JP6911073B2 - 反応混合液および関連製品の調製方法 - Google Patents
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Description
PCR反応のピペッティングの際に、全ての必要な成分、すなわち試薬類、を、反応チューブに一つずつ、または、好ましくは、少なくともそれらのうちいくつかをマスターミックスとして最初に混合し、この混合液を複数サンプルへ分注することによって、加えることができる。通常、個別に加えられなければならない成分の一つは、研究対象のサンプルである。サンプル、チューブまたはマイクロタイタープレートにおけるサンプルウェルの数は、一設定につき何百、または何千にすらなる。
本発明の目的は、PCR測定の調製の間でのピペッティング補助のための新規溶液の提供であり、特に、ピペッティングの様々な段階におけるエラーの検出をより容易化するものである。
−測定を行うために必要な少なくとも一つの物質および第一の色を溶液に提供する第一の着色剤を含む第一の試薬溶液を提供する、
−第二の溶液は、該測定を行うために必要な他の少なくとも一つの物質および第一の色とは異なる、第二の色を溶液に提供する第二の着色剤を含む第二の試薬溶液を提供する、
−PCR工程に供される混合溶液であって、前記混合溶液は該第一および第二の着色剤に起因して、第一および第二の色とは異なる第三の色を呈する混合溶液、を提供するため第一および第二の試薬溶液を混合する。
分子生物学的実験における核酸は、通常、複雑な試料物資から精製される。抽出、沈殿、ハイブリダイゼーション、および、異なる様式のクロマトグラフィー、またはフィルター濾過等に基づく方法を含む、様々な精製方法がある。それらの技術のほとんどにおいて、核酸は、選択された溶液において溶解または溶出のいずれかがなされる。沈殿した核酸は、様々な溶液に溶解することができる。その他のDNA相互作用に基づく異なる方法を用いる場合には、溶出バッファーに対して、適したイオン強度など、さらなる必要条件がある。高イオン強度条件下での、シリカへのDNA結合に基づく精製方法が、広く使用される。結合したDNAは、低イオン強度のバッファーまたは純水を用いて、シリカマトリックスから溶出される。シリカ結合方法に基づく多くのキットが入手可能であり、また一般的にそのキットは溶出バッファーを含む。実験作業手順におけるピペッティング段階の回数を減らすため、着色剤は溶出バッファーに含むことができ、また、キットと共に提供されたバッファーは着色されたバッファーで置換できる。これを行うことにより、使用者は、別個の段階で色素を追加する必要がない。
新たな酵素技術は、PCRのためのサンプル調製を著しく容易にすることを可能としており、PCRへ直接、未精製のサンプルを用いることでさえ可能である。しかしながら、多くの実験において、いくつかの反応のためにサンプルは分離される必要があり、しばしば、再試行または他の目的のために、いくつかのサンプルを保存できることが好ましい。それゆえ、サンプルが特別なサンプルバッファーで溶解(lysed)、および溶解(dissolved)されるダイレクトPCRプロトコールの人気が高い。ダイリューションプロトコール(dilution protocol)と呼ばれるこれらにおいて、希釈バッファーはサンプルを溶解(lyse)する異なる試薬を含有してもよい。これらの試薬に加えて、後続のピペッティング段階をより簡便にするため、希釈バッファーに着色剤を添加できる。
リアルタイムPCRの大多数は、遺伝子発現解析研究のために行われる。これらの実験において、関心のある核酸はRNAであり、それゆえ通常のqPCRのためのテンプレートとして直接的に適しているものではない。qPCRの前に、RNAサンプルはqPCRステップの前に逆転写されなければならない。逆転写反応およびqPCR反応は、組み合わさることができ、同じ反応混合液の中で続いて行うことができる。しかしながら通常、その条件は、それら二つの反応のいずれかに対して、侵害的であり最適ではないものである。ほとんどの場合、独立した逆転写反応を行うこと、独立したqPCRにおいてテンプレートとして合成されたcDNAを使用すること、が最適である。逆転写反応の設定においても、qPCRで述べられたように、ピペッティングの間、サンプルを追跡するための同様の試みがある。本発明の実施形態は、この試みを克服するため、cDNA合成反応においてどのようにして着色剤が用いられるのかについて、記載する。
上述された内容と同様に、色素は、バイサルファイト処理に関与するあらゆる成分にも、結果として得られるサンプルと第二の反応溶液との混合に先立って添加することができる。
好ましくは、異なる色は、裸眼によって識別可能である。しかしながら、色調間を区別できるハードウェア制御の光学測定もまた、利用することができる。
着色剤としてのキシレンシアノールを、0.0026%(w/v)の濃度で、(Finnzymes,Finland)からのDyNAmo Flash SYBR(R) green qPCRおよびDyNAmo Flash Probe qPCRマスターミックスに添加した。その結果、清澄な青色透明溶液を生じた。キノリンイエローを、0.000174%(w/v)の濃度で、サンプルバッファーに添加した。このサンプルバッファーは、1mM トリス−HCl pH8.5および、0.1mM EDTAを含む。その結果、清澄な黄色透明溶液が得られた。
図4a−4dは、マスターミックスおよびサンプルについて、例1のピペッティング補助色素有り(図4aおよび4b)、および、無し(図4cおよび4d)で得られた、標準系列を示す。両系列ともに、製品説明中の手順に従って、DyNAmo Flash Probe マスターミックスを用いて、ヒト染色体DNA配列の増幅によって実施された。プライマー配列は、ACCTCCAAACTGGCTGTAACおよびATCTCCTCCTCATTGCAAAGであった。検出は、TGGCCCCTTGAAGACAGCAGの配列を有する加水分解プローブに基づいた。アンプリコンのサイズは121bpであった。
本発明は、以下のピペッティング手順を行うために利用された:
−(青色)着色された2xミックスを、いくつかの反応のためのプレミックスを得るために、プライマーおよびプローブ、添加剤および水、に完全に混合させた。
−プレミックスを、マイクロタイタープレートのいくつかのウェルへ、ピペッティングした(15uL/well)。
−(黄色)着色されたDNAサンプル溶液を、プレミックスの上にピペッティングした(5uL/well)。
−得られた溶液の色を、正しい(緑色)かどうか、手動で確認した。
上述の実施例において用いられている色素の希釈物、および、既存の着色されたマスターミックスの希釈物の様々な希釈度での吸光度は、異なる波長における視覚的に知覚可能な範囲の評価のための目視観察で測定され、かつ、比較された。その目的は、特に、異なる色素で視覚的に知覚可能な吸収範囲を決定すること、および、商業的に入手可能な色素が、qPCRにおいて使用されるおそらく最も一般的である、FAMおよびSYBR蛍光色素と共に使用するのに適しているかどうかを確認すること、であった。
+++ 強い色
++ 容易に確認できる色
+ 弱い色ではあるが、通常の研究環境において、肉眼による視認可能
− 通常の研究環境において、肉眼による視認不可
アスタリスク(*)で示す場合は、吸収ピークが完全に明確(well−defined)ではなかったか、または、明瞭ではなかった。
(1) ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)測定のための反応混合液の調製方法であって、
−該測定を行うために必要とされる、少なくとも一つの物質を含む第一の試薬溶液の提供、
−該測定を行うために必要とされる、少なくとも一つの他の物質を含む第二の試薬溶液の提供、
−PCR工程に供される混合溶液を提供するための、第一の試薬溶液と第二の試薬溶液の混合、
を含み、
−第一の試薬溶液は、第一の試薬溶液に第一の色を与える第一の着色剤を含み、
−第二の試薬溶液は、第二の試薬溶液に第一の色とは異なる第二の色を与える第二の着色剤を含み、
−該混合により、該第一および第二の着色剤に起因して、第一および第二の色とは異なる第三の色を呈する混合溶液が得られる、
ことを特徴とする反応混合液の調製方法。
(2) 該試薬溶液の一つが、該PCR測定において増幅される生物学的サンプルを含むサンプル溶液であることを特徴とする、(1)の方法。
(3) 少なくとも一つの試薬溶液が、ポリメラーゼ、プライマー、イオン、dNTPsまたは、蛍光qPCR色素もしくはプローブ、のうち一つもしくはそれ以上であることを特徴とする、(1)または(2)の方法。
(4) 少なくとも一つの試薬溶液が、PCRマスターミックス、特にqPCRマスターミックスまたはPCRもしくはqPCRプレミックスであることを特徴とする、前記いずれかの方法。
(5) 少なくとも一つの試薬溶液が、サンプル溶出バッファー溶液であることを特徴とする、前記いずれかの方法。
(6) 少なくとも一つの試薬溶液が、サンプル希釈バッファー溶液であることを特徴とする、前記いずれかの方法。
(7) 少なくとも一つの試薬溶液が、第一および第二の試薬溶液の混合の前の、サンプル溶解、cDNA合成反応、逆転写反応、サンプル消化、バイサルファイト反応、サンプル溶出、またはサンプル希釈のような、調製工程の段階において使用されることを特徴とする、前記いずれかの方法。
(8) 該第一および/または第二の着色剤として色素を使用することを特徴とする、前記いずれかの方法。
(9) 該第一および/または第二の着色剤が、キノリンイエロー、キシレンシアノール、ブリリアントブルー、パテントブルー、インジゴカルミン、アシッドレッド1、m−クレゾールパープル、クレゾールレッド、ニュートラルレッド、ブロモクレゾールグリーン、アシッドバイオレット5、ブロモフェノールブルー、およびオレンジGからなる群から選択されること特徴とする、前記いずれかの方法。
(10) 溶液に第一および第二の色とは異なる色を与える追加的な着色剤を含む、一つ以上の追加的な試薬溶液を提供し、それによって、前記追加的な試薬溶液が、第一もしくは第二溶液、または混合溶液との混合で、該追加的な着色剤に起因して、さらなる識別可能な色を呈する追加的な混合された溶液を形成することができることを特徴とする、前記いずれかの方法。
(11) −該測定の実施のために必要である少なくとも一つのさらなる物質を含む第三の試薬溶液を提供し、前記第三の試薬溶液が、第一、第二、および第三の色とは異なる第四の色を溶液に提供し、かつ、
−該第一、第二および第三の着色剤に起因して、第一、第二、第三および第四の色とは異なる第五の色を呈する混合された試薬溶液を提供するために、第一および第二の試薬溶液と第二の試薬溶液を混合すること、
を特徴とする、前記いずれかの方法。
(12) 第一の試薬溶液がサンプル溶液であり、第二の試薬溶液がマスターミックスであり、かつ、第三の試薬溶液がプライマー溶液である、(11)の方法。
(13) −溶液に、第一、第二、および第三の色とは異なる第四の色を溶液に提供する第三の着色剤を含む第三の溶液を提供し、かつ、
−それぞれ第三および第五の色を呈し、お互いに異なる色であり、第一、第二および第四の色とも異なる、第一および第二の混合溶液を得るために、該第二および第三の試薬溶液と、第一の試薬溶液を個別に混合する、
ことを特徴とする、(1)ないし(10)のいずれかの方法。
(14) 第一の試薬溶液が(q)PCRマスターミックスであり、第二の試薬溶液が一つのプライマーセットを含み、第三の試薬溶液が第一のプライマーセットとは異なる第二のプライマーセットを含むことを特徴とする、(13)の方法。
(15) 定量的PCRのための反応混合液が調製され、前記反応混合液が蛍光剤を含むことを特徴とする前記いずれかの方法であって、該着色剤のいずれの吸収ピークも、該蛍光剤の放射波長または励起波長と重複しない、または、該波長における反応混合液の総吸収が、少なくとも0.05未満、好ましくは0.03未満、特に0.1未満(1mm光路長)である、方法。
(16) 試薬溶液の吸光度が、最大吸収波長において、1mm光路長を用いて、0.001−0.5、特に0.01−0.5、好ましくは0.03−0.15であることを特徴とする、前記いずれかの方法。
(17) 試薬溶液が適切に混合されたか否かを、該色の存在の観察に基づいて確認することを特徴とする、前記いずれかの方法。
(18) スペクトル分解能を有する光学的手段の使用によって、該確認を自動的に実行することを特徴とする、(17)の方法。
(19) 目視検査によって、該確認を実行することを特徴とする、(17)の方法。
(20) 第一の試薬溶液がポリメラーゼ溶液、または、ポリメラーゼバッファー溶液であることを特徴とする、前記いずれかの方法。
(21) 第一の試薬溶液が、ポリメラーゼ溶液またはポリメラーゼバッファーから選択され、第二の試薬溶液が、プライマー、プローブ、またはサンプルから選択されることを特徴とする、前記いずれかの方法。
(22) 該混合が、マイクロタイターストリップまたはプレートの一つ以上のウェルへ試薬溶液をピペッティングすることによって実行されることを特徴とする、前記いずれかの方法。
(23) ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)測定のための溶液セットであって、
−該PCR測定を行うために必要とされる、少なくとも一つの物質を含む第一の試薬溶液、
−該PCR測定を行うために必要とされる、少なくとも一つの他の物質を含む第二の試薬溶液、
を含み、
−第一の試薬溶液が、第一の色を呈する第一の着色剤を備え、
−第二の試薬溶液が、第一の色とは異なる第二の色を呈する第二の着色剤を備え、
−第一および第二の試薬溶液が、混合によって、該第一および第二の着色剤に起因して、第一および第二の色とは異なる第三の色を呈する、混合溶液を形成することができる、
ことを特徴とする溶液セット。
(24) 該試薬溶液の少なくとも一つが、増幅されるテンプレートを受容するサンプル溶液であることを特徴とする、(23)の溶液セット。
(25) 前記試薬溶液の少なくとも一つが、ポリメラーゼ、プライマー、イオン、dNTPまたは、蛍光qPCR色素もしくはプローブの一つ以上を含み、好ましくはPCRマスターミックスであり、より好ましくはqPCRマスターミックスであることを特徴とする、(23)ないし(24)の溶液セット。
(26) 前記試薬溶液の少なくとも一つが、溶出バッファーまたは希釈バッファーであることを特徴とする、(23)ないし(25)のいずれかの溶液セット。
(27) 該第一および/または第二の着色剤が、キノリンイエロー、キシレンシアノール、ブリリアントブルー、パテントブルー、インジゴカルミン、アシッドレッド1、m−クレゾールパープル、クレゾールレッド、ニュートラルレッド、ブロモクレゾールグリーン、アシッドバイオレット5、ブロモフェノールブルー、およびオレンジGからなる群から選択されることを特徴とする、(23)ないし(26)のいずれかの溶液セット。
(28) 個々の試薬溶液における該着色剤の濃度が、所望のPCR工程の濃度へ希釈した際、該溶液の吸光度が、最大吸収波長において、1mm光路長を用いて、0.001−0.5、特に0.01−0.5、好ましくは0.03−0.15に相当することを特徴とする、(23)ないし(27)のいずれかの溶液セット。
(29) 前記第一および/または第二の試薬溶液が濃縮物であることを特徴とする、(23)ないし(28)のいずれかの溶液セット。
(30) 前記第一および第二の試薬溶液が、qPCRに適した透明または半透明の混合溶液を形成することができるものであることを特徴とする、(23)ないし(29)のいずれかの溶液セット。
(31) 第一の試薬溶液が、ポリメラーゼ溶液またはポリメラーゼバッファーから選択され、第二の試薬溶液が、プライマー、プローブ、またはサンプルから選択されることを特徴とする、(23)ないし(30)のいずれかの溶液セット。
(32) 混合溶液が蛍光剤を含むことを特徴とする、(23)ないし(31)のいずれかの溶液セットであって、該着色剤のいずれの吸収ピークも、該蛍光剤の放射波長または励起波長と重複しない、溶液セット。
(33) 混合溶液が蛍光剤を含み、かつ、該蛍光剤の放射または励起波長における混合溶液の総吸光度が、0.05未満、好ましくは0.03未満、特に0.1未満(1mm光路長)であることを特徴とする、(23)ないし(32)のいずれかの溶液セット。
(34) 定量的PCRの反応混合液の調製のための、(1)ないし(22)のいずれかの方法、または、(23)ないし(33)のいずれかの溶液セット、の使用。
Claims (22)
- (a)少なくとも第一および第二の着色剤、および第一および第二の核酸合成試薬を含む複数の成分を提供すること、ここで
(i)第一の成分は第一の着色剤および第一の核酸合成試薬を含む、
(ii)第二の成分は第二の着色剤および第二の核酸合成試薬を含む、
(iii)第一の着色剤は第一の色を与え、第二の着色剤は第一の色と視覚的に区別可能な第二の色を与え、第一および第二の着色剤の組み合わせは第一および第二の色と視覚的に区別可能な第三の色を有する溶液をもたらす、および
(iv)第一および第二の核酸合成試薬はポリメラーゼ、dNTP、プライマー、マグネシウム塩、核酸テンプレート、qPCR色素、および/またはPCR産物のためのプローブの二つ以上を含む;および
(b)複数の成分を組み合わせて、第一および第二の色と視覚的に区別可能な第三の色を有する溶液を形成すること、
を含む、核酸合成試薬を含む核酸合成反応混合液の調製方法。 - (a)核酸合成試薬および少なくとも第一および第二の着色剤を含む核酸合成反応混合液を調製すること、ここで
(i)第一の成分は第一の着色剤および第一の核酸合成試薬を含む、
(ii)第二の成分は第二の着色剤および第二の核酸合成試薬を含む、
(iii)第一の着色剤は第一の色を与え、第二の着色剤は第一の色と視覚的に区別可能な第二の色を与え、第一および第二の着色剤は一緒に第一および第二の色と視覚的に区別可能な第三の色をもたらす、および
(iv)核酸合成試薬は核酸合成反応を実施するために十分である;および
(b)核酸合成反応混合液を用いて、核酸合成反応を実施すること、
を含む、核酸合成方法。 - 第一および第二の色が、少なくとも30nm分離している、吸収スペクトルにおける最大ピークを有する、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成反応がPCRを含む、請求項2〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成反応が定量的PCRを含む、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成反応が逆転写を含む、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成試薬がdNTPを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成試薬が核酸テンプレートを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成試薬がqPCR色素を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成試薬がプライマーを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成試薬がさらに、サンプル溶解、cDNA合成反応、逆転写反応、サンプル消化、バイサルファイト反応、サンプル溶出、またはサンプル希釈から選択される調製工程の段階において使用される試薬溶液を含み、調製工程の段階が核酸合成試薬を組み合わせる前に行われる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成反応産物の分析のために電気泳動を実施することをさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも一つの着色剤がゲル電気泳動で検出可能である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 第一および/または第二の着色剤が色素である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 第一および/または第二の着色剤が:キノリンイエロー、キシレンシアノール、ブリリアントブルー、パテントブルー、インジゴカルミン、アシッドレッド1、m−クレゾールパープル、クレゾールレッド、ニュートラルレッド、ブロモクレゾールグリーン、アシッドバイオレット5、ブロモフェノールブルー、およびオレンジGから選択される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 第一の色が青、第二の色が黄色、および第三の色が緑である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成反応混合液が、濃縮物である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成反応混合液が、増幅される生物学的サンプルと組み合わせられる、請求項2〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸合成試薬が、さらに蛍光剤を含み、いずれの着色剤の吸収ピークが、蛍光剤の放射波長または励起波長と重複しないものである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光剤の放射波長または励起波長における混合液の総吸収が、少なくとも0.05未満(1mm光路長)である、請求項19に記載の方法。
- 核酸テンプレートがRNAテンプレートである、請求項8に記載の方法。
- 核酸テンプレートがDNAテンプレートである、請求項8に記載の方法。
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