JPS59153172A - 核酸の定量装置 - Google Patents

核酸の定量装置

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JPS59153172A
JPS59153172A JP59017247A JP1724784A JPS59153172A JP S59153172 A JPS59153172 A JP S59153172A JP 59017247 A JP59017247 A JP 59017247A JP 1724784 A JP1724784 A JP 1724784A JP S59153172 A JPS59153172 A JP S59153172A
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plate
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dna
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ジヨゼフ・アール・キオフスキ
クリフオード・エル・ヘンドリツク
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Millipore Corp
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はＤＮＡ又はＲＮＡの検定に有用な方法及び装置
に関し、特には、ｆＭ数の検定を同時に行うことが可能
な複数のくぼみ（ｍｕｌｔｌｗｅｌｌ　）のろ過装置に
関する。
個々のくぼみ又は反応室を多数含有する試験管内分析用
試験板は一般的に知られた実験用具である。かかる装置
は米国特許３．６４９．４６４号、同４、５０４．８６
５号、同４，２７６．０４８号、同４、１５４．７９５
号、米国再発行特許５　Ｑ、５６２号によって例示され
るように広範囲の種類の目的及び検定に対して用いられ
てきた。微孔質膜ろ過膜及び該微孔質膜を含有するろ過
装置は、最近発達した細胞及び組織培養技術及び検定の
多く−特にウィルス学及び免疫学の分野における該技術
等と共に特に有用になってきた。
中には７〜８時間続くものがいくつがある複数の検定を
同時に実施するのに複数のくぼみのろ過板を用いてから
ろ過を実際に行う方法が行われてきた。このようなろ過
板、特に微孔質膜を含有するろ過板を用いた場合、くぼ
みの中の流体が重力流れによって膜を通過し、それによ
って実験計画の所望の段階に至る以前に反応くぼみ内か
ら内容物を損失させる点で周知がっ再発生の問題がある
。
他の装置のくぼみの底部にある膜は、重力流れによりか
つまた隣接したくぼみへの側方移行によっても液体を損
失して相互汚染を引き起こす。検定がサンプルの極めて
少い址を反応体として用いる場合、かかる試験サンプル
の容置が１００マイク四リツターより少ない場合がよく
あるから、このように膜を通る流体損失を防止すること
は非常に重要である。このような毛管作用及び重力流れ
によって微孔質膜の下面に常に生成する懸垂液滴の容量
は典型的には約５ｏマイクロリツターであるから、この
ような側合の流体損失が検定に顧著な影響を及ぼすに違
いないことは明らかである。
現在、単一ストランドウィルス性Ｄ　Ｎ　Ａ　又！−ｔ
ＲＮＡ分子を含む単一ストランドＤＮＡ又はＲＮＡ分子
を検出するＭｕｍ形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　
）技法が利用できる。通常、雑種形成は単一ストランド
ＤＮＡ又はＲＮＡ分子をニトロセルロース等の基質に結
合させた後に、結合したＤＮＡ又はＲＮＡを＠ｌｉｄを
付した相補性単一ストランドＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含
有する液体に混合する工程を含む。
相補性単一ストランドＤＮＡ分子の結合度は、基質上の
［１１１の量を測定することによって測定する。
このように操作することによって、基体に結び付けられ
た単一ストランドＤＮＡ又はＲＮＡ或は液体中のＤＮＡ
又はＲＮＡのどちらかを検定することができる。かかる
技法は、例えば米国特許４、５０２．２０４号に記載さ
れている。本発明より以前には、血液中のウィルスの存
在を検定する有効かつ信頼できる方法は存在しなかった
。これは主に多種類の血液血清タンパク質によって雑種
形成反応が干渉されるからである。
よって、ウィルス、特に血液中のウィルスを検定する有
効かつ信頼できる方法を提供するのが望ましいであろう
。
発明の要約 各端部が開いた開口を俵数有する板から成り、第１の液
体透過性基体が検定される物質に対する抗体を結合させ
てなるＤＮＡ又はＲＮＡのマイクロリッター散を検定す
るろ過装置を提供するものである。液体透過性基体を各
開口の一端を横切って配置かつ各開口の一端のまわりに
シールして個別の基体面を有するくぼみを形成し、疎水
性布地を各くぼみの境界になる基体面を横切って配置し
かつ該基体面に隣接して接着した。疎水性布地は、差圧
をかけない場合に、くぼみ内からの側方移行及び／又は
重力流れによって流体が損失されるのを防止する。加え
て、第２の液体透過性基体であってその上に単一のスト
ランドＤＮＡ又はＲＮ　Ａを結合させることができるも
の、及び第１の基体手段を通り抜けるような流体を第２
の基体手段に向ける案内突起を提供する。
使用に際し、試験されるべき試料を第１基体の中に通し
てＤＮＡ又はＲＮＡを含有する微生物学的物質を基体に
結合した該物質の抗体に結合させ、ろ液を拮てる。次に
、第１基体を洗浄して雑種形成反応を妨げる血液血清タ
、バク質叉はその他の成分を取り除くことができる。次
に、第２基体及び案内突起を第１基体の各々の下に位置
させ、結合した微生物学的物質をＤＮＡ又はＲＮＡを単
一のストランドＤＮＡ又はＲＮＡにかえる試薬に接触さ
せて、それによって該ＤＮＡ又はＲＮＡを第２基体に結
合させることができる。次に、結合した単一のストラン
ドＤＮＡ又はＲＮＡに対し相補性の標識ＤＮＡ又はＲＮ
Ａプループを第２基体に接触させて有効な単一ストラン
ドＤＮＡ又はＲＮＡに結び付ける。次に第２基体を放射
能又はその他の検出方法で測定し、次いでもとの試料中
のＤＮＡ又はＲＮＡ濃度（微生物学的物質ｍ度）に関連
させる。
本発明の好適な態様では、第１基体は酢酸セルロース１
模から成り、両膜には抗体がジビニルスルホンブリッジ
を通して結合されており、かつ第２基体はニトロセルロ
ースから成り、該ニトロセルロースに単一ストランドＤ
ＮＡ又はＲＮＡを結合させることができる。
本発明は抗体を結合させてなる第１ｆａ孔質膜を含有す
る反応くぼみを少くとも１個有し、かつ結合した抗体に
対し相補性の抗原を流体から分離、選択及び保留するの
に適切なろ過装置の改良である。第１微孔質膜に瞬接し
て多孔質疎水性布地を張り付ける。該布地は第１＠孔質
膜の上又は好ましくは下の一方に位置させる。この疎水
性布地は減圧力が存在しない場合に膜を通る側方移行又
は重力流れによる流体損失を防止するが、それでも板上
の各くぼみの内部中に又は内部から外にガスを拡散させ
る。
本発明の実Ｍｕ　態様は第１図に示す減圧アセンブリー
の場合に最も有用であり、該アセンブリーは各々が４４
０マイクロリツター（μ２）以下の個々の試験サンプル
９６個を同時に処理することができる。減圧アセンブリ
ーは減圧室として励くベース２から成り、かつ調節した
外部減圧源への接続用のポース突起を含有する。ベース
２の中にトレー６及び／又は受は板８を入れる。該受板
８は９６個以下の個々の室を有し、両案は各々第２倣孔
質膜を含有し、該第２微孔質膜の上に単一のストランド
ＤＮＡ又はＲＮＡを付着させることができる。９６−く
ぼみろ過板１２がガスケット１４′及び１６によって分
離されてトレー６の上に置かれる。ガスケット１４及び
１６は減圧力の存在において気密のシールを形成する。
本発゛明の好適な実施態様を用いるろ過板の詳細図を第
２及び３図に示す。ろ過板１２に見られるくぼみの数が
単に第三者に対する便宜上のものにすぎないことは理解
されよう。板１２は１個程の少いくぼみ又は板の実際の
寸法に機能的に与えることが可能な限り多数のくぼみを
含有することができる。ろ過板１２は任意の市販の弾力
性及び非反応性材、料から作ることができ、組成の選択
は単に便宜又は経済上の事項である。各くぼみ２２は板
１２の深さ全体を貫く開口２４から成り、板１２の厚さ
はくぼみの中に保持される流体の容量を決める。開口径
は使用者の要求を満足するように変わるが、典型的には
直径が３〜２５ミリメータの範囲になる。第１微孔質膜
ろ過膜（フィルター）２６を、各くぼみを横切る面がろ
退園２８として働くように板１２内の開口２４を横切っ
て配置し、かつ開口２４の周りにシールする。微孔質膜
２６を板１２に接着しかつ両膜２６を開口２４の周囲に
シールする方法は当分野で周知であるから、本明細書で
詳細に説明する必要は無い。各開口２４を横切ってろ過
而２８を形成する第１倣孔質膜２６の組成及び流れ特性
もまた選択事項である。酢酸セルレース、ポリアミド、
ポリ７ツ化ビニリデン倣孔質膜等が、抗体を結合させる
のに用イラレル。酢酸、セルレースは、ジビニルスルフ
ォンブリッジによってそれに抗体を容易かつ有効に結合
させることができるから第１微孔質膜として好適である
。膜の多孔度は選んだ用途を見込んで選択する。厚さ５
０〜２００マイクロメーター、多孔度α０２５〜１α０
マイクロメーターの膜が好まれるが、第１倣孔質膜２６
はそのような微孔質膜に制限されない。むしろ、微孔質
膜の代りに限外ろ過材を利用することができる。限外ろ
過材なる用量は分子を溶液状に保つことができる材料を
意味する。かかる限外ろ過材はおよそ１００ダルトン程
の小分子及び通常およそ２００万ダルトン程の大分子を
保持するのに有用である。該限外ろ過材の例は当分野に
おいて周知であり、ポリスルホン及びミリポア社よりペ
リコン（ｐｒｔ、ＬＩｃｏ＃）の登録商標で市販される
その他の重合材を含む。
必要な全ては膜２６が検定される微生物学的物質の抗体
に結合することができること、及び両膜が洗浄工程を有
し又は有しないで雑種形成相互作用を妨げる物質を保持
しないことである。各くぼみ２２に境界をつける個々の
膜フイルタ−２６はろ過した後にフィルターバンチで取
り外し、必要に応じて更に処理することができることは
当業者に理解されよう。
第６図に示す装置は、抗原が第１膜２６に付けた抗体に
結合された後、かつ第１　ＩＩＩ　２６を洗浄して雑種
形成相互作用を妨害する物質を無くした後、かつ単一ス
トランドＲＮＡ又はＤＮＡを第２膜５４に付着すること
が望ましい場合に用いられる配置である。第６図に示す
ように、疎水性布地をくぼみ２２のろ週間２８を横切っ
て配置し、がつ瞬接して接着させる。疎水性布地は、布
地６゜とろ週間２８との間に微小間隙を作りかつ保つよ
うに開口２４の周囲に接して第１膜２６に接着させ゛る
のが好ましい。布地３ｏがパラフィンフィルム等３２に
より熱接着性であるか、又は接着剤を用いて第１膜２６
に接着させることができる。膜２６を布地３０に接着す
るのにフィルター３２よりもむしろポリプロピレンウェ
ブを用いることができる。ポリプロピレンウェブを用い
る場合には、それが水性液体を透過し得るものであるが
らして穴を形成する必要は無い。加えて、布地６ｏは織
布又は不織布で作ることができ、かつ疎水性ポリエステ
ル、ポリオレフィン、ポリテトラフルオルエチレン又は
その他のポリマーのいずれによっても作ることができる
。
膜２６に抗原を付着した後に、抗原を選択的に取り除い
て抗原ＤＮＡ及びＲＮＡを単一のストランドＤＮＡ及び
ＲＮＡに変換する試薬、例えば１０Ｍ水酸化ナトリウム
、１０Ｍ水酸化カリウム等で洗浄する。試薬は単一スト
ランドＤＮＡ又はＲＮＡをニトロセルロース、ポリ７ツ
化ビニリデン、ナイロン等、好ましくはニトロセルルー
ルの展５４に運び、そこで羊−ストランドＤＮＡ又はＲ
ＮＡは結び付けられる。次に、結合した単一ストランド
ＤＮＡ又はＲＮＡはビチオン或は放射性リン、イオウ等
の放射性標識の標識を付けたＤＮＡ等の標識ＤＮＡ又は
ＲＮＡプルーブと反応することができる。
第１膜２６及び疎水性布地６０の板１２への付着は別工
程として行ってこれらの適当な位置調節及び微小間隔３
４の形成を確実にするのが好ましい。それでも、特に熱
接着性の疎水性材料を布地層として用いる場合には、第
１膜及び疎水性布地の両者を同時に付着することが可能
である。
このように多孔質の疎水性布地を貼付することによって
、試薬として用いられる試料各社の使用を少く、たいが
いの場合には１００ミクｐリツター（以下μｔを用いる
）よりも少くすることができる。布地層の無い場合、容
量がおよそ５０μｔの流体液滴がろ過手段の下部に懸垂
する液滴として集まって失われる。適所の疎水性布地に
より、毛管作用と重力流れとの結果としてろ過而２８の
下に生成する懸垂液滴はほとんど微小間隔３４内に保持
されて、液体がろ過而を通過する傾向は大きく低減され
るか、又は完全に排除される。その結果、検定であって
その間にくぼみの内容物が流体媒質温地相又は流体中の
反応体をパッシングする必要があるものを、誤りや不便
無〈実施することができる。
本発面の別の態様は第３及び５図に示す懸垂液滴投下（
リリース）設備である。この設備は第１及び４図に示す
多室流体収集手段と共に用いようとするもので、上に一
直線に並べられたくぼみの内部から複数の個々の受室５
０を経てろ液を受けるように設計されている。このよう
に各くぼみからのる液を別々に分析する。しかし、この
分画化の特徴のみでは、かけた差圧によって流体を疎水
性布地を通して＠ダ（する際に、種々のくぼみから出て
いるる液が入って来る問題を正すことができない。同様
に、疎水性布地が存在しないか、或番ま検定のために必
要としない状態では、懸垂液滴が生成し、決まって各ろ
退園の下面に収集する。小容量の検定においては、研究
者は膜から液滴として垂れ下がる５０μｔを失うことが
できなしＡ０容鷺が一層多い検定においてさえも、ろ板
の偶発移動又はそれに続く操作は懸垂する液滴を移動さ
せて液滴を誤った受室の中に落下させ、それによってろ
液の相互汚染及び間違った試験結果の原因になる。
これらの種類の問題は、懸垂液滴投下設備を−ろ退園２
８と板２０の下の流体収集手段４との間に一案内突起６
０の形で配置することによって解決される。この案内突
起６０の好適な実施態機番ま板１２内の個々のろ退園２
８に対応するノぐターンで成形される一連のスパイク６
１として第６及び５図に現われる。各スノくイク６１は
二重機能に働、＜：第一に、これが無ければ懸垂液滴と
して失われる恐れのある小容量の流体をのせて集め力）
つろ退園２８から除く表面とじ；第二に懸垂液滴を形成
する流体を適当な室５０に向ける案内として働く。突起
６１を射ｌ：Ｉ８成形するか或は打抜き（ｄｉｅｃｕｔ
　）アセンブリーにすることができる。ナイｐン、ポリ
スチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン等の任意の
成形重合物質を用いて案内突起を作ることができるが、
疎水性材料は懸垂液滴の遮断及び案内を促進するが故に
好適である。
大多数の検定において疎水性布地と流体案内突起とを縦
列にして用いることが期待される。それでも、くぼみ内
に流体を保持する必要が無い場合には、懸垂液滴投下設
備を単独で用いてより効果的になるようにすることがで
きる。
本発明の装置は、初めに検定されるべき微生物学的物質
を含有する試料をくぼみ２２の中に導入することによっ
て用いられることができる。サンプルがＤＮＡ又はＲＮ
Ａ雑槌形成を妨げる物質を含有しない場合には、室５０
を第６図に示すように位置させることができる。かかる
妨害物質が存在する場合には、室５０は、くぼみ２２よ
りろ液を受けないように位置させる。次に、膜２６上の
抗体に結び付けられた微生物学的抗原を洗浄して該妨害
物質を無くす。その後で、微生物学的抗原を試薬に接触
させて微生物学的抗原を取り除き、微生物学的抗原のＤ
ＮＡ又はＲＮＡを単一ストランドＤ　Ｎ　Ａ、又はＲＮ
Ａに換える。この後者の工程の間に、室５０は単一スト
ランドＤＮＡを受けるように位置させて、それにより単
一ストランドを暎５４に結合させる。結合されない物質
は膜５４を通り抜けて廃棄物になる。各室５０内の膜５
４に結合した単一ストランドＤＮＡ又はＲＮＡを放射線
標識を付した相補性単一ストランドＤＮＡ又はＲＮＡに
接触させて第２膜５４に結び付けられた任意の結合単一
ストランドＤＮＡ又はＲＮＡとの雑種形成を行わせる。
次に付着した放射能を測定し、当分野で周知の任意の方
法で既定した標準曲線上によって濃度に相関させる。
本発明の好適な態様では、抗体をジビニルスルホンブリ
ッジによって酢酸セルロースの第１膜に結合させる。抗
体を特定の条件下で酢酸セルロースにカップリングする
場合には、抗体を脱活性することなく抗体の一層有効な
結合を行わせることを見出した。これにより、所定のサ
ンプルがらの抗原の回収がかなり増大する。酢酸セル党
−ス膜を、ｐＨが約８〜１３の間のジビニルスルホンの
０．０１〜２ＯＲｊ社％水溶液中にジビニルスルホンカ
ップリングを十分に行わせる時間及び温度、典型的には
室温で５０分間浸漬する。膜から過剰のジビニルスルホ
ンをすすぎ落としてから、ｐＨが約８〜１２の間の抗体
溶液で飽和させる。次に、飽和した膜を蒸発を防ぐ条件
下、例えば不透過性フィルムの間でジビニルスルホンブ
リッジにより抗体を酢酸セルロニスに実質的に完全にカ
ップリングさせる時間及び温度において培養する。代表
的な培養条件は室温で２時間或は夜通し４℃にすること
である。次に、得られた生成物を初めにｐ　Ｈが約７の
緩衝生理食塩水にｔｊｌ漬して置くこと（ソーキング）
によって保存し、次いで抗体を脱活性しない温度、例え
ば４℃で保存することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明について有用な減圧アセンブリーの分解
図である。 第２図は本発明の１実施態様から成るろ過装置の平面図
である。 第３図は本発明から成る好適なろ過装置の断面図である
。 第４図は第３図に示した好適な実施態様について有用な
流体収集手段の１実施態様である。 第５図は第３図に示した発明の別の好適な実施態様であ
る。 第１図 、　第３図 手続補正書 昭和５９年３月２２日 特許贋官若彰和夫殿 事件の表示　昭和５９年　特願第１７２４７　　号発明
の名称　核酸の定量装置 補正をする者 中件との関係　　　　　　　　　　特許出願人名称　　
ミリポア・コーポレイション 代理人 補正の対象 補１Ｆの内容　　別紙の通り １　明細書１２頁８行の「フィルター３２」を「パラフ
ィンフィルム３２」に訂正する。 ２、　同１５頁６行の「ビチオン」を「ビオチン」に訂
正する。 五　同１３頁７行の「放射性標識の標識を付けた」を「
放射性標識で標識した」に訂正する。 ４、　同１５頁下から９行の「飯２０」を「板１２」に
訂正する。 ５、　同１５頁下から８行の「−」を１−」に訂正する
。 五　同１５頁下から７行の「決される。」の後に「該流
体手段４は室５０と、第２膜５４と、突起６０とから成
る。」を挿入する。 Ｚ　同１５頁下から５行の１６１」を削除する。 ８、　同１５頁下から４行の「６１」を１又は突起６０
」に訂正する。 ９　同１６百２行の「６１」を「６０」に訂正する。 １α同１７頁１０〜１１行の「放射線標識を付した」を
「放射線標識した１に訂正する。 １１　　第３図及び第５図を添付のように訂正する。 第３図 第４図 ！：１Ｕ 第５図 ｂＬＩ　　　　ｂｔＪ　　　　６０

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、　厚みを通して伸びる少くとも１個の開口を有する
    板と、 抗体を結合させて成り、前記板内の前記開口の一端の上
    をおおって配置されて個別の容積を有するくぼみを形成
    する第１の膜と、 前記の一端にある励記第１の膜に隣接した疎水性布地と
    、 前記開口の数に対応する室を少くとも１個有する第２の
    板で、前記室の各々は第２の膜から成る底部を有し、該
    第２の膜は単一のストランドＲＮＡ又は単一のストラン
    ドＤＮＡ分子に結合することができるもの とから成る装置。 ２、　前記第１膜の下に、前記第１膜を通り抜ける流体
    を前記室に向けるように一直線に並べた突起を含む特許
    請求の範囲第１項記載の装置。 五　前記第１膜が酢酸セルロースであり、前記抗体を前
    記第１膜にジビニルスルホンで結合させる特許請求の範
    囲第１項記載の装置。 ４、　前記第２膜ふニトロセルロースである特許請求の
    範囲第１項記載の装置。 ５、　１ｒｉｌ記抗体が抗ウイルス抗体である特Ｉｖ！
    Ｆ−請求の範囲第１項記載の装置。 ６、　前記第１膜が酢酸セｌルロースであり、前記第２
    膜がニトロセルシースである特許請求の範囲第１項記載
    の装Ｍ。 ｌ　前記疎水性布地をポリエステル、ポリオレアイン、
    ポリテトラフルオルエチレンから成る群より選ぶ特許請
    求の範囲第１項記載の装置。 ８、　前記疎水性布地が熱接着性である特許請求の範囲
    第１項記載の装置。 ９、　６１１記疎水性布地を接着剤で結び付ける特許請
    求の範囲第１項記載の装置。
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