CN107367626B - 微点样装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了微点样装置。提供用于将流体点样到阵列的装置和方法。还提供了通过这类方法生产的阵列。在本发明的一个方面，描述了用于将多个流体点样到阵列中的点样器装置，点样器装置包括：以第一配置设置的多个储存器，每个储存器保持其各自的流体；具有以第二配置设置的多个位置的打印头，所述第二配置不同于所述第一配置；多个管，每个管被配置为从管的第一端处的储存器到所述管的第二端处的打印头中的位置提供流体连通；以及泵，用于通过管将流体从储存器泵送到打印头。

Description

微点样装置

本发明为分案申请，其母案的申请号为201380031738.8，申请日为2013年4月17日且发明名称为“微点样装置”。

政府利益

本发明是在通过美国国立卫生研究院授予的许可No.AI061611下的政府支持做出的。美国政府对于本发明具有某些权利。

背景技术

在美国、加拿大和西欧，传染病导致约7%的人类死亡率，而在发展中地区，传染病导致超过40%的人类死亡率。传染病引起各种临床表现。常见的明显表现是发烧、肺炎、脑膜炎、腹泻和腹泻含血。尽管身体上的现象暗示一些病原体为致病因素并排除其他病原体，但仍存在各种可能的诱发性因素并且清楚的诊断通常需要执行各种化验。用于诊断病原体的传统微生物学技术可花费数天或数周，常常延误合适的治疗过程。

近年来，聚合酶链反应（PCR）已成为快速诊断传染因素可选择的方法。PCR可以是诊断传染病的快速、灵敏和专用工具。使用PCR作为主要诊断手段的挑战是可能的诱发性有机体的多样性和存在于一些病理样本中的有机体的低水平。通常不能进行大组的PCR化验，对每一种可能的诱发性有机体进行一个化验，其中大部分预期是阴性的。当病原体核酸的浓度低并且需要大量样本以收集充足的反应模板时，问题加剧。在一些情形中，样本不足以化验所有可能的致病因素。一种方案是进行“多重PCR”，其中，在一个反应中同时化验样本的多个靶。尽管已经证明多重PCR在一些系统中是有价值的，但在高水平多重反应的鲁棒性和难以清楚分析多种产物方面存在缺点。为了解决这些问题，化验可随后被划分为多个次要PCR。在主要产物中嵌入次要反应会增加鲁棒性。然而，这种进一步处理可能是昂贵的并且可引起污染或其他问题。

本发明解决搬运材料的各种问题，以进行生物分析。

发明内容

在本发明的一个方面，描述了一种用于将多个流体点样（spot）到阵列中的点样器（spotter）装置，所述点样器装置包括：被设置为第一配置的多个储存器，每个储存器保持其各自的流体；被设置为第二配置的具有多个位置的打印头，第二配置与第一配置不同；多个管，每个管被配置为提供从管的第一端处的储存器到管的第二端处的打印头中的位置的流体连通；以及泵，用于通过管将流体从储存器泵送到打印头。本文描述了点样器装置、泵、打印头和其他部件的配置的各种特征。

在本发明的另一方面，提供一种用于打印具有处于一配置的多个井的阵列的方法。所述方法包括：将流体从多个储存器同时泵送到打印头上的多个位置，以在具有与阵列相同的配置的打印头上形成多个滴；移动阵列以与滴接触；以及将每个相应滴同时传送到其各自的井中。还公开了通过这类方法制造的阵列。

在又一方面，提供一种用于将一个或多个液体传送到多个井的预选定阵列中的系统，所述系统包括：多个管，每个管具有与储存器流体连通的第一端和终止于孔口中的第二端；多个储存器，所述储存器相对于彼此被设置为预定配置；打印头，其能够操作为可移动地保持每个孔口处于预定位置，从而使得每个孔口的位置对应于井的预选定阵列中的井；多个吸管，每个吸管具有将第一端连接到第二端的中空开口，该第一端流体连接到相应的管的第一端并且该第二端与相应的储存器的底部可移除地接触；以及计量供给装置，其能够操作为将预选定量的流体从每个吸管的第二端推动通过其相应的管并从其相应的孔口出来。

对于本领域技术人员来说，通过考虑例示目前被认为是执行本发明的最佳模式的优选实施例的以下详细描述，本发明的附加特征将变得显而易见。

附图说明

图1示出根据本发明的一个实施例的柔性袋。

图2示出根据图1的柔性袋的细胞溶解区的实施例。

图2a示出与图2所示的细胞溶解区相对应的气囊（bladder）的一部分的实施例。

图2b示出根据图1的具有替代性涡旋机构的柔性袋的细胞溶解区的实施例。

图3示出根据图1的柔性袋的核酸制备区的实施例。

图4示出根据图1的柔性袋的第一级扩增区的实施例。

图5除了示出袋的替代性实施例之外与图1类似。

图5a是图5的袋的配件的横截面图。

图5b是图5的袋的一部分的放大图。

图6是袋的另一替代性实施例的立体图。

图6a是图6的袋的配件的横截面图。

图7示出与图6的袋一起使用的说明性气囊部件。

图8是与图6的袋一起使用的仪器的分解立体图，包括图6的袋。

图9示出图8的仪器的局部横截面图，包括图7的气囊部件，以阴影示出图6的袋。

图10示出图8的仪器的局部横截面图，包括用于夹阀的各个气囊和图6的袋。

图11示出来自在图5的袋中溶解和扩增的样本的第二级扩增的扩增曲线（---阳极对照；—-—酿酒酵母靶1；—（细实线）酿酒酵母靶2；—（粗实线）酿酒酵母靶3；—--—--粟酒裂殖酵母靶1；—--—粟酒裂殖酵母靶2；----阴性对照）。

图12除了示出具有第二级高密度阵列的袋之外与图6类似。

图13示出图8的仪器的部件的修改。支撑构件已经设置有配置为与图12的袋一起使用的马达。

图14是图12的第二级高密度阵列的分解立体图。

图15是图12的第二级高密度阵列的仰视图，示出处于第二级高密度阵列的构造期间。

图16示出类似于图14-15所示阵列的部分地被构造的高密度阵列，只是井的布置不同。

图17示出移除了放置臂以允许观察下面的细节的点样器的立体图。

图18除了示出放置臂之外与图17类似。

图19是图18的点样器的一部分的右侧视图。

图20是沿图17中的线20-20的横截面图。

图21是沿图17中的线21-21的横截面图。

图22是图17的打印头的仰视图，示出了96个足量滴。

图23除了仅示出76个滴之外与图22类似。

图24是图18的点样器的右侧视图，示出了放置臂的细节。

图25除了放置臂已移动阵列以与打印头接触之外与图24类似。

图26是点样器系统的示意图。

图27示出管和打印头的替代实施例。

具体实施方式

本文描述的独立的（self-contained）核酸分析袋可用于化验样本中存在的各种生物物质，例如抗原和核酸序列，例如在单个封闭系统中。在一个实施例中，袋用于化验多种抗原。说明性地，在选择性地可用完即弃的袋中执行各个步骤，包括核酸制备、初级大体积多重PCR、稀释初级扩增产物以及次级PCR，最后进行实时检测和/或后扩增分析，诸如熔解曲线分析。然而，应该理解，抗原检测是一个示例性用途并且袋可用于其他核酸分析或检测其他物质，包括但不限于多肽类、毒素和小分子。此外，应该理解，可在本发明的袋中执行各个步骤，但对于某些用途可省略一个或多个步骤，并且可相应地改变袋配置。

尽管PCR是本文的例子中所使用的扩增方法，但是应该理解，使用引物的任何扩增方法都可能是合适的。这类合适的过程包括聚合酶链反应（PCR）；链置换扩增（SDA）；核酸序列基扩增（NASBA）；级联滚环扩增（CRCA）；DNA的环介导等温扩增（LAMP）；核酸的等温和嵌合体（chimeric）引物起始扩增（ICAN）；基于靶的依赖解旋酶的扩增（HDA）；转录介导扩增（TMA）等。因此，当使用术语PCR时，应该理解包括其他替代性扩增方法。应该理解，可能需要相应地调整规程。

图1示出了说明性的独立式核酸分析袋10。袋10具有细胞溶解区20、核酸制备区40、第一级扩增区60和第二级扩增区80。含核酸的样本经由样本注射端口12被引入袋10。袋10包括不同尺寸的各种通道和泡形罩（blister）并且被布置为使得样本流过系统。样本穿过各个区并因此被处理。

样本处理发生在位于袋10内的各种泡形罩中。各种通道被设置用以在处理区内和处理区之间移动样本，而其他通道被设置用以将流体和试剂传送到样本或从样本移除这类流体和试剂。说明性地，袋10内的液体通过压力（例如气动压力）在泡形罩之间移动，如下所述，但也可考虑在袋内移动材料的其他方法。

尽管可以使用其他容器，但是说明性地，袋10由两层柔性塑料薄膜或其他柔性材料（诸如，聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚碳酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯及其混合物）形成，所述材料可通过本领域已知的任何过程制造，包括挤出、等离子体沉积和层压。也可以使用金属箔或具有铝层压结构（lamination）的塑料。其他屏障材料是本领域已知的，并且能够密封在一起以形成泡形罩和通道。如果使用塑料薄膜，则层可被粘合在一起，说明性地，通过热密封。说明性地，材料具有低核酸结合能力。

对于采用荧光监测的实施例，优选在操作波长下吸收率足够低并且自发荧光的塑料薄膜。这种材料可通过尝试不同的塑料、不同的塑化剂和合成比例以及不同的薄膜厚度来识别。对于具有铝或其他箔层压结构的塑料，可使被荧光检测装置读取的袋部分没有箔。例如，如果在袋10的第二级扩增区80的泡形罩82中监测荧光，则将使泡形罩82处的一层或两层不具有箔。在PCR的例子中，由约0.0048英寸（0.1219mm）厚的聚酯（Mylar, Dupont,Wilmington DE）和0.001-0.003英寸（0.025-0.076mm）厚的聚丙烯薄膜构成的薄膜层压件执行良好。说明性地，袋10由能够传输约80%-90%的入射光的透明材料制成。

在说明性实施例中，通过在泡形罩和通道上施加压力（例如气动压力），在泡形罩之间移动材料。因此，在采用气动压力的实施例中，说明性地，袋材料的柔性足够大，以允许气动压力具有期望效果。术语“柔性”在此用于描述袋材料的物理特性。术语“柔性”在此被定义为通过在此使用的气动压力的水平可容易地变形，而不会开裂、破碎、龟裂等。例如，薄塑料片（诸如Saran™包裹膜和Ziploc®袋）和薄金属箔（诸如铝箔）是柔性的。然而，仅泡形罩和通道的某些区域需要是柔性的，即使在采用气动压力的实施例中。此外，仅泡形罩和通道的一侧需要是柔性的，只要泡形罩和通道容易变形。袋10的其他区域可由刚性材料制成或可以利用刚性材料加强。

说明性地，塑料薄膜被用于袋10。可铣削或以其他方式切割金属片（例如铝）或其他合适的材料，以产生具有上凸表面图案的模具。当被配合到气动压力机（例如，A-5302-PDS, Janesville Tool Inc., Milton WI）中时，说明性地被调节处于195℃的操作温度，气动压力机用作印刷机，仅在模具与薄膜接触处熔化塑料薄膜的密封表面。在形成袋10时，各种部件，诸如PCR引物（说明性地被点样到薄膜上并干燥）、抗原结合基质、磁珠和硅酸锆珠，可被密封在各种泡形罩内。用于样品处理的试剂可在密封之前共同地或单独地被点样到薄膜上。在一个实施例中，核苷三磷酸（NTP）与聚合酶和引物相分离地被点样到薄膜上，基本上消除聚合酶的活性，直到通过含水样本进行水合反应。如果在水合作用之前含水样本已被加热，则这为真正的热启动PCR提供条件并且降低或消除对昂贵的化学热启动成分的需求。下面参照图5b进一步论述这种单独点样，但是应该理解，这种点样可与本文论述的任何实施例一起使用。

当气动压力用于移动袋10中的材料时，在一个实施例中可采用“气囊”。气囊组件710（其一部分在图2a中示出）可在类似于袋制造过程的过程中制造，但气囊组件710中的各个泡形罩包括气动配件（例如配件724a），该气动配件允许通过压缩气体源为气囊组件710中的各个气囊加压。由于气囊组件经受压缩气体并且可使用多次，因此气囊组件可由比袋坚韧或厚的材料制成。替代性地，气囊可由利用垫圈、密封件、阀门和活塞紧固在一起的一系列板形成。其他布置也在本发明的范围内。

当袋10被放置在仪器内时，气动气囊组件710压靠袋10的一个面，从而如果特定气囊充气，则压力将迫使液体从袋10中的相应泡形罩中流出。除了与袋10的许多泡形罩相对应的气动气囊之外，气囊组件可具有对应于袋10的各种通道的额外气动致动器，诸如气囊或气动驱动的活塞。当启用时，这些额外的气动致动器形成夹阀（pinch valve）以阻断和关闭相应的通道。为了将液体约束在袋10的特定泡形罩内，可在通向和来自泡形罩的通道上方对夹阀气动致动器充气，从而使得致动器用作夹阀以夹闭通道。说明性地，为了混合不同泡形罩中的两个液体体积，使密封连接通道的夹阀气动致动器减压，并且交替地为泡形罩上方的气动气囊加压，迫使液体来回通过连接泡形罩的通道以混合其中的液体。夹阀气动致动器可具有各种形状和尺寸并且可被配置为一次阻断多于一个通道。在图1中这种说明性夹阀被示出为夹阀16，其可用于关闭所有注射端口。虽然在此论述了气动致动器，但应该理解，可考虑为袋提供压力的其他方式，包括各种机电致动器，诸如直线步进电机、马达驱动的凸轮、气动驱动的刚性桨叶、液压或电磁力、辊、摇臂以及（在一些情形中）翘起的弹簧。此外，除了垂直于通道的轴线施加压力之外，还有各种可逆或不可逆地关闭通道的方法。这些方法包括横跨通道扭结袋、热密封、滚动致动器以及被密封到通道中的各种物理阀，诸如蝶阀和球阀。此外，小的珀尔帖装置或其他温度调节器可被放置在通道附近并被设定在足以冻结流体的温度，有效地形成密封。此外，尽管图1的设计适于以将致动器元件放置在泡形罩和通道中的每个上方为特征的自动化仪器，但还可考虑致动器可保持静止，并且袋可在一个或两个维度中过渡，从而使得较少数量的致动器可用于若干处理站，包括样本破裂、核酸俘获、第一级和第二级PCR以及其他袋应用，诸如免疫测定和免疫PCR。作用在通道和泡形罩上的辊能够证明在袋在站之间转移的配置中尤其有用。因此，尽管在目前公开的实施例中使用气动致动器，但当在本文中使用“气动致动器”时，应该理解，根据袋和仪器的配置可使用其他致动器和其他提供压力的方式。

参照图1，提供了被配置用于核酸提取和多重PCR的说明性样本袋10。样本经由配件90中的样本注射端口12进入袋10。注射端口12可以是易破密封件、单向阀或其他入口端口。来自袋10内的真空可用于将样本抽入袋10中，注射器或其他压力结构可用于迫使样本进入袋10，或者可使用经由注射端口12将样本引入袋10中的其他装置。样本经由通道14行进到细胞溶解区20的三瓣式泡形罩22，在其中溶解样本中的细胞。一旦样本进入三瓣式泡形罩22，就关闭夹阀16。与可能已经关闭的夹阀36一起，夹阀16的闭合将样本密封在三瓣式泡形罩22中。应该理解，不是每个样本都需要进行细胞溶解。对于这类样本，可省略细胞溶解区或可将样本直接移动到下一区。然而，许多样本需要进行细胞溶解。在一个实施例中，珠铣削法用于溶解细胞。

通过在存在诸如硅酸锆（ZS）珠34的溶解颗粒的情况下摇晃或涡旋样本的珠铣削法（bead-milling）是形成溶解产物的有效方法。应该理解，如在此使用的，诸如“溶解”、“溶解的”和“溶解产物”的术语不限于使细胞破裂，而是这类术语包括破坏非细胞微粒，诸如病毒。图2显示细胞溶解区20的一个实施例，其中，会聚流产生高速珠冲击，以产生溶解产物。说明性地，三瓣式泡形罩22的两个下瓣24、26经由通道30连接，并且上瓣28在通道30的相对侧31处连接到下瓣24、26。图2a示出气囊组件710的对应部分，该对应部分将与袋10的细胞溶解区20接触。当袋10被放置在仪器中时，泡形罩组件710中的相应气动气囊724、726、728与袋10的每个瓣24、26、28相邻。应该理解，当涉及袋中的泡形罩或通道与其相应的气动致动器之间的关系时，术语“相邻”指的是当袋被放置在仪器中时泡形罩或通道与相应的气动致动器之间的关系。在一个实施例中，与下瓣24、26相邻的两个下气动气囊724、726的气动配件724a、726a接通（plumb）在一起。气动配件724a、726a和与上瓣28相邻的上气动气囊728的气动配件728a接通到被配置为驱动双动气动气缸的电致动阀的相对侧。通过这样配置，压力在上气动气囊728和两个下气动气囊724、726之间交替。当来回切换阀时，袋10中的液体通过通道30中的窄连结点（nexus）32在下瓣24、26和上瓣28之间被驱动。当同时对两个下瓣24、26加压时，流会聚并喷射到上瓣28中。根据瓣的几何形状，连结点32处珠34的碰撞速度可以为至少约12m/sec，提供导致溶解的高冲击碰撞。说明性的三瓣式系统允许良好的细胞破裂和结构鲁棒性，同时最小化尺寸和气动气体消耗。尽管ZS珠被用作溶解颗粒，但是应该理解，此选择仅是说明性的，并且可使用其他材料和其他形状的颗粒。还应该理解，其他配置的细胞溶解区20在本发明的范围内。

尽管三瓣式泡形罩被用于细胞溶解，但是应该理解，其他多瓣式配置在本发明的范围内。例如，可以使用四瓣式泡形罩，例如四叶式交叉图案的泡形罩，其中，对相对的泡形罩同时加压，朝向彼此推进溶解颗粒，然后斜向移动到另两个瓣，然后可同时对这另两个瓣加压。这种四瓣式泡形罩的优点是具有沿两个方向的高速冲击。此外，可以考虑使用单瓣式泡形罩，其中，溶解颗粒从单瓣式泡形罩的一部分快速移动到另一部分。例如，气动致动器可用于关闭单瓣式泡形罩的一些区域，在其余区域中暂时形成多瓣式泡形罩。还可以使用其他致动方法，诸如马达、气动、液压或电磁驱动的桨叶作用在装置的瓣上。辊或旋转桨叶可用于在图2的连结点32处将流体驱动到一起，例如如果在上和下瓣之间设置再循环装置并且致动器提供蠕动式泵送作用。其他配置在本发明的范围内。

在不临时形成多瓣式泡形罩的情况下，也可在单瓣式溶解泡形罩内足够快地移动样本和溶解颗粒以实现溶解。在一个这种替代性实施例中，如图2b所示，通过经由旋转附接到电动马达19的叶片或桨叶21来冲击袋可实现涡流。叶片21可在溶解泡形罩处冲击袋或者可在溶解泡形罩附近冲击袋，例如在临近溶解泡形罩的边缘17处。在这种实施例中，溶解泡形罩可包括一个或多个泡形罩。图12示出包括一个这种泡形罩522的实施例。图13示出包括叶片21的珠敲击马达19，叶片21可被安装在图8所示的仪器800的第二支撑构件804的第一侧811上。然而应该理解，马达19可被安装在第一支撑构件802或仪器800的其他结构上。

图2a还示出了具有气动配件716a的气动气囊716和具有气动配件736a的气动配件736。当袋10被放置为与气囊组件710接触时，气囊716与通道12对齐，以使夹阀16完整。类似地，气囊736与通道38对齐，以使夹阀36完整。气动气囊716和736的操作允许打开和关闭夹阀16和36。尽管仅示出了气囊组件710的与细胞溶解区相邻的部分，但是应该理解，气囊组件710可设置有与气动泡形罩类似的装置，以控制遍布袋10的其余区域的流体的移动。

其他现有技术仪器在密封的柔性容器内教导PCR。见例如美国专利No. 6,645,758和No. 6,780,617以及共同待决的美国专利申请No. 10/478,453，其通过引用合并于此。然而，在密封的PCR器皿中进行细胞溶解可提高使用容易度和安全性，尤其是当待测试样本可能含有有害生物物质时。在本文所示的实施例中，来自细胞溶解的废物以及来自所有其他步骤的废物保留在密封袋内。然而，应该理解，可以移除袋内容物，以便进行进一步测试。

一旦细胞溶解，就打开夹阀36并通过通道38将溶解产物移动到核酸制备区40，如图3所最佳示出的，之后，关闭夹阀36，将样本密封在核酸制备区40中。在图3所示的实施例中，核酸的提纯采用经珠铣削的材料并利用与基于二氧化硅的磁珠56结合的亲和性，利用乙醇冲洗珠并利用水或其他流体洗提核酸，以从细胞溶解产物提纯核酸。核酸提取所需的各个成分说明性地位于泡形罩44、46、48中，通过通道45、47、49连接泡形罩以允许试剂混合。溶解产物从通道38进入泡形罩44。泡形罩44可设置有磁珠56和合适的结合缓冲液，例如高盐缓冲液，诸如1-2-3™ Sample Preparation Kit（Idaho Technology, Salt LakeCity, UT）缓冲液，或者可通过连接到泡形罩44的一个或多个通道随后提供这些成分之一或两者。核酸被俘获在珠56上，然后打开夹阀53，并且溶解产物和珠56可通过在泡形罩44和58上交替地作用轻柔的压力而被混合，然后经由例如由气囊组件710上的相应气动气囊提供的气动压力移动到泡形罩58。通过可收缩磁体50将磁珠56俘获在泡形罩58中，可收缩磁体50位于与泡形罩58相邻的仪器中，并且通过向泡形罩58施加压力可将废物移动到废物储存器或可返回泡形罩44。然后关闭夹阀53。当释放夹阀55时，利用从泡形罩46提供的乙醇、异丙醇或其他有机或无机冲洗溶液冲洗磁珠56。可选地，磁体50可收缩，允许通过在泡形罩46和58上提供交替的压力来冲洗珠。通过磁体50再次将珠56俘获在泡形罩58中，并且溶解产物的非核酸部分从珠56被冲洗掉并且可返回泡形罩46，并通过夹阀55被固定或者可以经由另一通道被冲洗到废物储存器。一旦磁珠被冲洗，就打开夹阀57，从泡形罩48释放水（例如缓冲水）或另一种核酸洗提液。再次地，磁体50可收缩以允许最大程度地混合水和珠56，例如通过在泡形罩48和58上提供交替的压力。磁体50再次伸展以收集珠56。释放夹阀59，并且经洗提的核酸经由通道52移动到第一级扩增区60。然后关闭夹阀59，由此将样本固定在第一级扩增区60。

应该理解，如图3所示和如上所述的核酸制备区40的配置仅是说明性的，并且在本发明的范围内存在各种其他配置。

在此使用的乙醇、水和其他流体可通过各种方式提供到泡形罩。流体可存储在泡形罩中，泡形罩的颈部可被各种夹阀或易破部分阻断，易破部分可在样本制备顺序中的合适时间打开。替代性地，流体可存储在袋（如图5所示的袋110）中的储存器中，或存储在参照图6的袋210所论述的配件中，必要时经由通道移动。在另一实施例中，可从外部源引入流体，如图1所示，特别地对于乙醇注射端口41、88和柱塞67、68、69。说明性地，由更硬材料制成的柱塞67、68、69可插入配件90，并且在启用柱塞时可提供测定量的流体，如在通过引用合并于此的美国专利8,409,508中一样。替代性地，柱塞可以是较软材料并且配件可以是更硬材料。对于每个柱塞，测定量可以相同或不同。最后，在另一实施例中，袋可设置有存储在一个或多个泡形罩中的测定量的流体，其中，流体被容纳在泡形罩中，例如被设置在泡形罩内的小密封袋中，在泡形罩内有效地泡形罩。在合适的时刻，可使密封袋破裂，例如通过气动压力，由此将流体释放到袋的泡形罩中。仪器还可被配置为直接通过仪器和配件或袋材料之间的液体接触来提供一些或所有试剂，只要经由单向阀封闭地调节流体通道以防止仪器在运行期间被污染。此外，通常期望在操作之后密封袋或其配件以阻止污染的DNA从袋中逸出。已知各种根据需要提供试剂的装置，诸如注射器泵，并且已知各种与配件或袋暂时流体接触的装置，诸如有倒钩的配件或O型圈密封件。应该理解，如特定应用的需要所确定的，将流体引入合适的泡形罩的这些方法中的任何方法都可与在此论述的袋的实施例中的任何实施例一起使用。

如上所述，巢式（nested）PCR涉及以两个级进行的靶扩增。在第一级，扩增靶，例如从基因组（genomic）或逆转录模板（reverse-transcribed template）。根据需要，可在平稳阶段之前终止第一级扩增。在第二反应中，第一级的扩增子（amplicon）可被稀释，并且次级扩增使用相同的引物或例如使用混杂到第一级产物的引物内部的巢式引物。巢式PCR的优点包括：a）初始反应产物形成均匀的特异性（specific）模板，确保第二反应中的高保真度，其中，即使相对低效的第一级反应也可产生合适的模板来支持稳健的第二级反应；b）来自第一级反应的非特异性产物不会明显干扰第二级反应，因为使用不同的巢式引物并且初始扩增模板（例如，基因组DNA或逆转录产物）可被稀释到消除其在第二扩增中的意义的程度；以及c）巢式PCR使得可进行更高阶反应复用。第一级反应可包括用于若干唯一扩增产物的引物。然后在第二级反应中识别这些产物。然而，应该理解，第一级多重反应和第二级单重反应仅是说明性的，并且其他配置也可行。例如，第一级可利用单对引物扩增各种不同的相关扩增子，并且第二级可用于以扩增子之间的区别为目标，例如利用熔解曲线分析。

返回图1，核酸样本经由通道52进入第一级扩增区60并被传送到泡形罩61。包括聚合酶（例如Taq聚合酶）、dNTP和引物（例如用于多重扩增的多对引物）的PCR混合物可被设置在泡形罩61中或可如上所述地经由各种装置被引入泡形罩61中。替代性地，干燥的试剂可在组装袋10时被点样到袋10上的位置，并且水或缓冲液可被引入泡形罩61，例如经由柱塞68，如图1所示。如图4最佳示出的，现在样本被夹阀59和72固定在泡形罩61中，并且在两个或多个温度之间热循环，例如通过位于仪器中并被配置为接触泡形罩61的加热块或珀尔帖装置。然而，应该理解，如本领域已知的，加热和冷却容纳在泡形罩61内的样本的其他装置在本发明的范围内。用于热循环的替代性加热/冷却装置的非限制性例子包括：在气囊中设置空气循环泡形罩，其中，与泡形罩61相邻的气动泡形罩中的空气在两个或多个温度之间循环；或者将样本移动到泡形罩61内的温度区，例如利用多个气动压力机，如在通过引用合并于此的美国专利申请No. 10/478,453中一样，或者通过在轴线上平移袋10或通过为袋10设置旋转布局并旋转袋10以在固定温度的热区之间移动内容物。

来自病原体的核酸通常与大量宿主核酸分离。这些宿主衍生的核酸通常与引物相互作用，导致扩增不期望的产物，此产物清除引物、dNTP和聚合酶活性，可能导致缺乏期望的资源产物。来自病原有机体的核酸通常数量低，并且不期望的产物是潜在问题。可优化区60的第一级反应中的循环数量，以最大化特异性产物并最小化非特异性产物。预期最佳的循环数量将在约10至约30个循环之间，例如在约15至约20个循环之间，但是应该理解，可根据具体靶、宿主和引物顺序改变循环数量。

在第一级多重扩增之后，在流体转移到次级反应位置之前，稀释第一级扩增产物，例如在不完全的PCR混合液（master mix）中。

图4示出以三个步骤稀释样本的说明性实施例。在第一步骤中，打开夹阀72，并且通过将泡形罩61中的样本与来自泡形罩62的等体积的水或稀释液混合，样本经历二倍稀释，水或稀释液被提供到泡形罩62，以及64和66，如上所述。在泡形罩61、62之间来回挤压体积提供彻底的混合。如上所述，可通过设置在气囊710中并且与泡形罩61、62相邻的气动气囊提供混合。可交替地对气动气囊加压，迫使液体来回移动。在混合期间，夹阀74防止液体流入相邻泡形罩。在混合结束时，在区域70俘获一定量被稀释的样本，关闭夹阀72，将稀释的样本密封在区域70中。打开夹阀74，并且通过设置在泡形罩63、64之一或两者中的水或缓冲液进一步稀释样本。如上所述，在泡形罩63、64之间前后挤压体积会提供混合。随后，关闭夹阀74，将进一步稀释的一定量样本密封在区域71中。说明性地，通过利用设置在泡形罩65、66之一或两者中的缓冲液或水进行最终稀释，如上所述地混合。说明性地，利用不完全PCR混合液（例如，含有除引物之外的所有PCR试剂）作为流体进行此最终稀释。在第二级扩增之前可选地加热泡形罩66的内容物可提供在不需要昂贵的抗体或酶的情况下进行热启动扩增的益处。然而，应该理解，最终稀释可使用水或其他稀释液，并且在第二级扩增区80中提供额外的PCR成分。尽管说明性实施例使用三个稀释级，但是应该理解，可使用任何数量的稀释级来提供合适水平的稀释。应该理解，通过调整区域70和71中俘获的样本量可控制稀释量，其中，在区域70和71中俘获的样本量越少，稀释量越大，或者其中，通过重复打开和关闭夹阀72和74和/或夹阀74和76而在区域70和/或区域71中俘获的额外等份可用于减少稀释量。预期约10^-2至约10^-5的稀释液适用于许多应用。

次级PCR反应的成功取决于多重第一级反应产生的模板。通常，利用高纯度DNA执行PCR。诸如酚提取的方法或商业DNA提取包提供高纯度DNA。通过袋10处理的样本可能需要进行适应性调节以补偿较低纯度的制备物。生物样本的成分可抑制PCR，这是潜在的障碍。说明性地，热启动PCR、较高浓度的taq聚合酶、调整MgCl₂浓度、调整引物浓度以及添加辅助物（诸如DMSO、TMSO或甘油）可择地可以用于补偿较低的核酸纯度。尽管第一级扩增可能更关注纯度问题，但是应该理解，在第二级扩增中也可进行类似调整。

尽管在说明性实施例中通过将少量扩增样本保留在袋的第一级PCR部分的泡形罩和通道中来完成稀释和第二级样本制备，但是应该理解，也可以通过其他方式执行这些过程。在一个这种说明性例子中，预扩增样本可被俘获在能够将固定量的样本从第一级PCR试剂移动到第二级PCR试剂的构件（例如平移或旋转构件）的小腔中。一微升份的预扩增样本与100微升新鲜PCR试剂混合将致使浓度减小100倍。应该理解，此稀释仅是示例性的，并且其他体积和稀释水平是可行的。此方法可通过迫使第一级扩增产物进入刚性配件来实现，第一级扩增产物在其中与图1的柱塞68或69之一接触。在这种实施例中，柱塞将被配置为运载一小部分样本以与相邻稀释缓冲液或第二级PCR缓冲液接触。类似地，滑动元件可用于运载少量第一级扩增产物以与第二级反应混合物接触，同时保持各级之间的密封，并且将扩增样本容纳在刚性配件90内。

在第一级PCR和稀释之后，通道78将样本转移到多个小体积泡形罩82，以便进行次级巢式PCR。在一个说明性实施例中，在第二级泡形罩中提供的干燥引物通过进入的含水材料再悬浮，以完成反应混合。可选择地，用于检测双链核酸的荧光染料，诸如LCGreen®Plus（Idaho Technology, Salt Lake City, UT），可被设置在每个泡形罩中或者可被添加到在连续稀释结束时提供的不完全PCR混合液中，但是应该理解，LCGreen® Plus仅是说明性的，并且如本领域已知的可使用其他染料。在另一可选实施例中，被配置为用于每个特异性扩增子的干燥荧光标记低聚核苷酸探针可与各个干燥引物一起被设置在每个相应第二级泡形罩中。此外，尽管袋10被设计为在其中容纳所有反应和操作，以减少污染，但在一些情况中，可能期望从每个泡形罩82移除扩增产物以进行进一步分析。本领域已知的用于检测第二级扩增子的其他手段在本发明的范围内。一旦样本被转移到泡形罩82，就启用夹阀84和86以关闭泡形罩82。现在每个泡形罩82容纳扩增特定靶所需的所有试剂。说明性地，每个泡形罩可容纳唯一一对引物，或者多个泡形罩82可容纳相同引物以提供许多复制的扩增产物。

可以注意到，在此公开的实施例使用泡形罩进行第二级扩增，其中，泡形罩由与柔性部分的其余部分相同或类似的塑料薄膜形成。然而，在许多实施例中，从未从第二级泡形罩移除第二级泡形罩的内容物，并且因此，不需要在柔性泡形罩中发生第二级反应。应该理解，第二级反应可在与泡形罩流体连接的多个刚性、半刚性或柔性腔中发生。腔可被密封，如在本例子中通过在连接腔的柔性通道上施加压力，或者可以用其他方式密封，例如通过加热密封或利用单向阀。在此论述的各个实施例包括单独设置用于收集废物的泡形罩。由于从未移除废物，因此可将废物收集在刚性、半刚性或柔性腔中。

利用在第一级扩增中使用的相同引物进行第二级扩增（见美国专利No. 6,605,451）在本发明的范围内。然而，通常有利的是在第二级反应中具有第一级产物内部的引物，从而使得第一和第二级引物结合位置之间没有重叠或重叠最小。第一级产物的稀释很大地消除初始模板DNA和第一级试剂对第二级反应的贡献。此外，说明性地，具有高于用于第一级Tm的Tm的第二级引物可用于加强巢式扩增。引物可被设计为避免显著的发夹结构、异源/同源二聚体和不期望的混杂物。由于巢式设计，第二级引物比用于在单个步骤中从基因组DNA扩增靶的引物更耐有毒反应。可选择地，热启动用于第二级扩增。

如果荧光染料被包括在第二级扩增中，例如作为dsDNA结合染料或作为荧光探针的一部分，如本领域已知的，则提供的光学器件可用于监测一个或多个样本的扩增。可选择地，扩增曲线的形状分析可提供用于将每个样本称呼为阳性或阴性。在通过引用合并于此的美国专利No. 6,730,501中论述了称呼样本的说明性方法。替代性地，可使用采用交叉阈值的方法。计算机可被设置在外部或仪器内，并且可被配置为执行方法并基于第二级扩增的存在或缺乏称呼样本为阳性或阴性，并且可通过将扩增曲线的特征参数（诸如交叉阈值）与标准曲线或相对于运行内的其他扩增曲线对比，提供关于开始模板浓度的定量信息。然而，应该理解，本领域已知的其他方法可用于称呼每个样本。可对荧光信息进行其他分析。一个这种非限制性例子是使用熔解曲线分析来显示扩增子的合适的熔解特征（例如,Tm、熔解曲线形状）。提供的光学器件可配置为立即俘获所有泡形罩63的图像，或者可为每个单个泡形罩提供单个光学器件。其他配置在本发明的范围内。

图5示出替代性的袋110。在本实施例中，各个试剂经由配件190被加载到袋110中。图5a示出具有多个柱塞168之一的配件190的横截面。应该理解，尽管图5a示出穿过入口通道115a的横截面，但如图5的实施例所示，存在12个入口通道（入口通道115a至115l），每个入口通道可具有其在配件190中使用的自己的柱塞168，但在本特定配置中，未使用入口通道115c、115f和115i。应该理解，具有12个入口通道的配置仅是说明性的，并且可使用任何数量的入口通道和相关柱塞。在说明性实施例中，配件190的可选的真空端口142可形成为通过配件190的第一表面194以与腔192连通。可选的真空端口142可被设置用于与真空或真空腔（未示出）连通以抽出袋110内的空气，从而在腔192和袋110的各个泡形罩和腔内形成真空。柱塞168随后被足够远地插入到腔192内以密封真空端口142。说明性地，腔192被设置在预定量的真空下以在使用时将期望量的液体抽入腔192。在已经通过引用合并于此的美国专利NO. 8,409,508中可找到制备腔192的额外信息。

说明性配件190进一步包括形成在配件190的第二表面195中的注射端口141。说明性地，注射端口141被放置得比真空端口142更靠近袋110的塑料薄膜部分，如图5a所示，从而使得柱塞168插入得足够远以密封真空端口142，同时仍允许经由注射端口141进入腔192。如图所示，塑料薄膜部分117的第二表面119提供可穿透密封件139，以防止腔192和周围大气之间经由注射端口141连通。然而，应该理解，第二表面119可以可选择地不延伸到注射端口141，并且可以采用各种其他密封件。此外，如果需要密封的另一位置，例如在配件190的第一表面194上，则注射端口141可包括至配件190上的该位置的通道。已经通过引用合并于此的美国专利申请NO. 10/512,255示出密封件位置远离注射端口并且密封件经由通道连接到腔的各种配置。此外，美国专利NO. 8,409,508公开了通道将单个密封件连接到多个腔的各种配置。密封件位置的变化以及单个注射端口与多个腔的连接在本发明的范围内。可选择地，密封件139可以是易破的并且可在插入插管（未示出）时破裂，以允许来自插管内的流体样本被抽入或压入腔192。

袋组件110的说明性柱塞168是圆柱形的并且具有约5mm的直径以被压配合到腔192中。柱塞168包括第一端173和相反的第二端175。如图5a所示，柱塞168的凹口169形成在第二端175中。在使用时，第二端175被部分插入腔192中，并且凹口169与注射端口141对准以允许流体样本被抽入或注射到腔192中，即使当柱塞168插入足够远以致柱塞168反而阻挡注射端口141时。

说明性地，流体位于具有注射器的容器（未示出）中，注射器具有可被插入注射端口141以刺穿其中的密封件139的筒状尖端。在使用排空空气的袋组件110的情况下，当密封件139被刺穿时，由于腔192内相对于环境空气压力的负压，流体从容器退出。然后流体穿过端口141以填充腔192。此时，流体通常不会流到袋110的塑料薄膜部分117中。最后，将柱塞168插入腔192中，从而使得柱塞168的第二端175接近腔192的底部191，以将测定量的试剂或样本推入塑料薄膜部分117。如图所示，柱塞168被配置为使得，当完全插入时，第二部分175不会遭遇腔192的底部191。剩余空间可用于捕集气泡，由此减少进入塑料薄膜部分117的气泡数量。然而，在一些实施例中，当完全插入柱塞168时，期望第二端175接触底部191。在图5所示的实施例中，入口通道115a、115b、115d、115e、115g、115h、115j、115k和115l都通向反应区或储存器泡形罩。应该理解，与入口通道115a相关的柱塞的完全插入将迫使样本进入三瓣式泡形罩122，与入口通道115b相关的柱塞的完全插入将迫使试剂进入储存器泡形罩101，与入口通道115d相关的柱塞的完全插入将迫使试剂进入储存器泡形罩102，与入口通道115e相关的柱塞的完全插入将迫使试剂进入储存器泡形罩103，与入口通道115g相关的柱塞的完全插入将迫使试剂进入储存器泡形罩104，与入口通道115h相关的柱塞的完全插入将迫使试剂进入储存器泡形罩105，与入口通道115j相关的柱塞的完全插入将迫使试剂进入储存器泡形罩106，与入口通道115k相关的柱塞的完全插入将迫使试剂进入储存器泡形罩107，并且与入口通道115l相关的柱塞的完全插入将迫使试剂进入储存器泡形罩108。

如果使用包括如图5a所示的实施例所示的凹口169的柱塞设计，则柱塞168可在下降之前旋转，从而偏置凹口169并关闭注射端口141使其不与腔192连通，以将内容物密封在其中。这用于最小化通过注射端口141流到周围大气中的任何可能的流体回流，这在期望延迟完全插入柱塞时尤其有用。尽管以上参照柱塞168示出和描述的凹口169，但是在将流体样本分配到腔192中之后不久通过其他方式（诸如，朝向腔192的底部按压柱塞168、热密封、单向阀或自密封端口）关闭注射端口141在本发明的范围内。如果热密封被用作密封方法，则仪器中可包括密封条，从而当将袋插入仪器中时热密封所有腔。

在说明性方法中，使用者将样本注射到与入口通道115a相关的注射端口141中，并将水注射到各个其他注射端口。水使之前已经在与每一个入口通道115b、115d、115e、115g、115h、115j、115k和115l相关的腔192中冷冻干燥的试剂复水。水可通过单个密封件注射，然后经由通道被分配到每个腔，如以下图6所示，或者水可被单独地注射到每个腔中。替代性地，不通过注射水来使干燥的试剂复水，而是可将诸如溶解试剂、核酸提取试剂和PCR试剂的试剂注射到配件190的合适的腔192中。

当启用与入口通道115a相关的柱塞168时，经由通道114迫使样本直接进入三瓣式泡形罩122。使用者还按压其余柱塞168，迫使内容物从配件190中的每个腔192出来并通过108进入储存器泡形罩101。此时，袋110被加载到仪器中进行处理。尽管图8所示的仪器800被配置用于图6的袋210，但是应该理解，修改仪器800的气囊的配置将使仪器800适于与袋110和510或其他配置的袋一起使用。

在一个说明性例子中，当按压柱塞168时，储存器泡形罩101现在包含在异丙醇中的DNA结合磁珠，储存器泡形罩102现在包含第一冲洗溶液，储存器泡形罩103现在包含第二冲洗溶液，储存器泡形罩104现在包含核酸洗提缓冲液，储存器泡形罩105现在包含第一级PCR试剂（包括多重第一级引物），储存器泡形罩106现在包含没有引物的第二级PCR试剂，储存器泡形罩107现在包含没有引物和没有模板的阴性对照PCR试剂，并且储存器泡形罩108现在包含具有模板的阳性对照PCR试剂。然而，应该理解，这些试剂仅是说明性的，并且根据期望的反应和最佳条件可使用其他试剂。

一旦袋110已被放置到仪器800中并且样本已经移动到三瓣式泡形罩122，就可通过利用溶解颗粒（诸如ZS或陶瓷珠）搅拌样本而使样本经受破裂。溶解颗粒可被设置在三瓣式泡形罩122中，或者可与样本一起被注射到三瓣式泡形罩122中。图5的三瓣式泡形罩122以与图1的三瓣式泡形罩22很相同的方式操作，对两个下瓣124、126一起加压，并且压力在上瓣128和两个下瓣124、126之间交替。然而，如图所示，下瓣124、126比下瓣24、26圆很多，允许珠平稳地流到通道130并且允许高速碰撞，即使在连结点32处没有三角形流分离器。与三瓣式泡形罩22相同，图5的三瓣式泡形罩122允许有效地溶解或分裂样本中的微生物、细胞和病毒微粒。已经发现，宽度为约3-4mm（例如约3.5mm）的通道130在溶解期间保留相对纯净的珠并且有效地提供高速碰撞。

在溶解之后，通过对位于储存器泡形罩101上方的气囊加压经由通道138将核酸结合磁珠注射到上瓣128。磁珠与三瓣式泡形罩122的内容物混合（例如，比在溶解期间更轻柔地），并培养溶液例如约1分钟，以允许核酸结合到珠。

然后，经由通道143将溶液泵送到“图8”的泡形罩144，在该处，珠被容纳在仪器中的可收缩磁体俘获，该磁体例如是气动驱动的。磁珠俘获过程开始于对珠铣削设备122的所有瓣124、126和128加压。这迫使122的多数液体内容物通过通道143进入泡形罩144。磁体与泡形罩144的下部144b接触并且培养样本若干秒，以允许磁体从溶液俘获珠，然后对临近泡形罩122的气囊减压，对临近泡形罩部分144a和144b的气囊加压，并且流体被迫返回泡形罩122。由于单次穿过不能俘获所有珠，因此可重复10次此过程以基本俘获泡形罩144中的所有珠。然后，迫使液体离开泡形罩144，仅留下磁珠和俘获的核酸，并在两次连续冲洗中将冲洗试剂引入泡形罩144（例如分别经由通道145和147从储存器泡形罩102和103中引入）。在每次冲洗时，对包含冲洗试剂的储存器泡形罩上方的气囊加压，迫使内容物进入泡形罩144。退出磁体并且通过对覆盖泡形罩144的每个瓣144a和144b的两个气囊中的每个交替加压来分裂包含磁珠的小球。当上瓣144a被压缩时，液体内容物受迫进入下瓣144b，并且当下瓣144b被压缩时，内容物受迫进入上瓣144a。通过在上瓣144a和下瓣144b之间搅拌泡形罩144中的溶液，有效地从磁珠冲掉杂质。在不充分搅拌（珠的小球不受干扰）和过度搅拌（可能从珠表面冲掉核酸并随着冲洗试剂损失核酸）之间保持平衡。在每个冲洗循环之后，经由泡形罩144中的磁体俘获磁珠并且说明性地迫使冲洗试剂进入现在用作废物盛器的三瓣式泡形罩122。然而，应该理解，所使用的储存器泡形罩也可用作废物盛器，或者其他泡形罩可被专门设置为废物盛器。

然后经由通道149将来自储存器泡形罩104的核酸洗提缓冲液注射到泡形罩144中，再次搅拌样本，并且通过采用磁体再次俘获磁珠。泡形罩144中的流体混合物现在含有来自原始样本的核酸。泡形罩144上的压力经由通道152将核酸样本移动到第一级PCR泡形罩161，在该处样本与含有多个引物组的第一级PCR混合液混合，经由通道162从储存器泡形罩105提供PCR混合液。如果需要，可在混合之前加热样本和/或第一级PCR混合液，以提供热启动的优点。可选地，在第一级PCR之前可提供用于逆转录RNA靶的成分。替代性地，RT酶，例如耐热RT酶，可被设置在第一级PCR混合液中，以允许同时逆转录RNA靶。应该理解，RT酶可以存在于本文公开的任何实施例中的第一级PCR混合物中。如下面将看到的，图5的袋110可被配置为高达10个引物组，但是应该理解，可以改变配置并且可使用任何数量的引物组。以低压对位于泡形罩161上方的气囊加压，以迫使泡形罩161的内容物与泡形罩161的另一侧上的加热/冷却元件（例如珀尔帖元件）紧密接触。泡形罩161上的压力应该足以确保与加热/冷却元件的良好接触，但应该足够轻柔使得不致从泡形罩161压迫出流体。加热/冷却元件是温度循环的，例如在约60℃至约95℃之间。说明性地，温度循环执行约15-20个循环，由此扩增存在的一个或多个核酸靶。同样说明性地，温度循环在平稳阶段之前停止，并且可在对数阶段甚至对数阶段之前停止。在一个例子中，可以仅期望利用所需的扩增子富集样本，而不达到最小检测量。见通过引用合并于此的美国专利No. 6,605,451。

然后，通过迫使大多数样本经由通道152返回泡形罩144可选择地稀释经扩增的样本，仅在泡形罩161中留下少量（例如，约1%至5%）经扩增的样本，并且经由通道163从储存器泡形罩106提供第二级PCR混合液。样本被彻底混合，例如通过经由通道163在泡形罩106和161之间来回移动样本。如果需要，在第二级扩增之前，可将反应混合物加热到延伸温度（extension temperature）以上，例如至少60℃。然后，迫使样本通过通道165进入第二级扩增区180中心的一阵列小体积泡形罩182中。十个说明性小体积泡形罩182中的每个可包含不同引物对，基本与第一级扩增中的引物对之一相同或“嵌入”第一级引物对内以扩增缩短的扩增子。现在通过样本与水化合的引物使扩增混合物完全。并且，通过分别对储存器泡形罩107和108的内容物加压，迫使PCR混合液不具有经由通道166来自储存器泡形罩107的靶DNA或具有经由通道167来自储存器泡形罩108的对照DNA，引入阳性和阴性对照样本。如图所示，阳极对照泡形罩183和阴极对照泡形罩181的每一种存在五个，其可2倍复用，以为十个不同的第二级扩增反应提供必要的对照。应该理解，此配置仅是说明性的，并且可提供任何数量的第二级泡形罩。

说明性地，用于第二级扩增的PCR混合液缺少引物，但以其他方式变得完全。然而，“不完全的”PCR混合液也可缺少其他PCR成分。在一个例子中，第二级PCR混合液仅是水或缓冲液，然后其与可选择地稀释的第一级PCR扩增产物混合。此混合物移动到小体积PCR反应泡形罩，在该处已经提前提供了所有其余成分。如果需要，所有其余成分可混合在一起并作为单一混合物被点样到小体积PCR反应泡形罩中。替代性地，如图5b所示，每个成分可被点样到小体积PCR反应泡形罩182的单独区域上。如图5b所示，存在四个区域，例如，dNTP被点样在区域182a处，引物被点样在182b处，聚合酶被点样在182c处，并且镁混合物被点样在182d处。通过在使成分复水之前单独点样成分并加热样本混合物，可最小化非特异性反应。应该理解，可以用此方式点样任意组合的成分，将成分点样到泡形罩的一个或多个区域中的该方法可与本发明的任何实施例一起使用。

密封通向小体积PCR反应泡形罩181、182和183的通道165、166和167，并且气动气囊轻柔地按压阵列使其靠着加热/冷却元件（例如珀尔帖元件），以便热循环。可单独为第二级热循环设定循环参数。说明性地，通过将激励源（例如蓝光（450-490nm））聚焦到阵列上并对得到的荧光发射物（例如510nm以上的荧光射线）成像，来监测反应。

在以上例子中，未论述夹阀。然而，应该理解，当期望将样本包含在泡形罩之一中时，对位于通向和来自特定泡形罩的通道上方的气动致动器加压，产生夹阀并关闭通道。相反，当期望从泡形罩之一移动样本时，对合适的气动致动器减压，允许样本流过通道。

上述图5中的袋包括试剂储存器泡形罩101至108，其中，使用者将试剂从配件190注射到袋110的塑料薄膜部分117中的试剂储存器泡形罩101至108，例如在将袋110插入仪器之前。虽然使用图5的试剂储存器泡形罩具有优点，包括能够保持各个泡形罩的内容物处于不同温度，但也存在一些缺点。由于操作者负责将试剂从配件190移动到储存器泡形罩101至108，并且由于这通常在机器外部完成并因而没有启用的夹阀，因此试剂可能偶尔从储存器泡形罩泄漏到工作泡形罩。在制备和加载期间，暴露储存器泡形罩中的试剂。如果它们被按压、挤压甚至被轻微地撞击，试剂可能通过可用通道泄漏。如果试剂损失大，则反应可能完全失败。此外，在操作期间，从储存器泡形罩101至108压入的试剂量可能存在一些变化，导致不一致的结果。自动地将试剂引入配件190并将试剂从配件190移动到试剂储存器泡形罩101至108，将会解决这些问题中的许多问题，并且在本发明的范围内。

图6的袋210通过利用直接注射方法以不同方式处理这些问题中的许多问题，其中，仪器自身移动柱塞268（例如经由气动活塞）并当需要试剂时迫使试剂进入各个工作泡形罩。在图6的实施例中，试剂被引入配件290的各个腔292中并且保持在其中直到被需要，而非将试剂存储在图5的储存器泡形罩101至108中。活塞268在合适时间的气动操作将测定量的试剂引入合适的反应泡形罩。除了处理许多上述问题之外，袋210还具有更紧凑的形状，允许更小的仪器设计，并且袋210具有更短的通道，允许更好的流体流动并最小化通道中的试剂损失。

在图6的一个说明性实施例中，包括待测试样本（100μl）和溶解缓冲液（200μl）的300μl混合物被注入注射端口241a。水也经由密封件239b被注入配件290，与十一种不同的试剂混杂，每种试剂经由通道293以干燥形式被预先设置在腔292b至292l（以阴影示出）。说明性地，这些试剂可包括冷冻干燥的PCR试剂、DNA提取试剂、冲洗溶液、免疫测定试剂或其他化学实体。对于图6的例子，试剂用于核酸提取、第一级多重PCR、多重反应的稀释以及制备第二级PCR试剂并且控制反应。在图6所示的实施例中，需要注入的仅是端口241a中的样本和端口241b中的水。

如图6所示，经由密封件293b注射的水经由通道293分配到各个腔。在本实施例中，仅样本和水需要被注射到袋210中。然而，应该理解，水可被单独地注射到每个腔292中。此外应该理解，如果需要，可将特定湿试剂注射到每个腔中，而不是将干燥试剂设置在各个腔292中并在注入水时混杂。此外，应该理解，腔292中的一个或多个可仅设置有水，并且必要的试剂可干燥地设置在合适的反应泡形罩中。如由特定反应的需要指示的，以上各种组合在本发明的范围内。

如图6中可见，可选择的突起213被设置在配件290的底部表面297上。如图所示，突起213位于它们各自的入口通道215内。然而，可以采用其他配置。突起213辅助打开入口通道215，并当柱塞268被按压时防止底部表面297与另一平坦表面接合从而阻断入口通道215，这有助于在柱塞268启用时防止回流。这类突起可用在根据本发明的各个袋中的任何袋上。

在将水注入袋以混杂配件的多个腔中的多种干燥试剂的实施例中，需要关闭注射端口和许多腔之间的通道的装置。如果通道未关闭，则每个柱塞的启用可能迫使其各自腔中的一些内容物返回到通道中，可能污染相邻腔并改变容纳在腔中和从腔传送的体积。已经使用若干方式关闭此通道，包括如上所述地旋转有凹口的柱塞268，横跨通道热密封塑料薄膜由此永久地关闭通道，以及向通道施加压力作为夹阀。也可以使用其他封闭件，诸如内嵌入配件中的阀，例如单向阀。

在将流体加载到腔292中并将袋210加载到仪器中之后，按压柱塞268a（例如经由启动气动活塞），迫使其余样本经由通道214进入三瓣式泡形罩220。与图1和5所示的实施例一样，经由气囊组件810的作用气囊824、826和828顺序地按压三瓣式泡形罩220的瓣224、226和228，如图7-9所示，迫使液体通过瓣之间的窄连结点232，并驱动高速碰撞，切割样本并释出核酸，例如包括来自难以打开的孢子、细菌和真菌的核酸。细胞溶解持续合适的时间长度，例如0.5至10分钟。

一旦充分溶解了细胞，就启用柱塞268b并经由通道236将储存在腔292b中的核酸结合磁珠注射到三瓣式泡形罩220的上瓣228中。样本与磁珠混合并且允许培养混合物合适的时间长度，例如约10秒至10分钟。

样本和珠的混合物经由气囊826的作用受迫通过通道238进入泡形罩244，然后经由气囊844的作用通过通道243进入泡形罩246，其中，位于仪器800中邻近泡形罩245的可收缩磁体850（在图8中示出）俘获来自溶液的磁珠，形成靠着泡形罩246的内表面的小球。然后位于泡形罩246上方的气动气囊846迫使液体从泡形罩246流出并通过泡形罩244返回现在用作废物盛器的泡形罩222中。然而，如以上参照图5论述的，其他废物盛器在本发明的范围内。可以启用柱塞268c、268d和268e之一，以经由通道245将冲洗溶液提供到泡形罩244，然后经由通道243将冲洗溶液提供到泡形罩246。可选择地，收缩磁体850，并且通过交替地对气囊844和846加压使得珠经由通道243从泡形罩244和246来回移动来冲洗磁珠。一旦磁珠被冲洗，就通过启用磁体850将磁珠俘获在泡形罩246中，然后将冲洗溶液移动到泡形罩222。可根据需要重复此过程，以从核酸结合磁珠冲洗掉溶剂缓冲液和样本残渣。说明性地，进行三次冲洗，每个都利用腔292c、292d和292e中的冲洗试剂。然而，应该理解，更多或更少次的冲洗在本发明的范围内。如果需要更多次冲洗，则可提供更多个腔292。替代性地，每个腔292可保存较大体积的流体并且每次启用柱塞可在每次启用时仅迫使部分体积从腔流出。

在冲洗之后，存储在腔292f中的洗提缓冲液经由通道247移动到泡形罩248，并且收缩磁体。溶液经由通道252在泡形罩246和248之间循环，破坏泡形罩246中的磁珠小球并允许被俘获的核酸脱离珠并进入溶液。再次启用磁体850，俘获泡形罩246中的磁珠，并且洗提的核酸溶液受迫进入泡形罩248。

按压柱塞268h并且来自腔292h的第一级PCR混合液与泡形罩248中的核酸样本混合。可选择地，通过交替启用气囊848和864，经由通道253在248和264之间压迫混合物，来混合混合物。在若干混合循环之后，溶液包含在泡形罩264中，在该处执行第一级多重PCR。如果需要，在混合之前，样本可保留在泡形罩246中，同时预加热第一级PCR混合液，例如通过将第一级PCR混合液移动到泡形罩264中或者通过在泡形罩248附近提供加热器。如上所述，此预加热可提供热启动PCR的益处。图8所示的仪器800的特征是加热和冷却样本的基于珀尔帖的热循环器886和888。然而，应该理解，如上所述可以使用其他加热器/冷却器装置。可选择地，在温度循环期间，泡形罩248和264之间的混合可持续，其中热循环器886被放置用于加热和冷却泡形罩248和264两者。已经发现在一些实施例中这种混合改进第一级PCR反应。此外，可通过改变两个或多个不同泡形罩中的温度，允许最小的能量消耗和最大的热循环速率，来完成热循环。例如，泡形罩248中的温度可保持在95℃，并且泡形罩264中的温度可保持在65℃，并且在这些泡形罩之间移动样本会有效地将热量传递到样本以及从样本传递出热量，允许快速准确的热循环。温度循环例如执行15-20个循环，但如上所述地，根据应用可期望进行其他程度的扩增。如以下将看到的，第二级扩增区280被配置用以检测18个第二级反应中的扩增。因此，泡形罩264中的PCR反应可包括18个不同的引物对。

在替代性的热启动方法中，袋210被制造为在泡形罩之一中（例如引物264）设置有引物。在一个实施例中，引物被单独地冻结干燥，然后在制造期间被引入泡形罩264中作为易碎的小球。在第一级PCR之前，说明性地，样本从泡形罩246中被洗提并且被推到泡形罩264以使引物小球复水。与泡形罩248和264相邻放置的珀尔帖886被加热到48℃，并且PCR混合液被推到泡形罩248。在保持例如10秒（期间两个泡形罩达到48℃）之后，泡形罩248和264之间的混合开始。因此，酶和dNTP保留在泡形罩248中，并且大多数样本和引物保留在泡形罩264中，直到成分分别达到48℃。然而，应该理解，48℃的选择是为了与同时发生的第一级扩增和利用AMV（其在高达50℃下具有活性）的RT一起使用而做出的。如果不需要RT或者使用更加耐热的RT酶，则根据引物熔解温度或特定的第一级扩增规程中的其他因素，可将两个泡形罩248和264中的一个或两个加热至58℃，甚至更高。应该理解，此热启动方法可与本发明的任何实施例一起使用。

在替代性实施例中，为了降低第一级PCR反应的复杂性，泡形罩248可被划分成两个或多个泡形罩。通常认为多重反应的非特异性产物的数量按混合物中引物数量的二次方（或者可能是更高的幂）升高，而化验敏感度的损失是输入样本量的线性函数。因此，例如，将第一级PCR分成两个反应（每个反应具有本实施例的单个反应的一半量）会使敏感度降低至1/2，但非特异性反应的量和复杂度会多至1/4。如果泡形罩248被划分为或多个泡形罩，则泡形罩264可被划分为数量等于泡形罩248的数量的泡形罩。每个相应的泡形罩248将经由各自的通道253连接到其各自的泡形罩264。每个泡形罩264将设置有包括一子组所有引物的小球。来自泡形罩246的样本将横跨每个泡形罩248被划分，每个泡形罩248相对于所有其他泡形罩被密封，并且利用每对泡形罩248和264进行热循环，如上所述。在热循环之后，样本再次结合到泡形罩266中或者单独被传送到单独组的第二级泡形罩。

在第一级PCR已进行了期望数量的循环之后，可如以上参照图5的实施例所论述的那样稀释样本，通过迫使大多数样本返回泡形罩248，仅留下少量，并添加来自腔292i的第二级PCR混合液。替代性地，来自292i的稀释缓冲液可经由通道249移动到泡形罩266，然后通过在泡形罩264和266之间来回移动流体而与泡形罩264中的扩增样本混合。在混合之后，迫使泡形罩264中剩余的一部分稀释样本进入现在是废物盛器的三瓣式泡形罩222。如果需要，可利用来自腔292j和292k的稀释缓冲液重复进行若干次稀释，然后将来自腔292g的第二级PCR混合液添加到一些或所有稀释的扩增样本中。应该理解，可通过改变稀释步骤的数量或通过改变在与稀释缓冲液或第二级PCR混合液混合之前被丢弃的样本的百分比，来调整稀释水平。如果需要，在移动到第二级泡形罩282以便进行第二级扩增之前，样本和第二级PCR混合液的此混合物可在泡形罩264中被预加热。如上所述，这种预加热可使第二级PCR混合物中不再需要热启动成分（抗体、化学品或其他）。

说明性的第二级PCR混合液是不完全的，缺少引物对，并且18个第二级泡形罩282中的每个预加载有特定的PCR引物对。如果需要，第二级PCR混合液可缺少其他反应成分，然后也可将这些成分预加载到第二级泡形罩282中。如以上参照之前例子论述的，每个引物对可与第一级PCR引物对相同或者可嵌入第一级引物对内。样本从泡形罩264到第二级泡形罩的移动使PCR反应混合物完全。来自腔292l的对照样本也经由通道267移动到对照泡形罩283。根据需要，对照样本可以是阳性或阴性对照物。说明性地，每个袋将包含对照反应，其验证过程中每个步骤的操作并证明阳性结果不是由之前扩增的核酸的自身污染导致的。然而，这在许多规程中不实用，尤其是高度多重反应。提供合适的对照物的一种说明性方法涉及利用诸如面包酵母物种的示踪样本。核酸从酵母中提取出，伴随其他核酸。第一和第二级PCR反应扩增来自酵母基因组的DNA和/或RNA靶。说明性地，从拼接的mRNA前体得到的mRNA序列可用于通过布置引物序列以跨过内含子而产生RNA特异性靶序列。针对参考标准对酵母拷贝数的定量分析允许实质上确认系统的每个成分都在工作。对于许多第二级化验中的每个的阴性对照反应更加成问题。这可能需要以并行或单独运行来运行对照反应。

气囊组件810的气囊882的启用将样本密封到它们各自的第二级泡形罩282、283中，并且气囊880的启用对第二级泡形罩282、283提供轻柔的压力，以迫使第二级泡形罩282、283与加热器/冷却器装置接触。位于第二级扩增区280之上的窗口847允许在PCR期间以及反应产物的DNA熔解曲线分析期间荧光监测阵列。

应该注意，图6的袋210具有若干未密封区域，诸如未密封区域255和未密封区域256。这些未密封区域形成不涉及此说明性实施例中的任何反应的泡形罩。反而，这些未密封区域被设置在工作泡形罩和通道之间的空间中。在一些制造过程中，与在所有未使用区域都密封的袋相比，已经发现当设置诸如255和256的未密封区域时有时产生更少的泄漏，可能是由于减少了薄膜材料中成问题的褶皱。对于任何袋实施例可选择地提供这类未密封区域。

图8示出可与袋210一起使用的说明性设备800。仪器800包括可形成外壳壁或被安装在外壳内的支撑构件802。仪器800还包括可选择地可相对于支撑构件802移动的第二支撑构件804，以允许插入和退出袋210。可移动支撑构件804可安装在轨道上或科通过各种方式中的任一种相对于支撑构件802移动。说明性地，一旦袋210已被插入仪器800中，盖805就配合在袋210上。在另一实施例中，通过其他机械装置或通过气动压力将袋210保持就位，可固定支撑构件802和804两者。

说明性地，气囊组件810和气动阀组件808被安装在可移动构件802上，而加热器886和888被安装在支撑构件802上。然而，应该理解，此布置仅是说明性的，并且可采用其他布置。由于气囊组件810和气动阀组件808被安装在可移动支撑构件804上，这些气动致动器可朝向袋210移动，从而使得气动致动器设置为与袋210接触。当袋210被插入仪器800中并且可移动支撑构件804朝向支撑构件802移动时，袋210的各个泡形罩位于与气囊组件810的各个气动气囊和气动阀组件808的各个气动活塞相邻的位置，从而使得启用气动致动器可从袋210的一个或多个泡形罩压出液体或者可与袋210的一个或多个通道形成夹阀。下面参照图9和10更详细地论述袋210的泡形罩和通道与气囊组件810和气动阀组件808的气动致动器之间的关系。

每个气动致动器具有一个或多个气动配件。例如，气囊组件810的气囊824具有气动配件824a，并且气动活塞843具有其相关的气动配件843a。在说明性实施例中，气囊组件810的每个气动配件延伸通过可移动支撑构件804中的通路816，其中，软管878经由阀899将每个气动配件连接到压缩空气源895。在说明性实施例中，通路816不仅提供至压缩空气源895的入口，而且此通路还帮助对准气囊组件810的各个部件，从而使得气囊与袋210的泡形罩正确地对准。

类似地，气动阀组件808也被安装在可移动支撑构件804上，但是应该理解，可采用其他配置。在说明性实施例中，气动阀组件808上的销858安装在可移动支撑构件804上的安装开口859中，气动活塞843、852、853和862延伸通过可移动支撑构件804中的通道816，以接触袋210。如图所示，气囊组件被安装在可移动支撑构件804的第一侧811上，而气动阀组件808被安装在可移动支撑构件804的第二侧812上。然而，由于气动活塞843、852、853和862延伸通过通道816，因此气动阀组件808的气动活塞和气囊组件810的气动气囊一起工作，以为袋210提供必要的气动致动器。

如上所述，气囊组件810和气动阀组件808的每个气动致动器具有相关的气动配件。尽管图8仅示出了若干软管878，但是应该理解，每个气动配件经由软管878连接到压缩气体源895。压缩气体源895可以是压缩机，或替代性地，压缩气体源895可以是压缩气体气缸，诸如二氧化碳气缸。当期望便携性时，压缩气体气缸尤其有用。其他压缩气体源在本发明的范围内。

仪器810的若干其他部件也连接到压缩气体源895。被安装在支撑构件802的第一侧813上的磁体850说明性地利用经由软管878来自压缩气体源895的气体而伸展和收缩，但本领域已知移动磁体850的其他方法。磁体850位于支撑构件802的凹陷部851中。应该理解，凹陷部851可以是通过支撑构件802的通路，从而使得磁体850可接触袋210的泡形罩246。然而，根据支撑构件802的材料，应该理解凹陷部851不必完全延伸通过支撑构件802，只要当磁体850伸展时，磁体850足够靠近以在泡形罩246处提供足够大的磁场，并且当磁体850收缩时，磁体850不显著影响存在于泡形罩246中的任何磁珠。尽管参照了收缩磁体850，但是应该理解，可使用电磁体，并且可通过控制通过电磁体的电流来启用和停用电磁体。因此，尽管本说明书论述了退回或收缩磁体，但是应该理解，这些术语足够广义以包括撤销磁场的其他方式。应该理解，气动连接件可以是气动软管或气动空气歧管，由此减少所需的软管或阀的数量。

被安装在支撑件802上的气动活塞阵列869的各个气动活塞868也经由软管878连接到压缩气体源895。尽管仅示出了将气动活塞868连接到压缩气体源895的两个软管878，但是应该理解，每个气动活塞868都连接到压缩气体源895。显示了十二个气动活塞868。当袋210被插入仪器800中时，十二个气动活塞868被放置用以启用袋210的它们各自的十二个柱塞268。当盖805被关闭在袋210上时，盖805上的边缘806为配件290提供支撑件，从而使得当启用气动活塞868时，盖805将配件290保持就位。应该理解，用于配件290的其他支撑件在本发明的范围内。

一对加热/冷却装置，例如珀尔帖加热器，被安装在支撑件802的第二侧814上。第一级加热器886被放置用以加热和冷却用于第一级PCR的泡形罩264的内容物。第二级加热器888被放置用以加热和冷却用于第二级PCR的袋210的第二级泡形罩282和283的内容物。然而，应该理解，这些加热器也可以用于其他加热目的，并且根据特定应用的需要可包括其他加热器。

如果需要，仪器800可包括反馈机构（未示出），用于提供关于样本是否实际上受迫进入特定泡形罩的反馈。说明性的反馈机构包括温度或压力传感器或光学检测器，尤其是包括荧光或彩色染料时。说明性地，这类反馈机构可被安装在支撑构件802或804上。例如，压力传感器可被安装在支撑件802上，邻近泡形罩264的位置。当样本可能移动到泡形罩264时，如果压力传感器被按压，则允许继续进行样本处理。然而，如果压力传感器未被按压，则样本处理可能停止，或者在在屏幕892上显示错误信息。任意组合的泡形罩或所有泡形罩可具有反馈机构，以提供关于样本是否合适地移动通过袋的反馈。

当需要荧光检测时，可设置光学阵列890。如图8所示，光学阵列890包括光源898，例如过滤白光的过滤LED光源或激光照明，以及照相机896。通过可移动支撑件804的窗口847为光学阵列890提供到达袋210的第二级扩增区280的入口。说明性地，照相机896具有多个光电检测器，每个对应于袋210中的第二级泡形罩282、823。替代性地，照相机896可拍摄包括所有第二级泡形罩282、283的图像，并且图像可被划分为与第二级泡形罩282、283中的每个相对应的单独视域。根据配置，光学阵列890可以是静止的，或者光学阵列890可以位于移动器上，移动器附接到一个或多个马达并且移动以从每个单个第二级泡形罩282、283获得信号。应该理解，可采用其他配置。

如图所示，计算机894控制压缩空气源895的阀899，并由此控制仪器800的所有气动件。计算机894还控制加热器886和888以及光学阵列890。这些部件中的每个都例如经由线缆891电连接，但其他物理连接或无线连接在本发明的范围内。应该理解，计算机894可容纳在仪器890内或者可以在仪器890外部。此外，计算机894可包括控制一些或所有部件的内设电路板，并且还可包括用以接收和显示来自光学阵列的数据的外部计算机，诸如台式或膝上PC。接口893，例如键盘接口，可被设置为包括用于输入信息和变量（诸如温度、循环次数等）的密钥。说明性地，还提供显示器892。显示器892可以例如是LED、LCD或其他这种显示器。

图9示出在仪器800操作期间气囊组件810和袋210之间的关系。气囊组件包括子组件815、817、818、819和822。由于气囊子组件815的气囊809很大，因此气囊子组件815例如具有两个气动配件815a和815b。气囊809用于相对于袋210的塑料薄膜部分217关闭腔292（如图6所示）。当按压柱塞268之一，气动配件815a和815b中的一个或两个允许气囊809放气。在来自腔292之一的流体穿过之后，再次对气囊809加压，密封通道214、236、245和249。尽管说明性气囊子组件815仅具有一个气囊809，但是应该理解，可采用其他配置，说明性地，通道214、236、245和249中的每个具有其自身相关的气囊或气动活塞。气囊子组件822说明性地包括三个气囊824、826和828。如上所述，气囊824、826和828驱动三瓣式泡形罩222进行细胞溶解。如图所示，气囊824、826和828稍大于它们相应的泡形罩224、226和228。已经发现，在充气时，气囊的表面可变得稍微圆顶形，并且利用尺寸稍大的气囊允许在相应泡形罩的整个表面上良好地接触，使得压力更均匀并且更好地排空泡形罩。然而，在一些情况中，可能需要也可能不需要完全排空个别泡形罩，并且较大或较小尺寸的气囊可用于控制泡形罩排空体积。气囊子组件817具有四个气囊。气囊836用作通道236的夹阀，而气囊844、848和866被配置为分别在泡形罩244、248和266上提供压力。气囊子组件818具有两个气囊846和864，其被配置为分别在泡形罩246和264上提供压力。最后，气囊子组件819控制第二级扩增区280。气囊865用作通道265和267的夹阀，而气囊882向第二级泡形罩282和283提供轻柔的压力，以迫使第二级泡形罩与加热器888紧密接触。尽管气囊组件810设置有五个子组件，但是应该理解，此配置仅是示例性的，并且可使用任意数量的子组件或者气囊组件810可被设置为单个一体式组件。

图10类似地示出仪器800操作期间气动阀组件808和袋210之间的关系。气动阀组件808具有四个气动活塞842、852、853和862，而非气囊。这些各自由压缩空气驱动的气动活塞842、852、853和862向通道242、252、253和262提供定向压力。由于活塞的直径相当窄，因此它们可配合在气囊子组件817和气囊子组件818之间以为通道242、252、253和262提供夹阀，允许通道242、252、253和262相当短。然而，如果需要，气动活塞842、852、853和862可被可包括在气囊组件810中的气囊替代，避免对气动阀组件808的需求。应该理解，气囊和气动活塞的任何组合都在本发明的范围内。还应该理解，本领域已知的在袋210的通道和泡形罩上提供压力的其他方法在本发明的范围内。

图12示出与图6的袋210类似的袋510。具有入口通道515a至515l的配件590类似于具有入口通道215a至215l的配件290。具有它们各自的通道538、543、552、553、562和565的泡形罩544、546、548、564和566类似于具有它们各自的袋210的通道238、243、252、253、262和265的泡形罩244、246、248、264和266。袋210的通道245、247和249在某种程度上被重新配置为袋510上的通道545a-c、547a-b和548a-c；510的各个通道稍微短于它们在袋210上的对应通道。然而，应该理解，通道配置仅是示例性的，并且各种通道配置在本发明的范围内。

图12的袋510和图6的袋210之间存在两个主要区别。第一，三瓣式泡形罩222已被溶解泡形罩522替代。溶解泡形罩522被配置为用于经由冲击产生涡旋，该冲击通过旋转附接到电动马达19的叶片或桨叶21产生，如图2b所示。由于此溶解方法不依赖于气动活塞上的交替压力，因此仅示出单瓣式泡形罩。由于溶解泡形罩522仅具有单个瓣，因此通道514和536都通向溶解泡形罩522的单个瓣。应该理解，溶解泡形罩522可用于本文描述的任何袋实施例。还应该理解，说明性地，溶解组件810可被修改为利用被配置用于泡形罩522的单个气囊替代气囊子组件822的气囊824、826和828。相反，在以上各个其他实施例中描述的三瓣式泡形罩可用于袋510。溶解泡形罩522可设置有可选的加强补片523，例如利用粘合剂或层压而附接到溶解泡形罩522的外表面。加强补片523有助于最小化由于与桨叶21反复接触而导致的袋510的撕裂。图13示出被安装在第二支撑构件804上的电动马达，例如Mabuchi RC-280SA-2865直流马达（Chiba, Japan）。在一个说明性实施例中，马达以5,000至25,000rpm（具体地10,000至20,000rpm，更具体地约15,000至18,000rpm）转动。对于Mabuchi马达，已经发现7.2V为溶解提供足够的rpm。然而，应该理解，当桨叶21冲击袋510时，实际速率可稍低。根据使用的马达和桨叶，可利用其他电压和速率进行溶解。可选择地，受控的少量空气可提供到与溶解泡形罩522相邻的气囊。已经发现，在一些实施例中，利用一个或多个少量空气部分地填充相邻气囊有助于在溶解过程期间放置和支撑溶解泡形罩。替代性地，其他结构，例如刚性或柔顺的垫圈或围绕溶解泡形罩522的其他保持结构，可在溶解期间用于约束袋510。

图12的袋510和图6的袋210之间的第二个主要区别是第二级扩增区280的泡形罩281、282和283已被第二级扩增区580中的高密度阵列581替代。高密度阵列581包括多个第二级井582，具体地50或更多个井，更具体地120或更多个井。具有更多个第二级井582，例如约200、约400甚至约500或更多个的实施例在本发明的范围内。其他配置也在本发明的范围内。可通过使井582更小、通过使阵列581的高密度更大或通过其组合来添加额外的第二级井582。对于第二级PCR，每个井可包含一对引物。应该理解，一个或多个井可用于阳性或阴性对照。

当井中填充有泡形罩566中的经稀释的第一级扩增产物时，井之间的交叉污染成为主要问题。在袋210中，通过经由通道265的单独分支填充每个第二级泡形罩，然后利用图9所示的气囊882进行密封，来控制交叉污染。对于高密度阵列581，其中流体可填充泡形罩584中的一些或全部，也必须控制井之间的交叉污染。在一个实施例中，第二级PCR引物可共价地或非共价地结合到每个井的内表面，因此很像PCR芯片起作用。然而，在许多实施例中，期望在不将PCR引物束缚到井的情况下控制井之间的交叉污染。在来自泡形罩566的流体通过流过高密度阵列581的第一表面581a而移动到井582的实施例中，控制井之间的交叉污染是困难的。

存在用于成功地加载第二级扩增区580的若干期望特征。首先，期望从泡形罩566进入的流体基本上将所有井580填充至基本相同的水平。未填充的井会产生错误的阴性信号。第二，期望填充井582的过程不会导致井中的引物漏出。从一个井中损失引物会限制该井中的PCR反应效率并且会污染相邻的井。第三，在井582已被填充并且开始PCR之后，期望井相对于彼此完全密封。扩增子从一个井泄漏出来以及泄漏到另一个井会降低第一个井中的信号并升高第二个井中的信号，可能导致第一个井中的错误阴性和第二个井中的错误阳性。此外，对于某些种类的对照，重要的是在一个井中产生的扩增子不会进入其可能在其中被进一步扩增的另一个井。

此问题的解决方案包括使用屏障层。在一个例子中，屏障层是物理屏障，其被设置为允许快速加载井并允许相对于大量流体快速密封。在另一个例子中，使用组合的化学和物理屏障，其中，物理屏障用于密封井，并且随后化学屏障有条件地将低聚核苷酸引物释放到井溶液中，例如通过加热、缓慢释放或酶消解。井深度或至每个井的通道长度也可用于控制从井释放试剂。可采用其他手段加载高密度阵列581。

图14示出利用物理屏障的第二级580的说明性实施例。具有井582的高密度阵列581夹在袋510的第一层518和第二层519之间。具有穿孔586的穿孔层585被设置在高密度阵列581的一侧上，以用作物理屏障，并且第二层587被设置在高密度阵列581的相反侧上以形成井582的底部。说明性地，穿孔层585和第二层587是已经被密封到高密度阵列581的塑料薄膜，例如通过热密封，但是应该理解，可采用其他密封方法。还应该理解，用于高密度阵列581的材料和用于穿孔层585和第二层587的材料应该彼此兼容并且与密封方法和使用的化学过程兼容。当用于PCR时，可用于高密度阵列581并且可被热密封的兼容塑料的例子是PE、PP、Monprene®和其他嵌段共聚物弹性体。如果在检测化学过程中使用荧光染料，则可能期望高密度阵列581由黑色或其他相对的荧光不透明的材料形成，以最小化从一个井582渗漏到其相邻井的信号并且为了使层585和587中的至少一个相对地荧光透明。对于穿孔层585和第二层587，可使用诸如Mylar®或PET的坚固工程塑料与诸如PE、PP和Dupont Surlyn®的可热密封塑料层的层压构件。对于基于粘合剂的系统，诸如PET或聚碳酸酯的刚性工程塑料可用于形成高密度阵列581，然后PCR兼容塑料薄膜用作穿孔层585和第二层587。在一个说明性实施例中，高密度阵列581由黑色PE形成，复合聚乙烯/PET层压件（或Xerox^® PN104702热层压袋材料）用于被热密封到高密度阵列581的穿孔层585和第二层587，并且复合聚丙烯/PET用于袋510的第一层518和第二层519。

应该理解，穿孔586与井582对准。还应该理解，穿孔586足够小，在缺少一定力时，流体不易流过穿孔586。说明性的穿孔可为0.001-0.1mm，更具体地0.005-0.02mm，更具体地约0.001mm。在说明性实施例中，第二级扩增区580被设置在真空下，从而使得当从泡形罩566接收流体时，真空将流体抽吸通过穿孔586进入每个井582。一旦井582被充满，就不再存在迫使流体流入或流出井582的力。然后可启用与第二级扩增区580相邻的气囊（未示出，但与气囊880/882类似地就位），以相对于高密度阵列581按压第一层518并将流体密封到井582中。尽管袋510的第一层518用于密封井582，但是应该理解，可在穿孔层585和第一层518之间设置可选的密封层。

在一个说明性例子中，可如下地制备第二级扩增区580。可通过首先冲孔、模制或以其他方式在塑料片（说明性地，0.1至1mm厚）中形成一阵列井582。井可形成需要的任何规则或不规则阵列，并且可具有例如0.05μl至20μl的体积，更具体地0.1μl至4μl。然后将层585或587之一层压到高密度阵列581的第一表面581a，例如通过热或粘合剂。如图15所示，穿孔层585被应用于第一表面581a。然后，手动地通过移液器或自动地（例如利用可x/y定位的例如针式点样器的点样器、点阵打印机、小体积自动移液器或微流体微接触式点样器（micro-fluidic micro-contact spotter））将试剂589（例如该阵列的化学过程的独特要素，诸如PCR引物对）点样到井中。下面在例子4中论述用于点样试剂的说明性装置。当每个井582中的试剂589已经干燥之后，将第二层585或587应用到阵列581的第二表面581b。利用一阵列小直径针对层585进行穿孔，以形成穿孔586。可在层585已被固定到阵列581之前或之后形成穿孔586。应该理解，可在层585上在穿孔之前或之后完成点样或在层587上完成点样。对具有预先穿孔的孔的阵列进行点样未显示明显的泄漏，并且提供以下优点，即，用于穿孔的针不会由于接触点样试剂而被污染。替代性地，为了最小化泄漏的可能，并且为了将点样试剂放置在阵列中最远的位置，期望将试剂589点样到第二层587，利用层585密封阵列581，然后对层585进行穿孔。在说明性例子中，利用GeSiM A060-324 Nano-Plotter 2.1/E（Grosserkmannsdorf, Germany）或以下在例子4中论述的点样器将试剂点样到第二层587上。利用这种点样器，可同时点样多个阵列。

一旦被点样和穿孔，阵列581就位于袋510的层518和519内并被密封就位，例如通过热密封、利用粘合剂、超声焊接、机械封闭或将阵列581封闭在袋510中泡形罩584内的其他手段。应该理解，泡形罩584经由通道565流体连接到泡形罩566，并且液体可从通道565流到泡形罩584中并流过穿孔586。在一个说明性例子中，当形成泡形罩584时，注意留出空气逸出的路径。这可通过在与第二级扩增区580相邻的第一层518的内表面上“形成华夫格”完成，以使薄膜材料压印有稍微突起的纹理的式样。这使得空气和液体可沿穿孔层585的表面穿过并且更好地使得液体可到达并填充所有井582。然后，袋510被放置在真空腔内并被排空。说明性地，当压力已达到约0.3毫巴时，真空腔内的气动气缸被启动，将柱塞向下驱动到配件590中以密封通道567，由此阻断来自密封袋内的阵列和真空腔的通道。多个其他柱塞也被驱动到配件590中以密封多个入口通道515。袋从真空腔被取出并且可被封装以便长期存储在真空袋中。

可以与袋210类似的方式使用袋510。由于阵列581被封装在真空那个中，因此，当液体从泡形罩566移动到第二级扩增区580时，液体样本被抽吸通过穿孔586并进入井582中。通过在阵列上方对气动气囊充气驱走过量的液体，并且如上所述地完成热循环，例如通过加热和冷却压靠阵列一侧的珀尔帖元件。

如上所述，穿孔层585可被各种合适的物理或化学屏障替代。在利用化学屏障的一个说明性实施例中，省略穿孔层585，并且试剂589被点样到井582中溶解相对缓慢的缓冲液中。说明性地，包含合适浓度的聚合物（诸如PEG、聚蔗糖、聚山梨醇酯20）或糖（诸如蔗糖、海藻糖或甘露糖醇）的试剂589将与第二级PCR反应兼容并且可比单独点样在水或Tris/EDTA中的引物更慢地溶解。点样在这些缓冲液之一中的引物在井582中被风干，如上所述（应该理解，在这种实施例中，第二层587被固定到高密度阵列581以便点样）。这些相同聚合物可用于冷冻干燥酶试剂（例如在PCR中使用的酶和缓冲液）以形成包含稳定的酶的开口基质。因此，被点样在这些缓冲液中的引物可在井582中的合适位置冷冻干燥，引起相比风干更慢但可能更完全的复水。当使用袋510时，来自泡形罩566的流体通过真空或压力被驱入井中并开始溶解引物混合物。通过选择适当缓慢地溶解的缓冲液，当启用与第二级扩增区580相邻的气囊时，每个井582的内容物在发生任何实质交叉污染之前被密封在其中。

另一个实施例采用直到第二级扩增区580被加热至预定温度以上才溶解的基质。这种基质的一个例子是低熔点琼脂糖，诸如GenePure LowMelt Agarose (ISCBioexpress)。在一个例子中，此琼脂糖的5%溶液在65℃熔化并且在24-28℃胶化。在点样之前，试剂589可例如升温至50℃并且与已经熔化的此琼脂糖混合，然后少量地（例如，100至500nl）被点样到井582中。为了在点样期间保持混合物呈液态，这可能必须在被加热至琼脂糖的熔化温度以上的小室中完成。替代性地，可以用移液管稀释琼脂糖溶液，而不需熔化。在点样琼脂糖/试剂混合物之后，干燥高密度阵列581。这可以是简单的风干，或者引物琼脂糖混合物可包含以上列出的糖和聚合物，从而可以冷冻干燥试剂。当袋510用于PCR时，当来自泡形罩566的流体移动到高密度阵列581时，第二级扩增区580可被加热至例如55℃。在此温度下，琼脂糖未熔化，因此引物未被释放到溶液中。一旦高密度阵列581被充满，就使相应的气囊充气以密封井。当在第一PCR循环的第一变性步骤中温度升高至65℃以上时，包含引物的琼脂糖熔化，将引物释放到混合液中。说明性地，热循环从不降低到60℃（或琼脂糖的其他熔化温度）以下，使得琼脂糖在热循环期间不会胶化。此外，在图8的说明性仪器800中，通过位于袋一侧上的加热器888进行反复的温度循环。预期横跨井582中的PCR溶液通常存在温度梯度，这应当通过对流的流体流有助于引物的混合。在类似实施例中也可以使用蜡。

在另一实施例中，引物可有条件地结合到井581，在井581已被充满之后随即将引物释放到溶液中。根据引物如何附接到塑料基板上，可利用热（例如在PCR反应的第一个循环期间）、光（例如通过窗口847辐射的光）、化学品（例如，双硫腙连同热将降低可以用于将引物联结到井的二硫键）或酶（例如，位点特异性蛋白酶，诸如Tissue PlasminogenActivator，可用于使将引物附接到基板的合适的连接肽裂开）使引物裂开。

在另一实施例中，在扩增之后，脱氧核糖核酸酶可以被注入第二级扩增区580，以进一步最小化任何潜在的污染风险。

应该理解，本文已经描述了用于与PCR使用的第二级扩增区580。然而，袋510和第二级扩增区580的其他用途在本发明的范围内。此外，应该理解，可以在具有或不具有核酸提取物和第一级PCR扩增区的情况下使用第二级扩增区580。最后，应该理解，第二级扩增区580可与本文描述的任何袋实施例一起使用。

例子1：巢式多重PCR

在为袋110配置的与仪器800类似的仪器上，在图5的袋110中进行一组反应。为了示出细胞溶解和两级核酸扩增的有效性，在对数期将各50μL的酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的活培养菌与来自健康捐献者的100μL鼻咽抽出物样本混合以形成样本，然后与200μL溶解缓冲液（6M盐酸胍、15%TritonX 100，3M醋酸钠）混合。然后，将溶解缓冲液中的400μL样本中的300μL注入袋110的腔192a。

袋110被制造为具有被密封在三瓣式泡形罩122中的0.25g ZS珠。如下所述，在制造袋110期间第二级引物也被点样到泡形罩181和182中。袋110被加载如下：

115a 样本和溶解缓冲液，如上所述，

115b 在溶解缓冲液中的磁珠，

115d-e 冲洗缓冲液（10mM柠檬酸钠）

115g 洗提缓冲液（10mM Tris，0.1mM EDTA），

115h 第一级PCR缓冲液：

0.2mM dNTP

0.3μM每个引物：

Sc1：被配置为用于扩增结合到RNA并结合到酿酒酵母的MEX67p的YRA1核酸蛋白质的一部分的引物。所述引物被配置为横跨内含子进行扩增，从而使得cDNA（经由M-MLV逆转录的mRNA）的扩增产生180bp扩增子。

Sc2：被配置为用于扩增酿酒酵母的MRK1糖原合成酶激酶3（GSK-3）同源物的cDNA的121bp区域的引物。

Sc3：被配置为用于扩增酿酒酵母的RUB1泛素样蛋白的cDNA的213bp区域的引物。

Sp1：被配置为用于扩增粟酒裂殖酵母的suc1依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶调节亚基的cDNA的200bp区域的引物。

Sp2：被配置为用于扩增粟酒裂殖酵母的sec14 胞质体因子家族的cDNA的180bp区域的引物。

具有3mM MgCl₂的PCR缓冲液（不具有BSA）

50单位M-MLV

4.5单位Taq：抗体

100单位重组核糖核酸

115j-k 第二级PCR缓冲液

0.2mM dNTP

1X LC Green^® Plus（Idaho Technology）

具有2mM MgCl₂的PRC缓冲液（具有BSA）

4.5单位Taq

115l 具有第一级扩增子的样本的第二级PCR缓冲液。

在制造期间，第二级泡形罩181和182被点样有巢式第二级引物。每个泡形罩被点样有一个引物对，引物对的量在利用第二级PCR缓冲液复水时产生约0.3μM的最终浓度。第二级巢式引物如下：

Sc1：被配置为用于扩增Sc1 cDNA第一级扩增子的80bp部分的引物。

Sc2：被配置为用于扩增Sc1 cDNA第一级扩增子的121bp部分的引物。

Sc3：被配置为用于扩增Sc1 cDNA第一级扩增子的93bp部分的引物。

Sp1：被配置为用于扩增Sc1 cDNA第一级扩增子的99bp部分的引物。

Sp2：被配置为用于扩增Sc1 cDNA第一级扩增子的96bp部分的引物。

对于任何靶，第一级和第二级引物对之间都不存在重叠。每对引物被点样到一个阴性对照泡形罩181和两个第二级泡形罩182中，使得每个第二级扩增运行两次，并且每个复制品具有阴性对照。

在加载之后，与入口通道115a相关联的柱塞的启用将样本移动到三瓣式泡形罩122、与入口通道115b相关联的柱塞的启用将磁珠移动到储存器101，与入口通道115d-e相关联的柱塞的启用将冲洗缓冲液移动到储存器102和103，与入口通道115g相关联的柱塞的启用将洗提缓冲液移动到储存器104，与入口通道115h相关联的柱塞的启用将第一级PCR缓冲液移动到储存器105，与入口通道115j-k相关联的柱塞的启用将第二级PCR缓冲液移动到储存器106和107，以及与入口通道115l相关联的柱塞的启用将阳性对照物（具有预先制备的第一级扩增子的第二级PCR缓冲液）移动到储存器108。在此例子中，在将袋110加载到仪器中之前，按压与入口通道115a和115b相关联的柱塞。在运行期间按顺序按压仪器中的所有其他柱塞，并且根据需要将流体移动到储存器102至108。

一旦袋110被放置到仪器中，就在存在ZS珠的情况下敲击10分钟，如上所述。一旦细胞溶解完成，就压缩储存器101并且迫使来自储存器101的核酸结合磁珠进入三瓣式泡形罩122，其中，轻柔地混合珠并允许培养5分钟。

然后将样本-珠混合物移动到泡形罩144，在该处，经由启用磁体俘获磁珠。一旦磁体伸展，就对与泡形罩144相邻的气囊加压，以迫使流体返回三瓣式泡形罩122。然后利用来自储存器102和103的冲洗溶液如上所述地冲洗被俘获的珠。在冲洗之后，经由启用磁体再次俘获珠在泡形罩144中，并且将存储在储存器104中的洗提缓冲液移动到泡形罩144，在该处，在2分钟的培养之后，随后将从珠洗提的核酸移动到泡形罩161，如上所述。

在泡形罩161中，核酸样本与来自储存器105的第一级PCR混合液混合。然后使样本保持处于40℃下10分钟（在此期间M-MLV将mRNA转化为cDNA），之后保持处于94℃下2分钟（以使M-MLV失活并从taq去除抗体）。然后热循环是20个循环的94℃下10秒和65℃下20秒。

在第一级扩增之后，利用来自储存器106的第二级PCR混合液将样本稀释约100倍。然后将样本移动到如上所述地预先被点样有第二级引物的泡形罩182。第二级PCR缓冲液从储存器181被移动到阴性对照泡形罩181，并且阳性对照混合物从储存器108被移动到泡形罩183。样本在94℃下变性30秒，然后扩增94℃下5秒和69℃下20秒的45个循环。

如图11中可见，所有靶扩增子和阳性对照显示扩增，而阴性对照都未显示扩增。每个样本被复制。复制品各自显示类似的扩增（数据未示出）。

应该理解，酿酒酵母和粟酒裂殖酵母靶仅是说明性的，并且其他靶在本发明的范围内。

例子2：高密度PCR

以上例子使用图5的袋110。袋110具有5个阴性对照泡形罩181、5个阳性对照泡形罩183和10个小体积样本泡形罩182。图6的袋210将小体积样本泡形罩282的数量增加至18个。然而，图12所示的袋510的高密度阵列581可具有120个或更多个第二级井582。第二级反应数量的这种增加使得可进行宽泛组的可能性诊断和人物识别应用，而不需要增大袋及其仪器的尺寸。这里描述了各种例子。

在一个例子中，已知用于常见的呼吸道病毒的标准商业荧光免疫化验能够检测七种病毒：腺病毒、PIV1、PIV2、PIV3、RSV、流感A和流感B。更完整的组（panel）说明性地将可包括对于另外五种病毒的化验：冠状病毒、人类偏肺病毒、博卡病毒、鼻病毒和非HRV肠病毒。对于高度可变病毒，诸如腺病毒或HRV，期望使用多个引物以针对病毒谱系的所有分支（例如，分别4个外部和4个内部引物组）。对于其他病毒，诸如冠状病毒，存在不随季节交替改变的4个不同谱系（229E、NL63、OC43、HKU1），但是它们差异足够大，以致需要单独的引物组。说明性的完全的呼吸道病毒组还针对SARS冠状病毒，可能针对禽流感HA和N子类并且可能针对其他。最后，一些呼吸道病毒示出这种高速率的顺序变化，这将有益于对每个这种病毒产生多于一个巢式PCR化验，由此最小化引物作用下由顺序变化导致的错误阴性结果的机会。当包括本文描述的所有引物组时，在第二级扩增中，这种呼吸道病毒组可具有80个或更多个特异性扩增子。高密度阵列581可容易地将这种组容纳在单个袋510中。

袋510的高密度阵列581的第二个应用将是确定从受感染患者隔离出的多种耐药细菌的特性和耐抗生素范围。目前的方法需要培养组织若干天并根据经验测试各个耐药性概况。在等待结果期间，医生将通常开出宽范围的抗生素，这导致增加多种耐药细菌。PCR引物已被研制用于检测耐抗生素性的基因确定因素（耐抗生素性基因自身）。然而，由于这些基因中的一些的大量变异体，需要大量扩增子来完全确定耐性概况。Hujer等人描述了一组62个PCR化验，用以识别不动杆菌分离菌中存在的耐性基因。同样，高密度阵列581可容易地将这种组容纳在单个袋中。

高密度阵列的使用的第三个例子是人物识别领域，例如用于遗体法医学鉴定和亲子鉴定。人物识别的大部分市场由分析短串联重复序列（STRs）的系统占据。此分析通常需要利用例如毛细管电泳根据尺寸分离重复序列。用于此目的的专用实验室设备通常不是实地便携式的。人们对利用单核苷酸多态性（SPN）进行识别测试越来越感兴趣，因此存在大量用于识别SPN的技术并且这些技术中的一些能够实地使用。Sanchez等人已经出版了一组52个良好特征化的SNP，这共同使得两个人偶然匹配的概率非常低（平均匹配概率至少为5.0×10^-19）。在实践中，每个SNP需要两个扩增子以准确地确定每个基因座的类型（见例如Zhou等人）。因此，具有104个第二级井582的一个袋510可完全地测定一个人的所有52个SNP基因座的类型。

应该理解，通过将不同诊断应用的化验结合到一个袋中可获得成本和工作流程上的优点。例如，完整的呼吸道病毒组可与细菌识别组结合。这些结合可简化制造，因为组装的袋的种类较少。这还可简化最终使用者的工作，因为需要储备在诊所的袋的特定种类较少，并且还降低对于特定临床样本使用错误的袋的可能。对于一些应用，这些优点可补偿制造具有更多数量的引物对的袋的成本。因此，具有100个或更多个第二级井582的一个袋510可用于容纳多个化验组。

例子3：过程对照

对高度多重化验的对照可存在很多问题，尤其是在品质必须与每个测试的成本竞争的临床诊断设施中。袋510的高密度阵列582可能加剧此问题，因为可在单个运行中化验的诊断靶的数量增加。这里论述各种类型的对照。

说明性的过程对照包括将完整的组织，例如包含RNA靶的组织，混合到患者样本中（在将样本注入袋中之前）。这种靶可以是完整的RNA噬菌体（MS2或Qβ）或完整的植物RNA病毒（烟草花叶病毒）或存在于完整的酵母中的mRNA。专用于RNA靶的外部引物将存在于第一级PCR中，并且包含内部引物的井582将存在于高密度阵列中。对此井582中的扩增产物的检测确认过程的所有步骤正确地运作。后第二级扩增熔解曲线也可用于核实制成正确的特定产物。根据扩增曲线确定的交叉点（“Cp”）可用于定量测量试剂的完整性。例如，Cp可与来自在不同时刻运行的相同批的其他的袋的Cp相比较。尽管使用了完整的组织，但是应该理解，如果测试溶解不重要的话，可使用提纯的或分离出的核酸。在其他情形中，可能期望仅利用对照组测试分析的后面步骤。例如，将天然或合成核酸模板与同类引物一起加入高密度阵列的井中可用于测试第二级PCR反应，并且将核酸模板加入具有第一级PCR扩增混合物中的合适引物的第一级PCR和第二级扩增反应区的井582中将测试第一和第二级PCR反应两者。

如上所述的过程对照组不测试靶扩增子专用的引物的完整性。测试特异性引物的完整性的阳性对照的一个例子使用核酸混合物，例如合成RNA，因为通常可更好地控制稳定性和可变性并且这些序列由于环境污染而不能存在，其中，混合物包含用于存在于特定袋中的每个引物的核酸。在诊断设施中，此阳性对照可在用于测试患者样本的袋的运行的结束处使用。混合物可被注入袋中，例如从与用于患者样品批相同的批，并且由所有靶扩增子都提供阳性结果来定义成功。阴性对照可以用相同方式完成；在用于测试患者样本的袋的运行的结束处，可将水或缓冲液注入袋中，并且由所有靶扩增子都提供阴性结果来定义成功。

诊断实验室中的各个工作流程和规程可用于确定在运行上述对照袋之前运行的患者样本袋的数量。无论对比袋频繁或不频繁地运行，这些对照组增加了总系统的时间和成本。为此，在袋内进行对照将是有用的。高密度阵列581的结构允许用于阴性对照的以下新颖方法。在本例子中，核酸，例如，合成扩增子，被加入高密度阵列581的井之一582a中。扩增此序列的引物被加入此井582a并被加入横跨阵列间隔开的另外两个井582b和582c中。说明性地，扩增子序列和引物是人造的并被设计为使得使用的引物都不会偶然扩增另一靶。

当干净的未被污染的袋510在仪器800中运行时，包含合成靶的井582a将产生扩增子并由此被称作阳性。包含相应的引物的另外两个井582a、582b不应该扩增样本中的任何东西并因此被称作阴性。为了额外的对照，可进一步处理袋510。说明性地，然后对使高密度阵列靠着加热器888的气囊880/882减压，并混合井582的内容物。在一个说明性方法中，如下混合井582的内容物：加热器888用于将高密度阵列的温度短时间地循环到缓冲液的沸点以上和以下（例如，85℃10秒、然后105℃20秒的三个循环）。在高密度阵列581的井582中产生的蒸汽泡应该迫使井582的内容物进入第二级扩增区泡形罩580。可选择地，通过利用气囊将液体从袋510的一端移动到另一端，第二级扩增区580的内容物可与袋510的剩余内容物混合。这些步骤的目的是将特异性污染对照扩增子与贯穿袋的任何特异性靶扩增子混合在一起。

如果在袋已经以此方式运行之后使用者意外地打开袋，则将释放特异性靶扩增子和污染对照扩增子两者。如果微量的这种核酸污染之后的袋运行，则仪器可检测到污染事件，因为仅包含专用于合成扩增子的引物的井582b、582c将被记作阳性。仪器中的软件将警告使用者并且运行结果将被标注为疑似。

在对照污染的另一方法中，在运行结束时，可添加DNA降解化学品或酶以破坏第一和第二级PCR反应的几乎所有DNA产物。说明性地，这可通过与上述污染检测方法类似的方法完成，即，通过将第二级阵列的内容物加热至局部沸点温度以上，由此将扩增样本从阵列851的井582中抽出，将加热的液体与第一级反应的稀释内容物混合，添加一等份DNA降解物质（例如通过入口通道515k），冷却或不冷却混合物，以及允许培养DNA降解反应物直到PCR反应中产生的几乎所有DNA都被破坏。如本领域已知的，这可利用脱氧核糖核酸酶、酸或氧化剂来实现。

应该理解，在此描述的污染对照组中的任一个可单独地或以其任意组合使用。

例子4：阵列加载

图16示出高密度阵列的另一实施例。高密度阵列681的配置与高密度阵列581的配置类似。在此说明性实施例中，高密度阵列681设置有布置为圆形图案的102个二级井682。如图所示，阵列681还设置有固定到其上的层687，层687类似于上述第二层587，但是阵列681未设置穿孔层。尽管阵列681是用于本例子的说明性阵列，但是应该理解，阵列581和其他布置的高密度阵列在本发明的范围内。

如上所述，商用点样器，诸如GeSiM A060-324 Nano-Plotter 2.1/E（Grosserkmannsdorf, Germany），可用于加载高密度阵列581。替代性地，可利用可x/y定位的点样器，诸如针式点样器、点阵打印机、小体积自动移液器或微流体微接触式点样器，点样高密度阵列681。

图17-19示出说明性的点样器600。点样器600设置有底座601。泵阵列620附接到底座601。加载阵列630与泵阵列620相邻。说明性的加载阵列630被配置为接收96个井的板，但其他板配置在本公开的范围内，包括384个井的板、1536个井的板和其他配置的板。还应该理解，其他配置的一个或多个小瓶或储存器可用于提供待点样的流体。如在图19中最佳可见的，说明性的96个井的板636位于加载平台635上，96个井的板636远高于标准微量滴定板，以提供用于点样多个阵列的较大储存器。但是，如图20所示，可使用标准的96个井的板。加载平台635可以通过臂634的动作升高或降低。

在图19中，示出板636处于降低位置。在此位置，板636的顶部633不与吸管641的尖端642接触或重叠，允许容易地插入和移出板636。如图20所示，加载平台635处于升高位置。多个吸管638延伸通过支撑件640并进入板636的每个井637。吸管638是从支撑件640上方延伸到每个井637底部的管子。在说明性实施例中，吸管638是25口径不锈钢。然而，可使用与待点样到阵列681的流体兼容的任何材料。优选地，用于吸管638的材料是刚性的或半刚性的，以便延伸到井637的底部，从而几乎可使用板636中的所有流体。为了帮助使用尽可能多的流体，以一定角度切割每个吸管638的尖端642，以防止吸管638相对于井637密封。说明性地，可以以30-60°角，更具体地以45°角，切割尖端642，但是应该理解，角度的选择可取决于井637的形状。例如，如果井637具有平坦底部，则显著小于30°的角度可能是有用的，而大体圆锥形的井637可需要更大的角度。替代性地，在相对于井637密封是成问题的这些配置中，尖端642可具有凹口或凹槽，或者可设置有不与井637的底部一致的任何形状。

每个吸管638向上延伸通过其各自的在支撑件640中的孔口641。如在说明性实施例中示出，孔口641被配置为与井637对准，并且每个孔口的尺寸形成为允许吸管638在孔口641内自由移动。重物639被固定到每个相应吸管638的顶部。每个重物639相对于井637的底部偏压尖端642。在所示实施例中使用圆柱形黄铜重物。然而应该理解，这仅是说明性的并且可使用其他形状和材料。期望重物639的尺寸大于孔口641，从而使得当移除板636时重物639静置在支撑件640上并保持每个相应吸管638就位，以当下一个板升高就位时进入其各自的井。

在说明性实施例中，每个吸管638延伸通过其各自的重物639并连接到柔性管644。然而应该理解，吸管638和管644可在重物639正下方或其内连接，或者吸管638可将成分从更硬材料改变为更软材料。说明性地，管644是内径为0.012英寸、外径为0.025英寸的弹性体材料，例如硅酮或聚氨酯。然而应该理解，根据具体应用，可使用其他尺寸的各种材料。说明性地，柔性管644是弹性体材料，但足够柔韧而不会破裂或破碎的其他材料在本公开的范围内。

如在图17中最佳可见的，多个管644延伸通过平行布置的泵阵列620，并延伸到打印头660。图21示出泵阵列620的横截面图，其中第一气动密封件623更靠近加载阵列630放置，并且第二气动密封件624更靠近打印头660放置。管644被夹在顶部支撑件621和底部支撑件622之间。底部支撑件设置有三个气动元件。第一气动密封件623和第二气动密封件624操作作为管644上的夹阀，以根据需要打开和关闭管644，从而允许流体从井637流过管644达到打印头660。蠕动泵626设置有稍微偏离由虚线631指示的机械中心的泵头625，由此沿打印头方向压迫流体，尤其是当密封件623关闭并且密封件624打开时。可选择地，可以以一定角度（未示出）设置泵626，从而使得泵头625首先与更靠近密封件623的管644接触，由此朝向密封件624压迫流体。在图17中最佳可见的，开口627、628和629连接到管子612、613、614，然后管子612、613、614连接到压缩气体源616。压缩气体源616可以是压缩机，或替代性地，压缩气体源616可以是压缩气体气缸。弹簧（未示出）可用于沿与压缩气体源移动方向相反的方向偏压密封件和泵头，由此使得管可以在较小阻力下恢复其初始形状。在说明性实施例中，需要约50psi或更小来调节合适量的流体。在说明性实施例中，通过单个蠕动泵626同时泵送所有管644中的流体，由此通过每个管644移动基本相同量的流体。在说明性实施例中，管644对准为平行布置，并且密封件623和624以及泵626沿直线布置。然而，其他布置在本公开的范围内。

应该理解，通过管644流到打印头660的流体的量将由管644的直径、泵头625的宽度和泵626施加在管644上的压力大小确定。调节这些参数在本公开的范围内。此外，通过本领域已知的其他装置（例如辊、液压泵、机电泵及其他计量供给装置）泵送流体通过管644在本公开的范围内。

打印头660设置有与高密度阵列681中的102个井682对准的102个位置662。每个管644连接到一个位置662。96个井的板636是96个井637的矩形阵列，而高密度阵列681是102个井682的大体圆形阵列。通过将柔性管子用于管644，可布置仅通过将特定管644固定到打印头660中的特定位置而将来自板636中任何井637的流体传送到高密度阵列681中的任何井682。如图17-18所示，具有96个管644，使打印头660上的六个位置662是空的。当流体被传送到阵列681时，六个井682将仍是空的，见图18中的六个未填充井682。然而应该理解，若干吸管638可附接到单个重物639，从而使得板636中的一个井637为打印头660上的多于一个位置供料。如果在阵列681中运行两次或三次反应，则科期望在板636的每个井637中放置两个或三个吸管638，但是在板636中使用更少的井637。应该理解，具有102个井的板可用于传送流体通过吸管638。重新配置在本公开的范围内，并且当点样器600用于多个不同的阵列681时，可期望进行重新配置。此外，应该理解，打印头660和相应的阵列681的配置仅是说明性的，并且打印头和阵列的其他配置在本公开的范围内，只要打印头与部分或所有阵列基本对准。例如，如图15所示，与阵列581对准的打印头将在本公开的范围内。此外，对于井非常小的密度非常高的阵列，不能形成足够小的以致在打印头上时不接触的滴。在这种情形中，可能期望使用两个或更多个打印头，并使用每个打印头加载阵列的单个部分。

如在图19中最佳可见的，每个管644延伸通过打印头660，从而使得每个管终止于打印头660正下方的孔口645中。在说明性实施例中，一小段金属管子被设置在每个管644的端部处，其可以或可以不延伸通过打印头660，以提供此孔口645，例如与吸管638所使用的管子相同的金属管子。说明性地，孔口645的端部643被抛光为平坦光滑的表面，由此反射光并有助于显示滴692，如下所述。在说明性实施例中，使用250微米的孔口，其尺寸形成为用以提供足够的表面张力，以形成和支撑0.1至10.0μl，更具体地0.5至1.0μl的流体滴。然而，这仅是示例性的并且其他尺寸的孔口和滴在本公开的范围内。在图27所示的替代实施例中，每个管644a可终止于打印头660a处或其内，并且打印头660a可设置有突起677a，突起677a说明性地与打印头主体一体形成。突起677a可被涂成黑色或其他颜色或者可设置有金属涂层，以有助于显示滴。孔口645a可由能够传导所传送的流体的材料制成或涂覆有这种材料。例如，如果流体含水，则可以使用由疏水材料制成的打印头。在一个说明性实施例中，打印头660a可由Teflon®制成或可由具有Teflon®涂层的另一种材料制成，诸如不锈钢。这类材料可用于孔口被设置在打印头本身上的实施例中（图27），或每个管644延伸通过打印头660的实施例中（图19），以减少向打印头660传送的流体。此外，如图25所示，可设置脱离子器680以减少静电作用并有助于从打印头660传送滴。

在操作泵626时，流体从板636的井637移出，从而在经由管644连接到其井637的每个孔口处形成滴692。如在图17中最佳可见的，设置成像系统，例如包括光源和照相机。设置用以照亮滴692的光源672，例如高入射的灯，但可使用其他配置。例如被安装在底座601中的开口668正下方的照相机670对滴692进行成像。图22是打印头660的底部表面661的显示器695（如图26所示）上提供的屏幕截图，示出了附着到与管644附接的96个孔口中的每个的滴692。由于在打印头660上有102个位置662，并且说明性例子中每个井637仅使用一个吸管638，因此六个位置662没有滴692，示出六个管孔口645。其余96个孔口被它们各自的滴692阻挡。图23类似于图22，只是缺少二十个滴，如空位置691所示，展示了额外二十个管孔口。

照相机670连接到处理器694（见图26），处理器694被编程以确定所有滴692是否足够，例如通过估计体积（4/3πr³）并与可接受体积范围比较。编程还可包括检测会使滴不足的气泡。在一个说明性实施例中，可按以下步骤对处理器进行编程：

（1）向照相机670发信号以获得滴形成之前打印头的图像，

（2）核查图像以确保打印头660上不存在滴，

（3）如果存在微滴，则软件通知使用者，否则向点样器发出信号以产生滴692，

（4）向照相机670发信号以获得具有滴692的打印头的第二个图像，

（5）核查图像以确保滴692的位置和尺寸合适，

（6）如果步骤（5）中的滴692经核查不合格，则软件通知使用者，否则向点样器600发信号以打印阵列681，

（7）在打印阵列681之后，软件向照相机670发信号以获得没有滴的打印头660的第三个图像，

（8）核查图像以确保打印头660上不存在滴，

（9）软件通知使用者每个步骤（8）的核查情况。

用于在步骤2、5和8中核查滴存在和不存在的图像分析依赖标准二进制阈值技术。

作为步骤5中核查滴信息的一部分，在一个说明性实施例中，分析图像以确定每个滴的位置和直径（以像素计）。软件核查每个滴的中心位置在孔口641的中心的规定距离内。接着，软件确定每个滴的半径并核查这些大于下阈值以确保每个井中存在的引物量足以进行PCR扩增，并且小于上阈值以确保微滴不会沉积在阵列681的靶井682之外。下阈值和上阈值可以是1%、2%、5%、10%、15%、20%或从应用中可接受的滴提供一定范围的流体的任何其他百分比。

作为步骤5中滴形成的替代核查方案，当成像时可掩蔽滴，每个滴具有圆形掩模。使用掩模而不利用半径作为标准。如果滴完全填充圆并且不超出圆，则滴合格。如果滴未完全填充圆或超出圆的尺寸，则滴不合格。选择圆的线条的宽度以提供阈值，较粗的圆线条提供较大的范围，较细的圆线条提供较小的范围。

替代性地，视觉观察图像可用于确定是否所有滴692都足够。如果所有滴692都足够，则可被传送到阵列681。可能期望在流体中包括彩色或荧光染料，以帮助显影。替代性地或额外地，可抛光孔口641的端部643以反射光和帮助显影。如果荧光染料用于PCR检测，则可能期望显影该染料或使用不与PCR的荧光相干扰的另一种显影染料。例如，LCGreen®Plus可用于PCR检测，而IRDye® （Licor, Lincoln, Nebraska）可用于滴显影。本领域已知其他染料。可选择地，在传送之后可对打印头660、阵列681或两者显影，以确定是否已经从打印头660传送了来自每个滴692的足够量。

如果滴692由于不满足预定标准而不足够，则滴可被传送到阵列681，如上所述，但可丢弃阵列681。替代性地，可通过吸除或其他方式从打印头660移除不足够的滴692。

为了更好地观察其他部件，从图17和图19的近侧省略放置臂652。然而，在图18、24和25中最佳地示出放置臂。放置臂652设置有用于接收阵列681的平台653。阵列681设置有一个或多个，优选两个或多个开口655，对准销654可延伸通过开口655。开口655可被配置为卡扣到对准销654，以便更牢度地对准。替代性地，可提供用以接收阵列681的凹陷部。应该理解，将阵列681合适地放置到平台653上的其他方法在本公开的范围内。如果滴由于满足预定标准而被确定为足够，则向上移动放置臂652，从而使得阵列681的每个井682被放置为与其各自的滴692接触。一旦形成接触，每个滴692及其各自的孔口645之间的表面张力就被释放，并且滴692被传送到其各自的井682。然后可降低放置臂652，移除阵列681，并且重复该过程，只要板636的每个井637中具有足够的流体。应该理解，在传送滴692之后，可相对于阵列581如上所述地处理阵列681，以使其成为本文描述的任何袋的第二级。

图24-25示出一个说明性放置臂652的细节。在本例子中，放置臂652包括平面四杆机构664，其中，联接器连杆656将平台653连接到旋转臂659。联接器连杆656在附接点649处附接到从动件连杆658，并且在附接点648处附接到旋转臂659。旋转臂659在附接点647处附接到顶部结构605，并且从动件连杆658在附接点650处附接到顶部结构605。短连杆669由附接点647和648之间的距离确定。顶部结构605用作四杆机构的接地连杆。在说明性实施例中，选择连杆的长度，使得高密度阵列681跟随在马上接触打印头660之前竖直移动的联接器曲线。这种竖直移动是期望的，从而使得每个滴692与其各自的井682接触，同时最小化当马上接触之前的移动不是竖直的时可发生的交叉污染。此联接器曲线移动也是有用的，因为照相机670的开口668可位于打印头660正下方。压印板663在旋转接头646处接合到联接器连杆656。可调节旋转接头646以提供阵列681和打印头660之间的平面对准。在对准好之后，可以锁定旋转接头646以提供持续的对准。如图19所示，提供两个相同的平面四杆机构664（顶部结构605的每侧上提供一个）并且被同步锁定（该同步一起旋转两个驱动器连杆657）以在打印头660处合适地对准阵列681，如图25所示。应该理解，平面四杆机构664仅是说明性的，并且将阵列放置在打印头660上的其他方法在本公开的范围内，包括其他手动和自动手段。

打印头660被固定到泵板667，泵板667固定到泵阵列620。泵板667可相对于泵阵列620移动，从而允许与照相机670对准。替代性地，泵板667可设置有在泵阵列620上的多个附接位置，使得能够横向放置。这种横向放置可选择地允许通过单个泵头660填充可在压印板663上彼此相邻地就位的多个阵列681，或者允许泵头660通过先在一个位置打印，然后在第二位置打印来打印较大的阵列。

图24-25示出照相机670的说明性布置。在本说明性实施例中，水平地安装照相机670，并且镜子674用于反射通过开口668接收的图像。然而应该理解，其他布置在本公开的范围内，包括但不限于省略镜子和将照相机670竖直地安装在开口668下方。提供底部外壳604以保护照相机670。可提供顶部外壳（未示出）以保护底座601上方的许多部件。然而，优选的是，这种顶部外壳允许相对容易地插入和移出阵列681和板636。

返回图22-23，存在被内设到打印头660的多个支座675，例如六个支座675，但可使用其他数量的支座。已经发现，当层687被固定到阵列681时，阵列681常常稍微弯曲。支座675用于在滴692被传送到井682期间靠着压印板663推平阵列681。

图26是用于点样阵列的系统698的框图。系统698包括计算装置696，其可包括一个或多个处理器694、存储器（未示出）、计算机可读介质（未示出）、一个或多个HMI装置（例如，输入输出装置（未示出）、显示器695、打印机（未示出）等）、一个或多个通信接口（未示出）等。计算装置696可以可通信地联接到点样器600，点样器600可联接到压缩气体源616。计算装置可控制系统的一个或多个部件，包括泵阵列620、放置臂652、加载平台635、成像系统676或任何组合。应该理解，系统可被配置为使得可手动地操作各个部件。

可通过插入其所有井637都包含清洁溶液的板636来清洁点样器600，并且启用泵626直到所有清洁溶液都已离开孔口641。盛器可被放置在打印头660下方以收集清洁溶液。

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尽管已经参照优选实施例详细描述了本发明，但是改变和修改处于如在所附权利要求中描述和限定的本发明的范围和精神内。

Claims (25)

1.一种用于将多个流体点样到阵列中的接触点样器装置，包括：

多个储存器，每个储存器保持其各自的流体，

具有多个孔口的打印头，所述多个孔口以与所述阵列相同的配置设置，

多个管，每个管被配置为从所述管的第一端处的储存器到所述管的第二端处的打印头中的孔口提供流体连通，

泵，其用于通过所述管将流体从所述储存器泵送到所述打印头，以便在所述孔口上形成并保持多个滴，

平台，其用于接收和定位所述阵列并使所述阵列与所述打印头接触，从而将每个滴传送到其各自的阵列井，以及

照相机，其定位为与所述打印头视觉接触，所述照相机能够操作为同时提供在滴形成之前的全部所述多个孔口的图像，并且同时提供在滴传送之前的带有由所述泵保持的滴的全部所述多个孔口的图像。

2.根据权利要求1所述的接触点样器装置，进一步包括：

被设置在所述储存器上方的支撑件，

多个吸管，每个吸管连接到其各自的管的第一端，每个吸管从其各自的管的第一端延伸并通过所述支撑件到达储存器，每个吸管具有定位在所述支撑件上方的重物以将所述吸管偏压到所述吸管的各自的储存器的底部。

3.根据权利要求2所述的接触点样器装置，其中，在移除所述储存器时，所述重物静置在所述支撑件上。

4.根据权利要求2所述的接触点样器装置，其中，所述吸管是刚性的或半刚性的，并且所述管是弹性体的。

5.根据权利要求1所述的接触点样器装置，其中，所述泵进一步包括：被配置为同时对所有管进行泵送的泵。

6.根据权利要求5所述的接触点样器装置，其中，所述泵是设置有偏置的泵头的蠕动泵。

7.根据权利要求1所述的接触点样器装置，其中，所述照相机进一步能够操作为同时提供在滴传送到所述阵列之后的所述打印头的全部所述孔口的图像。

8.根据权利要求7所述的接触点样器装置，进一步包括CPU，所述CPU具有被配置为分析所述图像的软件，所述软件能够操作为确定每个滴是否满足预定标准。

9.根据权利要求7所述的接触点样器装置，进一步包括用以照亮所述滴的光源。

10.根据权利要求9所述的接触点样器装置，其中，所述光源是高入射光源。

11.根据权利要求10所述的接触点样器装置，其中，每个孔口具有被抛光成平坦光滑的表面的端部，该端部被配置为用于将来自所述光源的光反射回其各自的滴。

12.根据权利要求7所述的接触点样器装置，其中，每个所述储存器中的流体包含荧光染料，以帮助对所述滴成像。

13.根据权利要求1所述的接触点样器装置，其中，所述管能够移除地连接到所述打印头，从而使得与管流体连通的任何预选定储存器能够被设定为将来自所述预选定储存器的流体提供到所述打印头上的任何孔口。

14.根据权利要求1所述的接触点样器装置，其中，所述多个储存器是96个井的板中的井。

15.根据权利要求1所述的接触点样器装置，进一步包括计量供给装置，所述计量供给装置能够操作为将预选定量的流体从所述多个储存器推动到所述打印头上的所述多个孔口。

16.根据权利要求15所述的接触点样器装置，其中，所述计量供给装置位于所述多个储存器和所述打印头之间。

17.根据权利要求15所述的接触点样器装置，其中，所述计量供给装置是蠕动泵。

18.一种利用根据权利要求1-17中任一项所述的接触点样器装置将多个流体点样到阵列中的方法，包括：

获取在滴形成之前的所述打印头的所述多个孔口全部的图像，

将流体从以第一配置设置的多个储存器同时泵送到所述多个孔口，以在所述孔口上形成多个滴，其中所述第一配置不同于所述阵列的配置，

使所述阵列与所述滴接触，以及

将每个相应滴同时传送到其各自的井中。

19.根据权利要求18所述的方法，进一步包括：对所述滴成像并且在使所述阵列与所述滴接触之前确定所述多个滴全部的估算容量是否在预定的上阈值和下阈值之内。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，如果一个或多个滴被确定为在所述预定的上阈值之上或所述预定的下阈值之下，则丢弃所述阵列。

21.根据权利要求19所述的方法，其中，如果所述滴中的一个或多个被确定为在所述预定的上阈值之上或所述预定的下阈值之下，则移动吸除材料以与所述滴接触，并且重复泵送和成像步骤。

22.根据权利要求19所述的方法，其中，估算所述多个滴中的每一个的容量包括：分析所述图像以确定每个滴的位置和半径，并且核查所述滴中的每一个的半径对应于在所述下阈值之上和所述上阈值之下的估算容量。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述多个滴中的每一个的估算容量在所述上阈值和所述下阈值的1%、2%、5%、10%、15%或20%之内。

24.根据权利要求19所述的方法，其中，估算所述多个滴中的每一个的容量包括：在所述多个滴中的每一个周围限定掩模，并且其中，如果滴填充但不超出所述掩模，则所述滴在预定的上阈值和下阈值之内。

25.根据权利要求18所述的方法，进一步包括如下步骤中的一个或多个：

a）向所述照相机发信号以获得滴形成之前的所述打印头的第一图像，

b）核查所述第一图像以确保在所述打印头上不存在滴，

c）如果在步骤b）中存在滴，则通知使用者，

d）如果在步骤b）中不存在滴，则发出在所述孔口上形成多个滴的信号，

e）向所述照相机发信号以获得具有滴的所述打印头的第二图像，

f）核查所述第二图像以确保所述滴的位置和尺寸或容量合适，

g）如果在步骤f）中所述滴未通过核查，则通知使用者，

h）如果在步骤f）中所述滴通过核查，则发出使所述阵列与所述滴接触的信号，

i）向所述照相机发出信号以获得在使所述阵列与所述滴接触之后的所述打印头的第三图像，

j）核查所述第三图像以确保在所述打印头上不存在滴，

k）如果在步骤j）中所述打印头通过核查，则通知使用者。