CN108368495B - 具有不耐热染料的组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽，和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。本公开进一步提供了采用这样的组合物的方法，以及包含用于形成这样的组合物的成分的试剂盒。

Description

具有不耐热染料的组合物
本公开提供了一种含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽，和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。本公开进一步提供了采用这样的组合物的方法，以及包含用于形成这样的组合物的成分的试剂盒。
发明背景
本公开涉及可用于设置和进行生化或分子生物学反应，并监测其状态的方法中的工具。关于生化或分子生物学反应的准备工作特别包括组装期望反应的所有必要反应物的步骤。通常，生化或分子生物学反应发生在水溶液中。因此，首先提供作为分离的组分的不同反应物。必须将它们组合以形成反应混合物，即形成具有指定浓度的所选成分并且处于限定的其他条件下的组合物，以便在稍后允许发生期望的反应。将所述组分混合以形成水溶液中的期望的组合物。为此，可以将组分作为干燥物质或作为已经溶解的物质，添加至混合物。此外，可以将几个组分单独地放在一起，溶解并混合以形成试剂，并且随后可以将多个试剂组合并混合，以便形成用于期望反应的期望的组合物(反应混合物)。
反应混合物通常从不同水溶液的组合，所述水溶液不具有明显(即可见)的特殊特征。因此，技术人员面临这样的任务，即仔细监测期望的反应混合物的所有必要反应物(组分，组分溶液)在一个反应容器或多个反应容器中的组装过程。例如，熟练的实验室操作员依赖于由容器(其中提供具体试剂储液)的标记提供的信息。但是，一旦试剂从所述容器取出并转移至反应容器中，所述试剂与相应标记的物理关联就丢失了。在没有任何进一步追踪措施的情况下，关于反应容器中的相应试剂的存在和身份的信息就丢失了。在此方面，追踪措施可以是特别的记录，表明已经将具体试剂储液的等分试样转移到具体的反应容器中。追踪措施的另一实例是存在于具体试剂并且可以通过光学方式(例如目视检查)确定的着色剂。一旦将具有着色剂的试剂添加到反应容器，所述着色剂指示相应试剂在容器中的存在。这个原理已经用于生物化学和分子生物学，特别是在使用聚合酶链式反应(PCR)的应用中。
如在Pelt-Verkuil, Elizabeth van, Belkum, Alex van, Hays, John P.(2008) “Principles and Technical Aspects of PCR Amplification”, SpringerNetherlands (ISBN 978-90-481-7579-6)中的“7.3 Taq DNA polymerase and itsmodifications”所报道的，一些制造商提供含有报道为惰性的红色染料的耐热DNA聚合酶或现成的PCR主混合物(master mixes)，所述染料不干扰聚合酶活性、扩增的PCR产物的纯化，测序或进一步的下游加工应用。这些染料相关产品的商购可得的实例包括REDAccuTaq®、REDTaq® (Sigma)和Red Hot® Taq DNA Polymerase (Thermo Fisher)等。这样的产品充当追踪措施，是因为它们允许目测控制聚合酶或主混合物的真实添加和混合。此外，它们有助于PCR扩增产物在凝胶电泳上的目测追踪。实际上，这些染料充当对应于125个碱基对的DNA片段的分子量标记。作为用于可视地指示试剂是否存在于小瓶中的目的的惰性着色剂宣传的另一种染料是VisiBlue™ (TATAA Biocenter)。WO2015/054396公开了作为着色剂与qPCR主混合物一起用于实时PCR仪器的可见染料制剂。
用于PCR的反应混合物是用于在设置后通过应用温度变化而启动的生化或分子生物学反应的实例。更普遍地，关于设置生化或分子生物学反应的方法，操作者期望反应混合物的组分保持以下趋势的条件：(i) 化学稳定，(ii) 不彼此反应，和(iii) 对于将随后进行的期望反应，不变成功能失常的。为此目的，熟知且经常应用的条件包括低的环境温度，例如0℃和4℃的范围内的温度，其提供用于很多生化反应物的这种期望的条件。具体地，这种低温对于抑制起源于嗜温生物的酶的生物活性而言会是有利的。然而，来自耐热生物的很多酶可以在室温下操作，因为其催化活性在更高的温度下展现。因此，大量的设置生化或分子生物学反应的制备方法在比进行相应的适当反应的温度更低的温度下进行。
技术上，期望将着色试剂作为第一液体组合物的标记组分，否则无法将第一液体组合物与可以和所述第一组合物混淆的其他液体组合物区分开。这样的着色试剂可有利地在将不同试剂组合在反应混合物中的手动执行的方法中充当目测对照。理想地，这种目测对照允许检验具体试剂是否已经存在于混合物中。除了目测对照之外，可调整而用于通过其他光学方式(特别是通过可自动化的方式)评估的着色试剂是期望的。
考虑到混合物的目的是允许生化反应发生的事实，进一步期望对于所述生化反应而言，着色试剂是惰性的；也就是说，着色剂不应抑制或以其他方式不利地干扰使用所述混合物进行的生化反应。
在生化反应的过程期间，对反应混合物的任何光学性质进行改变的具体情况下，期望对这种改变的检测不受所述着色剂的不利影响。在待进行的生化反应是包括监测热循环步骤期间的荧光发射的步骤的实时PCR的情况下，这是非常特异性的需求。在这点上的具体挑战是找到不使一种或多种荧光染料的荧光淬灭的着色试剂，所述荧光染料可作为指示PCR方法的进程和/或结果的检测系统的一部分存在于反应混合物中。仍另一个技术目标是由使用可由设备(包括但不限于用于实时PCR的热循环仪)生成的光度读数，将目测对照与自动化对照组合的期望所给出的。
通过更广泛地关注于包括温度变化的生化反应，本公开的作者采用了搜索即便在低浓度下也具有容易对人眼可见的颜色的不耐热染料，或能够显示荧光的染料的方法。所述搜索特异性地关注不耐热的染料，以使对光度检测的任何影响最小化，所述光度检测可以是在反应混合物的加工过程中，可以包含染料的情况。
发明内容
涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的第一方面是一种含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽，和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的第二方面是根据本公开的含水组合物用于指示所述耐热多肽的存在的用途，所述多肽包含在所述组合物中。涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的第三方面是在将多个组分组合以形成混合物的过程中，检验第一组分的存在并且任选地检验另外的组分的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 提供作为分离的水溶液的所述混合物的两种或更多的组分，其中所述组分之一包含纯化的具有生物活性的耐热多肽；(b) 选择第一组分，并使用第一纯化的不耐热的水溶性物质将所述第一组分染色，在容许温度下处于功能构象的所述第一物质吸收光和/或显示荧光，其中步骤(a)的所述多肽的最大容许温度高于所述第一物质的最大容许温度；(c)任选地选择另外的组分，并使用另外的纯化的不耐热的水溶性物质将所述另外的组分染色，在容许温度下处于功能构象的所述另外的物质吸收光和/或显示荧光，其中步骤(a)的所述多肽的最大容许温度高于所述另外的物质的最大容许温度；(d) 将所述两种或更多组分混合；(e) 评估步骤(d)中获得的混合物中的第一纯化的不耐热的水溶性物质的功能构象，从而检验所述第一组分在所述混合物中的存在；(f) 任选地评估步骤(d)中获得的混合物中的另外的纯化的不耐热的水溶性物质的功能构象，从而检验相应的另外的组分在所述混合物中的存在；由此在将不同试剂组合以形成混合物的过程中，检验第一组分的存在并且任选地检验另外的组分的存在。涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的第四方面是确定组合物的加工状态的方法，其中所述组合物的加工包括应用温度变化，所述方法包括以下步骤：(a) 提供含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度；(b) 通过应用达到高于所述物质的最大容许温度的温度的改变，加工步骤(a)的组合物，其中所述物质的构象被不可逆地改变，从而变成功能失常的；(c) 通过光学工具评估所述物质的功能构象；从而确定所述组合物的加工状态。涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的第五方面是确定组合物的第一未加工状态和第二加工状态的方法，其中所述组合物的加工包括应用温度变化，所述方法包括以下步骤：(a) 提供含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度；(b) 将步骤(a)的组合物保持在低于所述物质的最大容许温度的温度并且不进行温度变化，从而使所述物质保持功能构象；(c) 通过光学工具评估所述物质的功能构象；(d) 通过应用达到高于所述物质的最大容许温度的温度的改变，加工步骤(a)的组合物，其中所述物质的构象被不可逆地改变，从而变成功能失常的；(e) 重复步骤(c)；从而确定所述组合物的第一未加工状态和第二加工状态。涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的第六方面是部件的试剂盒，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。
发明详述
在本报告中，使用的某些术语具有具体的含义，或被首次定义。出于本公开的目的，在存在其业界接受的定义时，所使用的术语由这种定义限定，除了在这些定义与下文所述的定义冲突或部分冲突的情况下。在定义冲突的情况下，术语的含义首先通过下文所述定义中的任一种限定。
用于本发明的说明书和权利要求中的术语“包含”是指“包括，但不一定限于”。
本文使用的冠词“一(“a”和“an”)”是指一个或多于一个(即至少一个)的所述冠词的语法对象。例如，“一种化合物”是指一种化合物或多于一种化合物。
在指示数值的范围，例如浓度范围时，所述范围由第一值n1和第二值n2表示。所指范围的下限被理解为等于或高于所述第一值n1的数值。所指范围的上限被理解为等于或低于所述第二值n2的数值。因此，所指范围中的数值x通过
Figure 31273DEST_PATH_IMAGE001
给出。
应理解，与数值n组合的术语“约”和字符“~” (“约n”，“~n”)表示在由所述值±5%的数值给出的区间中的数值x，即
Figure 483114DEST_PATH_IMAGE002
。如果没有另外说明，在与数值n组合的术语“约”和字符“~”描述具体实施方式的情况下，n的值是甚至更具体的实施方式。
术语“可见光”是指被人眼感知到的电磁波谱部分。认为人眼对约380 nm至约750nm的波长作出反应。在光谱颜色方面，在约380 nm至约430 nm范围中的单色波长被视为紫色，在约430 nm至约490 nm范围中被视为蓝色，在约490 nm至约570 nm范围中被视为绿色，在约570 nm至约600 nm范围中被视为黄色，在约600 nm至约640 nm范围中被视为橙色，且在约640 nm至约750 nm范围中被视为红色。
当光照在物体上时，其可以被吸收、反射和/或散射。当表面等同地吸收所有波长的入射光时，人的感觉认为所述物体是黑色的。当所述表面等同地反射所有波长时，所述物体被视为白色的。术语“颜色”是指对应于上文对于可见光谱的单色光所述的，在人类中被称作红色、蓝色、黄色等类别的视觉感知特性。当存在于白光中的某些波长被吸收时，视觉感知将没有被吸收的波长检测为“有色的”光。感知到的颜色称作被除去的颜色的互补色。例如，如果红色波长通过吸收的方式被从白光除去，则感知到的颜色是蓝绿色。蓝绿色与红色互补，并且红色与蓝绿色互补。因此，颜色来源于光谱，即光功率对比波长的分布，在眼中与光受体的光谱灵敏度的相互作用。“着色剂”被认为是可以与无色物体混合的具有颜色的第一物体。一些物体，特别是有色液体，不仅可以反射光，而且在具体实施方式中还能够传导光或自行发光，这也促成颜色。可以通过添加作为着色剂的在液体中可溶的染料，使无色透明的液体着色。“染料”是能够吸收一种或多种波长的光的化合物。在本发明的背景下，染料是水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光。本领域熟知的染料的一个非限定性具体实施方式是非荧光染料。本领域熟知的染料的另外的非限定性具体实施方式是“荧光染料”，其特征在于在激发后再发出光的性质，即“荧光”。
在本公开的背景下，如果由于对高于容许温度的热暴露的不可逆反应，通过改变其化学和/或物理结构的方式使材料功能丧失，包括被破坏、变性、分解、导致功能失常或以其他方式失活，则所述材料(例如但不限于具有生物活性的多肽，或吸收光和/或显示荧光的物质)被认为是“不耐热的”。对于考虑的每种材料，“容许温度”限定了直到该温度，所述材料是功能性的并且能够展示特有特征的温度；高于所述容许温度，所述特有特征以不可逆的方式丧失功能。展示特有特征的能力被理解为包括可逆性失活；因此，高于特定温度，所述材料可不再是功能性的，但一旦温度再次降低，就恢复为功能性的。因此，术语“容许温度”涵盖情况为可逆性失活的热条件。对于考虑的每种材料，在高于该温度则发生不可逆改变的温度被称作“最大容许温度”。术语“耐热性”和“耐热的”是指相对于第二材料，第一材料在第二材料不耐热的温度下，耐受其化学和/或物理结构中的不可逆改变的性质。
涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的一个方面是一种含水组合物，其包含(一种或多种)纯化的具有生物活性的耐热多肽，和(一种或多种)纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。
如本文公开的所有方面的进一步的实施方式是如本文公开的含水组合物用于指示所述耐热多肽的存在的用途，所述多肽包含在所述组合物中。如本文公开的所有方面的又一个具体实施方式是如本文公开的含水组合物用于额外地指示所述组合物没有暴露于高于所述不耐热的水溶性物质的最大容许温度的温度的用途，所述物质包含在所述组合物中，其中在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，并且其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。如本文公开的所有方面的又另一个具体实施方式是如本文公开的含水组合物用于额外地指示所述组合物暴露于高于所述不耐热的水溶性物质的最大容许温度的温度的用途，所述物质包含在所述组合物中，其中在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，并且其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。xyz。
重要的是，所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。在如本文公开的所有方面的具体实施方式中，在所述多肽的容许温度下，所述多肽具有生物活性，或所述多肽的生物活性被可逆地阻断。按照上文所述的“容许温度”的理解，所述多肽的物理-化学状态与展示或获得允许功能(在此方面为生物功能)的构象相容。因此，在如本文公开的所有方面的具体实施方式中，直到所述多肽的最大容许温度，所述多肽具有生物活性，或所述多肽的生物活性被可逆地阻断。因此，在如本文公开的所有方面的更具体的实施方式中，高于所述多肽的最大容许温度，所述多肽没有生物活性，并且所述多肽的生物活性被不可逆地阻断。
如上文已经提到的，在如本文公开的组合物中，所述物质的最大容许温度低于所述多肽的最大容许温度。功能构象依赖于容许温度。只有处于功能构象，所述物质才吸收光和/或显示荧光。在如本文公开的所有方面的又另一个具体实施方式中，在所述物质的容许温度下，所述物质处于功能构象并且吸收光和/或显示荧光，前提是所述物质没有暴露于高于所述物质的最大容许温度的温度。因此，在如本文公开的所有方面的进一步的具体实施方式中，直到所述物质的最大容许温度，所述物质处于功能构象并且吸收光或显示荧光，前提同样是所述物质没有暴露于高于所述物质的最大容许温度的温度。因此，在如本文公开的所有方面的更具体的实施方式中，高于所述物质的最大容许温度，所述物质的构象不可逆地改变，从而变成功能失常的。
有利地，具有生物功能的多肽的容许温度的范围与水溶性物质的容许温度的范围重叠，在容许温度下处于功能构象的所述水溶性物质吸收光和/或显示荧光。因此，涉及本文公开的所有其他方面和实施方式的进一步方面是一种含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽，和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度，其中所述物质的最大容许温度是所述多肽的容许温度。
通过非容许温度使物质失活可遵循不同的动力学。在应用达到高于所述物质的最大容许温度的温度变化后，所述物质开始丧失其功能构象，从而丧失吸收光或显示荧光的能力。这种功能丧失可以快或慢，在后一种情况下导致逐步的变化。在分子水平上，将存在单分子的所述物质，其最大部分将是不可逆地功能失常的；同时，取决于使用非容许的高温进行温育的时间间隔并且取决于温度本身，一小群保留功能的剩余的物质分子可存在至少一小段时间。例如，在仅稍高于所述物质的最大容许温度的非容许温度下温育非常短的时间间隔，可使一定部分的所述物质保留功能。有利地，并且在如本文公开的所有方面的另外的具体实施方式中，选择所述不耐热物质，以使在高于所述物质的最大容许温度的温度下，所述组合物中的75%或更高的所述物质的吸收光和/或显示荧光的能力被不可逆地阻断。如果在逐步失活的情况下，在短时间间隔后温度再次降低至所述物质的容许温度的范围内的温度，具有功能构象的剩余物质将仍能够吸收光或显示荧光。因此，在如本文公开的所有方面的进一步具体实施方式中，相对于对所述多肽和所述物质二者容许的第一温度，在高于所述第一温度并且高于所述物质的最大容许温度的第二温度下：(a) 所述多肽的50%或更多的生物活性存在或被可逆地阻断，并且(b) 75%或更多的所述物质具有功能失常的构象。更具体地，在第二温度下，所述多肽的至少一定量的生物活性存在或被可逆地阻断，所述量选自55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%和95%。甚至更具体地，在第二温度下，至少一定量的所述物质具有功能失常的构象，所述量选自80%、85%、90%、95%和100%。因此，在第二温度下，所述组合物中的至少一定量的所述物质的吸收光和/或显示荧光的能力被不可逆地阻断，所述量选自75%、80%、85%、90%、95%和100%。
选择具有生物活性的多肽，以使其在所述物质的容许温度范围内是耐热的。重要的是，所述具有生物活性的多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。在如本文公开的所有方面的非常有利的具体实施方式中，具有生物活性的多肽起源于嗜热生物。嗜热生物是嗜极端生物(extremophile organism)，其在约40℃和约120℃之间的相对高的温度下存在。嗜热生物区别于嗜温生物。很多嗜热生物是古细菌，但嗜热真细菌是已知的。嗜热生物通常见于地球的各种地热地区，例如温泉和深海热液喷口，以及腐烂的植物物质，如泥炭沼泽和堆肥中。与其他类型的细菌不同，嗜热生物可以在热得多的温度下存活，而如果暴露于相同的温度，其他细菌会受到损伤并且有时会被杀死。作为其存活的先决条件，嗜热生物包含能够耐受高温并且甚至在高温下发挥作用的酶。这些酶中的一些以分离的形式用于分子生物学中，例如用于PCR的热稳定DNA聚合酶。在如本文公开的所有方面的具体实施方式中，具有生物活性的多肽是酶，更具体地是具有模板依赖性RNA或DNA聚合酶的活性的酶。
考虑对于目标分子的任何生物活性，在如本文公开的所有方面的进一步具体实施方式中，所公开的任何组合物进一步包含作为所述酶的底物或所述酶的辅助底物的分子。更具体地，在生物化学和分子生物学中，底物是酶作用于其上的分子。酶催化涉及一种或多种底物的化学反应。在单一底物的情况下，底物结合酶的活性位点，并且形成酶-底物复合物。底物转化成一种或多种产物，其随后从活性位点释放。随后，活性位点可以自由地接受另一底物分子。在多于一种底物的情况下，这些底物可以以具体的顺序结合活性位点，然后一起反应以产生产物。在此方面，辅助底物(有时也称作辅酶)可以存在于一些酶-催化的反应中。辅助底物本身不具有催化活性，但辅助酶以显示其催化活性。辅助底物通常充当辅助物质，因为它为酶催化的生化反应提供转移位点，并且因为它通过所述酶与底物一起反应。
在具体实施方式中，包含在如本文的所有方面和实施方式中公开的组合物中的底物是核酸，更具体地是能够被模板依赖性RNA或DNA聚合酶加工的核酸或其功能等价物，甚至更具体地是DNA或RNA分子，其任选地包含一个或多个可检测的标记，甚至更具体地是双链、单链或其混合的构象。在此方面，进一步包含的是含有可检测的标记(例如但不限于生物素残基、地高辛残基或荧光团)的DNA或RNA分子。在此方面，进一步包含的是含有核苷类似物(例如但不限于二脱氧核苷)和包含可检测的标记(例如但不限于地高辛残基或荧光团)的核苷的DNA或RNA分子。进一步地，在更具体的实施方式中，底物是核苷三磷酸、脱氧核糖核苷三磷酸，或其功能等价物。在此方面，其功能等价物能够被酶(即模板依赖性RNA或DNA聚合酶)加工。这样的功能等价物包括包含可检测的标记(例如但不限于生物素残基或荧光团)的核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸。
在如本文公开的所有方面和实施方式中，在容许温度下处于功能构象的纯化的不耐热的水溶性物质吸收光，具体是可见光，更具体是在380 nm至750 nm波长范围中的光，甚至更具体地是在500 nm至650 nm的波长范围中的光。已经发现有利的不耐热的水溶性物质包含多肽组分和任选的发色团。因此，具有极大的优势并且在如本文公开的所有方面的具体实施方式中，所述物质包含细菌视紫红质或其功能变体或衍生物。
耐热的/不耐热的：所述对象耐热多肽(例如酶)和可溶的不耐热染料，即在纯化的不耐热的水溶性物质(在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光)的实施方式中，通过涉及在不同温度下其各自的功能状态的不同特异性质而表征。基本上，所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。处于其非变性形式，即处于其功能构象的不耐热染料能够吸收可见光。非变性形式在容许温度下存在，其允许染料以与其光吸收性质相容的化学和/或物理状态存在。一旦温度上升高于最大容许温度，所述染料不可逆地丧失其吸收可见光的能力。选择根据本公开的含水组合物中的不耐热染料的阈值温度，使其处于所述含水组合物中的耐热多肽(例如耐热酶)的功能性温度范围之内。在具体实施方式中，所述不耐热染料在如下的温度范围中不可逆地丧失其吸收可见光的能力，而在所述温度范围中，组合物中的耐热酶仍具有活性或仅被可逆地抑制，但没有以大量的相对量被不可逆地变性。
在如本报告中公开的所有方面的具体实施方式中，所述不耐热染料是不耐热的细菌视紫红质。通用术语“细菌视紫红质”(= BR；Trivedi S.的综述Recent Patents on DNA& Gene sequences 5 (2011) 35-40)是指主要见于盐杆菌(古细菌)的紫膜中的整合膜蛋白。从细菌生物质纯化的这种蛋白吸收绿光(波长500-650 nm，在约568 nm具有吸收最大值)，并且将其转化成在细菌中用于ATP生产的电化学梯度。共价结合在BR的结合位点中的辅因子视黄醛已经被大量的不同化学结构代替，并且由此获得的修饰性质包括颜色和光化学行为。依赖于功能性视黄醛类似物中的共轭双键的数量，可以产生具有在可见和近红外区的几乎任何吸收特征的材料(Oesterheld D.等人，Quarterly Reviews of Biophysics24 (1991) 425-478)。进一步地，BR的多肽部分已经是分子设计的对象，例如，以改变BR分子的表面的某些特征(Mitra K.等人，Protein Engineering 15 (2002) 485-492)。考虑到已经对细菌视紫红质，其功能变体和等价物描述的不同物理和化学构象，根据本公开的理解是功能构象对应于能够在容许温度下吸收光的不耐热的构象。
BR的三维三级结构类似于脊椎动物视紫红质的三维三级结构。BR具有典型的亚视黄基蛋白结构，其中存在7个跨膜α螺旋并且一个视黄醛包埋在其中。发色团通过席夫碱键共价连接至赖氨酸残基。视紫红质和细菌视紫红质的功能是不同的，并且其氨基酸序列中几乎没有同源性。据报道，BR在没有盐的情况下稳定，耐受大多数蛋白酶的降解，长期保持光化学性质，在0℃和45℃之间在pH范围1-11发挥作用，并且在水中耐受高于80℃的温度，且在干燥时耐受高至140℃的温度(Trivedi S.，同上)。分离BR的方法是本领域熟知的，并且在本文中以非限定性的方式通过实施例1例示。其他方法报道例如在Seyedkarimi, M.-S.等人，Extremophiles 19 (2015) 1021-1028中。由于同样的理由，涉及关于如本文公开的所有方面的纯化细菌视紫红质的具体实施方式涵盖具有从广古菌(Euryarchaeota)的成员的培养的生物细胞质分离的细菌视紫红质的溶解的膜囊泡，例如作为包含细菌视紫红质的紫膜囊泡从剩余的生物质分离。出于本公开的目的，细菌视紫红质和/或紫膜囊泡的制品不必作为质子转运系统发挥作用，而是只要在容许温度下处于功能构象的这种材料吸收光，并且只要这种材料是不耐热的，在技术上就足够了，如本文笼统地对于在容许温度下处于功能构象，吸收光的物质所描述的，其中所述多肽(例如所述耐热酶)的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。
在如本报道中公开的所有方面的又更具体的实施方式中，所述不耐热染料，即所述不耐热的水溶性物质(在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光)是来自盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarum，也称作盐生盐杆菌(Halobacterium halobium))的细菌视紫红质。在文献中，这种具体的不耐热BR已经在一定程度上被描述为细菌视紫红质的第一实例。通过差示扫描量热法，Jackson, MB & Sturtevant JM Biochemistry 17 (1978)911-915报道了从盐生盐杆菌分离的紫膜的两种跃迁态，一种在约80℃ (在文献中也称作预跃迁)，并且另一种在约95℃-100℃ (主跃迁)。在0℃至75℃没有看到跃迁。在随后的研究中，Cladera J.等人(Eur. J. Biochem. 207 (1992) 581 -585)发现紫膜中的主要热跃迁是由于协同构象变化造成的，其涉及静电和氢键相互作用的网络的破坏。BR的热跃迁被描述为伴随着由于共价连接至BR多肽中的结合位点的视黄醛席夫碱的水解而导致的脱色。实际上，BR的热漂白是BR多肽的不可逆变性，与辅因子视黄醛的共价键的分解，并且由此丧失介导颜色的辅因子的结果。
一方面，来自古细菌紫膜的天然(即非变性) BR可以用作能够吸收可见光的水溶性染料。关于具有耐热的核苷酸聚合酶的反应混合物，意外地发现相对于核苷/脱氧核苷三磷酸和DNA或RNA聚合酶，BR表现为惰性成分。此外，来自BR的光诱导漂白的任何产物，即丧失功能并且涉及光吸收功能失常形式的BR (特别是来自盐沼盐杆菌的细菌视紫红质)，不干扰DNA或RNA聚合酶，并且也不干扰所述酶与核苷/脱氧核苷三磷酸的相互作用；进一步地，关于与模板核酸的酶/底物相互作用，没有可检测的抑制性作用。
在如本文公开的所有方面和实施方式中，在容许温度下处于功能构象的纯化的不耐热的水溶性物质显示荧光。在如本文公开的所有方面的具体实施方式中，所述物质的荧光具有在350 nm至700 nm的范围内的发射波长。在如本文公开的所有方面的又另一个具体实施方式中，在使用具有300 nm至650 nm范围内的波长的光激发后，发射荧光。已经发现有利的不耐热的荧光性物质包含多肽组分和任选的发色团。因此，具有极大的优势并且在如本文公开的所有方面的具体实施方式中，所述物质包含荧光蛋白或其功能变体或衍生物。
耐热的/不耐热的：所述对象耐热多肽(例如酶)和荧光性的可溶的不耐热物质(例如荧光蛋白)，即在纯化的不耐热的水溶性物质(在容许温度下处于功能构象的所述物质显示荧光)的实施方式中，通过涉及在不同温度下其各自的功能状态的不同特异性质而表征。基本上，所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。处于其非变性形式，即处于其功能构象的不耐热的荧光染料能够吸收特定激发波长的光并显示荧光。非变性形式在容许温度下存在，其允许荧光染料以与其光吸收和发荧光性质相容的化学和/或物理状态存在。一旦温度上升高于最大容许温度，所述染料不可逆地丧失其吸收光和/或显示荧光的能力。选择根据本公开的含水组合物中的不耐热荧光染料的阈值温度，使其处于所述含水组合物中的耐热多肽(例如耐热酶)的功能性温度范围之内。在具体实施方式中，所述不耐热荧光染料在如下的温度范围中不可逆地丧失其吸收光和/或显示荧光的能力，而在所述温度范围中，组合物中的耐热酶仍具有活性或仅被可逆地抑制，但没有以大量的相对量被不可逆地变性。
在如本报道中公开的所有方面的又更具体的实施方式中，所述不耐热荧光染料，即所述不耐热的水溶性物质(在容许温度下处于功能构象的所述物质显示荧光)是选自以下的荧光蛋白：绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白/R-藻红蛋白，和红色荧光蛋白/dsRed。
绿色荧光蛋白(GFP)是由238个氨基酸残基构成的蛋白(26.9 kDa)，其在暴露于蓝色至紫外范围的光时，显现亮绿色荧光。尽管很多其他海洋生物具有类似的绿色荧光蛋白，但GFP通常是指首先从水母维多利亚多管水母(Aequorea victoria)分离的蛋白。来自维多利亚多管水母的GFP具有在395 nm波长的主要激发峰，和在475 nm的一个次峰。其发射峰在509 nm，处于可见光谱的较低的绿色部分。来自海肾(Renilla reniformis)的GFP具有在498 nm的单个主要激发峰。在细胞和分子生物学中，GFP基因常用作表达报告子。在修饰的形式中，已经将其用于制造生物传感器，并且已经创造出表达GFP的很多动物，作为基因能够在给定生物体全身表达的概念证明。可以通过繁殖、使用病毒载体注射或细胞转化，将GFP基因引入到生物体并保持在其基因组中。增强型绿色荧光蛋白(EGFP)从转化的大肠杆菌(E. coli)重组表达并纯化。重组的EGFP (Gene Bank登录号U57607)是具有293个氨基酸的32.7 kDa单体，包括任选的His-标签。重组EGFP的激发和发射谱与从维多利亚多管水母纯化的GFP相同，其中激发/发射波长分别为488和507 nm。EGFP是商购可得的，例如来自BioVision, Inc., Milpitas, CA (USA)，目录号#4999-100。黄色荧光蛋白(YFP)从转化的大肠杆菌重组表达并纯化。所述蛋白是具有238个氨基酸的26.4 kDa单体，激发/发射波长为525和538 nm。YFP是商购可得的，例如来自BioVision，目录号#4998-100。蓝色荧光蛋白(BFP)从转化的大肠杆菌重组表达并纯化。所述蛋白是具有259个氨基酸的29 kDa单体，包括任选的His-标签，等电点：6.17。激发波长为308 nm至383 nm；发射波长为440至447 nm。BFP是商购可得的，例如来自BioVision，目录号#4994-100。青色荧光蛋白(CFP)从转化的大肠杆菌重组表达并纯化。所述蛋白是具有284个氨基酸的31.3 kDa单体，包括任选的His-标签，激发/发射波长分别为458 nm和480 nm。CFP是商购可得的，例如来自BioVision，目录号#5986-100。红色荧光蛋白/dsRed从转化的大肠杆菌重组表达并纯化。所述蛋白是包括任选的His-标签的27.6 kDa单体，激发/发射波长分别为557和585 nm。红色荧光蛋白/dsRed是商购可得的，例如来自BioVision，目录号#4997-100。红色荧光蛋白/R-藻红蛋白(R-PE)是从红藻分离的非常明亮的藻胆蛋白，其显示极端亮红-橙色的荧光，具有高的量子产率。R-PE由a、b和g亚基组成，并且作为(ab)6g存在。R-PE和密切相关的B-PE (B-藻红蛋白)是具有橙色荧光的最强的荧光藻胆蛋白。R-PE是常用于基于荧光的检测的大分子，包括在缀合物中。红色荧光蛋白/R-藻红蛋白是商购可得的，例如来自BioVision，目录号#6005-1。
在如本文公开的所有方面的另一具体实施方式中，报道了一种含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽，和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度，其中所述组合物进一步包含多种不同的纯化的不耐热的水溶性物质，并且其中所述多肽的最大容许温度高于每一种所述物质的最大容许温度。在如本文公开的所有方面的更具体的实施方式中，至少在容许温度下处于功能构象的第一物质吸收光，并且至少在容许温度下处于功能构象的第二物质显示荧光。在此方面非常有利并且具有高实用性的是一种含水组合物，其包含(一种或多种)纯化的具有DNA和/或RNA聚合酶活性的耐热的模板依赖性酶，不耐热的荧光蛋白和不耐热的细菌视紫红质作为所述组合物中的染料。在这样的具体实施方式中，在所述酶的容许温度下，所述酶具有生物活性，或所述酶的生物活性被可逆地阻断。所述酶(或可以存在于所述组合物中的多种耐热酶)的容许温度的范围在所述荧光蛋白的最大容许温度和细菌视紫红质的最大容许温度二者之上延伸。因此，相对于对所述酶和所述染料二者容许的第一温度，在高于所述第一温度并且高于所述染料的最大容许温度的第二温度下：(a) 所述酶的50%或更多的生物活性存在或被可逆地阻断，并且(b) 75%或更多的每一种染料具有功能失常的构象。更具体地，在第二温度下，至少一定量的每一种染料具有功能失常的构象，所述量选自80%、85%、90%、95%和100%。
在如本文公开的所有方面的又进一步的具体实施方式中，将所述含水组合物放在一个或多个反应容器中，特别是微孔板形式的多个反应容器中。在如本文公开的所有方面的更具体的实施方式中，所述含水组合物包含一种或多种具有DNA和/或RNA聚合酶活性的耐热酶，并且将包含所述含水组合物的一个或多个容器放置在实时PCR仪器中。xyz。
使用温度变化启动的生化或分子生物学反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)。PCR是通过以下的循环产生多个拷贝的DNA片段的方法：(1) 变性(热诱导的双链DNA至单链的分离)，(2) 退火(特异性引物在目标片段任一末端的结合)；和(3) 延伸(通过使用DNA聚合酶并入核苷三磷酸(dNTPs)，在目标片段上的引物序列的延伸)。随后，可以将对于固定数量的循环(例如30个或更多)，在每个循环加倍的扩增产物(PCR产物)进行进一步的测试。由于变性步骤(1)需要温度变化，PCR通常使用源自于嗜热生物的耐热DNA聚合酶进行，所述嗜热生物例如但不限于水生栖热菌(Thermus aquaticus)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)，和海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis)。
终点测定法测量在末次PCR循环结束时累积的PCR产物的量，而实时聚合酶链式反应(实时PCR)监测在PCR发生的过程期间(即实时)的PCR产物的扩增。因此，在整个PCR过程(在固定数量的循环期间)，而不是在末次循环之后，在PCR结束时(即终点)，收集数据。在实时PCR中，通过在循环期间首次检测到PCR产物的扩增时的时间点，而不是在固定数量的循环后累积的PCR产物的量，来表征反应。核酸目标的起始拷贝数量越高，越快地观察到PCR产物扩增的指示剂的显著增加。
存在多种不同的技术可能性，以在实时PCR中提供PCR产物扩增的指示剂的效果。通常并且本领域熟知的，指示剂是基于荧光的光信号。在实时PCR过程期间被监测的荧光可以使用独立于目标序列的非特异性检测方法来检测，例如通过在结合dsDNA时具有特殊荧光性质的荧光染料(例如SYBR® Green I或其他嵌入染料)，或通过使用序列特异性荧光寡核苷酸探针；即序列特异性方法(例如TaqMan®水解探针，Molecular Beacons)来检测。
存在多种不同的商购可得的仪器，来进行实时PCR，即实时PCR热循环仪。实时PCR热循环仪的基本部件是用于进行温度循环的热系统，与用于捕获产生的荧光的系统组合的用于发射激活荧光团所必需的光的光学系统，以及用于控制仪器操作，以及收集和分析产生的数据的软件。
实时PCR热循环仪中的光学系统包含两个主要部件：用于激发一种或多种荧光染料的光源，和用于监测发射的荧光的检测器。激发光源可以分成广谱和窄谱。在广谱中，可以使用光源滤镜，将光缩窄至对于具体荧光团适合的波长范围。其他仪器采用窄谱光源，包括激光和发光二极管。光学系统的检测器部件记录从报告荧光团发射的光。大多数系统使用光电倍增管(PMTs)、光电二极管或电荷耦合器件(CCS)相机。CCD相机可以同时记录所有的孔，产生更强的机械设计，而光电二极管和PMT都一次记录一个点。一些仪器利用多个光电二极管和PMT，这减少了移动部件的数量。检测的通道数量通常在1个和6个之间。
用于实时PCR的仪器中的每个通道通过限定的光谱波长间隔表征，并且具有其对应的光源、滤镜组和检测器。选择检测的通道的波长间隔，以匹配对应的荧光染料的光发射。也就是说，在多通道仪器中，理想地，来自具体染料的荧光仅在单个通道并且不在另一通道中检测。具体地，多重PCR方法，例如基于TaqMan®探针以及基于FRET (荧光共振能量转移)的系统，通常使用荧光染料进行，例如但不限于FITC、JOEL、ROX、HEX、TAMRA、TexasRed、Quasar 705和Cy5，并且在具有多个光学通道的仪器中使用。
用于进行实时PCR的很多仪器针对特异染料进行优化。递送的一些平台对某些染料是预校准的，并且因此使用这些具体染料显示最佳的性能，但也可以使用具有相似激发和发射波长的染料。对于一些平台，在使用所述仪器前有必要进行校准。
通常，PCR且特别是实时PCR在一个或多个小瓶(管)中进行。可以将小瓶以复数提供并集中在阵列中，也称作微孔或多孔板。与循环仪平台一起使用的多重反应小瓶有不同的格式。可得仪器中的几种使用标准的96孔板格式。进一步地，存在提供使用384-和/或1536-孔板的可能性的系统，有时在如用于96孔板格式的相同系统中。此外，具有多至48孔的平台正在商业化，提供了操作单个管(小瓶)和使用96孔板之间的中间方案。
在启动反应之前，必须将包含单个反应的必要组分的试剂组合在每个小瓶中。所述试剂通常作为水溶液提供，其可含有模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、核苷三磷酸(或其功能类似物)、标记的寡核苷酸、嵌入染料、缓冲剂、盐，和其他化合物。通常，在添加到PCR反应混合物之前，将某些成分组合(“预混合”或“预混的”)。为此的实例是所谓的“主混合物”。PCR“主混合物”以预混且优化的格式提供了进行PCR所需的多种成分，其改善并简化了PCR工作流程。商购可得的典型示例性主混合物含有DNA聚合酶、盐、镁或其他二价离子、dNTPs和优化的反应缓冲剂。为了形成适合于进行PCR的完整反应混合物，仅需要添加模板DNA和引物。
本公开报道了一种含水组合物，其包含耐热多肽，例如但不限于酶，和可溶的不耐热染料，其中处于其功能性，非变性形式的所述不耐热染料能够吸收可见光。如本文公开的指示剂染料被有利地用作将不同试剂组合在将暴露于温度变化的反应混合物中的方法(特别是手动进行的方法)中的视觉对照。在应用温度变化之前，作为试剂的一部分的不耐热的指示剂染料以可见的方式对人眼指示所述试剂的存在。因此，在将两种或更多不同无色水溶液组合以形成反应混合物时，可以目测检验是否存在一种组分，即包含指示剂染料的一种组分。因此，本公开提供了在将不同试剂组合以形成反应混合物的过程中，检验第一组分的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 提供作为分离的水溶液的所述反应混合物的两种或更多的组分；(b) 将第一染料与第一组分混合；(c) 将第二组分与染色的第一组分混合，并检测所述混合物中的第一染料，从而检验所述第一组分在所述混合物中的存在。在要手动制备大量的反应混合物时，这样的方法是特别有用的。在示例的情况下，存在对应于多种期望的反应混合物的多个反应容器。在液体操作的第一步，特别是手动移液中，将组分A的水溶液添加到每个容器中。在这个阶段，目测或其他对照可以在未加工的空容器和已经包含组分A的等分试样的容器之间进行区分，而没有太大的困难。在液体操作的后续步骤中，添加组分B。具体地，在组分A和B的添加体积与单独的组分A的体积没有显著差别的情况下，用以监测手动液体操作的任何错误的具体目测对照是一项挑战，并且可能产生一定数量的可能最终缺少组分B的反应容器。也就是说，可以没有意识到导致容器中缺少组分B的移液错误。在两种组分的体积如此之小，具体以至于人眼不能清楚地区分作为一方面的第一和第二组分的添加体积，和作为另一方面的单独的第一组分的体积的情况下，相同类型的错误是可能的。可以通过向一个组分(具体地向需要目测或基于染料检测的其他方式来识别其存在的组分)添加染料，以避免这样的错误来源。
在存在待添加至混合物的另外的基本组分的情况下，用作所述另外组分的成分的另外的(第二)染料可以提供技术上的优势，用于检验所述另外组分在混合物中的存在的目的。然而，对于这个目的，需要能够在第一染料的存在下确定另外的染料。因此，本公开提供了在将不同试剂组合以形成反应混合物的过程中，检验第一和第二组分的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 提供作为分离的水溶液的所述反应混合物的三种或更多的组分；(b) 将第一组分与第一染料混合，并且将第二组分与第二染料混合；(c) 将第三组分与染色的第一组分混合，并且任选地检测所述混合物中的第一染料，从而检验第一组分在所述混合物中的存在；(d) 将染色的第二组分与步骤(c)的混合物混合，并任选地检测所述混合物中的第二染料，从而检验第二组分在所述混合物中的存在；(e) 除非已经在步骤(c)和/或(d)中进行，检测步骤(d)的混合物中的第一和/或第二染料，从而检验第一和第二组分的存在。重要的是，必须选择染料，以使每种染料的检测可以独立于另一种的检测发生。因此，第一染料必须不完全掩盖第二染料，并且反之亦然。
所提及的不同组分是作为水溶液提供的试剂，其组合以形成反应混合物。也就是说，不同的试剂包含反应配搭物，其在允许发生反应的条件下，在混合物中彼此组合时，可以参与反应。
如上文所述，涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的一个方面是根据本公开的含水组合物用于指示所述耐热多肽的存在的用途，所述多肽包含在所述组合物中。涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的又进一步的方面是在将多个组分组合以形成混合物的过程中，检验第一组分的存在并且任选地检验另外的组分的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 提供作为分离的水溶液的所述混合物的两种或更多的组分，其中所述组分之一包含纯化的具有生物活性的耐热多肽；(b) 选择第一组分，并使用第一纯化的不耐热的水溶性物质将所述第一组分染色，在容许温度下处于功能构象的所述第一物质吸收光和/或显示荧光，其中步骤(a)的所述多肽的最大容许温度高于所述第一物质的最大容许温度；(c) 任选地选择另外的组分，并使用另外的纯化的不耐热的水溶性物质将所述另外的组分染色，在容许温度下处于功能构象的所述另外的物质吸收光和/或显示荧光，其中步骤(a)的所述多肽的最大容许温度高于所述另外的物质的最大容许温度；(d) 将所述两种或更多的组分混合；(e) 评估在步骤(d)中获得的混合物中的所述第一纯化的不耐热的水溶性物质的功能构象，从而检验所述第一组分在所述混合物中的存在；(f) 任选地评估在步骤(d)中获得的混合物中的另外的纯化的不耐热的水溶性物质的功能构象，从而检验相应的另外的组分在所述混合物中的存在；由此在将不同试剂组合以形成混合物的过程中，检验第一组分的存在，并且任选地检验另外的组分的存在。
在具体实施方式中，所述步骤(d)的混合物包含步骤(a)的纯化的具有生物活性的耐热多肽，步骤(b)的物质，和任选的步骤(c)的另外的物质。在进一步的具体实施方式中，所述步骤(d)的混合物是水溶液。更具体地，所述具有生物活性的耐热多肽是具有DNA和/或RNA聚合酶活性的模板依赖性酶。在又另一个具体实施方式中，所述步骤(a)至(f)在低于所述物质的最大容许温度的温度并且没有温度变化的情况下进行，从而使所述第一物质和任选的另外的物质保持功能构象。在又进一步的具体实施方式中，第一物质是不耐热的荧光蛋白并且第二物质是不耐热的细菌视紫红质。此外，在进一步的具体实施方式中，所述步骤(e)和(f)中的任一项包括通过目视检查、比色测量和荧光测量中任一种的评估。在进一步的具体实施方式中，所述方法进一步包括通过应用高于所述物质的最大容许温度的温度加工步骤(d)的组合物的额外步骤(g)，其中所述第一物质和任选的另外物质的构象被不可逆地改变，从而变成功能失常的。在又进一步的具体实施方式中，所述方法进一步包括光学评估的额外步骤(h)，具体地通过目视检查、比色测量和荧光测量中任一种的评估。
附图描述
图1：qPCR主混合物中的不耐热蛋白染料的可视化和变性。
A) 在变性前，YFP在20 µL Roche Multiplex DNA Master中的系列稀释物的图像。
B) 在95℃ 30秒后，如小图A中所示的相同平板的图像。
C) 在变性前，BR在20 µL Roche Multiplex DNA Master中的系列稀释物的图像。B) 在95℃ 30秒后，如小图C中所示的相同平板的图像。
D) 在变性前，所示的藻胆蛋白在20 µL Roche Multiplex DNA Master中的系列稀释物的图像。B) 在95℃ 30秒后，如小图E中所示的相同平板的图像。
图2：不耐热的可视化染料在qPCR主混合物中的荧光/吸光性质。在图中，荧光强度通过y-轴表示，x-轴表示温育时间。
A) 在465-510 nm波长的检测通道中，量化20和10 µg的YFP。
B) 在533-610 nm波长的检测通道中，作为吸光度测量的500和1000 µg的BR。
C) 在533-580 nm波长的检测通道中，从2000 µg至125 ng的R-PE的两倍连续稀释物。
D) 在618-660 nm波长的检测通道中，从2000 µg至125 ng的APC的两倍连续稀释物。
E) 在618-660 nm波长的检测通道中，从2000 µg至125 ng的C-PC的两倍连续稀释物。
图3：双重qPCR性能没有受到YFP或BR的显著影响。在两个图中，荧光强度通过y-轴表示，x-轴表示PCR循环的数量。
A) 在存在(绿色，蓝色曲线)或不存在(红色) YFP/BR混合物的情况下，量化β-珠蛋白基因表达的FAM检测通道反应。无模板的对照以紫色显示。
B) 来自相同双重反应的HEX检测通道中的Px002测定。
实施例
实施例1
本发明提供了一种含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽，和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。为了选择示例性的不耐热的水溶性物质，测试了对人眼可见的多种候选蛋白。具体地，评估了它们作为适合用于qPCR (定量聚合酶链式反应)主混合物的不耐热的可视化染料的用途。
根据本发明，如在上述含水组合物中提供的不耐热的水溶性物质允许使用者容易地确定标准的96-或384-孔测定板中所有加载的孔。因为所提供的不耐热的水溶性物质在PCR (或者，在具体实施方式中为qPCR (定量PCR))的初始加热步骤期间变性，这样的染料将不干扰可在DNA/RNA测定(特别是实时PCR测定)的过程中生成的荧光信号。这种技术效果是超出本领域已知的其它加载和/或归一化染料(例如专利蓝V或Rox染料)的区别特征和益处。现有技术的染料的发射谱与用于检测可在PCR的过程中生成的荧光信号所需要的仪器检测通道的目标波长部分或完全重叠。部分或完全的重叠限制了方法中的多重化。此外，因为在具体实施方式中，不耐热的水溶性物质是荧光蛋白，这种性质使热循环仪控制软件能够自动检测平板中加载的孔。在另一实施方式中，可以通过使用多种不耐热物质的“条码”组合，确定样品中的具体DNA或RNA测定，所述多种不耐热物质是荧光性的并且可以在热循环仪的不同检测通道单独地检测。
实施例2
以根据本发明的组合物中的不耐热的水溶性物质为例，选择三个蛋白家族用于研究：源自维多利亚多管水母的绿色荧光蛋白(GFP)，来自嗜盐的古细菌盐沼盐杆菌的细菌视紫红质(BR)，和从深海藻类分离的藻胆蛋白，如R-藻红蛋白(R-PE)、别藻蓝蛋白(APC)和c-藻蓝蛋白(C-PC)。使用Roche Multiplex DNA Master的20 µL反应中的纯化蛋白的系列稀释物进行初步工作，以测定通过肉眼看到混合物所需的可视化染料的量。随后，将这些反应加热至95℃，进行30秒以模拟在qPCR启动时的初始变性保持，并且测量在这些条件下着色蛋白如何完全变性。图1显示了使用黄色荧光蛋白(YFP，GFP的突变衍生物)的反应的系列稀释物和随后变性的可视化。图2说明了BR在相同条件下的性能，而图3显示了在使用R-PE、APC或C-PC作为可视化染料时的结果。
所有三个蛋白家族都成功地通过目测方式区分了包含具有添加剂(所述不耐热的水溶性物质作为孔中的主混合物的存在的指示染料)的主混合物的孔与不含添加剂的孔以及空的孔。对于可视化，YFP需要的蛋白最多，在20 µL反应中需要最少140 µg以清楚地看到黄色(图1)，并且在添加多于200 µg的YFP时，颜色在95℃ 30秒没有完全消失(图1B)。使用BR，在2.5和5 µg之间的水平达到可视化(图1C)，并且对于测试的所有样品，紫色有效地消失(图1D)。最后，向主混合物添加仅纳克的蛋白，藻胆蛋白即清楚可见：R-PE在少至250-500ng可见，APC在500和1000 ng之间是可区分的，并且C-PC在低至500 ng水平呈清楚的蓝色(图1E)。一般地，对于藻胆蛋白，在低于1 µg的水平，使用95℃，30秒的热脉冲，颜色发生变性。
实施例3
随后，通过在Roche LightCycler 480 II qPCR仪器上的荧光/吸光度，测试候选视觉染料的不耐热性质。使用对于具体目标蛋白适合的滤镜，测量在20 µL Multiplex DNAMaster反应中的染料的初始荧光：YFP (465-510 nm)、BR (仅吸光度，533-610)、R-PE(533-580)、APC (618-660)和C-PC (618-660)。如前所述，使用在95℃保持30秒，使蛋白染料变性。图2显示了这些实验的结果。对于具有YFP (图2A)或R-PE (图2C)的反应，使用变性脉冲使荧光信号降低至基线。APC (图2D)和C-PC (图2E)看到强的荧光信号降低，但通过加热没有消除，并且尽管注意到BR的吸光度降低的趋势(图2B)，但这个信号没有与背景噪音清楚地区分。
实施例4
对于用于DNA或RNA主混合物的所有可能的视觉染料添加剂(即如根据本发明的含水组合物中提供的不耐热的水溶性物质)，qPCR性能必须不受染料添加剂的存在的不利影响。我们首先使用20 µL Multiplex DNA Master反应中的BR (7.5 µg)和YFP (200 ng)的混合物，对此进行了测试。这些反应含有用于双重反应(在FAM通道中检测β-珠蛋白基因表达，并且在HEX通道中检测合成转录物Px002)的目标模板DNA和寡核苷酸。图3显示了这种视觉染料的混合物没有改变qPCR反应的Cp (交叉点)或显著影响曲线形状或平台高度，表明在所测试的水平的BR和YFP的存在或不存在的情况下等同的性能。类似地，在图4中我们使用相同的双重测定测试了400 ng的R-PE添加剂，并且同样观察到对Cp、曲线形状或RFI平台高度没有影响。

Claims (18)

1.一种用于聚合酶链式反应(PCR)的含水组合物，其包含纯化的耐热的模板依赖性RNA或DNA聚合酶和纯化的不耐热的来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物，所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶在高达至少95℃具有生物活性，在0℃至75℃的容许温度下处于功能构象的所述来自盐沼盐杆菌的细菌视紫红质或其功能性衍生物吸收光和/或显示荧光并且在不可逆变性后不吸收光和/或显示荧光，其中所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶的最大容许温度高于所述来自盐沼盐杆菌的细菌视紫红质或其功能性衍生物的最大容许温度。
2.根据权利要求1的含水组合物，其中在所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶的容许温度下，所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶具有生物活性，或所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶的生物活性被可逆地阻断。
3.根据权利要求1-2中任一项的含水组合物，其中所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶起源于嗜热生物。
4.根据权利要求1-2中任一项的含水组合物，其中在容许温度下处于功能构象的所述纯化的不耐热的来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物吸收在500 nm至650 nm波长范围内的可见光。
5.根据权利要求1-2中任一项的含水组合物，其中将所述含水组合物放在一个或多个反应容器中。
6.根据权利要求1-2中任一项的含水组合物，其中将所述含水组合物放在微孔板形式的多个反应容器中。
7.根据权利要求1-2中任一项的含水组合物，所述组合物放在实时PCR仪器中。
8.根据权利要求1-7中任一项的含水组合物用于指示所述纯化的耐热的模板依赖性RNA或DNA聚合酶的存在的用途，所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶包含在所述组合物中。
9.根据权利要求8的用途，其用于额外地指示所述组合物没有暴露于高于所述纯化的不耐热的来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物的最大容许温度的温度，所述来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物包含在所述组合物中，其中在容许温度下处于功能构象的所述来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物吸收光和/或显示荧光，并且其中所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶的最大容许温度高于所述来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物的最大容许温度。
10.一种确定组合物的加工状态的方法，其中所述组合物的加工包括应用温度变化，所述方法包括以下步骤：
(a) 提供根据权利要求1-7中任一项的含水组合物；
(b) 通过应用达到高于所述纯化的不耐热的来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物的最大容许温度的温度的改变，加工步骤(a)的组合物，其中所述来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物的构象被不可逆地改变，从而变成功能失常的；
(c) 通过光学工具评估所述来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物的功能构象；
从而确定所述组合物的加工状态。
11.一种确定组合物的第一未加工状态和第二加工状态的方法，其中所述组合物的加工包括应用温度变化，所述方法包括以下步骤：
(a) 提供根据权利要求1-7中任一项的含水组合物；
(b) 将步骤(a)的组合物保持在低于所述纯化的不耐热的来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物的最大容许温度的温度并且不进行温度变化，从而使所述来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物保持功能构象；
(c) 通过光学工具评估所述来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物的功能构象；
(d) 通过应用达到高于所述来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物的最大容许温度的温度的改变，加工步骤(a)的组合物，其中所述来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物的构象被不可逆地改变，从而变成功能失常的；
(e) 重复步骤(c)；
从而确定所述组合物的第一未加工状态和第二加工状态。
12.一种试剂盒，其包含纯化的具有生物活性的耐热的模板依赖性RNA或DNA聚合酶，和纯化的不耐热的来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物，在0℃至75℃的容许温度下处于功能构象的所述来自盐沼盐杆菌的细菌视紫红质或其功能性衍生物吸收光和/或显示荧光，其中所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶的最大容许温度高于所述来自盐沼盐杆菌的水溶性细菌视紫红质或其功能性衍生物的最大容许温度。
13.根据权利要求12的试剂盒，其中所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶和所述来自盐沼盐杆菌的细菌视紫红质或其功能性衍生物作为混合物存在于单个容器中。
14.在将多个组分组合以形成混合物的过程中，检验第一组分的存在并且检验另外的组分的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 提供作为分离的水溶液的所述混合物的两种或更多的组分，其中所述组分中的第一组分包含纯化的耐热的模板依赖性RNA或DNA聚合酶，其在高达至少95℃具有生物活性；
(b) 选择第一组分，并使用纯化的不耐热的水溶性第一物质将所述第一组分染色，所述第一物质是来自盐沼盐杆菌的细菌视紫红质或其功能性衍生物，并且在0℃至75℃的容许温度下处于功能构象的所述第一物质吸收光和/或显示荧光，其中步骤(a)的所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶的最大容许温度高于所述第一物质的最大容许温度；
(c) 选择另外的组分，并使用另外的纯化的不耐热的水溶性物质将所述另外的组分染色，在容许温度下处于功能构象的所述另外的纯化的不耐热的水溶性物质吸收光和/或显示荧光，其中步骤(a)的所述模板依赖性RNA或DNA聚合酶的最大容许温度高于所述另外的纯化的不耐热的水溶性物质的最大容许温度；
(d) 将所述两种或更多的组分混合；
(e) 评估步骤(d)中获得的混合物中的第一物质的功能构象，从而检验所述第一组分在所述混合物中的存在；
(f) 评估步骤(d)中获得的混合物中的另外的纯化的不耐热的水溶性物质的功能构象，从而检验相应的另外的组分在所述混合物中的存在；
由此在将不同试剂组合以形成混合物的过程中，检验第一组分的存在并且检验另外的组分的存在。
15.根据权利要求14的方法，其中步骤(a)至(f)在低于所述纯化的不耐热的水溶性物质的最大容许温度的温度并且没有温度变化的情况下进行，从而使所述第一物质和另外的纯化的不耐热的水溶性物质保持功能构象。
16.根据权利要求14和15中任一项的方法，其中所述方法进一步包括通过应用高于所述物质的最大容许温度的温度，加工步骤(d)的组合物的额外步骤(g)，其中所述第一物质和任选的另外的物质的构象被不可逆地改变，从而变成功能失常的。
17.根据权利要求16的方法，其中所述方法进一步包括光学评估的额外步骤(h)。
18.根据权利要求17的方法，其中所述方法进一步包括通过目视检查、比色测量和荧光测量中任一种的评估的额外步骤(h)。
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