KR101839380B1 - 핵산의 검출 방법 및 디바이스, 키트 - Google Patents

핵산의 검출 방법 및 디바이스, 키트 Download PDF

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Abstract

핵산 증폭법에 의해 증폭된 다중쇄 핵산을, 특수한 장치를 필요로 하지 않고, 간편 또한 고정밀도로 핵산을 검출하는 방법, 및 핵산 검출 디바이스를 제공한다. 발색성의 류코형 색소와 다중쇄 핵산의 접촉으로 발생하는 정색(呈色) 반응을 이용하여, 핵산을 가시광에서 검출하는 방법, 및 당해 방법에 사용하는 핵산 검출 디바이스를 제공한다.

Description

핵산의 검출 방법 및 디바이스, 키트{METHOD AND DEVICE FOR DETECTING NUCLEIC ACID, AND KIT}
본 발명은, 다중쇄 핵산의 검출 방법, 및, 다중쇄 핵산 검출 디바이스 또는 키트의 기술분야에 속한다.
분자 생물학의 연구 분야, 유전자 검사 등의 임상 응용 분야에 있어서, 타겟 핵산을 특이적으로 증폭하는 방법은 매우 중요한 기술이 되어 있다.
핵산 증폭법으로서는, PCR법(Polymerase Chain Reaction)이 가장 범용되고 있지만, 복잡한 온도 제어가 필요하기 때문에, LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)법, ICAN(lsothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)법 등의 등온 증폭법도 개발되어 있다.
PCR법이나 LAMP법, ICAN법 등에 의해 증폭된 핵산은 2본쇄이며, 검출법에는 형광 색소를 이용하는 방법이 활발히 연구되고 있다.
가장 일반적인 방법은, 증폭 반응 후의 용액을 아가로스 전기영동에 걸어, Ethidium Bromide나 SYBR Green 등의 형광성 인터컬레이터를 결합시켜, 특이적인 형광을 관찰하는 방법이다(비특허문헌 1). 그러나, 전기영동 후에 형광성 인터컬레이터로 검출하는 방법은, 30분∼1시간 정도의 영동 시간을 요하는 동시에, 형광을 검출하기 위한 UV 조사 장치나 형광 검출기 등의 고가의 기계가 필요하다.
다른 DNA의 혼재의 가능성이 없고, 증폭 산물의 유무만을 판별할 경우에는, PCR 개시 전의 반응액에 미리, 형광성 인터컬레이터를 첨가하고, 증폭 반응 후의 형광 검출을 행함으로써, 전기영동을 생략하는 것은 가능하다(특허문헌 1). 그러나, 형광성 인터컬레이터는 프라이머 등의 1본쇄 핵산에 결합하기 위해서 백그라운드 시그널이 증강되어, 검출 감도의 저하를 초래하는 문제가 있다. 이것에 대하여, 1본쇄 핵산과 결합한 형광성 인터컬레이터에 우선적으로 반응하는 화합물로 처리함으로써, 백그라운드 시그널을 저감하는 방법(특허문헌 2), 및, 1본쇄 핵산과 비교하여 2본쇄 핵산과의 반응 특이성을 향상시킨 형광 색소(특허문헌 3)가 개발되어 있지만, 형광 검출을 행하는 점에서 변함은 없다.
혹은, 형광 표지된 프라이머를 사용하여 핵산 증폭 반응을 행함으로써, 형광 편광으로 검출하는 방법(특허문헌 4)도 개발되어 있지만, 형광 프라이머는 일반적으로 고가이며, 또한, 증폭 산물에 취입되지 않은 형광 표지 프라이머의 분리 조작이 필요해지기 때문에 번잡하다는 등의 문제가 있다.
일본 특개평5-237000호 공보 국제공개 제2002/103053호 일본 특개2003-240780호 공보 일본 특개평9-187275호 공보
Molecular Cloning Second Edition, vol.1, 6.15(1989)
본 발명은, 핵산 증폭 반응에 의해 증폭된 다중쇄 핵산을, 복잡한 조작이나 특수한 장치를 필요로 하지 않고, 간편 또한 신속하게 가시광에서 검출하는 다중쇄 핵산의 검출 방법, 및 다중쇄 핵산 검출 디바이스 또는 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 행한 결과, 다중쇄 핵산을 발색성의 류코(leuco)형 색소와 접촉시키는 것에 의해, 류코형 색소의 탈리기가 해리하여 정색(呈色)하고, 핵산을 가시광에서 검출할 수 있는 것을 알아냈다. 또한, 이 원리를 이용한 다중쇄 핵산 검출 디바이스 또는 키트의 제작이 가능한 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 발색성의 류코형 색소를 다중쇄 핵산과 접촉시키는 공정을 포함하며, 류코형 색소와 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 나타내는 색조를 가시광에서 검출하는 것을 특징으로 하는 다중쇄 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.
류코형 색소는, 일반식(Ⅰ) :
Figure 112013024805254-pct00001
(식 중, R1, R2 및 R3은, 각각 독립적으로 치환 또는 무치환의 아릴기를 나타낸다. L은, -SO3R4, -NO3, -NO2, -CN, -X, -NHR5, -N(COR6)(COR7), -SR8, -SSR9, -OR10, -NHSNH2, -OH, 또는, -H를 나타낸다. 여기에서, R4는 알칼리 금속 또는 수소 원자를 나타낸다. X는 할로겐 원자를 나타낸다. R5, R6, R7, R8, R9 및 R10은, 각각 독립적으로, 알킬기, 아릴기, 아실기, 알케닐기, 또는 알키닐기를 나타낸다)으로 표시되는 화합물로서, 류코형 색소와 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 류코형 색소의 탈리기가 해리하고, 탈리기의 해리에 의해 가시광에서 검출 가능한 색조를 나타내는 것이 바람직하다.
상기 일반식(Ⅰ)으로 표시되는 화합물은,
일반식(Ⅱ) :
Figure 112013024805254-pct00002
(식 중, L은 상기와 같다. R11 및 R12는, 각각 독립적으로, 치환 또는 무치환의 아릴기를 나타낸다. R13, R14, R15, R16 및 R17은, 각각 독립적으로, 할로겐 원자, 카르복시기, 설포기, 니트로기, 시아노기, 아미드기, 아미노기, 알킬기, 아릴기, 알케닐기, 알키닐기, 히드록시기, 알콕시기, 아릴옥시기, 알킬티오기, 아릴티오기, 알킬아미노기, 아릴아미노기, 아실기, 알콕시카르보닐기, 아릴옥시카르보닐기, 알킬설포닐기, 또는 아릴설포닐기를 나타낸다)으로 표시되는 화합물인 것이 바람직하다.
류코형 색소는, 트리아릴메탄계 색소와 구핵제(求核劑)와의 반응물인 것이 바람직하다.
트리아릴메탄계 색소가, 겐티아나 바이올렛, 크리스탈 바이올렛, 메틸 그린, 말라카이트 그린, 빅토리아 블루, 파라로자닐린 및 그들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 색소인 것이 바람직하다.
구핵제가, 아황산 이온, 아황산수소 이온, 질산 이온, 아질산 이온, 시아니드 이온, 할로겐화물 이온, 질소 구핵제, 황 구핵제, 알칼리 금속 알콕시드, 알칼리 금속 수산화물, 및 히드리드 구핵제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 구핵제인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은, (d) 류코형 색소를 유지하는 담체(擔體), (e) 검체가 담체(d)를 통과하는 경로, 및 (f) 검체와 류코형 색소의 상호 작용에 의해 나타내는 색조를 가시광에서 검출하고, 다중쇄 핵산의 존재를 판정하는 부위를 갖는, 다중쇄 핵산 검출 디바이스 또는 키트에 관한 것이다.
류코형 색소는, 일반식(Ⅰ) :
Figure 112013024805254-pct00003
(식 중, R1, R2 및 R3은, 각각 독립적으로, 치환 또는 무치환의 아릴기를 나타낸다. L은, -SO3R4, -NO3, -NO2, -CN, -X, -NHR5, -N(COR6)(COR7), -SR8, -SSR9, -OR10, -NHSNH2, -OH, 또는, -H를 나타낸다. 여기에서, R4는 알칼리 금속 또는 수소 원자를 나타낸다. X는 할로겐 원자를 나타낸다. R5, R6, R7, R8, R9 및 R10은, 각각 독립적으로, 알킬기, 아릴기, 아실기, 알케닐기, 또는 알키닐기를 나타낸다)으로 표시되는 화합물로서, 류코형 색소와 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 류코형 색소의 탈리기가 해리하고, 탈리기의 해리에 의해 가시광에서 검출 가능한 색조를 나타내는 것이 바람직하다.
담체(d)는, 트리아릴메탄계 색소와 구핵제의 혼합액을 유지하는 것이 바람직하다.
트리아릴메탄 색소가, 겐티아나 바이올렛, 크리스탈 바이올렛, 메틸 그린, 말라카이트 그린, 빅토리아 블루, 파라로자닐린 및 그들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 색소인 것이 바람직하다.
구핵제가, 아황산 이온, 아황산수소 이온, 질산 이온, 아질산 이온, 시아니드 이온, 할로겐화물 이온, 질소 구핵제, 황 구핵제, 알칼리 금속 알콕시드, 알칼리 금속 수산화물, 및 히드리드 구핵제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 구핵제인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 따르면, 특별한 검출 기기를 사용하지 않고, 다중쇄 핵산과 류코형 색소의 접촉에 의해 생기는 정색 반응에 의해, 핵산 합성 또는 증폭의 유무를 목시(目視) 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산 검출 디바이스는, 다중쇄 핵산을 포함하는 검체를 디바이스 상에 첨가하는 것만으로, 정색 반응에 의해 신속하게 피험 물질을 목시 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 핵산 검출용 크로마토형 디바이스의 일례를 나타내는 개략도.
도 2는 본 발명의 핵산 검출용 필터형 디바이스의 일례를 나타내는 개략도.
도 3은 본 발명의 핵산 검출용 흡인형 디바이스의 일례를 나타내는 개략도.
도 4는 본 발명의 핵산 검출용 유로형 디바이스의 일례를 나타내는 개략도.
도 5는 본 발명의 핵산 검출용 튜브형 디바이스의 일례를 나타내는 개략도.
이하, 본 발명을 상세하게 기재한다.
1. 핵산의 검출 방법
본 발명은, 발색성의 류코형 색소를 다중쇄 핵산과 접촉시키는 공정을 포함하며, 류코형 색소와 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 나타내는 색조를 가시광에서 검출하는 것을 특징으로 하는 다중쇄 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.
검출 대상인 다중쇄 핵산에는 2본쇄 핵산, 3본쇄 핵산, 또는, 4본쇄 핵산 등이 포함된다. 핵산으로서는 DNA 또는 RNA 외, 이들 화학 수식체가 많이 알려져 있고, 또한 PNA라고 불리는 폴리펩티드쇄를 주쇄에 갖는 핵산 유연체(類緣體) 등도 알려져 있지만, 다중쇄 핵산에는 이들이 모두 포함된다. 보다 바람직하게 사용되는 핵산은, 2본쇄 DNA, 2본쇄 RNA, DNA와 RNA의 하이브리드쇄, 및 PNA 등의 인공 핵산의 2본쇄 등이다. 단, 1본쇄 핵산이어도, 복수 혼재하는 등, 색소에 의한 염색이 가능할 경우, 상기의 검출 방법으로 확인하는 것이 가능해진다.
발색성의 류코형 색소란, 류코형 색소로서 현색제를 반응시켰을 때에 발색 상태가 되는 것을 의미한다. 류코형 색소란 무색 또는 담색의 색소이며, 현색제와의 반응이나, 광 등의 물리 자극에 의해 그 구조를 변화하여 색조의 변화를 나타내는 색소를 의미한다. 현색제로서는, 산화제나 알코올 등이 알려져 있지만, 상기의 검출 방법에서는, 다중쇄 핵산이 현색제로서 사용된다.
상기의 검출 방법에서는, 다중쇄 핵산에 발색성의 류코형 색소를 첨가하고, 다중쇄 핵산과 류코형 색소를 접촉시켜 상호 작용시키는 것에 의해 색조의 변화를 나타내는 것을 검출 원리로 하고 있다. 상호 작용이란, 다중쇄 핵산의 가역적인 결합에 의해, 류코형 색소에 어떠한 물리 화학적인 영향이 발생하는 것을 의미한다.
류코형 색소로서는, 일반식(Ⅰ) :
Figure 112013024805254-pct00004
으로 표시되는 화합물로서, 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 류코형 색소의 탈리기가 해리하고, 탈리기의 해리에 의해 가시광에서 검출 가능한 색조를 발생하는 화합물이 바람직하다.
상기 일반식(Ⅰ)에 있어서, R1, R2, R3은, 각각 독립하여 치환 또는 무치환의 아릴기를 나타낸다. 아릴기로서는, 페닐기, 나프틸기, 안트라세닐기 등을 들 수 있다. 이들 아릴기는, 또한, 아미노기, 히드록실기, 알콕시기, 카르보닐기, 카르복시기, 설폰산기, 알킬기 등의 관능기, 및/또는 할로겐 원자와 같은 다른 원자로 치환되어 있어도 된다.
L은 탈리기를 나타내고, 구체적으로는, -SO3R4, -NO3, -NO2, -CN, -X, -NHR5, -N(COR6)(COR7), -SR8, -SSR9, -OR10, -NHSNH2, -OH, 또는, -H를 나타낸다.
R4는 알칼리 금속 또는 수소 원자를 나타낸다. X는, F, Cl, Br, I 등의 할로겐 원자를 나타낸다. R5, R6, R7, R8, R9 및 R10은, 각각 독립적으로, 알킬기, 아릴기, 아실기, 알케닐기, 알키닐기를 나타내고, 이들 치환기는 또한, 다른 일반적인 관능기나 원자, 예를 들면 아미노기 등의 헤테로 관능기나 할로겐 원자 등에 의해 치환되어 있어도 된다.
류코형 색소는, 산화 환원 등의 반응에 의해 발색하는 색소이며, 발색 상태에 있는 색소와 구핵제와의 반응물이어도 된다. 예를 들면, 트리아릴메탄계의 발색 상태에 있는 색소에 구핵제를 반응시킴으로써, 류코형 색소로 변환할 수 있다. 이 경우, 단일의 트리아릴메탄계 색소를 사용해도, 사용하는 구핵제를 바꾸면, 다른 구조를 갖는 류코형 색소가 얻어진다.
색소로서는, 산화 환원 등의 반응에 의해 발색하고, 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 가시광에서 검출 가능한 색조를 나타내는 것이 있으면 특별히 제한은 없지만, 트리아릴메탄계 색소, 크산텐계 색소, 퀴놀린계 색소, 페노티아진계 색소, 페녹사진계 색소 및 이들 혼합물을 들 수 있다. 이 중에서도, 트리아릴메탄계 색소인 것이 바람직하다.
트리아릴메탄계 색소로서는, 일반식(Ⅱ) :
Figure 112013024805254-pct00005
으로 표시되는 화합물인 것이 보다 바람직하다. 식 중, L은 상기와 같다. R11 및 R12는, 각각 독립적으로, 치환 또는 무치환 아릴기를 나타낸다.
치환 아릴기란, 할로겐 원자, 히드록시기, 알콕시기, 할로겐 원자로 치환된 알콕시기, 아릴기로 치환된 알콕시기, 아릴옥시기, 알킬기, 할로겐 원자로 치환된 알킬기, 히드록시기로 치환된 알킬기, 카르복시기의 에스테르로 치환된 알킬기, 시아노기로 치환된 알킬기, 시클로알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 복소환기, 아미노기, 알킬아미노기, 아릴아미노기, 알킬설포닐기로 치환된 아미노기, 아실기로 치환된 아미노기, 메르캅토기, 알킬티오기, 할로겐 원자로 치환된 알킬티오기, 아릴티오기, 카르복시기 또는 그 에스테르 혹은 그 아미드, 카르보닐기(옥소기), 포르밀기, 알킬카르보닐기, 아릴카르보닐기, 티오카르보닐기(티옥소기), 시아노기, 니트로기, 설폰산기, 알킬설포닐기, 할로겐 원자로 치환된 알킬설포닐기, 및 아릴설포닐기에서 선택되는 1 또는 복수기를 치환기로서 갖는 아릴기를 나타낸다.
R13, R14, R15, R16 및 R17은, 각각 독립적으로, 예를 들면, 할로겐 원자, 카르복시기, 설포기, 니트로기, 시아노기, 아미드기, 아미노기, 알킬기, 아릴기, 알케닐기, 알키닐기, 히드록시기, 알콕시기, 아릴옥시기, 알킬티오기, 아릴티오기, 알킬아미노기, 아릴아미노기, 아실기, 알콕시카르보닐기, 아릴옥시카르보닐기, 알킬설포닐기, 아릴설포닐기 등을 나타낸다.
당해 색소는, 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 반응식(Ⅲ) :
Figure 112013024805254-pct00006
으로 표시되는 기구로 정색한다고 생각되지만, 정색 기구는 특별히 한정되는 것은 아니다.
트리아릴메탄계 색소의 구체예로서는, 메틸 그린, 말라카이트 그린, 크리스탈 바이올렛, 파라로자닐린, 겐티아나 바이올렛B, 겐티아나 바이올렛R, 나이트 블루, 빅토리아 블루B, 빅토리아 블루R 등의 류코형 유도체를 들 수 있다. 이 중에서도, 크리스탈 바이올렛, 겐티아나 바이올렛, 메틸 그린, 말라카이트 그린이 바람직하고, 크리스탈 바이올렛, 겐티아나 바이올렛이 보다 바람직하다.
트리아릴메탄계 색소 외에, 퀴놀린계 색소인 4-(p-디메틸아미노스티릴)퀴놀린, 페노티아진계 색소인 페노티아진, 벤조일류코메틸렌 블루, 페녹사진계 색소인 페녹사진 등의 류코형 유도체를 들 수 있다. 단, 다중쇄 핵산과 접촉하여 발색하면 이들 색소에 한정되지 않는다.
발색 상태에 있는 색소와 반응하여, 류코형 색소로 변환시키는 구핵제로서는, 예를 들면, 아황산나트륨 등의 아황산 이온 함유물, 아황산수소나트륨 등의 아황산수소 이온 함유물, 질산나트륨 등의 질산 이온 함유물, 아질산나트륨 등의 아질산 이온 함유물, 나트륨시아니드 등의 시아니드 이온 함유물, 할로겐화물 이온, 질소 구핵제, 황 구핵제, 알칼리 금속 알콕시드, 알칼리 금속 수산화물, 히드리드 구핵제 등의 구핵제가 사용 가능하지만, 류코형으로 변환 가능하며, 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 발색형으로 재변환 가능하면 특별히 한정되지 않는다.
할로겐화물 이온으로서는, 예를 들면, 불화물 이온, 염화물 이온, 브롬화물 이온, 요오드화물 이온 등을 들 수 있다.
질소 구핵제로서는, 예를 들면, 암모니아, 메틸아민, n-프로필아민, 디메틸아민, 벤질아민, N-메틸벤질아민, 아닐린, n-헵틸아민, 1-아미노데칸, 1,3-디아미노프로판 등의 아민계 구핵제; 아세틸아미드 등의 아미드계 구핵제; 디아세틸이미드, 디포르밀이미드, 프탈이미드, 프탈이미드의 금속염 등의 이미드계 구핵제; 벤젠설포닐아미드, p-니트로벤젠설포닐아미드, o-니트로벤젠설포닐아미드, m-니트로벤젠설포닐아미드, p-톨루엔설포닐아미드 등의 설포닐아미드계 구핵제 등을 들 수 있다.
황 구핵제로서는, 예를 들면, 티올, 디설피드, 또는 티오요소를 들 수 있다.
알칼리 금속 알콕시드로서는, 예를 들면, 나트륨메톡시드, 나트륨에톡시드, 칼륨 제3급 부톡시드 등을 들 수 있다.
알칼리 금속 수산화물로서는, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등을 들 수 있다.
히드리드 구핵제란, 구핵제로서 수소 공여할 수 있는 시약을 의미하고, 예를 들면, 트리아세톡시히드로붕산나트륨, 수소화붕소나트륨, 테트라히드로붕산리튬, 피리딘보란 착체, 테트라히드로퓨란보란 착체, 2-피콜린보란 착체, 황화디메틸-보란 착체, 시아노수소화붕소나트륨, 수소화트리에틸붕소리튬, 수소화리튬알루미늄, Red-Al[수소화비스(2-메톡시에톡시)알루미늄나트륨], L-Selectride[수소화트리(sec-부틸)붕소리튬], K-Selectride[수소화트리(sec-부틸)붕소칼륨], DIBAL-H(수소화디이소부틸알루미늄) 등을 들 수 있다.
구핵제로서는, 구체적으로는, 아황산나트륨, 아황산수소나트륨, n-프로필아민, 메르캅토에탄올, 수산화나트륨, 수산화칼륨이 바람직하고, 아황산나트륨, 메르캅토에탄올, 수산화나트륨이 보다 바람직하다.
색소와 구핵제의 조합으로서는, 크리스탈 바이올렛과 아황산나트륨, 겐티아나 바이올렛과 아황산나트륨, 크리스탈 바이올렛과 수산화나트륨, 메틸 그린과 2-메르캅토에탄올, 메틸 그린과 아황산나트륨, 말라카이트 그린과 아황산나트륨의 조합이 바람직하고, 이들 중에서도, 크리스탈 바이올렛과 아황산나트륨, 겐티아나 바이올렛과 아황산나트륨, 메틸 그린과 아황산나트륨의 조합이 보다 바람직하다.
발색성의 류코형 색소를 다중쇄 핵산과 접촉시키는 공정에서는, 발색성의 류코형 색소가 다중쇄 핵산과 접촉하여, 양자에 반응이 일어나면, 어떻게 접촉시켜도 된다.
류코형 색소와 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 나타내는 색조의 가시광하에서의 검출에서는, 자외선과 같은, 가시광이 아닌 광을 조사하지 않고, 일반적인 실험실에 있어서의 조명과 같은 가시광하에서 색조를 검출한다. 가시광이면, 자외선 조사할 경우와 같이 특별한 장치가 필요하지 않고, 간편하게 검출할 수 있다.
다중쇄 핵산 검출의 가장 간단한 방법은, 류코형 색소와 다중쇄 핵산의 접촉에 의한 색조의 변화를 목시로 관찰하는 것이다. 여기에서, 목시로의 관찰이란, 류코형 색소와 다중쇄 핵산이 결합했을 경우의 색조의 변화, 또는, 다중쇄 핵산과 결합하고 있지 않은 류코형 색소의 색조의 변화를 목시로 관찰하는 것을 말한다. 가시광하에서의 색조의 변화에 의거하여, 다중쇄 핵산의 존재의 유무를 확인할 수 있다.
색조의 변화란, 구체적으로는, 가시광하에서 색의 종류가 변화하는 것(가시광 파장), 또는, 색의 농담이 변화하는 것(반사율) 등을 들 수 있지만, 가시광에서 검출할 수 있는 것이면 이들에 한정되지 않는다. 색의 종류의 변화로서는, 예를 들면, 적자색으로부터 하늘색으로의 변화, 및 황색으로부터 적자색으로의 변화를 들 수 있다.
또한, 시료 용액의 가시광 영역의 흡광도를 측정하는 것에 의해서도, 핵산을 검출할 수 있다. 여기에서, 가시광이란 특히 380㎚∼800㎚ 파장의 광을 가리킨다. 측정 파장은 사용하는 색소에 의해 적의(適宜) 설정하면 된다. 또한, 흡광도 측정에 의해, 시료 중의 핵산 농도를 정량하는 것도 가능하다. 그 외, 색소와 핵산에 의한 불용성의 침전물이 생길 경우, 필터나 멤브레인을 사용하여 검출해도 되며, 원심 분리에 의해 침전을 검출하는 것도 가능하다. 또한, 핵산의 유무의 판정을 용이하게 하도록 다른 색조의 색소를 혼합해도 된다.
상기의 검출 방법에서는, 검체에 포함되는 다중쇄 핵산을 검출할 수 있지만, 검체는 다중쇄 핵산을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 핵산 증폭법의 반응액뿐만 아니라, 미생물이나 동물 세포, 혹은 식물 세포로부터의 추출액이어도 상관없고, 식품으로부터의 추출액도 호적하게 사용할 수 있다.
핵산 증폭법으로서는 PCR법으로 대표되는 핵산 서열을 증폭시키는 것이면 어떤 것이어도 상관없다. 예를 들면, PCR법 이외에, LCR(Ligase Chain Reaction)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법, RCA(Rolling Circle Amplification)법, CPT(Cycling Probe Technology)법, Q-Beta Replicase Amplification Technology법, ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids)법, LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of DNA)법, NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method)법, 및 TMA(Transcription mediated amplification method)법 등의 공지의 방법을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. Q-Beta Replicase Amplification Technology법, RCA법, NASBA법, SDA법, TMA법, LAMP법, ICAN법 등은 일정 온도로 증폭 반응을 행하는 방법이며, 그 외의 PCR법이나 LCR법 등은 온도 사이클링으로 증폭 반응을 행하는 것이다. 또한, RNA를 역전사 효소 등에 의해 DNA로 역전사하고, 이 DNA를 주형으로 하여 상기의 핵산 증폭법을 사용하면 간접적으로 RNA를 검출하는 것이 가능하다.
핵산 증폭법의 증폭 산물인 다중쇄 핵산을 검출할 때는, 핵산 증폭 반응 후의 반응액에 류코형 색소를 첨가하는 것이 바람직하지만, 핵산 증폭 반응 전에, 미리 류코형 색소를 반응액에 첨가해도 된다.
또한, 류코형 색소는, 다중쇄 핵산을 포함하는 검체에 단독으로 첨가해도 되며, 안정화제와의 혼합물의 형태로 첨가하는 것도 가능하다.
안정화제란, 류코형 색소가 발색하는 것을 막는 화합물을 의미하고, 예를 들면, 환원제나 아민, 티올 화합물 등이지만, 발색을 방지할 수 있으면 이들에 한정되지 않는다. 안정화제는 단독으로 첨가해도 되며, 복수를 조합시켜서 첨가해도 된다.
또한, 류코형 색소는, 다중쇄 핵산을 포함하는 검체에 직접 첨가해도 되며, 발색 상태에 있는 색소를 구핵제 등으로 처리하여 류코형 색소로 변환 후에 첨가해도 된다. 혹은, 발색 상태에 있는 색소와 구핵제의 혼합물을 첨가해도 된다. 예를 들면, 크리스탈 바이올렛과 아황산나트륨을 혼합하여 류코형으로 변환 후, 이 혼합액을 사용하여 다중쇄 핵산을 목시 검출 가능하다. 발색 상태에 있는 색소와 구핵제의 혼합액은, 류코형 색소가 불안정하며 단리 곤란일 경우, 특히 유효한 사용법이 된다.
핵산을 포함하는 검체에의 류코형 색소의 첨가량은, 착색을 확인할 수 있으면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 마지막 농도는, 보통 10% 이하이며, 바람직하게는 1% 이하이며, 더 바람직하게는 0.1% 이하이다.
핵산 검출 후의 착색한 검체액은, 다른 분자 생물학적인 조작에 그대로 사용하는 것도 가능하다. 그러한 분자 생물학적인 조작에는, 제한 효소 처리, 시퀀스 반응, PCR과 같은 효소 반응이나, 전기영동에 의한 확인 조작 등이 포함된다.
2. 핵산 검출 디바이스 및 키트
본 발명은, 또한, (d) 류코형 색소를 유지하는 담체, (e) 검체가 담체(d)를 통과하는 경로, 및 (f) 검체와 류코형 색소의 상호 작용에 의해 나타내는 색조의 변화를 가시광에서 검출하고, 다중쇄 핵산의 존재를 판정하는 부위를 갖는 다중쇄 핵산 검출 디바이스 또는 키트에 관한 것이다.
류코형 색소를 유지한 담체(d)의 소재로서는, 색소를 유지할 수 있고, 핵산을 포함하는 검체를 통과할 수 있는 것이면 특별히 한정은 없다. 바람직한 구체예로서는, 부직포, 여과지, 유리 파이버 여과지, 유리 섬유포, 유리 필터, 니트로셀룰로오스 필터, 폴리에틸렌이나 폴리프로필렌 등으로 이루어지는 다공질재 등을 들 수 있다. 담체(d)에의 류코형 색소의 고정은, 물리적 흡착 또는 화학적 결합 등, 공지의 방법으로 행할 수 있다. 물리적 흡착으로서는, 예를 들면, 일정량의 색소 용액에 담체를 함침한 후에 건조하는 건조 흡착 등을 들 수 있다.
담체(d)에 유지되는 류코형 색소의 양은, 색조의 변화를 가시광에서 검출하는 것이 가능하면 특별히 제한되지 않지만, 핵산을 포함하는 검체와의 혼합 후의 색소의 마지막 농도가, 바람직하게는 10% 이하이며, 보다 바람직하게는 1% 이하이며, 더 바람직하게는 0.1% 이하이다.
류코형 색소를 유지하는 담체(d)를 검체가 통과할 때에, 검체 중에 다중쇄 핵산이 포함될 경우, 다중쇄 핵산과 류코형 색소의 상호 작용에 의해, 류코형 색소로부터 탈리기가 해리하여 색조의 변화가 생긴다. 여기에서, 상호 작용이란, 예를 들면, 펩티드 결합이나 디설피드 결합과 같은 공유 결합, 이온 결합, 배위 결합, 반데르발스 결합, π-π 상호 작용과 같은 비공유 결합을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
담체(d)에 있어서의 다중쇄 핵산과 류코형 색소의 상호 작용은, 다중쇄 핵산과 담체와의 친화성이나, 담체의 흡습성에 의해서도 영향을 받는다. 따라서, 이들 담체는, 다중쇄 핵산의 비특이적 흡착이나, 흡습성을 조정하기 위해서, 표면을 친수성 중합체나 계면 활성제로 피복하거나, 함침시키거나 해도 된다.
검체가 담체(d)를 통과하는 경로(e)란, 본 발명의 디바이스 또는 키트에 어플라이된 검체가 이동하는 경로를 말한다. 경로란, 검체의 이동이 유도되는 것과 같은 것이면 특별히 한정되지 않고, 홈이 형성되어 있어도 되지만, 반드시 필요한 것은 아니다. 경로(e)는, 담체(d) 및 판정 부위(f)와 연결하고 있고, 검체는, 경로(e)에 따라, 담체(d) 및 판정 부위(f)로 이동할 수 있다. 경로(e)의 소재로서는, 다중쇄 핵산을 포함하는 검체를 통과할 수 있는 것이면 특별히 한정은 없다.
검체와 색소의 상호 작용에 의한 색조의 변화를 가시광하에서 검출하고, 다중쇄 핵산의 존재를 판정하는 판정 부위(f)란, 담체(d)를 통과한 검체가 경로(e)를 이동하여 도달하는 부위를 말한다.
판정 부위(f)에 있어서의 색조의 변화를 가시광에서 검출하는 것에 의해, 다중쇄 핵산의 유무를 UV 조사 장치나 형광 검출기 등의 특별한 기기를 사용하지 않고 판정할 수 있다.
판정 부위(f)의 소재로서는, 다중쇄 핵산을 포함하는 검체가 통과 또는 흡수될 수 있는 것이면 특별히 한정은 없다. 바람직한 구체예로서는, 부직포, 여과지, 유리 파이버 여과지, 유리 섬유포, 유리 필터, 니트로셀룰로오스 필터, 폴리에틸렌이나 폴리프로필렌 등으로 이루어지는 다공질재 등을 들 수 있다. 이들 소재는, 적당한 흡습 속도를 가짐과 함께, 다중쇄 핵산이 착색하여 발색했을 때의 목시 확인성이 뛰어나는 등의 이점을 갖는다.
또한, 다중쇄 핵산의 양에 따른 정색의 정도를 나타내는 대비표를 작성하면, 검체 중의 다중쇄 핵산 농도를 추정하는 것도 가능하다. 또한, 농도를 규정한 표준 핵산을 사용하여 검량선을 작성해 두면, 분광 광도계나 색차계, 반사계 등의 범용적인 분석 기기를 사용하여, 시료 중의 다중쇄 핵산량을 정량하는 것도 가능하다.
다중쇄 핵산 검출 디바이스 또는 키트에의, 검체의 어플라이 방법에는 특별히 제한은 없지만, 검체는, 예를 들면 적하나 침지, 또는 흡인이나 원심으로 어플라이된다. 또한, 검체의 첨가 후, 별도 용매로 전개하는 것도 가능하다. 용매로 전개할 경우, 사용하는 용매는 색소의 색조에 영향을 주는 것이 아니면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 물이나 완충액 등을 들 수 있다. 본 발명의 다중쇄 핵산 검출 디바이스 또는 키트에는 시료 첨가 부위를 별도로 마련해도 된다. 또한, 검체를, 류코형 색소를 유지한 담체(d)에 직접 어플라이하는 것도 가능하다.
또, 상기의 담체(d)에는 류코형 색소를 단독으로 유지시켜도 되며, 류코형 색소와 안정화제를 유지시킬 수도 있다. 안정화제로서는 아민, 티올, 환원제 등을 사용할 수 있지만, 류코형 색소의 자연 발색을 억제할 수 있으면 이것에 한정되지 않는다. 또한, 류코형 색소를 직접 담체에 유지시키는 것은 아니라, 발색 상태에 있는 색소와 반응하여 류코형으로 변화시키는 화합물을 혼합해 담체에 공존시키는 것도 가능하다. 발색 상태에 있는 색소와 반응하여 류코형으로 변화시키는 화합물로서는, 아황산 이온, 아황산수소 이온, 질산 이온, 아질산 이온, 시아니드 이온, 할로겐화물 이온, 질소 구핵제, 황 구핵제, 알칼리 금속 알콕시드, 알칼리 금속 수산화물, 히드리드 구핵제 등의 구핵제를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 담체(d)의 하류 및/또는 상류 측에 안정화제나 다른 종의 색소를 유지한 담체를 배치할 수도 있다. 이 경우, 담체(d)와 (e)는, 서로 접촉하여 있어도 되며, 비접촉이어도 된다. 또한, 양담체의 중간 및/또는 그 전후에 다른 담체를 배치할 수도 있다. 또한 필요하면 검체를 어플라이하는 영역이나 정색을 판정하는 영역 등을 별도로 구비하는 것도 가능하다.
담체를 배치하기 위한 기재가 되는 부재는, 담체를 유지할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 플라스틱, 종이, 유리 등의 재질을 사용할 수 있다. 또한, 표면에 점착성을 갖고 있어도 된다.
상기의 다중쇄 핵산 검출 디바이스 또는 키트에 따르면, 다중쇄 핵산과 류코형 색소의 반응에 의한 발색에 의해, 다중쇄 핵산을 신속 또한 간편하게 검출하는 것이 가능하다.
본 태양에 있어서의 다중쇄 핵산 검출 디바이스 또는 키트의 형태의 구체예를, 도 1∼4에 나타낸다.
도 1에는, 크로마토형 다중쇄 핵산 검출 디바이스를 나타낸다. 이 검출 디바이스는, 류코형 색소를 유지한 담체(1), 시료 첨가 부위(2), 판정 부위(3)를 기재가 되는 부재(4) 상에, 점착제 등을 사용하여 붙인 것이다.
도 2에는, 필터형 다중쇄 핵산 검출 디바이스를 나타낸다. 도 2의 디바이스에서는, 검체는 지지체(5)의 내부에 어플라이되어, 담체(1)에 유지된 류코형 색소에 접촉하면서, 검체 수용 용기(6)에 수용된다. 상기 구성에 따르면, 검체 수용 용기(6)에 수용된 검체 용액의 색조에 의해, 검체에 포함되는 다중쇄 핵산의 유무 또는 양을 판정할 수 있다. 검체의 필터형 담체 중의 통과를, 원심이나, 가압 등에 의해 행하면, 매우 신속 또한 간편하게 다중쇄 핵산의 유무 또는 양을 판정할 수 있다.
도 3에는, 흡인형 다중쇄 핵산 검출 디바이스를 나타낸다. 도 3에 나타낸 검출 디바이스는, 류코형 색소를 유지한 담체(1), 및, 흡인 용구로 이루어지는 지지체(7)에 의해 구성된다. 도 3에서는, 흡인 용구로 이루어지는 지지체로서 마이크로 피펫용의 팁을 예시하고 있고, 이 경우에는 상부구에 마이크로 피펫터를 장착하여 흡인구로부터 검체를 흡인한다. 본 형태는 마이크로 피펫용의 팁에 한정되는 것은 아니며, 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)이나, 고마고메 피펫(Komagome pipette) 등의 피펫류, 캐필러리, 주사기 등을 호적하게 사용할 수 있다. 이 구성에 따르면, 각각의 담체를 구비하는 흡인 용구를 사용하여 검체를 흡인하는 것에 의해, 다중쇄 핵산의 유무를, 색소의 색조에 의해, 매우 신속 또한 간편하게 목시 검출하는 것이 가능하다.
도 4에는, 유로형 다중쇄 핵산 검출 디바이스를 나타낸다. 도 4에 나타낸 유로형 디바이스는, 류코형 색소를 유지한 담체(1)가 유로를 커트한 칩(8)에 배치되는 것을 특징으로 한다. 이 칩에는, 핵산 정제나 핵산 증폭 등을 목적으로 한 구조가 구비되어 있어도 된다. 본 형태의 검출 디바이스에 있어서, 시료 첨가 부위(9)에 어플라이된 검체는, 유로(10)를 이동하여 담체(1)를 통과하고, 최후에 판정 부위(14)에 도달한다. 다중쇄 핵산의 유무 또는 양은, 판정 부위(14)에 있어서의 정색을 가시광하에서 관찰하고, 목시로 판정하는 것에 의해, 판단할 수 있다. 또, 유로(10)의 형상은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 직선이나 곡선이어도 된다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 칩(8) 상에 유로와 담체의 복수 조합을 유지하고, 유로의 길이에 의해, 검체가 판정 부위(14)에 도달할 때까지의 유로(10)의 통과 시간에 차이를 내는 고안을 하는 것도 가능하다. 칩(8)이 핵산 증폭을 목적으로 하는 구조를 갖는 경우, 검체의 통과 시간의 차에 의해 핵산의 증폭량에 차이를 내, 단계적인 핵산의 증폭, 및 그 산물의 검출을 행할 수 있다.
3. 핵산 검출 디바이스 및 키트
본 발명은, 또한, (g) 류코형 색소를 유지하고, 외력에 의해 개구하고, 류코형 색소를 방출하는 개구부를 구비한 담체, (h) 방출된 류코형 색소를 판정 부위로 유도하는 경로, 및 (ⅰ) 도입된 검체를 유지하고, 담체(g)로부터 경로(h)를 경유하여 도입된 류코형 색소와 유지된 검체의 반응에 의해 생기는 색조의 변화를 가시광에서 검출하고, 다중쇄 핵산의 존재를 판정하는 판정 부위를 갖는 다중쇄 핵산 검출 디바이스 또는 키트에 관한 것이다.
류코형 색소를 유지하고, 외력에 의해 개구하고, 류코형 색소를 방출하는 개구부를 구비한 담체(g)의 소재로서는, 류코형 색소를 일정 기간 안정되게 유지할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 담체(g)에는 류코형 색소가 충전되어 있고, 류코형 색소를 방출하는 개구부는 통상은 닫혀있으며, 외력에 의해 담체(g)가 개구했을 경우에만 류코형 색소가 방출된다. 여기에서, 외력이란, 담체의 개구를 가능하게 하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 손가락에 의한 압하(押下)나, 기계에 의한 압하를 들 수 있다. 외력에 의한 개구의 태양은, 류코형 색소를 방출할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 류코형 색소를 유지하는 막의 파괴를 들 수 있다. 본 태양의 디바이스 또는 키트는, 담체(g)의 개구를 용이하게 하기 위해서 침상(針狀) 구조를 구비하고 있어도 된다.
방출된 류코형 색소를 판정 부위로 유도하는 경로(h)란, 상기 담체(g)로부터 방출된 류코형 색소가 통과하는 경로를 말한다. 경로(h)의 형상·재질은, 류코형 색소를 통과할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 방출된 류코형 색소가, 중력에 의해 낙하하여 판정 부위(ⅰ)에 도달하는 경우에는, 경로(h)는 류코형 색소의 낙하를 저해하지 않는 것이면 된다.
도입된 검체를 유지하고, 담체(g)로부터 경로(h)를 경유하여 도입된 류코형 색소와 유지된 검체의 반응에 의해 생긴 물질을 가시광하에서 관찰하고, 다중쇄 핵산의 존재를 목시로 판정하는 판정 부위(ⅰ)는, 본 발명의 제1 태양에 따른 다중쇄 핵산의 검출 디바이스 또는 키트에서 설명한 바와 같다.
본 태양에 있어서의 다중쇄 핵산 검출 디바이스의 형태의 구체예를, 도 5에 나타낸다.
도 5에는, 튜브형 다중쇄 핵산 검출 디바이스를 나타낸다. 이 튜브형 디바이스에는, 외부에서의 물리적 작용에 의해 핵산 용액에 색소를 첨가시키는 구조를 갖는 것도 포함된다. 예를 들면, 도 5에 있어서 튜브(13)의 뚜껑 부분에, 막에 의해 류코형 색소(11)를 유지하고, 뚜껑에 투입된 침상 구조(12)를 통하여, 예를 들면 손가락으로 누르는 등의 외부에서의 물리적 작용에 의해 막을 찢음으로써 류코형 색소(11)를 튜브 하부에 적하하여, 튜브 하부의 검체에 포함되는 다중쇄 핵산을 염색할 수 있다.
본 발명에 있어서, 다중쇄 핵산 검출 키트란, 다중쇄 핵산을 특이적으로 발색하는 류코형 색소를 포함하는 용액으로 이루어지는 검출용 유닛에 더해, 각종 시약이나 기구 등을 구비한 형태를 가리킨다. 상술의 디바이스를 더 더한 것도 키트로 간주한다. 상기 각종 시약에는 목적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머, DNA 폴리머라제, 핵산 증폭 반응에 사용되는 완충액이나 제한 효소 등이 포함된다.
이들 디바이스를 사용하여 얻어진, 다중쇄 핵산을 포함하는 착색한 검체를, 다른 분자 생물학적인 조작에 그대로 사용하는 것도 가능하다. 그러한 분자 생물학적인 조작에는, 제한 효소 처리, 시퀀스 반응, PCR과 같은 효소 반응이나, 전기영동에 의한 확인 조작 등이 포함된다.
또한, 검체를 자동적으로 처리하고, 염기 서열 등을 해석하는 장치에 본 발명의 다중쇄 핵산 검출 디바이스를 도입하는 것도 가능하다. 예를 들면, 핵산 정제·증폭 장치에 본 발명의 핵산 검출 디바이스를 도입하는 것에 의해 핵산의 유무를 판정하거나, DNA 자동 해석 장치에 도입하는 것에 의해, 확실하게 PCR로 증폭·라벨된 샘플만을 선별하고, 해석을 행하거나 하는 것도 가능하다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 그 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
( 실시예1 ) 류코형 색소(1)를 사용한 PCR 산물의 검출
(ⅰ) 류코형 색소(1)의 합성
크리스탈 바이올렛 500㎎을 물에 용해 후, n-프로필아민 200㎎을 첨가하고, 30분 교반했다. 생긴 침전을 건조하여, 류코형 색소(1)(1,1-tris(4-N,N-dimethylaminophenyl)-N-aminopropane) 450㎎을 얻었다.
(ⅱ) PCR 산물의 조제
주형으로서 pUC19(다카라 바이오사제)를 사용하고, PCR 증폭에 의해 약 330염기쌍이 증폭하도록 이하의 프라이머F : 5'-GGAAACAGCTATGACCATGA-3' 및 프라이머R : 5'-CTATGCGGCATCAGAGCAG-3'을 설계했다. 프라이머F와 프라이머R을 각 15p㏖과, 10ng의 pUC19를 0.2㎖의 PCR용 튜브에 넣고, ExTaq PCR 키트(다카라 바이오사제)의 설명서에 따라, 100㎕의 PCR 반응액을 조제했다. 그 후, 튜브를 써멀 사이클러(GeneAmp PCR System(어플라이드 바이오시스템즈사제))에 세트하고, 95℃에서 5분간 열처리 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초의 사이클을 35회 행하여, 목적의 약 330bp의 증폭을 행하여, 포지티브 컨트롤로 했다. 또한, ExTaq DNA 폴리머라제를 첨가하지 않고 같은 반응을 행하여, 네거티브 컨트롤로 했다.
(ⅲ) PCR 산물의 검출
포지티브 컨트롤, 및 네거티브 컨트롤 50㎕에, 상기에서 합성한 류코형 색소(1) 2㎍을 첨가해 색조 변화의 관찰 및, 흡광도(A590㎚)의 측정을 행했다. 그 결과를 표 1에 나타냈다.
(비교예1)
류코형 색소 대신에 겐티아나 바이올렛을 사용한 이외는 실시예1과 같은 방법으로 PCR 산물의 검출을 행했다. 그 결과를 표 1에 나타냈다.
( 실시예2 ) 류코형 색소(1)를 사용한 LAMP 산물의 검출
(ⅰ) LAMP법 산물의 조제
「Loopamp(R) 살모넬라 검출 시약 키트」(에이켄가가쿠사제)를 사용하고, LAMP법에 의한 핵산 증폭 반응액을 조제했다. 10㎕의 Control DNA Sal과 40㎕의 마스터 Mix(Reaction Mix. Sal과 Bst DNA Polymerase를 용량비로 20:1의 비율로 별도 혼합한 것)를 혼합하여, 65℃에서 1시간 반응 후, 또한, 80℃에서 20분 반응함으로써, 핵산이 증폭된 반응액(포지티브 컨트롤)을 조제했다. 또한, 10㎕의 Control DNA Sal과 40㎕의 Reaction Mix. Sal을 혼합하여, 65℃에서 1시간 반응 후, 또한, 80℃에서 20분 반응함으로써, 핵산이 증폭되어 있지 않은 반응액(네거티브 컨트롤)을 조제했다.
(ⅱ) LAMP법 산물의 검출
검체로서 LAMP법 산물을 사용한 이외는, 실시예1과 같이 행했다. 그 결과를 표 1에 나타냈다.
[표 1]
Figure 112013024805254-pct00007
실시예1에 있어서, PCR에 의한 핵산 증폭이 있는 포지티브 컨트롤의 경우는, 류코형 색소의 첨가 후 바로 청자색으로 변화했다. 한편, PCR에 의한 핵산 증폭이 없는 네거티브 컨트롤의 경우, 류코형 색소의 첨가에 의한 착색이 인정되지 않아, 핵산 증폭의 유무를 목시로 용이하게 판별하는 것이 가능했다. 또한, 색소에 의한 검출에 요한 시간은 1분 이내였다.
비교예1에서는, 핵산 증폭의 유무에 관계없이 청자색을 나타내어, 핵산의 유무를 판정하는 것은 곤란했다.
실시예2에 있어서, LAMP법에 의한 핵산 증폭이 있는 포지티브 컨트롤의 경우는, 류코형 색소의 첨가 후 바로 청자색으로 변화했다. 한편, LAMP법에 의한 핵산 증폭이 없는 네거티브 컨트롤의 경우, 류코형 색소의 첨가에 의한 착색이 인정되지 않고, 핵산 증폭의 유무를 목시로 용이하게 판별하는 것이 가능했다. 또한, 색소에 의한 검출에 요한 시간은 1분 이내였다.
( 실시예3 ) 메틸 그린을 사용한 다중쇄 핵산의 검출
0.2% 메틸 그린 수용액 100㎕과 2-메르캅토에탄올 50㎕을 혼합하고, 실온에서 10분간 반응했다. 실시예1 및 2와 같은 방법으로, PCR 산물 및 LAMP법 산물을 조제했다. 각각의 핵산 증폭 산물의 포지티브 컨트롤, 및 네거티브 컨트롤 50㎕에, 상기의 혼합액 2㎕을 첨가하여, 색조 변화의 관찰을 행했다. 그 결과를 표 2에 나타냈다.
[표 2]
Figure 112013024805254-pct00008
PCR, LAMP법에 의한 핵산 증폭이 있는 포지티브 컨트롤의 경우는, 메틸 그린과 2-메르캅토에탄올로 이루어지는 혼합액을 첨가 후 바로 청록색으로 변화했다. 한편, 핵산 증폭이 없는 네거티브 컨트롤의 경우, 혼합액의 첨가에 의한 착색이 인정되지 않고, 핵산 증폭의 유무를 목시로 용이하게 판별하는 것이 가능했다. 또한, 색소에 의한 검출에 요한 시간은 1분 이내였다.
( 실시예4 ) 겐티아나 바이올렛B를 사용한 다중쇄 핵산의 검출
0.2% 겐티아나 바이올렛B의 50% 에탄올 용액과, 6% 아황산나트륨 수용액을 등용량씩 혼합했다. PCR 반응액과 LAMP법 반응액을 실시예1 및 2와 같은 방법으로 조제했다. 각각의 핵산 증폭 산물의 포지티브 컨트롤, 및 네거티브 컨트롤 50㎕에, 상기에서 조제한 혼합액 1㎕을 첨가 후의 색조 변화의 관찰을 행했다. 그 후, 590㎚에 있어서의 흡광도를 측정했다. 그 결과를 표 3에 나타냈다.
[표 3]
Figure 112013024805254-pct00009
PCR 및 LAMP법에 의한 핵산 증폭이 있는 포지티브 컨트롤의 경우는, 혼합액 첨가 후 바로 청자색으로 변화했다. 한편, 핵산 증폭이 없는 네거티브 컨트롤의 경우, 혼합액의 첨가에 의한 착색이 인정되지 않고, 핵산 증폭의 유무를 목시로 용이하게 판별하는 것이 가능했다. 또한, 색소에 의한 검출에 요한 시간은 1분 이내였다.
( 실시예5 ) 흡인형 디바이스의 제작
실시예1에서 합성한 류코형 색소(1)의 0.2% 용액을 조제하고, 이 용액 1㎕을 원형으로 펀칭한 다공질 폴리에틸렌 시트(기공경 50㎛, 두께 1.5㎜, 직경 1.5㎜)에 함침했다. 이것을 실온에서 건조시켜서, 색소를 유지한 담체로 했다. 상기 담체를, 도 3에 나타낸 바와 같이, 200㎕용의 피펫팁의 선단에 충전하여, 흡인형 디바이스를 제작했다.
( 실시예6 ) 흡인형 디바이스에 의한 다중쇄 핵산의 검출
PCR 산물과 LAMP법 산물을 각각 실시예1 및 2와 같은 방법으로 조제하고, 포지티브 컨트롤, 및 네거티브 컨트롤을 준비했다. 실시예5에서 제작한 흡인형 디바이스를 마이크로 피펫에 장착하고, 각각의 검체 100㎕을 흡인하여, 피펫팁 내의 검체 용액의 색조를 관찰했다. 그 결과를 표 4에 나타냈다.
( 실시예7 ) 흡인형 디바이스의 제작
0.2% 겐티아나 바이올렛과 6% 아황산나트륨을 등용량씩 혼합하고, 이 혼합액 1㎕을 원형으로 펀칭한 다공질 폴리에틸렌 시트(기공경 50㎛, 두께 1.5㎜, 직경 1.5㎜)에 함침했다. 이것을 실온에서 건조시켜서, 색소를 유지한 담체로 했다. 상기 담체를, 도 3에 나타낸 바와 같이, 200㎕용의 피펫팁의 선단에 충전하여, 흡인형 디바이스를 제작했다.
( 실시예8 ) 흡인형 디바이스에 의한 다중쇄 핵산의 검출
PCR 산물과 LAMP법 산물을 각각 실시예1 및 2와 같은 방법으로 조제하고, 포지티브 컨트롤, 및 네거티브 컨트롤을 준비했다. 실시예7에서 제작한 흡인형 디바이스를 마이크로 피펫에 장착하고, 각각의 검체 100㎕을 흡인하여, 피펫팁 내의 검체 용액의 색조를 관찰했다. 그 결과를 표 4에 나타냈다.
[표 4]
Figure 112013024805254-pct00010
실시예6에 있어서, PCR법 및 LAMP법에 의한 핵산 증폭이 있을 경우, 칩 내의 검체액은 청자색을 나타내고, 한편, 증폭 핵산이 존재하지 않을 경우는, 무색 투명이었다. 흡인형 디바이스를 사용한 증폭 핵산의 검출에 요한 시간은 불과 수 초이며, 신속 또한 간편하게 목시에 의한 판정이 가능했다.
실시예8에 있어서도, PCR법 및 LAMP법에 의한 핵산 증폭이 있을 경우, 칩 내의 검체액은 청자색을 나타내고, 한편, 증폭 핵산이 존재하지 않을 경우는, 무색 투명이었다. 흡인형 디바이스를 사용한 증폭 핵산의 검출에 요한 시간은 불과 수 초이며, 신속 또한 간편하게 목시에 의한 판정이 가능했다.
( 실시예9 ) 착색 후의 샘플을 사용한 처리의 검토
실시예1 및 3과 같은 방법으로, PCR 산물의 착색을 행하고, 착색 후의 샘플을 사용하여, 전기영동, PCR, 제한 효소 처리, 시퀀스 반응을 행했다. 그 결과, 본 발명에 의한 핵산의 착색은 후처리에 영향을 주는 일 없이, 모두 양호하게 실시하는 것이 가능했다.
1. 다중쇄 핵산과 접촉함으로써 발색하는 류코형 색소를 유지한 담체
2. 시료 첨가 부위(유리 파이버 여과지)
3. 판정 부위(여과지)
4. 기재
5. 담체를 유지하는 지지체
6. 검체 수용 용기
7. 피펫팁
8. 유로를 갖는 칩
9. 시료 첨가 부위
10. 유로
11. 색소
12. 침상 구조
13. 튜브
14. 판정 부위
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Claims (13)

  1. 발색성의 류코형 색소를 다중쇄 핵산과 접촉시키는 공정을 포함하고,
    류코형 색소와 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 나타내는 색조를 가시광에서 검출하며,
    상기 류코형 색소가, 일반식(Ⅰ) :
    Figure 112017075298126-pct00011

    (식 중, R1, R2 및 R3은, 아릴기를 나타낸다. L은, -SO3R4, -NO3, -NO2, -CN, -X, -NHR5, -N(COR6)(COR7), -SR8, -SSR9, -OR10, -NHSNH2, -OH, 또는, -H를 나타낸다. 여기에서, R4는 알칼리 금속 또는 수소 원자를 나타낸다. X는 할로겐 원자를 나타낸다. R5, R6, R7, R8, R9 및 R10은, 각각 독립적으로, 알킬기, 아릴기, 아실기, 알케닐기, 또는 알키닐기를 나타낸다)
    으로 표시되는 화합물로서,
    류코형 색소와 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 류코형 색소의 탈리기가 해리하고, 탈리기의 해리에 의해 가시광에서 검출 가능한 색조를 나타내는 것을 특징으로 하는 다중쇄 핵산의 검출 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 일반식(Ⅰ)으로 표시되는 화합물이,
    일반식(Ⅱ) :
    Figure 112017075298126-pct00012

    (식 중, L은 상기와 같다. R11 및 R12는, 아릴기를 나타낸다. R13, R14, R15, R16 및 R17은, 각각 독립적으로, 할로겐 원자, 카르복시기, 설포기, 니트로기, 시아노기, 아미드기, 아미노기, 알킬기, 아릴기, 알케닐기, 알키닐기, 히드록시기, 알콕시기, 아릴옥시기, 알킬티오기, 아릴티오기, 알킬아미노기, 아릴아미노기, 아실기, 알콕시카르보닐기, 아릴옥시카르보닐기, 알킬설포닐기, 또는 아릴설포닐기를 나타낸다)
    으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 다중쇄 핵산의 검출 방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    류코형 색소가, 트리아릴메탄계 색소와 구핵제와의 반응물인 것을 특징으로 하는 다중쇄 핵산의 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    트리아릴메탄계 색소가, 겐티아나 바이올렛, 크리스탈 바이올렛, 메틸 그린, 말라카이트 그린, 빅토리아 블루, 파라로자닐린 및 그들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 색소인 다중쇄 핵산의 검출 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    구핵제가, 아황산 이온, 아황산수소 이온, 질산 이온, 아질산 이온, 시아니드 이온, 할로겐화물 이온, 질소 구핵제, 황 구핵제, 알칼리 금속 알콕시드, 알칼리 금속 수산화물, 및 히드리드 구핵제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 구핵제인 다중쇄 핵산의 검출 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    구핵제가, 아황산 이온, 아황산수소 이온, 질산 이온, 아질산 이온, 시아니드 이온, 할로겐화물 이온, 질소 구핵제, 황 구핵제, 알칼리 금속 알콕시드, 알칼리 금속 수산화물, 및 히드리드 구핵제로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 구핵제인 다중쇄 핵산의 검출 방법.
  8. (d) 류코형 색소를 유지하는 담체(擔體),
    (e) 검체가 담체(d)를 통과하는 경로, 및
    (f) 검체와 류코형 색소의 상호 작용에 의해 나타내는 색조를 가시광에서 검출하고, 다중쇄 핵산의 존재를 판정하는 부위
    를 갖고,
    류코형 색소가, 일반식(Ⅰ) :
    Figure 112017075298126-pct00013

    (식 중, R1, R2 및 R3은, 아릴기를 나타낸다. L은, -SO3R4, -NO3, -NO2, -CN, -X, -NHR5, -N(COR6)(COR7), -SR8, -SSR9, -OR10, -NHSNH2, -OH, 또는, -H를 나타낸다. 여기에서, R4는 알칼리 금속 또는 수소 원자를 나타낸다. X는 할로겐 원자를 나타낸다. R5, R6, R7, R8, R9 및 R10은, 각각 독립적으로, 알킬기, 아릴기, 아실기, 알케닐기, 또는 알키닐기를 나타낸다)
    으로 표시되는 화합물로서,
    류코형 색소와 다중쇄 핵산과의 상호 작용에 의해 류코형 색소의 탈리기가 해리하고, 탈리기의 해리에 의해 가시광에서 검출 가능한 색조를 나타내는 것을 특징으로 하는 다중쇄 핵산 검출 디바이스.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서,
    담체(d)가, 트리아릴메탄계 색소와 구핵제의 혼합액을 유지하는 것을 특징으로 하는 디바이스.
  11. 제10항에 있어서,
    트리아릴메탄 색소가, 겐티아나 바이올렛, 크리스탈 바이올렛, 메틸 그린, 말라카이트 그린, 빅토리아 블루, 파라로자닐린 및 그들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 색소인 디바이스.
  12. 제10항에 있어서,
    구핵제가, 아황산 이온, 아황산수소 이온, 질산 이온, 아질산 이온, 시아니드 이온, 할로겐화물 이온, 질소 구핵제, 황 구핵제, 알칼리 금속 알콕시드, 알칼리 금속 수산화물, 및 히드리드 구핵제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 구핵제인 디바이스.
  13. 제11항에 있어서,
    구핵제가, 아황산 이온, 아황산수소 이온, 질산 이온, 아질산 이온, 시아니드 이온, 할로겐화물 이온, 질소 구핵제, 황 구핵제, 알칼리 금속 알콕시드, 알칼리 금속 수산화물, 및 히드리드 구핵제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 구핵제인 디바이스.
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