KR0161352B1 - 피씨알용 격납 큐벳 및 그 사용방법 - Google Patents

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존 디 후서
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Abstract

본 발명은 a) 반응 격실 및 검출 시약을 포함하는 큐벳을 제공하는 단계 및, 상기 반응 격실 내에 핵산 물질 및, 폴리머라제, 프라이머 핵산 및 뉴클레오티드를 포함하는 증폭 시약을 제공하는 단계 ; b) 상기 샘플 및 상기 시약을 제공한 후, 상기의 큐벳내의 내용물을 영구히 밀폐하는 단계 ; c) 상기 폴리머라제, 핵산 프라이머 및 뉴클레오티드를 사용하여 폴리머라제 연쇄반응의 단계에 의해 핵산물질을 증폭시키는 단계 ; d) 상기 증폭된 핵산 물질에 상기 검출 시약 중의 최소한 하나를 부착시키는 단계 ; 및E) 상기 검출 시약을 사용하여 증폭된 핵산 물질을 검출하는 단계들을 포함하고, 상기 c), d) 및E)는 상기 핵산 물질이 상기 큐벳내에 한정된 상태로 유지되는 동안 일어나는, 에어로솔이 큐벳으로부터 빠져나가 다른 큐벳을 오염시키는 일이 없는, 밀폐된 격납 큐벳 내에서의 핵산 물질의 증폭 및 검출 방법에 관한 것이다.

Description

피씨알용 격납 큐벳 및 그 사용방법
본 발명은 PCR(폴리머라제연쇄반응 : polymerase chain reaction) 기술을 사용하여 핵산을 증폭 및 검출하기 위한 반응을, 증폭된 핵산을 외계에 노출시키는 일 없이, 수행할 수 있는 큐벳(cuvettes)에 관한 것이다. 폴리머라제연쇄반응(PCR) 기술을, 종종 단일 세포로부터와 같이 적은양으로 추출되는 DNA 와 같은 핵산 물질을 수억의 모사물로 증폭시키는 것을 가능하게 한다. 이것은 중요하며, 그 이유는 PCR 기술 이전에는 단일 DNA 가닥을 검출하는 것은 실제적으로 불가능하였기 때문이다.
그러나, 인간이 면역결핍 바이러스(HIV, 다르게는 AIDS 를 유발하는 것으로 알려져 있음)의 DNA 와 같은 단일 DNA 가닥을 선택된 DNA 를 증폭시킬 수 있는 증폭 시약에 가하는 경우, 수억의 그 DNA 모사물이 비교적 단시간내에 얻어질 수 있다. 이 기술은 더욱이, 증폭된 선택물질을 하이브리다이제이션(hybridization) 할 수 있는 프로우브들(probes)을 사용하여 증폭된 핵산 물질(예를들면, DNA)의 검출을 가능하게하며, 이러한 프로우브들은 차례로 여과막과 같은 고상 지지체에 고정화(immobilization) 되거나 또는, 고정화 가능하게 되며, 또는 효소나 다른 종류의 잔기를 사용하는 검출을 위하여 표식(label) 된다.
종래, 이는 원하는 수효의 모사물이 형성될 때까지, 폐쇄된 플라스틱 용기내에서 핵산 물질을 증폭시키는 것에 의해서 수행되어왔다. 그후, 이 용기는 폐쇄 해제와 같은 재개봉이 이루어지며, 증폭된 모사물을 꺼내어 검출장치로 이송시키거나 또는, 검출 시약을 증폭용으로 사용된 용기에 가하여 동일 용기내에서 검출이 수행되도록 한다.
이러한 기술은 PCR 기술을 편리하고도 광범위하게 사용하기에는 불만족스러운 것으로 알려져있으며, 그 이유는 폐쇄 해제및/또는 유체의 이동 동작중에 에어로솔(aerosols)이 생성되기 때문이다. 이러한 에로솔은 소량의 증폭된 핵산 물질, 예를들면, DNA를 함유한다. 그 다음, 이 에어로솔은 외계로 분산된다. 보통, 외계중의 이러한 소수의 분자들은 크게 염려할 것이 못된다. 그러나 검출을 위해서 조만간 사용하게될 다른 증폭 용기들을 오염시켜 손상시키는데 있어서는, 단 한 개의 DNA 분자로 충분하다. 즉, 잘못된 DNA 분자가 조작자에 의해서 부주의하게 퍼뜨려지거나 또는 조만간 사용하게될 또는 다른 증폭 용기내로 운반된다면, 그 한분자가 다음 단계의 증폭에 필요한 DNA 를 제공하지 않으면 안되는 전체가 된다. 말할 필요도 없이, 다음 시험의 목적이 특정한 DNA(예를들면, HIV)가 존재하는지의 여부를 판단하는 것이며, 그 잘못된 DNA 로 인하여 환자의 DNA 가 아니라 잘못된 DNA 만을 검출한다면, 그 시험은 완전히 망쳐진 것이다. 따라서 DNA 증폭의 그 대단한 능력이 시험에 있어서의 잠재적인 손상의 근원이 된다. 실제로, 어떤 연구소에서는 시료가 이미 증폭된 단지 몇 개의 용기를 폐쇄해제시키는 것에 의하여 오염된 일을 경험하고 있다. 비록, 이러한 문제는 생성된 에어로솔을 최소하하기 위하여 애쓰는 고도로 숙련되고 훈련된 요원을 쓰는 것에 의하여 회피될 수 있다하더라도, 이러한 노력의 필요성은 이 기술의 전반적인 사용을 비실용적인 것으로 만들고 있다.
따라서, 본 발명 이전에 있어서는, 주위의 외계를 오염시키는 일 없이 핵산 물질을 증폭 및 검출하기 위한 방법 및 장치를 제공하는 것이 문제가 되어왔다.
본 발명 이전에 있어서는, 검출 단계의 자동화 즉, 조작자의 게재 필요성을 최소화하기위한 또 다른 문제가 여전히 남아있었다. 증폭된 핵산 물줄의 이동 필요성 또는, 검출 시약의 첨가 필요성은 이러한 자동화를 곤란하게 만들었다.
상기한 문제점들은 상술한 필요성을 해소하는 장치 및 방법에 의해서 해결될 수 있다. 본 발명은, 어떠한 증폭된 핵산 물질도 누출되지 못하도록 증폭된 핵산 및 증폭 시약을 큐벳내에 한정시키는 것에 의하여 오염이 방지될 수 있다는 자각에 근거하고 있다.
더욱, 상세하게는, 본 발명의 한 양태에 따라, 상기한 문제점들은 핵산 물질의 증폭 및 검출을 수행하기 위한 밀폐된 일회용 큐벳에 의하여 해소될 수 있으며, 상기한 큐벳은 반응 격실을 포함하는 다수의 격실과, 30- 95의 온도 범위를 통하여 반응 격실의 내용물을 능동적 또는 수동적으로 순환시키는 수단, 적어도 하나 이상의 검출 물질에 사용하기위한 반응 격실에 인접하여 위치하는 적어도 하나 이상의 저장실, 격실의 내용물에 압력이 가하여질 때 전술한 순서로 격실들을 유체적으로 상호 연통하는 수단으로 이루어지며, 모든 격식들은 용기의 외부로 향한 유체 흐름이 봉쇄되며 상기의 반응 격실은 핵산 물질과 반응되지 않은 증폭 시약들을 수용하는 것을 특징으로하고, 적어도 하나 이상의 격실들이 증폭후의 검출하기 위한 핵산 물질을 고정화시키는 수단을 검출 개소에 포함하므로, 증폭된 핵산 물질의 검출이 증폭된 핵산 물질에 의한 다른 용기들이나 장치의 오염없이 이루어진다. 그 결과, 증폭된 핵산 물질의 검출이 증폭된 핵산 물질에 의한 다른 용기들이나 장치를 오염시키는 일 없이 수행된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기한 문제점들은 앞의 단락에서 기술한 바와같은 밀폐된 큐벳에 의하여 해소될 수 있으며, 여기서, 반응 격실중의 시약 내용물은 폴리머라제 효소, 주형 핵산 및 대옥시리보뉴클레오티드로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 상기한 문제점들은 DNA 를 증폭 및 검출하기 위한 장치에 의하여 해소될 수 있으며, 이 장치는
ⅰ) 다수의 격실과, 적어도 하나 이상의 다른 격실에 격실들의 각각을 상호 연통시키기 위한 수단과, 여기서, 이 격실들은
a) DNA 가닥들을 증폭시키기위한 적어도 하나 이상의 반응 격실과,
b) 검출 개소를 포함하며, 증폭된 DNA 를 검출하기위한 적어도 하나 이상의 검출 격실,
c) 증폭된 DNA 가닥들에 검출 물질을 이송하기 위한 수단을 포함하고,
ⅱ) 30- 95의 온도 범위를 통하여 반응 격실중의 내용물을 능동적 또는 수동적으로 순환시키기 위한 수단,
ⅲ) 증폭시키기위한 DNA 시료를 반응 격실내로 주입시키기 위한 적어도 하나 이상의 반응 격실에만 연통된 액체 첨가 수단을 포함하는 큐벳으로 이루어지며, 이 큐벳이
ⅳ) DNA 시료가 주입된 후, 큐벳의 이 통로를 밀봉하는 수단을 또한 포함하는 것을 특징으로 하고, 이 장치가 검출 격실내의 검출 개소상에 적어도 검출 물질 및 DNA 가닥을 이동시키기 위한 수단을 또한 포함하므로, 일단 DNA 시료가 격실내로 주입되어 첨가 구멍이 밀폐되면, 격실의 유체 내용물이 전체의 증폭 및 검출 반응동안에 조작자 및 외계와의 접촉없이 수용된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서는, 상기한 문제점들은 에어로솔이 큐벳으로부터 빠져나가 외계를 오염시키는 일 없이 밀폐된 큐벳내에서 핵산 물질을 증폭 및 검출하는 방법에 의해서 해소될 수 있으며, 이 방법은
a) 증폭 시약이 그 내부에 존재하는 반응 격실과 검출 물질을 사용하기 위한 저장 격실을 포함하며, 격실들중 적어도 하나 이상이 검출 개소를 포함하는 다수의 격실들과, 유체를 이송하도록 격실들을 상호 연통하는 수단으로 이루어지는 큐벳내에 핵산 물질 시료를 주입하고,
b) 큐벳내로 모든 핵산을 가두기 위하여 핵산 물질을 수용하는 큐벳부를 영구히 밀폐하며,
c) 시약들이 유효하게 되도록 미리 설정된 온도 변화를 통하여 큐벳내를 순환시키는 것에 의하여 핵산 물질을 증폭시키고,
d) 반응실로부터 검출 개소로 증폭된 핵산 물질을 유체적으로 이송시키며,
e) 검출 개소로 검출 물질을 유체적으로 이송시키고,
f) 검출 개소에서, 검출 물질로 증폭된 핵산 물질을 검출하는 단계들로 이루어져서, 시종일관, 핵산 물질이 큐벳내에 한정된 상태로 유지된다.
본 발명의 장점은, 증폭된 핵산을 수용하는 큐벳공간의 재개봉을 피하는 것으로 인하여 증폭된 핵산으로 외계를 오염시킬 위험성을 배제시킬 수 있는 큐벳을 핵산 증폭용으로 제공한다는 것이다.
본 발명의 이와 관련한 장점은, 비교적 비숙련된 노력으로 이러한 증폭에 사용될 수 있는 큐벳을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 장점은, 자동화된 방법으로 처리하기 용이한 이러한 큐벳을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 특히 바람직한 큐벳 형태를 사용하여 DNA 를 증폭 및 검출하는 PCR 기술의 사용에 관하여 먼저 설명하기로 한다. 더욱이, 그 방법 및 장치가 증폭된 핵산이 어떠한 형태로든 큐벳으로부터 새어나가지 못하도록 하는한, 어떠한 종류의 큐벳내에서 어떠한 출처로부터의 핵산을 어떠한 핵산 증폭 방법으로 증폭시키던지 유효하다. 핵산은, 예를들면, 플라스미드 또는 클로닝된 DNA 나 RNA, 또는 세균, 효묘, 바이러스, 바이러스나 세균에 의하여 감염된 세포류, 식물 또는 동물을 포함한 어떠한 출처로 부터의 자연적인 DNA 나 RNA 로부터 얻어질 수 있다.
DNA 나 RNA 는 혈액이나 조직물로부터 추출될 수도 있다. PCR 과는 다른 전사 입각 증폭(transcription-based amplification)이라 불리워지는 또 다른 증폭 방법이 Proc. Natl. Acad, Sci, USA, 86 권, 1173-1177 면, 1989 년 2 월(바이오케미스트리)에 기재되어 있으며, 본 발명의 격납 큐벳을 사용하면 도움이 될 수 있다.
제1도는 본 발명에 따라 구성된 큐벳(cuvette)의 평면도이다.
제2도는 제1도의 Ⅱ-Ⅱ 선을 따라 대체적으로 얻어진 단면도이다.
제3도는 제1도의 Ⅲ-Ⅲ 선을 따라 대체적으로 얻어진 단면도이다.
제4도는 제1도의 Ⅳ-Ⅳ 선을 따라 얻어진, 피펫이 없는 상태의 부분 단면도이다.
제5도는 제1도의 Ⅴ-Ⅴ 선을 따라 얻어진 확대 부분 단면도이다.
제6도는 선택적인 일구체예를 도시하는, 제1도의 도면과 유사한 부분 평면도이다.
제7도는 선택적인 일구체예를 도시하는, 제1도의 도면과 유사한 평면도이다.
제8도는 제7도의 Ⅷ-Ⅷ 선을 따라 얻어진 단면도이다.
제9도는 제1도의 도면과 유사한 부분적으로 절개된 평면도이며, 선택적인 일구체예 즉, 제11도의 Ⅸ-Ⅸ 선을 따라 대체적으로 얻어진 절개 평면을 도시한다.
제10, 11 및 12도는 각각, 제9도의 Ⅹ-Ⅹ, XI-XI, XII-XII 선을 따라 대체적으로 얻어진 단면도이다.
제13도는 또 다른 일구체예를 도시하는, 제9도의 도면과 유사한 부분적으로 절개된 평면도이다.
제14 및 15도는 선택적인 일구체예들을 도시하는, 부분적으로 절대된 부분 평면도이다.
제16 도는 제15도의 ⅩⅥ-ⅩⅥ 선을 따라 대체적으로 얻어진 단면도이다.
제17도는 또 다른 일구체예를 도시하는, 제9도와 유사한 부분적으로 절개된 부분 평면도이다.
제18도는 제17 도의 ⅩⅤⅢ-ⅩⅤⅢ 선을 따라 대체적으로 얻어진 단면도이다.
제19도는 선택적인 일구체예를 도시하는, 제5도의 도면과 유사한 단면도이다.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
10, 10A, 10B, 100, 100C, 100D, 100E : 큐벳
12, 14, 41 : 쉬트(스트립)
26, 26A, 26B, 126, 126C, 126D, 126E : 반응격실 28 : 증폭시약
30, 30A, 30B, 32, 32A, 32B, 34, 34A, 34B, 36, 36A, 36B, 38, 38A, 38B, 132, 132A, 132B, 132C, 132D, 132E, 134, 134A, 134B, 134C, 134D, 134E, 136, 136A, 136B, 136C, 136D, 136E, 138, 138A, 138B, 138C, 138D, 138E, 139, 139A, 139B, 139C, 139D, 139E : 저장 격실
40, 140 : 검출 격실 42 : 배수 격실
60 : 외압원
113, 113C, 113D, 115, 115C, 115D, 184, 184C, 184E, 260 : 피스톤
[PCR 기술]
일반적으로, 핵산 증폭은 특수한 프로토콜(protocol)을 통하여 진행된다. 하나의 유용한 프로토콜이 미합중국 특허 번호 4,683,195 호에 설명되어 있다. 간략히 언급하면, DNA 증폭의 경우에 있어서 이 프로토콜은,
1) 관심의 대상인 적어도 하나 이상의 특이적인 핵산 서열을 함유하는 것으로 믿어지는 시료를 얻고,
2)가닥들을 분리하기 위하여 시료를 변성시키며,
3) 시료를 프라이머, 폴리머라제와 같은 확장효소, 그리고 핵산의 복제에 있어서 유용한 다른 종류의 증폭 성분들과 접촉시키고,
4) 단계 #2 와 #3 을 필요한 만큼의 회수로 반복시키며,
5) 증폭된 DNA 를 검출하는 단계들을 특징으로 한다.
이러한 부류중의 바람직한 프로토콜은 다음과 같다.
1) 적절한 제한 효소(들)을 사용하여 완전한 DNA 이중 나선을 선택적으로, 화학적으로 절단하여, 관심의 대상인 영역을 분리한다.
2) 분리된 핵산부(여기서는 DNA)와 뉴클레오티드류의 용액을 소정시간, 예를들면, 10 분 이하로 92 - 95로 가열하여 유지시켜서, 두 가닥의 핵산을 변성 즉, 두 가닥을 풀어서 분리시켜 주형을 형성시킨다.
3) 그 다음, 이 용액을 30 - 60의 영역으로 냉각시켜서, 두 개의 주형 가닥의 각각에 대하여 프라이머를 어닐링(annealing) 또는 "부착" 시킨다. 이를 확실하게 발생시키기 위하여, 약 55정도의 적절한 온도에서 약 15초간, "정온 방치(incubation)" 영역내에 유지시킨다.
4) 그 다음, 이 용액을 약 70로 가열, 유지시켜서, 확장 효소, 바람직하게는 열에 안정한 폴리머라제 효소가 현존하는 데옥시리보뉴클레오티드를 이용하여 주형 가닥들에 결합된 프라이머들을 확장시키도록 한다.
5) 완성된 새로운 쌍의 가닥들을 약 10 - 15 초 동안 92 - 95로 다시 가열하여, 이 쌍이 분리되도록 한다.
6) 그 다음, 적절한 수효의 가닥들이 얻어질 때 까지 단계 3)-5) 를 수 많은 회수동안 반복한다. 반복 회수가 많아지면 많아질수록 더욱 많은 배수의 핵산(여기서는 DNA)이 생성된다. 바람직하게는, 핵산의 소망 농도가 최소량의 시간내에 도달되는 것이며, 여기서, 각 주기는 1 분 미만이 소요된다. 그러나, 5분 정도의 시간이 일 주기동안 소요 수도 있다.
여기서 사용되는 바와같이, "프라이머" 라는 용어는 자연적으로 존재하거나 또는 합성적으로 생성된 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 이것은 어떤 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 확장 생성물의 합성이 유발되는 조건하에 놓여지는 경우, 합성의 개시점으로서 작용할 수 있다. 이러한 조건들로서는, 4 개의 표준적인 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트와 같은 뉴클레오티드류 및 DNA 폴리머라제와 같은 중합용 시약의 존재, 그리고 적절한 온도 및 pH 를 들수 있다. 일반적으로, 본 발명 사용되는 각각의 프라이머들은 15 - 40 개의 뉴클레오티드를 가지며, 바람직하게는 20 - 25 개의 뉴클레오티드를 가진다.
이 모든 것은 약 30- 약 95사이의 온도 주기를 사용하여 하나의 큐벳내에서 수행되는 것이 바람직하다. 본 발명의 큐벳은 PCR 기술이 전문 기술자는 물론, 덜 숙련된 기술자에 의해서도 정확한 방식으로 일상적으로 수행될 수 있도록하는 접근 수단을 제공한다. 본 발명에 대한 완벽한 이해를 위하여, 본 발명과 더불어 수행되는 것으로서의 PCR 기술에 관한 더욱 상세한 설명을 우선 나열하기로 한다.
어떠한 DNA 는 선택적으로 수억배로 복제될 수 있다. 적절한 프라이머 핵산 가닥의 선발은, 최상의 조건하에서, 우선적으로 선택된 DNA 가 복제될 것임을 확실하게 보장한다. 바람직하게는, 모든 프라이머들이 큐벳내로 혼입될 때 바이오티닐화되어, 이하에 기재된 바와같이 진행하여 검출 가능하게 되는 것이다. 확장 효소의 존재하에, 프라이머에 목하 부착된 표적 DNA 의 가열은 선택된 DNA 의 모사물을 포함하는 이중가닥을 생성한다. 이와같이 형성된 새로운 쌍은, 그 다음, 단시간 동안의 고온 변성에 의하여 분리되며, 이 절차가 반복된다. 시료가 첨가될 때, 프라이머, 데옥시리보뉴클레오티드 및 확장 효소는 사전 혼입된 시약들로서거나 또는 DNA 가 함께 첨가된 시약들로서이거나 간에 존재하기만 하면, 하나의 반응 격실 내에서 모두 수행될 수 있다. 사전 혼입된 경우, 이 시약들은 분사물 및 건조물로서 사용될 수 있으며, 이러한 시약들로서는 폴리머라제, 염류, 완충용액류, 안정화제류 및, 복제에 필요한 뉴클레오티드류를 들 수 있다.
폴리머라제 효소는 그 출처에 관계없이 모두 유용하다. 바람직하게는 이하, "TAQ" 로 지칭하는, 더무스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) 로 부터 천연적으로 생산된 폴리머라제또는, 예를들면, EPO 공고 258,017 호에 기재된 바와같은 유전 공학적으로 생산된 어떠한 합성 동등물을 들 수 있다.
효소의 존재로 인하여, 신속한 열주기의 필요성 및 고온에서의 단시간의 체류시간이 강조된다. 92 - 95의 변성 온도는 효소의 실활온도에 근접하는 것이며, 따라서, 긴 가열시간은 불만족스러운 것이 된다.
그후, 복제된 DNA 는 동정되며, 바람직하게는, 적절한 검출 물질이 첨가되거나 또는 그 내부에 수용되어 있는 검출 격실로 상기의 복제된 DNA 를 이동시켜서 동정하는 것이다. 종래의 방법에 있어서는, 이러한 복제된 DNA 의 "이동" 및/또는 검출 프로우브와 같은 시약들의 첨가는 DNA 를 수용하는 반응 격실의 재개봉이 불가피하여, 상기에서 언급한 에어로솔의 문제를 야기하였다. 검출은 복제된 DNA 가닥에 대하여 상보적인 서열의 뉴클레오티드를 통하여 결합될 수 있는 통상적인 물질들의 사용을 포함한다. 이러한 물질들은, 검출 격실내에서와 같은 검출 개소에 DNA 를 포획, 유지시키기 위하여 사용될 수 있는 적절한 수단을 또한 포함한다. 바람직하게는, 이러한 적절한 수단은 포획할 수 있는 막 및/또는 비드(bead) 를 생각할 수 있다.
검출은 일반적으로, 고정화 물질 및 신호 발생 물질을 필요로 한다.
바람직하게는, DNA 를 복제하기위하여 사용된 프라이머가 이미 바이오티닐화되어 있어서, 고정화 물질 또는 신호 발생 물질중의 어느 하나에 부착된 아비딘과 반응할 수 있도록 되어있는 것이다.
이하, "아비딘 - 비드 포획(avidin - bead capture)" 법이라 칭하는, 아비딘이 비드와 같은 고정화 물질에 부착된 경우, 검출 프로우브는 그 자체가 신호를 발생(예를들면, 방사선에 의한) 하거나 또는 신호를 생성하는 시약과 반응하는 복제된 프라이머와 하이브리다이제이션 할 수 있는 핵산 서열로 사용된다. 예를들면, 검출 프로우브는 검출 가능한 신호(예를들면, 색변화) 를 생성하는 류코염료와 반응할 수 있는 어떤 적절한 신호발생 잔기에 부착될 수 있으며, 이러한 것으로는 바람직하게는 효소, 예를들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제를 들수 있다. 프로우브의 3' 또는 5' 말단에 신호 발생 잔기 또는 고정화 물질을 부착하는 기술은 공지되어있다. "합성 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 3' 말단에 대한 티올 특이적 프로우브의 부착에 관한 효율적 방법(Efficient Methods for Attachment of Thiol Specific Probes to the 3' End of Synthetic Oligodeoxyribonucleotides)", 뉴클레익 애시드스 리서치, 15권, p.5303(1987)을 예로들면, 3' 말단 부착에 유용한 기술이 논의되어있다. 5' 말단 부착에 대하여 논의한 논문은 다수가 있으며, 다음은 그 대표적인 것이다 : "5' 말단 기능기.....에 관한 소개(Introduction of 5' Terminal Functional Group.....)", 아날리티칼 바이오케미스트리, 164권, p.336(1987). 3' 또는 5' 말단의 어느 하나가 고정화 물질상에 신호 발생 잔기를 부착시키기 위하여 사용될 수 있다는 것은 대단히 명백하다. 따라서 여기서 사용하고 있는 "프로우브(probe)" 라는 용어는 천연적으로 얻어지거나 또는 합성적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 이것은 프라이머와 같이 작용하지는 않으나, 하이브리다이제이션된 생성물을 형성할 수 있도록 핵산의 하나 또는 그 이상의 서열에 실질적으로 상보적인 되도록 의도된다. 더욱이, 프로우브는 일반적으로 결과로서 얻어지는 하이브리다이제이션된 생성물을 "포획(caption)" 또는 "검출(detection)" 하도록 의도된다.
선택적으로는, 검출 프로우브와 고정화 프로우브는 하나로서 같을 수 있으며, 상기에서 언급한 아날리티칼 바이오케미스트리 잡지내에 기술된 기술을 사용하여 5' 말단에 부착된다.
상기한 바와같이, 아비딘은 서양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 신호 발생 물질에 부착될 수 있으며, 이하, "올리고 포획(oligo capture)" 법이라 칭한다. 이러한 경우에 있어서, DNA 의 고정화는 고정화 프로우브에 의하여 바람직하게 달성될 수 있는바, 고정화 중합체 비드에 부착되는 서열과 같은 복제된 바이오티닐화된 프라이머와 하이브리다이제이션하는 핵산 서열이다.
따라서, 여기서 사용하고 있는 "검출 물질"은 복제된, 바이오티닐화된 프라이머상의 프로우브를 포함하며, 여기서 프라이머는 그 자체가 검출가능한 신호를 발생하거나 또는 검출 가능한 신초를 생성하는 시약과 반응할 수 있는 것이다.
증폭된 DNA 뿐만 아니라, 모든 검출 물질들을 수용하는 큐벳은 혼합을 촉진시키기 위하여 교반 또는 진탕될 수 있으며, 표적 DNA 에 대한 프로우브의 어닐링은 통상적인 온도 주기에 의하여 달성될 수 있다.
DNA 에 대한 프로우브의 하이브리다이제이션은 검출 개소가 있다면, 그곳에 대한 이송 전 또는 후에 수행될 수 있다.
그후, 모든 액체가 검출 개소로부터 제거된다. 이 시점에서, 검출 물질의 일부는 복제된 DNA 가닥의 일부분이 되거나 또는 DNA 가닥에 하이브리다이제이션 되며, 상기의 DNA 는 막의 표면에 포획된다. DNA 가닥을 고정화시키기 위한 수단이 결여되어있는 어떠한 DNA 가닥도 막을 지나 통과하게된다.
최종 단계는 막상에 포획된 DNA 가닥으로부터 돌출되어있는 검출 물질과 반응할 수 있는 류코 염료나 어떤 다른 염료 전구체를 함유하는 액체를 검출 격실내로 주입하는 것이다. 유용한 류코 염료로서는, 미합중국 특허 번호 4,089,747 호에 설명되어있는 것들을 들수있으며, 바람직하게는, 폴리(비닐 피롤리돈) 과 같은 가용성 중합체와 조합하여 사용되는 것이다. 염료의 바람직한 예로서는 2-(4-하이드록시-3, 5-디메톡시페닐)-4, 5-비스(4-메톡시페닐)이미다졸을 들수있으며, 그 이유는 이것이 서양고추냉이 퍼옥시다제1분자당 약 1000 염료 분자를 발색시키기 때문이다.
언급한 바와같이, DNA 는 비드상의 프로우브에 부착되거나 또는 하이브리다이제이션될 수 있다. 이러한 비드를 위한 유용한 물질로서는, DNA 에 대하여 하이브리다이제이션될 프로우브나 아비딘의 어느 것인가에 대하여 결합하기에 유용한 반응기를 갖는 중합체를 들수 있다. 활성 할로겐 원자류, 2-치환활성화 에틸술포닐 또는 비닐술포닐기를 통한 아비딘의 이러한 중합체상에 대한 통상적인 공유 부착이 알려져있다. 따라서, m 및 p-(2-클로로에틸술포닐메틸)스티렌의 공중합체가, 예를들면, 이러한 비드에 대하여 유용하다.
전술한 절차를 실용적인 것으로 만들 수 있는, 본 발명의 두가지 핵심적인 양태가 있다.
그 첫 번째는, 반응 격실의 내용물이 신속하게 가열된 다음, 신속하게 냉각될 수 있도록 효율적인 열 전달을 사용하는 것이다. 능동적 또는 수동적 순환이 일어진다면, 능동적 또는 수동적인 가열 및 냉각을 허용하는 수단이 유용하다. 즉, 펠타이어(Peltier) 장치를 반응 격실내에 장착하여 격실에 테를두른 열 전달 벽을 제공하도록 할 수 있다.
그러나, 바람직하게는, 열전달이 수동적인 수단에 의하여 이루어지는 것이며, 여기서, 열전달 물질은 반응 격실의 벽표면 대부분이다. 열원 또는 히트 싱크가 외원으로부터 공급되며, 가장 바람직하게는 큐벳의 양옆으로 공급되는 것이다.
두 번째의 핵심적인 양태는, 증폭된 핵산이 새어나가지 못하도록 큐벳 격실들을 구성하는 것이다. 즉, 격실들은, 일단 증폭이 일어난 후에는 외계로 누출되지 않도록 밀봉되어져야만 한다. 하나의 바람직한 구성은, DNA 가 도입되기 전에 모든 시약들이 격실내로 사전 혼입되는 것이며, DNA 도입후에 누출되지 않도록 큐벳을 잠그기 위한 잠금 수단을 사용한다. 이러한 일 구체예에 있어서는, 필요한 반응을 달성하기 위하여, 바람직하게는 압력을 사용하여 밀폐된 큐벳내에서 격실을 상호간의 액체 연통을 이룰수있도록 하기 위한 수단이 제공된다.
[열 주기(Thermal Cycling)]
바람직한 열 전달 메카니즘 즉, 격실의 수동 전달벽에 관하여 우선적으로 고려하면, 이러한 벽의 재료는 고율의 열에너지 전달을 제공할 수 있는 소정의 열 경로길이 및 열저항률을 제공하도록 선정된다. 가장 바람직하게는, 이러한 경로 길이가 약 0.3 ㎜보다 크지 않아야하며, 1 ㎠ 의 단면적에 대한 열저항률이 약 5.0/와트보다 크지않아야 한다. 이들 특성은 두께가 약 0.05㎜ 인 플라스틱, 또는 알루미늄과 같은 금속과 플라스틱의 라미네이트로 열 전달력을 구성시키는 것에 의하여 용이하게 달성될 수 있다. 이러한 알루미늄은 두께 χ/(전도율 Kㆍ표면적A)로 환산한 열저항률 R 이 약 0.003/와트이다(이 값은 약 0.24/와트의 열저항률을 갖는 동일 두께의 통상적인 유리와 좋은 대조를 이룬다). 플라스틱, 바람직하게는, 중밀도 폴리에틸렌으로 한쪽 또는 양쪽이 코팅된 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)와 같은 열 봉합가능한 코팅된 폴리에스테르는 약 0.005㎝ 의 바람직한 두께의 대하여 1.06/와트의 열 저항률을 갖는다.
열 전달벽은 어떤 적절한 수단에 의하여 다른 큐벳 벽에 고정될 수 있다. 이러한 하나의 수단은 초벌칠된 접착층이며, 예를들면, 상기한 수단은 통상적인 고온 아크릴성 접착제로 이루어지며, 이어서 통상적인 폴리에스테르 접착층이 후속된다. 이들 접착층은 열 전달벽의 표면상에 연장될 수 있으며, 이러한 연장이 사용되는 경우에는, 알루미늄이 큐벳내에서 발생하는 반응들을 저해하는 것을 방지하게 할 수 있다. 선택적으로는 플라스틱층으로 알루미늄을 피복할 수도 있다.
이러한 열전달벽으로 구성된 큐벳은 약 200μl 의 액체부피에 대하여 10 초 이하의 열 시간 상수, 타우(tau : τ) 를 생성하는 것으로 판명되었다. 가장 바람직한 것은, τ가 3 - 8 초의 오더(order)이다.
즉, 물이 채워진 이러한 큐벳을 열전달벽의 외면을 따라 가열하고, 반응 격실 내부의 상기벽의 대응점에서 그 온도를 측정하는 경우, 28로부터 103.9의 최종 온도까지 열 반응 곡선이 얻어진다. 그 내부의 액체가 76의 온도에 도달하는데 요하는 시간(63의 차이(103.9 - 28))이 타우(τ) 값이다. 이것은 잘 알려져있는 다음의 열 반응식으로 부터 대략적으로 유도된다.
1) 온도 T(t) = 최종 온도 +(초기온도 - 최종온도) ㆍe-t/τ
따라서, 의문시되는 시간 간격 t가 타우와 동일하다면 e-t/τ= e-1"R 0.37 이다. 이러한 경우에 있어서는 T(t)(t = 타우의 경우)는 초기온도 + 63의 (최종온도-초기온도)의 합과 동일한 온도이다. 이러한 값으로 부터, 큐벳내의 액체에 대한 타우는 약 3.5 초가 되는 것으로 판명되었다. 반응 격실내의 액체와 알루미늄 사이에 개재층을 사용하는 바람직한 형태에 대하여, 타우 즉, 열시간 상수는 큐벳내의 액체가 물인 경우에도 여전히 약 10초 이하이다.
선택적으로는, 열원이 디포커스(defocus) 된 레이저일 수 있다. 이러한 경우에 있어서는, 열 전달벽으로서 대단히 투명한 폴리에스테르 층을 사용하는 것이 바람직하며, 레이저에 대하여 적절한 흡수 파장을 갖는 염료가 반응 격실내로 혼입된다.
[격납]
본 발명의 또 다른 양태에 대하여 생각하면, 증폭된 DNA 는 큐벳내에 갇혀져야만 한다. 이것은, 증폭에 필요한 시약들 즉, 프라이머 가닥, 데옥시리보뉴클레오티드 및 확장 효소를 핵산 물질 시료의 첨가전에 큐벳내에 미리 혼입시키거나, 또는 시료와 함께 첨가하는 것을 의미한다. 더욱 바람직하게는, 검출 물질을 시료의 첨가전에 미리 혼입시키는 것이며, 그 결과, 시료 첨가후 및 증폭전에 누축되니 않게 큐벳을 밀폐시키면, 더 이상의 첨가가 필요하지 않게된다. 그러나 선택적으로, 증폭후에 검출 물질을 저장격실에 첨가할 수 있도록 다음 조건하에 큐벳을 구성시킬 수 있다. 1) 검출 물질이 첨가되는 저장 격실은 증폭에 사용되는 반응 격실과 분리되어 있어야 하며, 2) 저장 격실에 증폭된 핵산을 공급하는 것이 아니라, 저장 격실에 증폭된 핵산에 대한 시약을 공급할 수 있는 편도의 체크 밸브와 같은 수단을 제공하여야 한다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 큐벳은 저장 격실과 검출 격실사이를 소통시키기 위한 수단이 설치된다. 일 구체예에 있어서, 이러한 소통수단은 저장 격실로부터 검출 개소까지 시약을 이동시키기 위한 압압 부재와 같은 수단, 예를들면, 별도의 검출 격실을 포함한다. 선택적으로, 가장 바람직하게는, 압압 수단이 큐벳의 외부에 위치하고, 큐벳의 벽이 외부로부터 내부로 압력을 전달하기에 충분할 정도로 가요성인 것이며, 따라서, 큐벳내의 시약들을 압착하여 이동시키는 것이 가능하게 된다.
외부의 압력원으로서는, 예를들면, 압압 롤러나 공기 실린더로 부터의 피스톤의 어느 것일 수 있다.
[전형적인 큐벳 구체예]
본 발명의 제1도의 큐벳(10)은 압압 롤러와 같은 외부의 압압 수단(60) 과 공동 작용하는 가요성 격실을 특징으로하여, 본 발명의 전장치를 제공한다. 더욱 상세하게는, 제2도의 큐벳(10)은 두 개의 비교적 얇은 쉬트(12, 14) 로 이루어지며, 이 쉬트는 서로 포켓 또는 격실을 짝지워 이루도록 성형되고 접촉하는 쉬트들의 평면으로부터 돌출되는 통로를 연통시키는 바와같이 하여 형성된다. 이 쉬트들은 적어도 그 외주연(16)을 따라 함께 고정되며, 바람직하게는, 열 봉합 및/또는 초음파 압압 봉합에 의해서와 같이, 격실들 또는 통로들을 에워싸는 모든 점들에서 고정된다. 에틸렌 비닐 아세테이트와 같은 열에 의하여 활성화될 수 있는 접착제가 이러한 접합 조작에 유용하다. 액체 주입구(22)는 봉합된 주연(16)에 있어서 예외이며, 이것은 합치되는 피펫(24) 과 함께 사용된다. 이러한 구멍(22)은 선택적으로 제4도에 나타낸 바와같이, 그 내부로 연장되는 견고한 테(23) 를 포함하며, 그 내부에 피펫(24)이 위치된다.
격실들은 다음과 같다 :
격실(26)은 반응 격실이며, 제2도에 나타낸 바와같이, 선택적으로, 액체 또는 건조된 형태로 그 내부에 사전 혼입되는 증폭 시약들(28)을 수용한다. 제1도의 격실(30)은 하나의 사전 혼입된 시약으로서의 세정수를 수용하는 제1의 세정 격실로서의 저장 격실이다. 격실(32)는 그 내부에 사전 혼입된 적어도 하나 이상의 검출 물질 즉, 증폭된 DNA 에 부착되기 위한 상보적인 뉴클레오티드를 그 한쪽 말단에 갖고 있는 바이오티닐화된 프로우브를 수용하는 저장 격실이며, 바람직하게는, 신호 발생 잔기, 예를들면, 상기에서 언급한 서양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 아비딘을 또한 수용한다. 저장 격실(34)은 제2의 세정액 수용 저장 격실이며, 저장 격실(32)의 체적보다 더 큰 체적을 갖는 것이 바람직하다. 저장 격실(36)은 그 내부에 사전 혼입되는 나머지 검출 시약들 즉, 과산화물 및 류코 염료, 예를들면, 2-(4-하이드록시-3, 5-디메톡시페닐)-4, 5-비스(4-메톡시페닐)이디다졸, 바람직하게는 안정화제로서의 폴리(비닐 피롤리돈) 과의 조합물을 수용한다. 저장 격실(38)은 너무 많은 류코 염료가 발색되는 것을 방지하기 위하여 그 내부에 사전 혼입되는 정지 용액, 예를들면, 소디움 아자이드 용액을 수용한다.
최종적으로, 격실(40)은 이후 논의될 본 구체예에 있어서의 검출 개소이며, 격실(42)은 배수 격실이고, 바람직하게는 그 내부로 액체가 강제유입됨에 따라 팽창할 수 있도록 초기에는 수축되어있는 것이다. 격실(42)은 통로(44) 를 경유하여 격실(40)에 연통되어 있다. 선택적으로, 편도 체크 밸브(도시하지 않음)가 통로(44)에 포함될 수 있으며, 이와 같이하여 격실(40) 내부로 폐액이 역류하여 바람직하지 못한 바탕색을 내는 것을 방지하게 된다.
상호 연통은 다음과 같다 :
통로(21)는 주입구(22)와 격실(26)을 연통하며, 통로(44)는 압력이 롤러(60)에 의하여 발생될 때까지 격실(26)에 도입된 DNA 를 보호 유지하기 위하여 46 에 설치된 임시적인 봉합을 제외하고는, 반응 격실(26) 과 검출 격실(40)을 연통한다. 제2도에 나타낸 바와같이, 통로(48),(49),(50),(52),(54)는 각각 격실(30),(32),(34),(36),(38) 과 검출 격실(40)을 연통하며, 다시 상기 각각의 통로들은 임시적인 봉합(56)을 갖는 것이 바람직한바, 이것은 롤러(60)가 봉합부를 파손시킬때까지 각각의 격실로 부터의 유출을 방지하게 한다. 통로(54)는 다른 통로(48, 49, 50 및 52)가 연통되는 간선으로 제공된다.
격실들은 신중하게 고려하며 제1도와 같이 위치되며, 그 결과로서, 롤러(60)가 화살표(62)의 방향으로 경로 A 를 따라 진행하는 것에 의하여 각각의 격실들은 적절한 순서로 격실(40) 내로 유입하게 된다. 따라서, 우선적으로 증폭된 DNA 가 격실(40) 내로 밀려 들어가며, 그 다음은 제1세정액, 그 다음은 류코 염료용액, 그리고 최종적으로 정지용액이 밀려들어가게 된다. 류코 염료로 부터의 발색이 빛하에서 용이하게 탈색되는 어떤 경우에 있어서는, 발색은 암소에서 수행되어야 한다. 또한, 각각의 통로들은 롤러에 의해서 압착될 수 있도록 구성되는 것이 바람직하며, 즉, 통로들은 경로 A 내에서 화살표(62)에 대하여 직각 미만인 각도를 항상 형성하도록 구성된다. 통로들이 직각을 형성하는 경우에는, 롤러가 통로를 압착시키지 못하고 통로위로 튀어오르기 쉽다.
양 쉬트(12)와 (14)가 롤러(60)에 의하여 압착되는 것은 필수적인 것은 아니다. 단지 양 쉬트중의 어느 하나가 적어도 170 g/㎝ 의 압력하에 놓여질 수 있기만 하면 된다. 1500 g/㎝ 정도의 높은 압력도 유용하다. 따라서, 제5도에 있어서, 쉬트(12)는 열 봉합가능한 폴리에스테르, 예를들면, 3 M 사에 의하여 제조된 상표 스코치팩(ScotchpakTM) 등급의 열 봉합가능한 필름 번호 229 와 같은 압착가능하고 비교적 가용성인 플라스틱으로 이루어지며, 반면에 쉬트(14)는 가요성 및 압착성이 더 낮은 것일 수 있고, 또는 쉬트(12)와 동일한 가요성을 갖는 것일 수도 있다.
적어도 제5도에 나타낸 바와같이 격실(26)에 있어서는, 쉬트(14)가 외측상의 알루미늄박과 내측상의 중합체층(66), 바람직하게는 쉬트(12)와 같은 폴리에스테르층의 적층구조로 구성될 수 있다. 알루미늄박은 바람직하게는, 약 0.0013㎝ 와 약 0.026㎝ 사이의 두께를 갖는 것이며, 가장 바람직하게는 약 0.005㎝ 이다. 층(66)은 약 0.0013㎝ 와 약 0.03㎝ 사이의 두께를 갖으며, 가장 바람직하게는 0.005㎝ 이다. 층(66)이 존재한다 하더라도, 격실(26)의 열 경로 길이는 약 0.3㎜ 이하 이어야하며, 열 저항률은 약 5.0/와트를 초과하지 않아야 한다. 플라스틱 단일층에 대한 적층 구조의 장점은, 일단 격실이 롤러에 의하여 압착되면 하류쪽 압력하에 액체를 역류시킬수도 있는 바와같은 재팽창을 알루미늄이 저해한다는 것이다. 이와같은 이유로 하여, 쉬트(14)는 큐벳(10)의 전장에 걸쳐 적층 구조로 구성되도록 하는 것이 바람직하다. 액체가 그 격실로 부터 분출된 다음에는, 다른 격실을 비우기 위하여 사용되는 더 하류쪽의 통로까지 역류되지 않는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위하여, 제1도에 있어서의 롤러(60)가 좌측으로부터 우측으로 진행함에 따라, 조임 수단이 다음과 같이 통로들을 조이기 위하여 큐벳(10) 상의 하향 경사부에 사용될 수 있다.
롤러(60)가 격실(26)을 가로질러 이동함에 따라 P₁위치에서 조임이 수행된다. 롤러가 격실(30)을 가로질러 이동함에 따라 P₂위치에서 조임이 일어나며, 격실(32)에 대하여는 P₃위치에서, 격실(34)에 대하여는 P₄ 위치에서, 그리고 격실(36)에 대하여는 P5위치에서 마찬가지로 조임이 일어난다.
선택적으로, 제6도에 나타낸 바와같이, 모든 출구 통로들을 우선적으로 물로 채우는 것을 확실하게 하기 위하여 전방 세정 격실을 포함할 수 있으며, 그 결과, 상류의 격실들이 하류의 격실들로 향한 통로내로 역류 할 수 없게 된다. 이미 언급한 부분들과 유사한 부분들에 대하여는 구별하기 위하여 첨자 A 를 동일한 참조 번호에 부여하였다.
따라서, 제6도에 있어서, 롤러(60)와 조우하는 가장 첫 번째의 격실은 간선(54A) 까지 통로(62) 를 경유하여 비워지게 되는 세정수를 수용하는 저장 격실(61) 일 수 있다. 나머지 통로(44A),(48A),(49A),(50A) 및 (52A) 모두는 앞서 기재한 바와같이 그들 각각의 격실들로 부터 연통된다. 격실(26A)에 대한 주입통로(21A) 및 주입구(22A)는 격실(61)로 인하여 큐벳(10A)의 반대쪽 가장자리로 이동된다. 격실(61) 과 통로(61)의 작용은 롤러가 이 격실을 납작하게 만들 때, 격실(61) 내의 세정수로 모든 격실들의 모든 통로를 채우기 위한 것이다.
그후, 각각의 연속된 격실이 롤러에 의해서 납작하게 될 때, 격실(26A)의 증폭된 DNA 가 통로(48A),(49A),(50A) 또는 (52A) 내에 이미 채워져있는 물로 인하여 상기 통로중의 어느 하나내로 밀려들어가게 될 가능성이 전혀 배제된다. 이러한 물은 각각의 격실들의 내용물을 검출 격실까지 이동시킴에 있어서 불리한 영향을 미치지는 않는다. 격실(61)은 격실(32),(36) 및(38) 내에 저장된 건조된 시약들을 재구성(re-constitution) 할 수 있는 부가적인 장점을 제공한다. 즉, 이하 설명하는 바와같이, 각각의 격실들이 그 각각의 통로에 대한 출구를 봉쇄하기 위하여 사용되는 경미한 열 봉합이 생략되고 이들 시약들이 그들의 격실내에 건조된 상태로 있는 경우, 격실(61)이 롤러에 의하여 압압되어 큐벳을 물로 채우게되면, 격실(61)의 물이 건조된 시약들을 재구성시키게 된다. 선택적으로, 이것은 큐벳을 진탕시키는 것에 의하여 촉진될 수 있다. 이러한 재구성 단계를 반응격실내로 시료를 주입하기 전이나 후, 또는 반응 격실내에서의 증폭전이나 후에 일으킬 수 있다.
앞서 언급한 구체예들은 격실들 각각의 연속적인 압압으로 특징지워진다.
부가적으로, 조임위치 P₁ - P5가 또한 사용되는 조건하에, 액체를 수용하는 모든 격실들에 대한 동시적인 압압도 사용될 수 있다. 즉, 압력이 통로(44) 를 제외한 통로들의 출구를 봉쇄하기 위하여 P₁ - P5모두에 가하여지는 경우, 격실(26),(30),(32),(34),(36) 및(38) 모두에 대하여 압력이 동시적으로 가하여질 수 있다.(예를들면, 적절히 위치시킨 공기 피스톤에 의함). 그러나, 단지 통로(44) 만이 봉쇄 해제되어 있으므로, 증폭된 DNA 만이 이송된다. 그후, 조임 위치 P₁만이 조임 해제되면 통로(49) 를 통하여 세정액을 이송시키게되며, 조임 위치 P5가 최종적으로 조임 해제될 때 까지 그러한 방식으로 계속된다. 각각의 격실들 및 통로들내에 액체를 한정하고 있는 봉합부의 파열에 필요한 압력미만으로 가압되도록 주의 하여야만 한다.
제1도 및 제3도에 있어서의 검출 격실(40)은 파일(piles)(43),(43'),(43"), 및(43'")이 배치되어있는 지지 쉬트(41)인 검출 부재(39) 로 구성되어있는 흐름 경유(flow-by) 격실이다. 올리고 포획법이 사용되는 경우, 각 파일은 상기한 검출 프로우브가 이동 불가하게 부착되며 검출하고자 하는 DNA 와 하이브리다이제이션하도록 구성되는 중합체 비드로 이루어진다. 가장 바람직하게는, 각 비드는 다른 종류의 DNA 에 대한 다른 종류의 검출 프로우브를 갖으며, 그 결과, 충분히 다른 종류의 비드 파일들, 예를들면, 8 - 10 의 비드 파일들이 존재하는 경우, 격실(36)의 염료로 부터 발색되는 비드들에 기초하여 티슈 타이핑(tissue typing)을 수행할 수 있다. 라택스 비드가 통상적이다.
쉬트(41)는 비드 파일에 부착될 수 있는 물질로 부터 선택되며, 비드 파일들이 그 제조시 침착, 건조될 때 상기의 파일들을 적소에 보호 유지시키게 된다. 유용한 예로서는, 니트로셀룰로스, 팔 코포레이션( Pall corp.)에 의하여 제조되는 바와같은 다공성 나일론 막을 들 수 있으며, 가장 바람직한 것은 라택스로 코팅한 종이이다. 이러한 라택스로 코팅된 종이의 예를들면 다음과 같다 : 무게 약 54g/㎡, 두께 약 0.6 ㎜ 이고, 약 80의 경목(hardwood) 처리한 종이를 표면 사이징(sizing) 처리한 다음, 평균 약 7g/㎡ 의 라택스 코팅으로 피복시킨 것을 들 수 있으며, 상기의 코팅 조성은 통상적인 공업용 등급의 라택스, 20 중량의 NaOH, 분산제로서의 TSPP, 이산화 실리콘 및 이산화티탄과 같은 불투명화제, 하이드래스퍼스(hydrasperse) 클레이 및, 그 나머지의 증류수로 이루어진다.
쉬트(12)와(14)는 다음과 같이 제조, 조립된다 : 쉬트(14)는 제1도 및 제2도에 나타낸 바와같이 형성된 격실 오목부를 갖도록 사전 성형된다. 상기의 오목부가 컵 형상이 되도록 쉬트(14) 를 위쪽이 아래가 되도록 돌린다음, 격실(30),(32),(34),(36) 및(38) 내에 들어가는 액체 및 건조된 시약(38) 등을 넣는다. 그 다음, 현재 상판인 쉬트(12) 를 정확히 겹쳐지도록 하며, 상기의 쉬트(12)는 제2도의 26' 로 나타낸 합치하는 오목부를 제외하고는 본질적으로 편형하다. 그 다음, 2 장의 쉬트를, 격실(26) 과 통로(21)의 이음부(25) 를 제외하고는 제1도에 해칭선으로 표시한 바와같이 각 격실들의 주연부를 서로 가볍게 붙인다. 예를들면, 가벼운 열 봉합은, 각각의 출구 통로에 대한 각 격실의 방출구를 포함한 상기 부분들에서 2 장의 플라스틱 쉬트를 부착시킨다. 이것은 액체가 도입된 경우, 격실로부터 액체가 진행하는 것을 잠정적으로 봉쇄하게 되나, 롤러(60)가 사용될 때에는 봉쇄가 해제된다(이러한 잠정적인 봉쇄는 제2도에서 통로(48),(49),(52) 및(54)의 단면상에 파선으로 나타나있으며, 액체가 격실들로 부터 이 잠정적인 밀봉부로 강제로 통과될 때 분리되는 위치를 나타낸다).
그후, 열 봉합과 같은 견고한 봉합은 각 격실들의 주연 및 그 출구통로주위에 수행되나, 격실에 대한 통로의 이음부를 횡단하는 방향으로 이러한 열 봉합은 수행되지 않는다. 또한, 외주연(16)에 대하여도 열 봉합이 수행된다. 이러한 격실들 주위의 봉합은, 격실들로부터 액체가 압압되는 경우 액체가 쉬트(12)와(14) 사이의 어느곳으로 누출되지 않고 단지 각각의 통로를 따라서만 흐르게 되도록 한다.
큐벳(10)이 사용될 때, 제5도에서의 환자의 시료(5)는 피펫(24)을 경유하여 구멍(22)을 통하여 격실(26) 내로 주입된다. 이것은 오목부(26')가 제2도 에서의 형영(phantom) 및 제5도에서의 실선으로 나타낸 바와같이, 쉬트(12)의 나머지 부분과 대략 동일 높이가 되기에 충분한 정도로 "튀어 나옴(pop out)" 을 야기한다.
선택적으로, 부분 26' 는 제19 도에 있어서와 같이 대향하는 수포(26") 를 형성하도록 쉬트(12)의 나머지 부분이 이루는 평면을 넘어 튀어나오게 되도록 강제될 수 있다. 더욱이, 제19 도에 나타낸 바와같이, 쉬트(12)와(14)는 어떠한 금속 성분이나 금속층을 보유할 필요가 없으며, 전적으로 플라스틱 쉬트만으로도 충분한 열전달율을 제공할 수 있다. 제1도 및 제4도에서의 구멍(22)은 증폭 단계에 앞서서 피펫(24)을 꺼낸후에는 폐쇄될 수 있어야만 한다. 이것은 폐쇄된 구멍을 열 봉합 시키거나, 또는 스트립(12)와(14) 를 견고한 밀봉으로 열봉합시키는 것 또는 도시하지 않은 편도 밸브를 갖는 테(13) 를 구성시키는 것과 같은 적절한 방식으로 구멍을 폐쇄시키는 것에 의하여 달성될 수 있다. 구멍(22)이 열 봉합될 경우에는, 테(13)가 생략되는 것이 바람직하며, 피펫( 24)은 직접 구멍내로 단지 밀어 넣어진다. 어떠한 봉쇄 방식을 사용하든지 간에, 그것은 PCR 증폭시 또는 액체 이송시에 생기는 어떠한 압력에도 견딜 수 있어야만 한다. 열 봉합은 바람직한 방법이다.
상기한 바와같이, 필요한 열적 PCR 주기를 제공하기 위한 가열 및 냉각은 격실(26)에 한쪽 또는 양쪽의 스트립(12)와(14) 를 가열하여 일으키는 것이 바람직하다.
증폭된 DNA 가 격실(40)에 들어가는 경우, 열이 스트립(14) 를 통하여 가하여지는 동안, 하이브리다이제이션이 일어나도록 잠시동안 그곳에 보호 유지된다. 바람직하게는, 스트립(14)은 격실(40)에 있어서 투명하여, 그 내용물을 검사할 수 있도록 가시광선 파장과 같은 적절한 파장의 방사 전달을 가능하게 한다. 격실(42)은 공기 유입뿐만 아니라 액체의 유입도 수용할 수 있도록 팽창가능하며, 그 이유는 상기의 격실이 바람직하게는 그 사용전에 있어서 수축되어 있기 때문이다. 선택적으로, 본 큐벳을 수용, 사용하는 장치는, 배출 체적이 필요한 경우, 제3도에 나타낸 바와같은 팽창된 형상으로 격실(42)을 당기는 진공판을 포함할 수 있다. 격실들이 증폭된 DNA 가 역류되어 유입되는 것을 방지할 수 있는 조건하에서라면, 모든 격실들(30) -(38)은 증폭시 및 후에 있어서 제7도 및 제8도에 있어서와 같이, 외계로부터 밀봉되는 것이 필수적인 것은 아니다. 이미 언급한 부분들과 유사한 부분들에 대하여는 구별하기 위하여 첨자 B 를 동일 참조 번호에 부여한다. 따라서, 큐벳(10B)은 앞에서와 같이 격실들(26B),(30B),(32B),(34B),(36B),(38B),(40B) 및(42B) 를 갖으며, 앞에서와 같이 작용할 수 있도록 상기 격실들을 상호 연통하는 통로들을 갖는다. 그러나, 각각 및 모든 격실들은 그 주연부(16B)에 설치되는 액체 주입구(70) 를 갖으며, 이 주입구(70)는 외계로부터 각각의 격실까지의 유체 경로인 연통하는 통로(72) 를 갖는다. 이러한 구성에 있어서는, 격실(26B)만이 DNA 증폭시에 그 내부에 액체 즉, 시료 DNA 와 증폭 시약들을 수용한다(주입구(22B)는 이때 봉쇄된다). 왼쪽에 있는 다른 격실들은, 그 출구 통로와 그 이음부로 형성되는 잠정적인 열 봉합으로 인하여 열려져있다. 추가적인 안전장치로서, 체크 밸브(80)가 이들 격실내로의 DNA 역류를 방지할 수 있도록 통로(54B) 내에 삽입될 수 있다. 이러한 밸브는 통상적인 것이며, 예를들면, 제8도에 있어서와 같이, 시트(82)와, 상류쪽 후방으로 밀려지는 경우, 흐름을 정지시키도록 시트(82) 상에 위치하는 볼(84) 로 구성될 수 있다. 볼(84)은 자유로이 이동가능하나, 작은 멈추개(86)에 의하여 그 하류쪽으로는 흘러갈 수 없다. 밸브(80)는 간선 통로(54B)에 위치하는 것이 바람직하며, 그 이유는 모든 저장 격실들에 대하여 하나의 밸브만을 사용할 수 있으며, 경로 A 의 외측에 위치하므로, 즉, 압압 롤러의 통과를 방해하지 않기 때문이다.
각각의 저장 격실이 제7도에서의 피펫으로부터 적절한 액체를 수용한 후 및 경로를 따라 압압 롤러가 이동하기전에, 각 주입구(70)는 구멍(22A)의 봉쇄와 유사한 방식으로 단단하게 봉쇄된다. 선택적으로, 주입구(70)는 모든 시약들을 사전 혼입시키기 위한 채움기술(fill technique)을 사용할 수 있다.
나머지 구체예들에 있어서는, 격실들을 수축가능한 가요성 벽으로 하는 대신에, 증폭된 DNA 및 검출 물질들과 같은 수용 액체를 이동시키기 위한 방법, 또는 모든 격실들을 유체적으로 상호연통시키는 방법으로서, 적절한 격실을 형성하는 피스톤실내의 피스톤을 사용할 수 있다. 즉, 피스톤은 격실들의 가요성 벽과 동등한 크기를 갖는다. 따라서, 제9도 - 제12 도에 있어서, 제9도의 큐벳(100)은 제10도의 열 전달벽(114)을 갖는 반응 격실(126), 세정액 저장 격실(134). 류코 염료 저장 격실(136), 정지 용액 저장 격실(138) 및 다른 세정액 저장 격실(139) 로 구성되며, 각각 상기 격실들로 부터 연장되는 통로(144),(149),(150),(152),(154) 및(156)을 갖는다. 바람직하게는, 벽(114)은 앞서의 구체예들과 같이 구성되는 것이다. 이들 격실들 각각은 피스톤실로서 작용하며, 각각의 실들의 내부에는 격실내의 시약들의 외측으로 배치된 각각의 피스톤(113) 또는 (115)가 장착된다. 바람직하게는, 피스톤은 도시한 바와같이 2 중 밀봉 구조이며, 격실에 대하여 확실하게 계합되는 구동 작동자(도시하지 않음) 용 홈(도시하지 않음) 과 같은 수단을 포함한다. 그러나, 통로(149)와(150)은 통로(151) 를 함께 형성하도록 연결하는 것에 의하여 제9도와 제12 도에 있어서의 격실(126) 과 연통된다. 유입되는 DNA 시료는 또한, 제9도에 있어서의 외부 쇼울더(123)가 설치된 액체 유입구(122) 로 부터 통로(121) 경유하여 격실(126)에 공급된다. 통로(152),(154) 및(156)은, 제9도의 격실(126) 로 부터 연통되는 통로(144) 내로 통로(155)에서 제12 도에서와 같이 함께 연결된다. 그 다음, 통로(155)는 격실(14) 로 연통되는 통로(157)와 쇼울더(123) 내의 159 에 위치하는 출구 통로를 형성하도록 분지된다. 쇼울더(123)는 외부적으로 나사산이 형성되어있는 멈추개를 수납할 수 있도록, 도시하지는 않지만 내부적으로 나사산이 형성되어 있으므로, 유입구(122)와 출구(159)의 양방은 멈추개에 의하여 밀봉시킬 수 있다.
팽창할 수 있는 어떠한 가요성 벽도 존재하지 않으므로, 분리된 피스톤실(182) 과 피스톤( 184)은 제9, 11 및 12 도의 검출 격실(140) 로 부터의 공기 팽창을 허용할 수 있도록 설치된다. 실(182)은 통로(185) 를 경유하여 격실(140)의 저부까지 연통된다. 이것은 실 내부의 피스톤(184)을 수동으로 끌어당기는 것에 의하여 수행될 수 있다. 축(187)은 피스톤은 끌어 당기기 용이하도록 피스톤(184) 으로 부터 돌출되어 있을 수 있다. 특히, 제9도를 참조하면, 흐름 통과(flow-through) 격실(140)은 다른 격실들로부터 이송된 상태 그대로의 액체가 첫 번째로 유입되는 상방부(190) 및, 투과막(194)에 의하여 상방부와 분리되는 제10도에 있어서의 하방부(192) 를 갖는다. 하방부(192)는 실질적으로 흡수제(196)에 의하여 점유되며, 격실(140) 로 유입되는 모든 과잉량의 액체를 흡수하도록 되어 있다. 막(194)은 바람직하게는, 주조되거나 짜여지거나 또는 전기 광학적으로 제조된 미세 여과막이다. 흡수제(196) 로서는, 예를들면, 셀룰로스 아세테이트와 같은 어떠한 적절한 물질도 사용가능하다. 막(194)은 DNA 와 하이브리다이제션된 것들로 부터 유리된, 미반응된 검출 표식을 분리함에 있어서 도움이 되도록 작용한다. 즉, 격실(132) 내의 검출 프로우브는, 일단 액체가 격실(140)에 도달되면, 격실(126) 내의 증폭된 DNA 와 하이브리다이제이션 및 막(914)(또는, 막에 의하여 포획되는 비드에 부착될 수 있도록 의도된다. 이러한 프로우브들은 류코 염료 및 과산화물이 격실(14)에 도달되면 이들과 반응하는, 서양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 표식을 또한 포함할 수 있다. 격실(132),(134),(136), 및(138)은 액체를 가하여 채울 수 있으며, 그 다음, 피스톤을 삽입한다. 선택적으로는, 도시하지는 않지만, 미리 패킹된 앰풀을 삽입할 수 있으며, 그다음, 피스톤을 삽입하여, 피스톤에 의하여 압압되도록 하는 것으로서, 부서지기 쉬운 앰풀이 파괴되어 액체를 방출하도록 할 수도 있다. 큐벳(100) 내의 액체의 이송은 피스톤(113),(115) 및(184)에 의하여 모두 제어될 수 있으며, 여기서 피스톤(184)은 다른 피스톤들이 진행하도록 진공을 만들기 위하여 사용될 수 있다. 선택적으로는, 도시하지는 않지만, 추가적인 격실 및 결합된 피스톤이 격실(126) 내로 추가적인 효소를 공급할 수 있도록 포함될 수 있으며, 그 결과로서, 변성단계에 의한 효소의 어떠한 실활도 더 많은 효소의 첨가에 의하여 대처할 수 있게 된다.
따라서, 큐벳(100)은 다음과 같이 사용한다 : 제9도에 나타낸 바와같이 위치하는 피스톤을 사용하여, 시료 DNA 를 피펫을 통하여 구멍(122)에 도입한다. 통로(121) 를 통하여, 증폭 시약들이 이미 존재하는 격실(126) 로 시료를 유입시키거나, 또는, 증폭 시약이 DNA 와 동시에 도입되는 경우에는 이들을 마찬가지로 격실(126)에 유입시킨다. 출구(159)와 통로(155)는 유입되는 액체에 의하여 격실(126) 내에서 공기가 밀려나는 것을 허용한다. 그 후, 멈추개를 쇼울더(123) 내에 삽입하여, 구멍(122)와(159) 를 밀봉한다. 원하는 DNA 증폭이 이루어질 때까지, 열 전달 벽(114)을 사용하여 격실(126)에서 열 주기 순환이 수행되도록 한다. 이 시점에 이루기까지, 피스톤은 이동되지 않는다.
다음, 격실(132)의 피스톤(113)은 격실 내로 격실(132)의 검출 물질을 밀어내도록 진행한다. 즉, 아비딘 - 비드 포획법의 경우에 있어서는, 격실(126)의 내용물은 바람직하게는, 증폭된 DNA 를 모사할 수 있도록, 아비딘을 통하여 결합되는 중합체 비드와 어닐링 단계에서 증폭된 DNA 를 확장시킬 수 있는 바이오티닐화된 프라이머를 포함한다. 이 격실은 또한, 서양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 잔기에 부착되는 확장된 프라이머와 하이브리다이제이션하도록 구성된 뉴클레오티드인 검출 프로우브를 포함할 수 있다. 격실(134) 로 부터의 약간의 세정 용액은 원한다면, 격실(126) 내에 존재하는 검출 시약들 모두를 피스톤(115)에 의하여 확실하게 밀려나갈 수 있도록 할 수 있다. 그 다음, 혼합은 어떠한 통상적인 수단에 의하여 전 큐벳을 교반시키는 것에 의하여 달성될 수 있다. 다음, 검출 프로우브는, 벽(114)을 통한 통상적인 단계에 있어서의 열적 제어, 예를 들면, 5분간 42로 가열하는 것에 의하여 격실(126) 내의 증폭된 DNA 에 하이브리다이제이션될 수 있다.
다음, 부가적인 세정 용액은 격실(134) 로 부터 밀려나가, 격실(126) 로 부터 검출 격실(140) 까지 하이브리다이제이션된 액체를 세정한다. 피스톤(115)은 또한, 통로(156) 및 (155)를 통하여 격실(139)로부터 세정액을 밀어내도록 진행하여, 통로(155) 내에 여전히 남아있는 하이브리다이제이션된 액체 모두를 격실(140) 내로 세정시키며, 따라서, 후속되는 류코 염료로부터 통로(144) 내에 남아있는 모든 하이브리다이제이션된 액체를 분리시키게 된다. 포획 수단에 결합되지 못한 유리된 검출 프로우브와 같은 모든 물질들이 막(194)을 통과하여 흡수제(196) 내로 유입되는 것을 확실하게 하기 위하여, 충분한 세정 용액을 격실(126) 및(140)을 통하여 통과시킨다. 이러한 세정 단계에 있어서는, 우선적으로 역압이 격실(126) 로부터 격실(140) 까지 액체의 이송을 저해하는 것을 방지하기 위하여, 피스톤(184)을 끌어 당길 필요가 있다.
다음에는, 우선적으로 격실(136)의 류코 염료와 그 다음의 격실(138)의 정지 용액이 그들 각각의 피스톤(113)을 진행시키는 것에 의하여 통로(155) 및(157) 로 진행된다음, 격실(140) 내로 유입된다. 이것으로서, 증폭된 DNA 가 존재한다면, 막(194)에 적절한 발색이 이루어진다(모든 유리된 검출 물질이 이미 흡수제(196) 내로 세정되었기 때문에, 증폭된 DNA 가 존재하지 않는다면, 어떠한 색상도 나타나지 않을 것이며, 따라서, 시험은 "음성" 으로 나타날 것이다).
검출 개소를 갖기위하여 별도의 검출 격실을 존재시키는 것은 필수적인 것이 아니다. 다음의 구체예를 고려하여 설명하는 바와같이, 검출개소가 반응 격실일 수도 있다. 앞서 언급한 부분들과 부분들은 구별하기 위하여 첨자 C 를 동일한 참조번호에 부여한다. 따라서, 제12 도에 있어서의 큐벳(100 C)은 격실(126 C),(132 C),(134 C),(136 C), 및 앞서와 같이, 유입구(122 C) 로 부터 및 상호간에 연통되는 통로들을 갖는다. 피스톤(113 C),(115 C) 및(184 C)는 앞서와 같이 진행되는 DNA 증폭후에, 액체를 이송시키기 위하여 앞서와 같이 사용된다. 그러나, 격실(132 C)은 검출 시약으로서, 자성 필터를 수용하는, 중합체로 형성된 자성 비드를 포함하는바, 이는 짝지워지는 DNA 서열과 하이브리다이제이션되는 물질이 결합되어져 있다. 이것은 한쪽 말단, 예를들면, 증폭된 DNA 의 한쪽 말단에 하이브리다이제이션 시키도록 의도되어있는 것이다. 그 증폭된 DNA 의 다른 말단은, 상기한 바와같은 서양고추냉이 퍼옥시다제를 보유하고 있는 검출 프로우브에 하이브리다이제이션시키도록 의도되어 있다. 이 구체예에 있어서는, 존재하고 있는 것들로 부터의 DNA 에 아직 하이브리다이제이션되지 않은, 유리된 검출 프로우브의 분리는 다음과 같이 이루어진다 : 세정용액이 격실(134 C) 로부터 주입될 때, 비드 시약들 및 증폭된 DNA 에 하이브리다이제이션된 어떠한 검출 프로우브도 유지시키기 위하여, 격실(126 C) 밑에 자장을 건다. 이것은 유리된 검출 프로우브들 및 그들이 표식들을 격실(126 C) 로부터 세정되도록하여 격실(182 C) 로 유입되게하며, 피스톤(184 C)은 공간은 만들기 위하여 끌어당겨진다. 류코 염료 및 정지 용액이 그 내부로 이송되는 동안에도 자장은 계속 유지되며, 어떠한 증폭된 DNA 가 존재하는 경우, 반응 격실인 격실(126 C) 내에 색상이 나타나게 된다.
제8- 12 도의 큐벳에 대한 또 다른 선택은, 격실(132),(134),(136),(138),(182), 또는 그들의 "C" 대응부를 연장시켜서, 이들이 큐벳에 대하여 L-형을 부여하도록 제8도의 평면으로부터 90°로 돌출(도시하지 않음) 되게 하는 것이다. 이러한 배치는 주형 설계 및 조립을 단순화시키는 장점을 갖는다.
큐벳의 사용전 단계에서 DNA 를 추출하는 대신에, 본 발명의 큐벳내에서 세포들로부터 DNA 를 추출하는 것이 가능하다. 이러한 경우에 있어서, 큐벳은 제14 도에 나타낸 바와같이 구성되는 것이 바람직하며, 여기서, 앞서 기재한 부분들과 유사한 부분들에 대하여는 구별하기 위하여 첨자 D 를 부여한다. 따라서, 큐벳(100 D)은 저장 격실들내에서 사용되는 피스톤(113 D)을 갖는, 앞서와 같이 동일한 격실들(126 D),(132 D),(134 D),(136 D) 및(138 D) 를 갖는다. 쇼울더(123 D)는 액체 유입구(122 D)를 보호하며, 앞서 기재한 바와 모두 동일하게, 막(도시하지 않음)에서 검출이 수행된다. 그러나, 반응 격실인 격실(126 D)에 피펫으로 취한 액체 시료를 인도하는 대신에, 통로(121 D)는 추출 격실(200)에 액체 시료를 인도한다. 이 경우에 있어서의 액체 시료는 전혈 또는 적혈구용액이며, 여기서 DNA 가 추출되게 된다. 이때, 이 액체 시료는 큐벳에 가하여지며, 이하에 기재하는 추출제들이 선택적으로 첨가될 수 있다. 선택적으로, 상기의 추출제들을 격실(200) 내에 사전 혼입시킬 수도 있다. 피스톤(113 D)은 도입된 시료에 대하여 최대의 공간을 제공하지 위하여, 도시한 바와같이 완전히 끌어 당겨져있는 것을 제외하고는, 다른 유사한 격실들과 마찬가지로 격실(200) 내에서 사용된다. 격실(200)의 대향단(202)에는, 통로(204)가 중간 격실(206)에 유체적으로 연통되어 있으며, 이곳에는 필터(208)가 배치되어 있어서 액체가 격실(126 D)에 도달하기 위해서는 상기의 필터를 통과하여야만 한다. 필터(208)는 적당한 포어 크기를 갖고 있어서, 필터내에 세포 단편은 간직하고, 추출된 DNA 는 통과시킨다. 예를들면, 포어 크기가 약 0.45 미크론인 나일론 또는 폴리프로필렌으로 제조된 필터가 특히 바람직하다.
격실(206)로 부터, 통로(120)는 추출된 DNA 와 용매(예를들면, 물)을 격실(126D)로 운반한다. 사용할 때에, 액체 시료는 격실(200) 내로 주입되며, 바람직하게는, 어찌되었든 추출제와 함께 주입되는 것이다. 어떠한 DNA 추출 프로토콜은, 계면활성제와 같은 부수적인 추출제와 함께 사용될 수 있다. 고도로 바람직한 것은, 약 5 분간 약 95의 온도로 용액을 단순 가열하는 것이다. 이러한 가열은 세포의 용해 및 단백질의 변성에 효과적이다. 이러한 추출법에 있어서의 보조제로서, 롬 앤 하스(Rohm and Hass) 로 부터 입수가능한 비이온성 계면 활성제인 TX - 100 의 10 중량용액와 함께 덱스트란을 3 중량용액으로서 선택적으로 첨가될 수 있다. 격실(200)의 가열은 격실벽의 적어도 220 부분을 알루미늄으로 구성시키는것에 의하여 더욱 신속히 이루어질 수 있는바, 상기의 알루미늄은 큐벳저부의 외측까지 연장(별도의 표면으로서 도시하지는 않음) 되어 있다.
격실(200)에 인접한 큐벳의 저부 표면에 대한 가열은, 따라서, 격실(200)을 가열함에 있어서 효과적이다. 적절한 인큐베이션 기간후, 격실(200)의 내용물은 피스톤(113 D)을 진행시키는 것에 의하여 필터(208) 로 밀려들어간다. 어떤 경우에 있어서는, 선택된 DNA 에 대한 검출 개소와 함께, 검출 격실내에 양성 및 음성 대조부를 수용하는 것이 바람직할 수 있다. 제15도 및 제16도는 이러한 것이 설치되어 있는 변형예를 도시한다. 앞서 언급한 부분들과 유사한 부분들에 대하여는 구별하기 위하여 첨자 E 를 부여한다. 따라서, 제15 도에 있어서의 큐벳(100E)은 적절한 피스톤(184E) 등을 갖고있는, 앞서와 같은 격실들(126E),(136E),(138E), 및(182E) 를 갖는다. 통로(121E)는 액체 시료를 구멍(122E) 로 부터 반응 격실(126E) 까지 운반하며, 통로(151E)는 또한, 상기의 격실에 액체를 공급한다. 바이오티닐화된 프라이머는 적절한 위치로 부터 인도되며, 류코 염료 및 정지 욕액은 통로(155E) 를 경유하여, 검출 개소로 향하는 통로(157) 까지 인도된다. 통로(144E)는 격실(126E) 내에서 생성된 DNA 생성물을 통로(155E) 및(157E) 까지 도달가능하게 한다. 통로(157E) 로부터 나오는 액체는 제16 도의 흡수제(194E)와 접촉되어 배치되는 검출막(194E) 과 조우하게 되며, 나머지 모두는 앞서의 구체예 들과 동일하다. 그러나, 앞서의 구체예들과는 다르게, 제15 도에 있어서와 같이, 막(194E)에 "S" 로 표식된 시료 DNA 검출을 위한 영역, "+" 로 표식된 양성 대조를 위한 영역 "-" 로 표식된 음성 대조를 위한 영역의 분리된 영역들이 있다. 양성 대조의 목적은, DNA가 존재하는 경우, 시약들이 그 DNA에 대한 신호(바람직하게는 색상) 를 생성시키는 것을 보장하기 위한 것이며, 즉, 시약들이 어떠한 이유로 인해서든 부족하여, "+" 영역에서 신호를 생성시키는데 실패하는 경우, 사용자에게 정보를 보내기 위한 것이다. 반면에, 음성 대조는 신호를 생성해서는 안된다. 음성 대조의 주 목적은 비교하고자 하는 시료 색상에 대한 바탕색상을 사용자에게 제공하기 위한 것이다. 즉, 희미한 바탕 색상이 외래적인 이유들로 인하여 시약들에 나타날 수 있으며, 시험에 있어서 "양성" 판독으로 간주하기 전에, 시료 색상이 상기의 바탕 색상보다 그 밀도에 있어서 상당히 커야만 한다는 것은 중요하다. 이것을 수행할 수 있는 몇가지 방법이 있다. 제15도 및 제16도의 구체예에 있어서, 사용되는 방법은 아비딘 - 비드 포획법이다. 이 방법은, 비드에 공유 결합적으로 부착되는 아비딘 또는 스트랩트아비딘 및, 바이오티닐화된 프라이머, 그리고 검출 물질의 일부로서 표식된 검출 프로우브를 사용하는 것을 특징으로한다. 바람직하게는, 적어도 프로우브들이 제15 도에 있어서의 저장 격실(250),(252) 및(254) 내에 보호 유지되는 것이다. 각 격실들은 한 종류의 검출 프로우브에 대하여 사용되며, 즉, 격실(250)은 시료 DNA 프로우브를 수용하고, 격실(252)은 음성 대조용 프로우브를 수용하며, 격실(254)은 양성 대조용 프로우브를 수용한다. 피스톤(260)은, 그 내용물을 각각의 통로(262),(264) 및(266)을 통하여 각각의 프로우브들과 관련한 검출 격실(268),(270) 및(272) 및 각각의 프로우브 통로내로 강제이송시키기 위하여, 그들 각각의 격실들을 동시에 압압하도록 사용되며, 바람직하게는, 각각의 격실들을 동시에 압압하도록 사용하는 것이다. 따라서, 각검출 격실은 그 내부에 단지 그에 해당되는 프로우브만을 수용하며, 다른 두 종류의 프로우브는 수용하지 않는다.
세 개의 모든 검출 격실들에 대하여 증폭된 DNA 및 다른 시약들을 공급하기 위하여, 통로(157E)는 제15 및 16도에 있어서와 같이, 검출 격실들과 연통되는 세 개의 지류(274),(276) 및(278) 로 나뉘어지는 것이 바람직하다. 세 종류의 프로우브 중 두 종류는 적절한 DNA에 상보적인 유전 물질을 갖고 있다는 것은 용이하게 인식될 수 있을 것이다. 시료에 대한 프로우브는 시료의 표적 DNA 에 유전적으로 상보성을 갖는다. 양성 프로우브는, 적어도 적혈구인 경우에 있어서는 항상 존재하는 DNA 물질, 바람직하게는 베타 - 글로빈에 대하여 유전적 상보성을 갖는다. 음성 프로우브는 시료로 부터의 미지의 증폭된 DNA와 짝지워지는 유전적 상보성을 갖는다. 이것은 서열이 무질서한 어떤 유전 코드(code), 아마도 "넌센스(nonsense)" 코드와 상보적인 프로우브를 구성시키는 것에 의하여 가장 용이하게 수행될 수 있다. 그 처리 방법은 다음과 같이 작업 수행되며, 이로부터 명백하게 될 것이다 : 아비딘 - 담지 비드는 격실(250),(252) 및(254) 내에 프로우브들와 함께 수용시키는 것이 바람직하다. 증폭된 DNA가 통로(274),(276) 및(278) 를 경유하여 각각의 검출 격실들에 공급됨에 따라, 피스톤(260)을 진행시켜 이들 검출 격실들내로 적절한 프로우브 및 비드들을 밀어낸다. 이들 격실들은 적절히 가열되어, 증폭된 DNA 를 하이브리다이제이션시키며, 특히, 격실들(250) 및(254) 로 부터의 적절한 프로우브와 격실들(268) 및(272) 내에서 증폭된 DNA를 하이브리다이제이션시킨다. 바람직하게는, 어떠한 하이브리다이제이션도 검출 격실(270) 내에서 발생되지 않으며, 그 이유는, 음성 대조 프로우브와 반응할 수 있는 어떠한 "넌센스" DNA 도 존재하지 않기 때문이다. 그후, 세정용액을 검출 격실을 통하여 밀어내어, 막(194E)을 세정시키며, 하이브리다이제이션되지 않아서 비드에 부착되지 못한 어떠한 표식된 프로우브들도 모두 흡수제(196E) 내로 밀어낸다. 세정물은 이어서, 류코 염료 용액과 접촉된 다음, 정지 용액과 접촉된다.
사용가능한 또 다른 방법은, 소위 "올리고 포획 기술(oligo capture technique)" 을 사용하는 것이다. 제17 도 및 제18 도의 이 기술에 있어서는, 표식된 프로우브가 증폭된 DNA 의 도입에 앞서 검출막상에 이미 고정화된 형태로 저장된다. 이미 언급한 부분들과 유사한 부분들에 대하여는 구별하기 위하여 첨자 F 를 부여한다. 이 구체예에서 사용되는 올리고 포획법은, 막상 또는 내에 포획되는 상기에서 언급한 비드상에, 또는 막상의 어느것인가에 고정화되어있는 프로우브가, 적절한 DNA 에 상보적인 유전물질을 수용하고 있는 것을 특징으로 한다. 다른 격실(139F)에 있어서는, 증폭된 DNA 상의 바이오틴과 반응하기 위한 표식된 아비딘이 저장되며, 표식은, 예를들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다. 따라서, 제17도 및 제18도의 큐벳(100F)은, 검출 격실(190F)에 관한 것과 제17도의 저장 격실(139F) 내에 저장되는 물질을 제외하고는, 제9도의 구체예에 있어서의 큐벳과 동일하다. 더욱 상세하게는, 시료 DNA 프로우브는 막(194F)의 "S" 부분에 고정되며, 양성 대조 프로우브는 "+" 부분에 고정화되고, 음성 대조 프로우브는 "-" 부분에 고정화된다. 이러한 프로우브들을 담지하는 막(194F)의 각 부분은 다른 부분과 접촉하지 않는 것이 바람직하다. 이 경우에 있어서의 절차는, 증폭된 DNA를 통로(157F) 를 경유하여 검출 격실(190F) 내로 강제유입시켜, 막(194F)의 전 표면상으로 흐르게 한다. 적절한 가열은, 증폭된 표적 DNA를 특별히 하이브리다이제이션시키며, 따라서 "S" 영역내의 프로우브에 부착되고, "+" 영역내의 프로우브에 대하여는 도처에 편재하는 DNA가 부착되며, "-" 영역에서는 하이브리다이제이션하기 위한 어떠한 프로우브도 존재하지 않는 것이 바람직하다. 세정 용액은, 예를들면, 134 F 나 그외의 곳으로부터 격실(190F) 내로 강제 유입되며, 이어서 아비딘 - 표식이 유입되는바, 증폭된 DNA 또는 양성 대조 DNA 의 어느것인가와 목하, 하이브리다이제이션된 바이오티닐화된 생성물과 반응하게 된다. 그후, 세정 용액이 부가된 다음, 류코 염료와 정지 용액이 부가된다.
본 발명에 따른 큐벳은 PCR(폴리머라제 연쇄반응 : polymerase chain reaction) 기술을 사용하여 핵산을 증폭 및 검출하기 위한 반응을, 증폭된 핵산을 의계에 노출시키는 일 없이, 수행할 수 있게 한다.

Claims (13)

  1. a) 반응 격실 및 검출 시약을 포함하는 큐벳을 제공하는 단계 및, 상기 반응 격실내에 핵산 물질 시료 및, 폴리머라제, 프라이머 핵산 및 뉴클레오티드를 포함하는 증폭 시약을 제공하는 단계 ; b) 상기 샘플 및 상기 시약을 제공한 후, 상기의 큐벳내의 내용물을 영구히 밀폐하는 단계 ; c) 상기 폴리머라제, 핵산 프라이머 및 뉴클레오티드를 사용하여 폴리머라제연쇄 반응의 단계에 의해 핵산물질을 증폭시키는 단계 ; d) 상기 증폭된 핵산 물질에 상기 검출 시약 중의 최소한 하나를 부착시키는 단계 ; 및 e) 상기 검출 시약을 사용하여 증폭된 핵산 물질을 검출하는 단계들을 포함하고, 상기 c), d) 및E)는 상기 핵산 물질이 상기 큐벳내에 한정된 상태로 유지되는 동안 일어나는, 에어로솔이 큐벳으로부터 빠져나가 다른 큐벳을 오염시키는 일이 없는, 밀폐된 격납 큐벳내에서의 핵산 물질의 증폭 및 검출 방법.
  2. a) 반응 격실 및 검출 시약을 포함하는 큐벳을 제공하는 단계 및, 상기 반응 격실내에 핵산 물질 시료 및, 리가제, 프라이머 핵산 및 뉴클레오티드를 포함하는 증폭 시약을 제공하는 단계 ; b) 상기 샘플 및 상기 시약을 제공한 후, 상기의 큐벳내의 내용물을 영구히 밀폐하는 단계 ; c) 상기 리가제, 핵산 프라이머 및 뉴클레오티드를 사용하여 리가제연쇄 반응의 단계에 의해 핵산물질을 증폭시키는 단계 ; d) 상기 증폭된 핵산 물질에 상기 검출 시약 중의 최소한 하나를 부착시키는 단계 ; 및 e) 상기 검출 시약을 사용하여 증폭된 핵산 물질을 검출하는 단계들을 포함하고, 상기 c), d) 및 e)는 상기 핵산 물질이 상기 큐벳내에 한정된 상태로 유지되는 동안 일어나는, 에어로솔이 큐벳으로부터 빠져나가 다른 큐벳을 오염시키는 일이 없는, 밀폐된 격납 큐벳내에서의 핵산 물질의 증폭 및 검출 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산 물질은 DNA를 포함하는 방법.
  4. 상기 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 c)는 상기 증폭 단계를 제공하기위하여 미리 설정된, 37를 초과하는 온도를 포함하는 온도 변화를 통하여 상기 반응 격실 및 상기 핵산 물질을 순환시키는 것을 포함하는 방법.
  5. a) 증폭시약이 그 내부에 존재하는 반응 격실, 및 검출 물질에 사용하기 위한 저장 격실을 포함하며, 격실들 중 하나는 검출 개소 및, 유체 이송을 제공하도록 격실들을 상호 연통시키는 (interconnecting)수단을 포함하는 큐벳내에 핵산 물질 샘플을 주입하는 단계 ; b) 상기의 큐벳내로 모든 핵산을 가두기 위하여 상기의 핵산물질을 함유하는 상기의 큐벳부를 영구히 밀폐하는 단계 ; c) 상기의 시약들이 유효하게 되도록 큐벳내를 미리 설정된 온도변화를 통하여 순환시키는 것에 의하여 핵산 물질을 증폭시키는 단계; d) 상기의 반응 격실로부터 상기의 검출개소로 증폭된 핵산 물질을 유체적으로 이송시키는 단계; e) 상기의 검출 개소로 검출 물질을 유체적으로 이송시키는 단계 ; 및 f) 상기 검출물질과 함께 상기 핵산물질이 상기 큐벳내에 하정된 상태로 유지되는 동안, 상기의 검출 개소에서, 검출 물질로 증폭된 핵산물질을 검출하는 단계를 포함하는, 에어로솔이 큐벳으로부터 빠져나가 다른 큐벳을 오염시키는 일이 없는, 밀폐된 격납 큐벳 내에서의 핵산 물질의 증폭 및 검출 방법.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 단계 c)는 반응 격실의 안쪽 및 바깥쪽 양 방향으로, 반응격실의 주요벽을 가로질러서 열을 전달시키는 단계를 포함하고, 상기 주요 벽은 열전도성 물질을 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 주요벽은 0.3㎜ 이하의 열 경로 길이 및 5.0/와트 이하의 열 저항을 갖는 방법.
  8. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 큐벳은, 피스톤실 내의 피스톤의 진행이 반응 격실내의 압력을 증가시키기 위한, 상기의 반응 격실에 유체적으로 연통되어 있는, 제1피스톤실과 그 내부의 제1피스톤 및, 피스톤실내에서 피스톤이 당겨지는 경우, 검출개소에서 압력을 완화시키기 위한, 상기의 검출 개소에 유체적으로 연통되어 있는, 제2피스톤실과 그 내부의 제2피스톤을 추가로 포함하며, 상기 단계 d)는 상기의 제2피스톤을 끌어 당기는 동안, 상기의 제1피스톤이 진행되는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제1항 또는 제5항에 있어서, 격실의 벽은 외압이 상기 격실을 압압하며 상기 격실로부터 액체를 강제이송시킬 수 있을 정도로 충분히 가요성이며, 단계 d)는 상기 격실의 상기 가요성 벽에 규정된 순서로 외압을 가하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제1항 또는 제5항에 있어서, 검출 시약이 자성화될 수 있는 물질로 이루어지는 비드(bead)를 포함하며, 단계 d)-e)는 반응 격실에 상기의 비드를 이송시키는 단계, 증폭된 핵산 물질에 상기의 검출 물질을 부착시키는 단계, 상기 검출물질을 상기 증폭된 물질에 부착시키는 단계 및, 상기의 반응 격실내에 상기 비드 및 부착된 검출 물질을 보유시키는 자장의 존재하에, 미부착된 검출 물질을 세척하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제5항에 있어서, 단계 d)와 e)는 반응 격실을 먼저 압압시키고, 이후, 저장 격실을 압압시키는 것에 의하여 순차적으로 일어나는 방법.
  12. 제5항에 있어서, 단계 d)와 e)가 저장 격실과 반응격실을 동시에 압압시키는 것 및, 증폭된 핵산 물질이 이송될 때까지 검출물질의 흐름을 지연시키는 것에 의해 일어나는 방법.
  13. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 검출단계의 이전 단계로서, 미리 넣어둔 물을 저장 격실로부터 건조형태의 검출물질까지 이송시키는 것에 의하여, 저장 격실내에 건조된 형태로 넣어진 검출 물질을 재구성시키는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
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