KR102164504B1 - 반응 혼합물 및 관련 생성물을 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 검정용 반응 혼합물을 제조하는 방법 및 PCR용 용액 세트에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 PCR 검정으로 증폭시키려는 생물학적 샘플을 포함하는 샘플 용액 및 상기 용액에 제 1 컬러를 제공하는 제 1 착색제를 제공하고, 상기 검정을 수행하는데 필요한 하나 이상의 다른 물질을 포함하는 시약 용액 및 상기 용액에 제 1 컬러와 상이한 제 2 컬러를 제공하는 제 2 착색제를 제공하고, 상기 샘플 용액과 제 1 시약 용액을 혼합시켜 PCR 공정으로 처리되는 혼합 용액을 제공하는 것을 포함하며, 혼합 용액은, 상기 제 1 및 제 2 착색제로 인해, 제 1 및 제 2 컬러와 상이한 제 3 컬러를 지닌다. 본 발명은 PCR 검정의 피펫팅을 상당히 돕는다.

Description

반응 혼합물 및 관련 생성물을 제조하는 방법{METHOD OF PREPARING A REACTION MIXTURE AND RELATED PRODUCTS}
본 발명은 (생)화학적 시약의 피펫팅(pipetting)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 특히 정량적 PCR (qPCR) 증폭을 위한 마이크로웰로의 시약의 피펫팅 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 피펫팅을 보조하는 새로운 제품에 관한 것이다.
PCR 반응물을 피펫팅할 때, 모든 필요한 성분들, 즉, 시약들을 반응 튜브에 하나씩 첨가하거나, 바람직하게는 성분들의 적어도 일부를 먼저 마스터 믹스(master mix)로서 합친 다음 이러한 혼합물을 다수의 샘플로 분할함으로써 첨가할 수 있다. 일반적으로 별도로 첨가되어야 하는 성분들 중 하나는 연구 중에 있는 샘플이다. 마이크로역가 플레이트의 샘플, 튜브 또는 샘플 웰의 수는 장치 당 수 백개 또는 심지어 수 천개일 수 있다.
시약을 정확하게, 즉 올바른 순서와 양으로 첨가하는 것은 PCR 뿐만 아니라 다수의 그 밖의 (생)화학적 반응에서 확실한 결과를 수득하는데 결정적이다. 실패한 실험은 시간과 비용의 손실을 초래한다. 경제적인 중요성은 막대할 수 있다. 왜냐하면 구성요소, 플라스틱 용품 및 개인 노동 시간의 낭비 때문이다. 더욱이, 실험 결과를 획득하는데 있어서의 지연은 상당할 수 있다. 이러한 널리 공지된 문제에 대한 다양한 해결책이 있어 왔다.
상기 문제에 대한 기계적인 해결책이 있다. 당 분야에는 샘플 튜브 및 플레이트에 이용되는 다양한 자동화 피펫팅 로봇, 다중채널 피펫 및 유도(guidance) 시스템 (예컨대, 핀지메스(Finnzymes) Piko® Light Plate, BioTx Well Aware™)이 알려져 있다.
수 년간, 피펫팅과 전기영동 진행의 추적을 돕는 일부 가시적 염료를 함유한 이용가능한 PCR 마스터 믹스 또는 완충제가 또한 있어 왔다. 이러한 믹스는 전형적으로 전기영동 겔 로딩을 돕기 위해 용액의 밀도를 증가시키는 일부 성분을 또한 지닌다.
US 6942964호는 겔 로딩 및 추적 염료로도 사용된 피펫팅 보조 염료를 이용한 제품을 기재한다. 착색제가 중합효소에 혼입되었는데, 착색제는 중합효소가 PCR 믹스 또는 마스터 믹스에 피펫팅되었는지를 사용자가 알도록 돕는다. 유사한 제품이 BioLine Accuzyme Red이다.
USB 코퍼레이션의 RubyTaq는아가로스 겔 진행 동안 분리되는 두 개의 염료의 혼합물을 포함하는 중합효소를 특징으로 한다: 마젠타(magenta) (500 bp [2% 겔] 및 1500 bp [0.8% 겔] 사이에서 진행) 및 옐로우(yellow) (10 bp 미만에서 진행).
페르멘타스(Fermentas) 및 프로메가(Promega)는 또한 효소 반응 완충제에 착색제를 첨가하였다. 페르멘타스의 DreamTaq™ Green 반응 완충제는 그린으로서 보여질 수 있지만, 컬러는 겔 전기영동 동안 블루와 옐로우 밴드로 분리된다. 프로메가 GoTaq 및 GoTaq Green 마스터믹스가 유사하게 거동한다.
중합효소에 첨가된 염료가 전기영동 단계를 보조하는 것이 아닌 경우에 이용가능한 제품도 있다. 예로는 ABgene Red® Hot이 있다.
NEB는 DNA 중합효소 반응 완충제에 첨가된 염료 액시드 레드(Acid red)를 특징으로 하는 제품 (Crimson Taq)을 제공한다. 상기 제품은 또한 6% 덱스트란을 밀도 증강제로서 사용한다.
Qiagen의 CoralLoad 염료는 착색되지 않은 마스터 믹스에 첨가하기 위한 분리된 튜브 중의 농축물로서, 그리고 또한 임의의 기성(ready-made) 10x PCR 완충제로서 이용가능하다. 상기 염료는 두 개의 겔 추적 염료 (오렌지 및 레드)를 함유한다.
KR 2002/0045167호는 PCR 성분의 용해를 확인하기 위한 착색제를 함유하는 동결-건조된 PCR 믹스를 기재한다. US 6153412호는 냉동건조된 PCR 시약의 존재를 확인하고 PCR 시약과 시험 샘플의 완전한 혼합을 보장하는데 사용된 동결-건조된 반응 혼합물을 또한 기재한다. 반면, US 5565339호는 반응 혼합물로 용해되지 않은, 핫 스타트(hot start) 왁스 상태의 염료의 사용을 기재한다.
Absolute Blue QPCR 마스터 믹스는 반응 장치에서 피펫팅을 용이하게 하는 비활성 블루 염료를 함유한다.
또한 WO 2007/088506호는 염색된 마스터 믹스를 기재한다.
어플라이드 바이오시스템즈는 qPCR 생성물에 포함된 ROX 패시브(passive) 참조 염료를 지닌다. 염료의 목적은 상이한 반응들간에 그리고 반응 동안 하나의 샘플에서 어떠한 비-PCR 관련 형광성 변화에 대한 표준화에 사용될 수 있는 안정된 형광 수준을 제공하기 위한 것이다. 상기 방법은 또한 피펫팅 정확성에서의 편차에 대하여 적어도 부분적으로 표준화하기 위해 제안된다.
상기 언급된 제품들 중 마지막 세 개를 제외한 모두는 전통적인 종말점 PCR에서만 사용하도록 제안된다. 착색제 외에, 이들은 전형적으로 겔 웰의 바닥으로 샘플 재료를 취하기 위한 밀도 증강제를 함유한다 (예컨대, US 6942964호 참조). 밀도 증강제가 없으면, 샘플은 주위 액체로 분산될 것이다.
종말점 PCR에 사용된 착색제는 일반적으로 정량적 PCR (qPCR)에는 적합하지 않다. 왜냐하면 이들은 일반적으로 진행중인 반응의 실시간 광학 측정을 방해하기 때문이다. 특히, 염료는 전형적으로 qPCR 형광성의 검출 파장과 중첩된 스펙트럼을 지니거나 이들의 흡광도가 지나치게 높다. 사용된 염료에 대한 일반적인 요건은 PCR 반응에 대한 비-억제 효과 또는 반응 pH에서의 안정성을 포함한다.
염료가 마스터 믹스 또는 중합효소에 제공된 상기 언급된 용액의 추가의 단점은 이들이 샘플 (즉, PCR에서 증폭되는 물질)의 피펫팅을 도울 수 없다는 것이다. 그러나, 샘플 피펫팅은 공정의 추적을 유지하는데 가장 중요하고 - 그리고 가장 어려운 단계이다.
이용가능한 다양한 기계적 시스템들도 문제를 완전히 해소할 수 없다. 이들은 고가이며 피펫팅 에러는 주로 부피 차이로 인해 항상 시각적으로 확인될 수 있는 것이 아닌데, 이는 실패한 결과를 얻은 후에도 에러가 검출될 수 없을 수 있음을 의미한다.
따라서, 개선된 피펫팅 보조물이 요구된다. 특히, 샘플 피펫팅 단계에도 사용될 수 있는 그러한 피펫팅 보조물이 요구된다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 PCR 검정의 준비 동안 피펫팅을 보조하고 특히 다양한 단계의 피펫팅에서 에러가 보다 용이하게 검출되도록 하는 신규한 용액을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 독립항에 정의된 본 발명에 의해 달성된다.
PCR 검정의 피펫팅 단계에서, 적어도 두 개의 시약 용액을 혼합시켜 최종 혼합물을 수득하고, 최종 혼합물을 PCR로 처리한다. 본 발명은 시약 용액들을 상이한 초기 착색제들로 착색시킨다는 생각에 기반하는데, 혼합시에 초기 착색제의 컬러와 상이한 구별가능한 컬러가 생산된다.
따라서, 용액의 컬러에 의해, 이것이 제 1 시약 용액인지, 제 2 시약 용액인지 또는 이들의 혼합물인지를 직접 분간할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 방법은
- 검정을 수행하는데 필요한 하나 이상의 물질을 포함하는 제 1 시약 용액 및 상기 용액에 제 1 컬러를 제공하는 제 1 착색제를 제공하고,
- 상기 검정을 수행하는데 필요한 하나 이상의 다른 물질을 포함하는 제 2 시약 용액 및 상기 용액에 제 1 컬러와 상이한 제 2 컬러를 제공하는 제 2 착색제를 제공하고,
- 제 1 및 제 2 시약 용액을 혼합시켜 PCR 공정으로 처리되는 혼합 용액을 제공하는 것을 포함하고, 혼합 용액은, 상기 제 1 및 제 2 착색제로 인해, 제 1 및 제 2 컬러와 상이한 제 3 컬러를 지닌다.
전형적인 적용에서, 시약 용액들 중 하나는 샘플 용액, 즉 PCR 검정으로 증폭되는 생물학적 샘플을 함유하거나 수용하기 위한 용액이고, 시약 용액들의 나머지는 검정을 수행하는데 필요한 몇몇 그 밖의 하나 이상의 다른 물질, 예를 들어 중합효소 용액 또는 마스터 믹스를 함유한다. 샘플 용액은 완충된 용액일 수 있다 (이하 "샘플 완충 용액"). 따라서, 제 1 컬러를 갖는 마이크로웰은, 웰에 마스터 믹스와 같은 다른 시약 없이 샘플 용액만이 존재함을 나타낸다. 제 2 컬러를 갖는 마이크로웰은, 마스터 믹스가 첨가되었지만 아직 샘플은 없음을 나타낸다. 마지막으로, 제 3 컬러를 갖는 마이크로웰은 샘플이 마스터 믹스에 적절하게 첨가되었음을 의미한다. 컬러는 시각적으로 또는 자동 광학적 수단에 의해 조사될 수 있다.
일 구체예에서, 시약 용액들 중 하나는 용리 완충제이고, 그러한 용리 완충제는 핵산 정제 키트와 함께 사용된다.
일 구체예에서, 시약 용액들 중 하나는 핵산을 방출하기 위해 고형-상태 샘플의 용해를 조장하는데 사용된 희석 완충제이다. 시약 용액은 또한 PCR 전에 방출된 성분을 희석, 분해 또는 침전시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 직접적인 PCR 검정을 피펫팅할 때 본 발명을 이용할 수 있다.
추가의 구체예에서, 시약 용액들 중 하나는 cDNA 합성 반응, 역전사효소 반응 또는 바이설파이트 반응에 사용되는 용액이다.
일 구체예에서, 시약 용액들 중 하나는 PCR 공정용 샘플을 준비하는데 사용되는 몇몇 다른 용액이다.
본 발명은 또한 시약 용액들의 초기 컬러와 구별가능한 컬러를 지니는 혼합 용액을 형성할 수 있는, 두 개 이상의 착색된 PCR 시약 용액을 생산하기 위한 염료의 신규한 용도를 제공한다.
추가의 구체예는 종속항들의 요지이다.
본 발명의 구체적인 목적은 정량적 PCR에 적합한 피펫팅 보조 용액을 획득하는 것이다. 이러한 목적은 형광 공정, 즉 여기(excitation) 및 방출, 또는 qPCR에 사용된 광학 검출을 현저하게 방해하지 않는 그러한 착색제들 및 착색제 농도를 이용하여 달성된다. 구체적으로, qPCR 처리되는 반응 혼합물은 적어도 qPCR 여기 및 방출 파장에서 투명하거나 반투명하다. 이것은 일반적으로, 반응 혼합물의 최대 흡광도가 0.5 미만, 특히 0.15 미만 (1 mm 광로를 이용하여 측정됨)이고, 착색제의 흡수 영역이 사용된 형광성 qPCR 염료(들) 또는 변형된 DNA 올리고누클레오티드 프로브(들)의 여기 또는 방출 파장과 적어도 현저하게 중첩되지 않음을 의미한다.
일 구체예에서, 정량적 PCR용 반응 혼합물을 제조하는데, 반응 혼합물은 형광 염료, 프라이머 또는 프로브를 포함하며, 상기 착색제 중 임의의 것의 흡광도 피크는 상기 형광 염료, 프라이머 또는 프로브의 방출 또는 여기 파장과 중첩되지 않는다. 중첩이 있는 경우, 이러한 중첩은 qPCR 신호를 현저하게 약화시키지 않을 것인데, 이는 일반적으로 상기 파장에서의 반응 혼합물의 전체 흡광도가 0.05 미만, 바람직하게는 0.03 미만, 특히 0.1 미만임을 의미한다.
본 발명은 상당한 이점을 제공한다. 초기 용액과 생성된 용액은 상호 다른 컬러를 지니기 때문에, 당업자는 초기 용액들을 구별할 뿐만 아니라 초기 용액과 이들의 혼합물도 구별한다.
또한, 착색된 용액으로부터, 당업자는 용액들이 적절하게 혼합되었는지 그리고 요망되는 반응 부피로부터 현저한 편차가 있는지를 신속하게 감지할 수 있다.
더욱이, 컬러로 인해, 어떠한 액체가 잠재적으로 오염물, 마이크로웰 밀봉 문제 등을 일으킬 수 있었던 잘못된 위치에 튀었는지 또는 흘렀는지를 용이하게 알 수 있다. 특히 열적 사이클링 전에 미세역가 플레이트 상에 적용된 접착제 밀봉 필름의 경우, 밀봉 접착부에 있는 임의의 액체는 밀봉 및 이에 따라 전체 PCR 검정을 손상시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 수행된 피펫팅 단계가 착색제를 이용하여 가시화되는 경우, 이들의 에러율을 심지어 더욱 낮추는 기계적 용액와 함께 사용될 수 있다. 피펫팅 로봇을 이용할 때, 요망되는 단계 뒤에 광학적 검출에 기반한 정성 조사 단계를 부가할 수 있거나, 시약의 부피 및 컬러가 시각적으로 신속하게 조사될 수 있다.
상기 이유로, 본 방식으로 사용된 염료 및 그 밖의 착색제는 반응 장치에서 그리고 특히 반응 플레이트로 시약을 로딩하는 동안에 추적을 유지하는 것을 도울 수 있다. 따라서, 본 접근법은 피펫팅 샘플에 대해 상당한 도움과 증가된 확실성을 제공한다.
qPCR에서 PCR 반응 이후 증폭된 생성물을 겔에 로딩할 필요가 없다. 따라서, 밀도 증강제가 불필요하다. 결과적으로, 본 발명의 용액에는 밀도 증강제가 없을 수 있거나 소량의 밀도 증강제만을 함유한다 (즉, 겔 전기영동에 요구되는 것보다 적은).
일 구체예에 따라서, 상기 언급된 제 1 및 제 2 시약 용액 외에, 용액에 상이한 컬러를 제공하는 추가의 착색제를 포함하는 하나 이상의 추가의 시약이 제공된다. 용액들은 혼합시에 상기 추가의 착색제들로 인해, 추가의 가능한 컬러를 갖는 추가의 용액들을 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 샘플을 마스터 믹스에 피펫팅하는 것과 같은 공정 중의 한 특정 단계에서 피펫팅을 보조할 뿐만 아니라 다른 단계들, 특히 샘플 피펫팅 단계 이전이나 이후의 단계들 동안에 피펫팅을 보조하는데에도 이용될 수 있다.
보다 상세하게, 상기 방법은 상기 검정을 수행하는데 필요한 하나 이상의 추가의 물질을 포함하며, 용액에 상기 언급된 제 1, 제 2 및 제 3 컬러와 상이한 제 4 컬러를 제공하는 제 3 착색제를 함유하는 제 3 시약 용액을 제공하고, 제 3 시약 용액을 제 1 및 제 2 시약 용액과 혼합시켜, 상기 제 1, 제 2 및 제 3 착색제로 인해, 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 컬러와 상이한 제 5 컬러를 갖는 혼합된 시약 용액을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 제 1 시약 용액은 샘플일 수 있고, 제 2 반응 용액은 마스터 믹스일 수 있으며, 제 3 시약 용액은 프라이머 용액일 수 있다. 적용 순서는, 검정 지시서에 달리 정의되지 않는 한 중요하지 않다.
상기에 대안적으로, 본 방법은 제 1, 제 2 및 제 3 컬러와 상이한 제 4 컬러를 용액에 제공하는 제 3 착색제를 함유하는 제 3 시약 용액을 제공하고, 제 1 시약 용액을 상기 제 2 및 제 3 시약 용액과 개별적으로 혼합시켜 서로 상이하고 제 1, 제 2 및 제 4 컬러와도 상이한 제 3 및 제 5 컬러를 각각 지니는 제 1 및 제 2 혼합 용액을 수득하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제 2 시약 용액은 한 세트의 프라이머를 함유할 수 있고 제 3 시약 용액은 제 2 세트의 프라이머를 함유할 수 있다. 또한 이러한 구체예에서, 모든 초기 구성요소들 및 모든 생성된 혼합물들의 컬러는 유일한 것이다.
상기 언급된 두 개의 구체예는 또한 연속하여 이루어질 수 있는데, 이로 인해 제 2 및 제 3 시약 용액은, 자체가 두 개 이상의 상이하게 착색된 시약 용액들을 혼합시켜 제조된 것인 시약 용액과 궁극적으로 개별적으로 혼합된다. 다른 유형의 조합물이 또한 가능하다.
"시약 용액"은 PCR 목적에 요구되거나 유리하게 사용되는 하나 이상의 시약을 함유하는 임의의 용액이다. 가장 전형적인 구성요소는 중합효소, 누클레오티드, 프라이머, 이온, 마그네슘, 그 밖의 염, pH 완충제, dNTP 또는 형광성 qPCR 염료 또는 프로브, 올리고누클레오티드, 핵산 결합제, 핵산 주형이다. 시약은 또한 중합효소 반응 또는 이의 모니터링에 영향을 주는 그 밖의 중합효소 반응 첨가제일 수 있다.
용어 "샘플 용액"은 달리 명시되지 않는 한, 여전히 주형이 없거나, PCR을 이용하여 증폭시키려는 주형이 이미 여기에 첨가되어 있는 완충되고 완충되지 않은 샘플 용액 둘 모두를 포함한다. 용어 "샘플 용액"은 용어 "시약 용액"에 포함된다.
용어 "마스터 믹스"는 발생하는 PCR에 필요한 구성요소 또는 인자의 전부 또는 대부분의 혼합물, 전형적으로는 특이적인 샘플 및 앰플리콘인 주형 및 프라이머를 제외한 전부를 지칭한다. 시판되는 마스터 믹스는 일반적으로 농축된 용액이다. 마스터 믹스는 다수의 샘플에 공통인 시약을 모두 함유할 수 있으나, 또한 단지 하나의 샘플에 대해 구상될 수 있다. 마스터 믹스를 이용하는 것은 피펫팅된 부피간 차이로 인해 샘플들 사이의 피펫팅 에러 및 변화를 감소시키는데 도움이 된다. 또한 피펫팅에 소요되는 시간을 최소화한다.
qPCR 마스터 믹스는 qPCR 반응을 수행하기 위한 마스터 믹스이다. 따라서, 형광 염료 또는 형광 태깅된(tagged) 올리고누클레오티드 프라이머 또는 프로브를 함유할 수 있다.
용어 "프리믹스"는 주형을 제외한 PCR 반응에 필요한 모든 성분을 함유한 마스터 믹스를 지칭한다.
본원에서 용어 "컬러"는 가시적인 범위에서 백색광에 대한 (용액의) 어떠한 검출가능한 스펙트럼 반응을 의미한다. 따라서, (물의 거의 100% 투과와 대조적으로) 용액에 대해 착색된 시각적인 외관을 제공하는 용액의 흡광도 스펙트럼에서의 하나 이상의 파장 범위가 존재한다. 백색, 흑색 및 세이드 오프그레이(shades ofgrey)가 본원에서 컬러로서 간주된다. 이후 제시되는 바와 같이, 약 0.01 (1 mm 광로)을 초과하는 흡광도는 용액에 시각적으로 감지할 수 있는 컬러를 제공하는 한편, 약 0.001 (1 mm 광로)을 초과하는 흡광도는 하드웨어-기반 스펙트럼 검출 수단에 의해 비교적 용이하게 검출될 수 있다.
용어 "상이한 컬러"는, 컬러가 바람직하게는 맨눈으로, 그러나 적어도 스펙트럼 검출 수단으로 구별가능한 것을 의미한다. 특히, "상이한 컬러"는 이들의 흡수 스펙트럼에 있어서 적어도 30 nm 만큼 분리된 최대 피크를 지닐 수 있다. 바람직하게는, 상이한 컬러는 레드, 옐로우, 블루 또는 사이언, 마젠타, 옐로우 및 이들의 시각적으로 구별가능한 조합 및 세이드, 예를 들어 그린, 오렌지 및 바이올렛의 군으로부터 선택된다.
용어 "착색제"는 용액 내에서 균질하게 혼합되거나 용해될 수 있고 용액에 감지할 수 있는 컬러를 제공할 수 있는 어떠한 물질을 의미한다. 일 구체예에 따라, 착색제는 염료, 특히 수성 염료, 바람직하게는 비-산화성 수성 염료이다.
용어 "투명" 또는 "반투명" 착색제-함유 용액은 특히 qPCR을 수행하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 몇몇 형광 여기 및/또는 방출 파장에서 광학적 투과 영역을 지니는 용액을 지칭하며, 파장은 반응 혼합물에 함유된 플루오로포어, 형광 염료(들) 및/또는 변형된 DNA 올리고누클레오티드 프로브(들)에 좌우된다. 전형적으로, 여기 파장은 350 내지 690 nm, 특히 490 내지 650 nm이다. 방출 파장은 전형적으로 350 nm 내지 730 nm, 특히 515 nm 내지 680 nm이다. 투명 용액은 광학적으로 본래 비-확산성이나, 반투명 용액은 확산적으로 광을 통과시킨다.
용어 "샘플"은 대상 핵산을 함유하거나 대상 핵산의 존재에 대해 분석되는 고형 물질 또는 용액을 지칭한다.
용어 "희석 완충제"는 PCR 설정 전에 샘플 전처리에 이용될 수 있는 용액을 지칭한다. 전처리는 핵산을 방출하기 위한 샘플 용해, 희석, 결합, 화학적 용해, 침전 및 일부 성분의 효소적 분해를 포함할 수 있다.
용어 "예비 공정"은 후속하는 PCR 반응에서 전체로 또는 부분적으로 샘플로서 사용될 수 있는 생성물을 제공하는 임의의 반응, 피펫팅 단계 또는 전처리를 지칭한다.
전형적으로 용액을 제 1 및 제 2 착색제와 혼합시킴에 의해 획득한 제 3 컬러는 용액의 제 1 및 제 2 컬러의 색(chromatic) 조합이다. 따라서, 제 3 컬러는 제 1 및 제 2 컬러의 스펙트럼을 합친 스펙트럼으로 생성될 수 있다. 그러나, 제 3 컬러가 보다 복잡한 공정, 예컨대 제 1 및 제 2 착색제의 반응을 통해, 또는 형광 공정, 예컨대 형광 공명 에너지 전이 (FRET)에 기인하여 형성되는 것을 제외시키는 것은 아니며, 단, 형광 파장은 사용된 qPCR 플루오로포어의 것과 상이하다.
다음에, 본 발명의 구체예 및 이점이 첨부된 도면을 참조로 하여 보다 상세하게 기재된다.
도 1a는 착색된 샘플 완충제, 착색된 시약 용액 및 이들의 착색된 혼합물을 각각 함유하는 세 개의 마이크로웰의 단면도를 도시한다.
도 1b는 빈 웰과, 착색된 샘플 완충제, 착색된 시약 용액, 이들의 착색된 혼합물 및 광학적으로 투명한 액체를 지니는 웰을 함유하는 미세역가 플레이트의 상부도를 도시한다.
도 2a 및 2b는 본 발명을 수행하는 예시적인 방식의 흐름도를 설명한다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 본 방법의 흐름도를 도시한다.
도 4a 내지 4d는 피펫팅 보조 염료를 이용 (4a 및 4b)하고 이용하지 않으며 (4c 및 4d) 마스터 믹스와 샘플로 수득한 표준 시리즈를 도시한다.
도 5a 내지 5d는 흡광도 측정 실시예와 관련된 흡광도 스펙트럼을 도시한다.
도 6a 내지 6c 및 7a 내지 7c는 cDNA 합성 반응에서 착색제의 이용을 설명한다.
구체예의 상세한 설명
플레이트 설정을 용이하기 하기 위해, 본 발명은 일 구체예에서 (q)PCR 공정의 피펫팅 단계에서 마스터 믹스 피펫팅의 추적을 유지하는데 도움이 되는 염료 조합물, 샘플 및 이들의 혼합을 제공한다. 따라서, 염료는 qPCR 반응에 최소 효과를 지니고 (예컨대, 사용된 샘플 또는 DNA 중합효소에 영향을 주지 않을 것이다) 형광성의 광학적 검출에 현저한 영향을 미치지 않도록 최적화되는 것이 바람직하다. 바꾸어 말해, 사용된 염료는 qPCR 검정에 적합하다.
qPCR용으로 사용된 전형적인 플루오로포어는 Alexa 350, FAM™, TET™, VIC™, JOE™, HEX™, CY®3, TAMRA™, ROX™, Texas Red®, CY®5, CY®5.5 및 Quasar®705를포함하며, 이들의 방출 및 여기 파장은 표 1에 제시된다.
표 1
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도 1a는 본 발명의 기본 원리를 도시한다. 마이크로웰(12A)은 제 1 컬러 (가로선)를 지니는 착색된 샘플 완충제(14A)를 함유한다. 마이크로웰(12B)은 제 2 컬러 (세로선)를 지니는 착색된 마스터 믹스(14B)를 함유한다. 마이크로웰(12C)은 제 1 및 제 2 컬러에서 비롯된 제 3 컬러 (가로선 및 세로선)을 지니는, 샘플 완충제와 착색된 마스터 믹스의 착색된 혼합물을 함유한다.
도 1b는 미세역가 플레이트(10)를 도시하는데, 상기 플레이트는, 도 1a에서와 같이 도시되고 표시된 용액에 추가하여, 빈 웰(12) 및 컬러가 없는 (점) 착색되지 않은 액체(14D)를 함유한다. 또한, 희석된 반응 혼합물(14E)이 도시되는데, 상기 혼합물은 초기 반응 혼합물(14C)을 착색되지 않은 액체(14D)로 희석시킴에 의해 수득한 것이고, 희석된 반응 혼합물은 초기 반응 혼합물(14C)과 동일한 기본 컬러를 갖지만, 증가된 투명성, 즉 감소된 흡광도 (성긴 가로선 및 세로선)를 지닌다. 이후 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 컬러 뿐 아니라 희석 정도는 본 발명의 일 구체예에 따라 모니터링될 수 있다.
염료들은 바람직하게는 시각적으로, 즉 맨 눈으로 서로 구별되고 검출될 수 있다. 따라서, 상이한 컬러는 스펙트럼에 의해 비교적 밀집하여 분포되며 특별한 장비는 불필요하다. 그러나, 광학 스펙트럼 검출기 또는 컴퓨터 비젼을 사용한 자동 장치에서, 상이한 컬러들을 구별하는 능력을 저하시키지 않으며, 또한 스펙트럼 규모로 보다 정교하게 분포된 컬러를 이용할 수 있다.
일 구체예에 따라, 조합물은 블루 마스터 믹스 및 옐로우 샘플 완충제를 포함한다. 함께 혼합될 때 이들은 분명한 그린 용액을 형성한다. 플레이트의 블루 컬러는 마스터 믹스가 첨가되었으나 샘플은 아직 존재하지 않음을 나타낸다. 샘플이 첨가되면 컬러가 그린으로 바뀐다. 웰의 용액이 옐로우인 경우, 이것은 마스터 믹스 없이 샘플만이 존재함을 의미한다. 일 구체예에 따르면, 블루 염료는 크실렌 시아놀(Xylene cyanol)을 포함한다. 일 구체예에 따르면, 옐로우 염료는 퀴놀린 옐로우(Quinoline yellow)를 포함한다. 이러한 염료는 중합효소 및 샘플 완충제에 각각 적합한 것으로 밝혀졌다.
다른 잠재적인 염료는 브릴리언트 블루(Brilliant Blue), 페이턴트 블루(Patent Blue), 인디고카르민(Indigocarmine), 액시드 레드(Acid Red) 1, m-크레졸 퍼플(Cresol Purple),크레졸 레드(Cresol Red), 뉴트랄 레드(Neutral Red), 브로모크레졸 그린(Bromocresol Green), 액시드 바이올렛(Acid Violet) 5, 브로모 페놀 블루(Bromo phenol blue), 및 오렌지(Orange) G를 포함한다. 다른 잠재적인 염료가 US 6942964호에 나열되어 있다.
일 구체예에 따르면, 염료는 개개의 용액에 대해 시각적으로 감지할 수 있는 컬러를 제공할 정도로 충분히 강하지만, 형광 검출을 방해하지 않을 정도로 충분히 약하고/거나 그러한 용도로 일반적으로 이용되는 다른 염료에 의한 겔 전기영동 이동 추적을 방해하지 않을 정도로 충분히 약하다. 예를 들어, 상기 언급된 크실렌 시아놀 및 퀴놀린 옐로우가 이러한 그룹의 염료에 속한다. 따라서, 착색되고 증폭된 반응 혼합물을 종말점 겔 전기영동 분석하는 경우, 착색제는 분석에 아무런 영향을 미치지 않는다. 그 대신, 전기영동 염료를 지니는 통상적인 로딩 완충제가 증폭된 혼합물에 첨가될 수 있다. 적당한 염색이 또한 투명하거나 반투명한 용액의 일반적인 시각적 외관을 유지시킨다.
염료의 적합한 농도는 염료 자체에 의존적이다. 일 구체예에 따르면, 기계-보조 컬러 검출되는 경우, 초기 용액 중 염료의 농도는 이의 최대 흡수 파장에서 (1 mm 광로) 0.001 내지 0.5의 흡광도를 생성하도록 조정된다. 시각적 컬러 검출되는 구체예에 따르면, 염료의 농도는 이의 최대 흡수 파장에서 (1 mm 광로) 0.01 내지 0.5, 특히 0.03 내지 0.5의 흡광도를 생성하도록 조정된다. 가장 바람직한 구체예에서, 흡광도는 0.03 내지 0.15이며, 이러한 흡광도는, 흡광도 피크가 qPCR 여기 및/또는 방출 파장과 다소 중첩될지라도, 컬러의 시각적 검출가능성 및 qPCR 측정에 대한 무시할만하거나 적은 효과 둘 모두를 보장한다. 그러한 중첩이 존재하는 경우, 최대 흡광도와 관계 없이, qPCR 여기 및/또는 방출 파장에서의 전체 흡광도는 0.05 미만, 바람직하게는 0.03 미만, 특히 0.01 미만인 것이 바람직하다 (1 mm 광로). 두 개 (또는 그 초과)의 초기 용액이 상이하게 착색된 염료를 지니기 때문에, 어떠한 특정 파장에서 현저한 누적 흡광도는 없다. 또한 상기 흡광도는 요망되는 PCR 공정 농도로 희석된 용액의 바람직한 흡광도임이 주목되어야 한다. 용액이 농축물로서 전달되는 경우, 바람직한 흡광도는 각기 더 높다.
대안적인 구체예에 따라, 용액 중 하나 이상에 염료가 제공되는데, 염료는 qPCR에 사용하기 적합하며 (즉, 사용된 파장에서 형광 검출에 영향을 주지 않으며) 겔 전기영동에서 검출될 정도로 충분히 강하고, 샘플에 관해 겔에서 적합한 간격으로 진행된다. 따라서, 분리된 로딩 완충제가 반드시 필요한 것은 아니다.
염료를 함유하는 샘플 완충제는 의도하는 용도에 따라 희석물 또는 농축물로서 전달될 수 있다.
도 2는 착색된 샘플 용액 (단계 20) 및 하나 이상의 시약 용액 (단계 21, 임의로 22)을 단일 용기내에 피펫팅하고 용액들을 혼합시키는 (단계 23) 일반적인 개념을 도시한다. 혼합 용액의 컬러를 조사한 후 (단계 24) 혼합물을 PCR로 처리한다 (단계 25). 간단하게 하기 위해 도 2에 도시되지 않은 그 밖의 피펫팅 및 가공 단계가 있을 수 있음이 인지되어야 한다.
본 발명의 일반적인 개념을 이용한 여러 구체예를 하기에서 설명한다.
일 구체예에 따르면, 다수의 착색된 샘플 완충 용액이 제공되며, 여기서 상이한 착색제를 이용하여 샘플 완충제에 상이한 컬러를 제공한다. 추가의 구체예에 따르면, 다수의 착색된 샘플 완충제를 동일하게 착색된 시약 혼합물과 혼합시켜 상이한 컬러의 반응 혼합물을 생성한다. 따라서, 다수-샘플 PCR 검정에서, 용액의 컬러에 기반하여 상이한 샘플들을 구별할 수 있다. 예를 들어, 블루 마스터 믹스와 혼합된 옐로우 샘플 완충제 및 레드 샘플 완충제는 그린 및 마젠타 반응 혼합물을 생성할 수 있었고, 이로부터 당업자는 적절한 혼합 뿐만 아니라 샘플의 유형을 즉시 입증할 수 있다.
일 구체예에 따라, 마스터 믹스 및 다수의 착색된 프라이머 믹스가 제공되며, 여기서 상이한 착색제를 이용하여 믹스에 상이한 컬러 (마스터 믹스: 컬러 1, 프라이머 믹스: 컬러 2 및 컬러 3)를 제공한다. 프러이머 믹스를 마스터 믹스와 합쳐서 여전히 상이하게 착색된 믹스를 생성한다 (컬러 4 및 6). 추가로, 착색된 샘플 (컬러 7)을 수득된 믹스에 첨가시킴에 의해, 구별가능한 PCR 용액이 수득된다 (컬러 8 및 9). 공정의 각각의 경우에, 용액들의 컬러는 용액의 내용물을 나타낸다.
도 3에 설명된 대로, 일 구체예에 따라, 다수의 마스터 믹스 또는 프리믹스가 상이하게 착색되도록 하는 상이한 착색제 (프리믹스 1: 컬러 2, 프리믹스 2: 컬러 3, ... 프리믹스 n: 컬러 n+1로 언급됨)가 제공된 그 밖의 프리믹스 (단계 31, 32) 및 추가의 컬러를 지니는 샘플 (컬러 1)이 제공된다 (단계 30). 프리믹스를 샘플과 개별적으로 혼합하고 (단계 33a, 33b) 생성된 용액의 컬러를 조사한다 (단계 34a, 34b). 컬러는, 프리믹스 용액과 샘플 용액의 각각의 조합이 용액을 서로에게서 그리고 초기 프리믹스와 샘플 용액으로부터 구별가능하게 하는 독특한 컬러를 생성하도록 바람직하게 선택된다. 조사 후에 (34a, 34b), 용액은 원칙적으로 PCR 준비가 된 것이다. 간단하게 하기 위해 도 3에 도시되지 않은 그 밖의 피펫팅 및 가공 단계가 있을 수 있음이 인지되어야 한다.
보다 일반적으로, (PCR 반응에 필요한 성분, 예컨대 중합효소, 프라이머, 이온, dNTP 또는 형광성 qPCR 염료 또는 프로브, 또는 그 밖의 첨가제를 각각 함유하는) 다수의 초기 용액 및 추가의 컬러 (컬러 1)를 지니는 샘플이 제공될 수 있으며, 상기 초기 용액에는 용액이 상이하게 착색되도록 하는 상이한 착색제가 제공된다 (용액 1: 컬러 2, 용액 2: 컬러 3, ... 용액 n: 컬러 n+1). 컬러는, 용액들의 각각의 조합이 용액을 서로에게서 구별가능하게 하는 독특한 컬러를 생성하도록 바람직하게 선택된다.
유용성 가치가 높은 본 발명의 선택된 변형이 하기에 기재된다.
용리 완충제에서 염료의 이용
분자 생물학 실험용 핵산은 일반적으로 복잡한 샘플 물질로부터 정제된다. 추출, 침전, 하이브리드화 및 상이한 방식의 크로마토그래피 또는 필터링 등에 기반한 방법을 포함하는 다양한 정제 방법이 존재한다. 기술의 대부분에서, 핵산은 선택된 용액에 용해되거나 용리된다. 침전된 핵산은 다양한 용액에 용해될 수 있다. 다른 DNA 상호작용에 기반한 그 밖의 방법을 이용하는 경우, 적합한 이온 강도와 같은 용리 완충제에 대한 더 많은 요건이 존재한다. 고 이온 강도 조건에서 실리카에 대한 DNA 결합에 기반한 정제 방법이 광범하게 이용된다. 결합된 DNA를 저 이온 강도 완충제로 또는 순수한 물로 실리카 매트릭스로부터 용리시킨다. 실리카 결합 방법에 기반한 다수의 키트가 이용가능하며 일반적으로 키트는 용리 완충제를 함유한다. 실험 워크플로에서 피펫팅 단계의 수를 감소시키기 위해, 착색제를 용리 완충제에 포함시킬 수 있거나 키트에 제공된 완충제를 착색된 완충제로 대체할 수 있다. 이렇게 함으로써, 사용자는 별도의 단계로 컬러를 부가하지 않아도 된다.
예를 들어, 염료를 함유하는 샘플 완충제를 다수의 상업용 또는 자가(homebrew) DNA 정제 키트와 함께 샘플 용리 완충제로서 이용할 수 있다. 이용가능한 다수의 키트에 제공된 용리 완충제는 매우 간단하게 염료를 함유하는 샘플 완충제로 대체될 수 있다. 대안적으로, 소량의 염료 농축물이 샘플을 지나치게 희석시키지 않으면서 키트에 제공된 용리 완충제에 첨가될 수 있다.
그 밖의 착색된 시약 용액은, 상기 논의된 대로, 공정에 필요한 어떠한 다른 용액일 수 있다.
용리 완충제에서 염료의 이용 (직접 PCR)
새로운 효소 기술은 PCR을 위한 샘플 제조를 상당히 단순화시킬 수 있었고 심지어 미정제 샘플을 직접 PCR하는 것도 가능하다. 그러나 다수의 실험에서 샘플은 여러 반응으로 분리될 필요가 있고 가능한 반복 또는 다른 목적을 위해 샘플의 일부를 저장할 수 있는 것이 종종 바람직하다. 따라서 샘플이 특수한 샘플 완충제에서 분해되고 용해되는 직접 PCR 프로토콜이 매우 인기 있다. 이러한 소위 희석 프로토콜에서, 희석 완충제는 샘플을 용해시키는 상이한 작용제를 함유할 수 있다. 이러한 작용제 외에, 착색제가 희석 완충제에 첨가되어 후속하는 피펫팅 단계를 용이하게 할 수 있다.
그 밖의 착색된 시약 용액은 상기 논의된 대로 공정에 필요한 어떠한 다른 용액일 수 있다.
이러한 구체예를 설명하기 위해, 실리카로의 DNA 결합에 기반한 키트를 이용하여 우유 샘플로부터 두 세트의 추출을 수행하였다. 하나는 가이드라인에 따랐고 다른 세트에서는 용리 완충제가 옐로우 염료를 지니는 1x 샘플 완충제로 대체되었다. 정제된 샘플을 qPCR에 이용하였고 기재된 두 세트의 qPCR 결과를 비교하였다. 현저한 차이는 관찰되지 않았다.
역전사 반응에서 염료의 이용
대부분의 실시간 PCR은 유전자 발현 연구를 위해 수행된다. 이러한 실험에서 대상 핵산은 RNA이므로 보통의 qPCR에 직접적으로 적합한 주형이 아니다. qPCR 이전에, RNA 샘플은 qPCR 단계에 앞서 역전사되어야 한다. 역전사 및 qPCR 반응을 조합하여 동일한 반응 혼합물에서 계속해서 수행할 수 있다. 그러나, 일반적으로 조건은 절충되며 두 반응 중 어느 쪽에도 최적이 아니다. 대부분의 경우에 분리된 역전사 반응을 실행하고 생성된 cDNA를 분리된 qPCR 반응에서 주형으로서 이용하는 것이 더욱 최적이다. 역전사 반응 장치에서 qPCR에 대해 기재된 바와 같이 피펫팅 동안 샘플의 추적을 유지하는 동일한 과제가 존재한다. 본 발명의 구체예는 이러한 과제를 풀기 위해 어떠한 착색제를 cDNA 합성 반응에 이용할 수 있는지를 기재한다.
cDNA 합성 반응에서 착색제의 이용은 또한 다음과 같이 설명되었다.
두 cDNA 합성 반응 시리즈가 제조되며, 하나는 qPCR을 위해 지시된 농도에 비해 10배의 최종 농도로 옐로우 착색제를 지니고, 다른 하나에는 추가의 염료가 없다. 1000ng, 500ng, 10ng, 1ng, 100pg 및 10 pg의 희석액을 지니는 HeLa 총 RNA 희석 시리즈를 주형으로서 이용하였다. 그렇지 않으면 반응은 매뉴얼에 따라 수행되었다 (제품 번호 F-470, 핀지메스). 이어서 각 반응의 1,5 ㎕ 분취량을 DyNAmo SYBR Flash qPCR 마스터 믹스를 이용한 qPCR에서 주형으로서 이용하였다.
도 6a 내지 6c 및 도 7a 내지 7c와 관련하여, 두 개의 표준 곡선이 생성되었고, 첫 번째 (도 6c)는 첨가된 염료를 지니는 시리즈를 나타내고 다른 하나 (도 7c)는 염료가 없는 시리즈를 나타낸다. 그 결과는 cDNA 합성이 착색제의 존재하에 수행될 수 있고 반응의 정량적 특성이 유지됨을 나타낸다.
실제로, 염료는 전사효소, 샘플, 완충 용액과 함께 또는 농축물로서 별도로 반응내로 들어올 수 있다.
바이설파이트 반응에서 염료의 이용
상기에서 논의된 바와 유사하게, 염료는 또한 샘플을 혼합시키기 전에 바이설파이트 처리의 일부를 구성하는 임의의 성분에 첨가될 수 있어서 제 2 반응 용액으로 수득될 수 있다.
상기 예로부터 알 수 있는 바와 같이, 염료는 최종 PCR 반응 혼합물을 혼합시킬 때 뿐만 아니라 예비 공정 단계, 특히 샘플 제조와 관련된 단계, 예컨대 역전사 반응 (예컨대, cDNA 합성), 바이설파이트 반응, 샘플 용리 또는 샘플 희석 단계에도 존재할 수 있다. 이러한 예는 제한적인 것이 아니며, 당업자가 이해하는 바와 같이, 염료는, 예를 들어 효소, 반응 완충제, 샘플과 함께 또는 별도로, 다양한 방식으로 이러한 반응에 또한 도입될 수 있다.
컬러가 또한 예비 공정 단계에 존재하기 때문에, 이러한 단계들의 피펫팅이 또한 촉진된다. 그러나, 바람직한 구체예에 따르면, 최종 반응 용액을 예컨대 중합효소 또는 마스터 믹스와 혼합시킬 때 하나 이상의 착색된 용액이 생긴다.
도 2b는 하나 이상의 착색된 시약 용액 (단계 20')을 하나 이상의 예비 공정 단계 (29') 이전에 공정에 도입시키는 원리를 일반적인 수준에서 설명한다. 전처리는 하나 이상의 다른 물질의 도입을 또한 포함할 수 있다 (단계 28'). 전처리 후에, 공정은, 예비 공정 단계의 생성물 (또는 이의 분취량)을 제 2 착색된 시약 용액과 혼합시키고 (단계 21' 및 23'), 혼합 용액의 컬러를 조사하고 (step 24') (q)PCR을 진행함에 의해 (단계 25'), 상기 설명된 것과 유사하게 계속될 수 있다.
피펫팅 공정의 모니터링이 하기에 기재된다
바람직하게는, 상이한 컬러를 맨 눈으로 구별할 수 있다. 그러나, 컬러들을 구별할 수 있는 하드웨어-보조 광학 측정기를 또한 이용할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 피펫팅되는 하나 이상의 마이크로웰의 조건을 피펫팅 공정 동안 분광 분석이 가능한 광학적 수단에 의해 자동적으로 한번 이상 조사한다.
일 구체예에 따르면, 마이크로웰의 조건은 피펫팅 공정의 상이한 단계에서 두 번 이상 자동적으로 조사된다. 바람직하게는 그러한 조사가 분리된 매 피펫팅 단계 후에 수행된다.
착색되지 않은, 즉 광학적으로 투명한 액체의 각 첨가로 인해 착색제의 농도의 감소되고 착색된 용액의 컬러는 옅어진다. 반면, 착색된 물질의 첨가는 컬러의 세이드를 변화시킨다. 따라서, 웰 내에서 용액 컬러의 강도 및/또는 세이드는 피펫팅 단계를 나타낸다. 마이크로웰(들)의 스펙트럼 반응의 자동 측정에 의해, 피펫팅 공정의 진행이 모니터링될 수 있다.
일 구체예에 따라, 상기 언급된 모니터링을 컴퓨터 프로그램을 이용하여 수행하는데, 상기 프로그램은 요망되는 피펫팅 단계 후에 측정된 스펙트럼 반응을 이러한 단계에 대한 소정의 한계치와 비교하도록 구성된다. 그러한 한계치는 첨가된 시약을 고려하여, 용액 컬러의 정확한 세이드 및/또는 강도를 반영하도록 설계된다. 측정된 값이 허용되는 범위 내에 있지 않은 마이크로웰은 부정확하게 피펫팅된 것으로 표시된다.
용액 컬러의 검출은 바람직하게는 흡광도 측정에 기반한다. 예를 들어 자동 피펫팅 장치 또는 (q)PCR 열적 사이클링 장치의 필수 부분에 있을 수 있는 검출 기계는 흡광도 측정 수단, 즉 광원, 광 검출기 및 적어도 하나의 파장 또는 파장 범위에서 마이크로웰의 내용물의 흡광도를 측정하기 위한 수단을 포함한다. 바람직하게는, 흡광도 측정 수단이 분광광도계를 포함한다. 본 발명에 의해, 심지어 컬러의 세이드 및 강도에서의 작은 변화, 및 이에 따라 웰의 내용물에서의 변화를 검출할 수 있으므로, 피펫팅 및 PCR 검정의 신뢰도가 개선될 수 있다.
대안적인 구체예에 따르면, 검출 기계는 분리된 장치에 함유되는데, 임계적 피펫팅 단계 후에 상기 장치로 반응 용액이 자동 또는 수동으로 운반될 수 있다. 분리된 장치에서, 신속한 플레이트 판독을 수행한 후에 플레이트를 추가 가공을 위해 운반한다.
따라서, 본 발명은 또한 다수의 마이크로웰을 함유하는 미세역가 플레이트를 수용하기 위한 수단 및 마이크로웰의 내용물의 광학적 흡광도를 측정하기 위한 수단을 포함하는, 피펫팅을 모니터링하는 장치를 제공한다. 흡광도를 검출하기 위한 상기 수단은 샘플의 스펙트럼 흡광도 프로필 (컬러 검출용) 및/또는 샘플의 컬러 세기 (희석율 검출용)를 검출하도록 구성된다. 바람직하게는, 장치는 전체 피펫팅 공정을 모니터링할 수 있도록 상기 언급된 기능 둘 모두를 지닐 수 있다. 광학적 검출 수단은 측정된 흡광도를 분석 및 저장하고 계산을 수행하거나 미리-저장된 데이터와 측정 데이터와의 비교를 수행하는 계산 유닛에 연결되는 것이 바람직하다.
검출 기계는 반응 용액의 온도를 충분히 낮게 유지하기 위해 냉각될 수 있는 마이크로플레이트-수용 블록을 함유할 수 있다. 대부분의 핫 스타트 중합효소의 경우, 냉각은 불필요하다.
자동 검출은 반응 용기의 부피가 적을 때, 즉 5 ㎕ 미만, 특히 1 ㎕ 미만일 때 특히 도움이 되는데, 그 이유는 용액의 컬러 및 부피 둘 모두의 신뢰할 만한 시각적 관찰이 이러한 경우에 더욱 어렵기 때문이다.
마이크로웰은 분리될 수 있거나 어떠한 공지된 유형의 미세역가 스트립 또는 플레이트에 함유될 수 있다. 바람직하게는, 웰은 투명한 물질로 제조되며, 이로 인해, 시각적인 조사 또는 스펙트럼 측정이 웰의 벽을 통해 수행될 수 있다.
염색 실시예
착색제로서 크실렌 시아놀을 (핀지메스, Finland)로부터의 DyNAmo Flash SYBR® 그린 qPCR 및 DyNAmo Flash Probe qPCR 마스터 믹스에 0.0026% (w/v)의 농도로 첨가하였다. 결과는 분명한 블루 투명 용액이었다. 퀴놀린 옐로우를 샘플 완충제에 0,00174% (w/v)의 농도로 첨가하였다. 샘플 완충제는 1 mM Tris - HCL pH 8,5 및 0,1mM EDTA을 함유하였다. 그 결과, 분명한 옐로우 투명 용액을 수득하였다.
착색된 샘플 완충제 및 착색된 마스터 믹스를 혼합시켜, 분명한 그린 투명 혼합물을 생성하였다.
증폭 실시예
도 4a 내지 4d는 실시예 1의 피펫팅 보조 염료와 함께 (도 4a 및 4b) 및 염료 없이 (4c 및 4d) 마스터 믹스 및 샘플로 수득한 표준 시리즈를 도시한다. 두 시리즈는 모두 제품 매뉴얼의 프로토콜에 따라 DyNAmo Flash Probe 마스터 믹스로 인간 유전체 DNA 서열을 증폭시킴에 의해 수행되었다. 프라이머 서열은 ACCTCCAAACTGGCTGTAAC 및 ATCTCCTCCTCATTGCAAAG이었다. 검출은 서열 TGGCCCCTTGAAGACAGCAG을 지니는 가수분해 프로브에 기반하였다. 앰플리콘 크기는 121 bp였다.
증폭 곡선 (도 4a 및 4c)과 표준 곡선 (도 4b 및 4d)의 상호 유사성으로부터, 염료의 존재가 반응 효율에 영향을 주지 않거나 형광 세기에 현저하게 영향을 주지 않음을 확인할 수 있다.
피펫팅 실시예
본 발명은 다음 피펫팅 순서를 이행하도록 활용되었다:
- 여러 반응을 위한 프리믹스를 수득하기 위해 착색된 (블루) 2x 믹스를 프라이머 및 프로브, 첨가제 및 물과 충분히 혼합시켰다.
- 프리믹스를 미세역가 플레이트의 수 개의 웰에 피펫팅하였다 (15 ㎕/웰).
- 착색된 (옐로우) DNA 샘플 용액을 프리믹스 (15 ㎕/웰) 상에 피펫팅하였다.
- 생성된 용액의 컬러가 정확한지를 수동으로 조사하였다 (그린).
상기 단계들 후에, 생성된 용액은 (q)PCR로 처리할 준비가 된 것이다. qPCR을 위해, 시약들은 웰의 바닥으로 원심분리되는 것이 바람직하다.
흡광도 측정 실시예
상기 실시예에 사용된 염료의 상이한 희석액 및 존재하는 착색된 마스터 믹스의 희석액의 흡광도를 측정하고 상이한 파장에서의 시각적으로 감지할 수 있는 범위를 평가하는 시각적인 관찰과 비교하였다. 특히 상이한 염료를 지니는 가시적으로 감지할 수 있는 흡광도 범위를 측정하고 또한 시판되는 염료가 qPCR에 대개 가장 대중적으로 이용되는 염료인 FAM 및 SYBR 형광 염료와 함께 이용하기에 적합할 지를 조사하는 것이 목적이었다.
측정은 1 mm 및 0.1 mm 광로를 이용한 Nanodrop ND-1000 분광광도계로 수행되었다.
컬러의 시각적 검출가능성, 최대 흡광도 및 샘플들의 흡광도 뿐만 아니라 실험에 이용된 용액과 염료의 유형을 포함한 결과를 하기 표 1 내지 7에 제시한다. 표 1 내지 3은 FAM 또는 SYBR와 함께 이용하기에 바람직한 염료로 수득된 결과를 도시하는 한편, 표 4 내지 7은 시판되는 착색된 PCR 용액으로 수득된 비교 실시예를 도시한다.
표에서, 하기 부호를 이용한다:
+++ 강한 컬러
++ 조사하기 쉬운 컬러
+ 약하지만 맨 눈으로 보통의 실험실 환경에서 볼 수 있는 컬러
- 맨 눈으로 보통의 실험실 환경에서 보이지 않는 컬러
별표(*)로 표시된 경우에는, 흡광도 피크가 완전히 잘-정의되지 않거나 뚜렷하지 않았다.
표 1
Figure 112019062336835-pat00002
표 2
Figure 112019062336835-pat00003
표 3
Figure 112019062336835-pat00004
표 1 내지 3의 용액의 최대 흡광도는 FAM 및 SYBR 염료의 형광 파장에서 비교적 멀리 있었다. 표 3의 반응 혼합물의 흡광도 스펙트럼 (1x 희석액)을 도 5a에 도시한다. 이러한 데이터로부터 다음과 같은 결론을 내릴 수 있다: 시험된 염료는 초기 용액에 사용하기에 적합하고 또한 동시에 qPCR 반응 혼합물에서 이러한 형광 염료와 함께 착색제로서 적합한 것으로 입증되었다.
표 4
Figure 112019062336835-pat00005
표 4의 완충제는 최대 FAM 및 SYBR 형광성에 가까운 510 nm에서 최대 흡광도를 지닌다. 이러한 염료들의 경우 흡광도는 qPCR 신호를 현저하게 감소시킬 것이다. 따라서, qPCR에서 이러한 믹스의 사용은 실행할 수 없을 것이다.
표 5
Figure 112019062336835-pat00006
표 5의 믹스는 419 nm에서 매우 강한 흡광도를 지닌다. 흡광도 피크가 전혀 날카롭지 않기 때문에, 또한 495 nm에서 현저한 흡광도를 지니는데 (1 mm 광로의 경우에 0.17), 이는 FAM 및 SYBR 염료가 여기되는 범위이다. 이러한 염료들의 경우 흡광도는 qPCR 신호를 감소시킬 것이다. 흡광도 스펙트럼 (1x 희석액)을 도 5c에 도시한다.
표 6
Figure 112019062336835-pat00007
표 6의 믹스는 485 nm에서 매우 강한 흡광도를 지닌다. 흡광도 피크가 전혀 날카롭지 않기 때문에, 또한 495 nm에서 현저한 흡광도를 지니는데 (1 mm 광로의 경우에 0.982), 이는 FAM 및 SYBR 염료가 여기되는 범위이다. 이러한 염료들의 경우 흡광도는 qPCR 신호를 현저히 감소시킬 것이다. 흡광도 스펙트럼 (1x 희석액)을 도 5d에 도시한다.
표 7
Figure 112019062336835-pat00008
표 7의 믹스는 475 nm에서 매우 강한 흡광도를 지닌다. 흡광도 피크가 전혀 날카롭지 않기 때문에, 또한 495 nm에서 현저한 흡광도를 지니는데 (1 mm 광로의 경우에 0.393), 이는 FAM 및 SYBR 염료가 여기되는 범위이다. 이러한 염료들의 경우 흡광도는 qPCR 신호를 현저히 감소시킬 것이다. 흡광도 스펙트럼 (1x 희석액)을 도 5b에 도시한다.
감지할 수 있는 범위는 파장에 의존적인데, 일반적으로 1 mm 광로의 경우에 0.01 내지 0.1 이상의 흡광도를 제공하는 컬러가 투명한 액체와 시각적으로 구별가능한 것으로 여겨진다. 흡광도가 0.1 내지 0.2로 상승하면, 컬러는 눈에 매우 뚜렷해 보인다. 그러나, 정교한 기계는 보다 민감하므로, 예컨대 컬러 측정을 위해 분광광도계를 이용한 경우, 0.001 이상의 흡광도를 제공하는 염료를 이용할 수 있었다.
컬러 검출에 의한 반응 장치 부피를 조사하기 위한 기계의 이용은 컬러가 지닐 수 있는 가능한 네거티브 효과를 최소화할 목적으로 보다 희석된 컬러를 이용할 수 있게 한다. 예를 들어 qPCR에서, 형광성 검출에 현저한 영향을 미치지 않으면서 이용될 수 있었던 염료의 범위를 증가시킬 것이다.
상기 구체예 및 실시예 및 첨부된 도면은 예시적인 목적을 위한 것이다. 본 발명의 범위는 등가물을 고려한 하기 청구범위에 기반하여 검토되어야 한다.

Claims (34)

  1. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 검정을 수행하는데 필요한 적어도 하나의 물질을 포함하는 제 1 시약 용액을 제공하는 단계로서, 적어도 하나의 물질이 PCR 생성물을 위한 중합효소, dNTP, PCR 프라이머, 마그네슘염, 핵산 주형, qPCR 염료, 또는 프로브 중 하나 이상을 포함하는 단계,
    PCR 검정을 수행하는데 필요한 적어도 하나의 다른 물질을 포함하는 제 2 시약 용액을 제공하는 단계로서, 적어도 하나의 다른 물질이 PCR 생성물을 위한 중합효소, dNTP, PCR 프라이머, 마그네슘염, 핵산 주형, qPCR 염료, 또는 프로브 중 하나 이상을 포함하는 단계, 및
    PCR 공정으로 처리되는 혼합 용액을 제공하기 위해 상기 제 1 및 상기 제 2 시약 용액을 혼합하는 단계를 포함하는, PCR 검정을 위한 반응 혼합물을 제조하는 방법으로서,
    상기 제 1 시약 용액은 제 1 시약 용액에 제 1 컬러를 제공하는 제 1 착색제를 함유하고,
    상기 제 2 시약 용액은 상기 제 1 컬러와 상이한 제 2 컬러를 용액에 제공하는 제 2 착색제를 함유하며,
    상기 혼합하는 단계가, 상기 제 1 및 제 2 착색제로 인해, 제 1 및 제 2 컬러와 상이한 제 3 컬러를 지니는 혼합 용액을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 검정을 위한 반응 혼합물을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제 3 컬러는 시각적으로 검출되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 혼합물의 컬러가 조사되고 제 3 컬러의 검출은 제 1 및 제 2 용액이 혼합되었음을 나타내는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컬러들은 이들의 흡수 스펙트럼에 있어서 적어도 30 nm 만큼 분리된 최대 피크를 가지는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각 시약 용액 중 상기 착색제들의 농도는 상기 용액의 1 mm 광로를 갖는 최대 흡수 파장에서 0.001 내지 0.5의 흡광도에 해당하고, 이때 상기 용액은 요망되는 PCR 공정 농도로 희석된, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검정을 수행하는데 필요한 적어도 하나의 추가의 물질을 포함하는 제 3 시약 용액을 제공하는 단계로서, 상기 제 3 시약 용액이 제 1, 제 2 및 제 3 컬러와 상이한 제 4 컬러를 용액에 제공하는 제 3 착색제를 함유하는 단계, 및
    상기 제 1, 제 2 및 제 3 착색제로 인해, 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 컬러와 상이한 제 5 컬러를 지니는 혼합된 시약 용액을 제공하기 위해 제 3 시약 용액을 제 1 및 제 2 시약 용액과 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 3 착색제를 함유하는 제 3 시약 용액을 제공하여 용액에 제 1, 제 2 및 제 3 컬러와 상이한 제 4 컬러를 제공하는 단계, 및
    제 1 시약 용액을 제 2 및 제 3 시약 용액과 개별적으로 혼합시켜 제 3 및 제 5 컬러를 각각 지니는 제 1 및 제 2 혼합 용액을 수득하는 단계로서, 상기 제 3 및 제 5 컬러는 서로 상이하고 제 1, 제 2 및 제 4 컬러와 상이한 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시약 용액의 적어도 하나가 중합효소를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시약 용액의 적어도 하나가 핵산 주형을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시약 용액의 적어도 하나가 마그네슘염을 포함하는, 방법.
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