JP2536945B2 - Ｐｃｒ用の封入キュベットおよびその使用方法 - Google Patents

Ｐｃｒ用の封入キュベットおよびその使用方法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明はPCR技術を利用して、核酸の増幅および検
出を、増幅された核酸を環境に露出することなく、実施
することができるキュベット（cuvette）に関する。
〔従来の技術〕
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）はDNA等の、単一の細胞
のように小さなものから頻繁に抽出される核酸材料が数
億という複製物に増幅されるのを可能とする。これは、
PCR技術の開発の前は、単一のDNAのストランドを検出す
るということは夢にも考えられなかったことであるか
ら、重要なことである。しかしながら、単一のDNAスト
ランド（例えば、ヒトの免疫欠陥ビールス（HIVとい
い、AIDSを引き起すものとして知られている））のDNA
が選定されたDNAを増幅する増幅試薬に加えられると、
そのDNAの何億という複写物が比較的に短期間のうちに
得られる。それどころか、増幅された核酸材料（例えば
DNA）の検出のため、選定された増幅材料にハイブリッ
ダイズするプローブを使用することを可能とし、そのよ
うなプローブは固体支持体（例えば、フィルタ膜）に固
定若しくは固定可能にされており、酵素もしくは他の成
分を使用して検出するためラベル（標識）を付けられて
いる。
通常はこれは、封止されたプラスチックコンテナ内
で、所望の数の複製が得られるまで、核酸材料を増幅す
ることにより達成される。その後、キュベットは封止を
破ることにより再度開けられ、増幅された複写体が取り
出され検知装置に送られるか、又は検知剤が増幅を行っ
たコンテナに印加され、検出は同一のコンテナ内で実施
される。
〔発明が解決しようとする課題〕
この方法はPCR技術を簡便に広範に使用するには不充
分であり、それはエーロゾルが開封若しくは流体の搬送
の過程で発生することによる。エーロゾルは増幅された
核酸材料（即ちDNA）を幾分含んでいる。そして、エー
ロゾルは環境中に分散されることになる。環境中のその
ような微量の分子についてはあまり注意が払われていな
かった。しかしながら、たった一つのDNA分子であって
も検出に未使用の他の増幅コンテナを破壊するおそれが
ある。即ち、オペレータの不注意により、迷出してきた
DNA分子が検査の未了のコンテンナに浮遊し、もしくは
運ばれてくると、そのたった一つの分子が次の増幅を行
わしめるのに必要なDNAとなる。言うまでもないことで
あるが、次の試験のポイントで特定のDNAが存在してい
るのが（例えばHIVの存在）分かったら、そしてこれが
迷出DNAが原因であり、患者のそれが原因でないことが
分かっただけで、その試験は無駄になってしまうことに
なる。即ち、DNA複製の能力が高いことが誤試験の主た
る原因となるのである。実際問題としてどの研究施設で
も、サンプルが既に増幅されたコンテナの封止がされて
いないことが汚染の原因であることが認められている。
そのような問題は熟練度の高い人を使用し、エーロゾル
の発生を最小となるように努力することで、避けること
はできようが、そのような熟練労働が必要なことはこの
技術を一般的な応用するためには障害となる。
従って、この発明の目的は、周囲の環境を汚染するこ
となく核酸材料の増幅及び検出を行うことができる装置
及び方法を提供することにある。
この発明の他の目的は検知工程を自動化し、オペレー
タの介入の必要性を最小とすることにある。増幅した核
酸材料を運搬したり、検知試薬を印加したるすることは
自動化を困難とするものである。
〔課題を解決するための手段〕
この発明は次のことを基本解決原理とするもので、そ
れは、どのような増幅核酸材料といえどもこれが逃れる
ことができないようにキュベットに増幅試薬及び増幅核
酸を閉じ込めておくことにより汚染を防止することがで
きるということである。
更に特定すると、この発明の目的を達成する、この発
明の一つの実現形態である、核酸材料の増幅および検出
を実施するための閉鎖した、使いすて型のキュベット
は、核酸材料と増幅試薬とを含有した反応室を含んだ複
数の隔室と、約30℃から約95℃の範囲の温度を通じて前
記反応室の内容物を能動的に若しくは受動的に循環せし
める手段と、少なくとも一つの検出材料と共に使用する
ように前記反応室に近接して位置する少なくとも一つの
収納室と、圧力が反応室の内容物に印加されたときに前
記隔室を所定の順序で相互に流体的に連結する手段とを
具備しており、前記隔室は全てキュベットの外側の位置
に対して流体に対して閉鎖されており、前記隔室の少な
くとも一つはその中の検出地点において増幅の後の検出
のため核酸材料を不動にするための手段を具備してお
り、増幅された核酸の検出を増幅された核酸材料による
他のキュベットもしくは装置の汚染なしに行うことがで
きることを特徴とする。この構成の効果は増幅した核酸
材料の検出を、濃縮された核酸材料によりコンテナもし
くは装置の汚染なしに、実行することができることであ
る。
上記において、この発明の目的を達成するため前記反
応室の試薬成分は核酸材料、ポリメラーゼ酵素、プライ
マー核酸およびニュークレオチドより成る。
この発明の目的を達成する、この発明の他の実現形態
である、DNAを増幅および検出する装置において、
（１）複数の隔室と、これを少なくとも一つの他の隔室
に相互に製造するための手段とを有するキュベットを有
し、該キュベットは（ａ）DNAストランドを増幅するた
めの少なくとも一つの反応室と、（ｂ）増幅されたDNA
を検出し、検出地点を具備する少なくとも一つの検出室
と、（ｃ）検出された材料を増幅されたDNAストランド
に伝達する手段とを備え、（ii）約30℃から約95℃の温
度範囲を通して反応室の内容物の積極的若しくは受動的
な循環を許容する手段を具備し、（iii）増幅のためサ
ンプルDNAを前記反応室に対する注入を許容するため、
前記少なくとも一つの反応室にのみ連結される液体アク
セス手段を具備し、（iv）サンプルDNAの注入の後にDNA
の通過に対して前記キュベットを遮断する手段を具備
し、更に少くとも検出材料およびDNAストランドを検出
室におよび検出部位に移動する手段を具備する。一旦DN
Aサンプルが隔室に導入されアクセス開口が閉鎖される
と、隔室内の流体内容物は運転者及び環境との接触が起
こらないようにに増幅期間及び検出反応の期間は拘束さ
れる。
この発明の目的を達成する、更に別の実現形態であ
る、環境を汚染するエーロゾルが外部に流出することを
許容することなしに閉鎖キュベットにおいて核酸材料を
増幅しかつ検出する方法は、（ａ）核酸材料のサンプル
をキュベットに注入し、該キュベットは、増幅試薬が存
在する反応室と、検知材料と共に使用する収納室と、検
知地点を含む少なくとも一つの室とを含む多数の隔室並
びに流体の伝達を行わしめるため前記隔室を相互に連結
する手段を具備し、（ｂ）核酸材料を包含する前記キュ
ベットの部分を恒久的に遮断し、全ての核酸をそのキュ
ベットに封入し、（ｃ）前記試薬が有効となる所定の温
度変化にわたってキュベットを循環させることにより核
酸材料を増幅し、（ｄ）増幅された核酸材料を前記反応
室から前記検知地点に流体的に搬送し、（ｅ）検知材料
を前記検知点に流体提供に搬送し、並びに（ｆ）前記地
点において増幅された核酸材料を前記検知材料と共に検
出し、同時に核酸材料は前記キュベット中に封入維持す
ることを特徴とする。
この発明を以下特に好ましい構造のキュベットを使用
してDNAの増幅及び検出をするPCR技術に使用する場合に
ついて説明する。しかしながら、核酸の増幅のどのよう
な方法に応用したとしても有効であり、いかなるキュベ
ットでも、どのようなソースからであっても、増幅した
核酸材料がいかなる構造かを問わずキュベットから逃げ
るのを防止する装置若しくは方法である限りは、どのよ
うなソースからも核酸材料の増幅を行うことができる。
核酸材料は、例えば、プラスミド若しくはクローン化さ
れたDNA若しくはRNA、又は天然のDNA若しくはいかなる
ソースからであるとをとわずDNAから得ることができ、
そのようなソースとしてはバクテリア、イースト、ビー
ルス、ビールスやバクテリアに侵された細胞、植物若し
くは動物である。DNA若しくはRNAは血液若しくは組織の
材料から抽出することができる。転写に基ずく増幅と称
され、PCR法は異なった方法もこの発明の封入キュベッ
トの利益を享受することができ、この転写に基ずく増幅
方法は1989年１月の米国のProc.Natl.Acad.Sci誌1173-1
177頁（Biochemistry）に記載されてある。
PCR技術 核酸増幅技術は一般的にいえば特定のプロトコルを介
して進められている。最も有益なプロトコルは米国特許
第4,683,195号に示されるものである。手短にいうと、
このプロトコルはDNAの増幅を次のステップから行うも
のである。
（１） 関心のある配列を持つ少なくとも一つの特定の
核酸を含有する候補となるサンプルを得る。
（２） サンプルを変性させ、ストランドを分離する。
（３） サンプルをプライマー、ポリメラーゼ等の延長
酵素、核酸の複製に有益な増幅成分と接触させる。
（４） 上記２及び３のステップを必要な回数だけ繰り
返えす。
（５） 増幅されたDNAを検出する。
このクラスにおける好ましいプロトコルは次のように
なっている。
（１） 適当な制限酵素を使用することにより完全なDN
A二重らせんを必要に応じてで化学的に切断し、関心の
ある部分を分離する。
（２） 分離された核酸の部分（ここではDNA）及びニ
ュークレオチドは加熱を受け、かつある時間（約10分よ
り長くない時間）これを維持され、二つの核酸のストラ
ンドを変性させ、即ちこれらストランドをほどき、分離
し、テンプレートを形成する。
（３） それから溶液が30℃−60℃の範囲で冷却され、
プライマーをアニールし、もしくは二つの各テンプレー
トストランドを結合する。このため溶液は”培養”領域
において適当な温度、例えば55℃、に約15秒の間保持さ
れる。
（４） 次いで、溶液は加熱され70℃に維持され、延長
酵素（好ましくは熱に安定なポリメラーゼ酵素）は、
そこに存在するデオキシリボニュークレオチドを使用す
ることで、プライマーの境界をテンプレートストランド
まで延長せしめる。
（５） 完成した新規なストランド対は再び92℃−95℃
に約10-15秒にわたって加熱を受けこの対は分離せしめ
られる。
（６） ステップ（３）−（５）が適当な数のストラン
ドが得られるまで何回も繰り返えされる。繰り返えしが
多いほど生成される核酸（ここではDNA）の増幅数が多
くなる。好ましい設定により、所望の濃度の核酸濃度を
最小時間で達成することができ、各サイクルが１秒で起
る。しかしながら、１サイクルを５分のように長い時間
で行うことができる。
ここで使用されるプライマーという用語は天然にある
ものであると、合成されたものであるとを問わず、オリ
ゴニュークレオチドのことであり、核酸ストランドに相
補的なプライマー延長生成物の合成が惹起される条件に
おかれたとき合成を開始する開始点として挙動すること
ができるものである。そのような条件はニュークレオチ
ド（例えば４つの標準のデオキシリボニュークレオチド
トリフォスフェート）及びDNAポリメラーゼのような重
合試薬の存在と、適当な温度並びにpHが必要である。一
般的にいって、この発明において使用される各プライマ
ーは15〜40のニュークレオチドを具備しており、そして
好ましくは20から25のニュークレオチドを具備してい
る。
以上の全ては、キュベット（cuvette）内で、約30℃
と95℃との間の温度の時間を使用して行われた。この発
明のキュベットはPCR技術を技能者によってその技能が
低くても正確に日常的に行わしめる実質的なアプローチ
を提供することにある。この発明の完全な理解のため、
この発明で実施されたPCR技術の詳細をまず説明する。
どのようなDNAであっても数億回もの複製が実行され
る。適当なプライマー核酸ストランドを設定することに
より、最適条件の下で、選定されたDNAが第１に複製さ
れることを確保することができる。好ましくは、全ての
プライマーはキュベットに組み込まれるときビオチン化
され、以下述べるように進行するのが検出される。今は
プライマーに付着される目標のDNAを延長酵素の存在の
下で加熱することにより選定されたDNAの複製を具備す
る二重ストランドが生成される。かくして形成された新
規な対は次に高温度の短時間の変性を行うことにより分
離される。これらは、一つの反応室で行われるが、その
際、プライマー、デオキシリボニュークレオチド及び延
長酵素がDNAに印加される予め組み込まれる試薬として
か、又はサンプルの印加時に存在していることが必要で
ある。組み込まれているとき、試薬は噴霧もしくは乾燥
によって印加することができ、ポリメラーゼ、塩基、バ
ッファ、安定剤、及び複製に必要なニュークレオチドが
含められる。
ポリメラーゼ酵素はそのソースに拘わらず有益であ
る。好ましくは、以後TAQと称するサーモスアクアテッ
クス（thermus acuaticus）から天然に製造されるも
の、もしくはEPO公報第258,017号に例えば記載されるよ
うに、遺伝学を下に工業的に作られるどのような合成的
な等化物とすることができる。
酵素の存在は熱循環を急速に行わせ、高温度での滞在
時間が短縮される必要があることに注意されたい。92℃
から95℃の変性温度は酵素の反応を停止する温度に近
く、長い加熱時間となる。
その後、複製されたDNAが特定されるが、これはDNA
を、適当な検出印加若しくは包含された検出室に移動す
ることによって行われる。公知技術では、複製されたDN
Aのような“移動”ないしは検出プローブとしての試薬
の添加によりDNAを含む反応室の再開放が必要となり、
上述のエーロゾルの問題を発生せしめる。この検出方式
では複製されたDNAストランドにニュークレオチドの相
補的な配列を介して接合することができる通常の材料を
使用している。そのような材料は検出点、例えば検出
室、でDNAをトラップしかつ保持するのに使用される適
当な手段を包含する。好ましくはそのような手段はトラ
ップされる膜ないしはビードの構造をもっている。
検出においては一般的にいって固定材料および信号発
生材料が必要である。好ましくはDNAの複製に使用され
るプライマーはビオチン化が既にされており、不動材料
もしくは信号発生材料のどちらかに付着されるアビディ
ンと反応することができる。もしアビディンがビードの
ような不動材料に付着されると（以後アビディン−ビー
ド捕捉方法）検知プローブが複製されたプライマーとハ
イブリッダイズするニュークレオチド配列とともに使用
することができ、この複製プライマーは放射性となるこ
となどによって自ら信号を発生しもしくは信号を発生す
る試薬と反応する。例えば、いかなるものでもよいが適
当な信号発生成分に検出プローブは取り付けることがで
き、そのような信号発生成分としては、検知可能な信号
（例えば色変化）を生成する無色（leuko）染料と反応
することができる西洋ワサビパーオキシダーゼ（horser
adish peroxidase）等の酵素が好ましい。信号発生成分
もしくは固定材料を３′もしくは５′末端でプローブに
付着させる技術は公知である。例えば、Nucleic Resear
ch誌、vol 15、5303頁（1987年）の"Efficient Methods
for attachment of Thiol Probe to the 3′End of Sy
nthetic Oligodeoxy-ribonucleotides"という文献であ
る。この文献で述べられている５′末端結合は枝葉であ
り、次のもの、Analytical Biochemistryのvol.164、第
336頁（1987）の"Introduction of 5′Termminal Funct
ional Groups....."だけが重要なものである。容易に明
らかなことは３′もしくは５′端部のいずれもが不動材
料の信号発生成分に付着するのに使用できることであ
る。
ここに使用する“プローブ”という用語は、プライマ
ーのようには挙動しないが、ハイブリッダイズ製造物を
形成するように一つ若しくはそれ以上の核酸の配列と実
質的に相補的となるように意図された、天然にある若し
くは合成されたオリゴノニュークレオチドのことをい
う。さらに、プローブとは得られたハイブリット製造物
の“捕捉”若しくは“検出”のいずれをも一般的には意
図している。
これとは別に、検出プローブおよび不動プローブは同
一のものとすることができ、前述のAnalytical Biochem
istryの開示技術を使用して、例えば５′末端だけに結
合することができる。
上述のように、アビディンは、西洋ワサビパーオキシ
ダーゼ等の、以後“オリゴキャプチャー（oligo captur
e）”方法と称する信号発生材料に結合される。このよ
うな場合、DNAの固定化は好ましくは固定プローブによ
り行われ、ここに固定プローブは、複製されたビオチン
化プライマーとハイブリッダイズするニュークレオチド
配列である固定プローブにより達成するのが好ましく、
そのような配列はポリマービードに結合される。
かくして、ここに述べた“検出材料”とは複製され
た、ビオチン化プライマー上のプローブを意味し、この
プローブは検出可能な信号をそれ自体で発生するか、検
知可能な信号を生成するため試薬と反応するものであ
る。この後者の場合は検出材料はそのような試薬も含有
する。
全の検出材料を含有したキュベットは増幅をされたDN
Aと共に撹拌され若しくは振動され、混合を促進する。
目標DNAへのプローブのアニーリングは通常の温度循環
により達成される。
DNAへのプローブのハイブリッダイズは、トランスフ
ァーに先立ちもしくはその後に検出地点（もしこれが設
けられていればの話であるが）に対して行われる。
その後全の液体は検出地点から取り出される。この点
において検出材料のある程度は複製されたDNAストラン
ドの一部であり、DNAは膜の表面によって補足される。
どんなDNAストランドでもこれを固定する手段を欠如し
たものは膜を越えて通過してしまう。
最終ステップは検出隔室に対して膜上に捕捉されたDN
Aストランドから突出する検知材料と反応することがで
きる無色染料もしくは他の染料前駆体を含有する検出隔
室に注入する。有益な無色染料としては、ポリ（ビニー
ルピロリドン）等の可溶性のポリマーと好ましくは組み
合せされる、米国特許第4,089,747号に説明されるもの
がある。染料の好ましい例は２−（４−ヒドロキシ−3,
5−ヂメトキシフェニール）−4,5−ビス（４−メトキシ
フェニール）イミダゾールであり、というのはこれは西
洋ワサビパーオキスダーゼの１分子に対して1000個の染
料分子を付加することができるからである。
上に述べたようにDNAはビード上においてプローブ結
合もしくはハイブリッダイズすることができる。ビード
は検出膜によって捕捉されるべく選定される。そのよう
なビードの有益な材料としてはDNAにハイブリッダイズ
するアビディンもしくはプローブのどちらかに結合され
る有効な反応グループを持つどのようなポリマーをも含
むことができる。そのようなポリマー上の活性なハロゲ
ン原紙、２−置換活性エチルスルフォニールもしくはビ
ニルスルフォニール介したアビディンの通常の共有結合
が公知である。かくしてｍ及びｐ−（２−クロロエチル
スルフォニールメチール）スチレンのコーポリマー等が
ビードのために有効である。
上記の工程を実際的とするこの発明の二つの鍵となる
点がある。その第１は有効な熱伝達を使用し、反応室の
内容物が迅速に加熱され、それから迅速に冷却されるよ
うにすることである。積極的もしくは受動的な加熱もし
くは冷却を行わしめる手段は、積極的もしくは受動的な
循環を行う場合には有効である。即ち。ペルチエ（Peli
tier）の装置を、該室を区切る熱伝達壁を提供するよう
に反応室に取り付けることができる。しかしながら、好
ましくは、熱伝達は受動的な手段により達成することが
でき、この場合は、熱伝達材料は反応室の主要平面であ
る。次いで、熱ソースもしくはシンク最も好ましくはキ
ュベットの両面にある外部ソースから供給される。
第２の鍵となる点はキュベットの隔室を増幅された核
酸が逃れるのを防止するように構成することである。即
ち、隔室は増幅の発生後は環境に対して漏洩しないよう
にシールする必要がある。好ましい構成は、隔室にDNA
の導入の前に全の試薬を予め組み込み、かつ固定手段に
よりDNAの導入の後の漏洩に対するキュベットのロック
をする。この実施例では、好ましくは印加圧力を使用し
て閉鎖されたキュベット内における隔室間で液体連通せ
しめ、必要な反応を得るための手段が設けられる。
熱循環 第１に好ましい熱伝達機構、即ち隔室の壁面による受
動的な熱伝達、を考慮すると、壁の材料は高い熱エネル
ギ伝達係数を提供する所定の熱路長及び熱抵抗が得られ
るように選定される。最も好ましくは、そのような進路
は約0.3mmより大きくはなく１平方cmの断面積での熱抵
抗はワット当たり約5.0℃より大きくない。これらの性
質は熱伝達壁をプラスチック、もしくはプラスチックお
よび厚みが0.05mmのアルミニューム等の金属のラミネー
トにより構成することにより容易に達成される。そのよ
うなアルミニュームは厚みχ／（熱伝導率Ｋ×表面積
Ａ）として計算される、約0.003℃/wattとして計算され
る熱抵抗Ｒを具備している。（これらの値は、約0.24℃
／ワットの熱抵抗を持つ同一の厚みの通常のグラスと対
比することができる。プラスチックは好ましくは熱シー
ル可能なポリエステル、例えばポリ（エチレンテレフタ
レート）、であり、その片側もしくは両側に中間の密度
のポリエチレンが被覆してあり、好ましい厚みである0.
005cmで1.06℃の熱抵抗を持っている。
熱伝達壁は適当などのような手段によっても他のキュ
ベット平面に固定することができる。そのような手段の
一つは初期接着剤（priming adhesive）であり、これは
例えば通常の高温度のアクリル系接着剤に通常のポリエ
ステル接着剤の層が継続したものである。これらの層は
熱伝達変速機の表面領域にわたって延びており、そのよ
うな延長部はアルミニュームを使用している場合はキュ
ベットの内部で起る反応と干渉することを防止すること
ができる。これとは別にプラスチック層をアルミニュー
ム上に被覆することができる。
そのような熱搬送壁により構成されたキュベットは約
200μｌの液体容積のために、約10秒より長くない熱時
定数（τ）を得ることができると分かった。最も好まし
くはγが３−８秒の程度である。即ち、水で充たされた
このキュベットが熱伝達壁の外部に沿って加熱されると
き、かつその温度がその熱伝達壁の他側の反応隔室の内
部の点で計測されたとすると、熱反応曲線を28℃から10
3.9℃の最終的温度まで発生させることができる。その
中の液体が76℃の温度（差（103.9−28）の63％）に達
するのに要する時間はτの値である。これは良く知られ
た次の熱反応式（１）からほぼ得ることができる。
温度Ｔ（ｔ）＝最終温度＋（初期温度−最終温度）×e
-1／τ（１） かくして、その時間間隔ｔがτに等しければ、e-1／τ
≒0.37となる。そのような場合、ｔ＝τでのＴ（ｔ）は
初期温度の合計に（最終温度−初期温度）の63％をプラ
スしたものに等しい温度になる。そのような値からキュ
ベットにおける液体のためのτは3.5秒でなければなら
ないことが判明した。反応室内のアルミニュームと液体
の間の中間層を使用した好ましい配置の場合、時定数τ
はキュベット内の液体が水のときは10秒より依然として
大きくない。
これとは別に熱源はデフォーカス（defocuse）された
レーザとすることができる。熱伝達壁としての透明なポ
リエステルを使用することはそのような場合に好まし
く、染料はレーザによって適当な吸収波長を具備する反
応隔室に組み込まれる。
封入 この発明の他の特徴に目を向けると、増幅されたDNA
はキュベット中に拘束しなければならないことである。
この実現のために増幅に必要な試薬（即ち、プライマー
ストランドであるデオキシリボニュークレオチドおよび
延長酵素）は核酸材料のサンプルの添加に先立ってもし
くは核酸材料がサンプルと一緒に添加されるに先立って
キュベットに予め組み込まれるている。最も好ましくは
検出材料はサンプルの添加に先立って組み込まれ、サン
プルの添加後で増幅の前にキュベットは漏洩に対して遮
断され、それ以上のアクセスの必要がない。しかしなが
ら、この代わりに、キュベットに検出材料が以下の条件
の下に増幅のあとに収納室に印加されるのを許容するよ
うに構成してもよく、ここにその条件とは（１）検出材
料が印加される収納室は増幅に使用される反応室から分
離しなければならず、（２）収納室が試薬を増幅核酸に
供給するのを許容し、しかし増幅された核酸が収納室に
供給するのは禁止する一路チェック弁のような手段を設
ける必要がある。
この発明の別の特徴によれば、キュベットは収納室と
検出室との連通を提供するための手段を具備している。
一つの実施例では、そのような連通手段は試薬を収納室
から検出地点、例えば分離した検出室に移動させるため
の手段を具備する。そして最も好ましくは、この代わり
に、加圧手段をキュベットの外部に設け、キュベットの
壁面は外部から内部に圧力を伝達するのに充分な可撓性
を具備しており、キュベットの内部で試薬の加圧および
移動が可能である。どのような外部圧力源でも使用可能
であり、外部圧力源は、例えば、圧力ローラ若し空気シ
リンダからのピストンである。
例示的なキュベットの実施例 この発明のキュベット10の特徴はフレキシブルな隔室
（第１図）であり、この隔室は外部の加圧手段（例え
ば、ローラ）と協働して、この発明の装置全体を構成す
る。もっと特定すると、キュベット10は二枚の薄いシー
ト12,14を具備し、このシートはモールディングにより
作られ、ポケットもしくは隔室に共に係合しかつ接触す
るシート（第２図）の平面から突出する通路を接続する
ようになっている。シートは少なくともその外周16にお
いて、好ましくは隔室もしくは通路を包囲する全の点
で、熱もしくは超音波圧着により合着されている。熱応
動型の接着剤、例えば、エチレンビニールアセテートが
そのような接合に適している。液体注入孔22のところは
シール16が破れており例外となっており、この孔22にピ
ペット24が嵌合使用される。孔22はそこに延びる剛直な
縁23（第４図）を持っており、その内部にピペット24が
着座する。
隔室は次のように構成される。隔室26は反応室であ
り、必要に応じて、液状もしくは乾燥状の予め組み込ま
れる増幅試薬28を具備している（第２図）。隔室30（第
１図）予め組み込まれた試薬としての洗浄水を具備した
第１の洗浄室としての収納室を具備する。隔室32は収納
室であり、予め組み込まれた検出材料の少なくとも一
つ、即ち増幅されたDNA、に結合される相捕的なニュー
クレオチドを末端に有するビオチン化プローブを包含す
るとともに、信号発生成分、例えば前記した西洋ワサビ
パーオキサイドに結合されるアビィデン等を包含してい
るのが好ましい。収納室32は第２図の洗浄水含有収納室
であり、収納室32の容積よりもっと大きい容積を具備し
ているのが好ましい。収納室36は残りの検出剤、例えば
パーオキサイドと、ルーコ染料、例えば２−（４−ヒド
ロキシ−3,5−ジメトキシフェニール）−4,5−ビス（４
−メトキシフェニール）イミダゾールを、好ましくは安
定剤としてのポリビニールピロリドンとの組み合せの形
で具備している。収納室38は予め内部に停止溶液を含有
しており、これは過多の無色染料が染料、例えばナトリ
ウムアジドに変化されるのを防止するためである。
隔室40はこの実施例の前記した検知点（サイト）であ
り、隔室42は廃棄室であり、好ましくはは初期は収縮し
ており、液体がその内部に圧送されるに従って膨脹する
ようになっている。隔室42は隔室40と通路43を介して連
通する。必要に応じてであるが、一路チェック弁（図示
しない）を通路43に設けることがことができ、これは洗
浄液が隔室40に逆流することにより不所望の背景色が付
くことを防止している。
相互連結は以下の通りである。通路21は注入開口22を
隔室26と接続し、通路44は反応室26を検知室40と接続
し、但し、46の箇所に一時的なシールが設けられ、圧力
がローラ60により発生されるまで、隔室26内に導入DNA
をを維持する。通路48は隔室30を、通路49は隔室32を、
通路50は隔室34を、通路52は隔室36を、通路54は隔室38
を、夫々検出室40に接続し、各通路は第２図のような一
時的なシール56を具備するのが好ましく、この一時的シ
ールはローラ60がシールを破るまで夫々の隔室からの流
出を阻止する。通路54は他の通路（48,49,50及び52）が
接合される本線となる。
隔室の位置は第１図において慎重に決定する必要があ
り、ローラ60が矢印63の進路Ａに沿って前進するに従っ
て各隔室は適当な順序で隔室40に向かって排出される。
即ち、第１に増幅されたDNAが隔室40に圧送され、次に
第１の洗浄液が、次に隔室32からの検出プローブが、そ
れから第２の洗浄液が、次いで無色染料溶液が、最後に
停止溶液が圧送される。ある場合には無色染料溶液から
の染料の発生は暗所で行われ、これは例えば染料が光に
よって退色する場合である。夫々の通路は好ましくはロ
ーラにより圧搾されるように構成され、即ち、進路Ａに
おいて矢印63に対していつも直角より小さい角度（第１
図のα参照）をなすように構成する。もしローラに対す
る角度が直角を形成するとすると、ローラは通路を圧搾
することがなくその代わり通路の上を飛び越ていまうこ
とになろう。
シート12および14の双方がローラ60により圧潰可能で
あるということは本質的ではなく、その少なくとも一方
が170g/cmの圧力の下で圧潰可能であるだけでも良い。1
500g/cmのように高い圧力も使用可能である。第５図に
おいて、シート12は圧潰可能な比較的フレキシブルなシ
ート、例えば、熱シール可能なポリエステル（例えば3M
社により製造されたScotochpakTMという商標の熱シール
式の第229号フィルムにて作られ、一方シート14はその
可撓性はより小さくかつ圧潰性も少なく、又はシート12
と同一程度のフレキシビリティを持たせることができ
る。
少なくとも隔室26についてはシート14は外側にアルミ
ニューム箔のラミネート64（第５図）を有し、内側にポ
リマー層66、好ましくはシート12のようなポリエステル
層を具備している。アルミニューム箔は好ましくは約0.
0013cmと約0.026cmの間の厚みを持ち、最も好ましくは
厚みは約0.005cmである。層66は約0.0013cmと約0.03cm
の間の厚みを持ち、最も好ましくは0.005cmである。層6
6が存在している場合は隔室26の熱進路長は約0.3mmより
大きいことはなく、熱抵抗は約5.0℃/wattを越えること
がない。プラスチックの単一のシートというラミネート
構造の利点は、隔室が一旦ローラによって圧潰される
と、アルミニュームは再度の膨脹の抵抗になることであ
る。そのような膨脹が起るとすると下流の圧力で液体の
逆流が起る。この理由で、シート14はキュベット10の全
長にわたってラミネートを構成するのが好ましい。
好ましくは、隔室から噴射された液体は、さらに下流
にある他の隔室を排除するのに使用される通路に逆流し
ないようになっている。この目的を達成するために、ロ
ーラ60が第１図の左側から右側に前進するとき、キュベ
ット10に向け下降する挟み手段が使用され、以下のよう
に通路を挟着する。
ローラ60が隔室26を横切ったとき挟着は点P1において
実行される。隔室30を横切って移動する際にピンチング
は点P2の箇所で実行され、同様に隔室32についてはピン
チングはP3の隔室で実行され、隔室34についてはP4で、
隔室36についてはピンチングはP5において実行される。
以上の代わりに予備洗浄室を第６図のように設けるこ
とができ、この室は全ての出口通路が第１に水で充填さ
れることを確保し、その結果、上流の隔室が下流の隔室
のための通路に対して逆流しなくなる。以前に説明され
たと同一の部品は同一の番号を使用するが区別するため
サフィックスＡが付加される。
第６図において、ローラ60が最初に出合う隔室は収納
隔室61であり、この隔室61は洗浄水を具備し、通路62を
介して共通配管54Aに洗浄水が排出される。残りの通路4
4A,48A,49A,50A及び52Aは前記と同様に夫々の隔室から
接続される。注入通路21Aおよび開口22Aは隔室61のため
にキュベット10Aの対抗側に配置される。隔室61および
通路62の機能はローラがこの隔室を圧潰したとき洗浄水
で全の隔室の通路を溢れさせさることである。したがっ
て、一連の各隔室がローラにより圧潰されたときに、各
26A内の増幅されたDNAが通路48a,49A,50Aもしくは52Aの
いづれにも押し込まれる恐れはない。それは水がすでに
そこに存在しているからである。そのような水は各隔室
の内容物を検出室に伝達することに悪影響はない。
隔室61はその付加的な利益として隔室32,36および38
内に収納された乾燥試薬の再構成を可能とすることがあ
る。即ち、各隔室の夫々の通路への出口を閉鎖する軽熱
シールが省略され、これらの試薬がその隔室で乾燥さ
れ、それから隔室61がローラ61によった加圧され、キュ
ベットに水を溢れさせた場合に、隔室61の水は乾燥試薬
を再構成する。その補助のためキュベットを必要に応じ
て振ることができる。この再構成ステップはサンプルを
反応室に注入の前、後もしくは反応室内での増幅の前、
後に起る。
上述の実施例は各隔室を逐次的に加圧することが特徴
である。しかしながら、挟みポンイトP1-P5を使用した
場合は全ての液体含有隔室を同時的に加圧することがが
できる。即ち、通路44を除いて出口通路を閉鎖するため
P1-P5の全に圧力が印加した場合に圧力が全ての隔室26,
30,32,36及び38に同時的に（例えば適当に配置された空
気ピストンによって）加わる。しかしながら、通路44だ
けが閉寒されているため、増幅されたDNAのみが伝達さ
れることになる。次にポイントP1のみが開放され、洗浄
流体が通路49を介して送られ、このようにして挟みポイ
ントP5が最終的に解放されるに至る。注意すべきは印加
圧力は液体を夫々の隔室及び通路に閉じ込める縫い目の
破裂に要する圧力より小さいことである。検出隔室40
（第1,3図）は検出部材39を具備する流通型隔室であ
り、この検出部材39は支持シート41であり、同シート41
上にパイル43,43′,43″および43′″が配置される。も
しオリゴキャプチャー方が使用される場合は各パイルは
ポリマービードより成り、そのビード上に上記したよう
なプローブが不動に結合され、検出すべきDNAとハイブ
リッダイズされる。最も好ましくは各ビードは異なった
DNAのための異なった検知プローブであり、もし充分な
異なったビードのパイル（例えば８から10）が存在する
とすれば、どのビードが隔室からの染料からの色を変化
せしめたかということを基づいた組織判別を実行するこ
とができる。そのためのラテッスビードは普通である。
シート41はビードのパイルに接合する材料から選定さ
れ、製造の間にデポジットされかつ乾燥されるとき所定
位置に保持される。有益な例としてはPall社により製造
されるニトロセルロース、多孔性ナイロン膜であり、最
も好ましくはラテッスでコーティングした紙である。そ
のようなラテッスコーティング紙は次の様なものであ
る。即ち、中間値で紙の重量は約54g/cm2で約6.0mmの厚
みであり、約80％の硬材にて作られ、紙の表面に糊付け
され、次いで平均約7g/cm2でラテッスがコーティングさ
れ、コーティングはその成分として通常の工業用グレー
ドのラッテス、20重量％のNaOH、分散剤としてのTSPP、
シリコンディオキサイドおよびチタニウムディオキサイ
ド等の不透明材、水溶性粘度（hydrasperse clay）およ
び残りの希釈水を具備する。
シート12及び14は次のように準備され組立られる。シ
ート14は第１図、第２図に示すように形成された隔室凹
部を予め成型している。シート14を上下さかさとし、カ
ップを形成する凹部とともに、試薬が印加され、ここに
試薬とは乾燥試薬28及び隔室30,32,34,36及び38への液
体等である。次に、この時点で上側シートであるシート
12が第２図の26′で示す係合凹みの箇所を除いて本質的
に平坦に重ねられる。それからこの二つのシートは、通
路21と隔室26との接合点を除き第１図の斜線をもって示
す各隔室の外周で軽く合体される。例えば、軽微な熱シ
ールにより、各隔室の夫々の流出通路に対する出口を含
めたこれらの部分で二つのプラスチックシートを合体す
ることができる。これは導入時に隔室から流出する液体
に対する一時的なブロックとなり、このブロックはロー
ラ60が印加されるときは破られる。（このような一時的
なブロックは第２図の通路48,49,52及び54の断面におい
て破線として現れており、液体が隔室から圧送され、こ
の一時的なシールに導かれたとき分離する箇所を表して
いる。） その後に、強固なシール（熱シール）が各隔室および
その流出通路の周囲において加えられ、しかしながら隔
室に対する通路の接合部を横断するようにはシールは行
われないように配慮されている。外周にも熱シールがさ
れる。隔室の周囲のシールは、隔室から押し出された液
体が夫々の通路に沿ってのみ流れ、シート12と14との間
の他の部分には流れないことを補償するものである。
キュベット10を使用する場合は患者サンプル５は孔22
のピペット24を介して第５図の隔室26に注入される。こ
れは凹んだ部分26′が飛び出し、第２図の破線、第５図
の実線で示すシート12の残りの部分と面一となるに至
る。
その代わりに部分26′はシート12の休止平面を越えて
飛び出し、第19図に示す対向膨脹部26″を形成させるこ
とができる。さらに、第19図に示すようにシート12及び
14は金属的な成分もしくは層を全く持たず、全体をプラ
スチックによって構成することができる。即ち、プラス
チックだけでもプラスチック相当は充分な熱伝達速度を
提供することができる。
本質的なことは第１図および第４図の開口22は、増幅
ステップに先立ってピペット24が引き抜かれた後に閉鎖
可能であることである。これは閉鎖された開口を熱シー
ルする、開口を適当な方法（例えば強固なシール機能を
持った熱シールストリップ12及び14による）、もしくは
図示しない一路弁をもったリム23を構成することによっ
て行うことができる。孔22を熱シールする場合はリム23
はシールすることができ、ピペット24は単にこの孔に直
接的に押し込むことができる。どのようなモードの閉鎖
手段が採用されたとしてもPCR増幅もしくは液体搬送の
間に形成されるどのような圧力にも有効に抵抗できるも
のでなければならない。熱シールは好ましい方法であ
る。
上記のように、加熱および冷却により必要な熱PCR循
環が好ましくは隔室26で一つもしくは双方のストリップ
12および14を加熱することによって起る。
増幅されたDNAが隔室40に侵入するとき、DNAはそこに
短い時間保持され、一方熱はストリップ14を介して印加
され、ハイブリッダイズが行われる。好ましくはストリ
ップ14は隔室40で透明であり、適当な波長の放射（可視
波長光）の伝達を許容し、内容物の試験が可能となる。
隔室42は膨脹することにより液体流体流束及び空気流入
流束を収容するよう膨脹することができる。予め使用の
前に膨脹されているからである。その代わりに、キュベ
ットを処理するのに使用される器具に真空プレートを具
備せしめることができ、これは無駄容積が必要な場合に
バキュームによって隔室42を第３図に示すような膨張形
状に成形する。
増幅の際およびその後に全の隔室30-38が雰囲気から
シールされていることは（第７図、第８図）もし増幅さ
れたDNAが逆流によって隔室に侵入することを防止でき
るように構成されている限りは本質的なことではない。
以前に説明したのと同様な部品は同一の参照番号とし、
区別のためのサフィックスＢが追加されている。
即ち、キュベット10Bは全て前と同様に隔室26B,30B,3
2B,34B.38B,40B及び42Bを具備し、その通路はこれらの
隔室を相互に連結し、前と同様に機能する。しかしなが
ら、各隔室はその周囲において液体注入開口70を具備
し、連結通路72と共に雰囲気から夫々の隔室に対する流
体通路を提供する。このような構成により、DNAの増幅
のときに隔室26Bだけが液体、即ちサンプルDNAと増幅試
薬とを具備する。（その注入開口22Bはこの時点では閉
鎖される。）他の隔室は開いたままとすることができ
る。それは一時的な熱シールがその出口通路との接合点
で形成されることによる。付加的な安全策として、チェ
ック弁80が通路54Bに設けられ、DNAがこれらの隔室に逆
流するのを防止することができる。そのようなバルブは
通常のものであり、例えば、第８図に示すようにシート
82と、ボール84とを具備し、このボールが上流に押し戻
されると、シート82上に着座し、流れを止める。ボール
82はフリーであるが小さなストッパ86に突き当たるまで
動くことができる。
バルブ80は本線上に位置するのが好ましく、それはこ
れにより一つのバルブで全ての収納室をまかなうことが
できるからであり、かつ進路Ａから外れており、加圧ロ
ーラの進行に対する障害とな何らならないのである。
各収納隔室がその適当な液体をピペット（第６図）か
ら受け取った後で、加圧ローラが進路Ａを移動する前
に、各開口70は開口22Aの場合と同様に密閉される。こ
れとは別に開口70は予め組み込まれる全ての試薬を充填
するのに使用することができる。
他の残りの実施例では、隔室の圧潰可能なフレキシブ
ル壁の代替として、増幅されたDNA及び検出材料等を含
む液体を移動させるため（もしくは全ての隔室を流体的
に相互に手段は適当な隔室を形成するため）ピストン室
内にピストンが設けられる。即ち、ピストンは隔室のフ
レキシブル壁の等価物である。
即ち、第９−12図において、キュベット100（第９
図）は熱伝達壁114（第10図）を具備する反応隔室126
と、検出材料収納室132（第９図）と、洗浄液収納隔室1
34と、無色染料収納室136と、停止液収納室138と、ほか
の洗浄液収納室139と、夫々の隔室に導く通路144,149,1
50,152,154及び156とを具備する。平面114は前の実施例
と同様に構成するのが好ましい。各隔室はピストン室と
して機能し、各室には隔室内の試薬の外側に配置される
夫々のピストン113もしくは115がある。好ましくは、ピ
ストンは図示のように二重シール型でありその隔室用の
駆動アクチュエータ（図示しない）と確実係合するスロ
ット（図示しない）のごとき手段を具備している。そし
て、通路149及び150は第９及び12図の隔室126と通路151
を形成するように接続している。流体DNAサンプルは、
外部肩部123を具備する液体侵入開口122から通路121を
介して隔室126にも供給される。
通路152,154及び156は第12図で示すように通路155で
合体接続され、この通路155に通路144は隔室126からの
供給を行う。通路155はそれから隔室140への通路157肩
部123内の159の点で流出する通気通路を構成するように
分岐する。肩部123は内部にねじ（図示しない）を切っ
ており、外ねじを切ったストッパを受け取ることがで
き、その結果双方の流入開口122及び通気開口159はスト
ッパによりシールされる。
膨脹のためのフレキシブルな平面は存在しないので、
別のピストンチャンバ182とピストン184とが設けられ、
検知隔室140（第９、10及び12図）からの空気の膨脹を
可能としている。チャンバ182は通路185を介して隔室14
0の底部に接続される。これはそのチャンバ内の手動引
き抜きピストン184により行うことができる。ステム187
はピストン184から突出しており、そのピストンを引き
出すのが容易になる。
第９図に着目すると、流通室140は上部190を具備し、
流体が他の隔室に搬送されるときにこの上部に最初に流
体が流入され、更に流通室140は下部192（第10図）を具
備し、この下部192は通気性の膜194によって上部から分
離される。下部192は吸収剤194によって実質的に実質的
されていて、隔室140に流入する過剰液体は全て吸収す
ることができる。膜194は成型、製織、もしくは電気光
学的切削による微粒透過膜であるのが好ましい。どのよ
うな適当な材料も吸収剤として使用可能であるが、例え
ばセルロースアセテートがある。
膜194はDNAにハイブリッダイズされたものからフリー
な未反応の検出ラベルを分離するのを助けられるもので
ある。即ち、隔室132内の検出プローブは、一旦液体が
隔室140に到達すれば隔室126内の増幅されたANAをハイ
ブリッダイズすると共に膜194に（もしくは膜にトラッ
プされたビードに）係合される。そのようなプローブは
西洋わさびパーオキシダーゼのようなラベルを具備して
おり、これらの材料が隔室140に到達する無色染料と反
応して過酸化物を形成する。隔室132,134,136及び138の
充填は液体を印加し、それからピストンを挿入すること
により達成される。その代わりに予めパッケージとした
アンプルが挿入され、次いでピストンが挿入される。ア
ンプルは脆弱に作られているのでアンプルは破断し、液
体は放出される。
キュベット内での液体の伝達は全てピストン113,115
及び184により制御され、ピストン184は他のピストンが
前進するのを許容するバキュームを発生するのに使用さ
れる。
この代わりに、図示しないが、付加的な隔室およびそ
れに関連するピストンが具備され、付加的な酵素を隔室
126に供給し、変性ステップによる酵素のどのような非
活性化に対してもより大量の酵素を追加することにより
対向することができる。
キュベット100は次のように使用される。最初にピス
トンは第９図の図示のように位置され、サンプルDNAは
ピペットを介して開口122に導入される。通路121を通過
するときにサンプルは隔室126に入り、隔室126には増幅
試薬がすでに存在しているかDNAと共に増幅試薬が導入
される。通気開口159及び通路155は隔室126内の空気が
前進する液体により押し出されるのを許容する。以後、
ストッパが肩部123に挿入され、開口122及び159をシー
ルする。熱循環が所望のDNAの増幅が達成されるまで熱
伝達壁114を介して行われる。このポイントまでピスト
ンは動かない。
次に隔室132のピストン113が前進され、隔室132の検
出材料を隔室126に押し出す。即ち、アビディン−ビー
ド捕捉方法の場合は、隔室126の内容物は好ましくはポ
リマービードを具備し、ポリマービードにアビディンを
介してビオチン科プライマーが係合されており、このチ
オチン化プライマーはアニーリングステップにおいて増
幅されたDNAと共に延長することができ、これにより増
幅されたDNAの複製を行う。隔室はまた検出プローブを
具備し、検出プローブはニュークレオチドであり、西洋
わさびパーオキシダーゼのような試薬と結合してハイブ
リッダイズするように構成される。隔室134からの洗浄
液はピストン115により押圧され、必要であれば全ての
検出試薬が隔室126に存在することを補償する。それか
ら混合が通常の手段によりキュベット全体を撹拌するこ
とにより行われる。検出プローブはそれから隔室126内
で通常のステップにしたがって熱制御を壁面114を介し
て42℃で例えば５分間行うことにより増幅DNAにハイブ
リッダイズされる。
次に、付加的な洗浄溶液が隔室134から押圧され、ハ
イブリッダイズされた液体を隔室126から検出室に押し
流す。またピストン115は隔室139から通路156および155
を通して押し流すように前進され、通路155に依然残留
しているハイブリッダイズされた流体を隔室140に押し
流し、通路144における残留されたハイブリッダイズ流
体を次に来る無色染料から分離する。充分な洗浄液が隔
室126押圧140を通され、全ての材料、トラップ手段に結
合されなかったフリーな検出プローブ等が膜194を通し
て吸収剤196に通過される。この洗浄ステップにおいて
はピストン184は引っ込む必要があり、これは背圧が隔
室126から隔室140への液体の搬送に抵抗することを防止
するものである。
次に、隔室136の第１の無色染料が、次いで隔室138の
ストッパ溶液が夫々のピストン113を前進させることに
より通路155および157に、それから隔室140に運ばれ
る。これは、適当なDNAがそこに存在しているとすれ
ば、膜194で適当な染料を形成せしめる。（もし存在し
ていない場合は、フリーな検出材料は全て既に吸収剤19
6に押し流されていることから、色は全く形成されるこ
とがなく、試験は否定的な表示を行うことになる。） 検出箇所を構成するために別体の検出隔室を特に設け
る必要は本質的にはない。次の実施例に関して説明する
ように、検出サイトは反応室と同居することができる。
前に説明したと同様の部品は同一の参照番号を付すもの
とし、区別のためサフィックスＣを付けるものとする。
第13図において、キュベット100Cは隔室126C,132C,13
4C,136C,138C及びこれらの隔室への又は隔室からの、さ
らには流入開口122Cからの通路を以前と同様に具備す
る。ピストン113C,115C,184Cは前と同様に同様の工程で
得られるDNAの増幅の後の液体の搬送に使用される。し
かしながら、隔室132Cは検出試薬として磁性充填剤を含
有するポリマーから形成される磁性ビードを具備してお
り、符号したDNA連鎖を持つハイブリッダイズ材料がこ
の磁性充填剤に結合される。これは、増幅されたDNAの
一端等にハイブリッダイズさせるためのものである。増
幅DNAの他端は前述のように西洋わさびパーオキシダー
ゼを担持した検出プローブにハイブリッダイズさせるた
めのものである。
この実施例では、DNAに未だハイブリッダイズされて
いないフリーな検出プローブをハイブリッダイズされた
ものから分離するため次のことが行われる。洗浄溶液が
隔室134Cから注入されたとき磁場が隔室126Cの下側に印
加され、ビード試薬および増幅DNAにハイブリッダイズ
される検出プローブを保持する。これはフリーな検出プ
ローブ及びそれらのラベルを隔室126Cから隔室182Cに押
し流し、隔室182Cではピストン184Cは収縮し、そのため
の室を形成する。磁場は維持され、無色染料およびスト
ッパ液体が運びこまれ、反応室である隔室126C内に増幅
DNAが存在するのであれば色が生成される。
第８−12図のキュベットの代わりの他の実施例とし
て、隔室132,134,138,182もしくはそのＣを付した対応
部分が延長され、その結果これらの隔室はキュベットに
Ｌ字型を付与する第８図の平面（図示しない）から90°
突出する。このような配置はモールドの構造及び製造を
単塔にする利点がある。
この発明のキュベットにおいてセル内でDNAを抽出す
ることがキュベットの使用に先立った段階で抽出する代
わりに可能である。このような場合はキュベットは第14
図のように構成するのが好ましい。以前に説明したのと
同様な部品は同一の番号を付するものとし、区別するた
めサフィックスＤを付する。
キュベット100Dは前と同様の隔室126D,132D,134d,138
Dを具備しており、かつピストン113Dが収納室内におい
て使用される。肩部123Dは液体流入開口122Dを保護し、
検出は以前と全て同様であり膜（図示しない）のところ
で行われる。しかしながら、通路121Dはピペットにて注
入されたサンプルを反応室である隔室126Dに搬送する代
わりに、サンプルを抽出隔室200に搬送する。この場合
の液体サンプルはそのままの血液もしくは血液細胞であ
り、これらのサンプルからDNAの抽出が行われる。液体
サンプルがキュベットに印加される時点において、以下
説明する抽出剤がオプション的に印加することができ
る。この代わりに抽出剤を隔室200に予め組み込みする
ことができる。
他の類似の隔室と同様にピストン113Dが隔室200に使
用され、但し、異なったところは、図示のように完全に
引っ込むことができ、導入されるサンプルのために最大
の空間を付与することができる。通路121Dはピストン11
3Dの直下のポイント201で隔室200に入る。
隔室200の対向端202で通路204は中間室206に流体的に
接続され、この室206に隔室126Dへの液体が通過するフ
ィルタ208が配置される。フィルタ208の孔寸法はフィル
タ内の細胞の断片を保持するが抽出されたDNAは通過さ
せるような寸法とする。例えば、フィルタを、約0.45ミ
クロンの孔寸法のナイロンもしくはポリプロピレンにて
形成することが特に好ましい。
隔室206から通路210は抽出されたDNA及び溶媒（例え
ば水）を隔室126Dに運ぶ。
使用時に、液体サンプルは隔室200に好ましくは抽出
剤と一緒に注入される。どのようなDNA抽出プロトコル
も表面活性材のような共有抽出剤と共に使用することが
できる。最も好ましいものは溶液を約５分に渡り95℃の
温度まで単純に加熱することである。そのような加熱は
蛋白質を変性し、細胞を分離するのに有効である。この
抽出方法の補助としてデキストランが必要に応じ３重量
パーセント、10重量パーセントのTX-100溶液と共に印加
され、ここにTX-100はRohm and Haas社から入手するこ
とができる非イオン性の表面活性剤である。隔室200の
加熱は、アルミニュームから隔室の平面の少なくとも一
部220を構成することによってより一層急速に行うこと
ができる。このアルミニュームはキュベットの底部外側
（別の表面としては図示してない）まで延びている。隔
室200に近接してキュベットの底面に熱を印加すること
により隔室200を有効に加熱することができる。
適当な培養期間の経過の後に、隔室200の内容物はピ
ストン113Dを前進することによりフィルタ208に押し込
まれる。
ある場合には、検出室において積極的若しくは消極的
な制御を選定されたDNAの検出サイトに沿って行うこと
が好ましいことがある。第15,16図はこのことを行う変
形例を図示する。以前に説明したのと同様の部品は同一
の参照番号を使用するものとし、区別のためサフィック
スＥを付す。
第15図において、以前と同様にキュベット100Eは隔室
126E,136E,182E,182Eを具備し、加えて、適当なピスト
ン184E等を具備する。通路121Eは開口122Eから反応室12
6Eに液体サンプルに運び、通路151Eは液体をその隔室に
運搬する。ビオチン化されたプライマーは適当な位置か
ら運ばれ、無色染料及びストッパ溶液は検出サイトに導
かれる通路157Eに通路157Eを介して搬送される。通路14
4Eは隔室126Eに生成されるDNA生成物にその通路155E,15
7Eでアクセスせしめるためのものである。通路157Eから
来る液体は吸収剤196E（第16図）に接触するように配置
される検出膜194Eと出合い、これは前の実施例と同様で
ある。
しかしながら、前の実施例と特に異なっているのはサ
ンプルDNA検出のため膜194Eに別の領域Ｓがあり、正の
制御のため“＋”の符号が負の制御のため“−”の符号
が付されている。正の制御の目的はDNAが存在している
場合に試薬がDNAの信号（好ましくは色）を発生するこ
とを補償し、即ち使用者に、“＋”領域で信号を発生す
るのに失敗したということからいずれにしても試薬が欠
陥があるということを知らしめることができる。負の制
御の目的はサンプル色を比較すべき背景色を使用者に知
らしめることである。即ち何らかの理由により試薬内に
おいて背景色の変化が起り、正の読み取りがその試験の
結果であると決定する前にサンプル色は密度がこれより
有意に大きくすることができる点で重要である。
これを行うための幾つかの方法がある。第15,16図の
実施例では使用された実施例はアビディン−ビードキャ
プチャーである。この方法の特徴はビードに供給結合さ
れたアビディンもしくはストレプトアビディン（strept
avidin）、ビオチン化プライマー、検出材料の一部とし
てのラベルを付けたプローブを使用することである。好
ましくは、少なくともプローブは収納隔室250,252,254
に保持される。各隔室は単一タイプの検出プローブに割
り当てられており、隔室250はサンプルDNAプローブ、25
2負の制御プローブ、254正の制御プローブを具備する。
ピストン260は夫々の隔室を好ましくは同時に加圧する
のに使用され、その内容物を、夫々の通路262,264,266
を介して、各プローブ及び各プローブ通路に関連する検
知室268,270,272に付勢するものである。かくして、各
検出室は内部にそのプローブのみ有し、ほかの二つは全
く持たない。
増幅されたDNA及び他の試薬の全ての３つの検出隔室
に対して供給を行うため、通路157Eは好ましくは３のブ
ランチ274,276,278に分離され、これらのブランチは検
出隔室と接続される。
容易に理解することができようが３つのうちの二つの
プローブは適当なDNAと相補的な遺伝学的材料を持つ。
サンプルのためのプローブはサンプルの目標DNAの遺伝
学的な相補物である。正のプローブは常に存在するDNA
材料のための遺伝学的相補物であり、少なくとも血液細
胞の場合はベータ−グロビンである。負のプローブはサ
ンプルから未知の増幅DNAと合う遺伝学的相補物であ
る。これを最も容易に行うのはプローブ相補物をその遺
伝学的符号が連鎖においてランダムであり、無意味コー
ドを構成することである。
以上のことから容易に理解することができようが、こ
のプロセスは以下のように行われる。アビディン担持ビ
ードは好ましくは隔室250,252及び254に収納される。増
幅されたDNAは通路274,276,278を介して夫々の検出介し
てに供給され、ピストン260は前進され、適当なプロー
ブおよびビードを検出室に押し出す。これらの隔室は適
当に加熱され、増幅されたDNAは特に隔室268及び272に
おいて隔室250および254から適当なプローブにハイブリ
ッダイズれる。好ましくは、検出室270にはハイブリッ
ダイズが起らない。それは負の制御プローブと反応する
無意味DNAが存在すべきでないからである。その後、洗
浄溶液が検出隔室を介して押圧され、膜194Eを通して未
ハイブリッダイズのラベルされた即ちビードに結合しな
いプローブを吸収剤196Eに押し流す。この押し流しの後
に無色染料液との接触ついでストッパ溶液との接触が行
われる。
もう一つの実施例は所謂オリゴキャプチャー技術を使
用するものである。その場合第17,18図に示すようにラ
ベルを付したプローブは増幅DNAの導入に先立ち検出膜
上に不動の形態で収納されている。以前に説明したのと
同様の部品は同一の参照番号を付与するものとし、区別
のためサフィックスＦが付けられる。
この実施例において使用されるオリゴキャプチャー方
法はプローブが膜、もしくは膜上にもしくは内にトラッ
プされたビード上に不動とされており、そのプローブは
適当なDNAに相補的な遺伝学的材料を具備する。他の隔
室（139F）では増幅されたDNA上でビオチンと反応する
ためのラベルDNAは例えば西洋わさびパーオキシダーゼ
とすることができる。
第17および18図においてキュベット100Fは検出室190F
及び収納室139F（第19図）に何が収納されているか以外
は第９図の実施例と同一である。もっと特定すると、サ
ンプルDNAプローブは膜194Fの部分Ｓで不動とされてお
り、正の制御プローブは“＋”の部分で不動にされてお
り、負のプローブは“−”の部分で不動とされている。
そのようなプローブを担持する膜の各部分194Fは好まし
くは他の部分と接触しない。
この場合のプロセスでは増幅DNAは通路157Fを介して
検出室190Fに導かれ、膜194Fの表面全体の上を流され
る。適当な加熱により増幅DNAは特定にハイブリッダイ
ズされ、かくしてＳ領域のプローブに結合し、そこに散
在したDNAは“＋”領域においてプローブに結合され
“−”領域では好ましくは全くハイブリッダイズしな
い。洗浄溶液は隔室190Fに134F又は他の部分から付勢さ
れ、次いでアビディン−ラベルがビオチン化生成物と反
応し、ハイブリッドダイズされて増幅目標DNAもしくは
正の制御DNAとなる。その後、洗浄溶液が印加され、そ
れから無色染料が印加される。
効果 この発明の技術的効果はこの発明のキュベットおよび
方法により得られた増幅核酸はその得られた増幅核酸に
より環境を汚染するおそれがなく、それは核酸を入れた
キュベットの領域を再度開ける必要がないことによる。
ほかの効果としてキュベットは比較的に未熟なもので
も増幅作業をすることができる。
また、この発明のキュベットおよび方法は自動処理に
対処することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はこの発明のキュベットの平面図。 第２図は第１図のII-II線に沿って表される断面図。 第３図は第１図のIII-III線に沿って表される断面図。 第４図は第１図のVI-VI線に沿って表される部分的断面
図（但しピペットは省略）。 第５図は第１図のＶ−Ｖ線に沿って表される拡大部分断
面図。 第６図は第１図と類似するが他の実施例を説明する部分
的平面図。 第７図は第１図と類似するが他の実施例を示す平面図。 第８図は第７図のVIII-VIII線に沿う断面図。 第９図は第１図と類似するが、他の実施例を示す部分的
断面平面図（第11図のIX-IX線に沿って表した断面
図）。 第10図、第11図、第12図は第９図の夫々Ｘ−Ｘ線、XI-X
I線、XII-XII線に沿って表される断面図。 第13図は第９図と類似するが夫々他の実施例を示す部分
的断面平面図。 第14図及び第15図は第９図と類似するが夫々他の実施例
を示す一部断面で表した部分的平面図。 第16図は第15図のXVI-XVI線に沿って表す断面図。 第17図は第９図と類似するが他の実施例を示す一部を破
断して示す部分的平面図。 第18図は第17図のXVIII-XVIIIに沿って表される断面
図。 第19図は第５図と類似するが他の実施例を説明する断面
図。 10,100,100C,100d,100E……キュベット 26,26A,26B……反応室 30,30A,30B……収納室 32,32A,32B……収納室 34,34A,304B……収納室 36,36A,36B……収納室 38,38A,38B……収納室 40,40A,40B……検出室（検出サイトを具備） 60……外部圧力源（可動手段） 113,113C,113D……ピストン移動手段 115,115C,115D……ピストン移動手段 126,126A,126B,126C,126D,126E……収納室 132,132A,132B,132C,132D,132E……収納室 134,134A,134B,134C,134D,134E……収納室 136,136A,136B,136C,136D,136E……収納室 138,138A,138B,138C,138D,138E……収納室 139,139A,139B,139C,139D,139E……収納室 140……検出室、184,184C,184E……ピストン移動手段 126C,194E,194F……検出サイト 260……ピストン移動手段
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェフリー アレン ウェルマン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14615, ロチェスター，ストーン ロード 1544 (72)発明者 チャールズ カリス ヒンクリー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14534, ピッツフォード，ラッチモア コート 23 (72)発明者 ウィリアム ハロルド ドニッシュ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14615, ロチェスター，スウィート バーチ レ ーン 320 (72)発明者 ジョン ブルース フィンドレイ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，クロスロード レーン 148 (56)参考文献 特開 昭62−240862（ＪＰ，Ａ)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少量のサンプルに含まれる核酸材料の検出
    装置であって、 検出装置がキュベットより成り、 前記キュベットは： （ｉ） 壁面により区画される複数の隔室と、該隔室の
    各々を少なくとも１つの他の隔室に相互に連結する手段
    とを具備し、前記隔室は： （ａ） 少なくとも一つの反応隔室と； （ｂ） 目標核酸材料を表す検出可能信号を発生し、か
    つ検出試薬を含む複数の試薬と； （ｃ） 目標材料を検出するための検出地点とより成
    り、前記隔室の少なくとも一つの少なくとも一つの壁面
    は一つの隔室から外部環境との間に熱の伝達を許容する
    ように構成されており； 前記キュベットは、更に： （ii） 前記少なくとも一つの反応隔室にのみ接続さ
    れ、該反応隔室への核酸材料サンプルの注入を行わしめ
    る液体アクセス手段と； （iii） 核酸材料サンプルの注入後に核酸材料が漏洩
    しないようにキュベットの閉鎖をする手段と； （iv） 前記検出試薬及び核酸材料をキュベットを閉鎖
    した状態に維持して前記検出地点まで移送する手段とを
    具備しており； これにより、核酸材料サンプルが一旦隔室内に注入され
    かつ前記アクセス手段が閉鎖されると、増幅及び検出反
    応の全過程を通じて、隔室内の液状の内容物は増幅を受
    けた核酸材料も含めてキュベット内のみを移動され作業
    員及び外部環境と接触することがないことを特徴とする
    核酸材料の検出装置。
  2. 【請求項２】前記複数の試薬は目標DNAを表す信号を発
    生し、かつ前記検出試薬はDNAを検出するための試薬で
    あり、かつ注入されるサンプルはDNA核酸材料のため試
    験されるべきものであるこ請求項１に記載の装置。
  3. 【請求項３】前記複数の試薬はDNAストランドの増幅の
    ための試薬を含むことを特徴とする請求項２に記載の装
    置。
  4. 【請求項４】前記複数の試薬は酵素、プライマー核酸及
    びニュークレオチドを含むことを特徴とする請求項１に
    記載の装置。
  5. 【請求項５】DNAを増幅および検出する装置において、 （ｉ） 複数の隔室と、これを少なくとも一つの他の隔
    室に相互に製造するための手段とを有するキュベットを
    有し、該キュベットは（ａ）DNAストランドを増幅する
    ための少なくとも一つの反応室と、（ｂ）増幅されたDN
    Aを検出し、検出地点を具備する少なくとも一つの検出
    室と、（ｃ）検出された材料を増幅されたDNAストラン
    ドに伝達する手段とを備え、 （ii） 約30℃から約95℃の温度範囲を通して反応室の
    内容物の積極的若しくは受動的な循環を許容する手段を
    具備し、 （iii） 増幅のためサンプルDNAを前記反応室に対する
    注入を許容するため、前記少なくとも一つの反応室にの
    み連結される液体アクセス手段を具備し、 （iv） サンプルDNAの注入の後にDNAの通過に対して前
    記キュベットを遮断する手段を具備し、更に少くとも検
    出材料およびDNAストランドを検出室におよび検出部位
    に移動する手段を具備し、一旦DNAサンプルが隔室に導
    入されアクセス開口が閉鎖されると、隔室内の流体内容
    物は運転者及び環境との接触が起こらないようにに増幅
    期間及び検出反応の全期間は拘束され、 前記移動手段は前記キュベット中に取り付けされたピス
    トンより成り、かつピストンは、該ピストンの移動時に
    前記検出材料及びDNAストランドをして前記検出地点に
    向け動くように付勢するべく構成される通路により連結
    され、 前記移動手段は前記キュベット中に設けたピストンを更
    に具備し、該ピストンは通路によって前記検知地点に流
    体的に連結される第２のピストンを具備し、第２のピス
    トンが収縮したときに前記検知地点での圧力を緩和する
    ことができることを特徴とする装置。
  6. 【請求項６】環境を汚染するエーロゾルが外部に流出す
    ることを許容することなしに閉鎖キュベットにおいて核
    酸材料を増幅しかつ検出する方法において、 （ａ） 核酸材料のサンプルをキュベットに注入し、該
    キュベットは、増幅試薬が存在する反応室と、検知材料
    と共に使用する収納室と、検知地点を含む少なくとも一
    つの室とを含む多数の隔室並びに流体の伝達を行わしめ
    るため前記隔室を相互に連結する手段を具備し、 （ｂ） 核酸材料を包含する前記キュベットの部分を恒
    久的に遮断し、全ての核酸をそのキュベットに封入し、 （ｃ） 前記試薬が有効となる所定の温度変化にわたっ
    てキュベットを循環させることにより核酸材料を増幅
    し、 （ｄ） 増幅された核酸材料を前記反応室から前記検知
    地点に流体的に搬送し、（ｅ）検知材料を前記検知点に
    流体提供に搬送し、並びに （ｆ） 前記地点において増幅された核酸材料を前記検
    知材料と共に検出し、同時に核酸材料は前記キュベット
    中に封入維持することを特徴とする閉鎖キュベット内の
    核酸材料の増幅および検出方法。
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