DK165957B

DK165957B - Apparat med et antal separate reagenskamre, der successivt indeholder de til en analytisk bestemmelse noedvendige reagenser

Info

Publication number: DK165957B
Application number: DK140690A
Authority: DK
Inventors: John Christopher Stanley
Original assignee: Scient Generics Ltd
Priority date: 1987-12-08
Filing date: 1990-06-08
Publication date: 1993-02-15
Also published as: EP0320240A1; NZ227219A; AU2822589A; DK165957C; CS275761B6; US5116576A; BR8807837A; WO1989005457A1; DE3861955D1; AU607570B2; DK140690A; HU890349D0; ES2021437B3; DK140690D0; GB8728639D0; IE883650L; ATE61484T1; FI895701A0; JPH03501521A; EP0320240B1

Description

i

DK 165957B

Opfindelsen angår et apparat til udførelse af analytiske bestemmelser, og især et apparat til udførelse af en specifik bindingsanalyse, såsom en immunoanalyse.

5 Der er en stor interesse for at forenkle analyseteknikker med henblik på at gøre det muligt for den uøvede bruger at udføre sammensatte analyseprocedurer uden fejl. Dette er især relevant for immunoanalyseområdet, som inden for helseområdet er blevet taget ud af det kliniske laboratorium, og som nu bliver 10 benyttet i klinikker, lægekonsultationer, veterinærkonsultationer og endog ved siden af patienten eller dyret. Dette er blevet gjort muligt ved indføringen af ikke-isotope marker, såsom enzymer, der kan give farvede slutresultater, der kan tydes visuelt eller måles i et simpelt instrument. Desuden er 15 nye formater blevet udtænkt med henblik på i høj grad at forenkle væskebehandlingen ved disse analyser, hvor eksempler inkluderer Hybritech's immunokoncentrationsapparat, US-A-4.376.110, American Hospital Supply Corporation's inaktive porøse medium, PCT W082/02601, Syva Company's koncentrationszonefremgangsmå-20 de, EP-A-0.046.004 og Bagshawe's absorberende matricepude, US-A-3.888.629. I disse analyseapparater finder de specifikke bindingsreaktioner, såsom de indbyrdes bindinger mellem anti-stof/antigen sted i en absorberende matrice eller membran, som er i berøring med en mængde materiale, der virker som en væ-25 skeabsorber. Under brug bliver prøven overført til matricen eller membranen, yderligere reagenser bliver tilføjet efterfulgt af en udvask og tilføjelsen af et enzymsubstrat (når der benyttes et enzymmærke). Ulempen ved denne type immunoanalyse-format er, at reagenserne må tilføres separat, dvs. med hen-30 blik på en manuel analyse bliver konjugatet, vaskepufferen og enzymsubstratet gjort tilgængeligt i drypflasker, der indeholder tilstrækkeligt fluidum til at udføre et antal analyser.

Til en analyse udført i et instrument må disse reagenser tilføres ved sammensatte pipetteringsmetoder. Disse separate rea-35 genser forøger den indviklede beskaffenhed af analysen og indfører muligheden for fejl begået af en ukyndig bruger, der indfører reagenser i en forkert rækkefølge, eller forøger i

DK 165957 B

2 høj grad den indviklede sammensætning af instrumentet i et automatiseret apparat.

Andre immunoanalyseapparater er blevet foreslået, som benytter 5 en absorberende eller ikke-absorberende målepind, på hvilken antistoffer er blevet immobi1iserede, f.eks. Unilever, EP-A-O.042.755, og Becton Dickinson and Company, EP-A-0.194.789.

1 disse apparater bliver prøven bragt i berøring med målepinden efterfulgt af den yderligere tilsætning af mærkede reagen-10 ser, en udvask og den sidste tilsætning af et enzymsubstrat (hvis der benyttes et enzymmærke) eller målingen af andre mærker med forskellige midler. Ulempen ved et sådant system er, at reagenserne må tilsættes til beholdere, i hvilke pinden bliver neddyppet, og en separat vaskestation, såsom en hushold-15 ningsvask, kan være påkrævet.

I GB-A-2073416 beskrives en teleskopcylinderenhed i to dele, som danner en engangsbeholder for en tampontop og et væskedyrkningsmedium. En konisk prop forsegler væsken fra tamponen, 20 men når de teleskopagtige dele bliver skubbet sammen, drejer proppen sådan, at forseglingen bliver brudt, og væskedyrkningsmediet kan komme i berøring med tamponen.

I EP-A-0206166 beskrives en prøveflaske, der omfatter et for-25 seglet kammer, som indeholder et flydende medium og et åbent kammer, som befinder sig uden om det forseglede kammer og bærer prøvegenstanden. En spærring adskiller det forseglede og det åbne kammer indbyrdes. Prøveflasken er udstyret med midler til at penetrere afspærringen og indgive prøvegenstanden i det 30 flydende medium.

US-A-3.825.410 viser et antal sammenkædede rum, som er adskilt af gennembrydelige membraner, hvor membranerne kan gennembrydes af en perforerende probe. Mængden af celler kan benyttes 35 med et internt filter, som er placeret på en filterunderstøtning. Filteret opfanger reaktanter fra en immunoprøvereaktion, og filtercellen bliver overført til et andet område med henblik på analysering.

DK 165957 B

3

Vi har nu udviklet et apparat til udførelse af analytiske bestemmelser, og som indeholder alle de nødvendige reagenser og vaskeopløsningen til udførelse af biologiske analyser eller kemiske analyser i apparatet.

5

Ifølge nærværende opfindelse er der tilvejebragt et apparat til udførelse af analytisk bestemmelse og omfattende et antal separate, særskilte kamre, der successivt indeholder de reagenser, der kræves til at gennemføre den ønskede analytiske 10 bestemmelse, hvor reagenskamrene er adskilt fra hinanden ved hjælp af et skillemiddel, der under brug bliver gennembrudt eller åbnet, hvor det nye og særegne ved apparatet er, at apparatet omfatter et prøveoverføringslegeme, som har et derpå anbragt prøveopsamlingsområde, og at reagenskamrene er udfor-15 met i en prøvekassettes hus, som ved dets ene ende er lukket, og ved dets anden ende har en indføringsåbning til indføring af prøveoverføringslegemet, hvorved den prøve, der skal analyseres, bliver overført til reagenskamrene, og hvor skille-midlerne mellem reagenskamrene under brug bliver gennembrudt 20 eller åbnet af prøveoverføringslegemet, og hvor der i prøvekassettens hus, i umiddelbar nærhed af dettes lukkede ende, er udformet et signaldetekteringskammer, som er adskilt fra det sidste reagenskammer af et ski 1 lemiddel, der under brug bliver gennembrudt eller åbnet af prøveroverføringslegemet.

25

Hver prøvekassette er komplet og kræver kun indsætningen af prøveoverføringslegemet efterfulgt af en simpel mekanisk manipulering for at fuldende analysen. Analysen eller analyseresultatet er synligt for operatøren, hvis et kolorimetrisk 30 slutresultat er valgt, og hvis prøven også bliver målt, kan koncentrationen af det ukendte materiale i prøven blive bestemt med henvisning til kalibratorer eller kontroller, som samtidigt bliver kørt under analysen. Denne bestemmelse kan blive udført visuelt til et kvalitativt eller halvkvantitativt 35 resultat eller et måleinstrument kan benyttes til på en overførings- eller reflektionsmåde at give et kvantitativt resultat. Som yderligere alternativer kan vælges elektrokemiske

DK 165957 B

4 marker, såsom dem, der er beskrevet af Serono i EP-A-0.142.301, eller radioaktive, kemisk selvlysende eller fluorescerende mærker kan anvendes. Det grundlæggende udførelsesprincip for prøvekassetten er anvendeligt til mange analyseområder og ind-5 sætteisen af egnede reagenser vil muliggøre, at såvel biokemiske som kemiske analyser kan udføres af en ufaglært operatør.

Apparatet ifølge nærværende opfindelse består af to komponenter: Prøveoverføringslegemet og selve prøvekassetten. Prøve-10 overføringslegemet kan omfatte en plastplade, f.eks. en plade af methylmethacrylat, polystyren, nylon eller celluloseacetat. Prøveoverføringslegemet er forsynet med et prøveopsamlingsområde. 1 en immunoanalyse er et specifikt bindemiddel, såsom et antistof eller et antigen immobi1iseret på prøveopsamlings-15 området. De specifikke bindemidler kan være direkte koblet med plastoverfladen under anvendelse af anerkendte metoder, såsom adsorption eller kovalent binding. De kan være bundet til en absorberende membran eller pude af nylon, polyurethan- eller polyetherskum eller cellulose eller andet sammentrykkeligt 20 materiale ved passiv adsorption eller kovalent binding. De kan være koblet til genstande, f.eks. af polystyren eller dextran, som bliver holdt på plads af et absorberende materiale. I tilfældet med direkte kobling til plastoverfladen er det ønskeligt at dække overfladen med et lag af absorberende materiale.

25 I alle de tre beskrevne tilfælde bliver prøven pipetteret eller tilsat uden måling til prøveopsamlingsområdet og optaget af det absorberende materiale. Eventuelt overskydende fluidum forbliver på overfladen. Prøven til en immunoanalyse kan f.eks. være urin, helblod, serum eller plasma.

30 I andre områder på prøveoverføringslegemet kan såvel kalibra-torer som kontroller være blevet indført under fremstillingen, og de kan være beskyttet fra prøven, som skal analyseres, ved hjælp af et aftageligt dæklag. I en yderligere modifikation 35 kan et eller flere filtreringslag være indlagt som toplaget på prøveoverføringslegemet med henblik på at fjerne partikler, såsom røde blodlegemer, før de når antistoflaget. Filtrerings-

DK 165957B

5 laget kan indeholde antistoffer sat op imod røde blodlegemer for at hjælpe med deres fjernelse.

Prøveoverføringslegemet indeholdende prøven bliver så sim-5 pelthen skubbet ind i prøvekassetten for at gennemføre immuno-analysen. Prøvekassetten omfatter en række adskilte reagenskamre, som for en bestemt type immunoanalyse successivt ville være et vaskekammer, et konjugatkammer, en yderligere række af vaskekamre og signaldetekteringskammeret. Alternativt, hvis 10 den første vask ikke er nødvendig, ville reagenskamrene for den specielle immunoanalyse, der bliver udført, i rækkefølge vare et konjugatkammer, en række af vaskekamre og signaldetekteringskammeret. Visse kamre i prøvekassetten kan være efterladt tomme med henblik på at sikre en mere effektiv fjernelse 15 af flydende reagenser fra prøveopsamlingsområdet. Signaldetek-teringskammeret kan være fyldt med reagens, f.eks. et enzymsubstrat, eller det kan være efterladt tomt, hvis der skal udføres en måling af fluorescens eller radioaktivitet. Om ønsket kan prøveoverføringslegemet være mærket eller kalibreret, så 20 at operatøren bliver hjulpet til udførelse af analysen kor rekt. F.eks. kan prøveoverføringslegemet være forsynet med mærker, som vil indikere over for operatøren, at prøveover-føringslegemet er anbragt i et bestemt reagenskammer. Operatøren kan også blive mindet om den tid, hvori prøveoverførings-25 legemet skal forblive i det bestemte kammer.

Det vil være klart, at selv om prøveoverføringslegemet kan benyttes i en immunoanalyse som beskrevet ovenfor, kan det også anvendes til at prøve andre væsker, såsom mælk, gærings-30 suppe, vand fra en flod, sø eller havet med henblik på at udføre en passende analyse deraf. Alternativt kan prøveoverførings legemet benyttes til at prøve luft ved at en atmosfærisk aerosol eller en partikelsuspension bliver trukket ind på en absorberende matrice på prøveoverføringslegemet ved sugning 35 eller ved brug af en venturi.

I en DNA-sondeanalyse tilvejebringer prøvekassetten en væsentlig forenkling af analyseproceduren. Prøveoverføringslegemet

DK 165957 B

6 er tilpasset til at optage en prøve indeholdende DNA; dette kan være blod eller en vævspodning eller et andet biologisk fluidum indeholdende celler eller viruser med DNA- eller RNA-indhold. Prøven kan også udtages fra en kultur af bakteriecel-5 ler. Prøvekassettens indre indretning af kamre ville successivt være et cellelyseringskammer eller DNA- eller RNA-eks-traktionskammer med muligheden for ekstern lydpåvirkning eller opvarmning for at hjælpe med prøveopløsning, et kammer indeholdende en mærket prøve, hvor mærket kan være radioaktivt, 10 fluorescerende, kemi 1uminescerende eller en hapten, såsom biotin, hvortil et avidin/enzym-konjugat kan binde, en række af vaskekamre med henblik på at fjerne overskydende prøve og et signaldetekteringskammer. Alternativt kan det første kammer til cellelysering eller ekstraktion udelades, hvis DNA'et el-15 ler RNA'et allerede er blevet renset for prøvematerialet før det bliver føjet til prøveoverføringslegemet. I disse eksempler kan DNA'et eller RNA'et være bundet specifikt eller ikke-specifikt til prøveoverføringslegemet. I et yderligere eksempel på en DNA-prøveanalyse udført i prøvekassetten kan et el-20 ler flere successive kamre indeholde en varmestabil DNA-poly-merase, såsom den, der er renset for Thermus aquaticus, og også oligonukleotide eller polynukleotide primere og nukleotide triphosphater. Anvendelsen af gentagne ydre opvarmnings- og kølingscykler for prøvekassetten vil muliggøre forstærkningen 25 af prøven af DNA ifølge fremgangsmåden beskrevet af Cetusi US patent nr. 4.683.195. Indholdet af disse DNA forstærkningstrin i prøvekassetten sikrer, at de meget store mængder DNA, som kan frembringes ved polymerasekædereaktionsmetoden ifølge Ce-tus, forbliver forseglet i kamrene og ikke kan undslippe til 30 de ydre omgivelser. På denne måde kan forureningen af laboratorieområder med forstærkede DNA-sekvenser, som er en voksende fare, undgås.

Der er betydelig interesse for at automatisere de sammensatte 35 og tidsforbrugende immunoanalyser og DNA-prøvningsprocedurer.

En måde hvorpå dette er blevet gennemført indtil nu er ved at bibeholde eksisterende analyseformater, såsom prøveglas, mi-

DK 165957 B

7 .

krotitreringskar eller de mere sofistikerede fastfasemateria-lerf såsom cellulosecoatede magnetiske genstande og at bygge et sammensat mekanisk apparat med mange funktioner, såsom overreagenspipettering, vaske- og detekteringsreagenstiIsæt-5 ning. Prøvekassetteformatet tilbyder en alternativ vej til automatisering. Eftersom kassetten er fuldstændig komplet, og alle reagenserne bliver indført under fremstillingen, er der ikke noget behov for afmålt reagenstilsætning eller vasketrin. Efter overføring af prøven til prøveoverføringslegemet fulden-10 der apparatet analysen ved, at man simpelthen skubber prøveoverføringslegemet ind i prøvekassetten, indtil det absorberende område er trængt helt ind i signaldetekteringskammeret.

En prøvekassette kan anvendes med standard antigen-opløsninger til at kalibrere apparatet, eller kalibratorer og kontroller 15 kan indbygges i hver prøvekassette, ud fra hvilket apparatet kan konstruere en kalibreringskurve.

Prøvekassetten kan også indeholde en prøveudmålingszone, som er tilvejebragt i kassettehuset stødende op til åbningen. Prø-20 veudmålingszonen inkluderer fortrinsvis en tampon af et absorberende materiale, såsom bomuldsvat eller polyurethanskum anbragt grænsende op til åbningen, hvorved eventuel overskydende prøvevæske bliver fjernet fra prøveoverføringslegemet. Prøveudmålingszonen vil i almindelighed være adskilt fra det første 25 reagenskammer med et skillemiddel, der under brug bliver gennembrudt eller åbnet af prøveoverføringslegemet.

Skillemidlet, der adskiller reagenskamrene fra hinanden og fra prøveudmålingszonen og fra signaldetekteringskammeret, bliver 30 gennembrudt eller åbnet af prøveoverføringslegemet, som bliver indført i prøvekassetten. Skillemidlet kan f.eks. være en en-vejsventil eller en plastfilm, der er klæbet henover et vindue eller en svækningszone dannet i en væg, der adskiller kamrene fra hinanden, og som bliver gennembrudt ved, at man presser 35 prøveoverføringslegemet derimod. Det er klart, at en enkelt prøvekassette kan vare forsynet med mere end en art skillemid-del, hvis dette er ønsket.

DK 165957 B

* \ 8

Signaldetekteringskammeret er fortrinsvis forsynet med mindst en transparent væg eller med et vindue, så at det signal, der angiver det analytiske resultat, kan måles optisk ved hjælp af et passende måleapparat. Signaldetekteringskammeret kan også 5 have en anden form end den for de foregående kamre med henblik på at lette signalmålingerne.

Med henblik på at forsegle prøveoverføringslegemet i prøvekassetten ved afslutningen af den analytiske bestemmelse og såle-10 des forhindre lækage af reagenser fra prøvekassetten, kan prøveoverføringslegemet enten være udformet fremadskridende tykkere, så at det under brug tilvejebringer en forsegling ved den første skillevæg, eller en flange kan være støbt på dets ende længst borte fra prøveopsamlingsområdet, og som er til-15 passet til at blive anbragt i en udtagning dannet i åbningsenden på kassettehuset.

I en anden udførelsesform ifølge opfindelsen kan apparatet være tilpasset til den parallelle behandling af en bestemt 20 prøve og kalibratorer eller kontroller, eller det kan anvendes til den parallelle behandling af et antal prøver fra den samme eller forskellige patienter eller dyr. Prøveoverføringslegemet og prøvekassetten er udvidet i sideretningen for at tilvejebringe et antal yderligere områder på prøveoverføringslegemet, 25 hvorpå der kan være anbragt enten kontrolmaterialer påført under fremstillingen eller påført samtidigt med prøven eller yderligere prøveopsamlingsområder. Kontrolområderne kan være beskyttet fra prøven, der skal analyseres, ved hjælp af et aftageligt dæklag, der enten kan fjernes af operatøren før udfø-30 reisen af analysen, eller som automatisk kan blive skrællet af med midler tilvejebragt i prøvekassetten, når prøveoverføringslegemet bliver indsat i denne. Den analytiske bestemmelse bliver udført på samme måde som det allerede er beskrevet, og prøveområdet kan så sammenlignes med kontrol- eller kalibra-35 torområderne ved afslutningen af analysen.

Alternativt kan prøvekassetten være yderligere underopdelt med vægge, der løber parallelt med bevægelsen af prøveoverførings

DK 165957 B

9 legemet i kassetten. Prøveoverføringslegemet har så et antal grene til bæring af prøver, kalibratorer eller kontroller, som ønsket. Denne type apparat kan anvendes til at udføre multiple analytiske bestemmelser.

5 I overensstemmelse hermed anviser nærværende opfindelse et apparat til udførelse af et antal analytiske bestemmelser og omfattende et antal separate, særskilte kamre, der successivt indeholder de reagenser, der kræves, til at gennemføre de øn-10 skede analytiske bestemmelser, hvor reagenskamrene er adskilt fra hinanden ved hjælp af et skillemiddel, ser under brug bliver gennembrudt eller åbnet, hvilket apparat omfatter et prøveoverføringslegeme, som har et antal grene, hvor hver gren har et prøveopsamlingsområde eller et område til overføring af 15 en kontrol eller kalibrator anbragt på dette, og mindst en langsgående skillevæg udformet i huset til en prøvekassette med henblik på at opdele huset i et antal separate analyserum, hvor reagenskamrene er udformet i huset, som er lukket ved dets ene ende og har en enkelt indføringsåbning eller et antal 20 indføringsåbninger ved dets anden ende til indføring af grenene på prøveoverføringslegemet, hvorved prøverne til analyse bliver overført til reagenskamrene, og skillemidlerne mellem reagenskamrene under brug bliver gennembrudt eller åbnet af grenene på prøveoverføringslegemet, og et antal signaldetekte-25 ringskamre, der er udformet i huset til prøvekassetten i umiddelbar nærhed af dettes lukkede ende, hvor signaldetekteringskammeret i et bestemt analyserum er adskilt fra det sidste reagenskammer for dette analyserum ved hjælp af et skillemiddel, som under brug bliver gennembrudt eller åbnet af en gren 30 på prøveoverføringslegemet.

*

Opfindelsen vil blive beskrevet nærmere under henvisning til den ledsagende tegning, hvor 35 fig. la viser et planbillede af prøveoverføringslegemet til apparatet ifølge opfindelsen,

DK 165957B

10 fig. Ib et længdesnit gennem prøveoverføringslegemet ifølge fig. la, fig. lc et længdesnit gennem et alternativt udformet prøve-5 overføringslegeme, fig. Id et planbillede af prøvekassetten til apparatet ifølge opfindelsen, 10 fig. le et længdesnit gennem prøvekassetten i fig. Id, fig. 2 prøveoverføringslegemet anbragt i prøvekassetten ved afslutningen af analysen, 15 fig. 3a og 3b to måder, hvorpå prøveoverføringslegemet kan være forseglet i prøvekassetten, fig. 4 i forstørret målestok et tværsnit gennem en skillevæg, der adskiller to kamre i prøvekassetten, 20 fig. 5 i forstørret målestok et tværsnit gennem skillevæggen i fig. 4 med prøveoverføringslegemet ført gennem denne, fig. 6a og 6b et prøveoverføringslegeme henholdsvis en prøve-25 kassette beregnet til parallel behandling af en prøve og kali-bratorer eller kontroller, fig. 7a og 7b et prøveoverføringslegeme henholdsvis en prøvekassette beregnet til parallel behandling af en prøve og kali-30 bratorer eller kontroller eller til den parallelle behandling af et antal prøver, fig. 8 resultaterne af et vaskeforsøg med henblik på at fjerne alkalisk phosphatase fra prøveoverføringslegemet under passage 35 gennem prøvekassetten, og fig. 9 resultaterne af en immunoenzymometrisk analyse for human IgG udført under anvendelse af prøvekassetten.

11

DK 165957B

Hed henvisning til tegningen viser figurerne la, lb og lc prøveoverføringslegemet 1. Prøveoverføringslegemet er et aflangt plastelement til hvis ene ende, der er bundet et absorberende materiale 2. Det absorberende materiale 2 strækker sig 5 på tværs af en overflade 3 af overføringslegemet og tilvejebringer et volumen på tilnærmelsesvis 1,0 cm5 som prøveopsamlingsområde. Resten af prøveoverføringslegemet er blottet og er beregnet til at blive holdt i hånden. Fig. lc viser en alternativ udformning, hvor det absorberende materiale er 10 dækket af en beskyttelsesklap 40, som er bundet til enden af prøveoverføringslegemet, eller som er fastgjort til enden af prøveoverføringslegemet før eller under dets passage gennem prøvekassetten.

15 Figurerne Id og le viser skematisk prøvekassetten, som bliver benyttet i opfindelsen. Prøvekassetten 4 er af aflang konstruktion og dannet af et passende plastmateriale. Prøvekassetten har en række kamre 5, 6, 7, 8, 9 og 41 formet deri. Det første kammer i rækken, kammeret 5, er forsynet med en åbning 20 10, gennem hvilken prøveoverføringslegemet under brug bliver indført. De forskellige kamre er adskilt fra hinanden ved hjælp af indre skillevægge 11, som er vist i de skematiske diagrammer ved hjælp af en række punkterede linier. Kammeret 41 er forsynet med et observationsvindue 12, gennem hvilket 25 prøveoverføringslegemet kan betragtes efter, at det er blevet helt indsat i prøvekassetten.

Kammeret 5 omfatter en prøveudmålingszone, som almindeligvis indeholder et materiale, såsom bomuldsvat eller et polyuret-30 hanskum i nærheden af åbningsslidsen 10, og som er beregnet til at feje eventuelt overskydende prøve fra topoverfladen af den absorberende matrice 2, der er bundet til prøveoverfø-ringslegemet 1. Kamrene 6, 7 og 8 indeholder reagensfluida til vedkommende analytiske bestemmelse, som skal udføres.

Fig. 2 viser kombinationen af prøvekassetten 4 og prøveoverføringslegemet 1 efter, at prøveoverføringslegemet 1 er blevet 35

DK 165957B

12 helt indsat i prøvekassetten 4. Prøveopsamlingsområdet 2 på prøveoverføringslegemet 1 er synligt gennem observationsvinduet 12. Det vil kunne bemærkes, at prøveoverføringslegeraet 1 rager ud fra enden af prøvekassetten.

5

Fig. 3a og 3b viser skematisk to måder, hvorpå lækage af fluidum fra kassetten kan undgås efter afslutningen af analysen. Som vist i tværsnit i fig. 3a bliver prøveoverføringslegemet 1 fremadskridende tykkere henimod den ende, som er fjernest fra 10 prøveopsamlingsområdet. På denne måde tilvejebringer prøveoverføringslegemet 1 en forsegling ved den første skillevæg 11 i prøvekassetten 4. De resterende skillevægge i kassetten 4 er ikke vist. Som vist i fig. 3b er prøveoverføringslegemet 1 forsynet med en opstående flange 13, der er beregnet til at 15 blive anbragt i en samvirkende udtagning dannet i åbningsenden af prøvekassetten 4.

Figurerne 4 og 5 viser i forstørret målestok en skillevæg 11 i prøvekassetten 4 før og efter, at den er blevet gennembrudt af 20 prøveoverføringslegemet 1, som i dette diagram er blevet forsynet med en bøjelig beskyttelsesklap 40 over det absorberende materiale. Som vist i fig. 4 har skillevæggen 11 en svæknings-zone 14, hvor enden af væggen støder op mod den nedre overflade af prøvekassetten 4. Bevægelse af prøveoverføringslegemet 1 25 horisontalt får spidsen af prøveoverføringslegemet 15 til at møde svækningszonen 14 og yderligere bevægelse i den horisontale retning vil bevirke, at skillevæggen bliver gennembrudt. Fig. 5 viser prøveoverføringslegemet under indtrængning gennem den gennembrudte væg ind i det næste reagenskammer. Den tykke-30 re del 16 af skillevæggen 11 forbliver intakt under denne procedure og virker som et styr, der holder prøveoverføringslegemet 1 presset tæt mod den nedre overflade 17 af prøvekassetten 4. Det er klart, at prøveoverføringslegemet 1 kan udstrække sig hen over hele bredden af prøvekassetten, eller at den kan 35 udstrække sig over kun en del af denne bredde, i hvilket tilfælde kun en del af skillevæggen 11 behøver at have den krævede svækningszone. Som vist i fig. 5 er frigangen mellem den

DK 165957B

13 nedre overflade 17 af prøvekassetten 4 og spidsen 18 af den gennembrudte skillevæg 11 sådan, at prøveopsamlingsområdet 2 bestående af absorberende materiale af beskyttelsesklappen 40 bliver komprimeret under prøveoverføringslegemets 1 passage 5 gennem skillevæggen 11. Dette er tilsigtet med henblik på at lette analysen ved at uddrive størstedelen af et reagens fra prøveopsamlingsområdet 2, før prøveopsamlingsområdet 2 bliver udsat for reagenset i det næste successive kammer. Om ønsket kan yderligere fremspring (ikke vist) være inkluderet i hvert 10 reagenskammer for at komprimere og derefter frigøre prøveopsamlingsområdet 2 med henblik på at sikre tilstrækkelig væskestrømning derigennem.

Der er forskellige måder, hvorpå de gennembrydelige vægge og 15 separate reagenskamre i prøvekassetten kan være konstrueret. Den foretrukne fremsti 11ingsmåde inkluderer støbningen af de indre vægge og sidevæggene som en komplet enhed med den efterfølgende tilføjelse af top- og bundvægge ved ultralydsvejsning eller klæbning. Alternativt bliver en støbning omfattende si-20 den, det indre og bundvæggene fremstillet, hvor de åbne vinduer i de indre vægge bliver forseglet ved en efterfølgende anbringelse af en plastfilm i hvert kammer, og hvor topvæggen bliver tilføjet ved ultralydsvejsning eller klæbning efter fyldning af kamrene med de flydende reagenser. En tredje fore-25 trukken fremsti 11ingsmåde er at fremstille kamrene som sær skilte enheder tilnærmelsesvis som terninger og at dække en åben flade af enheden med plastfilm, før denne bliver fyldt med flydende reagens. Den særskilte kammerenhed bliver så forseglet ved, at man påfører en plastfilm på den tilbageværende 30 åbne overflade. Den komplette prøvekassette bliver så frem stillet ved, at man støder successive særskilte kammerenheder sammen i en langsgående række og holder dem på plads med en plastklemme eller ved forsegling i et omgivende plastrør.

35 Figurerne 6a og 6b viser skematisk et analyseapparat, som er beregnet til parallel behandling af en bestemt prøve og kali-bratorer eller kontroller. Et prøveoverføringslegeme er gene- 14

DK 165957 B

relt betegnet med 20. Oette prøveoverføringslegeme 20 er af en lignende konstruktion som den for prøveoverføringslegemet beskrevet med henvisning til fig. 1, og det omfatter et prøveopsamlingsområde 22. Kontrol- og kalibreringsområder 22 er 5 også tilvejebragt på prøveoverføringslegemet 20. Prøvekassetten 23, som er vist i fig. 6b, har et aflangt observationsvindue 24. Prøvekassetten 23 er indvendigt forsynet med de træk, som er beskrevet med henvisning til prøvekassetten 4, men disse er ikke vist. Efter afslutningen af analysen kan prøvearea-10 let 22 blive sammenlignet med kontrol- og kalibratorarealerne 22 gennem observationsvinduet 24.

Figurerne 7a og 7b viser skematisk et analyseapparat, som er beregnet til den parallelle behandling af en prøve og kalibra-15 torer eller kontrolprøver eller til den parallelle behandling af et antal prøver, enten fra den samme eller fra forskellige patienter eller dyr. Et prøveoverføringslegeme er generelt betegnet med 30. Dette prøveoverføringslegeme 30 har et antal grene 31, som er sammenbundet af en bro 32. Grenene 31 og bro-20 en 32 er dannet af en enkelt plade af et støbt plastmateriale. Ved enden af hver gren 31 fjernt fra broen 32 findes områder 33. Disse områder 33 er beregnet enten som prøveområder eller til kalibratorer og kontroller som ønsket, afhængigt af den bestemte analyse, der bliver gennemført. Prøvekassetten 34, 25 som er vist i fig. 7b, har langsgående skillevægge 35 og tværgående skillevægge 36. De tværgående skillevægge 36 kan gennembrydes eller åbnes af grenene 31 på overføringslegemet 30. Prøvekassetten 34 er også forsynet med et observationsvindue 37, så at de forskellige områder 33 efter afslutningen af ana-30 lysen kan sammenlignes derigennem. De enkelte reagenskamre er holdt adskilt fra reagenskamrene på begge sider deraf. Med denne specielle type apparat, indeholdende stive langsgående skillevægge er det muligt, at udføre multiple analyser. I en immunoanalyse kan udføres en samtidig analyse af relaterede 35 stoffer, såsom skjoldbruskkirtelstimulerende hormoner, skjold-bruskkirtelhormon og triiodothyronin, som ofte alle bliver målt, når skjoldbruskkirteltilstanden hos en patient bliver 15

DK 165957 B

bedønt. I biokemiske analyser kan en række af biokemiske blodanalyser bestående af f.eks. analysen af glucose, totalt protein, natrium, kalium, creatinin og cholesterol udføres samtidigt på en patients prøve i en enkelt prøvekassette af denne 5 art.

Apparatet beskrevet ovenfor med henvisning til figurerne 1 til 5 i den ledsagende tegning bliver beskrevet yderligere i eksemplerne nedenfor med henvisning til udførelsen af en immuno-10 analyse i dette.

Eksempel 1

Et nøgletrsk ved prøvekassetten ifølge opfindelsen er den ef-,15 fektive adskillelse af ikke-bundne mærkede reagenser i en im- munoanalyse eller ONA-probeanalyse. Et forsøg blev udført for at bevise, at et typisk enzymmærke, såsom alkalisk phosphatase hurtigt kunne fjernes fra det absorberende område af prøveoverføringslegemet. Til enden af et prøveoverføringslegeme op-20 bygget af methylmethacrylat med dimensionerne 15 cm x 2 cm x 2 mm blev klæbet et stykke fuldt opskummet polyurethanskum med høj densitet med dimensionerne 1 cm x 1 cm x 1 cm. Så blev der tilsat 50 μΐ af en opløsning af alkaliphosphat i en 100 mM Tris-puffer med pH 7,5 ved en koncentration på 10 pg/ml til 25 skummet, og prøveoverføringslegemet blev forsigtigt skubbet gennem en række kamre i en prøvekassette opbygget af methyl-methacrylat, hvor hvert kammer har dimensionerne 2 cm x 1 cm x 1 cm og er adskilt med en gennembrydelig væg omfattende en 5 pm tyk film af plastificeret polyvinylchlorid strakt hen over 30 en vinduesudskæring i skillevæggene. Kamrene blev fyldt med 2,5 ml af en 100 mM Tris-puffer med pH 7,5 indeholdende 0,1% (volumen/volumen) polyoxyethylensorbitanmonolaurat og 0,1% (vægt/volumen) natriumazid. Efter afslutning af proceduren blev en prøve på 100 μΐ taget fra hvert kammer og overført til 35 en spektrofotometercuvette indeholdende 0,9 ml af en opløsning indeholdende 2 mg/ml p-nitrophenolphosphat i 100 mM diethanol-aminpuffer med en pH på 9,5. Graden for tilsynekomst af p-ni- 18

DK 165957 B

Patentkrav.

1. Apparat til udførelse af analytisk bestemmelse og omfat-5 tende et antal separate, sarskilte kamre (S, 6, 7, 8, 9, 41), der successivt indeholder de reagenser, der kræves til at gennemføre den ønskede analytiske bestemmelse, hvor reagenskamrene (5, 6, 7, 8, 9, 41) er adskilt fra hinanden ved hjælp af et skillemiddel (11, 14, 36), der under brug bliver gennembrudt 10 eller åbnet, kendetegnet ved, - at apparatet omfatter et prøveoverføringslegeme (1, 20, 30), som har et derpå anbragt prøveopsamlingsområde (2, 22, 33), - og at reagenskamrene (5, 6, 7, 8, 9, 41) er udformet i en prøvekassettes (4, 23, 34) hus, som ved dets ene ende er luk- 15 ket og ved dets anden ende har en indføringsåbning (10) til indføring af prøveoverføringslegemet (1, 20, 30), hvorved den prøve, der skal analyseres, bliver overført til reagenskamrene (5, 6, 7, 8, 9, 41), - og hvor skillemidlerne (11, 14, 36) mellem reagenskamrene 20 (5, 6, 7, 8, 9, 41) under brug bliver gennembrudt eller åbnet af prøveoverføringslegemet (1, 20, 30), - og hvor der i prøvekassettens (4, 23, 34) hus, i umiddelbar nærhed af dettes lukkede ende, er udformet et signaldetekteringskammer (41), som er adskilt fra det sidste reagenskammer 25 (9) af et skillemiddel (11, 36), der under brug bliver gennem brudt eller åbnet af prøveoverføringslegemet (1, 20, 30).

2. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at prøvekassetten (4, 23, 34) indeholder en prøveudmålingszone, der 30 er tilvejebragt i huset i umiddelbar nærhed af indføringsåbningen (10).

3. Apparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at et eller hvert skillemiddel (11), der adskiller kamrene (5, 35 6, 7, 8, 9, 41), har form som en væg eller vægge (11) omfat tende en envejsventi1, en plastfilm eller en svækningszone (14).

DK 165957B

16 trophenol blev målt ved 405 nm og blev taget som en indikation for enzymaktivitet. Fig. 8 viser mængden af enzymaktivitet fundet i hvert successivt kammer af prøvekassetten efter, at prøveoverføringslegemet var blevet ført igennem. Resultaterne 5 viser, at efter passering gennem seks kamre var mængden af alkalisk phosphatase tilbage i skummet blevet reduceret til nul.

Eksempel 2 10 En immunenzymometrisk analyse for humant IgG blev udført i prøvekassetten beskrevet i eksempel 1. 1 denne kassette blev kamrene fyldt successivt med mærket antistofkonjugat efterfulgt af fem vaskekamre og et signalpipetteringskammer fyldt med enzymsubstrat, 2 mg/ml p-nitrophenolphosphat i en 100 mM 15 diethanolaminpuffer med pH 9,5. Det enzymmærkede konjugat om fattede et kaninanti-humant IgG polyklonalt antistof bundet til alkalisk phosphatase under anvendelse af en glutraldehyd-koblingsprocedure. Konjugatet blev opløst i en 100 mM Trispuffer med pH 7,5 indeholdende 0,5% (vægt/volumen) casein, 1 20 mM magnesiumchlorid og 0,04% (vægt/volumen) thimerosal ved en konjugatkoncentration på 4 pg/ml. Det samme anti-humant IgG benyttet i konjugatet blev også immobi1iseret på polyurethan-skum af den fuldt opskummede type med høj tæthed ved en passiv adsorptionsproces involverende mætning af skummet med en op-25 løsning af antistof ved 5 pg/ml i en 200 mM natriumcarbonat-puffer med pH 9,5 og inkubering i 16 timer ved 37eC.

Efter coatning med antistof blev skummet vasket tre gange med en opløsning indeholdende 100 mM Tris-puffer med pH 7,5 og 30 0,5% (vægt/volumen) casein og blev tørret i luft ved rumtempe- ratur (22*C). En 1 cm x 1 cm x 1 cm blok af antistofcoated skum blev klæbet til enden af prøveoverføringslegemet med dimensionerne 15 cm x 2 cm x 2 mm. For at udføre analysen blev en aliquot på 50 μΐ af en opløsning af 100 mM Tris-puffer med 35 pH 7,5 indeholdende forskellige koncentrationer af humant IgG pipetteret på skumblokken, og prøveoverføringslegemet blev umiddelbart skubbet forsigtigt gennem de successive kamre i

Claims

1. Farveudviklingen i signaldetekteringskammeret fik lov at fortsætte i 10 minutter før en måling blev foretaget ved 405 5 nm. Fig. 9 viser en dosis-reaktionskurve for en række af individuelle humant IgG-analyser med forøget koncentration af antigen. Dette eksperiment viser, at prøvekassetteformatet tilvejebringer en hurtig og kvantitativ analyse for IgG. Den hastighed, hvormed denne analyse kunne udføres, skyldes det me-10 get store overfladeareal i det opskummede skum med høj tæthed, som tilvejebringer hurtige reaktionsbevægelser. Det er også fordelagtigt at have en mekanisk drevet strøm af væskereagenser gennem skummet for at tilvejebringe en yderligere acceleration i reaktionen. 15 Variationer i prøvekassetteudformningen benyttet i nærværende opfindelse kan indføres afhængigt af analysesekvensen for reagenserne krævet til udførelsen af den specifikke analytiske bestemmelse. Det er kun nødvendigt at regulere antallet af 20 reagenskamre og de reagenser, der er indeholdt i hvert successive kammer som ønsket. Apparatet ifølge nærværende opfindelse til udførelse af analytiske bestemmelser kan anvendes i mange analyseområder, og det 25 er ikke tilsigtet, at dets anvendelse bliver begrænset kun til området med immunoanalyse eller ONA- eller RNA-analyse. F.eks. kan reagenskamrene være fyldt med væskereaktanter for totalt protein, carbohydrat eller fedtanalyser, når næringstilstanden for næringsmidler skal bedømmes, eller alternativt kan phos-30 phat, nitrat eller andre forureningsmålinger udføres på frisktvandsforsyninger under anvendelse af passende reagenser. Der er mange flere anvendelser, som man kan forestille sig for apparatet ifølge opfindelsen, hvor de væsentlige træk med automatisk prøveudmåling, samtidig behandling af prøve og ka-35 librator eller kontroller og sammenbyggede reagenskamre forsyner den ikke faglærte bruger med et pålideligt og let anvendeligt analysesystem. DK 165957B

4. Apparat ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at signaldetekteringskammeret (41) er forsynet med mindst en gennemsigtig væg eller med et vindue (12, 24, 37).

5. Apparat ifølge et eller flere af kravene 1-4, kende tegnet ved, at prøveopsamlingsområdet (2, 22, 33) omfatter et absorberende element (2, 22, 33), der er bundet til den ene ende af prøveoverføringslegemet (1, 20, 30).

6. Apparat ifølge et eller flere af kravene 1-5, kende tegnet ved, at det er tilpasset til parallel behandling af en prøve og en kalibrator og/eller kontroller.

7. Apparat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at prø- 15 veoverføringslegemet (20, 30) har derpå udformede områder (22, 33), som er imprægneret med kalibratorer og/eller kontroller under fremstillingen, og et område (22, 33), som er tilpasset til opsamling af den prøve, der skal analyseres.

8. Apparat ifølge ethvert af de foregående krav til udførelse af et antal analytiske bestemmelser og omfattende et antal separate, særskilte kamre, der successivt indeholder de reagenser, der kræves til at gennemføre de ønskede analytiske bestemmelser, hvor reagenskamrene er adskilt fra hinanden ved 25 hjælp af et skillemiddel (36), der under brug bliver gennembrudt eller åbnet, kendetegnet ved, at apparatet omfatter - et prøveoverføringslegeme (30), som har et antal grene (31), hvor hver gren (31) har et prøveopsamlingsområde (33) eller et 30 område (33) til overføring af en kontrol eller kalibrator anbragt på dette, - og mindst én langsgående skillevæg (35) udformet i huset til en prøvekassette (34) med henblik på at opdele huset i et antal separate analyserum, 35. hvor reagenskamrene er udformet i huset, som er lukket ved dets ene ende og har en enkelt indføringsåbning eller et antal indføringsåbninger ved dets anden ende til indføring af grene- DK 165957 B ne (31) på prøveoverføringslegemet (30), hvorved prøverne til analyse bliver overført til reagenskamrene, og skillemidlerne (36) mellem reagenskamrene under brug bliver gennembrudt eller åbnet af grenene (31) på prøveroverføringslegernet (30), 5. og et antal signaldetekteringskamre, der er udformet i huset til prøvekassetten (34) i umiddelbar nærhed af dettes lukkede ende, hvor signaldetekteringskammeret i et bestemt analyserum er adskilt fra det sidste reagenskammer for dette analyserum ved hjælp af et skillemiddel (36), som under brug bliver gen-10 nembrudt eller åbnet af en gren (31) på prøveoverføringslegemet (30).

9. Apparat ifølge krav 8, kendetegnet ved, at hvert analyserum har et antal deri udformede reagenskamre. 15

10. Apparat ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at reagenskamrene indeholder de reagenser, der kræves til at udføre en bestemt immunoanalyse. 20 il. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-9, kendetegnet ved, at reagenskamrene indeholder de reagenser, der kræves til at udføre en DNA eller RNA sondeanalyse. 25 30 35