NL8600056A

NL8600056A - Werkwijze voor het aantonen van een lid van een immunologisch paar, werkwijze voor het bereiden van een drager waaraan een lid van een immunologisch paar is gebonden alsmede analyse-inrichting geschikt voor het uitvoeren van dergelijke werkwijzen.

Info

Publication number: NL8600056A
Application number: NL8600056A
Authority: NL
Original assignee: Nederlanden Staat
Priority date: 1986-01-13
Filing date: 1986-01-13
Publication date: 1987-08-03
Also published as: EP0233385A1; JPS62228166A

Description

1 ^ N.0. 33399

Werkwijze voor het aantonen van een lid van een Immunologisch paar, werkwijze voor het bereiden van een drager waaraan een lid van een immunologisch paar is gebonden alsmede analyse-inrichting geschikt voor het uitvoeren van dergelijke werkwijzen.

5

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het aantonen van een lid van een immunologisch paar, waarbij men een drager van poreus materiaal, waaraan het niet aan te tonen lid van het immunologische paar is gebonden, in aanraking brengt met een (te analyseren) vloeistof, 10 waarin zich het andere (aan te tonen) lid bevindt of vermoed wordt aanwezig te zijn en de vorming van het immunologische complex aantoont.

Een dergelijke werkwijze, die ook dot-immunobinding assay wordt genoemd, is bekend uit Hawkes c.s., Analytical Biochemistry 119, 142-147 (1982). Deze methode kan worden beschouwd als een enzyme-immuno assay, 15 waarbij als vaste drager een membraanfilter, bijvoorbeeld van nitrocellulose wordt gebruikt. De immobilisatie van antigeen of antistof (die tezamen een immunologisch paar vormen) aan de nitrocellulose verloopt snel en gezien de geringe oppervlakte van de plaats waar de te analyseren vloeistof wordt opgebracht is de benodigde hoeveelheid antigeen 20 resp. antistof aanzienlijk minder dan die bij de enzyme-immuno-assay. De gevoeligheid van een dergelijk testsysteem is groter of ten minste gelijk aan die van de enzyme-immuno-assay. Het gebruik van nitrocellulose als dragermateriaal maakt het bovendien mogelijk de testresultaten ten opzichte van een achtergrond te beoordelen. Hierdoor is het gemakkelijk-25 er specifieke en aspecifieke reakties van elkaar te onderscheiden.

Het door Hawkes c.s. beschreven incubatieproces verloopt zoals bij de gebruikelijke enzyme-immuno-assay's: een drager met daarop geïmmobiliseerd antigeen of antilichaam wordt in kontakt gebracht met een oplossing, waarin zich antistoffen respektievelijk antigenen bevinden. De aan 30 het antigeen gebonden antistoffen of de aan het antilichaam gebonden antigenen worden vervolgens aangetoond door middel van een tweede antistof met daaraan gekoppeld een enzym en een kleurreaktie. Door diffusie moeten de antistoffen in kontakt kernen met het (geïmmobiliseerde) antigeen.

Voor dit proces is het noodzakelijk dat ten minste gedurende 1 uur wordt 35 geïncubeerd.

Gevonden werd nu, dat de incubatietijd aanzienlijk kan worden bekort wanneer men bij een werkwijze als in de aanhef beschreven de te analyseren vloeistof met een geregelde snelheid door de drager doet passeren. Deze geregelde snelheid kan volgens de uitvinding worden inge-40 steld door middel van over- of onderdruk.

Λ * 0ί A 2 i V w v’ J 0 *c 2

Bij de werkwijze volgens de uitvinding vindt de antigeen- of anti-stofbindingsreaktie onder continue pers- of zuigfiltratie op een drager van poreus materiaal plaats. Een dergelijke drager kan bijvoorbeeld een membraanfilter van nitrocellulose, cellulose (acetaat), polyamide en der-5 gelijke zijn. De incubatietijd, die 10-15 maal korter is dan de incubatietijd volgens de werkwijze van de stand van de techniek, is mogelijk doordat de te reageren stoffen gedwongen naar elkaar toe worden bewogen, hetgeen veel sneller gaat dan wanneer deze stoffen door diffusie naar elkaar moeten bewegen, zoals bij een gebruikelijke enzyme-immuno assay 10 gebeurt.

De snelheid, waarmee men de te analyseren vloeistof volgens de uitvinding door de drager laat passeren, wordt zodanig ingesteld dat ccm-plexvorming van het immunologische paar zo efficiënt mogelijk kan plaatsvinden. In het algemeen zal deze snelheid 0,5-5 ml/an2/min. bedra-15 gen.

Bij voorkeur voegt men aan het te analyseren monster polyoxyethy-leensorbitanmonolauraat toe on de aspecifieke binding van antistoffen resp. antigenen aan het dragermateriaal te voorkomen. Gebleken is, dat bijvoorbeeld een onder de aanduiding Tween 20 in de handel gebracht po-20 lyoxyethyleensorbitanmonolauraat hier betere resultaten geeft dan bijvoorbeeld runderserumalbumine (bovine serum albumin). Tween 20 wordt bij voorkeur toegevoegd in een concentratie tussen 0,05 en 1 vol.%.

De uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een drager, waaraan antigeen gebonden is, en welke drager bij 25 de bovenbeschreven werkwijze kan worden toegepast. Deze werkwijze wordt gekenmerkt doordat men in het geval van niet-covalente binding de vloeistof die antigeen bevat op de drager aanbrengt en onmiddellijk door de drager zuigt (door toepassen van onderdruk) en dat men in het geval van covalente binding de vloeistof die het antigeen of antilichaam bevat 30 aanbrengt op een geaktiveerde drager, bijvoorbeeld een met glutaardial-dehyd of een ander bifunktioneel reagens behandelde nitrocellulosedra-ger.

Bij de laatstgenoemde werkwijze voegt men bij voorkeur een detergens toe in een hoeveelheid beneden de kritische micel-concentratie 35 (CMC), waardoor een verbetering van de ccmplexvorming van het immunologische paar teweeg gebracht kan worden. Als detergens gebruikt men hiervoor bijvoorbeeld het onder de aanduiding Zwittergent 3-14 in de handel gebrachte detergens (3-tetradecyldimethylammonio-1-propaansulfaat), oc-tylbeta-D-glycqpyranoside, octyl-beta-D-thioglycopyranoside enz.

40 De werkwijze voor het aantonen van antigenen of antistoffen volgens vöOU U 3 0 3 & __ '··.

de enzyme-iimmofiltratiemethode volgens de uitvinding wordt voor een niet-canpetitieve assay door middel van de volgende trappen uitgevoerd ï a) bevochtigen van een droge drager, zoals een nitrocellulosemembraan, b) hetzij opbrengen van een antigeen resp. antistof bevattende vloei- 5 stof, welke vloeistof onmiddellijk door de drager wordt gezogen, waarbij men de antigeen bevattende vloeistof eventueel een hoeveelheid detergens beneden de CMC doet bevatten, hetzij covalent binden van het antigeen of de antistof aan een geaktiveerde drager, zoals een met 0,1 gew.%'s glutaardialdehyd voorbehandelde nitrocellulose- 10 drager, c) eventueel bewaren van de drager bij lage temperatuur, bijvoorbeeld 4eC in een afgesloten houder, d) eventueel onder onderdruk bevochtigen van de drager met een bijvoorbeeld 0,5 vol.% Tween 20 bevattende oplossing teneinde nog open 15 plaatsen op de drager te bezetten en daarmee aspecifieke binding aan de drager te voorkomen, e) opbrengen van een monster, d.w.z. een eerste antistof resp. antigeen bevattende vloeistof of een vloeistof, waarin een eerste antistof resp. antigeen vermoed wordt aanwezig te zijn, op de antigeen 20 resp. antistof bevattende drager, waarbij het monster door middel van onder- of overdruk met een geregelde snelheid van 0,5-5 ml/cm^/min door de drager wordt gezogen of geperst, aan het monster wordt bij voorkeur Tween 20 in een concentratie tussen 0,035 en 1 vol% toegevoegd, 25 f) wassen van de drager met water, waaraan eventueel 0,5 vol.% Tween 20 is toegevoegd, waarbij de wasvloeistof door de drager wordt gezogen of geperst, g) toevoegen van een antilichaam gemerkt met een signaal-producerend systeem en doorzuigen en/of persen van deze vloeistof door de dra- 30 ger, zoals beschreven bij trap e), waarbij trap g) eventueel kan worden voorafgegaan door toevoegen van een niet-gemerkte antistof zoals beschreven bij trap e), aan het monster wordt bij voorkeur Tween 20 in een concentratie tussen 0,035 en 1 vol% toegevoegd, h) wassen van de drager zoals bij trap f), 35 i) drogen van de drager door zuigen, bepalen van de hoeveelheid gemerkt complex op de drager volgens een meetmethode, die is aangepast aan het signaal-producerende systeem dat werd toegepast.

Bij de bovenbeschreven trap a) gebruikt men bij voorkeur Zwitter- gent 3-14.

40 Bij dê bovenbeschreven trap g) kan het signaal-producerende systeem

Tl λ - % .·„

^ - > 'j ïJ J O

.. , 4 bijvoorbeeld van een van de volgende kategorieën zijn: chromogenen, gekatalyseerde reakties, radio-aktieve labels, enz.

In het geval van een competitieve assay voert men eerst de bovenbeschreven trappen a) - f) uit en vervolgens de volgende trap g): 5 g) opbrengen van een antistof resp. antigeen gemerkt met een signaal-producerend systeem op de drager, waarbij het monster door middel van onder- of overdruk met een geregelde snelheid tussen 0,5 en 5 ml/cm2/min door de drager wordt gezogen of geperst, aan het monster wordt bij voorkeur Tween 20 in een concentratie 10 tussen 0,05 en 1 vol.% toegevoegd, waarna men vervolgens de bovenbeschreven trappen h) en i) van de niet-ccmpetitieve assay uitvoert.

De uitvinding heeft tevens betrekking op een analyse-inrichting omvattende in gebruikstoestand van boven naar beneden een monster-opneem-15 plaat voorzien van een aantal boringen, een dragermateriaal, waarbij tussen het dragermateriaal en de monsteropneemplaat ter plaatse van de boringen ringvormige pakkingen zijn aangebracht, en een steunplaat voorzien van boringen, die in de aangebrachte toestand in lijn liggen met de boringen van de monsteropneemplaat, waarbij de steunplaat is voorzien 20 van een aansluiting voor het brengen onder verminderde druk, welke inrichting wordt gekenmerkt doordat tussen de laag dragermateriaal en de steunplaats ter plaatse van de boringen in de steunplaat verdere ringvormige pakkingen zijn aangebracht, die in lijn liggen met de bovengenoemde ringvormige pakkingen en in hoofdzaak dezelfde gemiddelde inwen-25 dige diameter hebben. In de steunplaat zijn bij voorkeur ringvormige groeven aangebracht voor het gedeeltelijk opnemen van de verdere ringvormige pakkingen. De ringvormige pakkingen omvatten bij voorkeur O-rin-gen. Het is echter ook mogelijk in plaats van O-ringen twee lagen van gemakkelijk vervormbaar materiaal, bijvoorbeeld polysiloxanrubber, waar-30 aan gaten zijn geperst, in de inrichting aan te brengen, waartussen het dragermateriaal wordt geklemd. Uiteraard dienen de gaten in dergelijke vervormbare lagen in een lijn te liggen met de boringen in de monsteropneemplaat en de steunplaat.

Met de werkwijze resp. de inrichting volgens de onderhavige uitvin-35 ding is het mogelijk immunologische analyses zeer snel uit te voeren. Dit is bijvoorbeeld van belang bij sexueel overdraagbare aandoeningen (SOA). Niet alleen het aantal patiënten dat aan een SOA leidt, maar ook het aantal verschillende infectieuze agentia is de laatste jaren aanzienlijk toegenomen. Deze agentia zijn te vinden onder de bacteriën, 40 protozoa, fungi en virussen. Een groot scala verschillende ziektebeelden

R ? ?! λ X A

V *·β ta/ V

5 ,.

wordt door deze infectieuze agentia opgeroepen, waarbij het opvalt dat verscheidene agentia zich klinisch min of meer hetzelfde manifesteren. Het gevolg is dan ook dat een korrékte diagnose door klinisch onderzoek alleen niet mogelijk is en dat laboratoritanonderzoek daarvoor de meest 5 belangrijke ondersteuningsfaktor is. Het is thans mogelijk met behulp van de werkwijze(n) en de inrichting volgens de uitvinding een dergelijk immunologisch laboratoriumonderzoek zo snel uit te voeren, dat de betreffende patiënt op de uitslag kan wachten en geen nieuwe afspraak voor het eventueel doorvoeren van de therapie behoeft te worden genaakt. 10 Hierbij wordt opgemerkt dat de gebruikelijke enzym-immuno assay (ELISA) ten minste 3 uren vergt tot het bekend worden van de testuitslag. De testuitslag van de methode volgens de uitvinding kan binnen 15-20 minuten worden verkregen.

De analyse-inrichting volgens de uitvinding zal thans aan de hand 15 van een in de tekening afgebeeld uitvoeringsvoorbeeld meer gedetailleerd beschreven worden. In de tekening is een analyse-inrichting opengewerkt afgebeeld. Deze bestaat uit een monsteropneemplaat 1 voorzien van boringen 2 waarin de vloeistof aangebracht wordt. Deze boringen 2 zijn van onderen van een ringvormige groef 3 voorzien waarin 0-ringen 4 gedeelte-20 lijk kunnen liggen. In samengevoegde toestand grenst aan de O-ringen 4, een dragermateriaal 5 dat weer wordt begrensd door O-ringen 6 die gedeeltelijk in groeven 7 liggen, aangebracht in een steunplaat 8. In deze steunplaat 8 zijn boringen 9 aangebracht die in het verlengde van de ringvormige groeven 7 liggen. Deze steunplaat 8 kan op een bak 10 aange-25 bracht worden waarbij passende afdichtmiddelen 11 aanwezig zijn cm afdichting tussen steunplaat 8 en bak 10 te verzekeren. De uit deze bak 10 kanende leiding 12 kan aangesloten worden op een vacuunpompmiddel.

De analyse-inrichting volgens de uitvinding kan worden vervaardigd door aanpassen van een in de handel verkrijgbare inrichting voor het 30 uitvoeren van dot-immunobinding assays, bijv. micro-sample filtration manifold van de firma Schleicher & Schuell, BHD.

De hierboven beschreven analyse-inrichting wordt als volgt gebruikt: op een stukje nitrocellulose als dragermateriaal worden spotjes antigeen- of antilichaamsuspensie onder hoog vacuum aangebracht. Daarbij 35 kan gebruik gemaakt worden van een sjabloon. Vervolgens wordt het dragermateriaal tussen de steunplaat en de monsteropneenplaat ingeklemd. Daarna kan men de eerste antistof of antigeen laten incuberen door de antistofoplossing snel met een multichannel-pipet in de incubatiecupjes, boringen 2, te brengen. De luchtinlaat dient hierbij geopend te zijn cm 40 de druk in de bak 1Q in evenwicht te brengen met de atmosferische druk.

- 0 0

Na het pipetteren wordt de luchtinlaat gesloten en wordt de vacuumpomp aangesloten op leiding 12 in werking gesteld. Dit is bij voorkeur een gekalibreerde peristaltische vacuumpcmp en daarbij is de bak 10 grotendeels gevuld met vloeistof zodat door het aanzuigen van vloeistof door 5 de vacuumpomp nauwkeurige werking van de zuigfiltratie verkregen wordt. De antigeen-antistof-reaktie zal niet plaatsvinden door middel van diffusie, zoals bij een normaal ELISA, maar door continue zuigfiltratie ter hoogte van het nitrocellulose-membraan als dragermateriaal 5. Dit maakt zeer korte reaktietijden mogelijk. Daarbij is het verrassend dat door 10 het aanbrengen van een O-ring tussen de steunplaat en de laag dragermateriaal geen weglekken plaatsvindt. Voor de conjugaat- en substraat-stap gaat men analoog aan een normale ELISA te werk.

Het is eveneens mogelijk on het filtraat gescheiden op te vangen als men een halve microtiterplaat in de vacuümkamer plaatst met een ge-15 leidingssysteem voor vloeistof daarbij. De afvoering van de vloeistof kan het best geschieden via een lucht-vloeistof-scheidingsfles waaraan een hoeveelheid chloorbleekloog voor desinfectie toegevoegd is.

Hoewel de hierboven beschreven uitvoering een voorkeursuitvoering van de uitvinding is moet begrepen worden dat de uitvinding daar niet 20 toe beperkt is en dat daaraan door de degene bekwaam in de stand der techniek wijzigingen aangebracht kunnen worden zonder buiten de gedachte van de onderhavige uitvinding te geraken.

In de volgende voorbeelden wordt de uitvinding nader toegelicht.

25 Voorbeeld I

Antistofdetectie (niet competitief)

Bij de uitvoering van de analyse wordt gebruik gemaakt van de hierboven beschreven analyse-inrichting.

Nitrocellulosemembraan (poriëngrootte 0,45 /urn) wordt bevochtigd 30 met gedestilleerd water. Per antigeenspot wordt 5 /ul van een suspensie van Treponema pallidum organismen (20 /ug/ml eiwit) in phosphate buffered saline (PBS), waaraan 0,005 % w/v Zwittergent 3-14 werd toegevoegd, onder vacuum opgebracht. De drager kan bij 4°C in afgesloten box bewaard worden of na circa 1 minuut drogen gebruikt worden. Elke spot 35 wordt onder vacuum gewassen met 200 /ul PBS, waaraan toegevoegd 0,5 % v/v Tween 20 (PBS-Tween). Vervolgens wordt 200 /ul patiëntenserum 1:50 verdund in PBS-Tween opgebracht, waarbij het serummonster door middel van onderdruk met een geregelde snelheid van 2 ml/cm^/min door de drager wordt gezogen. Dan wordt gewassen met 200 /ul PBS-Tween, waarna 200 40 /ul Horse radish peroxidase geconjugeerd geit-antihumaan immunoglobu- ^ r η λ o % - j 'J 0 o 7 ..

line 1:20.000 verdund in PBS-Tween niet een geregelde snelheid van 2 ml/cm^/min. door de drager wordt gezogen. De drager wordt driemaal onder vacuum met 200 /ul PBS-Tween gewassen. Vervolgens wordt 200 /ul sub-straatoplossing, welke tetramethylbenzidine (1,2 mg/ml), waterstofper-5 oxide (0,003 %), natriumacetaat (6,8 %) en citroenzuur (1,4 %> bevat, opgebracht en na 3 minuten incubatie doorgezogen. Het ontstaan van een groenblauwe spot tegen een witte achtergrond duidt op een positieve re-aktie. De intensiteit van de kleurreaktie kan in gradaties van 1+ en 2+ aangegeven worden, waarbij de 1+ reaktie de zwakste graad van kleuring 10 is die nog als positief beschoud wordt. Resultaten met serummonsters afkomstig van syfilitici en niet-syfilitici zijn weergegeven in tabel A.

TABEL A

aantal aantal (%) positieve diagnose_serumnonsters_serummonsters_ 15 syfilis 151 146 (96,7) geen syfilis_504_3 (0,6)_

Voorbeeld II

20 Antistofdetectie (competitief)

De uitvoering van de analyse verloopt analoog aan die beschreven bij de niet-canpetitieve antistofdetectie. Na reaktie van het patiëntenserum en de daarop volgende wasstap met PBS-Tween wordt 200 /ul Horse radish peroxidase geconjugeerde monoclonale antistof gericht tegen Tre-25 ponema pallidum 1:20.000 verdund in PBS-Tween cpgebracht en met een geregelde snelheid van 2 ml/cm^/min. door de drager gezogen. Na driemaal wassen met 200 /ul PBS-Tween wordt 200 /ul substraatoplossing, zoals beschreven bij de niet-ccmpetitieve antistofdetectie, opgebracht en na 3 minuten incubatie doorgezogen. De intensiteit van de kleurreaktie wordt 30 vergeleken met een antigeenspot, welke alleen met de Horse radish peroxidase geconjugeerde monoclonaal geïncubeerd werd. In geval van inhibitie door antistoffen in het patiëntenserum verandert de intensiteit van de kleurreaktie van 2+ naar 1+ of naar negatief. De resultaten met enkele serumnonsters van syfilitici en niet-syfilitici zijn weergegeven in 35 tabel B.

TABEL B

aantal aantal serummonsters (%) dat diagnose_serummonsters_inhibitie vertoont_ syfilis 10 8 (80) 40 geen syfilis_ 10_ 0 (0)_ Π - * T\ * * v

s' 8 Voorbeeld III

Antigeendetectie (niet-ccmpetitief)

Per spot werd 5 /ul monoclonale antistof gericht tegen Treponema pallidum 1;200 verdund in PBS onder vacuum opgebracht. Na circa 1 minuut 5 drogen wordt onder vacuum gewassen met 200 /ul PBS-Tween. Vervolgens wordt 200 /ul van een suspensie van Treponema pallidum-organismen in PBS, waaraan 0,05 % Tween 20 is toegevoegd, opgebracht en met een geregelde snelheid van 2 ml/cm^/min. door de drager gezogen. Als controle dient een suspensie van E.coli-organismen. De drager wordt onder vacuum 10 gewassen met 200 /ul PBS-Tween. Vervolgens wordt 200 /ul Horse radish peroxidase geconjugeerde monoclonale antistof gericht tegen Treponema pallidum 1:10.000 verdund in PBS-Tween opgebracht en met een geregelde snelheid van 2ml/cm2/min. door de drager gezogen. Na driemaal onder vacuum wassen met 200 /ul PBS-Tween wordt 200 /ul substraatop-15 lossing, zoals beschreven bij voorbeeld I, toegevoegd en na 3 minuten incubatie doorgezogen. Het ontstaan van een groenblauwe spot tegen een witte achtergrond duidt op aanwezigheid van Treponema pallidum in de onderzochte suspensie. De resultaten met verschillende hoeveelheden Treponema pallidum organismen zijn weergegeven in tabel C. De controles met 20 E. coli gaven een negatieve uitslag te zien.

TABEL C

aantal Treponema pallidum- organismen per ml_testresultaat 25 1 x 108 pos.

5 x 107 pos.

1 x 107 pos.

5 x 106 neg.

30 1 X 106 neg.

> O A* A /¾ n .» . e v v- -J ύ o o

Claims

1 I

1. Werkwijze voor het aantalen van een lid van een immunologisch paar, waarbij men een drager van poreus materiaal, waaraan het niet aan 5 te tonen lid van het immunologische paar is gebonden, in aanraking brengt met een (te analyseren) vloeistof, waarin zich het andere (aan te tonen) lid bevindt of vermoed wordt aanwezig te zijn en de vorming van het immunologische complex aantoont, met het kenmerk, dat men de te analyseren vloeistof met een geregelde snelheid door de drager doet passe-10 ren.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de snelheid waarmee men de te analyseren vloeistof door de drager doet passeren instelt tussen 0,5 en 5 ml/cmVmin.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men aan 15 het te analyseren monster polyoxyethyleensorbitanmonolauraat toevoegt in een concentratie tussen 0,05 en 1 volumeprocent.

4. Wërkwijze voor het bereiden van een drager waaraan een lid van een immunologisch paar covalent of niet-covalent is gebonden, ten ge-bruike bij de werkwijze volgens één of meer der conclusies 1-3, met het 20 kenmerk, dat men in het geval van covalente binding de vloeistof die dit lid bevat op een geaktiveerde drager aanbrengt en dat men in het geval van niet-covalente binding de vloeistof die dit lid bevat op de niet-ge-aktiveerde drager aanbrengt en onmiddellijk door de drager zuigt.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men door 25 toevoegen van een detergens in een hoeveelheid beneden de kritische mi- cel-concentratie (CMC) aan het antigeen een verbetering van de complex-vorming van het immunologische paar teweegbrengt.

6. Werkwijze voor het aantonen van antigenen of antistoffen volgens de enzym-immunofiltratiemethode, met het kenmerk, dat men voor een niet- 30 competitieve assay de volgende trappen uitvoert: a) bevochtigen van een droge drager, zoals een nitrocellulosemembraan, b) hetzij opbrengen van een antigeen resp. antistof bevattende vloeistof, welke vloeistof onmiddellijk door de drager wordt gezogen, waarbij men de antigeen bevattende vloeistof eventueel een hoeveel- 35 heid detergens beneden de CMC doet bevatten, hetzij covalent binden van het antigeen of de antistof aan een geaktiveerde drager, zoals een met glutaardiaidehyd voorbehandelde nitrocellulosedrager, c) eventueel bewaren van de drager bij 4°C in een afgesloten houder, d) eventueel onder onderdruk bevochtigen van de drager met een Tween 40 20 bevattende oplossing teneinde nog epen plaatsen op de drager te r. ' " \ · λ -* - * \j y -r*· -Λ·· bezetten en daarmee aspecifieke binding aan de drager te voorkomen, e) opbrengen van een monster, d.w.z. een eerste antistof resp. anti-geen bevattende vloeistof of een vloeistof, waarin een eerste antistof resp. antigeen vermoed wordt aanwezig te zijn, op de antigeen 5 resp. antistof bevattende drager, waarbij het monster door middel van onder- of overdruk met een geregelde snelheid van 0,5-5 ml/cm^/min door de drager wordt gezogen of geperst, aan het monster wordt bij voorkeur Tween 20 in een concentratie tussen 0,05 en 1 vol.% toegevoegd, · 10 f) wassen van de drager met water, waaraan eventueel 0,5 vol.% Tween 20 is toegevoegd, waarbij de wasvloeistof door de drager wordt gezogen of geperst, g) toevoegen van een antilichaam gemerkt met een signaal-producerend systeem en doorzuigen en/of persen van deze vloeistof door de dra- 15 ger, zoals beschreven bij trap e), waarbij trap g) eventueel kan worden voorafgegaan door toevoegen van een niet-gemerkte antistof zoals beschreven bij trap e), aan het monster wordt bij voorkeur Tween 20 in een concentratie tussen 0,05 en 1 vol.% toegevoegd, h) wassen van de drager zoals bij trap f), 20 i) drogen van de drager door zuigen, bepalen van de hoeveelheid gemerkt complex op de drager volgens een meetmethode, die is aangepast aan het signaal-producerende systeem dat werd toegepast.

7. Werkwijze voor het aantonen van antigeen of antistoffen volgens de enzym-immunofiltratiemethode, met het kenmerk, dat men voor een ccm- 25 petitieve assay de volgende trappen uitvoert: a) overeenkomstig trap a) van conclusie 6, b) overeenkomstig trap b) van conclusie 6, c) overeenkomstig trap c) van conclusie 6, d) overeenkomstig trap d) van conclusie 6, 30 e) overeenkomstig trap e) van conclusie 6, f) overeenkomstig trap f) van conclusie 6, g) opbrengen van een antistof resp. antigeen gemerkt met een signaal-producerend systeem, waarbij het monster door middel van onder- of overdruk met een geregelde snelheid tussen 0,5 en 5 ml/cm^/min door 35 de drager wordt gezogen of geperst, aan het monster wordt bij voor keur Tween 20 in een concentratie tussen 0,05 en 1 vol.% toegevoegd, h) overeenkomstig trap f ) van conclusie 6, i) overeenkomstig trap i) van conclusie 6. 40 •iS ··' :¾ λ χ

8. Analyse-inrichting omvattende in gebruikstoestand van boven naar beneden een monsteropneemplaat voorzien van een aantla boringen, een dragermateriaa, waarbij tussen het dragermateriaal en de monsteropneern-plaat ter plaatse van de boringen ringvormige pakkingen zijn aange- 5 bracht, en een steunplaat voorzien van boringen, die in aangebrachte toestand in lijn liggen met de boringen van de monsteropneemplaat, waarbij de steunplaat is voorzien van een aansluiting voor het brengen onder verminderde druk, met het kenmerk, dat tussen de laag dragermateriaal en de steunplaat ter plaatse van de boringen in de steunplaat verdere ring-10 vormige pakkingen zijn aangebracht, die in lijn liggen met de bovengenoemde ringvormige pakkingen en in hoofdzaak dezelfde gemiddelde inwendige diameter hebben.

9. Analyse-inrichting volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat in de steunplaat ringvormige groeven zijn aangebracht voor het gedeeltelijk 15 opnemen van verdere ringvormige pakkingen.

10. Analyse-inrichting volgens conclusie 8 of 9, met het kenmerk, dat de ringvormige pakkingen O-ringen omvatten. ****** & V ·-' V ^