本明細書に記載されている内蔵型核酸分析ポーチは、例示的に、単一の閉鎖システム内において、試料を種々の生物学的物質、例えば、抗原および核酸配列の存在についてアッセイするために用いられるとよい。一実施形態では、ポーチは、多数の病原菌のアッセイに用いられる。例示的には、任意選択的に使い捨て可能なポーチにおいて、種々のステップ、例えば、核酸調製、大量の一次多重PCR、一次増幅産物の希釈、および二次PCR、これに加えて、実時間検出および/または増幅後分析、例えば、融解曲線分析を行うことができる。しかし、病原菌検出は、1つの例示的な使用法であり、ポーチは、他の核酸分析または他の物質、例えば、制限されるものではないが、ペプチド、毒素および小分子の検出に用いられてもよいことを理解されたい。さらに、種々のステップが本発明のポーチ内において行われてもよいが、いくつかの使用において、これらのステップの1つまたは複数が省略されてもよく、それに応じて、ポーチ構成が変更されてもよいことを理解されたい。
PCRは、本明細書の実施例に用いられる増幅方法であるが、プライマーを用いるどのような増幅方法も適切に用いられることを理解されたい。このような適切な手順の例として、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、核酸配列基増幅(NASBA)、カスケードローリングサークル増幅(CRCA)、DNAのループ介在等温増幅(LAMP)、等温キメラプライマー核酸増幅(ICAN)、ターゲット基ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、転写介在増幅(TMA)、などが挙げられる。従って、PCRという用語が用いられる場合、他の代替的な増幅方法を含むことを理解されたい。プロトコルは、それに応じて調整される必要があることを理解されたい。
図1は、例示的な内蔵型核酸分析ポーチ10を示している。ポーチ10は、細胞溶解区域20、核酸調製区域40、第1段階増幅区域60,および第2段階増幅区域80を有している。核酸を含む試料は、試料注入ポート12を介して、ポーチ10内に導かれる。ポーチ10は、種々の通路および種々の大きさのブリスターを備えており、試料がシステムを通って流れるように配置されている。試料は、種々の区域を通り抜け、それに応じて処理されることになる。
試料処理は、ポーチ10内に配置された種々のブリスター内において行われる。試料を処理区域内に移動させるために、かつ試料を処理区域間で移動させるために、種々のチャネルが設けられている。その一方、流体および試薬を試料に送達するために、また試料からこのような流体および試薬を取り出すために、他のチャネルが設けられている。ポーチ10内の液体は、例示的には、圧力、例えば、以下に述べる空圧によってブリスター間を移動するようになっているが、ポーチ内において材料を移動させる他の方法も考えられる。
他の容器が用いられてもよいが、例示的に、ポーチ10は、2層の可撓性プラスチックフィルムまたは他の可撓性材料、例えば、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリル酸、およびこれらの混合物から形成されている。これらの材料は、当技術分野において周知のどのようなプロセス、例えば、押出成形、プラズマ蒸着、およびラミネート加工によって、作製可能である。金属箔またはアルミニウムが積層されたプラスチックが用いられてもよい。ブリスターおよびチャネルを形成するように互いに封止することができる他のバリア材料も、当技術分野において周知である。もしプラスチックフィルムが用いられるなら、これらの層は、例示的に、熱融着によって一緒に接合されるとよい。例示的に、この材料は、低い核酸接合力を有している。
蛍光モニタリングを用いる実施形態では、操作波長における吸光度および自己蛍光が充分に低いプラスチックフィルムが好ましい。このような材料は、種々のプラスチック、種々の可塑剤、および組成比、ならびに種々のフィルム厚みを試すことによって、特定されるとよい。アルミニウムまたは他の箔が積層されたプラスチックの場合、蛍光検出装置によって読み取られるポーチの部分は、箔が存在しないようになっているとよい。例えば、もしポーチ10の第2段階増幅区域80のブリスター82内において蛍光がモニターされるなら、ブリスター82の一方または両方の層は、箔が存在しないようになっているとよい。PCRの実施例において、約0.0048インチ(0.1219mm)厚みのポリエステル(Mylar、デュポン(Dupont)、デラウエア州ウィルミントン)および0.001〜0.003インチ(0.025〜0.076mm)厚みのポリプロピレンフィルムから構成されたフィルムラミネートが良好である。例示的に、ポーチ10は、入射光の略80%〜90%を透過することができる透明な材料から製造されている。
例示的実施形態では、材料は、圧力、例えば、空圧をブリスターおよびチャネルに印加することによって、ブリスター間を移動するようになっている。従って、空圧を用いる実施形態では、ポーチ材料は、例示的に、空圧が所望の効果をもたらすのに充分な可撓性を有している。本明細書に用いられる「可撓性(flexible)」という用語は、ポーチの材料の物理的特性を記述するために用いられている。本明細書において、「可撓性」という用語は、亀裂、破断、ヒビ割れ、などを生じることなく、空圧のレベルによって容易に変形可能な特性として定義されている。例えば、薄いプラスチックシート、例えば、SeranTMラップおよびZiploc(登録商標)バッグ、ならびに薄い金属箔、例えば、アルミニウム箔は、可撓性を有している。しかし、空圧を用いる実施形態においても、ブリスターおよびチャネルの一部の領域しか可撓性を必要としない場合がある。さらに、ブリスターおよびチャネルが容易に変形可能である限り、ブリスターおよび通路の一方しか可撓性を必要としない場合がある。ポーチ10の他の領域は、剛性材料から作製されていてもよく、または剛性材料によって補強されていてもよい。
例示的には、プラスチックフィルムがポーチ10に用いられている。金属、例えば、アルミニウムまたは他の適切な材料のシートが、隆起面のパターンを有する型を形成するように、圧延加工または切削加工されるとよい。例示的には195℃の作動温度で調整される空圧プレス(例えば、A−5302―PDS、Janesville Tool Inc.、ウィスコンシン州ミルトン)内に装着されると、この空気プレスが印刷機のように機能し、型がプラスチックフィルムと接触している箇所のみ、プラスチックフィルムの密封表面を融解することになる。ポーチ10が形成されるとき、種々の成分、(例示的にはフィルム上にスポッティングされ、乾燥される)PCRプライマー、抗原結合物質、磁気ビーズ、および珪酸ジルコニウムビーズが、種々のブリスター内に密封されるとよい。試料処理用の試薬は、密封前に、フィルム上に一緒にまたは個別にスポッティングされるとよい。一実施形態では、ヌクレオチド三リン酸(NTP)がポリメラーゼおよびプライマーとは別にフィルム上にスポッティングされ、水性試料によって反応が水和されるまで、ポリメラーゼの活性を本質的に排除するようになっている。水性試料が水和の前に加熱される場合、正確なホットスタートPCRのための条件が満たされ、ホットスタート用の高価な化学成分の必要性が低下または排除されることになる。この別々のスポッティングは、図5bに関して、以下にさらに詳細に説明するが、このようなスポッティングは、本明細書に記載されている実施形態のいずれに用いられてもよいことを理解されたい。
ポーチ10内の材料を移動させるために空圧が用いられる場合、一実施形態では、「ブラダー(bladder)」が用いられるとよい。ブラダーアセンブリ710(この一部が図2aに示されている)は、ポーチを製造するためのプロセスと同様のプロセスによって作製されるとよいが、ブラダーアセンブリ710内の個々のブリスターは、ブラダーアセンブリ710内の個々のブリスターが圧縮ガス源によって加圧されることを可能にする空圧取付具(例えば、取付具724a)を含んでいるとよい。ブラダーアセンブリは、圧縮ガスを受けるものであり、複数回使用できるようになっているので、ポーチよりも強い材料または厚い材料から作製されているとよい。代替的に、ブラダーは、ガスケット、シール、弁、およびピストンと一緒に固定された一連のプレートから形成されていてもよい。他の構成も本発明の範囲内にある。
ポーチ10が機器内に配置されると、空圧ブラダーアセンブリ710がポーチ10の1つの面に押し付けられ、これによって、特定のブラダーが膨張すると、その圧力がポーチ10内の対応するブリスターから液体を押し出すことになる。ポーチ10のブリスターの多くに対応する空圧ブラダーに加えて、ブラダーアセンブリは、ポーチ10の種々のチャネルに対応する付加的な空圧アクチュエータ、例えば、ブラダーまたは空圧によって駆動されるピストンを有していてもよい。これらの付加的な空圧アクチュエータは、作動されると、ピンチ弁を形成し、対応するチャンネルを締付けることによって閉鎖する。ポーチ10の特定のブリスター内に液体を閉じ込めるために、ピンチ弁空圧アクチュエータは、ブリスターに通じるチャンネルの全体にわたって膨張し、これによって、アクチュエータがピンチ弁として機能し、該チャネルを締付けることによって閉鎖する。例示的に、互いに異なるブリスター内の2つの液体の量を混合するために、連結チャンネルを封止しているピンチ弁空圧アクチュエータが減圧され、該ブリスターに面する空圧ブラダーが交互に加圧され、これによって、ブリスターに接続されたチャネルを通して液体を往復させ、その結果、液体が混合されることになる。ピンチ弁空圧アクチュエータは、種々の形状および種々の大きさを有することができ、2つ以上のチャネルを同時に締め付けるように構成されていてもよい。このような例示的なピンチ弁は、ピンチ弁16として、図1に示されている。ピンチ弁16は、全ての注入ポートを閉鎖するのに用いられるとよい。本明細書では、空圧アクチュエータが検討されているが、ポーチに圧力を供給する他の方法、例えば、リニアステッパモータまたはモータ駆動カムのような種々の電気機械アクチュエータ、空圧力、流体圧、または電磁気力によって駆動される剛性パドル、ローラ、ロッカーアーム、場合によっては、コックバネも考えられることを理解されたい。さらに、チャネルの軸と直交する方向に圧力を印加する方法に加えて、可逆的または非可逆的にチャネルを閉鎖する種々の方法もある。これらの例として、チャネルを横切ってバッグを捻る方法、熱融着する方法、アクチュエータを回転させる方法、および蝶弁およびボール弁のようなチャネル内に封入された種々の物理的弁を用いる方法が挙げられる。加えて、小型のペルチェ素子または他の温度調整器が、チャネルに隣接して配置され、流体を凍結させるのに充分な温度に設定され、シールを効果的に形成するようになっていてもよい。また、図1の設計は、ブリスターおよびチャネルの各々の上に配置されたアクチュエータ要素によって特徴付けられる自動機器に適合されているが、アクチュエータが静止した状態に維持され、ポーチが一次元または二次元的に移行する構成も考えられる。この場合、処理ステーションのいくつか、例えば、試料破壊、核酸捕捉、第1段階PCRおよび第2段階PCR、ならびに免疫アッセイおよび免疫PCRのようなポーチの他の用途に対して、わずかな数のアクチュエータしか用いられないようにすることができる。チャネルおよびブリスターに作用するローラは、ポーチがステーション間を移行する構成では、特に有用であることが分かっている。従って、空圧アクチュエータが、ここに開示されている実施形態において用いられているが、「空圧アクチュエータ」という用語が本明細書に用いられる場合、ポーチおよび機器の構成に応じて、圧力をもたらす他のアクチュエータおよび他の方法が用いられてもよいことを理解されたい。
図1を参照すると、核酸抽出および多重PCR用に構成された例示的な試料ポーチ10が準備される。試料は、取付具90の試料注入ポート12を介してポーチ10内に入るようになっている。注入ポート12は、脆弱シール、一方向弁、または他の入口ポートであるとよい。ポーチ10内の真空が試料をポーチ10内に引き込むために用いられるとよい。注射器または他の圧力が試料をポーチ10内に押し込むために用いられてもよいし、または試料を注入ポート12を介してポーチ10内に導く他の手段が用いられてもよい。試料は、チャネル14を介して、細胞溶解区域20の3ローブ式ブリスター22内に移動し、該3ローブ式ブリスターにおいて、試料内の細胞が溶解される。試料が3ローブ式ブリスター22に入ると、ピンチ弁16が閉鎖される。すでに閉じられているピンチ弁36に加えて、ピンチ弁16が閉じられることによって、試料が3ローブ式ブリスター22内に密封される。細胞溶解は、全ての試料に必ずしも必要ではないことを理解されたい。このような試料の場合、細胞溶解区域は、省略されてもよいし、または試料が次の区域に直接移動するようになっていてもよい。しかし、多くの試料では、細胞溶解は、必要である。一実施形態では、細胞の溶解にビーズ粉砕(bead−milling)が用いられている。
珪酸ジルコニウム(ZS)ビーズ34のような溶解用粒子の存在下で試料を振動または渦撹拌するビーズ粉砕は、溶解物を形成するのに効果的な方法である。本明細書に用いられる「溶解(lyse)」、「溶解する(lysing)」および「溶解物(lysate)」のような用語は、細胞を破裂させることに制限されず、ウイルスのような非細胞粒子の破壊も含むことを理解されたい。図2は、細胞溶解区域20の一実施形態を示している。ここでは、集束流が高速ビーズ衝突をもたらし、これによって、溶解物を生じるようになっている。例示的には、3ローブ式ブリスター22の2つの下側ローブ24,26が、チャネル30を介して互いに接続されており、上側ローブ28が、チャネル30の反対側31において、下側ローブ24,26に接続されている。図2aは、ポーチ10の細胞溶解区域20に接触することになるブラダーアセンブリ710の対応部分を示している。ポーチ10が機器内に配置されると、ブラダーアセンブリ710の対応する空圧ブラダー724,726,728が、それぞれ、ポーチ10のローブ24,26,28に隣接する。「隣接(adjacent)」という用語は、ポーチ内のブリスターまたはチャネルとその対応する空圧アクチュエータとの関係に関して用いられる場合、ポーチが機器内に配置されたときのブリスターまたはチャネルと対応する空圧アクチュエータとの関係を指すことと理解されたい。一実施態様では、下側ローブ24,26に隣接する2つの下側空圧ブラダー724,726の空圧取付具724a,726aは、一緒に組み込まれている。空圧取付具724a,726aと、上側ローブ28に隣接する上側空圧ブラダー728の空圧取付具728aとは、複動式空圧シリンダーを駆動させるように構成された電気作動式弁の対向側に組み込まれている。このように構成されていることによって、上側空圧ブラダー728および2つの下側空圧ブラダー724,726との間に圧力が交互に加えられる。弁が交互に切り換えられると、ポーチ10内の液体は、チャネル30内の狭い連結部32を通って、下側ローブ24,26と上側ローブ28との間を移動することになる。2つの下側ローブ24,26が同時に加圧されると、流れが集束し、上側ローブ28内に流れ込む。ローブの幾何学的形状にもよるが、連結部32におけるビーズ34の衝突速度は、少なくとも約12m/秒であるとよく、これによって、高衝撃の衝突をもたらし、その結果、細胞溶解をもたらすことになる。例示的な3ローブ式システムは、大きさおよび空気ガスの消費を最小限に抑えながら、良好な細胞破壊および良好な構造堅牢性を可能にとする。ZSビーズが溶解粒子として用いられているが、この選択は、単なる例示にすぎず、他の物質および別の形状の粒子が用いられてもよいことを理解されたい。また、細胞溶解区域20の他の構成も本発明の範囲内にあることを理解されたい。
3ローブ式ブリスターが細胞溶解のために用いられているが、他の多重ローブ式構成も本発明の範囲内にあることを理解されたい。例えば、例示的にクローバ葉のパターンを有する4ローブ式ブリスターが用いられてもよく、この場合、両側のブリスターが同時加圧され、溶解粒子を互いに向かう方に押し出し、次いで、他の2つのローブに対して偏らせ、この後、一緒に加圧されるようになっている。このような4ローブ式ブリスターは、両方向において高速衝撃をもたらすという利点がある。さらに、単一ローブ式ブリスターを用いることも考えられる。この場合、溶解粒子が単一ローブ式ブリスターの1つの部分から他の部分に迅速に移動することができる。例えば、空圧アクチュエータを用いて、単一ローブ式ブリスターのある領域を閉じ、これによって、残りの領域内に多重ローブ式ブリスターを一時的に形成することができる。他の作動方法、例えば、装置のローブに作用するモータ、空圧、流体圧、または電磁気によって駆動されるパドルが用いられてもよい。例えば、もし再循環手段が上側ローブと下側ローブとの間に設けられており、アクチュエータが蠕動ポンプ作用をもたらすなら、ローラまたは回転パドルを用いて、流体を図2の連結部32の位置において一緒に移動させることができる。他の構成も本発明の範囲内にある。
単一ローブ式溶解ブリスター内において、多重ローブ式ブリスターを一時的に形成することなく、溶解をもたらすため充分迅速に試料および溶解粒子を移動させることも可能である。このような1つの代替的実施形態では、図2bに示されているように、電動モータ19に取り付けられた回転ブレードまたはパドル21によってポーチに衝撃を与えることによって、渦巻きが形成されるとよい。ブレード21は、溶解ブリスターにおいてポーチに衝撃を与えてもよいし、または溶解ブリスター近傍、例えば、溶解ブリスターに隣接するエッジ17においてポーチに衝撃を与えてもよい。このような実施形態では、溶解ブリスターは、1つまたは複数のブリスターを備えているとよい。図12は、このような1つの溶解ブリスター522を備える実施形態を示している。図13は、ブレード21を備えるビーズ撹拌モータ19を示している。このモータ19は、図8に示されている機器800の第2の支持部材804の第1の側811に取り付けられるとよい。しかし、モータ19は、機器800の第1の支持部材802または他の構造部に取り付けられてもよいことを理解されたい。
図2aは、空圧取付具716aを有する空圧プラダー716および空圧取付具736aを有する空圧プラダー736を示している。ポーチ10がプラダーアセンブリ710に接触して配置されると、ブラダー716は、チャネル12と真っ直ぐに並び、ピンチ弁16をもたらすことになる。同様に、プラダー736は、チャネル38と真っ直ぐに並び、ピンチ弁36をもたらすことになる。空圧プラダー716,736の作動によって、ピンチ弁16,36が開閉する。プラダーアセンブリ710の細胞溶解区域に隣接する部分しか示されていないが、プラダーアセンブリ710は、同様の配置の空圧プラダーを備えており、ポーチ10の残りの区域の全体にわたって流体の移動を制御するようになっていることを理解されたい。
他の従来技術の機器が、密封された可撓性容器内におけるPCRを示唆している。例えば、米国特許第6,645,758号、米国特許第6,780,617号、および同時係属中の米国特許出願第10/478,453号を参照されたい。これらの開示内容は、参照することによって、ここに含まれるものとする。しかし、密封されたPCR容器内に細胞溶解区域を含むことによって、特に生体有害物質を含む試料が試験される場合に使い易さおよび安全性を改良することができる。本明細書に示されている実施形態では、細胞溶解からの廃棄物ならびに他の全てのステップからの廃棄物が、密封されたポーチ内に残留する。しかし、ポーチの内容物は、さらなる試験のために除去されてもよいことを理解されたい。
いったん細胞が溶解されると、ピンチ弁36が開き、溶解物は、チャネル38を通って図3において最も良く示されている核酸調製区域40に移動し、この後、ピンチ弁36が閉じ、試料が核酸調製区域40内に密閉される。図3に示されている実施形態では、核酸の精製は、ビーズ粉砕された材料を取り出し、シリカ基磁気ビーズ56への親和性結合によって、ビーズをエタノールによって洗浄し、核酸を水または他の流体によって溶出し、細胞溶解物から核酸を溶離させることによって、行なわれる。核酸抽出に必要な個々の成分は、例示的には、ブリスター44,46,48内に配置されており、これらのブリスターが、試薬の混合を可能にするために、チャネル45,47,49によって互いに接続されている。溶解物は、チャネル38からブリスター44に入る。ブリスター44は、磁気ビーズ56および適切な結合緩衝液、例えば、1−2−3TM試料調製キット(Idaho Technology、ユタ州ソルトトレークシティー)のような高塩緩衝液を含んでいるとよく、またはこれらの成分のいずれかまたは両方が、ブリスター44に連結された1つまたは複数のチャネルを通して後で供給されてもよい。核酸がビーズ上56に捕捉され、次いで、ピンチ弁53が開くと、溶解物およびビーズ56は、ブリスター44,58に交互に加えられる弱い圧力によって混合され、その後、例示的にはプラダーアセンブリ710の対応する空圧プラダーによって供給される空圧を介して、ブリスター58に移動することになる。磁気ビーズ56は、機器内においてブリスター58に隣接して配置された格納式磁石50によってブリスター58内に捕捉され、廃棄物は、廃棄物リザーバに移動されてもよいし、またはブリスター58に圧力を印加することによって、ブリスター44に戻されてもよい。次いで、ピンチ弁53が閉鎖される。ピンチ弁55が開くと、磁気ビーズ56は、ブリスター46から供給されるエタノール、イソプロパノール、または他の有機または無機洗浄溶液によって洗浄されることになる。任意選択的に、磁石50が後退され、これによって、ブリスター46,58に交互の圧力を加えることによって、ビーズが洗浄されてもよい。ビーズ56は、磁石50によって再び捕捉される。溶解物の非核酸部分は、ビーズ56から洗い流され、ブリスター46に戻され、ピンチ弁55によって該ブリスター内に保留されてもよいし、または他のチャネルを介して廃棄物チャンバに洗い流されてもよい。磁気ビーズが洗浄されると、ピンチ弁57が開き、水(例えば、緩衝用水)または他の核酸溶離液が、ブリスター48から放出される。ここでも、磁石50が後退され、これによって、例示的にブリスター48,58に交互に圧力を加えることによって、水およびビーズ56を最大限に混合することができる。磁石50が再び展開され、ビーズ56を収集する。ピンチ弁59が開き、溶離された核酸は、チャネル52を介して第1段階増幅区域60に移動する。次いで、ピンチ弁59が閉鎖され、これによって、試料が第1段階増幅区域60内に保留されることになる。
図3に示され、かつ前述された核酸構成区域40の構成は、単なる例示にすぎず、種々の他の設定が本開示の範囲内において可能であることを理解されたい。
本明細書において用いられるエタノール、水、および他の流体は、種々の方法によってブリスターに供給されるとよい。流体は、ブリスター内に貯蔵されていてもよい。この場合、ブリスターのネックが、種々のピンチ弁または脆弱部によって締付けられており、試料調製シーケンスの適切な時間に開けられるようになっているとよい。代替的に、流体は、図5のポーチ110に示されているように、ポーチのリザーバ内に貯蔵され、または図6のポーチ210に関して説明するような取付具内に貯蔵され、必要に応じて、チャネルを介して供給されるようになっていてもよい。さらに他の実施形態では、流体は、特にエタノール注入ポート41,88およびプランジャー67,68,69に関連して図1に示されている外部供給源から導入されてもよい。例示的に、米国特許第8,409,508号におけるように、例えば、より剛性の材料のプランジャー67,68,69が取付具90内に挿入され、該プランジャーの作動時に一定量の流体を供給するようになっていてもよい。なお、この文献の内容は、参照することによって、ここに含まれるものとする。代替的に、プランジャーが軟質材料であってもよく、取付具が剛性材料であってもよい。流体の一定量は、プランジャーごとに同じであってもよいし、または異なっていてもよい。最後に、さらに他の実施形態では、ポーチは、1つまたは複数のブリスター内に貯蔵された一定量の流体を含んでいてもよく、この場合、例示的に、ブリスター内の小さい密封ポーチに設けられたブリスター内に含まれ、これによって、ブリスター内にブリスターを効果的に形成することができる。適切な時期に、例えば、空圧によって密封ポーチが破裂され、これによって、流体がポーチのブリスター内に放出されることになる。機器は、もし流体の通過が一方向弁によって厳密に調整され、作動中に機器が汚染されるのを防ぐようになっていたなら、機器と取付具またはポーチ材料との間の液体接触によって試薬の一部または全てを供給するように構成されていてもよい。さらに、多くの場合、望ましくは、ポーチまたは取付具は、汚染DNAがポーチから漏れないように、作動後に密封されるとよい。試薬を必要に応じて供給する種々の手段、例えば、注射器ポンプ、および流体を取付具またはポーチに一時的に接触させる種々の手段、例えば、棘付き取付具またはOリングシールが知られている。流体を適切なブリスターに導くこれらの方法は、いずれも、特定の用途における必要性に応じて、本明細書において検討されるポーチの実施形態のいずれに用いられてもよいことを理解されたい。
前述したように、ネステッドPCRは、2段階で行われる標的増幅を含んでいる。第1段階では、標的は、例示的には、ゲノム鋳型または逆転写鋳型から増幅される。第1段階増幅は、必要に応じて、例えば、プラトー期前に終了するようになっている。二次反応では、第1段階の増幅産物(amplicon)が希釈されるとよく、二次増幅は、同一のプライマーを用いるか、または例示的に第1段階産物のプライマーの内側に相補的結合するネステッドプライマーを用いるようなっている。ネステッドPCRの利点として、a)初期反応産物が二次反応における高忠実度を確実にする均質かつ特異的な鋳型を形成する点、これによって、比較的低効率の第1段階反応であっても、健全な第2段階反応をもたらすのに十分な鋳型をもたらす点、b)異なるネステッドプライマーが用いられ、元の増幅鋳型(例えば、ゲノムDNAまたは逆転写産物)が二次増幅におけるその意義が低減される程度まで希釈されるので、第1段階反応による非特異性産物が第2段階反応に著しく干渉しない点、およびc)ネステッドPCRが高次反応の多重化を可能にする点が挙げられる。第1段階反応は、いくつかの固有の増幅産物のためのプライマーを含むことができる。これらの産物は、第2段階反応において特定される。しかし、第1段階の多重性および第2段階の単一性は、単なる例示にすぎず、他の構成も可能であることを理解されたい。例えば、第1段階は、単一対のプライマーを用いて種々の異なる関連増幅産物を増幅し、第2段階は、例えば、融解曲線分析を用いて、増幅産物間の差を標的化するために用いられてもよい
図1を参照すると、核酸試料は、チャネル52を介して第1段階増幅区域60に入り、ブリスター61に送られる。ポリメラーゼ(例えば、Taqポメラーゼ)と、dNTPと、プライマー、例えば、多重増幅用の複数対のプライマーと、を含むPCR混合物が、ブリスター61に供給されるとよく、または前述したように、種々の手段を介してブリスター61内に導かれるとよい。代替的に、乾燥試薬が、ポーチ10の組立時にブリスター61の箇所にスポティングされていてもよい。この場合、水または緩衝液が、例えば、図1に示されているように、プランジャー68を介してブリスター61に導かれるとよい。図4に最もよく示されているように、試料は、ピンチ弁59,72によってブリスター61内に保留され、例えば、機器内に配置されてブリスター61と接触するように構成されたヒートブロックまたはペルチェ素子によって、2つ以上の温度間において熱サイクリングされる。しかし、当技術分野において知られているようなブリスター61内に含まれた試料を加熱および冷却する他の手段も、本発明の範囲内にあることを理解されたい。熱サイクリングのための代替的な加熱/冷却装置の非制限的な例として、ブラダー内に空気循環ブリスターを設け、ブリスター61に隣接する空圧ブリスター内の空気が2つ以上の温度間で循環されるようになっている例、(参照することによってここに含まれることになる)米国特許出願第10/478,453号におけるように、例えば、複数の空圧プレスを用いて試料をブリスター61内の温度区域に移動させる例、またはポーチ10を軸上に平行移動させるかまたはポーチ10に回転具を設け、ポーチ10を回転させることによって、内容物を一定温度の熱区域間で移動させる例が挙げられる。
病原菌からの核酸は、多くの場合、宿主のかなりの量の核酸と共単離している。これらの宿主由来の核酸は、多くの場合、プライマーと相互作用し、望ましくない産物を増幅させ、その結果、プライマー、dNTPおよびポリメラーゼの活性を消耗させ、所望の供給源産物を欠乏させる可能性がある。病原菌由来の核酸は、概して、少量であり、望ましくない産物が生じると、潜在的な問題をもたらすことになる。区域60の第1段階反応におけるサイクルの数は、特異的な産物を最大にし、非特異的な産物を最小にするように最適化されるとよい。サイクルの最適な数は、約10から約30サイクルの間にあり、例示的には、約15から約20サイクルの間にあると予想されるが、サイクルの数は、特定の標的、宿主、およびプライマー配列に応じて変化することを理解されたい。
第1段階の多重増幅に続いて、第1段階増幅産物は、二次反応部位への流体移送の前に、例示的には、不完全PCRマスターミックスによって希釈されるようになっている。
図4は、試料を3ステップで希釈するための例示的実施形態を示している。第1のステップでは、ピンチ弁72が開き、ブリスター61内の試料をブリスター62からの同量の水または緩衝液と混合させることによって、試料の倍数希釈が行われる。水または緩衝液は、前述したように、ブリスター62およびブリスター64,66に供給されるようになっている。ブリスター61,62間を往復するようにその流体を圧迫することによって、充分な混合が行われる。前述したように。混合は、プラダー710内においてブリスター61,62に隣接して位置する空圧プラダーによって行われるとよい。空圧ブラダーは、交互に加圧され、これによって、流体を往復させる。混合中、ピンチ弁74は、隣接するブリスター内への流体の流入を防止するものである。混合が終了すると、希釈された試料は、領域70内に捕捉され、ピンチ弁72が閉じることによって、領域70内に密封される。ピンチ弁74が開き、ブリスター63,64の一方または両方に供給される水または緩衝液によって、試料は、さらに希釈される。前述したように、流体をブリスター63,64間を往復するように圧迫することによって、混合が行われる。続いて、ピンチ弁74が閉じ、さらに希釈された試料が領域71内に密封される。最後の希釈は、例示的には、ブリスター65,66の一方または両方に供給される緩衝液または水を用いて、前述したように混合することによって行われる。例示的には、この最後の希釈は、不完全PCRマスターミックス(例えば、プライマーを除く全てのPCR試薬を包む)を流体として用いて、行われる。第2段階増幅の前のブリスター66の内容物を任意選択的に加熱することによって、高価な抗体または酵素を必要としないホットスタート増幅の利点を得ることができる。しかし、水または他の緩衝液が最後の希釈に用いられ、追加的なPCR成分が第2段階増幅領域80内に供給されてもよいことを理解されたい。例示的実施形態では、3段階の希釈が用いられているが、適切なレベルの希釈をもたらすために、どのような数の希釈段が用いられてもよいことを理解されたい。また、領域70,71内に捕捉される試料の量を調整することによって、希釈の量が制御されてもよく、この場合、領域70,71に捕捉される試料の量が少ないほど、希釈される量が大きくなり、またはピンチ弁72,74および/またはピンチ弁74,76を繰返し開閉することによって領域70および/または領域71に捕捉される追加の部分を用いて、希釈の量を減少させてもよいことを理解されたい。約10−2から約10−5の希釈が、多くの用途に対して適当であることが予想される。
二次PCT反応の成功は、多重第1段階反応によって生成された鋳型に依存する。典型的には、PCRは、高純度のDNAを用いて行われる。フェノール抽出キットまたは市販のDNA抽出キットなどを用いる方法によって、高純度のDNAが得られる。ポーチ10を通って処理される試料は、低純度調製を補うための調整を行なう必要がある。PCRは、障害物となる可能性がある生物学的試料の成分によって阻害されることがある。例示的には、ホットスタートPCR、高濃度のTaqポリメラーゼ酵素、MgCl2濃度の調整、プライマー濃度の調整、および(DMSO,RMSO、またはグリセロールのような)免疫補助剤が、低核酸純度を補うために用いられるとよい。純度の問題は、その多くが第1段階増幅に関連する傾向があるが、第2段階増幅においても同様の調整が行われるとよいことを理解されたい。
例示的実施形態では、希釈および第2段階の試料調製は、ポーチの第1段階のPCR部分のブリスターおよびチャネルにおいて少量の増幅試料を保持することによって達成されるようになっているが、これらのプロセスは、他の方法によって行われてもよいことを理解されたい。このような1つの例示的な実施例では、予め増幅した試料を部材内、例えば、平行移動するかまたは回転する部材内の小さい空洞内に捕捉し、試料の一定量を第1段階PCR試薬から第2段階PCR試薬に移動させるようになっていてもよい。予め増幅した試料の1μLの部分を100μLの新鮮なPCR試薬と混合させると、濃度が100倍低下する。この希釈は、単なる例示にすぎず、他の量および他の希釈レベルも可能であることを理解されたい。このアプローチは、第1段階増幅産物を剛性取付具内に押し込み、図1のプランジャー68,69の1つと接触させることによって、達成することができる。このような実施形態では、プランジャーは、試料のいくらかを隣接する希釈緩衝液または第2段階PCR緩衝液に接触させるように、構成されているとよい。同様に、摺動要素を用いて、第1および第2段階間の密封性を維持し、かつ増幅した試料を剛性取付具90内に含有させながら、少量の第1段階増幅産物を第2段階反応混合物に接触させてもよい。
第1段階PCRおよび希釈に続いて、チャネル78が、試料を二次ネステッドPCRのための複数の低容積ブリスター82に移動させる。例示的な一実施形態では、第2段階ブリスターに供給される乾燥プライマーは、入ってくる水性物質によって再懸濁され、反応混合物をもたらすことになる。任意選択的に、二重鎖核酸を検出するために用いられる蛍光染料、例えば、LCGreen(登録商標)Plus(Idaho Technology,ユタ州ソルトレークシティ)が、各ブリスターに供給されてもよいし、または一連の希釈の終了時に供給された不完全PCRマスターミックスに付加されてもよい。しかし、LCGreen(登録商標)Plusは、単なる例示にすぎず、当技術分野において知られている他の染料が用いられてもよいことを理解されたい。任意選択的な他の態様では、各特異的増幅産物用に設定されている蛍光標識された乾燥オリゴヌクレオチド・プローブが、それぞれ、乾燥プライマーと共に第2段階ブリスターにそれぞれ供給されてもよい。さらに、ポーチ10は、汚染を低減するために、全ての反応および操作を含むように設計されているが、場合によっては、さらなる分析を行うために、増幅産物を各ブリスター82から除去することが望ましいこともある。当技術分野において知られている第2段階の増幅産物を検出するための他の手段も、本発明の範囲内にある。いったん試料がブリスター82に移送されると、ピンチ弁84,86が作動し、ブリスター82を封鎖する。ここで、各ブリスター82は、特定の標的の増幅に必要な全ての試薬を収容している。例示的に、各ブリスターは、固有対のプライマーを含んでいるとよく、または複数のブリスター82は、複数の複製増幅をもたらすために同一プライマーを含んでいてもよい。
本明細書に開示されている実施形態は、第2段階増幅のためのブリスターを用いており、これらのブリスターは、可撓性部分の残りと同一または同様のプラスチックフィルムから形成されていることに留意されたい。しかし、多くの実施形態では、第2段階ブリスターの内容物は、第2段階ブリスターから取り出されることがない。従って、第2段階反応が可撓性ブリスター内において行われる必要がない。第2段階反応は、ブリスターに流体接続された複数の剛性チャンバ、半剛性チャンバ、または可撓性チャンバ内において行われてもよいことを理解されたい。この実施例では、チャンバは、チャンバに接続された可撓性チャネルに圧力を加えることによって、または他の方法によって、例示的には、熱融着によって、または一方向弁を用いることによって、密封されるとよい。本明細書において検討される種々の実施形態は、廃棄物を収集することのみを目的として設けられたブリスターを備えている。廃棄物は、決して取り出されないので、剛性チャンバ、半剛性チャンバ、または可撓性チャンバ内に収集することができる。
第1段階増幅に用いられたプライマーと同じプライマーを用いて、第2段階増幅を行うことは、本発明の範囲内にある(米国特許第6,605,451号を参照されたい)。しかし、多くの場合、第1段階産物に内在するプライマーを第2段階反応のプライマーにすることが有利であり、これによって、第1段階プライマー結合部位と第2段階プライマー結合部位との間の重なりをなくすかまたは最小限に抑えることができる。第1段階産物の希釈によって、第2段階反応への元の鋳型DNAおよび第1段階試薬の寄与の大部分が排除される。さらに、ネステッド増幅を強めるために、例えば、第1段階において用いられた温度よりも高い温度Tmを有する第2段階プライマーが用いられてもよい。プライマーは、著しいヘアピン形状、ヘテロ/ホモ二量体、および望ましくない雑種形成を避けるように設計されているとよい。ネステッドフォーマットのために、第2段階プライマーは、単一ステップによってゲノムDNAの標的を増幅させるのに用いられるプライマーよりもはるかに有害な相互作用に対して耐性がある。任意選択的に、ホットスタートが第2段階増幅に用いられてもよい。
もし蛍光染料が、例えば、当技術分野において知られているdsDAN結合染料としてまたは蛍光性プローブの一部として、第2段階増幅に含まれたなら、設けられた光学素子を用いて、1つまたは複数の試料の増幅を監視することができる。任意選択的に、各試料が陽性であるかまたは陰性であるかを判定するために、増幅曲線の形状の解析が行われてもよい。試料を判定する例示的な方法が、米国特許第6,730,501号において検討されている。この文献の内容は、参照することによってここに含まれるものとする。代替的に、交差閾値を利用する方法が用いられてもよい。コンピュータが、機器外または機器内に設けられるとよい。コンピュータは、この方法を実施するように、かつ第2段階の増幅の有無に基づいて試料が陽性であるかまたは陰性であるかを判定するように、構成されるとよい。また、コンピュータは、増幅曲線(例えば、交差閾値)の特性パラメータを標準曲線または作動中の他の増幅曲線と比較することによって、開始鋳型濃度に関する定量情報をもたらすようになっているとよい。しかし、各試料を判定するために、当技術分野において知られている他の方法が用いられてもよいことを理解されたい。他の解析が、蛍光性情報に基づいて行われてもよい。このような1つの非制限的な実施例として、増幅産物の適切な融解特性(例えば、Tm、融解プロファイル形状)を示すために融解曲線解析を用いることが挙げられる。設けられた光学素子は、全てのブリスター82の画像を一度に捕捉するように構成されてもよく、または個々の光学素子が各ブリスターに対して設けられてもよい。他の構成も本発明の範囲内にある。
図5は、代替的なポーチ110を示している。この実施形態では、種々の試薬が取付具190を介してポーチ110内に装填されるようになっている。図5aは、複数のプランジャー168の1つを有する取付具190の断面を示している。図5aは、図5の実施形態に示されている入口チャネル115aを通る断面を示しているが、12個の入口チャンネル(入口115a−115l)が設けられており、これらの各々が、取付具190内において用いられるそれ自体のプランジャー168を有しているとよい。しかし、この特定の構成では、入口チャネル115c,115f,115iは、用いられていない。12個の入口チャネルを有する構成は、単なる例示にすぎず、どのような数の入口チャネルおよび関連するプランジャーが用いられてもよいことを理解されたい。この例示的実施形態では、取付具190の任意選択的な真空ポート142が、取付具190の第1の表面194を通ってチャンバ192に連通するように形成されている。任意選択的な真空ポート142は、真空または真空チャンバ(図示せず)に連通するように設けられているとよく、ポーチ110内から空気を引出し、チャンバ192および種々のブリスターならびにポーチ110のチャンバ内に真空をもたらすようになっている。次いで、プランジャー168が、真空ポート142を封鎖するために、チャンバ192内に充分深く挿入される。チャンバ192は、使用時に所望量の流体をチャンバ192内に引き込むために。例示的には、所定の真空下に設けられている。チャンバ192の調製に関する付加的な情報は、(すでに参照することによってここに含まれている)米国特許第8,409,508に見出すことができる。
例示的な取付具190は、取付具190の第2の表面195に形成された注入ポート141をさらに備えている。例示的に、注入ポート141は、図5aに示されているように、真空ポート142よりもポーチ110のプラスチックフィルム部分の近くに配置されている。従って、プランジャー168は、注入ポート141を介してチャンバ192内へのアクセスを可能にしながら、真空ポート142を封鎖するために十分遠くに挿入されることになる。図示されているように、プラスチックフィルム117の第1の表面119は、注入ポート141を介するチャンバ192と周囲空気との連通を阻止するための貫通可能なシール139を備えている。しかし、第2の表面119は、任意選択的に、注入ポート141まで延在していなくてもよいし、他の種々のシールが用いられてもよいことを理解されたい。さらに、もしシールの他の箇所、例えば、取付具190の第1の表面194上の箇所が望まれるなら、注入ポート141は、取付具190上の該位置にチャネルを備えていてもよい。(すでに参照することによってここに含まれている)米国特許出願第10/512,255号は、シールが注入ポートから遠く離れて配置されており、チャネルを介してチャンバに接続されている種々の構成を示している。また、米国特許第8,409,508号は、チャネルが単一シールを多数のチャンバに接続している種々の構成を開示している。シール位置の変更ならびに多数のチャンバに対する単一の注入ポートの接続は、本発明の範囲内にある。任意選択的に、シール139は、脆弱であり、カニューレ(図示せず)の挿入時に破られるとよく、これによって、流体試料がカニューレ内からチャンバ192内に引き込まれるかまたは押し出されることが可能になる。
ポーチアセンブリ110の例示的なプランジャー168は、円筒形状であり、略5mmの直径を有しており、チャンバ192内に圧入されているとよい。プランジャー168は、第1の端部173および反対側の第2の端部175を備えている。図5aに示されているように、プランジャー168のノッチ169が、第2の端部175に形成されている。使用時に、第2の端部175は、チャンバ192内の途中まで挿入され、このとき、ノッチ169が注入ポート141と真っ直ぐに並ぶことになる。これによって、プランジャー168が(ノッチが存在しないならプランジャー168が注入ポート141を塞ぐほど)深く挿入されても、流体試料は、チャンバ192内に引き込まれるかまたは注入されることが可能になる。
例示的には、流体は、挿入先端を有する注射器付きの容器(図示せず)内に含まれている。注射器の挿入先端は、注入ポート141内に挿入され、シール139を突き刺すようになっている。脱気されたポーチアセンブリ110を用いる場合、シール139が突き刺されると、周囲空気圧に対するチャンバ192内の負圧によって、流体が容器から吸引される。この流体は、ポート141を通ってチャンバ192を満たす。この時点で、通常、流体は、ポーチ110のプラスチックフィルム部分117内に流れない。最後に、プランジャー168がチャンバ192内に挿入され、プランジャー168の第2の端部175がチャンバ192の底部191に接近すると、プランジャー168が一定量の試薬または試料をプラスチックフィルム部分117内に押し込むことになる。図示されているように、プランジャー168は、完全に挿入されたときに、第2の端部175がチャンバ192の底部191に完全に当接しないように、構成されている。残余の空間は、気泡を捕捉するのに有用であり、これによって、プラスチックフィルム部分117に入る気泡の数を減少させることができる。しかし、いくつかの実施形態では、プランジャー168が完全に挿入されたとき、第2の端部175が底部191に当接することが望ましい場合もある。図5に示されている実施形態では、入口チャネル115a,115b,115d,115e,115g,115h,115j,115k,115lの全てが、反応区域またはリザーバブリスターに繋がっている。入口チャネル115aに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試料が3ローブ式ブリスター122内に押し込まれ、入口チャネル115bに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター101に押し込まれ、入口チャネル115dに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター102に押し込まれ、入口チャネル115eに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター103に押し込まれ、入口チャネル115gに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター104に押し込まれ、入口チャネル115hに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター105に押し込まれ、入口チャネル115jに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター106に押し込まれ、入口チャネル115kに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター107に押し込まれ、入口チャネル115lに付随するプランジャーが完全に挿入されると、試薬がリザーバブリスター108に押し込まれる。
図5aの実施形態に示されているように、ノッチ169を備えるプランジャー設計が用いられる場合、プランジャー168は、押し下げられる前に、回転されとよい。これによって、ノッチ169を位置ずれさせ、注入ポート141をチャンバ192との連通から閉じ、チャンバ192の内容部を密封することができる。これは、流体が注入ポート141を通って周囲雰囲気に逆流する可能性を最小に抑えるように作用し、プランジャーの完全な挿入を遅らせることが望ましいとき、特に有用である。図示されているように、前述のノッチ169がプランジャー168に対して設けられているが、他の手段、例えば、チャンバ192の底に向かうプランジャー168の押下げ、熱融着、一方向弁、または自己密封型ポートによって、流体試料をチャンバ192内に分注した直後に注入ポート141を閉じる構成も、本開示の範囲内にある。密封方法として熱融着を用いる場合、シールバーを機器内に設け、ポーチが機器内に挿入されたとき、全てのチャンバを熱融着するようになっているとよい。
例示的な方法では、ユーザーは、試料を入口チャネル115aに付随する注入ポート141に注入し、水を他の種々の注入ポートに注入する。水は、入口チャネル115b,115d,115e,115g,115h,115j,115k,115lの各々に付随するチャンバ192内において予め凍結乾燥された試料を再水和する。水は、1つの単一シールを通って注入され、以下の図6に示されるように、チャネルを介してチャンバの各々に分配されてもよいし、またはチャンバの各々に独立して注入されてもよい。代替的に、乾燥した試料を再水和するために水を注入する以外に、溶解試薬、核酸抽出試薬、およびPCR試薬などの湿式試薬が、取付具190の適切なチャンバ192内に注入されてもよい。
入口チャネル115aに付随するプランジャー168が作動すると、試料は、チャネル114を介して3ローブ式ブリスター122に直接押し込まれる。ユーザーは、残りのプランジャー168を押し、取付具190のチャンバ192の各々から内容物をリザーバブリスター101〜108に押し込む。この時点で、ポーチ110は、処理のために機器内に装填されている。図8に示されている機器800は、図6のポーチ210用に構成されているが、機器800のブラダー構成の修正によって、機器800をポーチ110,510または他の構成のポーチに用いられるように適合させることができることを理解されたい。
例示的な一実施例では、プランジャー168が押し下げられた時点で、リザーバブリスター101は、イソプロパノール内にDNA結合磁気ビーズを収容しており、リザーバブリスター102は、第1の洗浄溶液を収容しており、リザーバブリスター103は、第2の洗浄溶液を収容しており、リザーババリスター104は、核酸溶離緩衝液を収容しており、リザーババリスター105は、多重化第1段階プライマーを含む第1段階PCR試薬を収容しており、リザーババリスター106は、プライマーを含まない第2の段階PCR試薬を収容しており、リザーババリスター107は、プライマーおよび鋳型を含まない陰性対照PCR試薬を収容しており、リザーババリスター108は、鋳型を含む陽性対照PCR試薬を収容している。しかし、これらの試薬は、単なる例示にすぎず、所望の反応および最適条件に応じて、他の試薬が用いられてもよいことを理解されたい。
いったんポーチ110が機器800内に配置され、試料が3ローブ式ブリスター122に移動されたなら、試料は、ZSまたはセラミックビーズのような溶解粒子によって試料を撹拌することによって、破砕されるとよい。溶解粒子は、3ローブ式ブリスター122内に配置されていてもよいし、または試料と共に3ローブ式ブリスター122内に注入されてもよい。図5の3ローブ式ブリスター122は、図1の3ローブ式ブリスターと全く同じように作動され、2つの下側ローブ124,126が一緒に加圧され、圧力が上側ローブ128と2つの下側ローブ124,126と間で交互に加えられる。しかし、図示されているように、下側ローブ124,126は、下側ローブ24,26よりもかなり丸くなっており、これによって、チャネル13へのビーズの流れを円滑にし、連結部32に三角形の流れ分離部がなくても、高速衝突をもたらすことが可能である。3ローブ式ブリスターと同様に、図5の3ローブ式ブリスター122は、試料内の微生物、細胞、およびウイルス粒子を効果的に溶解または破砕することができる。約3〜4mm幅、例えば、約3.5mm幅のチャネル130は、溶解中、比較的ビーズが少なく、高速衝突を行うのに効果的であることが分かっている。
溶解後、核酸結合磁気ビーズは、リザーババリスター101に面して配置されたブラダーを加圧することによって、チャネル138を介して上側ローブ128内に注入される。磁気ビーズは、例示的には、溶解中よりも穏やかに3ローブ式ブリスター122の内容物と混合され、溶液が、例えば、約1分間保温され、これによって、核酸がビーズに結合することが可能になる。
次いで、溶液は、チャネル143を介して「8の字」状ブリスター144内に送り込まれ、該ブリスター144内において、ビーズが、機器内に収容されて例示的には空圧によって駆動される格納式磁石によって捕捉される。ビーズ捕捉プロセスは、ビーズ粉砕装置122の全てのローブ124,126,128を加圧することによって、開始される。これによって、3ローブ式ブリスター122の液体内容物の大部分がチャネル143を通してブリスター144内に押し込まれる。磁石は、ブリスター144の下側部分144bに接触され、試料は、数秒間保温され、これによって、磁石が溶液からビーズを捕捉することが可能になる。次いで、ブリスター122に隣接するブラダーが減圧されると共にブリスター部分144a,144bに隣接するブラダーが加圧され、液体がブリスター122内に押し戻される。単一パスによって全てのビーズが捕捉されないので、このプロセスは、最大10回繰り返され、これによって、実質的に全てのビーズをブリスター144内に捕捉することができる。次いで、液体がブリスター144から押し出され、磁気ビーズおよび捕捉された核酸のみが残り、(それぞれ、リザーバブリスター102,103からチャネル145,147を介して)、洗浄試薬がブリスター144内に導かれ、2回の連続的洗浄が行われる。各洗浄において、洗浄試薬を収容するリザーバブリスターに面して配置されたブラダーが加圧され、これによって、その内容物がブリスター144内に押し込まれる。磁石が引き込まれ、次いで、ブリスター144の各ローブ144a,144bを覆う2つのブラダーの各々を交互に加圧することによって、磁気ビーズを含むペレットが破砕される。上側ローブ144aが圧縮されると、液体内容物は、下側ローブ144bに押し込まれ、下側ローブ144bが圧縮されると、内容物は、上側ローブ144aに押し込まれる。上側ローブ144aと下側ローブ144bとの間でブリスター144内の溶液を撹拌することによって、磁気ビーズの不純物が効果的に洗浄される。この場合、不十分な撹拌と過剰な撹拌との間で均衡を取る必要がある。すなわち、不十分な撹拌では、ビーズのペレットが破砕されず、過剰な撹拌では、ビーズの表面から核酸が洗い流され、洗浄試薬と共に失われる可能性がある。各洗浄サイクル後に、磁気ビーズは、ブリスター144内に磁石を介して捕捉され、洗浄試薬は、例示的に、廃棄物容器として機能する3ローブ式ブリスター122内に押し込まれる。しかし、用いられたリザーバブリスターが廃棄物用容器として機能してもよいし、または他のブリスターが廃棄物容器として特別に設けられてもよいことを理解されたい。
次いで、核酸溶離緩衝液が、リザーババリスター104からチャネル149を介してブリスター144内に注入され、試料が再び撹拌され、磁石を用いることによって、磁気ビーズが再び捕捉される。ブリスター144内の流体混合物は、元の試料からの核酸を含んでいる。ブリスター144への圧力が、核酸試料をチャネル152を介して第1段階PCRブリスター161に移動させ、該ブリスター161において、試料は、多数のプライマーセットを含む第1段階PCRマスターミックスと混合される。PCRマスターミックスは、リザーバブリスター105からチャネル162を介して供給される。必要に応じて、試料および/または第1段階PCRマスターミックスは、混合の前に加熱されてもよく、この場合、ホットスタートの利点がもたらされる。任意選択的に、RNA標的の逆転写のための成分が、第1段階PCRの前に供給されてもよい。代替的に、RNA標的の同時逆転写を可能にするために、RT酵素、例えば、耐熱性RT酵素が第1段階PCRマスターミックに含まれていてもよい。本明細書に開示されている実施形態のいずれにおいても、RT酵素が第1段階PCRマスターミックスに含まれていてもよいことを理解されたい。以下に示されるように、図5のポーチ110は、最大10個のプライマーセット用に構成されているが、この構成は、任意の数のプライマーセットを用いるように変更されてもよいことを理解されたい。ブリスター161に面して配置されたブラダーが低圧で加圧され、ブリスター161の内容物をブリスター161の他の面上の加熱/冷却素子、例えば、ペルチェ素子に密接触させる。ブリスター161への圧力は、加熱/冷却素子との良好な接触を確実にするのに充分に大きく、流体がブリスター161から押し出されないように十分に小さく設定されるべきである。加熱/冷却素子は、例示的には、約60℃から約95℃の間で温度サイクリングされる、例示的には、温度サイクリングは、約15〜20サイクルにわたって行われ、存在する1つまたは複数の核酸標的の増幅が生じることになる。また、例示的には、温度サイクリングは、プラトー期前に終了するようになっており、さらに対数期中または対数期前に終了するようになっているとよい。一実施例では、最小レベルの検出に達することなく、試料の所望の増幅産物を増やすことが望ましい。米国特許第6,605,451を参照されたい。この内容は、参照することによって、ここに含まれるものとする。
次いで、増幅された試料は、任意選択的に、試料の殆どをチャネル152を介してブリスター144に押し戻すことによって希釈され、ブリスター161内に少量(例えば、約1〜5%)の増幅された試料のみを残し、第2段階PCRマスターミックスがリザーバブリスター106からチャネル163を介して供給される。試料は、例示的には、チャネル163を介してブリスター106とブリスター161との間を往復移動させることによって、完全に混合される。必要に応じて、反応混合液は、第2段階増幅の前に、伸長温度を超える温度、例えば、少なくとも60℃に加熱されてもよい。次いで、試料は、チャネル165を通って、第2段階増幅区域180の中心にある低容積ブリスター182のアレイ内に押し込まれる。10個の例示的低容積ブリスター182の各々は、異なるプライマー対を含むことができる。このプライマー対は、第1段階増幅のプライマー対の1つと本質的に同じであるか、または短縮化された単一複製配列を増幅するための第1段階プライマー対内に「入れ子(nest)」にされるもののいずれかである。試料によって水和されたプライマーは、増幅混合物をもたらすことになる。また、陽性対照試料および陰性対照試料が、リザーバブリスター107,108の内容物をそれぞれ加圧し、標的DNAを含まないPCRマスターミックスをリザーバブリスター107からチャネル166を介して送り出し、対照DNAを含むPCRマスターミックスをリザーババリスター108からチャネル167を介して送り出すことによって、導かれる。図示されているように、5つの陽性対照ブリスター183および5つの陰性対照バリスター181が配置されており、これらは、2倍に多重化され、これによって、10回の異なる第2段階増幅反応のために必要な対照をもたらすことになる。この構成は、単なる例示にすぎず、どのような数の第2段階ブリスターが設けられてもよいことを理解されたい。
例示的には、第2段階増幅に用いられるPCRマスターミックスにはプライマーが不足しているが、それ以外は、完全である、しかし。「不完全な」PCRマスターミックスは、他のPCR成分も不足している場合もある。一実施例では、第2段階PCRマスターミックスは、水および緩衝液のみであり、任意選択的に希釈された第1段階PCR増幅産物と混合されている。この混合物は、小容量PCR反応ブリスターに移動されるが、これらのブリスターに残りの成分の全てが予め供給されている。必要に応じて、残りの成分の全ては、一緒に混合され、単一の混合物として小容量のPCR反応ブリスター内にスポッティングされているとよい。代替的に、図5bに示されているように、これらの成分の各々が、小容量PCR反応ブリスター182の個別の領域にスポッティングされていてもよい。図5bに示されているように、4つの領域、例示的には、dNTPがスポッティングされた領域182a、プライマーがスポッティングされた領域182b、ポリメラーゼがスポッティングされた領域182c、およびマグネシウム化合物がスポッティングされた領域182dが存在する。成分を別々にスポッティングし、これらの成分を水和する前に試料混合物を加熱することによって、非特異反応を最小限に抑えることができる。どのような組合せの成分がこのようにしてスポッティングされてもよいこと、および成分をブリスターの1つまたは複数の領域内にスポッティングするこの方法は、本発明のどの実施形態と共に用いられてもよいことを理解されたい。
小容量PCR反応ブリスター181,182,183に繋がるチャネル165,166,167は、密封されている。熱サイクリングをもたらすために、空圧ブラダーが、アレイを加熱/冷却素子、例えば、ペルチェ素子に対して軽く加圧する。サイクリングパラメータは、第2段階熱サイクリングのために独立して設定されるとよい。反応は、励起光源、例えば、青色光(450〜490nm)をアレイ上に集束させ、得られる蛍光発光、例えば、510nmを超える蛍光発光を撮像することによって、監視される。
上記実施例では、ピンチ弁は、検討されていない。しかし、試料をブリスターの1つに収容することが望ましい場合、その特定ブリスターに繋がるチャネルに面して配置された空圧アクチュエータが加圧され、これによって、ピンチ弁を形成し、チャネルを閉じるようになっていることを理解されたい。逆に、試料をブリスターの1つから移動させることが望ましい場合、適切な空圧アクチュエータが減圧され、これによって、試料をチャネル内に流すことが可能になる。
図5において前述したポーチは、試薬リザーバブリスター101〜108を備えており、ユーザーは、例示的には、ポーチ110を機器に挿入する前に、取付具190から試薬をポーチ110のプラスチックフィルム部分117の試薬リザーバブリスター101〜108内に注入するようになっている。種々のブリスターの内容物を互いに異なる温度に維持する能力を有する図5の試薬リザーバブリスターを用いると、有利である。しかし、いくつかの不利な点もある。オペレータが試薬を取付具190からリザーバブリスター101〜108に移動させることに関与しており、この操作が、多くの場合、機械の外側で行われ、従って、ピンチ弁が作動されないことによって、試薬が、リザーバブリスターから作動ブリスターに漏れることがある。リザーバブリスター内の試薬は、調製中および装填中に露出している。もしこれらのリザーバブリスターが加圧、狭窄、または軽い衝撃を受けた場合、試薬が通じているチャネルを通って漏れる可能性がある。試薬の損失が多い場合、反応が完全に失敗する可能性がある。さらに、操作中、リザーバブリスター101〜108から押し出される試薬の量にいくらかの変動が生じ、その結果、一貫性のない結果をもたらす可能性がある。取付具190への試薬の導入および取付具190から試薬リザーバブリスター101〜108への試薬の移動の自動化は、これらの問題の多くを解消する。この自動化は、本発明の範囲内にある。
図6のポーチ210は、直接噴射手法を用いることによって、これらの課題の多くに異なる方法で対処している。この手法では、機器自体が、例示的には、空圧ピストンを介してプランジャー268を移動させ、試薬が必要とされるとき、該試薬を種々の作動ブリスター内に押し込むようになっている、図5のリザーバブリスター101〜108に試薬を貯蔵するのと違って、図6の実施形態では、試薬は、取付具290の種々のチャンバ292内に導かれ、必要になるまでそこに保持される。適切な時間にピストン268の空圧操作によって、一定量の試薬が適切な反応ブリスターに導かれる。前述した課題の多くに対処することに加えて、ポーチ210は、より小さい形状を有しており、これによって、より小型の機器設計を可能とし、またより短いチャネルを有しており、これによって、より良好な流体流れを可能とし、チャネル内における試薬の損失を最小限に抑えることができる。
図6の例示的実施形態では、試験される試薬(100μL)および溶解緩衝液(200μL)を含む300μLの混合液が、注入ポート241a内に注入される。水もシール239bを介して取付具290内に注入され、最大11個の異なる試薬を水和する。試薬は、各々、(斜線で示されている)チャネル293を介して、チャンバ292〜292l内に乾燥形態で予め供給されている。これらの試薬の例として、凍結乾燥PCR試薬、DNA抽出試薬、洗浄溶液、免疫測定試薬、または他の化学物質が挙げられる。図6の実施形態では、試薬は、核酸抽出、第1段階多重化PCR、多重化反応の希釈、第2段階PCR試薬の調製、および対照反応に用いられるものである。図6に示されている実施形態では、注入される必要があるものは、ポート241aの試料およびポート241b内の水である。
図6に示されているように、シール293bを介して注入された水は、チャネル293を介して種々のチャンバに分配される。この実施形態では、試料および水だけがポーチ210内に注入される必要がある。しかし、水は、各チャンバ29内に独立して注入されてもよいことを理解されたい。さらに種々のチャンバ292に乾燥試薬を供給し、水の注入時に水和するのと違って、特定の湿式試薬が、必要に応じて、各チャンバ内に注入されてもよいことを理解されたい。加えて、チャンバ292の1つまたは複数にのみ水が供給され、必要な試薬が適切な反応ブリスター内に乾燥形態で供給されてもよいことを理解されたい。特定の反応の必要性によってなされる前述した形態の種々の組合せも、本発明の範囲内にある。
図6に示されているように、任意選択的な突出部213が、取付具290の底表面297に設けられている。図示されているように、突出部213は、それらの該当する入口チャネル215内に配置されている。しかし、他の構成も可能である。突出部213は、入口チャネル215を開けるように作用し、プランジャー268が押し下げられたときに、底表面297が入口チャネル215を締め付けるように他の平坦面と係合するのを防止し、これによって、プランジャー268の作動時の逆流の防止を助長する。このような突出部は、本発明による任意の種々のポーチのいずれに用いられてもよい。
水がポーチ内に注入され、取付具内の多数のチャンバ内の多数の乾燥試薬を水和する実施形態では、注入ポートと多くのチャンバとの間にチャネルを閉じる手段が設けられることが望まれる。もしチャネルが閉じていないと、各プランジャーの作動によって、その該当するチャンバの内容物の一部がチャネル内に押し戻され、近傍のチャンバに混入し、該チャンバ内に含まれる量および該チャンバから送られる量を変動させる可能性がある。このチャネルを閉じるいくつかの方法、例えば、前述したノッチ付きプランジャー268を回転させる方法、チャネルを横切ってプラスチックフィルムを熱融着し、これによって、チャネルを恒久的に閉じる方法、およびピンチ弁としてチャネルに圧力を印加する方法が用いられてきている。他の閉鎖具、例えば、取付具内に組み込まれた弁、例示的には、一方向弁が用いられてもよい。
流体がチャンバ292内に注入され、ポーチ210が機器内に装填された後、プランジャー268aが、例示的には空圧ピストンの作動を介して、押し下げられ、試料の残り分をチャネル214を介して3ローブ式ブリスター220内に押し込む。図1および図5に示されている実施形態におけるように、3ローブ式ブリスター220のローブ224,226,228は、図7〜図9に示されているブラダーアセンブリ810の作動ブラダー824,826,828を介して、順次圧縮され、流体をローブの間の狭い連結部232内に押し込み、高速衝突をもたらし、これによって、試料をせん断し、核酸、例示的には、開けることが困難な胞子からの核酸、細菌、および菌類を遊離させる。細胞溶解は、適切な時間間隔、例えば、0.5〜10分間にわたって継続する。
いったん細胞が充分に溶解したなら、プランジャー268bが作動され、チャンバ292b内に貯蔵された核酸結合磁気ビーズがチャネル236を介して3ローブ式ブリスター220の上側ローブ228内に注入される。試料は、磁気ビーズと混合され、混合物が適切な時間間隔、例えば、約10秒から約10分間にわたって保温される。
試料およびビーズの混合物は、プラダー826の作用によってチャネル238を通ってブリスター244内に押し込まれ、次いで、プラダー844の作用によってチャネル243を通ってブリスター246内に押し込まれる。ブリスター246では、図8に示される機器800においてブリスター244に隣接して配置された格納式磁石850が、溶液から磁気ビーズを捕捉し、ブリスター246の内側表面にペレットを形成する。次いで、ブリスター246に面して配置された空圧ブラダー846が、ブリスター246から液体を押し出し、ブリスター244を通して(ここでは廃棄物容器として用いられる)ブリスター222内に戻す。しかし、図5に関連して説明したように、他の廃棄物容器も本発明の範囲内にある。プランジャー268c,268d,268eの1つが作動され、洗浄溶液をチャネル245を介してブリスター244に供給し、次いで、洗浄溶液をチャネル243を介してブリスター246に供給する。任意選択的に、磁石850が後退され、磁気ビーズは、プラダー844,846を交互に加圧されることによって、磁気ビーズをチャネル243を介してブリスター244,246間で往復運動させることによって、洗浄される。いったん洗浄されたなら、磁気ビーズは、磁石850の作動によって、ブリスター246内に再び捕捉され、次いで、洗浄液がブリスター222に移動させられる。このプロセスは、核酸結合磁気ビーズから溶解緩衝液および試料破片を洗い流すために、必要に応じて、繰り返されるとよい。例示的には、三回の洗浄が行われ、各洗浄に、チャンバ292c,292d,292eの洗浄試薬が用いられる。しかし、より多くの回数またはより少ない回数の洗浄も本発明の範囲内にあることを理解されたい。より多くの洗浄が所望される場合、より多くのチャンバ292が設けられるとよい。代替的に、各チャンバ292がより大量の流体を保持し、プランジャーの作動によって、各作動時に該チャンバからわずかな比率の量しか押し出されないようになっていてもよい。
洗浄後、チャンバ292fに貯蔵された溶離緩衝液が、チャネル247を介してブリスター248に注入された後、磁石が後退される。溶液は、チャネル252を介してブリスター246,248間を循環し、ブリスター246内の磁気ビーズのペレットが壊され、捕捉された核酸がビーズから解離し、溶液に入ることが可能になる。磁石850が再び作動し、ブリスター246内の磁気ビーズを捕捉し、溶離された核酸溶液がブリスター248内に押し込まれる。
プランジャー268hが押し下げられ、チャンバ292hからの第1段階PCRマスターミックスがブリスター248内の核酸試料と混合される。任意選択的に、混合物は、ブラダー848,864の交互の作動によって、混合物をチャネル253を介してブリスター248,264間で往復させることによって、さらに混合される。数サイクルの混合の後、溶液がブリスター264内に収容され、該ブリスター264内において、第1段階多重PCRが行われる。必要に応じて、混合の前に、試料がブリスター246内に保持されている間に、例えば、第1段階PCRマスターミックスをブリスター264内に移動させ、該ブリスター265内において予熱されるかまたはブリスター248に隣接して設けられたヒータによって予熱される。前述したように、この予熱によって、ホットスタートPCRの利点がもたらされる。図8に示されている機器800は、試料を加熱および冷却するペルチェ素子に基づくサーマルサイクラー886,888によって、特徴付けられている。しかし、前述したように、他の加熱/冷却装置が用いられてもよいことを理解されたい。任意選択的に、ブリスター248,264間の混合は、ブリスター248,264の両方を加熱および冷却するように配置されたサーマルサイクラー886による温度サイクリング中も継続されるとよい。このような混合は、いくつかの実施形態において第1段階PCR反応を改良することが分かっている。また、熱サイクリングは、2つ以上の異なるブリスターの温度を変化させることによって達成されてもよい。これは、最小のエネルギー消費を可能とし、熱サイクリング速度を最大限させることができる。例えば、ブリスター248の温度を95℃に維持し、ブリスター264の温度を65℃に維持し、試料をこれらのブリスター間で移動させることによって、効率的に熱を試料に伝達させ、迅速かつ正確な熱サイクリングを達成することができる。温度サイクリングは、例えば、15〜20サイクル行われるが、前述したように、用途によっては他のレベルの増幅が望ましい場合がある。以下に示されるように、第2段階増幅区域280は、18通りの第2段階反応における増幅を検出するように構成されている。従って、18種類の異なるプライマー対が、ブリスター264内のPCR反応に含まれるとよい。
代替的なホットスタート法では、ポーチ210が、プライマーをブリスターの1つ、例えば、ブリスター264内に設けるように、作製されている。一実施形態では、プライマーが別個に凍結乾燥され、製造中に、脆弱なペレットとしてブリスター264内に導入されている。第1段階PCRの前に、例えば、試料がブリスター246から溶出され、ブリスター24に押し込まれ、プライマーペレットを再水和する。ブリスター248,264に隣接して配置されたペルチェ886が48℃に加熱され、PCRマスターミックスがブリスター248内に押し込まれる。ある時間、例えば、10秒間にわたって保持し、この間に2つのブリスターが48℃に到達した後、ブリスター248,264間の混合を開始する。従って、成分が個別に48℃に到達するまで、酵素およびdNTPがブリスター248に残り、試料およびプライマーの殆どがブリスター264に残る。しかし、48℃の選択は、第1段階増幅および50℃まで活性であるAMVを用いたRTを同時に行う場合に用いるためであることを理解されたい。もしRTが必要でないなら、またはより耐熱性のRT酵素が用いられるなら、プライマー融点または特定の第1段階増幅プロトコルの他の要因に依存して、2つのブリスター248,264の一方または両方を最大58℃またはさらに高温に加熱してもよい。このホットスタート法は、本発明のどのような実施形態に用いられてもよいことを理解されたい。
代替的な実施形態では、第1段階PCR反応の複雑性を軽減するために、ブリスター248が2つ以上のブリスターに分割されてもよい。多重反応の非特異性産物の数は、混合物内のプライマーの数の二乗(またはさらに高次の指数)として増加し、アレイの感度の低下は、投入試料の量の線形関数であると考えられる。従って、例えば、第1段階PCRを2つの反応に分割すると、各反応は、この実施形態の単一反応の量の半分であり、感度は1/2に低下し、非特異性反応の量および複雑さは、1/4になる。ブリスター248をより多くのブリスターに分割する場合、ブリスター264もブリスター248の数と等しい数のブリスターに分割されるとよい。各ブリスター248は、該当するチャネル253を介して、各ブリスター264に接続されることになる。各ブリスター254は、全てのプライマーのサブセットを含むペレットを含む。ブリスター264の試料は、各ブリスター248にわたって分割される。各ブリスター264は、全ての他のブリスターから密封されており、前述のように、ブリスター248,264の各対に対して、熱サイクリングが進行する。熱サイクリング後、試料は、再びブリスター266内において再結合されてもよいし、または第2段階ブリスターの個別のセットに個々に送られてもよい。
第1段階PCRが所望のサイクル数にわたって進行した後、図5の実施形態において説明したように、試料は、以下のように、すなわち、試料の殆どをブリスター248に押し戻し、わずかな量のみを残し、チャンバ292iから第2段階PCRマスターミックスを加えることによって、希釈されるとよい。代替的に、チャンバ292iからの希釈緩衝液が、チャネル249を介してブリスター266に移動され、次いで、流体をブリスター264,266間を往復移動させることによって、ブリスター264内の増幅された試料に混合されてもよい。混合の後、ブリスター264に残っている希釈された試料の一部は、廃棄物容器として機能する3ローブ式ブリスター222に押し戻される。必要に応じて、チャンバ292j,292kからの希釈緩衝液を用いて、次いで、チャンバ292gからの第2段階PCRマスターミックスを希釈された増幅試料の一部または全てに添加することによって、希釈が数回繰り返されるとよい。希釈のレベルは、希釈ステップの回数を変更することによって、または希釈緩衝液または第2段階PCRマスターミックスとの混合の前に廃棄される試料の割合を変更することによって、調整されるとよいことを理解されたい。必要に応じて、試料と第2段階PCRマスターミックスとのこの混合物は、第2段階増幅のために第2段階ブリスター282に移動する前に、ブリスター264内において予熱されてもよい。前述したように、このような予熱は、第2段階PCR混合物内のホットスタート成分(抗体、薬物、など)の必要性を排除することができる。
例示的な第2段階PCRマスターミックスは、不完全であり、プライマー対が欠けており、18個の第2段階ブリスター282の各々には、特異性PCRプライマー対が予め装填されている。必要に応じて、第2段階PCRマスターミックスは、他の反応成分も欠けていることがあり、これらの成分も、第2段階ブリスター282内に予め装填されているとよい。前述の実施例において説明したように、各プライマー対は、第1段階PCRプライマー対と同じであってもよいし、または第1段階プライマー対内に入れ子(nest)になっていてもよい。ブリスター264から第2段階ブリスターへの試料の移動によって、PCR反応混合物が完全なものになる。チャンバ292lからの対照試料も、チャネル267を介して対照ブリスター283に移動する。対照試料は、必要に応じて、陽性対照であってもよいし、または陰性対照であってもよい。例示的に、各ポーチは、プロセスの各ステップの操作を正当であると確認し、陽性結果が予め増幅された核酸の自己汚染の結果ではないことを実証する対照反応を含んでいる。しかし、これは、多くのプロトコルにおいて、特に高次の多重反応において、実際的ではない。適切な対照をもたらす1つの例示的な方法は、試料にパン酵母などの種を加えることが含まれている。該核酸は、他の核酸と共に酵母から抽出される。第1段階PCR反応および第2段階PCR反応は、酵母ゲノムからDNA標的および/またはRNA標的を増幅させる。例示的には、分割された前駆体mRNAから導かれるmRNA配列を用いて、プライマー配列をイントロンを跨ぐように配置することによって、RNA特異的標的配列を生成することができる。参照標準に対する酵母コピー数の定量分析によって、システムの各成分が機能していることを実質的に確認することが可能である。多くの第2段階アッセイの各々に対する陰性対照反応は、より問題である。対照反応を平行してまたは独立して行うことが望ましい。
プラダーアセンブリ810のプラダー882の作動によって、試料がそれらの第2段階ブリスター282,283内に密封され、プラダー880の作動によって、第2段階ブリスター282,283に弱い圧力が加えられ、これによって、第2段階ブリスター282,283が加熱/冷却装置に接触させられる。第2段階増幅区域280に面して配置された窓847によって、PCR中および反応産物のDNA融解曲線分析中のアレイを蛍光モニタリングすることが可能になる。
図6のポーチ210は、いくつかの非密封領域、例えば、非密封領域255および非密封領域256を有することに留意されたい。これらの非密封領域は、この例示的実施形態における反応のいずれにも関連しないブリスターを形成している。むしろ、これらの非密封領域は、作動ブリスターとチャネルとの間の空間に設けられている。いくつかの製造プロセスにおいて、全ての非使用空間が密封されたポーチと比較して、領域255,256のような非密封領域が設けられている場合の方が、漏れが少ないことが分かっている。これは、フィルム材料において問題になる皺が低減することによると推測される。このような非密封領域は、任意選択的に、どのようなポーチの実施形態に設けられてもよい。
図8は、ポーチ210と共に用いることができる例示的な機器800を示している。機器800は、支持部材802を備えている。支持部材802は、ケーシングの壁を形成するかまたはケーシング内に取付けられている。機器800は、第2の支持部材804も備えている。第2の支持部材804は、任意選択的に支持部材802に対して移動可能になっており、これによって、ポーチ210の挿入および取出しが可能になる。移動可能な支持部材804は、軌道上に取付けられていてもよいし、または種々の方法によって支持部材802に対して移動するようになっていてもよい。例示的には、いったんポーチ210が機器800内に挿入されたなら、蓋805がポーチ210を覆って嵌合されるようになっている。他の実施形態では、支持部材802,804は、ポーチ210が適所に配置された状態で、他の機械的手段または空圧によって互いに固定されるとよい。
例示的に、ブラダーアセンブリ810および空圧弁アセンブリ80が移動可能な部材802上に取付けられており、ヒータ886,888が支持部材802上に取付けられている。しかし、この構成は、単なる例示にすぎず、他の構成も可能であることを理解されたい。ブラダーアセンブリ810および空圧弁アセンブリ808が移動可能な支持部材804に取り付けられているので、これらの空圧アクチュエータは、ポーチ210と接触して配置されるように、ポーチ210に向かって移動することができる。ポーチ210が機器800内に挿入され、移動可能な支持部材804が支持部材802に向かって移動されると、ポーチ210の種々のブリスターは、ブラダーアセンブリ810の種々の空圧ブラダーおよび空圧弁アセンブリ808の種々の空圧ピストンに隣接して配置され、これによって、空圧アクチュエータの作動によって、ポーチ210のブリスターの1つまたは複数から液体を押し出すことができ、またはポーチ210の1つまたは複数のチャネルに対してピンチ弁を形成することができる。ポーチ210のブリスターおよびチャネルとブラダーアセンブリ810の空圧アクチュエータおよび空圧弁アセンブリ808との間の関係については、図9および図10に関して以下にさらに詳細に検討する。
各空圧アクチュエータは、1つまたは複数の空圧取付具を有している。例えば、ブラダーアセンブリ810のブラダー824は、空圧取付具824aを有しており、空圧ピストン843は、関連する空圧取付具843aを有している。例示的実施形態では、ブラダーアセンブリ810の空圧取付具の各々は、移動可能な支持部材804の通路816を貫通しており、ホース878が各空圧取付具を弁899を介して圧縮空気源895に接続している。例示的実施形態では、通路816は、圧縮空気源895へのアクセスをもたらすのみならず、ブラダーがポーチ210のブリスターと適切に位置合わせされるように、ブラダーアセンブリ810の種々の構成部品を真っ直ぐに並べるのを助長する。
同様に、空圧弁アセンブリ808も、移動可能な支持部材804に取付けられている。しかし、他の構成も可能であることを理解されたい。例示的実施形態では、空圧弁アセンブリ808のピン858が移動可能な支持部材804の取付け開口859に取付けられ、空圧ピストン843,852,853,862は、移動可能な支持部材804の通路816を貫通し、ポーチ210に接触するようになっている。図示されているように、ブラダーアセンブリは、移動可能な支持部804の第1の側811に取付けらており、空圧弁アセンブリ808は、移動可能な支持部材804の第2の側812に取付けられている。しかし、空圧ピストン843,852,853,862は、通路816を貫通しているので、空圧弁アセンブリ808の空圧ピストンおよびブラダーアセンブリ810の空圧ブラダーは、協働して、ポーチ210の必要な空圧アクチュエータをもたらすように機能している。
前述したように、ブラダーアセンブリ810の空圧アクチュエータおよび空圧弁アセンブリ808の各々は、関連する空圧取付具を有している。図8においていくつかのホース878しか示されていないが、各空圧取付具は、ホース878を介して圧縮空気源895に接続されていることを理解されたい。圧縮ガス源895は、コンプレッサーであってもよいし、または代替的に二酸化炭素シリンダーのような圧縮ガスシリンダーであってもよい。圧縮ガスシリンダーは、もし携帯性が望まれるなら、特に有用である。圧縮ガスの他の源も本発明の範囲内にある。
機器810のいくつかの他の構成部品も 圧縮ガス源895に接続されている。支持部材802の第1の側813に取付けられている磁石850は、例示的に、ホース878を介する圧縮ガス源895からのガスを用いて、展開および後退するようになっている。しかし、磁石850を移動させる他の方法も、当技術分野において知られている。磁石850は、支持部材802の凹部851内に着座している。凹部851は、支持部材802を貫通する通路とすることができ、これによって、磁石850は、ポーチ210のブリスター246に接触することができることを理解されたい。しかし、支持部材802の材料に依存して、磁石850が展開したときに該磁石850がブリスター246に充分な磁場をもたらすのに充分に接近し、磁石850が後退したときに該磁石850がブリスター246に存在するどのような磁気ビーズにも著しい影響を与えない限り、凹部851は、支持部材802を通り抜ける必要がないことを理解されたい。格納式磁石850を参照しているが、電気磁石が用いられてもよく、この電磁石は、該電磁石を通る電流を制御することによって、作動および作動停止されるようになっていてもよいことを理解されたい。従って、本明細書では、磁石の引出しおよび後退について述べているが、これらの用語は、磁場を引き出す他の方法を含むように充分に広いことを理解されたい。空圧接続部は、空圧ホースまたは空圧空気マニホールドであってもよく、これによって、必要とされるホースまたは弁の数を減らすことができることを理解されたい。
支持体802に取付けられた空圧ピストンアレイ869の種々の空圧ピストン868も、ホース878を介して圧縮ガス源895に接続されている。空圧ピストン868を圧縮ガス源895に接続する2つのホース878しか示されていないが、空圧ピストン868の各々が圧縮ガス源895に接続されていることを理解されたい。12個の空圧ピストン868が示されている。ポーチ210が機器800内に挿入されると、12個の空圧ピストン868が、それぞれ、ポーチ210の12個のプランジャー268を作動するように配置される。蓋805がポーチ210を覆って閉じられると、蓋805のリップ806が取付具290を支持し、これによって、空圧ピストン868が作動するとき、蓋805は、取付具290を適所に保持することができる。取付具290の他の支持体も本発明の範囲内にあることを理解されたい。
1対の加熱/冷却装置、例えば、ペルチェヒータが、支持体802の第2の側814に取付けられている。第1段階PCRのためにブリスター264の内容物を加熱および冷却するために、第1段階ヒータ886が配置されている。第2段階PCRのためにポーチ210の第2段階ブリスター282,283の内容物を加熱および冷却するために、第2段階ヒータ888が配置されている。しかし、これらのヒータは、他の加熱目的のために用いられてもよいこと、および特定の用途に対して、必要に応じて、他のヒータが含まれていてもよいことを理解されたい。
必要に応じて、試料が実際に特定のブリスター内に押し込まれたかどうかに関するフィードバックをもたらすために、フィードバック機構(図示せず)が機器800内に含まれていてもよい。例示的なフィードバック機構の例として、温度または圧力センサ、または特に蛍光染料または着色染料が含まれている場合、光学検出器が挙げられる。このようなフィードバック機構は、例示的に、支持部材802,804のいずれかに取付けられるとよい。例えば、圧力センサがブリスター264の位置に隣接して支持体802に取付けられるとよい。試料が支持されながらブリスター264に移動したとき、もし圧力センサが押し下げられたなら、試料処理の継続が許容される。しかし、もし圧力センサが押し下げられなかったなら、試料処理が停止され、またはエラーメッセージがスクリーン892上に表示される。ブリスターのどのような組合せまたはブリスターの全てが、ポーチを通る試料の適切な移動に関するフィードバックをもたらすために、フィードバック機構を有しているとよい。
蛍光検出が望ましい場合、光学アレイ890が設けられるとよい。図8に示されているように、光学アレイ890は、光源898、例えば、フィルター付きLED光源、フィルター付き白灯、またはレーザー照射、およびカメラ896を備えている。移動可能な支持体804の窓847が、ポーチ210の第2段階増幅区域280への光学アレイ890のアクセスを可能にしている。例示的には、カメラ896は、複数の光検出器を有しており、これらの光検出機の各々は、ポーチ210の第2段階ブリスター282,283に対応している。代替的に、カメラ896は、第2段階ブリスター282,283の全てを含む画像を取得し、この画像を第2段階ブリスター282,283の各々に対応する個別の視野に分割するようになっていてもよい。構成にもよるが、光学アレイ890は、静止していてもよいし、または1つまたは複数のモータに取付けられた可動体上に配置され、個々の第2段階ブリスター282,283からの信号を得るように移動するようになっていてもよい。他の構成も可能であることを理解されたい。
図示されているように、コンピュータ894が、圧縮空気源895の弁899を制御し、これによって、機器800の空圧機構の全てを制御するようになっている。また、コンピュータ894は、ヒータ886,888および光学アレイ890も制御するようになっている。これらの構成要素の各々は、電気的に、例えば、ケーブル891を介して、互いに接続されている。しかし、他の物理的接続または無線接続も本発明の範囲内にある。コンピュータ894は、機器890内に収容されていてもよいし、または機器890の外部に配置されていてもよいことを理解されたい。さらに、コンピュータ894は、構成部品のいくつかまたは全てを制御する内蔵式回路基板を備えていてもよいし、光学アレイからのデータを受信し、かつ表示するために、外部コンピュータ、例えば、デスクトップ式またはラップトップ式PCを備えていてもよい。情報および変数、例えば、温度、サイクル時間、などを入力するために、キーを備えるインターフェイス893、例えば、キーボード・インターフェイスが設けられているとよい。例示的には、ディスプレイ892も設けられている。ディスプレイ892は、例えば、LED、LCD、または他のこのようなディスプレイであるとよい。
図9は、機器800の操作中のブラダーアセンブリ810とポーチ210との関係を示している。ブラダーアセンブリは、サブアセンブリ815,817,818,819,822を備えている。ブラダーサブアセンブリ815のブラダー809が大きいので、ブラダーサブアセンブリ815は、例示的に、2つの空圧取付具815a,815bを有している。ブラダー809は、(図6に示されているように)ポーチ210のプラスチックフィルム部分217からチャンバ292を封鎖するために用いられる。プランジャー268の1つが押圧されると、空圧取付具815a,815bの一方または両方がブラダー809を萎縮させることができる。流体がチャンバ292の1つを通り抜けた後、ブラダー809は、再加圧され、チャネル214,236,245,247,249を密封する。例示されているブラダーサブアセンブリ815は、1つのブラダー809しか有していないが、他の構成、例えば、チャネル214,236,245,247,249の各々がそれ自体に関連するブラダーまたは空圧ピストンを有する構成も可能であることを理解されたい。ブラダーサブアセンブリ822は、例示的に、3つのブラダー824,826,828を備えている。前述したように、ブラダー824,824,828は、細胞溶解のために3ローブ式ブリスターを駆動するようになっている。図示されているように、ブラダー824,826,828は、対応するブリスター224,226,228よりもいくらか大きくなっている。膨張時に、ブラダーの表面がいくらかドーム状になるので、いくらか大きいブラダーを用いることによって、対応するブリスターの全面に対して良好な接触をもたらし、ブリスターのより均一な加圧および排気を可能にすることが分かっている。しかし、場合によっては、個々のブリスターの完全な排気が望まれることもあるが、望まれないこともあり、ブリスターの排気量を制御するために、より大きいまたはより小さい大きさのブラダーが用いられてもよい。ブラダーサブアセンブリ817は、4つのブラダーを有している。ブラダー836は、チャネル236のためのピンチ弁として機能し、ブラダー844,846,866は、それぞれ、ブリスター244,248,266に圧力をもたらすように構成されている。ブラダーサブアセンブリ818は、2つのブラダー846,864を有している。ブラダー846,864は、それぞれ、ブリスター246,264に圧力をもたらすように構成されている。最後に、ブラダーサブアセンブリ819は、第2段階増幅区域280を制御するものである。ブラダー865は、チャネル265,267用のピンチ弁として作用し、ブラダー882は、第2段階ブリスターをヒータ888に密接触するように押し込むために、第2段階ブリスター282,283に弱い圧力をもたらすようになっている。ブラダーアセンブリ810は、5つのサブアセンブリを備えているが、この構成は、単なる例示にすぎず、どのような数のサブアセンブリが設けられてもよいこと、およびブラダーアセンブリ810は、単一の一体化アセンブリとして設けられてもよいことを理解されたい。
図10は、同様に、機器800の操作中の空圧弁アセンブリ808とポーチ210との関係を示している。ブラダーではなく、空圧弁アセンブリ808が、4つの空圧ピストン842,852,853,862を有している。各々が圧縮空気によって駆動されるこれらの空圧ピストン842,852,853,862は、チャネル242,252,253,262に方向性のある圧力をもたらすことになる。ピストンは、その直径が適度に小さいので、ブラダーサブアセンブリ817とブラダーサブアセンブリ818との間に嵌合することによって、チャネル242,252,253,262のためのピンチ弁をもたらし、チャネル242,252,253,262を適度に短くすることができる。しかし、必要に応じて、空圧ピストン842,852,853,862は、ブラダーアセンブリ810に含まれるブラダーに置き換えられてもよく、これによって、空圧弁アセンブリの必要性をなくすことができる。ブラダーと空圧ピストンとの間のどのような組合せも本発明の範囲内にあることを理解されたい。また、当技術分野において知られているポーチ210のチャネルおよびブリスターに圧力を加える他の方法も本発明の範囲内にあることを理解されたい。
図12は、図6のポーチ210と同様のポーチ510を示している。入口チャネル515a〜515lを有する取付具590は、入口チャネル215a〜215lを有する取付具290と同様である。チャネル538,543,552,553,562,565をそれぞれ有するブリスター544,546,548,564,566は、ポーチ210のチャネル238,243,252,253,262,264をそれぞれ有するブリスター244,246,248,264,266と同様である。ポーチ210のチャネル245,247,249は、ポーチ510のチャネル545a〜545c,547a〜547b,548a〜548cとしていくらか再構成されており、ポーチ510のそれぞれのチャネルは、ポーチ210の対応するチャネルよりもいくらか短くなっている。しかし、このチャネル構成は、単なる例示にすぎないこと、および種々のチャネル構成が可能であることを理解されたい。
図12のポーチ510と図6のポーチ6との間には、2つの主な違いがある。第1に、3ローブ式ブリスター222が、溶解ブリスター522に置き換えられている。溶解ブリスター522は、図2bに示されているように、電動モータ19に取付けられた回転ブレードまたはパドル21を用いて、衝撃を介して渦を生じさせるように構成されている。この溶解方法は、空圧ピストンの交互圧力に依存しないので、単一ローブ式ブリスターのみが示されている。溶解ブリスター522が単一ブリスターしか有していないので、チャネル514,536の両方が溶解ブリスター522の単一ローブに繋がっている。溶解ブリスターは、本明細書に記載されているポーチの実施形態のいずれに用いられてもよいことを理解されたい。溶解アセンブリ522は、例示的には、ブリスター522用に構成された単一ブラダーを有するブラダーサブアセンブリ822のブラダー824,826,828に置き換えられるように修正されてもよいことをさらに理解されたい。逆に、前述の種々の他の実施形態において述べた3ローブ式ブリスターがポーチ510に用いられてもよい。溶解ブリスター522は、任意選択的な補強パッチ523を備えていてもよい。強化パッチ523は、例示的に、接着剤または積層によって溶解ブリスター522の外面に取付けられている。補強パッチ523は、パドル21との繰返し接触によるポーチ510の引裂きを最小限に抑えるのを助長するものである。図13は、第2の支持部材804に取付けられる電動モータ、例えば、マブチRC-280SA-2865 DCモータ(千葉、日本)を示している。一例示的実施形態では、このモータha、5,000〜25,000rpm、さらに例示的には、10,000〜20,000rpm、さらに一層例示的には、略15,000〜18,000rpmで回転する。マブチモータの場合、7.2Vで溶解に対して充分な回転数が得られることが分かっている。しかし、ブレード21がポーチ510に衝撃を与える場合、実際の速度は、いくらか遅くなることを理解されたい。用いられるモータおよびパドルに依存して、他の電圧および速度が溶解に対して用いられてもよい。任意選択的に、制御された少量の空気が、溶解ブリスター522に隣接するブラダー内に供給されてもよい。いくつかの実施形態では、隣接するブラダーに1回または複数回にわたって少量の空気を部分的に充填することによって、溶解プロセス中に溶解スリスターを位置決めし、かつ支持するのを助長することができることが見出されている。代替的に、溶解中にポーチ510を保持するために、他の構造、例えば、ブリスター522を包囲する剛性または柔軟ガスケットまたは他の保持構造が用いられてもよい。
図12のポーチ510と図6のポーチ210との間の第2の主な違いは、第2段階増幅区域280のブリスター281,282,283が、第2段階増幅区域580における高密度アレイ581に置き換えられている点にある。高密度アレイ581は、複数の第2段階ウエル582,例示的には、50個以上のウエル、さらに例示的には、120個以上のウエルを備えている。さらにより多くの第2段階ウエル582,例示的には、約200個、約400個、さらに、約500個以上の第2段階ウエル582を有する実施形態も本発明の範囲内にある。他の構成も本発明の範囲内にある。付加的な第2段階ウエルは、ウエル582をより小さくすることによって、または高密度アレイ581をより大きくすることによって、またはこれらを組み合わせることによって、追加されてもよい。第2段階PCRにおいて、ウエルの各々は、対のプライマーを含むようになっているとよい。1つまたは複数のウエルは、陽性対照(positive control)または陰性対照(negative control)のために用いられてもよいことを理解されたい。
ウエルがブリスター566内の希釈された第1段階増幅産物によって満たされたときのウエル間の交差汚染が、大きな問題になる可能性がある。交差汚染は、ポーチ210では、図9に示されているように、各第2段階ブリスターをチャネル265の個別の分岐を介して充填し、次いで、ブラダー882によって密封することによって、制御されるようになっている。流体がブリスター584のいくつかまたは全てを満たす高密度アレイ581においても、ウエル間の交差汚染は、制御されねばならない。一実施形態では、第2段階PCRプライマーは、各ウエルの内面に共有結合または非共有結合の形態で結合しており、これによって、PCRチップと全く同様に機能している。しかし、多くの実施形態では、PCRプライマーをウエルに拘束させることなく、ウエル間の交差汚染を制御することが望ましい。ウエル間の交差汚染の制御は、流体が、高密度アレイ581の第1の表面581aを横切って流れることによって、ブリスター566からウエル582に移動する実施形態では、困難になる。
第2段階増幅区域580の満足のいく装填のためにいくつかの望ましい特徴について説明する。第1に、ブリスター566から流入する流体は、実質的に全てのウエル582を実質的に同一レベルで満たすことが望ましい。満たされなかったウエルは、誤った負信号を生じることになる。第2に、ウエル582を満たすプロセスは、ウエル内のプリマーを漏出させないことが望ましい。1つのウエルからのプライマーの損失は、該ウエル内のPCR反応の効率を制限し、近傍のウエルを汚染させる可能性がある。第3に、ウエル582が満たされ、PCRが開始した後、これらのウエルは、互いに完全に密封されることが望ましい。一つのウエルから他のウエルへの増幅産物の漏れは、第1のウエルの信号を低下させ、第2のウエルの信号を増大させ、これによって、第1のウエルにおける誤った負信号および第2のウエルにおける誤った正信号をもたらす可能性がある。さらに、制御の種類によっては、1つのウエハにおいて生じた増幅産物が他のウエルに進入してさらに増幅されないことが重要である。
この問題の解決策として、バリア層の使用が挙げられる。一実施例では、バリア層は、ウエルの迅速な装填および界面に触れていない流体からの迅速な密封を可能にするために設けられる物理的バリア層である。他の例では、化学的バリアと物理的バリアの組合せが用いられるが、この場合、物理的バリアがウエルを密封するために用いられ、次いで、化学的バリアが、例えば、加熱、徐放、または酵素消化によって、オリゴヌクレオチドプライマーをウエル溶液内に条件付きで放出するようになっている。ウエル深さまたは各ウエルに対するチャネル長さを用いて、ウエルからの試薬の放出を制御してもよい。高密度アレイ581を装填するための他の手段も可能である。
図14は、物理的バリアを用いる第2段階580の例示的実施形態を示している。ポーチ510の第1の層518と第2の層519との間に挟まれているのは、ウエル582を有する高密度アレイ581である。貫通孔586を有する穿孔層585が、高密度アレイ581の片側に設けられている。穿孔層585は、物理的バリアとして作用するものである。第2の層587が、高密度アレイ581の反対側に設けられている。第2の層587は、ウエル582の底を形成している。例示的に、穿孔層585および第2の層587は、熱融着によって高密度アレイ581に封止されたプラスチックフィルムである。しかし、他の封止方法が用いられてもよいことを理解されたい。また、高密度アレイ581に用いられる材料ならびに穿孔層585および第2の層587に用いられる材料は、互いに対する適合性、封止方法に対する適合性、および用いられる化学反応に対する適合性を有するべきであることを理解されたい。PCRに用いられる場合、高密度アレイ581に用いることができると共に熱融着を行うこともできる適合性プラスチックの例として、PE、PP、Monprene(登録商標)、および他のブロックコポリマーエラストマーが挙げられる。蛍光染料が化学検出に用いられる場合、高密度アレイ581が黒色材料または蛍光に対して比較的不透明な他の材料から形成され、層575,587の少なくとも1つが蛍光に対して比較的透明であると、1つのウエル582からその近傍のウエルへの信号漏れを最小限に抑えることができるので、望ましい。穿孔層585および第2の層587に対して、Mylar(登録商標)またはPETのような強靭なエンジニアリングプラスチックとPE,PP,およびDupont Surlyn(登録商標)のような熱融着可能なプラスチック層との積層体が用いられるとよい。接着剤に基づくシステムの場合、PETまたはポリカーボネートのような剛性エンジニアリングプラスチックを用いて、高密度アレイ581を形成し、次いで、穿孔層585および第2の層587として、PCR適合性プラスチックのフィルムが用いられてもよい。例示的な一実施形態では、高密度アレイ581は、黒色PEから作製され、複合ポリエチレン/PETラミネート(またはXerox(登録商標) PN104702:熱ラミネートポーチ材料)が高密度アレイ581に熱融着される穿孔層585および第2の層587に対して用いられ、複合ポリプロピレン/PETがポーチ510の第1および第2の層518,519に対して用いられるようになっている。
貫通孔は、ウエル582と一直線に並んでいることを理解されたい。また、貫通孔586は、力が作用しないなら、流体が容易に貫通孔586を通って流れないように充分小さいことを理解されたい。例示的な貫通孔は、0.001〜0.1mm、例示的には、0.005〜0.02mm、さらに例示的には、約0.01mmであるとよい。例示的実施形態では、第2段階増幅区域580は、真空下にあり、これによって、流体がブリスター566に入るとき、真空が流体を貫通孔586を通って各ウエル582内に引き込むことになる。いったんウエル582が満たされると、流体をウエル582内に押し込むかまたはウエル582から押し出す力は、もはや存在しない。次いで、第2段階増幅区域580に隣接するブラダー(図示されていないが、ブラダー880/882と同様の位置にあるブラダー)が作動し、第1の層518を高密度アレイ581に対して押圧し、流体をウエル582内に密封する。ウエル582を密封するためにポーチ510の第1の層518が用いられているが、任意選択的な密封層が穿孔層585と第1の層518との間に設けられていてもよいことを理解されたい。
例示されている一実施例では、第2段階増幅区域580は、以下のように準備されるとよい。高密度アレイ581は、最初、プラスチックシート(例示的に、0.1〜1mm厚み)にウエル582のアレイを穿孔、成形、またはそれ以外の方法によって形成することによって、作製されるとよい。ウエルは、所望されるどのような規則的または不規則的なアレイを形成していてもよく、例示的には、0.05〜20μL、さらに例示的には、0.1〜4μLの体積を有しているとよい。次いで、層585,587の1つが、例えば、熱または接着剤によって、高密度アレイ581の第1の表面581aに積層される。図15の例では、穿孔層585が第1の表面581aに付着されている。次いで、試薬589,例示的には、アレイの固有の化学要素、例えば、PCRプライマー対が、ピペット操作に基づく手動によって、または自動的に(例示的に、ピンスポッター、ドットマトリックスプリンター、少量自動ピペット、またはマイクロ流体マイクロ接触スポッターのようなx/y位置決め可能スポッターを用いて)ウエル内にスポッティングされる。試薬をスポティングする例示的な装置については、以下の実施例4において検討する。試薬589が各ウエル582内において乾燥した後、第2の層585または587がアレイ581の第2の表面581bに取付けられる。層585は、小径ニードルのアレイを用いて穿孔され、これによって、貫通孔が形成される。貫通孔586は、層585がアレイ581に固定される前または後のいずれに形成されてもよい。スポッティングは、穿孔の前または後の層585または層587のいずれに対して行われてもよいことを理解されたい。予め穿孔された孔を有するアレイのスポティングは、実質的に漏れず、穿孔に用いられるニードルがスポッティングされた試薬との接触によって汚染されないという利点をもたらすことが分かっている。代替的に、漏れの可能性を最小限に抑えるために、かつスポッティングされた試薬をアレイの最も遠い箇所に位置決めするために、試薬589を第2の層587にスポッティングし、アレイ581を層585によって密封し、次いで、層585を穿孔することが望ましい。代替的な実施例では、試薬は、GeSiM社製A060−324 Nano−Plotter 2.1/E(グロッサークメンスドルフ、ドイツ)または実施例4において以下に検討するスポッターを用いて、第2の層587上にスポッティングされる。このようなスポッターを用いることによって、多重アレイを同時にスポッティングすることができる。
いったんスポッティングされ、かつ穿孔されたなら、アレイ581は、例えば、熱融着、接着剤、超音波溶着、機械的な閉鎖、またはポーチ510の内側のアレイ581をブリスター584内に密閉する他の手段によって、ポーチ510の層518および519の内側に配置され、適所に密封されることになる。ブリスター584は、チャネル565を介してブリスター566に流体接続していること、および流体は、チャネル565からブリスター584内に入って貫通孔586の全体にわたって流れることができることを理解されたい。例示的な一実施例では、ブリスター584が形成されるとき、脱気のための経路をもたらすことに注意が払われるべきである。これは、第2段階増幅区域580に隣接する第1の層518の内面に(フィルム材料にいくらか隆起したテクスチャのパターンを刻む)「ワッフル構造」によって、達成することができる。これによって、空気および液体が穿孔層585の表面に沿って流れることができ、液体が良好にウエル582の全てに到達し、かつ満たすことができる。次いで、ポーチ510は、真空チャンバ内に配置され、減圧される。例示的には、圧力が略0.3ミリバールに達すると、真空チャンバ内の空圧シリンダーが作動し、プランジャーを取付具590内に下向きに移動させ、チャネル567を密封し、これによって、密封ポーチの内側のアレイおよび真空チャンバから経路を遮断することができる。種々の入口チャネル515を密封するために、複数の他のプランジャーも取付具590内に押し込まれる。ポーチは、真空チャンバから取り出され、長期貯蔵するために、真空バッグ内に包装されるとよい。
ポーチ510は、ポーチ210と同じように用いられるとよい。アレイ581が真空に包装されているので、液体がブリスター566から第2段階増幅区域580に移動するとき、液体試料は、貫通孔586を通してウエル582内に引き込まれる。余分の液体は、アレイに面する空圧ブラダーを膨張させることによって押し出され、熱サイクリングが、前述したように、例えば、アレイの片側に押し付けられたペルチ素子を加熱および冷却することによって行われる。
前述したように、穿孔層585は、種々の適切な物理的または化学的バリアに置き換えられてもよい。化学的バリアを用いる一例示的実施形態では、穿孔層585が省略され、試薬589は、比較的緩慢に溶解するバッファー内においてウエル582内にスポッティングされるようになっている。例示的に、PEG、Ficoll、またはポリソルベート20のようなポリマー,またはサクロース、トレハロース、またはマニトールのような糖類を適切な濃度で含む試薬589は、第2段階PCR反応と適合性があり、水またはTris/EDTAにおいてのみスポティングされるプライマーよりも緩慢に溶解するものである。これらのバッファーの1つにスポティングされたプライマーは、前述したように、ウエル582内において空気乾燥される(このような実施形態では、第2の層587は、スポッティングのために高密度アレイ581に取付けられることを理解されたい)。酵素試薬(例えば、PCRにおいて用いられる酵素および緩衝剤)の凍結乾燥において、同一ポリマーを用いて、安定化酵素を含有するオープンマトリックスを形成してもよい。従って、これらのバッファーにスポッティングされたプライマーは、ウエル582内の適所で凍結乾燥され、これによって、空気乾燥の場合よりも遅いが、より完全な再水和が得られることになる。ポーチ510が用いられるとき、ブリスター566からの流体は、真空または圧力によってウエル内に押し込まれ、プライマーミックスを溶解し始める。緩慢に溶解する緩衝材を適切に選択することによって、第2段階増幅区域580に隣接するブラダーが作動し、実質的な交差汚染が生じる前に、各ウエル582内の内容物が密封されることになる。
他の実施形態では、第2段階増幅区域580が所定温度を超える温度に加熱されるまで溶解しないマトリックスが用いられている。マトリックスのこのような一つの例は、低融点アガロース、例えば、GenePure LowMeltアガロース(ISC Bioexpress)である。一例では、このアガロースの1.5%溶液は、65℃で融解し、24〜28℃でゲル化する。スポッティング前に、試薬589が、例えば、50℃に加熱し、すでに融解しているアガロースと混合され、その少量(例えば、100〜500nL)がウエル582内にスポッティングされるようになっている。スポティング中に混合物を液状に維持するために、このスポッティングは、アガロースの融点よりも高温に加熱されたキャビネット内で行われねばならない。代替的に、融解することなくアガロースの希釈溶液をピペット操作によって滴下することも可能である。アガロース/試薬の混合物がスポッティングされた後、高密度アレイ581が乾燥される。これは、単純な空気乾燥であってもよいし、またはプライマー/アガロース混合物が前述の糖およびポリマーを含有し、これによって試薬が凍結乾燥されるようになっていてもよい。ポーチ510がPCRに用いられる場合、ブリスター566からの流体が高密度アレイ581内に移動するとき、第2段階増幅区域580が、例えば、55℃に加熱されてもよい。この温度では、アガロースが融解しないので、プライマーは、溶液内に放出されない。いったん高密度アレイ581が充填されたなら、対応するブラダーが膨張され、ウエルを密封する。第1PCRサイクルの第1の変性ステップにおいて温度が65℃を超えて上昇すると、プライマーを含有するアガロースが融解し、プライマーをマスターミックス内に放出する。例示的に、熱サイクリングは、60℃(またはアガロースの他の融点)未満にならないため、アガロースは、熱サイクリング中にゲル化しない。さらに、図8の例示的な機器800において、繰り返される温度サイクリングは、ポーチの片側に位置するヒータ888によってもたらされる。多くの場合、ウエル582内のPCR溶液を横切る温度勾配が存在し、これが流体の対流を生じさせ、プライマーの混合を促進すると考えられる。類似の実施形態において、ワックスが用いられてもよい。
さらなる実施形態では、プライマーは、条件付きでウエル581に結合されてもよく、この場合、ウエル581が充填された後、溶液内へのプライマーの放出が生じるようになっている。いかにプライマーがプラスチック支持体に付着されるかに応じて、熱(例えば、PCR反応の第1のサイクル中の熱)、光(例えば、窓846を通って照射される光)、化学薬品(例えば、熱が加えられた状態でプライマーをウエルに連結するジスルフィド結合を還元するジチオスレイトール)、または酵素(例えば、プライマーを支持体に付着させる適切なペプチドリンカーを開裂するために用いられるプラスミノーゲン活性因子のような部位特異的プロテアーゼ)を用いて、プライマーを開裂させることができる。
さらに他の実施形態では、増幅の後、DNアーゼが第2段階増幅区域580内に注入去れてもよく、これによって、汚染のいかなる潜在的なリスクもさらに最小限に抑えることができる。
本明細書では、第2段階増幅区域580は、PCRと共に用いるものとして記載されていることを理解されたい。しかし、ポーチ510および第2段階増幅区域580の他の使用も、本発明の範囲内にある。さらに、第2段階増幅区域580は、核酸抽出および第1段階増幅区域と共に用いられもよいし、または単独で用いられてもよいことを理解されたい。最後に、第2段階増幅区域580は、本明細書に記載されているポーチの実施形態のいずれと共に用いられてもよいことを理解されたい。
[ネステッド多重PCR]
(ポーチ110用に構成された)機器800と同様の機器において、一組の反応を図5のポーチ110内で行った。細胞溶解および2段階核酸増幅の効果を示すために、50μLの対数期にあるS.cerevisaieおよびS.pombeの生きた保温菌の各々を100μLの健康なドナーの鼻喉頭吸引物と混合して試料を生成し、次いで、200μLの溶解緩衝液(6Mグアニジン−HCL、15%のTritonX100、3M酢酸ナトリウム)と混合した。次いで、溶解緩衝液内の400μLの試料の内、300μLをポーチ110のチャンバ192aに注入した。
ポーチ110は、3ローブ式ブリスター122内に0.25gのZSビーズを密封するようにして、製造した。また、以下に検討する第2段階プライマーは、ポーチ110の製造中にブリスター181,182内にスポッティングした。ポーチ110は、以下のよう装填した。
115a 前述した試料および溶解緩衝液
115b 溶解緩衝液内の磁気ビーズ
115d〜115e 洗浄緩衝液(10mMクエン酸ナトリウム)
115g 溶離緩衝液(10mMトリス、0.1mM EDTA)
115h 第1段階PCR緩衝液
0.2mM dNTP
0.3μM プライマー:
Sc1:RNAおよびS.cerevisaieのMEX67pに結合するYRA1核タンパク質の一部を増幅するように構成されたプライマー(このプライマーは、cDNA(M−MLVを介して逆転写したmRNA)の増幅が180bpの増幅産物を生成するようにイントロンの全域で増幅するように構成されている)
Sc2:S.cerevisaieのMRK1グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK−3)同族体のcDNAの121bp領域を増幅するように構成されたプライマー
Sc3:S.cerevisaieのRUB1ユビキチン様タンパク質のcDNAの213bp領域を増幅するように構成されたプライマー
Sp1:S.pombeのsuc1−サイクリン依存性タンパク質キナーゼ調節サブユニットのcDNAの200bp領域を増幅するように構成されたプライマー。
Sp2:S.pombeのsec14−サイトゾル因子ファミリーのcDNAの180bp領域を増幅するように構成されたプライマー
3mMのMgcl2含有PCR緩衝液(BSAなし)
50ユニットのM−MLV
4.5ユニットのTaq:抗体
100ユニットのRNAseOut
115j〜115k 第2段階PCR緩衝液
0.2mM dNTP
IXLC Green(登録商標)Plus (Idaho Technology)
2mMのMgcl2含有PCR緩衝液(BSAあり)
4.5ユニットのTaq
115l 第1段階増幅産物の試料を含む第2段階PCR緩衝液
製造中、第2段階ネステッドプライマーを第2段階ブリスター181,182にスポッティングした。第2段階PCR緩衝液によって再水和されたときに約0.3μMの最終濃度をもたらす量の1つのプライマー対を、各ブリスターにスポッティングした。第2段階ネステッドプライマーは、以下の通りである。
Sc1:第1段階増幅産物のSc1のcDNAの80bp断片を増幅するように構成されたプライマー
Sc2:第1段階増幅産物のSc1のcDNAの121bp断片を増幅するように構成されたプライマー
Sc3:第1段階増幅産物のSc1のcDNAの93bp部分を増幅するように構成されたプライマー
Sp1:第1段階増幅産物のSc1のcDNAの99bp部分を増幅するように構成されたプライマー
Sp2:第1段階増幅産物のSc1のcDNAの96bp部分を増幅するように構成されたプライマー
標的のいずれに対しても、第1段階プライマー対と第2段階プライマー対とは、重複されていない。プライマーの各対を1つの陰性対照ブリスター181および2つの第2段階ブリスター182にスポッティングし、2通りの第2段階増幅を行い、それぞれ、陰性対照を行った。
装填後、入口チャネル115aに付随するプランジャーの作動によって、試料を3ローブ式ブリスター122に移動させ、入口チャネル115bに付随するプランジャーの作動によって、磁気ビーズをリザーバ101に移動させ、入口チャネル115d〜115eに付随するプランジャーの作動によって、洗浄緩衝液をリザーバ102,103に移動させ、入口チャネル115gに付随するプランジャーの作動によって、溶離緩衝液をリザーバ104に移動させ、入口チャネル115hに付随するプランジャーの作動によって、第1段階PCR緩衝液をリザーバ105に移動させ、入口チャネル115j〜115kに付随するプランジャーの作動によって、第2段階PCR緩衝液をリザーバ106,107に移動させ、入口チャネル115lに付随するプランジャーの作動によって、陽性対照(予め調製された第1段増幅産物の試料を含む第2段階PCR緩衝液)をリザーバ108に移動させた。この実施例では、ポーチ110を機器内に装入する前に、入口チャネル115a,115bに付随するプランジャーを押し下げた。必要に応じて、作動中に、他の全てのプランジャーを機器内において順次押し下げ、流体をリザーバ102〜108に移動させた。
ポーチ110を機器内に配置した時点で、前述したように、ZSビーズの存在下で、10分間の衝撃を行った。細胞溶解が完了した時点で、リザーバ101を圧縮し、核酸結合磁気ビーズをリザーバ101から3ローブ式ブリスター122に押し込み、3ローブ式ブリスター122において、ビーズを緩混合し、5分間保温した。
次いで、試料/ビーズ混合物をブリスター144に移動させ、磁石の作動によって、磁気ビーズを捕捉した。磁石が展開した時点で、ブリスター144に隣接するプラダーを加圧し、流体を3ローブ式ブリスター122に戻した。次いで、前述したように、リザーバ102,103からの洗浄溶液を用いて、捕捉されたビーズを洗浄した。洗浄後、磁石の作動によって、ビーズをブリスター144内において再び捕捉し、リザーバ104内に貯蔵された溶離緩衝液をブリスター144に移動させ、2分間の保温の後、前述したように、ビーズから溶離した核酸をブリスター161に移動させた。
ブリスター161において、核酸試料をリザーバ105からの第1段階PCRマスターミックスと混合した。次いで、試料を(M−MLVがmRNAをcDNAに変換させるために)10分間にわたって40℃に維持し、次いで、試料を(M−MLVを不活性化し、Taqから抗体を除去するために)2分間にわたって94℃に維持した。次いで、94℃×10秒および65℃×20秒の熱サイクリングを20回行った。
第1段階増幅に続いて、リザーバ106からの第1段階PCRマスターミックスを用いて、試料を約1000倍に希釈した。次いで、試料を前述したように予め第2段階プライマーがスポッティングされたブリスター182に移動させた。第2段階PCR緩衝液をリザーバ181から陰性対照ブリスター181に移動させ、陽性対照混合物をリザーバ108からブリスター183に移動させた。試料を94℃で30秒間変性させ、次いで、94℃×5秒および69℃×20秒の熱サイクリングを45回行うことによって、試料を増幅させた。
図11から分かるように、全ての標的増幅産物および陽性対照が増幅を示し、その一方陰性対照のいずれも増幅を示さなかった。各試料は、複製で実験された。これらの複製は、同様の増幅を示した(データは、示されていない)。
S.cerevisaie標的および S.pombe標的は、単なる例示にすぎず、他の標本も本発明の範囲内にあることを理解されたい。
[高密度PCR]
上記の実施例は、図5のポーチ110を用いている。ポーチ110は、5個の陰性対照ブリスター181、5個の陽性対照ブリスター183、および10個の低容積試料ブリスター182を有している。図6のポーチ210は、低容積試料ブリスター282の数を18個に増加させている。しかし、図12に示されているポーチ510の高密度アレイ581は、120個以上の第2段階ウエル582を有することができる。第2段階反応の数のこの増加は、ポーチおよびその装置の大きさを増加させることなく、幅広い潜在的な診断適用および人物同定適用を可能にする。以下、種々の実施例について説明する。
一実施例では、一般的な呼吸器ウイルス用の標準的な市販免疫蛍光アッセイは、7つのウイルス、すなわち、アデノウイルス、PIVI,PIV2,PIV3,RSV,インフルエンザA,およびインフルエンザBを検出することができることが知られている。より完全なアッセイパネルは、例示的に、追加的な5つのウイルス、すなわち、コロナウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、BOCAウイルス、ライノウイルス、および非HRVエンテロウイルス用のアッセイを含んでいる。アデノウイルスまたはHRVのような高変動ウイルスの場合、ウイルス系統の枝の全てを標的とする多重プライマーを用いることが望ましい(例示的に、4つのアウタープライマーと4つのインナープライマーとからなる各セット)。他のウイルス、例えば、コロナウイルスの場合、1つの季節から他の季節にかけて変動しない4つの別個の系統(229E,NL63,OC43,HKU1)があるが、これらも別々のプライマーセットが必要とされるほど分岐している。また、例示的な完全呼吸器ウイルス用のアッセイパネルは、SARSコロナウイルス、可能であれば、鳥インフルエンザHAおよびN派生型、ならびに可能であれば、他のものを標的にするだろう。最後に、呼吸器ウイルスのいくつかは、極めて高い配列変動率を示すので、このようなウイルスの各々に対して、2通り以上のネステッドPCRアッセイを行い、これによって、プライマー下での配列変動による誤った陰性結果の機会を最小限に抑えると有益である。本明細書に記載されているプライマーセットの全てが含まれる場合、このような呼吸器ウイルス用アッセイパネルは、第2段階増幅において80個以上の特異的増幅産物が生じさせることができる。高密度アレイ581は、単一ポーチ510内においてこのようなアッセイパネルを容易に収容することができる。
ポーチ510の高密度アレイ581の第2の適用は、感染患者から単離された多剤耐性細菌の同一性および抗生物質耐性スペクトルを決定することである。現在の方法は、生物を保温し、個々の薬剤耐性プロフィールを実験的に試験するために数日かかる。結果を受け取る間、医師は、多くの場合、広域スペクトル抗生物質を投与するが、これによって、多剤耐性細菌が増加する。PCRプライマーは、抗生物質耐性の遺伝子決定基(抗生物質耐性遺伝子自体)を検出するために、開発されてきている。しかし、これらの遺伝子のいくつかには極めて多数の変異体があるため、耐性プロフィールを完全に決定するには、多数の増幅産物が必要である。Hujerらは、アシネトバクター属単離体に存在する耐性遺伝子を同定するための62通りのアッセイを行うためのパネルを記載している。ここでも、高密度アレイ581は、このようなパネルを単一ポーチ内に容易に収容することが可能である。
高密度アレイの有用性の第3の例は、人物同定、例えば、死体の法医学的同定および親子鑑定のための人物同定の分野にある。人物同定の市場の殆どは、短直列型反復配列(DTR)を分析するシステムによって示されている。この分析は、一般的に、例えば、キャピラリー電気泳動を用いて、大きさごとに反復配列を分離する必要がある。この目的のために用いられる特別の実験室装置は、一般的に可搬型ではない。同定試験のために一塩基多型(SNP)を用いることにますます関心が高まっている。何故なら、SNPを同定するための多数の技法があるが、これらの技法のいくつかは、現場使用に適しているからである。Sanchezらは、2つの個体が偶然によって適合する極めて低い確率(少なくとも5.0×10−19の平均適合確率)を協働によってもたらす52個のウエルによって特徴付けられたSNPを公表している。実際には、各遺伝子座を正確に分類するには、SNPごとに2つの増幅産物が必要である(例えば、Zhouらを参照されたい)。従って、104個の第2段階ウエル582を有する1つのポーチ510が、52個のSNP遺伝子座の全てにおいて個体を完全に分類することができる。
種々の診断適用のアッセイを1つのポーチ内において組み合わせることによって、コストおよびワークフローに関する利点が得られることを理解されたい。例えば、完全呼吸ウイルス用アッセイパネルが細菌同定用アッセイパネルに組み合わされてもよい。これらの組合せは、製造を簡素化する。何故なら、組み合わされるポーチの種類が少なくなるからである。また、このような組合せは、エンドユーザーの仕事を簡素化する。何故なら、診療所に貯蔵される必要がある特別なポーチの種類が少なくなり、また特別の臨床試料に対して誤ったポーチを用いる機会が減るからである。いくつかの適用に対して、これらの利点は、極めて多数のプライマー対を有するポーチを製造するコストの増大を埋め合わせることができる。従って、多数のアッセイパネルを収容するために、100個以上の第2段ウエル582を含む1つのポーチを用いることができる。
[プロセス制御]
高度に多重化されたアッセイの制御は、特に品質が試験当たりのコストと競合しなければならない臨床診断設定において、問題になる場合がある。ポーチ510の高密度アレイ582は、単一処理においてアッセイされる診断標的の数が増加することによって、この問題が大きくなる可能性がある。以下、種々の形式の制御について検討する。
例示的なプロセス制御は、試料をポーチ内に注入する前に、インタクトな生物、例えば、RNA標的を含む生物を患者試料内に混合することを含んでいる。このような標的は、インタクトRNAバクテリオファージ(MS2またはQβ)、インタクト植物RNAウイルス(タバコモザイクウイルス)、またはインタクト酵母中に存在するmRNAとすることができる。RNA標的に特異的なアウタープライマーが第1段階PCR中に存在し、インナープライマーを含有するウエル582が、高密度アレイ中に配置されている。このウエル582内の増幅産物を検出することによって、プロセスのステップの全てが正しく機能していることが確認される。正しい特異的産物が生じたことを確認するために、第2段階増幅後の融解曲線が用いられてもよい。増幅曲線によって決定された交差点(Cp)を用いて、試薬の完全性の定量的測定値を得ることもできる。例えば、Cpが同一ロットのプロセスの異なる時点における他のポーチCpと比較されてもよい。インタクト生物が用いられているが、もし溶解に対する試験が重要でないなら、精製された核酸または単離された核酸が用いられてもよいことを理解されたい。他の状況では、分析の後のステップのみを試験する制御を行うことが望ましい場合がある。例えば、天然または合成核酸鋳型を同族プライマーと共に、高密度アレイのウエル内にスパイキングすることによって、第2段階PCR反応が試験されてもよいし、核酸鋳型を第1段階増幅混合物内の適切なプライマーと共に、第1段階PCR内および第2段階増幅区域のウエル582内にスパイキングすることによって、第1段階PCR反応および第2段階PCR反応が一緒に試験されてもよい。
前述したようなプロセス制御は、標的増幅産物に特異的なプライマーの完全性を試験するものではない。特異的プライマーの完全性を試験する陽性対照の一例として、核酸、例えば、合成RNAの混合物が用いられるが、これは、多くの場合、該混合物の安定性および可変性が良好に制御され、これらの混合物の配列が、環境汚染に起因して存在し得ないからである。倍混合物は、特定のポーチ内に存在するプライマーの各々に対して核酸を含んでいる。診断設定において、この陽性対照は、患者試料を試験するのに用いられたポーチのプロセス終了時に行われるとよい。該混合物は、例えば、患者試料に用いたものと同じロットからポーチに注入され、標的増幅産物の全てが陽性結果をもたらした場合、成功が確定される。陰性対照も同様に行うことができる。すなわち、患者試料を試験するのに用いたポーチのプロセス終了時に、水または緩衝液がポーチ内に注入され、標的増幅産物の全てが陰性結果をもたらした場合、成功が確定される。
診断研究室における個々のワークフローおよびプロトコルを用いて、前述した制御ポーチが処理される前に、患者試料ポーチの処理の数を決定することができる。制御ポーチが処理される頻度とは無関係に、これらの制御は、時間が掛かり、システム全体のコストがかさむ。この理由から、ポーチ内において制御を行うことが有益である。高密度アレイ581の構造は、陰性対照への以下の新規アプローチを可能にする。この例では、核酸、例えば、合成増幅産物が、高密度アレイ581のウエル582aに1つにスパイキングされる。この配列を増幅するプライマーは、このウエル582a内にスパイキングされると共に、アレイを横切って互いに離間された2つの他のウエル682b,582c内にスパイキングされる。例示的に、増幅産物配列およびプライマーは、人工的なものであり、用いられるプライマーのいずれも、偶然に別の標的を増幅しないように設計されている。
清浄な非汚染ポーチ510が装置800内で処理される場合、合成標的を含むウエル582aは、増幅産物を生じ、その結果、陽性と判定されるだろう。対応するプライマーを含む2つの他のウエル582a,582bは、試料中のどのようなものも増幅せず、その結果、陰性と判定されるだろう。ポーチ510は、追加的な制御のためにさらに処理されてもよい。例示的に、この後、高密度アレイをヒータ888に対して保持するブラダー880/882が減圧され、ウエル582の内容物が混合される。例示的な一方法では、ウエル582の内容物は、以下のように混合される。すなわち、ヒータ888を用いて、短時間にわたって、高密度アレイの温度が緩衝液の沸点の上下の温度にサイクル処理される(例えば、85℃×10秒の処理の後に105℃×20秒の処理を行うサイクリングが3回繰り返される)。高密度アレイ581のウエル582内に生じた蒸気の泡が、ウエル582の内容物を第2段階増幅区域のブリスター580内に押し出す。任意選択的に、第2段階増幅区域580の内容物は、ブラダーによって液体をポーチ510の一端から他端に移動させることによって、ポーチの残りの内容物に混合されるとよい。これらのステップの目的は、特異的汚染制御増幅産物をポーチの全体にわたって任意の特異的標的増幅産物と混合することにある。
ポーチがこのように処理された後、ユーザーが誤ってポーチを開いた場合、特異的標的増幅産物および汚染制御増幅産物の両方が放出されることになる。もしこれらの核酸の微量が後のポーチプロセスに混入したなら、機器は、汚染事象を検出することになる。何故なら、合成増幅産物に特異的なプライマーしか含んでいないウエル582b,582cが陽性と判定されるからである。機器内のソフトウエアは、ユーザーに警告し、処理の結果が疑わしいと注意喚起することになる。
汚染を制御する他の方法では、処理の終了時に、第1段階PCR反応および第2段階PCR反応のDNA産物の実質的に全てを破壊するために、DNA分解化学薬品またはDNA分解酵素が添加されてもよい。例示的に、これは、前述した汚染検出方法と同様の手法によって行われるとよい。すなわち、この方法は、第2段階アレイの内容物を局所的沸点を超える温度に加熱し、これによって、増幅された試料をアレイ851のウエル582から引き出し、加熱された液体を第1段階反応の希釈された内容物と混合し、DNA分解物質の一定分量を、例えば、入口チャネル515kを通して、混合物を冷却しながらまたは冷却せずに添加し、PCR反応において生じたDNAの実質的に全てが破壊されるまでDNA分解反応を促すことによって、行われるとよい。これは、当技術分野において知られているように、DNAアーゼ、酸、または酸化剤を用いて行われてもよい。
本明細書に記載されている汚染制御は、いずれも、単独で行われてもよいし、または任意の組合せで行われてもよいことを理解されたい。
[アレイ装填]
図16は、高密度アレイの他の実施形態を示している。高密度アレイ681は、構成に関して、高密度アレイ581と同様である。この例示的実施形態では、高密度アレイ681は、円パターンに配置された102個の第2段階ウエル682を備えている。図示されているように、アレイ681は、アレイに取付けられた層687も備えている。層687は、前述の第2の層587と同様である。しかし、アレイ681は、穿孔層を備えていない。アレイ681は、この実施例のための例示的なアレイであるが、アレイ581および高密度アレイの他の構成も、本発明の範囲内にあることを理解されたい。
前述したような市販のスポッター、例えば、GeSiM社製A060−324 Nano−Plotter 2.1/E(グロッサークメンスドルフ、ドイツ)が、高密度アレイ681を装填するのに用いられてもよい。代替的に、高密度アレイ681は、x/y位置決め可能なスポッター、例えば、ピンスポッター、ドット−マトリックスプリンター、少量自動化ピペット、またはマイクロ流体マイクロ接触スポッターを用いて、スポッティングされてもよい。
図17〜図19は、例示的なスポッター600を示している。スポッター600は、基部601を備えている。基部601に取付けられているのは、ポンプアレイ620である。ポンプアレイ620に隣接して配置されているのは、装填アレイ630である。例示的な装填アレイ630は、96個ウエル付きプレートを受け入れるように構成されているが、他のプレート構成、例えば、384個ウエル付きプレート、1536個ウエル付きプレート、および他の構成のプレートも本開示の範囲内にある。1つまたは複数のバイアルまたは他の構成のリザーバが流体をスポッティングするのに用いられてもよいことも理解されたい。図19に最もよく示されているように、例示的な96個ウエル付きプレート636が、装填プラットホーム635上に着座している。96個ウエル付きプレート636は、多重アレイをスポッティングするためのより大きいリザーバをもたらすために、標準的なマイクロ滴定プレートよりもかなり高くなっている。しかし、図20に示されているように、標準的な96個ウエル付きプレートが用いられてもよい。装填プラットホーム635は、アーム634の作動によって、上下動するようになっているとよい。
図19では、下側位置にあるプレート636が示されている。この位置では、プレート636の上端633は、ストロー641の先端642に接触しておらず、かつ重なっておらず、これによって、プレート636の挿入および取外しが容易になる。図20に示されている装填プラットホーム635は、上昇位置にある。複数のストロー638が、支持体640を通って、プレート636の各ウエル637内に延出している。ストロー638は、支持体640の上方から各ウエル637の底に延出するチュービングである。例示的な実施形態では、ストロー638は、25ゲージのステンレス鋼である。しかし、アレイ681にスポッティングされる流体と適合するどのような材料が用いられてもよい。好ましくは、ストロー638の材料は、ストロー638がウエル637の底まで延びるために、剛性または半剛性になっているとよく、これによって、プレート636の実質的に全ての流体を利用することができる。可能な限り多くの流体を利用するのを助長するために、各ストロー638の先端642は、傾斜して切断され、ストロー638がウエル637に対して封鎖されるのを防ぐようになっている。例示的に、先端642は、30〜60°、さらに例示的には、45°の角度で切断されているとよい。しかし、角度の選択は、ウエル637の形状に依存することを理解されたい。例えば、もしウエル637が平坦な底を有しているなら、30°よりも著しく小さい角度が有用であるが、略円錐状のウエル637は、より大きい角度を必要とする。代替的に、先端642は、ノッチまたは溝を有していてもよいし、ウエル637に対する封鎖が問題になる構成では、ウエル637の底に適合しないどのような形状を有していてもよい。
ストロー638の各々は、支持体640のその該当するオリフィス641を通って上方に延在している。例示的実施形態に示されているように、オリフィス641は、ウエル637と真っ直ぐに並ぶように構成されており、各オリフィス641は、該オリフィス内のストロー638の自由な運動を可能にするように寸法決めされている。錘639が、各ストロー638の上端に取付けられている。各錘639は、先端642をウエル637の底に向かって付勢している。図示されている実施形態では、円筒状の真鍮錘が用いられている。しかし、これは、単なる例示にすぎないこと、および他の形状および他の材料が用いられてもよいことを理解されたい。錘639は、望ましくは、オリフィス641よりも大きく寸法決めされている。これによって、錘639は、プレートが取り外されるとき、支持体640上に置かれ、次のプレートが適所に上昇したとき、各ストロー638を、該ストローがその該当するウエルに進入するように、適所に保持することができる。
例示的実施形態では、各ストロー638は、その該当する錘639を貫通し、可撓性チューブ644に接続されている。しかし、ストロー638およびチューブ644は、錘639の直下または錘639内において互いに接続されてもよいこと、またはストロー638は、より剛性の材料からより可撓性の材料に組成が変更されてもよいことを理解されたい。例示的に、チューブ644は、エラストマー材料、例えば、シリコーンまたはポリウレタンであり、0.012インチの内径および0.025インチの外径を有している。しかし、特定の用途に依存して、他の寸法を有する種々の材料が用いられてもよいことを理解されたい。例示的に、可撓性チューブ644は、エラストマー材料であるが、亀裂または破断を生じることなく充分に可撓性のある他の材料も、本開示の範囲内にある。
図17に最もよく示されているように、複数のチューブ644は、互いに平行になってポンプアレイ620を貫通し、プリントヘッド660まで延在している。図21は、ポンプアレイ620の断面図を示している。第1の空圧シール623が装填アレイ630に近い側に配置されており、第2の空圧シール624がプリントヘッド660に近い側に配置されている。チューブ644は、上支持体621と底支持体622との間に挟まれている。底支持体は、3つの空圧要素を備えている。第1の空圧シール623および第2の空圧シール624は、チューブ644に対してピンチ弁として作用し、必要に応じて、チューブ644を開閉し、流体がウエル637からチューブ644を通ってプリントヘッド660に流れることを可能にする。蠕動ポンプ626は、ポンプヘッド625を備えている。ポンプヘッド625は、点線631によって示されているように、機械中心からいくらか位置ずれし、これによって、特にシール623が閉じ、シール624が開いたとき、流体をプリントヘッドの方向に押し出すことになる。任意選択的に、ポンプ626は、ポンプヘッド625が最初にチューブ644のシール623に近い部分に接触するように、ある角度(図示せず)で傾斜して設けられているとよく、これによって、流体をシール624に向かって押し出すことになる。開口627,628,629は、図17に最もよく示されているチュービング612,613,614に接続されており、チュービング612,613,614は、圧縮ガス源616に接続されている。圧縮ガス源616は、コンプレッサーであってもよく、代替的に圧縮ガスシリンダーであってもよい。シールおよびポンプヘッドを圧縮ガス源によって移動する方向と反対方向に付勢するバネ(図示せず)が用いられるとよい。これによって、チュービングは、わずかな抗力によってその元の形状に回復することが可能になる。例示的実施形態において適切な量の流体を調節するために、略50psi未満の力が必要である。例示的実施形態では、全てのチューブ644内の流体は、単一の蠕動ポンプ626によって同時に送り出され、これによって、略均一な量の流体を各チューブ644を通して移送させることができる。例示的実施形態では、チューブ644は、互いに平行に真っ直ぐ延びており、シール623,624およびポンプ626は、直線状に設けられている。しかし、他の構成も本開示の範囲内にある。
チューブ644を通ってプリントヘッド660に移動する流体の量は、チューブ644の直径、ポンプヘッド625の幅、およびポンプ626によってチューブ644に印加される圧力の大きさによって、決定されることを理解されたい。これらのパラメータの調整は、本開示の範囲内にある。また、当技術分野において知られている他の手段、例えば、ローラ、流体圧ポンプ、電気機械ポプ、および他の計量装置によって、流体をチューブ644を通して送り出すことも、本開示の範囲内にある。
プリントヘッド660は、高密度アレイ681の102個のウエル682と真っ直ぐに並ぶ102個の位置662を備えている。各チューブ644は、位置662の1つに接続されている。96個ウエル付きプレート636は、96個のウエル637の矩形配列であり、その一方、高密度アレイ681は、102個のウエル682の略円形配列である。チューブ644に対して可撓性管を用いることによって、単に特定のチューブ644をプリントヘッド660の特定位置に取り付けることによって、流体をプレート636のウエル637のいずれかから高密度アレイ681のウエル682のいずれかに移送するように構成することができる。図17および図18に示されているように、96本のチューブ644が配置されており、プリントヘッド660上において6つの位置662が空になっている。流体がアレイ681に移送されるとき、図18において6つの未充填ウエル682として示されているように、6つのウエル682は、空のままである。しかし、いくつのストロー638が単一錘639に取付けられ、これによって、プレート636の1つのウエル637がプリントヘッド660上の2つ以上の位置に給液するようになっていてもよいことを理解されたい。もし反応がアレイ681において2通りまたは3通りに行われるようになっているなら、プレート636の各ウエル637に2つまたは3つのストローを配置し、プレート636のより少ないウエル637を用いることが望ましいこともある。102個のウエルを有するプレートが、流体をストロー638を通して移送するために用いられてもよいことを理解されたい。再構成も本開示の範囲内にあり、もしスポッター600が多数の異なるアレイ681に用いられるなら、再構成が望ましい。また、プリントヘッド660および対応するアレイ681の構成は、単なる例示にすぎず、プリントヘッドがアレイの一部または全てと略真っ直ぐに並んでいるなら、プリントヘッドおよびアレイの他の構成も本開示の範囲内にあることを理解されたい。例えば、図15に示されているようなアレイ581と真っ直ぐに並ぶように配置されたプリントヘッドも、本開示の範囲内にある。また、極めて小さいウエルを有する極めて高密度のアレイの場合、プリントヘッド上において接触できないほど小さい滴を形成することは、実際的ではない。このような場合、2つ以上のプリントヘッドを用いて、各々をアレイの該当する部分を装填するように用いることが望ましい。
図19に最もよく示されているように、各チューブ644は、プリントヘッド660を貫通しており、これによって、各チューブは、プリントヘッド660の直下においてオリフィス645で終端している。例示的実施形態では、このオリフィス645を設けるために、金属管の小片が各チューブ644の端に設けられている。この金属管の小片は、例示的に、ストロー638に用いられているものと同じ金属管であり、プリントヘッド660を貫通していてもよいし、または貫通していなくてもよい。例示的に、オリフィス645の端643は、滑らかな平面に研磨されており、これによって、光を反射し、以下に述べるように、滴692の視覚化を助長するようになっている。例示的実施形態では、250μmのオリフィスが用いられている。このオリフィスは、0.1〜10.0μL、さらに例示的には、0.5〜1.0μLの流体の滴を形成し、かつ支えるのに十分な表面張力をもたらすように寸法決めされている。しかし、これは、単なる例示にすぎず、他の大きさのオリフィスおよび滴も本開示の範囲内にある。図27に示されている代替的実施形態では、各チューブ644aは、プリントヘッド660aで終端していてもよいし、またはプリントヘッド660a内で終端していてもよく、プリントヘッド660aが、突起677aを備えていてもよい。突起677aは、例示的に、プリントヘッド本体と一体に形成されている。突起677aは、滴の視覚化を助長するために、黒色または他の色に塗装されているとよいが、金属被膜を備えていてもよい。オリフィス645aは、流体の移送を助長する材料から形成されていてもよいし、または該材料によって被覆されていてもよい。例えば、もし流体が水性の場合、疎水性材料から作製されたプリントヘッドが用いられるとよい。一例示的実施形態では、プリントヘッド660aは、Teflon(登録商標)から作製されているとよく、または他の材料、例えば、Teflon(登録商標)被膜を有するステンレス材料から作製されていてもよい。このような材料は、オリフィスがプリントヘッド自体に設けられている実施形態(図27)に用いられてもよいし、またはプリントヘッド660への流体の移送を低減させるために、各チューブ644がプリントヘッド660を貫通している実施形態(図19)に用いられてもよい。さらに、図25に示されているように、静電効果を低減させ、プリントヘッド660から滴の移送を助長するために、脱イオン装置680が設けられてもよい。
ポンプ626が作動すると、流体は、プレート636のウエル637から移動し、これによって、滴692が、チューブ644を介してウエル637に接続された各オリフィスに形成される。図17に最もよく示されているように、例示的には光源およびカメラを備える撮像システムが設けられている。光源672が、滴692を照明するために設けられている。光源672は、例示的には、高入射光源であるが、他の構成も可能である。例示的には基部601の開口668の直下に取付けられたカメラ670が、滴692を撮像するようになっている。図22は、(図26に示されている)ディスプレイ695に表示されたプリントヘッド660の底面661の画面コピーである。この画面コピーは、チューブ644に取付けられた96個のオリフィスの各々に付着した滴692を示している。プリントヘッド660上に102個の位置662があり、例示的な実施例では、ウエル637当たり1つのストロー638しか用いていないので、6つの位置662には、滴692が存在しておらず、6つのチューブオリフィス645を示している。残りの96個のオリフィスは、それぞれの滴692によって暗くなっている。図23は、空の位置691によって示されているように、20個の滴が欠落し、さらに多い20個のチューブオリフィスが露出している以外は、図22と同様である。
カメラ670は、プロセッサ694に接続されている(図26参照)。プロセッサ694は、例えば、体積(4/3πr3)を概算し、許容できる体積範囲と比較することによって、全ての滴692が充分であるかどうかを決定するようにプログラム化されている。このプログラム化は、滴を不十分にする可能性がある泡の検出を含んでいるとよい。一例示的実施形態では、プロセッサは、以下のステップ、すなわち、
(1)滴形成の前にプリントヘッドの画像を取得する信号をカメラ670に送信するステップと、
(2)滴がプリントヘッド660上に存在していないことを確認するために、画像を検証するステップと、
(3)もし滴が存在していたなら、ソフトウエアが、ユーザーに注意を換気し、もし滴が存在していなければ、滴692を生成する信号をスポッターに送信するステップと、
(4)滴692を有するプリントヘッドの第2の画像を取得する信号をカメラ670に送信するステップと、
(5)滴692の適切な位置および大きさを確認するために、画像を検証するステップと、
(6)もし滴692がステップ(5)における検証において適格性を満たしていなかったなら、ソフトウエアが、ユーザーに注意を喚起し、もし適格性を満たしていたなら、アレイ681をプリントする信号をスポッター600に送信するステップと、
(7)アレイ681がプリントされた後、ソフトウエアが、滴のないプリントヘッド660の第3の画像を取得する信号をカメラ670に送信するステップと、
(8)滴がプリントヘッド660上に存在していないことを確認するために、画像を検証するステップと、
(9)ソフトウエアが、ステップ(8)における検証の状態をユーザーに知らせるステップと、
を含むように、プログラム化されるとよい。
ステップ2,5、8において滴の存在および不在を検証するために用いられる画像解析は、標準的な2値化閾値技術によるものである。
ステップ5における滴形成の検証の一部として、一例示的実施形態では、画像は、各滴の位置および距離(単位:ピクセル)を決定するために解析される。ソフトウエアは、各滴の中心の位置がオリフィス641の中心の所定距離内にあることを検証する。次に、ソフトウエアは、滴の各々の半径を決定し、該半径が下側閾値よりも大きいことを検証し、これによって、各ウエルに存在するプライマーの量がPCR増幅に充分であることを確認し、該半径が上側閾値よりも少ないことを検証し、これによって、滴がアレイ681の標的ウエル682の外側に堆積しないことを確認する。下側および上側閾値は、用途において許容される滴に対応する流体の範囲を規定するものであり、1%、2%、5%、10%、15%、20%、または任意の他の百分率であってもよい。
ステップ5における滴形成の代替的な検証として、滴は、撮像されるときにマスクを付されるとよい。具体的には、各滴に円形マスクが付されるとよい。標準として半径を用いるよりも、むしろマスクが用いられる。もし滴が完全にマスクの円を満たし、かつ該円を超えていないなら、滴は、検証において適格性を満たしたことになる。もし滴が半径を完全に満たしていないかまたは該円を超えていたなら、滴は、検証において適格性を満たしていないことになる。円ラインは、閾値をもたらすように選択される。厚い円ラインは、大きな範囲をもたらし、薄い円ラインは、小さい範囲をもたらすことになる。
代替的に、画像の視覚的検査は、全ての滴692が充分であるかどうかを決定するために用いられるとよい。もし全ての滴692が充分であったなら、これらの滴は、アレイ691に移送されるとよい。視覚化を助長するために、望ましくは、流体内に着色染料または蛍光染料を含ませるとよい、代替的または付加的に、オリフィス641の端643は、光を反射し、視覚化を助長するために、滑らかに研磨されているとよい。もし蛍光染料がPCR検出に用いられるなら、望ましくは、この染料を視覚化するかまたはPCRの蛍光と干渉しない視覚化をもたらす他の染料を用いるとよい。例えば、LCGreen(登録商標)PlusがPCR検出に用いられるとよく、その一方、IRDye(登録商標)(Licor社、リンカーン、ネブラスカ州)が滴の視覚化に用いられるとよい。他の染料も当技術分野において知られている。任意選択的に、プリントヘッド660、アレイ681、またはこれらの両方は、各滴692から充分な量がプリントヘッド660から移送されたかどうかを決定するために、移送の前に視覚化されるとよい。
もし滴692が、所定の標準を満たさなかったことによって不十分な場合、該滴は、前述したようにアレイ681に移送されてもよいが、このアレイ681は、廃棄されるとよい。代替的に、不十分な滴692は、拭い取りまたは他の手段によって、プリントヘッド660から除去されてもよい。
他の構成部品がよく見えるように、配置アーム652は、図17および図19の手前側から省略されている。しかし、配置アームは、図18、図24および図25に最もよく示されている。配置アーム652は、アレイ681を受け入れるためのプラットホーム653を備えている。アレイ681は、1つまたは複数、好ましくは、2つ以上の開口655を備えており、これらの開口を通って、位置合せピン654が延出するようになっている。開口655は、さらに確実な位置合せのために、位置合わせピン654にスナップ嵌合するように構成されていてもよい。代替的に、アレイ681を受け入れるための凹部が設けられてもよい。プラットホーム653上へのアレイ681の適切な配置のための他の方法も本開示の範囲内であることを理解されたい。もし滴が所定の基準を満たすことによって充分であると決定されたなら、配置アーム652が上方に移動し、これによって、アレイ681の各ウエル682が、その該当する滴692と接触して配置されることになる。いったん接触したなら、各滴692とその該当するオリフィス645との間の表面張力が失われ、滴692は、その該当するウエル682に移送される。次いで、充分な流体がプレート636のウエル637の各々に満たされているならば、配置アーム652が降下し、アレイ681が取り外され、プロセスが繰り返される、滴692が移送された後、アレイ681は、アレイ581に関して前述したように処理され、次の段階として、本明細書において説明したポーチのいずれかに用いられることになることを理解されたい。
図24および図25は、1つの例示的な配置アーム652の詳細を示している。この実施例では、配置アーム652は、平坦な4バー機構664を備えている。この機構664において、カプラーリンク656がプラットホーム653を回転アーム659に接続している。カプラーリンク656は、取付点649において従動リンク658に連結されていると共に、取付点648において回転アーム659に連結されている。回転アーム659は、取付点647において上構造体605に取付けられており、従動リンク658は、取付点650において上構造体605に取付けられている。取付点647,648間の距離にわたって延存する短小リンク669が設けられている。上構造体605は、4バー機構の接地リンクとして機能している。例示的実施形態では、このリンクの長さは、高密度アレイ581がプリントヘッド660に接触する直前に垂直方向に移動する中関節曲線(coupler curve)に追従するように、選択されている。この垂直運動は、各滴692が、接触する直前の運動が垂直でない場合に生じ得る二次汚染を最小限に抑えながら、その該当するウエル682に接触するようになっていると、望ましい。また、この中関節曲線運動は、カメラ670の開口668がプリントヘッド660の直下に配置されているので、有益である。プラテン663が、回転接合点646においてカプラーリンク656に接合されている。回転接合点646は、アレイ681とプリントヘッド660との間に平坦な位置合わせをもたらすように、調整されるとよい。位置合せが設定された後、回転接合点646は、位置合せを継続させるために、固定されるとよい。図19に示されているように、2つの同一の平坦な4バー機構664が、1つが上構造体605の片側に位置するように、設けられている。これらの4バー機構664は、図25に示されているように、プリントヘッド660におけるアレイ681の適切な位置合せをもたらすように2つのドライバーリンク657を一緒に回転させる同期性が得られるように、係止されている。平坦な4バー機構664が単なる例示にすぎないこと、およびアレイをプリントヘッド660に配置する他の方法、例えば、他の手動および自動手段も本開示の範囲内にあることを理解されたい。
プリントヘッド660は、ポンププレート667に取付けられており、ポンププレート667は、ポンプアレイ620に取付けられている。ポンププレート667は、ポンプアレイ620に対して移動可能であり、これによって、カメラ670に対して位置合せを行うことができるようになっている。代替的に、ポンププレート667は、ポンプアレイ620に対して多重取付け位置を備えていてもよく、これによって、横方向の位置決めを行うことができる。このような横方向位置決めによって、任意選択的に、プラテン663上に互いに隣接して着座した多数のアレイ681が単一のポンプアレイ660によって充填されることが可能になり、またはポンプヘッド660が、最初に1つの位置でプリントし、次に第2の位置でプリントすることによって、より大きいアレイをプリントすることが可能になる。
図24および図25は、カメラ670のための例示的な構成を示している。この例示的実施形態では、カメラ670が水平に取付けられており、開口を通して受けた画像を反射するために、ミラー674が用いられている。しかし、他の構成、例えば、制限されるものではないが、ミラーの省略および開口668下におけるカメラ670の垂直取付けは、本発明の範囲内にあることを理解されたい。カメラ670を保護するために、底ケーシング604が設けられている。基部601の上方にある多くの構成部品を保護するために、上ケーシング(図示せず)が用いられてもよい。しかし、このような上ケーシングは、アレイ681およびプレート636の比較的容易な挿入および取外しを可能にするようになっていると好ましい。
図22および図23に戻ると、複数のスタンドフ675、例えば、6つのスタンドオフ675がプリントヘッド660に作り付けられている。しかし、他の数のスタンドオフが用いられてもよい。層687がアレイ681に取付けられるとき、多くの場合、アレイ681がいくらか湾曲することが見出されている。スタンドオフ675は、ウエル682への滴692の移送中に、アレイ681をプラテン663に対して平坦に押すように機能するものである。
図26は、アレイをスポッティングするためのシステム698のブロック図である。システム698は、コンピュータ装置696を備えている。コンピュータ装置696は、1つまたは複数のプロセッサ694、メモリ(図示せず)、コンピュータ読取可能な媒体(図示せず)、1つまたは複数のHMI装置(例えば、入力−出力装置(図示せず)、ディスプレイ695、プリンター(図示せず)、など)、1つまたは複数の通信インターフェイス(図示せず)、などを備えているとよい。コンピュータ装置696は、スポッター600に通信可能に連結されているとよく、スポッター600は、圧縮ガス源616に連結されているとよい。コンピュータ装置は、システムの1つまたは複数の構成部品、例えば、ポンプアレイ620,配置アーム652、装填プラットホーム635、撮像システム676、または任意の組合せを制御するようになっているとよい。システムは、種々の構成部品が手動によって作動されるように構成されていてもよいことを理解されたい。
スポッター600は、全てのウエル637が洗浄溶液を含むプレート636を挿入し、全ての洗浄溶液がオリフィス641から出るまで、ポンプ626を作動されることによって、洗浄されるとよい。洗浄溶液を収集するために、容器がプリントヘッド660の下方に配置されるとよい。
本発明を好ましい実施形態を参照して詳細に説明してきたが、変更形態および修正形態は、以下の請求項に記載され、かつ規定されている本発明の範囲および精神に含まれることになる。