entsyymideaktivointeja lisäämällä enemmmän entsyymiä.
Täten, kyvetin 100 käyttö on seuraava: lähtien männistä, jotka on sijoitettu kuten kuviossa 8 on näytetty, 3Q ruiskutetaan DNA-näyte pipetin kautta sisään aukosta 122.
• · ·· Näyte kulkee kanavan 121 läpi ja tunkeutuu lokeroon 126, jossa vahvistusreagenssit ovat läsnä, tai ne sisäänviedään yhdessä DNA:n kanssa. Ulospääsyaukko 159 ja kanava 155 sallivat, että etenevä neste pusertaa ilman pois lokerosta 35 126. Tämän jälkeen pannaan tulppa reunuksen 123 sisään, 94360 28 joka sulkee pois aukot 122 ja 159. Lokerolle 126 tehdään terminen vuorottelu, käyttämällä lämmönsiirtoseinää 114, kunnes toivottu DNA vahvistus on aikaansaatu. Tähän pisteeseen asti ei ole siirretty mäntiä.
5 Seuraavaksi työnnetään lokeron 132 mäntä 113 eteen päin lokeron 132 detektointiaineen pusertautiseksi lokeroon 126. So., jos kysymyksessä on avidiinihelmisieppausmene-telmä, sisältää lokeron 126 sisältö etusijaisesti polymee-rihelmiä, joihin avidiinin kautta on sidottu biotinyloitu 10 aluke, joka vahvistetun DNA:n kanssa pystyy laajenemaan lämpökäsittelyvaiheessa vahvistetun DNA:n kopioimiseksi. Lokero sisältää myös detektointikoettimen,joka on nukleotidi, joka on konstruoitu hybridiso ituinaan sellaiseen osaan kuten piparjuuriperoksidaaseen tarttuneen laajenne-15 tun alukkeen kanssa. Männällä 115 voi puristaa sisään vähän huuhteluliuosta lokerosta 134, jotta varmistettaisiin, että kaikki detektointireagenssit olisivat läsnä lokerossa 126, jos näin haluttaisiin. Ravistelemalla koko kyvettiä, millä tahansa tavanomaisella keinolla, voidaan sekoitus 20 saada aikaan. Detektointikoetin hydridisoidaan vahvistettuun DNA:hän tavanomaisella vaiheittaisella lämpösäädöllä, seinän 114 läpi, esim., 42 °C:een lämmityksellä viiden minuutin ajan.
Seuraavaksi puserretaan lisähuuhteluliuosta sisään 25 lokerosta 134, hybridisoidun nesteen huuhtelemiseksi lokerosta 126 detektointilokeroon 140. Mäntää 115 työnnetään myös eteen huuhteluliuoksen pusertamiseksi lokerosta 139 kanavien 156 ja 155 kautta, kaiken vielä kanavaan 155 jääneen hybridisoituneen nesteen huuhtelemiseksi, lokeroon 3Q 140, ja eristää täten kaiken lokeroon 144 jäljelle jääneen ·· hybridisoituneen nesteen leukoväriaineesta, jonka on määrä seurata. Päästetään tarpeeksi huuhteluliuosta lokeroiden 126 ja 140 läpi, kalvon 194 läpi absorboimisaineeseen 196 tapahtuvan kaikkien aineiden, kuten vapaiden detektointi-35 koettimien, joita ei ole sidottu sieppausvälineisiin, kul- 29
Qa 7 kemisen varmistamiseksi. Etupäässä tätä huuhteluvaihetta varten joudutaan vetämään mäntä 184 takaisin lokerosta 126 lokeroon 140 tapahtuvan nestesiirron vastapaineen vastustamisen estämiseksi.
5 Seuraavaksi syötetään ensin lokeron 136 leukoväri- aine ja sitten lokeron 138 pysätysliuos kanaviin 155 ja 157 ja sitten lokeroon 140, työntämällä niiden vastaavat männät 113 eteenpäin. Tämä tulee aiheuttamaan tarkoituksenmukaisen värimuodostuksen kalvossa 194, mikäli vahvis-10 tettu DNA on läsnä. (Mikäli se ei ole läsnä, koska kaikki vapaa detektointiaine on jo huuhtoutunut pois absorboimi-saineeseen 196, ei tule muodostumaan mitään värejä ja testi tulee osittamaan "negatiivista11.)
Ei ole tähdellistä, että erillinen detektointiloke-15 ro on läsnä, jotta olisi detektointipaikka. Niin kuin on selitetty liittyen seuraavaan suoritusmuotoon, voi detektointipaikka olla reaktiolokero. Aikaisemmin kuvattujen, samanlaisten osien viitenumerot ovat samat, ja näihin on lisätty tunnusomainen loppuliite "C".
20 Täten, kuvio 12, kyvetissä 100C on lokerot 126C, 132C, 134C, 136C, 138C ja niiden kanavat, jotka johtavat toisistaan toisiinsa ja sisääntuloaukosta 122C kuten aikaisemmin. Käytetään mäntiä 113C, 115C ja 184C nestesiir-toihin kuten aikaisemmin, DNA-vahvistuksen jälkeen, joka 25 etenee kuten aikaisemmin. Lokero 132C sisältää detektoin-tireagensseina, magneettisia helmiä, jotka on muodostettu polymeereistä, jotka sisältävät magneettisia täyteaineita, joihin hydridisoiva aine yhteensopivilla DNA-sekvensseillä on sidottu. Tämä on tarkoitettu tuottamaan hybridejä toi- 3Q sessa päässä, esim.,vahvistetun DNA:n päässä. Tämän vah-• » vistetun DNA:n toinen pää on määrä hybridisoitua piparjuu-riperoksidaasia kantavaksi detektointikoettimeksi, kuten edellä on kuvattu.
Tässä suoritusmuodossa aikaansaadaan, niiden detek-35 tointikoettimien, jotka eivät vielä ole hybridisoituneet 94360 30 DNA:ksi, separointi niistä, jotka ovat, seuraavasti: ruiskutettaessa huuhteluliuosta lokerosta 134C, järjestetään magneettikenttä lokeron 126C alapuolelle, pitämään helmi-reagenssit paikoillaan ja kaikki detektointikoettimet, 5 jotka ovat hybridisoituneet vahvistettuun DNA:hän. Tämä aikaansaa vapaiden detektointikoetinten ja niiden merkkiaineiden huuhtelemisen ulos lokerosta 126C ja lokeron 182C sisään, jonka mäntä 184C on vedetty takaisin, tilan tekemiseksi. Magneettikenttä pidetään edelleen yllä, salo maila kun leukoväriaine ja pysäytysnesteet siirretään sisään, ja ne aiheuttavat värimuodostumisen lokerossa 126C, reaktiolokerossa, mikäli jotain vahvistettua DNA:ta on läsnä.
Vielä muita vaihtoehtoja kuvioiden 8-12 kyvetille 15 on laajentaa lokerot 132, 134, 136, 138, 182, tai niiden "C" vastinosat, niin, että ne työntyvät 90° ulos kuvion 8 (ei näytetty) tasosta ja antavat kyvetille L-muodon. Tämän toimenpiteen etu on, että se yksinkertaistaa muotin rakennetta ja tuotantoa.
20 On mahdollista uuttaa DNA:ta soluista keksinnön ky- vetin sisällä, ennen kyvetin käyttöä olevan vaiheen asemesta. Tässä tapauksessa konstruoidaan kyvetti etusijäi-sesti niin kuin näytetään kuviossa 14, jossa aikaisemmin kuvattujen samanlaisten osien viitenumerot ovat samat, ja 26' joihin on lisätty tunnusomainen loppuliite "D".
Täten, kyvetissä 100D on samat lokerot 126D, 132D, 134D, 136D ja 138D kuten aikaisemmin, ja käytetään mäntiä 113D säilytyslokeroissa. Reunus 123D suojaa nesteen si- säänruiskutusaukkoa 122D, ja detektointi tehdään kalvolla 3Q (ei näytetty), kaikki niin kuin aikaisemmin on kerrottu.
* !! Sen sijasta, että kanava 12ID toimittaisi pipetoidun nes-tenäytteen suoraan lokeroon 126D, reaktiolokeroon, se toimittaa sen uuttolokeroon 200. Tässä tapauksessa on neste-näyte kokoveri tai verisoluliuos, josta pitäisi uuttaa 35 DNA:ta. Silloin kun tämä nestenäyte lisätään kyvettiin, 94360 31 voidaan alla käsiteltyjä uuttoaineita valinnanvaraisesti lisätä. Ne voidaan, vaihtoehtoisesti, esisisäänviedä lokeroon 200.
Lokerossa 200 käytetään mäntää 113D, kuten muissa 5 samanlaisissa lokeroissa, paitsi että se on täysin takai-sinvedetty, kuten näytetään, maksimitilan hankkimiseksi sisäänviedylle näytteelle. Kanava 121D liittyy lokeroon 200 pisteessä 201, joka on juuri männän 113D alapuolella.
Lokeron 200 vastakkaisessa päässä 202, yhdistyy 10 nestemäisesti kanava 204 välilokeroon 206, johon on sijoitettu suodatin 208, jonka läpi nesteen on kuljettava, lokeron 126D saavuttamiseksi. Suodattimen 208 huokoiskoot ovat sopivat solufragmenttien pidättelemiseksi suodatti-messa ja uutetun DNA:n läpipäästämiseksi. Esimerkiksi nai-15 Ionista tai polypropyleenistä tehty suodatin, jonka huo-koiskoko on noin 0,45 mikronia, on erityisen käyttökelpoinen.
Lokerosta 206 kuljettaa kanava 210 uutetun DNA:n ja liuottimen (esim. vettä) lokeroon 126D.
20 Käytössä, viedään nestenäyte lokeron 200 sisään, etusijaisesti yhdessä mahdollisen uuttoaineen kanssa. Voidaan käyttää mitä tahansa DNA-uuttomenettelyä, yhdessä yhtenäisten uuttoaineiden kanssa, kuten pinta-aktiivisten pesuaineiden. Suuresti suosittuna on liuoksen yksinkertai-25 nen lämmittäminen noin 5 minuuttia noin 95 °C:een lämpötilassa. Tällainen lämmitys denaturoi tehokkasti proteiinit ja 1iuentaa solut. Apuna tässä uuttomenetelmässä voidaan valinnanvaraisesti lisätä dekstraania 3 paino-%:n liuoksena, yhdessä 10 paino-%:n TX-100 liuoksen kanssa, 30 joka on ioniton pinta-aktiivinen pesuaine, joka on saata-·' vissa Rohm and Haas nimisestä firmasta. Lokeron 200 lämmittäminen voidaan nopeammin aikaansaada konstruoimalla ainakin osa 220 lokeron seinästä alumiinista, ja tämä alumiini ulottuu kyvetin ulkopohjaan asti (ei näytetty 35 erillisenä pintana). Kyvetin pohjapinnan lämmittäminen 94360 32 lokeron 200 vieressä lämmittää täten tehokkaasti lokeroa 200.
Sopivan inkubointiajän jälkeen, puserretaan lokeron 200 sisältö suodattimeen 208 työntämällä mäntä 113D 5 eteen.
Joissakin tapauksissa, voi olla toivottavaa, että detektointilokerossa on positiivinen ja negatiivinen kontrolli, yhdessä valikoidun DNA:n detektointipaikan kanssa. Kuviot 15 ja 16 ovat esimerkkeinä muunnelmasta, joka jär-10 jestää tämän. Aikaisemmin kuvattujen samanlaisten osien viitenumerot ovat samat, ja näihin on lisätty tunnusomainen loppuliite "E".
Täten, kuvio 15, on kyvetissä 100E lokerot 126E, 136E, 138E ja 182E, kuten aikaisemmin, tarkoituksenmukai- 15 sine mäntineen 184E, jne. Kanava 121E kuljettaa nestenäyt-
teen aukosta 122E reaktiolokeroon 126E, ja kanava 151E
syöttää myös nestettä tähän lokeroon. Toimitetaan bioti- nyloituja alukkeita sopivasta sijainnista, ja toimitetaan * ' leukovärlainetta ja pysäytysliuosta kanavan 155E kautta 20 kanavaan 157E, joka johtaa detektointipaikkaan. Kanava 144E järjestää pääsyn lokerossa 126E tuotetulle DNA tuotteelle näihin kanaviin 155E ja 157E. Kanavasta 157E tuleva neste kohtaa detektointikalvon 194E, joka on sijoitettu absorboimisaineen 196E yhteyteen, kuvio 16, kaikki kuten 26 aikaisemmissa suoritusmuodoissa.
Päinvastoin kuin aikaisemmissa suoritusmuodoissa, on kuitenkin kalvossa 194E erilliset alueet DNA-näytteen detektointia varten, merkitty "S”:llä; positiivista kontrollia varten merkitty "+":11a; ja negatiivista kontrol- 30 lia varten merkitty "-"rlla, kuvio 15. Positiivisen kon-» · trollin tarkoitus on varmistaa, että reagenssit tulevat tuottamaan DNA-signaalin (mieluummin värin), mikäli DNA on läsnä - so., hälyttää käyttäjää mikäli reagenssit ovat jollakin tavoin vialliset laiminlyömällä signaalin tuot-35 tamisen kohdassa "+". Toisaalta negatiivisen kontrollin ei 94360 33 tulisi tuottaa signaalia. Negatiivisen kontrollin ensisijainen tarkoitus on antaa käyttäjälle taustaväri, jota vasten näytteen väri voidaan verrata. So., heikko taustaväri voi esiintyä reagensseissa ulkoapäin tulevista syis-5 tä, ja on tärkeää, että näytteen väri on tiheydeltään huomattavasti suurempi kuin tämä, ennen kuin "positiivinen1' lukema luetaan testille kuuluvaksi.
On olemassa monta tapaa miten tämä voidaan tehdä. Kuvioiden 15 ja 16 suoritusmuodoissa käytetään menetelmää 10 avidiinihelmisieppausta. Tälle menetelmälle on tunnusomaista helmeihin kovalenttisesti tarttuneiden avidiinin ja streptavidiinin, biotinyloitujen alukkeiden, ja merkittyjen detektointikoettimien käyttö detektointiaineen osina. Ainakin koettimet pidetään mieluummin säilytysloke-15 roissa 250, 252 ja 254, kuvio 15. Jokainen lokero on omistettu yhdentyyppiselle detektointikoettimelle - lokerossa 250 on näyte-DNA-koetinta, lokerossa 252 negatiivisen kontrollin koetinta, ja lokerossa 254 positiivisen kontrollin koetinta. Mäntiä 260 käytetään pusertamaan nii-20 den vastaavia lokeroita, mieluummin samanaikaisesti, pakottaen sisällöt ulos vastaavien kanavien 262, 264 ja 266 kautta detektointilokeroihin 268, 270 ja 272, jotka on yhdistetty jokaiseen koettimeen ja jokaiseen koetinkana-vaan. Täten jokaisen detektointilokeron sisällä on vain 25 sen koetin, ja missään muussa ei ole kahta.
Vahvistetun DNA:n ja muiden reagenssien syöttämiseksi kaikkiin kolmeen lokeroon, jakautuu kanava 157E mieluummin kolmeen haaraan 274, 276 ja 278, kuviot 15 ja 16, jotka yhdistyvät detektointilokeroihin.
30 Tullaan ilman muuta arvostamaan, että kahdessa koi- • · *· mesta koettimesta on geneettinen aine, joka täydentää tarkoituksenmukaista DNA:ta. Näytekoettimessa on geneettinen komplementti kohteeksi asetetulle näyte DNAlle. Positiivisessa koettimessa on geneettinen komplementti aina läsnä-35 olevalle DNA:lie, ja joka mieluummin on, ainakin verisolu- 34 94360 tapauksissa, beeta-globiini. Negatiivisessa koettimessa on geneettinen komplementti, joka ei sovi yhteen minkään näytteessä olevan DNA:n kanssa. Tämä on tehty hyvin yksinkertaisesti konstruoimalla koetinelementti millä tahansa 5 geneettisellä koodilla, joka on sattumanvaraisessa järjestyksessä, näin ollen "hölynpöly" (nonsense) koodilla. Kuten tulee olemaan ilmeistä, menetelmä toimii seuraavasti: avidiinia-kantavat helmet säilytetään mieluummin koettimen kanssa lokeroissa 250, 252 ja 254. Kun vahvistettua DNA:-10 ta syötetään kanavien 274, 276 ja 278 kautta vastaaviin detektointilokeroihin, työnnetään männät 260 eteenpäin pusertamaan tarkoituksenmukaiset koettimet ja helmet näihin detektointilokeroihin. Nämä lokerot lämmitetään tarkoituksenmukaisesti, jotta aikaansaataisiin vahvistetun 15 DNA:n hybridisoiminen, erityisesti lokeroissa 268 ja 272, lokeroista 250 ja 254 tulevaan koettimeen. Pidetään parempana, että ei tapahdu mitään hybridisointia detektointilo-kerossa 270, koska ei olisi mitään "hölynpöly" DNA:ta läsnä, joka reagoisi negatiivisen kontrollikoettimen kanssa. 20 Huuhteluliuos puserretaan tämän jälkeen detektointiloke-roiden läpi huuhtelemaan kalvon 194E läpi kaikki ne merkityt koettimet, jotka eivät ole hybridisoituneet ja täten eivät ole tarttuneet helmeisiin, absorboimisaineeseen 196E. Huuhtelua seuraa yhteys leukoväriaineliuokseen ja 25 sitten yhteys pysäytysliuokseen.
Vielä toinen menetelmä, jota voidaan käyttää, on niin sanottu oligosieppaustekniikka. Tässä tekniikassa, kuviot 17 ja 18, säilytetään merkityt koettimet liikkumattomassa muodossa, jo detektointikalvolla, ennen kuin vatisi vistettu DNA viedään sisään. Aikaisemmin kuvattujen saman-I! laisten osien viitenumerot ovat samat, ja näihin on lisätty tunnusomainen loppuliite "F".
Tässä suoritusmuodossa käytetty oligosieppausmene-telmä esittää erikoisuutena koettimia, joita on tehty 35 liikkumattomiksi joko kalvolle, tai yllämainituille hei- li 35 94360 mille, jotka on siepattu kalvolle tai kalvon sisään, ja nämä koettimet sisältävät geneettisiä aineita, jotka täydentävät tarkoituksenmukaista DNA:ta. Toisessa lokerossa (139F), säilytetään merkittyä avidiinia, joka reagoi vah-5 vistetussa DNA:ssa olevan biotiinin kanssa, ja jonka merkkiaine voi olla, esim., piparjuuriperoksidaasi.
Täten on, kuviot 17 ja 19, kyvetti 10OF identtinen kuvion 9 suoritusmuodon kanssa, lukuunottamatta detektoin-tilokeroa 190F ja mitä säilytetään säilytyslokerossa 139F, 10 kuvio 17. Tarkemmin, näyte-DNA-koetin on tehty liikkumattomaksi kalvon 194F osalle MS", positiivinen kontrollikoe-tin on tehty liikkumattomaksi osalle "+", ja negatiivinen kontrollikoetin on tehty liikkumattomaksi osalle . Pidetään parempana, että tällaista koetinta kantavan kalvon 15 194F jokainen osa ei ole yhteydessä toisiin osiin.
Tässä tapauksessa on käytäntö, että puserretaan vahvistettu DNA kanavan 157F kautta detektointilokeroon 190F virtaamaan kalvon 190F koko pinnan yli. Tarkoituksenmukainen lämmitys aikaansaa, että vahvistettu DNA hybri-20 disoituu erityisesti ja tarttuu täten "S" alueella olevaan koettimeen, että kaikkialla läsnä oleva DNA tarttuu M+" alueella olevaan koettimeen, ja että mieluimmin ei mitään hybridisoidu ’’-n alueelle. Puserretaan huuhteluliuos lokeroon 190F, esim., lokerosta 134 tai muualta, jota seuraa 25* avidiini-merkkiaine, joka sitten reagoi biotinyloidun tuotteen kanssa, joka nyt on hybridisoitunut joko vahvistettuun DNA:hän tai positiiviseen DNA-kontrolliin. Tämän jälkeen lisätään huuhteluliuos ja sitten lisätään leuko-väriainet ja pysäytysliuos.

Claims (39)

1. Kertakäyttöinen kyvetti (10, 10A, 10B, 100, 100C, 100D, 100E, 100F) nukleiinihappoaineiden vahvista- 5 inisen ja detektoinnin toteuttamiseksi käsittäen: ensimmäisen lokeron (40, 40A, 40B, 126C); joukon lisälokeroita (26, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 61, 26A, 30A, 38A, 26B, 30B, 32B, 34B, 36B, 38B, 42B, 126, 132, 134, 136, 138, 139, 140, 182, 132C, 134C, 136C, 138C, 10 126D, 13 2D, 134D, 138D, 126E, 136E, 138E, 182E, 250, 252, 254) , ja vähintään yksi lisälokeroista sisältää aineita, joilla vahvistetaan ja detektoidaan nukleiinihap-poainei-ta; nesteyhdysvälineet (44, 48, 49, 50, 52, 54, 62, 15 44A, 48A, 49A, 50A, 52A, 54A, 54B, 144, 149, 150, 151, 152, 154, 155, 156, 157, 185, 144E, 151E, 157E, 262, 264, 266, 157F), joilla yhdistetään vähintään yksi lisälokero ensimmäiseen lokeroon (40, 40A, 40B, 126C) niin, että vähintään yhteen lokeroon pidätelty aine on siirrettävissä 20 ensimmäiseen lokeroon (40, 40A, 40B, 126C) kun kohdiste taan painetta aineeseen, joka on pidätelty tähän lokeroon; detektointipaikan (39, 190, 190F), jossa nukleiinihappo, vahvistuksen jälkeen, tehdään liikkumattomaksi ja detektoidaan se; ja 2*5 lämmönsiirtovälineet kyvetissä olevan aineen aktii vista tai passiivista vuorottelua varten; tunnettu siitä, että ensimmäinen lokero (40, 40A, 40B, 126C) ja detektointipaikka (39, 190, 190F) on suljettu nestevirtauksilta kyvetin ulkopuolella oleviin 30 paikkoihin, joten ei päästetä liikkeelle aerosoleja vah-« “ vistuksen ja detektoinnin aikana.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kyvetti, tun nettu siitä, että lämmönsiirtovälineet käsittävät ensimmäisen lokeron (40, 40A, 40B, 126C) seinän, joka on 35 valmistettu lämpöäjohtavasta materiaalista. 37 94360
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että lämmönsiirtoseinän lämpöreitin pituus ei ole suurempi kuin noin 0,3 mm ja lämpövastus ei ole suurempi kuin noin 5,0 °C/W/cm2.
4. Minkä tahansa aikaisemman patenttivaatimuksen mukainen kyvetti tunnettu siitä, että vähintään yhden lisälokeron vähintään yksi seinä on tarpeeksi joustava salliakseen ulkoisen paineen pusertaa lokeroa ja aikaansaada sen sisällä olevan aineen siirron ensimmäiseen 10 lokeroon (40, 40A, 40B, 126C).
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että lisälokerot (26, 30, 32, 34, 36, 38, 42, 61, 26A, 30A, 38A, 26B, 30B, 32B, 34B, 36B, 38B, 42B) ja niiden nesteyhdysvälineet (44, 48, 49, 50, 52, 15 54, 62, 44A, 48A, 49A, 50A, 52A, 54A, 54B) on sijoitettu niin, että jokaiseen lokeroon pidätelty aine voidaan pusertaa ulos määrätyssä järjestyksessä kohdistamalla ulkoista painetta lineaarisesti pitkin kyvetin ulkopintoja. * *
6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen kyvetti, 20 tunnettu siitä, että ulkoista painetta aikaansaadaan rullavälineillä (60), jotka etenevät kyvetin ulkoisen pinnan yli.
7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 4-6 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että yksi lisäloke- 25' roista (61) sisältää vettä ja on nestemäisesti liitetty kaikkiin muihin lisälokeroihin (26A, 30A, 38A), ja tämä lokero on sijoitettu niin, että sitä puserretaan ensimmäisenä .
8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukai- 30 nen kyvetti, tunnettu siitä, että yksi lisäloke-.!! roista on reaktiolokero (26, 26A, 26B, 126, 126C, 1260, 126E), johon viedään nukleiinihappoaine sisään.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että reaktiolokerossa (26, 26A, 26B, 35 126, 126C, 126D, 126E) on reagoimattomia vahvistusreagens- seja (28) esi-sisäänvietyinä siihen. 94360 38
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että reagoimattomat vahvistusrea-genssit ovat polymeraasientsyymi, alukenukleiinihappoja ja nukleotidejä. 5 il. Patenttivaatimuksen 9 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että reagoimattomat vahvistusrea-genssit ovat TAQ polymeraasi, alukenukleiinihappoja ja nukleotidejä.
12. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukai-10 nen kyvetti, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää puristusvälineitä, joilla puserretaan, vähintään yhteen lisälokeroon pidäteltyä ainetta aikaansaamaan ai-nesiirtoa ensimmäiseen lokeroon.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen kyvetti, 15 tunnettu siitä, että puristusvälineet käsittävät ensimmäisen mäntä-sylinteri kytkennän (113, 115), joka on si-joitettu vähintään yhteen lisälokeroon.
14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että puristusvälineet sisältävät 20 toisen mäntä-sylinteri kytkennän (182, 184, 182C, 184C, 182E, 184E) , joka on nestemäisestä liitetty ensimmäiseen lokeroon (140, 126C) niin, että kun vedetään toinen mäntä (184, 184C, 184E) takaisin sylinteriinsä, se vähentää painetta ensimmäisessä lokerossa. 25' 15. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 12 - 14 mu kainen kyvetti, tunnettu siitä, että yksi lisälo-kero on reaktiolokero (126D), johon nukleiinihappoaine viedään sisään, kyvetin sisältäessä lisäksi uuttolokeron (200) sijoitettuna reaktiolokeron (126D) nestevirran ylä-30 juoksulle, ja suodattimen (208) sijoitettuna nestereitin uuttolokerosta (200) reaktiolokeroon (126D) väliin, uuttolokeron (200) mahdollistaessa DNA:n separoinnin ainakin verisoluista, solufragmenttien separoituessa DNArsta suodattimen (208) avulla niin, että vain DNA jatkaa reaktio-35 lokeroon (126D). 94360 39
16. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että detektointi-paikka (39, 190, 190F) käsittää koettimen, joka sisältää geneettisen aineen, joka on komplementti DNA-aineelle, ja 5 hybridisoituu tämän takia tähän DNA-aineeseen, kun sitä tarkoituksenmukaisesti lämmitetään.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että detektointipaikka käsittää lisäksi positiivisen kontrollikoettimen, joka sisältää 10 geneettisen aineen, joka on komplementti aina verinäytteessä läsnä olevalle vahvistetulle DNA:lie.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että positiivisen kontrollikoettimen geneettinen aine on komplementti beetaglobiinille.
19. Patenttivaatimuksen 17 tai 18 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että positiivinen kontrollikoetin on tehty liikkumattomaksi detektointipaikan osalle, vahvistetun DNA:n poissaollessa.
20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 16 - 19 mu- 20 kainen kyvetti, tunnettu siitä, että detektointipaikka käsittää lisäksi negatiivisen kontrollikoettimen, joka sisältää geneettisen aineen, joka ei ole komplementtina millekään DNA:lie, joka odotetaan olevan läsnä verinäytteen vahvistuksen jälkeen. 2-$* . 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että negatiivinen kontrollikoetin on tehty liikkumattomaksi detektointipaikan osalle, vahvistetun DNA:n poissaollessa.
22. Patenttivattimuksen 20 tai 21 mukainen kyvetti, 30 tunnettu siitä, että positiivinen kontrollikoetin ja negatiivinen kontrollikoetin on tehty liikkumattomiksi detektointipaikan osalle kaiken vahvistetun DNA:n poissaollessa, jokaisen liikkumattomaksi tehdyn paikan osan ollessa pääkohdittain vapaa toisesta kontrollikoettimesta. α/ζ^η 40 *+ O 'J U
23. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että detektointi-paikka (39) käsittää kannattavan levyn (41), jolle on sijoitettu joukko elementtejä (43, 43', 43' ', 43'''), jokai- 5 sen elementin sisältäessä polymeerihelmen, johon on kiinnitetty DNA koetin.
24. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-22 mukai-inen kyvetti, tunnettu siitä, että detektointi-paikka (39) käsittää kannattavan levyn (41), jolle on si- 10 joitettu joukko elementtejä (43, 43' 43'' 43''') , jokaisen elementin sisältäessä polymeerihelmen, johon on kiinnitetty avidiinia.
25. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 16 - 22 mukainen kyvetti, tunnettu siitä, että detektointi- 15 paikka on ensimmäisessä lokerossa (126C), ja aine nukleii-nihappoaineen detektoimiseksi käsittää helmen, joka sisäl-ltää magnetoitavissa olevan aineen.
26. Laite DNA:n vahvistamiseksi ja detektoimiseksi sisältäen minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mu- 20 kaisen kyvetin.
27. Laite DNA:n vahvistamiseksi ja detektoimiseksi käsittäen kyvetin, joka sisältää i) joukon lokeroita ja välineitä, joilla jokainen lokero voidaan yhdistää vähintään toiseen lokeroon, lokeroiden sisältäessä a) ainakin yhden reaktiolokeron DNA-säikeiden vahvistamista varten, b) ainakin yhden detektointilokeron vahvistetun DNA:n detektoimiseksi ja sisältäen detektointipaikan, ja c) välineet detektointiaineen toimittamiseksi vahvistetuille DNA säikeille; 30 ii) välineet reaktiolokeron sisällön aktiivisen ja .: passiivisen vuorottelun sallimiseksi läpi lämpötilavaihte- lualueen noin 30 °C - noin 95 °C; iii) nesteen sisäänpääsyvälineet, jotka on liitetty vain mainittuun ainakin yhteen reaktiolokeroon vahvistet- 35 tavan DNA näytteen reaktiolokeroon tapahtuvan sisäänvien-nin sallimiseksi, li 4i 94360 tunnettu siitä, että kyvetti sisältää lisäksi iv) välineet kyvetin sulkemiseksi DNA:n sisäänruis-kutuksen jälkeistä DNA läpäisyä vastaan; ja laite sisältää lisäksi välineet ainakin detek-5 tointiaineen ja DNA säikeen siirtämiseksi detektointilo-keroon ja detektointipaikkaan; niin, että sen jälkeen kuin DNA näyte on injektoitu lokeroihin ja sisääntuloaukko on suljettu, on lokeroiden nestesisältö suojattu operaattorin ja ympäristön kon-10 taktia vastaan koko vahvistus- ja detektointireaktion aikana .
28. Menetelmä nukleiinihappoaineen vahvistamiseksi ja detektoimiseksi suljetussa kyvetissä, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet 15 a) nukleiinihappoainenäytteen sisäänruiskutus ky- vettiin, joka käsittää joukon lokeroita, jotka sisältävät reaktiolokeron, jossa vahvistavat reagenssit ovat läsnä, ja detektointiaineen kanssa käytettävän säilytyslokeron, ainakin yhden lokeron sisältäessä detektointipaikan, ja 20 välineet lokeroiden yhdistämistä varten nestesiirron järjestämiseksi; b) nukleiinihappoainetta sisältävien kyvettiosien sulkeminen pysyvästi kaiken nukleiinihapon sulkemiseksi kyvettiin; 2& c) nukleiinihappoaineen vahvistaminen vuorottele- malla kyvetti esivalittujen lämpövaihteluiden läpi rea-genssien saattamiseksi tehokkaiksi; d) vahvistetun nukleiinihappoaineen nestesiirto reaktiolokerosta detektointipaikkaan; 30 e) detektointiaineen nestesiirto detektointipaik- kaan jolloin kyvetti pidetään suljettuna nukleiinihappoma-teriaalin vuodon suhteen kyvetin ulkopuolelle; ja f) vahvistetun nukleiinihappoaineen detektoiminen detektointipaikassa detektointiaineella, nukleiinihappo-35 aineen jäädessä suljetuksi kyvetin sisään. Q ΛΧέη 42 “‘tJ'JU
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe c) sisältää lisävaiheen, lämmön siirtämisen suurehkon reaktiolokeroseinän läpi, sekä lokeron sisään että ulos lokerosta, suurehkon 5 seinän sisältäessä ainakin yhden lämpöäjohtavan materiaalin.
30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suurehkon seinän lämpöreitin pituus ei ole suurempi kuin noin 0,3 mm ja lämpövastus ei 10 ole suurempi kuin 5,0 °C/W/cm2.
31. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 28-30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyvetti käsittää lisäksi ensimmäisen mäntä-sylinteri kytkennän yhdessä lokerossa, joka on nestemäisesti kytketty reaktio- 15 lokeroon niin, että männän työntäminen eteenpäin lokerossa aikaansaa reaktiolokerossa paineenlisäyksen, ja toisen mäntä-sylinteri kytkennän toisessa lokerossa, joka on kytketty nestemäisesti detektointipaikkaan niin, että kun toinen mäntä vedetään takaisin sylinterissään, se vähen- 20 tää painetta detektointipaikassa, ja vaihe d) käsittää ensimmäisen männän työntäminen eteenpäin samalla kuin vedetään toinen mäntä takaisin vaiheen.
32. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 28 - 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ainakin • · · 25 yhden lokeron seinä on tarpeeksi joustava, salliakseen ulkoisen paineen pusertaa lokeroita niin, että ne pakottavat nesteen siirtymään ulos lokeroista, ja siitä, että vaihe d) käsittää vaiheen, jossa määrätyssä järjestyksessä kohdistetaan ulkoinen paine lokeroiden joustaviin seiniin.
33. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 28 - 30 mu- ·· kainen menetelmä, tunnettu siitä, että detektoin-tireagenssit sisältävät magnetoitavissa olevan aineen käsittävän helmen ja siitä, että vaiheet d) - f) käsittävät helmien siirtämisen reaktiolokeroon, helmien kiinnittämi- 35 nen vahvistettuun nukleiinihappoaineeseen, detektointiai- 43 94360 neen kiinnittäminen vahvistettuun aineeseen, ja kiinnit-tymättömän aineen huuhteleminen pois magneettikentän läsnä ollessa, mikä pitää helmet ja kiinnitetyn detektointiai-neen paikoillaan reaktiolokerossa.
34. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 28 - 30 mu kainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheet d) ja e) tapahtuvat perättäisesti pusertamalla ensin reak-tiolokeroa ja sen jälkeen säilytyslokeroa.
35. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 28 - 30 mu-10 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheet d) ja e) tapahtuvat pusertamalla samanaikaisesti säilytyslo-keroa ja reaktiolokeroa, ja hidastamalla detektointiaineen virtausta kunnes vahvistettu nukleiinihappoaine on siirretty .
36. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 28 - 30 mu kainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheena ennen vaihetta e), vaiheen, jossa säily-tyslokerossa kuivassa muodossa säilytetty detektointiaine järjestetään uudelleen, siirtämällä säilytyslokerosta esi-20 sisäänvietyä vettä tähän kuivaan aineeseen.
37. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 28 - 31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe a) käsittää vaiheen, jossa ruiskutetaan ainakin verisoluja ja valinnanvaraisia DNA uuttoaineita esimäärättyyn lokeroon 25 liuoksen muodostamiseksi; ja ennen c) vaihetta, se käsittää lisäksi vaiheet, i) DNA:n uuttaminen esimäärätyssä lokerossa olevista soluista; ja ii) uutetun DNA:n ja solufragmenttien liuoksen pu- 30 sertaminen, sopivan inkubointiajän jälkeen, esimaärätyn lokeron ja reaktiolokeron väliin asetetun suodattimen läpi, ja suodatin on mitoitettu jättämään solufragmentit paikoilleen ja päästämään DNA:n läpi.
38. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että vahvistusreagenssit sisältä- 94360 44 vät polymeraasin ja vahvistusvaihe käsittää DNA-säikeeseen liittyneen alukkeen jatkamisen polymeraasin vaikutuksen avulla kaksisäikeisen DNA:n muodostamiseksi.
39. Patenttivaatimuksen 38 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että jatkovaihetta seuraa kuumentaminen etukäteen määritetyssä lämpötilassa äsken muodostetun kaksisäikeisen DNA:n erottamiseksi yksisäikeiseksi. '»· · • · 94360 45
FI900535A 1989-02-03 1990-02-02 Polymeraasiketjureaktiossa käytettävä suljettu kyvetti sekä sen käyttömenetelmä FI94360C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30673589A 1989-02-03 1989-02-03
US30673589 1989-02-03
US33992389A 1989-04-17 1989-04-17
US33992389 1989-04-17

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI900535A0 FI900535A0 (fi) 1990-02-02
FI94360B true FI94360B (fi) 1995-05-15
FI94360C FI94360C (fi) 1995-08-25

Family

ID=26975330

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI900535A FI94360C (fi) 1989-02-03 1990-02-02 Polymeraasiketjureaktiossa käytettävä suljettu kyvetti sekä sen käyttömenetelmä

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0381501B1 (fi)
JP (1) JP2536945B2 (fi)
KR (2) KR0161276B1 (fi)
CA (1) CA1338505C (fi)
DE (1) DE69009510T2 (fi)
DK (1) DK0381501T3 (fi)
FI (1) FI94360C (fi)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5714380A (en) * 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
ES2141088T3 (es) * 1990-02-16 2000-03-16 Hoffmann La Roche Mejoras en la especificidad y conveniencia de la reaccion en cadena de la polimerasa.
US5173260A (en) * 1990-09-17 1992-12-22 Eastman Kodak Company Beads fused to a test device support
US5154888A (en) * 1990-10-25 1992-10-13 Eastman Kodak Company Automatic sealing closure means for closing off a passage in a flexible cuvette
US5133938A (en) * 1990-10-25 1992-07-28 Eastman Kodak Company Lockable valve mechanism for sample pouch
FR2669347A1 (fr) * 1990-11-15 1992-05-22 Inst Nat Sante Rech Med Procede permettant d'effectuer au moins deux reactions successives, en evitant les risques de contamination, notamment applicable aux techniques d'amplification de l'adn ou de l'arn.
FR2672301A1 (fr) * 1991-02-01 1992-08-07 Larzul Daniel Procede et dispositif pour amplifier le nombre d'une sequence definie d'acide nucleique dans un echantillon biologique.
US5258314A (en) * 1991-03-18 1993-11-02 Paradigm Biotechnologies Partnership Microprocessor-based biomedical monitoring apparatus and method
EP0504772A3 (en) * 1991-03-18 1993-01-27 Paradigm Biotechnologies Partnership Analytical apparatus
FR2674253B1 (fr) * 1991-03-19 1995-10-20 Diagnostics Pasteur Composition lyophilisee pour la multiplication de sequences d'acides nucleiques.
US5380489A (en) * 1992-02-18 1995-01-10 Eastman Kodak Company Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes
US7297313B1 (en) 1991-08-31 2007-11-20 The Regents Of The University Of California Microfabricated reactor, process for manufacturing the reactor, and method of amplification
FI915731A0 (fi) * 1991-12-05 1991-12-05 Derek Henry Potter Foerfarande och anordning foer reglering av temperaturen i ett flertal prov.
US5254479A (en) * 1991-12-19 1993-10-19 Eastman Kodak Company Methods for preventing air injection into a detection chamber supplied with injected liquid
WO1993015222A1 (fr) * 1992-01-29 1993-08-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Procede pour eviter les risques de contamination, notamment applicable aux techniques d'amplification de l'adn ou de l'arn
DE4234086A1 (de) * 1992-02-05 1993-08-12 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur bestimmung von in vitro amplifizierten nukleinsaeuresequenzen
US5888723A (en) * 1992-02-18 1999-03-30 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes
WO1993017328A1 (en) * 1992-02-20 1993-09-02 Drew Scientific Limited Liquid chromatography apparatus
WO1993022020A2 (en) * 1992-04-23 1993-11-11 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
US5364591A (en) * 1992-06-01 1994-11-15 Eastman Kodak Company Device for moving a target-bearing solid through a liquid for detection while being contained
US5290518A (en) * 1992-08-17 1994-03-01 Eastman Kodak Company Flexible extraction device with burstable sidewall
US5639423A (en) * 1992-08-31 1997-06-17 The Regents Of The University Of Calfornia Microfabricated reactor
US5565339A (en) * 1992-10-08 1996-10-15 Hoffmann-La Roche Inc. Compositions and methods for inhibiting dimerization of primers during storage of polymerase chain reaction reagents
US5288463A (en) * 1992-10-23 1994-02-22 Eastman Kodak Company Positive flow control in an unvented container
DE69305046T2 (de) * 1992-10-23 1997-04-03 Johnson & Johnson Clin Diag Regelung des Durchflusses in einem eingeschlossenen Behälter
TW313588B (fi) * 1992-10-23 1997-08-21 Eastman Kodak Co
US5422271A (en) * 1992-11-20 1995-06-06 Eastman Kodak Company Nucleic acid material amplification and detection without washing
US5425917A (en) * 1992-11-09 1995-06-20 Schmid; Peter Apparatus for attaching a labeled probe and/or antibody to macromolecules
WO1994026414A1 (en) * 1993-05-17 1994-11-24 Syntex (U.S.A.) Inc. Reaction container for specific binding assays and method for its use
ATE170001T1 (de) * 1993-10-21 1998-09-15 Abbott Lab Vorrichtung und verfahren zur überführung einer probe eines fluids
US5645801A (en) * 1993-10-21 1997-07-08 Abbott Laboratories Device and method for amplifying and detecting target nucleic acids
US5415839A (en) * 1993-10-21 1995-05-16 Abbott Laboratories Apparatus and method for amplifying and detecting target nucleic acids
ATE193465T1 (de) * 1994-01-06 2000-06-15 Johnson & Johnson Clin Diag Vorrichtung zum erwärmen einer flüssigkeitsführenden kammer von einer reaktionscuvette
CA2143365A1 (en) * 1994-03-14 1995-09-15 Hugh V. Cottingham Nucleic acid amplification method and apparatus
US5725831A (en) * 1994-03-14 1998-03-10 Becton Dickinson And Company Nucleic acid amplification apparatus
DE4420732A1 (de) * 1994-06-15 1995-12-21 Boehringer Mannheim Gmbh Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe
US5605796A (en) * 1994-07-19 1997-02-25 Behringwerke Ag Method for preventing amplification of nucleic acid contaminants in amplification mixtures using nuclease-receptor conjugates
WO1997000442A1 (en) * 1995-06-16 1997-01-03 The University Of Washington Microfabricated differential extraction device and method
US5716852A (en) * 1996-03-29 1998-02-10 University Of Washington Microfabricated diffusion-based chemical sensor
US6454945B1 (en) 1995-06-16 2002-09-24 University Of Washington Microfabricated devices and methods
US6541213B1 (en) 1996-03-29 2003-04-01 University Of Washington Microscale diffusion immunoassay
US5948684A (en) 1997-03-31 1999-09-07 University Of Washington Simultaneous analyte determination and reference balancing in reference T-sensor devices
AU3570797A (en) 1996-06-14 1998-01-07 University Of Washington Absorption-enhanced differential extraction device
FR2760838B1 (fr) * 1997-03-13 1999-05-21 Corning Inc Circuit fluidique integre d'execution d'un processus de preparation ou d'analyse d'un echantillon de matiere fluide, son procede de fabrication et appareil d'exploitation de ce circuit
FR2762910B1 (fr) 1997-05-05 1999-06-11 Bio Merieux Dispositif de transfert d'un liquide
US5919711A (en) * 1997-08-07 1999-07-06 Careside, Inc. Analytical cartridge
US6002475A (en) * 1998-01-28 1999-12-14 Careside, Inc. Spectrophotometric analytical cartridge
US5916522A (en) * 1997-08-07 1999-06-29 Careside, Inc. Electrochemical analytical cartridge
JP2001518624A (ja) 1997-09-26 2001-10-16 ユニバーシティ・オブ・ワシントン 同時の粒子分離および化学反応
US6723290B1 (en) 1998-03-07 2004-04-20 Levine Robert A Container for holding biologic fluid for analysis
EP1075328B1 (en) * 1998-05-01 2005-11-16 Gen-Probe Incorporated Automated diagnostic analyzing method
WO1999060397A1 (en) 1998-05-18 1999-11-25 University Of Washington Liquid analysis cartridge
US6830729B1 (en) 1998-05-18 2004-12-14 University Of Washington Sample analysis instrument
US6780617B2 (en) 2000-12-29 2004-08-24 Chen & Chen, Llc Sample processing device and method
DE19903704C1 (de) * 1999-01-30 2000-11-30 Fresenius Medical Care De Gmbh Aufnahmeeinheit für Lösungen, insbesondere Lösungen zur Kalibrierung von Sensoren zur Messung physiologisch relevanter Parameter
EP1181098B2 (en) * 1999-05-28 2011-07-06 Cepheid Cartridge for conducting a chemical reaction
WO2001026813A2 (en) * 1999-10-08 2001-04-19 Micronics, Inc. Microfluidics without electrically of mechanically operated pumps
FR2806009B1 (fr) * 2000-03-07 2002-05-31 Bio Merieux Procede de mise en oeuvre d'une carte d'analyse
KR100401389B1 (ko) * 2000-10-27 2003-10-17 김희태 핵산 검출 방법, 이를 위한 키트 및 이 키트를 구동시키기위한 구동장치
AU2002259017B2 (en) * 2001-04-26 2007-08-16 Boston Biomedica, Inc. Multichamber device and uses thereof for processing of biological samples
WO2003022435A2 (en) 2001-09-11 2003-03-20 Iquum, Inc. Sample vessels
DE10258840A1 (de) 2002-01-28 2003-08-07 Eppendorf Ag Stapelanordnung von Reaktionsgefäßen
GB0227765D0 (en) * 2002-11-28 2003-01-08 Secr Defence Apparatus for processing a fluid sample
WO2004061418A2 (en) 2002-12-26 2004-07-22 Meso Scale Technologies, Llc. Assay cartridges and methods of using the same
JP4632262B2 (ja) 2003-02-05 2011-02-16 アイキューム，インク． サンプルの処理
US7854897B2 (en) 2003-05-12 2010-12-21 Yokogawa Electric Corporation Chemical reaction cartridge, its fabrication method, and a chemical reaction cartridge drive system
DE10330804A1 (de) 2003-07-08 2005-04-28 Fresenius Medical Care De Gmbh Einwegkassette
JP4208820B2 (ja) 2003-11-28 2009-01-14 株式会社東芝 核酸検出カセット
GB2416030B (en) * 2004-01-28 2008-07-23 Norchip As A diagnostic system for carrying out a nucleic acid sequence amplification and detection process
US8101431B2 (en) 2004-02-27 2012-01-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems
JP4127679B2 (ja) 2004-03-18 2008-07-30 株式会社東芝 核酸検出カセット及び核酸検出装置
US7550267B2 (en) 2004-09-23 2009-06-23 University Of Washington Microscale diffusion immunoassay utilizing multivalent reactants
DE102004051573B4 (de) * 2004-10-22 2007-03-15 Yokogawa Electric Corporation, Musashino Verfahren zur Behandlung einer Abfallflüssigkeit in Chemischen Reaktions-Patronen und chemische Reaktions-Patrone, in der das Verfahren angewendet wird
CA2587085C (en) * 2004-10-27 2017-08-08 Cepheid Closed-system multi-stage nucleic acid amplification reactions
CN100462710C (zh) * 2004-11-09 2009-02-18 横河电机株式会社 在盒中处理废液的方法及应用此方法的化学反应盒
US8008066B2 (en) 2005-03-10 2011-08-30 Gen-Probe Incorporated System for performing multi-formatted assays
WO2006121997A2 (en) 2005-05-09 2006-11-16 Idaho Technology, Inc. Self-contained biological analysis
AU2006261953B2 (en) * 2005-06-24 2012-02-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Systems and methods including self-contained cartridges with detection systems and fluid delivery systems
JP4692200B2 (ja) * 2005-10-06 2011-06-01 横河電機株式会社 化学処理用カートリッジおよびその使用方法
DE102006010958A1 (de) * 2006-03-06 2007-09-13 Directif Gmbh Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zur Vervielfältigung einer Nukleinsäure
EP2049261B1 (en) 2006-07-28 2018-07-04 Diagnostics for the Real World, Ltd Device, system and method for processing a sample
US9102911B2 (en) 2009-05-15 2015-08-11 Biofire Diagnostics, Llc High density self-contained biological analysis
CN101541962A (zh) 2007-03-23 2009-09-23 株式会社东芝 核酸检测盒以及核酸检测装置
US8633013B2 (en) * 2007-05-03 2014-01-21 Clondiag Gmbh Assays
GB2456079B (en) * 2007-08-17 2010-07-14 Diagnostics For The Real World Device, system and method for processing a sample
EP2042237A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-01 Koninklijke Philips Electronics N.V. Reactor system including reaction chambers and method for filling and emptying the reaction chambers
US7850917B2 (en) * 2008-03-11 2010-12-14 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Particle agglutination in a tip
CA2638458A1 (en) 2008-07-31 2010-01-31 Spartan Bioscience Inc. Thermal recycling by positioning relative to fixed-temperature source
EP2410063B1 (en) 2009-03-19 2018-03-07 Kaneka Corporation Method, kit and device for detecting nucleic acid
CA2784353C (en) 2009-12-18 2015-11-03 Abbott Point Of Care, Inc. Biologic fluid analysis cartridge
US9199233B2 (en) 2010-03-31 2015-12-01 Abbott Point Of Care, Inc. Biologic fluid analysis cartridge with deflecting top panel
US9046507B2 (en) 2010-07-29 2015-06-02 Gen-Probe Incorporated Method, system and apparatus for incorporating capacitive proximity sensing in an automated fluid transfer procedure
EP2620508B1 (en) * 2010-09-22 2017-09-06 Kaneka Corporation Method and device for detecting nucleic acid, and kit
EP2624955A1 (de) * 2010-10-07 2013-08-14 BOEHRINGER INGELHEIM microParts GmbH Mikrofluidische plattform
ES2533839T3 (es) 2010-12-30 2015-04-15 Abbott Point Of Care, Inc. Cartucho de análisis de fluido biológico con porción de manipulación de muestra y porción de cámara de análisis
WO2012116308A1 (en) 2011-02-24 2012-08-30 Gen-Probe Incorporated Systems and methods for distinguishing optical signals of different modulation frequencies in an optical signal detector
WO2013028980A1 (en) 2011-08-24 2013-02-28 Abbott Point Of Care, Inc. Biologic fluid sample analysis cartridge
US11155871B2 (en) 2012-11-07 2021-10-26 Yale University Assessing risk of reading and language impairment
WO2017098321A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Spartan Bioscience Inc. Tube sealing system and methods for nucleic acid amplification
JP2018174826A (ja) * 2017-04-14 2018-11-15 キヤノンメディカルシステムズ株式会社 核酸調製器具
JP6863074B2 (ja) * 2017-05-24 2021-04-21 住友ゴム工業株式会社 マイクロ流路チップ
CN114025880B (zh) * 2019-04-26 2023-10-10 斯蒂拉科技公司 聚合酶链反应设备及其用于压力控制释放流体的方法
CN114056769A (zh) * 2021-11-09 2022-02-18 杭州遂真生物技术有限公司 一种基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4585623A (en) * 1984-02-27 1986-04-29 Allelix Inc. Device for performing quantitative chemical and immunochemical assays
CA1339653C (en) * 1986-02-25 1998-02-03 Larry J. Johnson Appartus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
CA1284931C (en) * 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US4690801A (en) * 1986-06-03 1987-09-01 Allelix Inc. Device for performing enzyme immunoassays
US4918025A (en) * 1987-03-03 1990-04-17 Pb Diagnostic Systems, Inc. Self contained immunoassay element
FR2612295B1 (fr) * 1987-03-11 1989-07-13 Abensour David Micro-analyseur automatique par colorimetrie ou bioluminescence
US4902624A (en) * 1987-11-23 1990-02-20 Eastman Kodak Company Temperature cycling cuvette

Also Published As

Publication number Publication date
EP0381501A3 (en) 1991-06-05
EP0381501B1 (en) 1994-06-08
DK0381501T3 (da) 1994-07-04
EP0381501A2 (en) 1990-08-08
JP2536945B2 (ja) 1996-09-25
KR0161276B1 (ko) 1998-11-16
FI94360C (fi) 1995-08-25
DE69009510T2 (de) 1995-01-05
FI900535A0 (fi) 1990-02-02
JPH037571A (ja) 1991-01-14
DE69009510D1 (de) 1994-07-14
CA1338505C (en) 1996-08-06
KR900013084A (ko) 1990-09-03
KR0161352B1 (ko) 1999-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI94360B (fi) Polymeraasiketjureaktiossa käytettävä suljettu kyvetti sekä sen käyttömenetelmä
US5229297A (en) Containment cuvette for PCR and method of use
US6645758B1 (en) Containment cuvette for PCR and method of use
CA2892980C (en) Device and method for carrying out an assay to detect a nucleic acid in a sample
US10661271B2 (en) Device, system and method for processing a sample
EP2352036B1 (en) Liquid flow path device
CN101213022B (zh) 自动医学诊断盒体
EP0478047B1 (en) Test devices
CN107367626B (zh) 微点样装置
AU2010311138A1 (en) Device and apparatus
KR20110103940A (ko) 채취튜브 기구, 시스템, 및 방법
US20230143960A1 (en) Devices and methods for mesofluidic and/or microfluidic processes
KR20200033808A (ko) 사용 시점에서 어레이의 배기를 위한 시스템 및 방법
US20050226772A1 (en) Sample withdrawal and dispensing device
WO2017203249A1 (en) System for use in bioprocessing
US10682644B2 (en) Cartridge, analysis system and method for testing a sample
EP3523033A1 (en) Cartridge for testing a sample and method for producing a cartridge of this kind
JPH04212036A (ja) 化学反応パック及びその使用方法
IE63501B1 (en) Containment cuvette for pcr and method of use
GB2418489A (en) Sample withdrawal and dispensing device
JP2022137643A (ja) 容器
CN114437901A (zh) 一种核酸提取用试剂存储结构
WO2018065106A2 (en) Cartridge for testing a sample

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
GB Transfer or assigment of application

Owner name: CLINICAL DIAGNOSTIC SYSTEMS, INC.

MM Patent lapsed

Owner name: CLINICAL DIAGNOSTIC SYSTEMS, INC.