CN102712951B - 制备反应混合物和相关产品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备用于聚合酶链反应(PCR)测定的反应混合物的方法和一种用于PCR的溶液组。该方法包括：提供样品溶液，其包含将在所述PCR测定中扩增的生物样品和为所述溶液提供第一颜色的第一着色剂；提供试剂溶液，其包含实施所述测定所需的至少一种其它物质和为所述溶液提供不同于第一颜色的第二颜色的第二着色剂；和将所述样品溶液和第一试剂溶液混合以提供将经受PCR处理的混合溶液，该混合溶液由于所述第一和第二着色剂而具有不同于第一和第二颜色的第三颜色。本发明显著辅助吸移PCR测定。

Description

制备反应混合物和相关产品的方法
发明领域
本发明涉及(生物)化学试剂的吸移。具体地讲，本发明涉及一种向用于聚合酶链反应(PCR)扩增、特别是定量PCR(qPCR)扩增的微孔吸移试剂的方法。另外，本发明涉及用于辅助吸移的新产品。 
发明背景 
当吸移PCR反应物时，可以将所有必需成分(即试剂)一种接一种地添加至反应管，或者优选地首先组合它们中的至少一些作为主混合物(master mix)随后将该混合物分成多个样品来添加。通常必须独立添加的一种成分为受到研究的样品。微量滴定板中样品、管子或样品孔的数量可以为每个设置(setup)几百或甚至几千个。 
不仅在PCR中而且在许多其它(生物)化学反应中，正确添加试剂即以正确的次序和量添加试剂对于获得有效结果是决定性的。失败的实验导致时间和金钱的损失。经济重要性可能巨大。这是因为成分、塑料器具和人员工作时间的浪费所致。此外，获得实验结果的延迟可能很严重。已存在针对这一熟知问题的各种解决办法。 
存在针对该问题的机械解决办法。本领域已知与样品管和板一起使用的各种自动化吸移机器人、多通道移液和引导系统(例如Finnzymes Piko Light Plate，BioTx Well AwareTM)。 
若干年来，还存在可用的PCR主混合物或缓冲液，其含有某些可见染料以辅助吸移和跟踪电泳运行。这些混合物一般还具有用于增加溶液密度的某些成分以辅助电泳凝胶加样。 
US 6942964公开一种使用吸移辅助染料的产品，该染料也用作凝胶加样和跟踪染料。已将着色剂与聚合酶结合，其有助于用户观察该聚合酶是否已被吸移至PCR混合物或主混合物。类似产品为BioLine Accuzyme Red。 
USB Corporation的RubyTaq特征为一种聚合酶，其包括在琼脂糖凝胶运行期间分离的两种染料：品红色(在500bp[2％凝胶]和1500bp[0.8％凝胶]之间运行)和黄色(10bp以下运行)的混合物。 
Fermentas和Promega也已将着色剂添加至酶反应缓冲液。可以观察到Fermentas’DreamTaqTM Green反应缓冲液为绿色，但该颜色在凝胶电泳期间分离成蓝色带和黄色带。Promega GoTaq和GoTaq Green Mastermix的表现类似。 
还存在这样的可用产品，其中添加至聚合酶的染料并不旨在辅助电泳阶段。实例包括ABgene Red Hot。 
NEB提供一种产品(Crimson Taq)，其特征为添加至DNA聚合酶反应缓冲液的染料酸性红。该产品还使用6％葡聚糖作为密度增强剂。 
Qiagen的CoralLoad染料既可作为单独管中的浓缩物获得，用于添加到无色的主混合物，也可作为任选的预制10×PCR缓冲液获得。其含有两种凝胶跟踪染料(橙色和红色)。 
KR 2002/0045167公开了冷冻干燥的PCR混合物，其含有着色剂以确认PCR成分的溶解。US 6153412也公开了冷冻干燥的反应混合物，其用于识别冻干PCR试剂的存在并且确保PCR试剂和测试样品的完全混合。另一方面，US 5565339公开染料在热起动蜡中的用途，所述蜡不溶解于反应混合物中。 
Absolute Blue QPCR Master Mix含有惰性蓝色染料以使反应设置中的吸移容易。 
WO 2007/088506也公开了一种染色的主混合物。 
所用生物系统具有包括在其qPCR产物中的ROX被动参考染料。该染料的目的是提供稳定的荧光水平，该荧光水平可用于将不同反应之间和反应期间的一个样品中的任何非PCR相关荧光变化归一化。该方法还建议至少部分地将吸移准确性的偏差归一化。 
建议仅在传统的终点PCR中使用上述产物中除最后三个以外的全部产物。除了这些着色剂之外，它们一般含有密度增强剂以使样品材料进入凝胶孔的底部(参见例如US 6942964)。在没有密度增强剂的情况下，样品将分散到周围液体中。 
终点PCR中所用的着色剂通常与定量PCR(qPCR)不相容。这通常是因为它们阻止正在进行的反应的实时光学测量。具体地讲，染料一般具有与qPCR荧光的检测波长重叠的光谱或者所述染料的吸收率过高。对所用染料的一般要求包括对PCR反应或反应物pH的稳定性的非抑制性效应。 
在主混合物或聚合酶内提供染料的上述解决办法的其它缺点在于，它们不能对吸移样品(即在PCR中待扩增的材料)提供帮助。然而，样品吸移是其中对过程保持跟踪最重要也最难的步骤。 
任何的可用的各种机械系统均不能完全解决该问题。它们十分昂贵，并且主要由于体积差异而不能始终在视觉上观察到吸移错误，这意味着在获得失败结果之前不可能检测到错误。 
因此，存在对增强的吸移助剂的需要。具体地讲，存在对也可用于样品吸移阶段的这种吸移助剂的需要。 
发明概述 
本发明的目的是提供一种新溶液，其用于在PCR测定的制备期间辅助吸移且尤其用于使得检测吸移的不同阶段中的错误更容易。 
本发明的目的通过在独立权利要求中定义的本发明来实现。 
在PCR测定的吸移阶段中，将至少两种试剂溶液混合以获得经受PCR的最终混合物。本发明是基于这样的构思：用不同的初始着色剂对试剂溶液着色，所述着色剂在混合之后产生不同于初始着色剂的颜色的可区别的颜色。 
因此，可以直接通过溶液的颜色来分辨其是第一试剂溶液，还是第二试剂溶液或是这些的混合物。 
更具体地讲，该方法包括： 
提供第一试剂溶液，其包含实施测定所需的至少一种其它物质和为溶液提供第一颜色的第一着色剂；和 
提供第二试剂溶液，其包含实施所述测定所需的至少一种其它物质和为溶液提供不同于第一颜色的第二颜色的第二着色剂；和 
将第一和第二试剂溶液混合以提供将经受PCR处理的混合溶液，该 混合溶液由于所述第一和第二着色剂而具有不同于第一和第二颜色的第三颜色。 
在典型应用中，试剂溶液之一为样品溶液，即含有或旨在接受将在PCR测定中扩增的生物样品的溶液，而其它试剂溶液含有实施测定所需的某些另外的至少一种其它物质，例如聚合酶溶液或主混合物(master mix)。样品溶液可以是缓冲溶液(下文称″样品缓冲溶液″)。因此，具有第一颜色的微孔表明在该孔中仅存在不含其它试剂如主混合物的样品溶液。具有第二颜色的微孔表明已添加了主混合物但尚不存在样品。最终，具有第三颜色的微孔表示已正确地向主混合物中添加了样品。可以视觉地或通过自动光学装置来检查颜色。 
在一个实施方案中，试剂溶液之一是洗脱缓冲液，如与核酸纯化试剂盒组合使用的洗脱缓冲液。 
在一个实施方案中，试剂溶液之一是用于促进固态样品裂解以释放核酸的稀释缓冲液。试剂溶液也可以用于在PCR之前稀释、消化或沉淀被释放的成分。因此，可以在吸移直接PCR测定时使用本发明。 
在其它实施方案中，试剂溶液之一是用于cDNA合成反应、逆转录酶反应或亚硫酸氢盐反应的溶液。 
在一个实施方案中，试剂溶液之一是用于制备PCR处理的样品的某些其它溶液。 
本发明还提供一种染料用于产生两种或更多种着色PCR试剂溶液的新用途，所述着色PCR试剂溶液能够形成具有可与试剂溶液的初始颜色区别的颜色的混合溶液。 
其它实施方式为从属权利要求的主题。 
本发明的具体目的是实现一种与定量PCR相容的吸移辅助溶液。这是通过使用不显著干扰荧光过程(即激发和发射)或qPCR中所用光学检测的那种着色剂和着色剂浓缩物而实现。具体地讲，经受qPCR的反应混合物至少在qPCR激发和发射波长处为透明或半透明的。这通常意味着：反应混合物的最大吸收率小于0.5，尤其小于0.15(使用1mm光程测量)，以及着色剂的吸收窗口与所用荧光qPCR染料或被修饰的DNA低聚核苷酸探针的激发或发射波长至少未显著重叠。 
在一个实施方案中，制备用于定量PCR的反应混合物，该反应混合物包含荧光染料、引物或探针，并且其中任何所述着色剂的吸收峰与所述荧光染料、引物或探针的发射或激发波长不重叠。如果存在重叠，则其不应显著减弱qPCR信号，通常意味反应混合物在所述波长下的总吸收率小于0.05，优选小于0.03，尤其小于0.1。 
本发明提供重要优点。因为初始溶液和得到的溶液相互具有不同颜色，所以不仅能区别初始溶液，而且能区别初始溶液和其混合物。 
另外，可以从着色溶液快速感知该溶液是否正确混合以及是否存在与所需反应体积的显著偏差。 
此外，颜色使得更容易观察是否有任何液体喷溅或溢漏在其可能潜在地导致污染、微孔密封问题等等的不当位置。尤其对于热循环之前施加在微量滴定板上的粘附性密封膜，密封接触点中的任何液体均可损害该密封并因此损害整个PCR测定。 
如果使用着色剂使实施的吸移步骤视觉化，则本发明也可以与机械解决办法一起使用以将错误率降低得甚至更低。当使用吸移机器人时，可以在所需步骤之后增加基于光学检测的品质检查步骤，或可在视觉上快速检查试剂的体积和颜色。 
出于上述原因，以本发明方式使用的染料和其它着色剂可在反应设置中且尤其在将试剂加样到反应板中期间辅助保持跟踪。因此，该方法为移液样品提供重要辅助并提高的确定性。 
在qPCR中，在PCR反应之后不需要将扩增的产物加样到凝胶中。因此，不需要密度增强剂。因而，本发明的溶液可以不含密度增强剂或仅含有少量密度增强剂(即低于凝胶电泳所需量)。 
根据一个实施方案，除上述第一和第二试剂溶液以外，提供一个或多个另外的试剂溶液，其包含为溶液提供不同颜色的另外的着色剂。该溶液能够在混合之后形成另外的溶液，其由于所述另外的着色剂而具有其它可区别的颜色。因此，本发明不仅可用于在该过程的一个具体阶段(例如将样品吸移到主混合物)中辅助吸移，而且还用于在其它步骤、尤其是样品吸移步骤之前或之后的步骤期间辅助吸移。 
更详细的说，该方法可以包括：提供第三试剂溶液，其包含实施所 述测定所需的至少一个其它物质，该第三试剂溶液含有为该溶液提供不同于上述第一、第二和第三颜色的第四颜色的第三着色剂；和将该第三试剂溶液与该第一和第二试剂溶液混合以提供混合的试剂溶液，其由于所述第一、第二和第三着色剂而具有不同于第一、第二、第三和第四颜色的第五颜色。具体地讲，第一试剂溶液可以是样品，第二反应溶液是主混合物，并且第三试剂溶液可以是引物溶液。除非测定说明中以其它方式定义，否则应用的次序并不重要。 
或者，上述方法可以包括：提供第三试剂溶液，其含有为溶液提供不同于第一、第二和第三颜色的第四颜色的第三着色剂；和将第一试剂溶液与所述第二和第三试剂溶液单独混合，以获得分别具有不同于彼此和第一、第二和第四颜色的第三和第五颜色。例如，第二试剂溶液可以含有一组引物，并且第三试剂溶液可以含有第二组引物。同样在这实施方案中，所有初始成分和所有得到的混合物的颜色都是唯一的。 
还可以将两个上述实施方案连接，使得第二和第三试剂溶液最终单独地与本身通过将至少两个不同的着色试剂溶液混合而制备的试剂溶液混合。其它种类的组合也是可能的。 
″试剂溶液″是含有对PCR目的必需或有利的至少一种试剂的任何溶液。最典型成分是聚合酶、核苷酸、引物、离子、镁、其它盐、pH缓冲剂、dNTP或荧光qPCR染料或探针、低聚核苷酸、核酸结合剂、核酸模板。该试剂也可以是其它聚合酶反应添加剂，其对聚合酶反应或其监测具有影响。 
除非特别指出，否则术语″样品溶液″涵盖缓冲的和非缓冲的样品溶液，其尚不含模板或者已向其中添加了将用PCR扩增的模板。术语″样品溶液″被术语″试剂溶液″涵盖。 
术语″主混合物(master mix)″是指发生PCR必需的所有或大部分成分或因子(通常是除模板和引物之外(它们均是样品和扩增子特异性的)的所有成分或因子)的混合物。市售的主混合物通常是浓缩溶液。主混合物可以含有多个样品共用的试剂，但其也可仅针对一个样品而构建。使用主混合物帮助降低因吸移体积间差异所致的样品间的吸移错误和变化。其还使吸移所花时间最少化。 
qPCR主混合物是实施qPCR反应所期望的主混合物。因此，其可以含有荧光染料或荧光标记的低聚核苷酸引物或探针。 
术语″预混合物″是指含有除模板之外的所有PCR反应必需成分的主混合物。 
本文中术语″颜色″是指(溶液)对视觉范围内白光的任何可检测光谱响应。因此，在溶液的吸收光谱中存在至少一种这样的波长范围，其为溶液提供着色视觉外观(与水的几乎100％透光度形成对比)。白色，黑色和灰色色调在本文中作为颜色计算。如随后所示，高于约0.01(1mm光程)的吸收率为溶液提供视觉上可感知的颜色，而高于约0.001(1mm光程)的吸收率可相对容易地通过基于硬件的光谱检测装置来检测。 
术语″不同颜色″是指颜色优选地通过裸眼、但至少用光谱检测装置可以区别。具体地讲，″不同颜色″可以在它们的吸收光谱中具有分隔至少30nm的最大峰。优选地，不同颜色选自：红色、黄色、蓝色或青色、品红色、黄色和它们视觉上可区别的组合和色调，例如绿色、橙色和紫色。 
术语″着色剂″是指能够均匀混合或溶解在溶液内并能够为溶液提供可感知颜色的任何物质。根据一个实施方案，着色剂是染料，尤其是水性染料，优选是非氧化性水性染料。 
术语″透明″或″半透明″的含着色剂溶液具体地讲是指在可用于实施qPCR的至少某些荧光激发和/或发射波长处具有光学透射窗口的溶液，所述波长取决于反应混合物中所含的荧光团、荧光染料和/或被修饰的DNA低聚核苷酸探针。一般而言，激发波长在350和690nm之间，尤其在490和650nm之间。发射波长一般在350nm至730nm之间，尤其在515nm至680nm之间。透明溶液在光学上是基本上非漫射性的，而半透明溶液漫射性地通过光。 
术语″样品″是指含有所关注的核酸或将针对所关注的核酸的存在进行分析的固体材料或溶液。 
术语″稀释缓冲液″是指在PCR设置(setup)之前可用于样品预处理的溶液。预处理可包括样品裂解，其用于释放核酸、稀释、结合、化学裂解、沉淀和酶消化某些成分。 
术语″制备性处理″是指获得可全部或部分用作后续PCR反应中样品 的产物的任何反应、吸移步骤或预处理。 
一般而言，通过将溶液与第一和第二着色剂混合所实现的第三颜色是该溶液的第一和第二颜色的色彩组合。因此，第三颜色可以作为第一和第二颜色的光谱的光谱总和而产生。然而，不排除第三颜色是通过更复杂过程形成，例如第一和第二着色剂的反应，或因荧光过程所致，例如荧光共振能量转移(FRET)，前提是荧光波长不同于所用qPCR荧光团的波长。 
接着，参考附图更详细描述本发明的实施方案和优点。 
附图简述 
图1A示出分别含有着色样品缓冲液、着色试剂溶液和它们的着色混合物的三个微孔的横断面图。 
图1B示出微量滴定板的俯视图，该微量滴定板包含空孔和含着色样品缓冲液、着色试剂溶液、它们的着色混合物混合物的孔以及含光学透明液体的孔。 
图2a和图2b示出进行本发明的示例性方式的流程图。 
图3示出本发明的一个实施方案的本发明方法的流程图。 
图4a至图4d示出在吸移辅助染料的情况下(4a和4b)和在没有吸移辅助染料的情况下(4c和4d)用主混合物和样品获得的标准系列。 
图5a至图5d示出与吸收率测量实施例有关的吸收光谱。 
图6a至图6c和图7a至图7c示出cDNA合成反应中着色剂的使用。 
实施方案的详细说明 
为使平板设置更容易，根据一个实施方案，本发明提供一种染料组合，其辅助在(q)PCR处理的吸移阶段中跟踪吸移主混合物、样品和这些的混合。因此，优选对染料进行优化，使得它们可对qPCR反应具有最小影响(例如将不影响所用的样品或DNA聚合酶)并且将不显著影响荧光的光学检测。换句话说，所用染料与qPCR测定相容。 
用于qPCR目的的典型荧光团包括：Alexa 350、FAMTM、TETTM、VICTM、JOETM、HEXTM、CY 3、TAMRATM、ROXTM、Texas Red 、CY 5、 和 其发射和激发波长示于表1中。 
表1. 
  染料   激发   发射
  Alexa 350   350   440
  FAM   494   518
  JOE   520   548
  VIC   538   554
  HEX   535   556
  Cy3   552   570
  TAMRA   565   580
  Cy3.5   581   596
  Texas Red   583   603
  ROX   585   605
  Cy5   643   667
  Cy5.5   675   694
  Quasar705   690   705
图1A示出本发明的基本原理。微孔12A含有具有第一颜色(横线)的着色样品缓冲液14A。微孔12B含有具有第二颜色(竖线)的着色的主混合物14B。微孔12C含有样品缓冲液与着色主混合物的着色混合物，其具有由第一和第二颜色产生的第三颜色(横线和竖线)。 
图1B示出微量滴定板10，除图1A中示出和标记的溶液以外，其还含有空孔12和不具有颜色的非着色液体14D(圆点)。另外，示出稀释的反应混合物14E，其是通过用非着色液体14D稀释初始反应混合物14C而获得，该稀释的反应混合物具有与初始反应混合物14C相同的基本色，但具有提高的透明性，即降低的吸收率(稀疏的横线和竖线)。如随后将更详细描述，根据本发明一个实施方案，不仅可监测颜色，而且可监测稀释程度。 
优选所述染料可在视觉上(即通过裸眼)检测和彼此区分。因此，不同颜色在波谱上相对密集地分布，并且不需要特殊设备。然而，在利用光学光谱检测器或计算机视觉的自动设备中，也可使用在光谱量表(spectral scale)上更细微分布的颜色，而不损害区别不同颜色的能力。 
根据一个实施方案，该组合包含蓝色的主混合物和黄色的样品缓冲液。当混合在一起时，它们形成清晰的绿色溶液。平板中的蓝色表明已添加了主混合物但尚不存在样品。当样品添加时，颜色变为绿色。如果孔中溶液为黄色，则其意味着仅存在样品而不存在主混合物。根据一个实施方案，蓝色染料包含二甲苯蓝。根据一个实施方案，黄色染料包含喹啉黄。已发现这些染料分别与聚合酶和样品缓冲液相容。 
其它潜在染料包含亮蓝、专利蓝、靛蓝胭脂红、酸性红1、间甲酚紫、甲酚红、中性红、溴甲酚绿、酸性紫5、溴酚蓝和橘黄G。其它潜在染料在US 6942964中列出。 
根据一个实施方案，该染料足够强，以向各自溶液提供视觉上可感知的颜色，但又足够弱而不干扰荧光检测，和/或足够弱而不干扰采用通常用于凝胶电泳迁移跟踪的其它染料进行的凝胶电泳迁移跟踪。例如，上述二甲苯蓝和喹啉黄属于这一组染料。因此，如果着色的扩增反应混合物经受终点凝胶电泳分析，则着色剂对该分析无影响。代替地，可向扩增的混合物添加具有电泳染料的常规加样缓冲液。适度染色也保持溶液的总体视觉外观透明或半透明。 
染料的适宜浓度取决于染料本身。根据针对机器辅助颜色检测的一个实施方案，调节初始溶液中染料的浓度以在其最大吸收波长(1mm光程)下产生0.001-0.5的吸收率。根据针对视觉颜色检测的一个实施方案，调节染料的浓度以在其最大吸收波长(1mm光程)下产生0.01-0.5、尤其是0.03-0.5的吸收率。根据最优选实施方案，吸收率是0.03-0.15，其确保即使吸收率峰会与qPCR激发和/或发射波长稍微地重叠，颜色具有视觉可检测性并且对qPCR测量的影响可以忽略或很小。如果这种重叠存在，则优选的是，不管最大吸收率如何，qPCR激发和/或发射波长下的总吸收率小于0.05，优选小于0.03，尤其小于0.01(1mm光程)。当两个(或更多)初始溶液具有不同颜色的染料时，在任何具体波长下均不存在显著的累积吸收率。也应注意，上述吸收率是稀释到所需PCR处理浓度的溶液的优选吸收率。如果溶液作为浓缩物递送，则优选吸收率相应地更高。 
根据替代性实施方案，溶液中的至少一种具备染料，该染料既适于在qPCR中使用(即不影响在所用波长处的荧光检测)且足够强以在凝胶电 泳中被检测到，而且相对于样品在凝胶上以适当距离运行。因此，不一定需要单独的加样缓冲液。 
取决于期望的用途，含有染料的样品缓冲液可以作为稀释物或浓缩物递送。 
图2示出将着色样品溶液(步骤20)和至少一种试剂溶液(步骤21，任选22)吸移到单个容器中并将所述溶液混合(步骤23)的一般概念。在使混合物经受PCR(步骤25)之前，检查混合溶液的颜色(步骤24)。应注意，为了简明，可能有其它吸移和处理步骤未示出。 
下文解释利用本发明的一般构思的若干实施方案。 
根据一个实施方案，提供数个着色样品缓冲溶液，其中使用不同着色剂来为样品缓冲液提供不同颜色。根据另一实施方案，将数个着色样品缓冲液与相同的着色试剂混合物混合，获得不同颜色的反应混合物。因此，在多样品PCR测定中，可以基于溶液的颜色而区别不同样品。例如，黄色样品缓冲液和红色样品缓冲液与蓝色主混合物混合，可以提供绿色和品红色反应混合物，从而不仅可以立即验证正确混合，而且还可以立即验证样品的类型。 
根据一个实施方案，提供一种主混合物和数个着色引物混合物，其中使用不同着色剂来为混合物提供不同颜色(主混合物：颜色1，引物混合物：颜色2和颜色3)。将引物混合物与主混合物(mister mix)组合，获得不同的着色混合物(颜色4和6)。此外，通过向所得混合物添加着色样品(颜色7)，获得可区别的PCR溶液(颜色8和9)。在该过程的各种情况下，溶液的颜色指示溶液的内容物。 
如图3中所示，根据一个实施方案，提供数个主混合物或其它预混合物(步骤31、32)(所述预混合物具备不同着色剂以使预混合物被不同地着色(即预混合物1：颜色2，预混合物2：颜色3，...预混合物n：颜色n+1))和具有另一颜色(颜色1)的样品(步骤30)。将预混合物单独与样品混合(步骤33a、33b)并且检查所得溶液的颜色(步骤34a、34b)。优选对所述颜色进行选择，使得预混合物溶液和样品溶液的组合获得唯一颜色从而使所述溶液可与彼此和初始预混合物和样品溶液区分。在检查(34a、34b)之后，原则上，所述溶液准备进行PCR。应注意，为了简明，可能有其 它吸移和处理步骤未在图3中示出。 
更通常地，可以提供数个初始溶液(各自含有PCR反应需要的成分，例如聚合酶、引物、离子、dNTP或荧光qPCR染料或探针或其它添加剂)(所述初始溶液具备不同着色剂以使这些溶液不同地着色(即溶液1：颜色2，溶液2：颜色3，...溶液n：颜色n+1))和具有另一颜色(颜色1)的样品。优选对这些颜色进行选择，使得溶液的各组合获得唯一颜色从而使得所述溶液可与其它溶液区分。 
高实用价值的本发明选定变型在下文描述。 
洗脱缓冲液中染料的使用 
用于分子生物学实验的核酸通常由复合体样品材料纯化得到。存在各种用于纯化的方法，包括基于提取、沉淀、杂化和不同模式的色谱法或过滤等等的方法。在大部分技术中，核酸溶解或洗脱于所选溶液中。沉淀的核酸可以溶于各种溶液中。当使用基于其它DNA相互作用的其它方法时，对洗脱缓冲液存在更多需要，例如适宜离子强度。广泛使用基于在高离子强度条件下DNA与氧化硅结合的纯化方法。用低离子强度缓冲液或纯水从氧化硅基质洗脱结合DNA。基于氧化硅结合方法的许多试剂盒是可得到的，并且该试剂盒通常含有洗脱缓冲液。为降低实验工作流程中吸移步骤的数量，着色剂可以包括在洗脱缓冲液中，或者试剂盒提供的缓冲液可以替代着色的缓冲液。通过这样做，用户不必以单独步骤添加颜色。 
例如，含有染料的样品缓冲液可以用作与许多商用或自制DNA纯化试剂盒组合的样品洗脱缓冲液。可以用含有染料的样品缓冲液来简单地替换由许多可得到的试剂盒提供的洗脱缓冲液。或者，可以在试剂盒提供的洗脱缓冲液中添加少量染料浓缩物，而不过多稀释该样品。 
如上所述，其它着色试剂溶液可以是该过程需要的任何其它溶液。 
稀释缓冲液中染料的使用(直接PCR) 
新的酶技术使得可能显著简化用于PCR的样品制剂并且甚至可能将未纯化样品直接用于PCR。然而在许多实验中，样品需要分开到若干反 应中，并且通常优选能够存储样品的一些以用于可能的重复或其它目的。因此，其中样品裂解并溶于特殊样品缓冲液中的直接PCR方案十分受欢迎。在这种所谓的稀释方案中，稀释缓冲液可以含有裂解该样品的不同药剂。除这些试剂以外，可以向该稀释缓冲液添加着色剂以使后续吸移步骤更容易。 
如上所述，其它着色试剂溶液可以是该过程需要的任何其它溶液。 
为展示该实施方案，采用基于DNA与氧化硅结合的试剂盒进行两组从牛乳样品的提取。一组遵循指南，另一组中洗脱缓冲液被具有黄色染料的1×样品缓冲液替换。将纯化样品用于qPCR，并且比较所述两组的qPCR结果。未观察到显著差异。 
逆转录反应中染料的使用 
进行大多数实时PCR以进行基因表达研究。在这些实验中，所关注的核酸是RNA，并且因此不是用于标准qPCR的直接适宜模板。在qPCR之前，RNA样品必须在qPCR步骤之前被逆转录。逆转录和qPCR反应可以组合并随后在相同反应混合物中实施。然而，通常该条件是两种反应的折中并且对于任一种都不是最佳的。在大多数情况下，更佳的是进行单独的逆转录反应并且在单独qPCR反应中将生成的cDNA用作模板。在逆转录反应设置中，与针对qPCR所述一样，在吸移期间，保持样品的跟踪存在相同挑战。本发明的实施方案描述了在cDNA合成反应中可以如何使用着色剂以克服该挑战。 
cDNA合成反应中着色剂的使用展示如下： 
制备两种cDNA合成反应系列，一种具有黄色着色剂，最终浓度10倍于qPCR的指导浓度，另一种不具有另外的染料。将具有1000ng、500ng、10ng、1ng、100pg和10pg稀释物的HeLa总RNA稀释系列用作模板。根据说明书(产品编号F-470，Finnzymes)以其它方式进行反应。然后，将1,5μl等份的各反应物用作采用DyNAmo SYBR Flash qPCR主混合物的qPCR中的模板。 
参考图6a-6c和图7a-7c，生成两个标准曲线，第一个(图6c)代表具有添加的染料的系列，而另一个(图7c)代表不含该染料。结果表明cDNA 合成可以在着色剂存在下实施，并且维持反应的定量性质。 
在实施中，染料可以伴随转录酶、伴随样品、伴随缓冲溶液或者单独地作为浓缩物进入反应。 
亚硫酸氢盐反应中染料的使用
与以上讨论类似地，还可以将染料添加至参与亚硫酸氢盐处理的任何成分中，然后将由此所得的样品与第二反应溶液混合。 
如可从上述实施例看出，染料不仅可存在于混合该最终PCR反应混合物时，而且还存在于制备性处理步骤中，尤其涉及样品制备的那些步骤中，例如逆转录反应(例如cDNA合成中)、亚硫酸氢盐反应、样品洗脱或样品稀释。这些实例并非限制，而如本领域技术人员所理解，染料还可以按不同方式引入这些反应中，例如伴随酶、伴随反应缓冲液、伴随样品或者单独地引入。 
当制备性处理步骤中也存在颜色时，也有助于这些步骤的吸移。然而，根据优选实施方案，当将最终反应溶液与(例如)聚合酶或主混合物混合时，形成至少一个着色溶液。 
图2以一般水平示出在至少一个制备性处理步骤29′之前向该过程引入至少一种着色试剂溶液(步骤20′)的原理。预处理可以也涉及一种或多种其它物质的引入(步骤28′)。在预处理之后，该方法可以通过以下方式与如上文所解释的类似地继续进行：将制备性处理步骤的产物(或其等份试样)与第二着色试剂溶液混合(步骤21′和23′)，检查混合溶液的颜色(步骤24′)以及进行(q)PCR(步骤25′)。 
下面描述吸移过程的监测。
优选地，不同颜色可通过裸眼区别。然而，也可以利用能够区别颜色的硬件辅助光学测量。 
根据一个实施方案，在吸移过程期间，自动地通过能够光谱分辩的光学装置至少一次地检查待吸移的一个或多个微孔的状况。 
根据一个实施方案，在吸移过程的不同阶段中至少两次地自动检查微孔的状况。优选地，在每个单独吸移步骤之后，进行这种检查。 
着色剂的浓度降低，并且着色溶液的颜色因每次添加非着色(即光学透明)液体而变弱。另一方面，添加着色物质改变色泽。因此，孔中溶液的颜色的强度和/或色泽指示吸移的阶段。通过自动测量微孔的光谱响应，可以监测吸移过程的进程。 
根据一个实施方案，使用计算机程序进行上述监测，该计算机程序适合于将在所需吸移步骤之后所测量的光谱响应与对这些步骤的预定义限制进行比较。将这种限制设计成反映溶液颜色的正确色泽和/或强度，并考虑所添加的试剂。将测量值未在合格范围内的微孔标记为不正确吸移。 
溶液颜色的检测优选基于吸收率测量。检测仪器(其可以是例如自动吸移装置或(q)PCR热循环装置的组成部分)含有吸收率测量装置，即光源，光检测器和用于测定微孔的内容物至少在一个波长或波长范围下的吸收率的器件。优选地，吸收率测量器件包括分光光度计。借助于本发明，吸移和PCR测定的可靠性可有所改进，因为可以检测颜色的色泽和强度的即使很小的变化，以及因此可以检测孔的内容物的即使很小的变化。 
根据替代性实施方案，检测仪器被包括在单独装置中，在关键性吸移步骤之后可以自动地或手动地将反应溶液转移到该单独装置。在该单独装置中，进行快速读板，随后将平板转移用于其它处理。 
因此，本发明还提供一种用于监测吸移的装置，其包括：用于接受含有数个微孔的微量滴定板的设备；和用于测量微孔的内容物的光学吸收率的设备。用于检测吸收率的所述器件适合于检测样品的光谱吸收率分布(用于颜色检测)和/或样品的颜色强度(用于稀释物检测)。优选地，该装置具有能够监测整个吸移过程的上述两个功能。光学检测设备优选与计算装置连接，该计算装置分析和存储测量的吸收率并且实施计算或者测量数据与预存储数据的比较。 
检测仪器可以含有微量板接受模块，其可以被冷却以保持反应溶液的温度足够低。对大多数热启动聚合酶而言，冷却并非必需。 
当反应容器的体积小，即小于5μl，尤其小于1μl时，自动检测是特别有帮助的，因为在这些情况下对溶液的颜色和体积进行可靠视觉观察 更加困难。 
微孔可以是分离的或包含在任何已知类型的微量滴定带或板中。优选地，由透明材料制造孔，使得可通过该孔的壁进行视觉检查或光谱测量。 
染色实施例 
以0.0026％(w/v)的浓度将二甲苯蓝作为着色剂添加到DyNAmoFlash SYBR 绿色qPCR和DyNAmo Flash Probe qPCR主混合物(来自Finnzymes，Finland)中。得到清澈蓝色透明溶液。以0,00174％(w/v)的浓度将喹啉黄添加到样品缓冲液中。该样品缓冲液包含1mm Tris-HCL pH8,5和0,1mM EDTA。结果，得到清澈黄色透明溶液。 
将着色样品缓冲液与着色主混合物混合，产生清澈绿色透明混合物。 
扩增实施例 
图4a-4d示出在实施例1的吸移辅助染料的情况下(图4a和4b)和在没有实施例1的吸移辅助染料的情况下(4c和4d)用主混合物和样品获得的标准系列。这两个系列都根据产品说明书中方案采用DyNAmo Flash Probe主混合物来扩增人基因组DNA序列而进行。引物序列是ACCTCCAAACTGGCTGTAAC与ATCTCCTCCTCATTGCAAAG。检测基于具有序列TGGCCCCTTGAAGACAGCAG的水解探针。扩增子尺寸是121bp。 
根据扩增曲线(图4a和4c)与标准曲线(图4b和4d)的相互类似性，可以发现染料的存在不影响反应效率或不显著影响荧光强度。 
吸移实施例： 
利用本发明来实施以下吸移顺序： 
将着色(蓝色)2×混合物与引物和探针、添加剂和水充分混合以获得用于多个反应的预混合物。 
将预混合物吸移到微量滴定板的多个孔(15μl/孔)中。 
将着色的(黄色)DNA样品溶液吸移到预混合物上(5μl/孔)。 
所得溶液的颜色经人工检查是正确的(绿色)。 
在上述步骤之后，所得溶液准备经受(q)PCR。对于qPCR，优选将试剂离心到孔的底部。 
吸收率测量实施例 
测量用于上述实施例的染料的不同稀释物和现有着色主混合物的稀释物的吸收率，并视觉观察比较以评价不同波长下的视觉可感知范围。具体地讲，该目的是用不同染料测定视觉可感知的吸收率范围，并还检查市售染料是否可适宜与FAM和SYBR荧光染料一起使用，FAM和SYBR荧光染料是qPCR中使用最普遍的染料。 
通过使用1mm和0.1mm光程的Nanodrop ND-1000分光光度计实施测量。 
将结果(包括颜色的视觉可检测性，样品的吸收率最大值和吸收率)以及实验中所用的溶液和染料的类型示于下表1-7中。表1-3示出用将与FAM或SYBR一起使用的优选染料获得的结果，而表4-7示出通过市售着色PCR溶液获得的比较实施例。 
在表中，使用以下符号： 
+++强烈的颜色 
++易于发现的颜色 
+弱颜色但在标准实验室环境中对裸眼可见 
-在标准实验室环境中对裸眼不可见的颜色 
对于用星号(*)表示的情况而言，吸收峰不完全明确或清楚。 
表1 
表2 
  产品   稀释物   视觉颜色  nm(λmax)   A(1mm)   A(1cm)
  样品缓冲液   500x   +++  413    
  Finnzymes   50x   +++  413    
    5x   ++  413   0,578  
  喹啉黄(QY)   1x   ++  413   0,124   1,163
    0.2x   +  413   0,026*   0,186
    0.04x   -  413   0,022*  
    0.02x    413    
表3 
  产品   稀释物   视觉颜色  nm(λmax)   A(1mm)   A(1cm)
  着色反应混合物   1x   ++  413   0,128  
  Finnzymes   0.2x   +  413   0,032   0,186
    0.1x   +  413   0,015   0,059
  G7   0.04x   -  413    
表1-3的溶液的吸收率最大值距离FAM和SYBR染料的荧光波长相对较远。表3的反应混合物的吸收光谱(1×稀释物)示于图5a中。可以从数据推断，被测试染料证明适于在初始溶液中使用并与这些荧光染料一起在qPCR反应混合物用作着色剂。 
表4 
表4的缓冲液在510nm处具有吸收率最大值，其接近于FAM和SYBR荧光最大值。用这些染料，吸收率可显著降低qPCR信号。因此，在qPCR中使用该混合物将不可行。 
表5 
 产品   稀释物   视觉颜色  nm(λmax)   A(1mm)   A(1cm)
 Green GoTaq   5x   +++  419    
 Promega   1x   ++  419   1,183  
    0.5x   ++  419   0,527  
 GT   0.1x   ++  419   0,130  
    0.02x   +  419   0,029*  
    0.01x   +  419   0,014*  
    0.005x   -      
表5的混合物在419nm处具有极强吸收率。因为吸收峰并不十分陡峭，所以其在495nm处还具有显著吸收率(0.17，采用1mm光程)，这是FAM和SYBR染料受激发的范围。用这些染料，吸收率可降低qPCR信号。吸收率光谱(1×稀释物)示于图5c中。 
表6 
  产品   稀释物   视觉颜色  nm(λmax)   A(1mm)   A(1cm)
  Quick-Loadmm   2x   +++  478   1,922*  
  NEB   1x   ++  485   1,000  
    0.5x   ++  485   0,516  
  QL   0.1x   +  485   0,103  
    0.02x   +  485   0,025  
    0.01x   -  485   0,012*  
    0.005x        
    0.001x        
    0.0005x        
表6的混合物在485nm处具有极强吸收率。因为吸收峰并不十分陡峭，所以其在495nm处还具有显著吸收率(0.982，采用1mm光程)，这是 FAM和SYBR染料受激发的范围。用这些染料，吸收率可显著降低qPCR信号。吸收率光谱(1×稀释物)示于图5d中。 
表7 
  产品   稀释物   视觉颜色  nm(λmax)   A(1mm)   A(1cm)
  Coral Load   10x   +++      
  Qiagen   1x   ++  475   0,407  
    0.5x   ++  475   0,202  
  CL   0.1x   +  475   0,043*  
    0.04x   +  475   0,018  
    0.02x   -      
表7的混合物在475nm处具有极强吸收率。因为吸收峰并不十分陡峭，所以其在495nm处还具有显著吸收率(0.393，采用1mm光程)，这是FAM和SYBR染料受激发的范围。用这些染料，吸收率可显著降低qPCR信号。吸收光谱(1×稀释物)示于图5b中。 
可感知范围取决于波长，但通常地，在1mm光程情况下提供0.01-0.1以上吸收率的颜色似乎可在视觉上与透明液体区别。当吸收率升高到0.1-0.2时，颜色对眼睛显得十分清楚。然而，复杂工具更加敏感，因此当将(例如)分光光度计用于颜色测量时，可以使用提供0.001以上吸收率的染料。 
使用通过颜色检测来检查反应设置体积的工具使得更加稀释的颜色可用于该目的，从而使颜色可能具有的可能负面影响最小化。例如，在qPCR中，可以使用且不显著影响荧光检测的染料的范围会增加。 
上述实施方案和实施例和附图是出于说明性目的。应基于将等效形式纳入考虑的以下权利要求书来评估本发明的范围。 

Claims (46)

1.一种制备用于聚合酶链反应即PCR测定的反应混合物的方法，其包括：
提供第一试剂溶液，其包含实施所述测定所需的至少一种物质；
提供第二试剂溶液，其包含实施所述测定所需的至少一种其它物质；
将所述第一和第二试剂溶液混合以提供将经受PCR处理的混合溶液；
其特征在于，
所述第一试剂溶液含有为所述第一试剂溶液提供第一颜色的第一着色剂；
所述第二试剂溶液含有为所述溶液提供不同于所述第一颜色的第二颜色的第二着色剂；
所述混合获得混合溶液，其由于所述第一和第二着色剂而具有不同于所述第一和第二颜色的第三颜色；
其中着色剂的吸收窗口与PCR荧光染料的激发或发射波长不重叠，所述混合溶液在所述波长处的最大吸收率小于0.5，采用1mm光程测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂溶液之一是样品溶液，其包含将在所述PCR测定中扩增的生物样品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述试剂溶液中的至少一种包含以下的一种或多种：聚合酶、引物、离子、dNTP或荧光qPCR染料或探针。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述试剂溶液中的至少一种是PCR主混合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述试剂溶液中的至少一种是qPCR主混合物或PCR或qPCR预混合物。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述试剂溶液中的至少一种是用于待扩增模板的样品洗脱缓冲溶液。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述试剂溶液中的至少一种是样品稀释缓冲溶液。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述试剂溶液中的至少一种用于制备性处理步骤中。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述制备性处理步骤为在将所述第一和第二试剂溶液混合之前进行的样品裂解、cDNA合成反应、逆转录反应、样品消化、亚硫酸氢盐反应、样品洗脱或样品稀释。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用染料作为所述第一和/或第二着色剂。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一和/或第二着色剂选自：喹啉黄、二甲苯蓝、亮蓝、专利蓝、靛蓝胭脂红、酸性红1、间甲酚紫、甲酚红、中性红、溴甲酚绿、酸性紫5、溴酚蓝和橘黄G。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，提供一种或多种另外的试剂溶液，所述另外的试剂溶液包含提供不同于所述第一和第二颜色的溶液颜色的另外的着色剂，由此所述另外的试剂溶液能够在与所述第一或第二试剂溶液或所述混合溶液混合之后形成另外的混合溶液，所述另外的混合溶液由于所述另外的着色剂而具有其它可区别的颜色。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
提供第三试剂溶液，其包含实施所述测定所需的至少一个其它物质，所述第三试剂溶液含有为所述溶液提供不同于所述第一、第二和第三颜色的第四颜色的第三着色剂；和
将所述第三试剂溶液与所述第一和第二试剂溶液混合以提供混合的试剂溶液，其由于所述第一、第二和第三着色剂而具有不同于所述第一、第二、第三和第四颜色的第五颜色。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一试剂溶液是样品溶液，所述第二试剂溶液是主混合物，并且所述第三试剂溶液是引物溶液。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
提供第三试剂溶液，其含有为所述溶液提供不同于所述第一、第二和第三颜色的第四颜色的第三着色剂；和
将所述第一试剂溶液与所述第二和第三试剂溶液单独混合以获得第一和第二混合溶液，所述第一和第二混合溶液分别具有不同于彼此和所述第一、第二和第四颜色的第三和第五颜色。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一试剂溶液是qPCR或PCR主混合物，所述第二试剂溶液含有一组引物并且所述第三试剂溶液含有不同于所述第一组引物的第二组引物。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，制备用于定量PCR的反应混合物，所述反应混合物包含荧光剂，并且其中任何所述着色剂的吸收峰都未与所述荧光剂的发射或激发波长重叠，或者所述反应混合物在所述波长处的总吸收率为至少小于0.05，采用1mm光程测定。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述反应混合物在所述波长处的总吸收率为至少小于0.03。
19.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，制备用于定量PCR的反应混合物，所述反应混合物包含荧光剂，并且其中任何所述着色剂的吸收峰都未与所述荧光剂的发射或激发波长重叠，或者所述反应混合物在所述波长处的总吸收率为至少小于0.1，采用1mm光程测定。
20.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在1mm光程情况下，所述试剂溶液在其最大吸收波长处的吸收率为0.001-0.5。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述试剂溶液在其最大吸收波长处的吸收率为0.01-0.5。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述试剂溶液在其最大吸收波长处的吸收率为0.03-0.15。
23.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，基于观察所述颜色的存在而检查所述试剂溶液是否已正确混合。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述检查使用能够进行光谱分辨的光学装置自动地进行。
25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述检查通过视觉检查来进行。
26.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一试剂溶液是聚合酶溶液或聚合酶缓冲溶液。
27.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一试剂溶液选自：聚合酶溶液、聚合酶缓冲液；并且所述第二试剂溶液选自：引物、探针和样品。
28.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述混合通过将所述试剂溶液吸移到微量滴定带或板的一个或多个孔来进行。
29.一种用于聚合酶链反应即PCR测定的溶液组，其包含：
第一试剂溶液，其包含实施所述PCR测定所需的至少一种物质；
第二试剂溶液，其包含实施所述PCR测定所需的至少一种其它物质；
其特征在于，
所述第一试剂溶液具备具有第一颜色的第一着色剂；
所述第二试剂溶液具备具有不同于所述第一颜色的第二颜色的第二着色剂；
所述第一和第二试剂溶液能够在混合之后形成混合溶液，其由于所述第一和第二着色剂而具有不同于所述第一和第二颜色的第三颜色；
其中着色剂的吸收窗口与PCR荧光染料的激发或发射波长不重叠，所述混合溶液在所述波长处的最大吸收率小于0.5，采用1mm光程测定。
30.根据权利要求29所述的溶液组，其特征在于，所述试剂溶液中的至少一种是用于接受待扩增模板的样品溶液。
31.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，所述试剂溶液中的至少一种含有以下的一种或多种：聚合酶、引物、离子或dNTP或荧光qPCR染料或探针。
32.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，所述试剂溶液中的至少一种是PCR主混合物。
33.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，所述试剂溶液中的至少一种是qPCR主混合物。
34.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，所述试剂溶液中的至少一种是用于待扩增模板的洗脱缓冲液或稀释缓冲液。
35.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，所述第一和/或第二着色剂选自以下：喹啉黄、二甲苯蓝、亮蓝、专利蓝、靛蓝胭脂红、酸性红1、间甲酚紫、甲酚红、中性红、溴甲酚绿、酸性紫5、溴酚蓝和橘黄G。
36.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，当稀释到所需PCR处理浓度时，在1mm光程情况下，各试剂溶液中的所述着色剂的浓度对应于所述溶液在其最大吸收波长处的吸收率0.001-0.5。
37.根据权利要求36所述的溶液组，其特征在于，各试剂溶液中的所述着色剂的浓度对应于所述溶液在其最大吸收波长处的吸收率0.01-0.5。
38.根据权利要求36所述的溶液组，其特征在于，各试剂溶液中的所述着色剂的浓度对应于所述溶液在其最大吸收波长处的吸收率0.03-0.15。
39.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，所述第一试剂溶液和/或所述第二试剂溶液是浓缩物。
40.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，所述第一试剂溶液和所述第二试剂溶液能够形成适于qPCR的透明或半透明混合溶液。
41.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，所述第一试剂溶液选自：聚合酶溶液、聚合酶缓冲液；并且所述第二试剂溶液选自：引物、探针和样品。
42.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，所述混合溶液包含荧光剂，并且其中任何所述着色剂的吸收峰不与所述荧光剂的发射或激发波长重叠。
43.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，所述混合溶液包含荧光剂，并且所述混合溶液在所述荧光剂的发射或激发波长处的总吸收率为小于0.05，采用1mm光程测定。
44.根据权利要求43所述的溶液组，其特征在于，所述混合溶液在所述荧光剂的发射或激发波长处的总吸收率为小于0.03。
45.根据权利要求29或30所述的溶液组，其特征在于，所述混合溶液包含荧光剂，并且所述混合溶液在所述荧光剂的发射或激发波长处的总吸收率为小于0.1，采用1mm光程测定。
46.根据权利要求1至28中任一项所述的方法或根据权利要求29至45所述的溶液组用于制备用于定量PCR的反应混合物的用途。
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