JPH07303468A - ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルを実施するための熱サイクリングシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 ＰＣＲプロトコル実施のための熱サイクリン
グシステムの提供。 【構成】 複数サイクルの各温度範囲内での変性及びハ
イブリダイゼーションを含むＰＣＲプロトコル実施のた
めの熱サイクリングシステムにおいて、増幅される１つ
以上の１本鎖又は２本鎖核酸配列、４つの異ったデオキ
シリボヌクレオチド、変性温度で不可逆的に変性されな
いＤＮＡポリメラーゼ、及び各核酸配列のための１対の
オリゴデオキシヌクレオチド反応混合物と、該反応混合
物を収容する熱伝達反応室、これを前記ＰＣＲプロトコ
ルに基き加熱、冷却のためのコンピュータ制御可能な手
段、反応室の加熱、冷却のための手段に制御可能に連結
されたユーザーによりプログラミング可能なコンピュー
タ手段とからなり、該手段が開始されると前記ＰＣＲプ
ロトコルに基づき反応室を加熱、冷却するようプログラ
ミングされているシステム。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ或いはＲＮＡ（核
酸）を増幅するための連鎖反応の分野に関し、より詳し
くは、ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルを実施するため
の熱サイクリングシステムに関する。

【０００２】

【従来の技術】既存の配列から核酸配列を合成するため
の従来の方法、例えばホスホジエステル及びホスホトリ
エステル法［ナラング等（Narang et al.）Meth.Enzymo
l.６８，９０（１９７９）；及びブラウン等（Brown et
al.）Meth.Enzymol.６８，１０９（１９７９）をそれ
ぞれ参照］は多量の核酸配列を製造するためには実用的
なものではなかった。その様な方法は労力及び時間が嵩
み、高価な装置及び試薬を必要とし、又総括的効率の低
いものである。

【０００３】少量の既存の配列から多量に核酸配列を製
造する方法がある。その様な方法は適当な宿主系的に核
酸配列をクローン化し、核酸配列が挿入されたベクター
が複製される宿主を培養してベクターのコピー従って配
列を得ることを含むものである（Ｔ．マニアティス等
（T.Maniatis et al.）Molecular Cloning : A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,３９０−
４０１（１９８２）；及び米国特許４，４１６，９８８
号及び４，４０３，０３６号各明細書参照）。元の配列
は又ベクターに挿入前に有機合成することもできる（米
国特許４，２９３，６５２号明細書参照）。

【０００４】サイキ等（Saiki et al.）、Science ２３
０，１５３０−１５３４（１９８５）により説明される
方法は、プライマー、ヌクレオチドトリホスフェート、
及びＤＮＡポリメラーゼなどの重合用試剤を用いて１種
以上の特定の核酸配列或いはその混合物を増幅するため
に工夫されたものである。１つのプライマーの延長生成
物は他のプライマーにハイブリダイズされると所望の特
種の核酸配列の製造のための鋳型になり、又、その逆も
同様である。この方法を必要なだけ繰返して所望量の配
列が製造される。

【０００５】この方法は多量のＤＮＡ或いはＲＮＡが容
易に入手可能でなく、そしてより多くのＤＮＡ及びＲＮ
Ａが試験を行うために十分な量を得るために調製されな
ければならない場合に、胎児その他の供与者からのＤＮ
Ａ或いはＲＮＡについて臨床試験を行うために特に有用
である。特定の病気に特徴的なＤＮＡ或いはＲＮＡの存
在は、患者からの核酸のサンプルを増幅し、そして試験
において検出される核酸配列の存在を分析するための各
種プローブ操作を用いることにより検出することができ
る。その様な試験には上記サイキ等により説明されてい
る鎌状赤血球貧血の胎児診断があり、この場合にはゲノ
ムＤＮＡの特定のω−グロビン標的配列の増幅の結果、
標的ＤＮＡコピーの指数的増大（２２０，０００倍）が
生じ、診断の感度及び速度を増大すると共にその複雑性
を減少させた。もう１つの試験はその犠牲者の核酸配列
を変更させると考えられているＡＩＤＳウィルスの診断
である。

【０００６】この増幅方法は上記分子クローニング法と
幾つかの類似性を有しているが、しかし、宿主生物体の
伝播を含まず、そこに含まれる危険性及び不都合が回避
される。加えて、この増幅法は目的配列と関連しない核
酸配列の合成を必要とせず、それにより複雑な生物学的
混合物からの生成物の広範な精製の必要性を無くす。最
後に、この増幅は目的配列からの多量の核酸配列を製造
するための及びその様な配列を比較的短時間内に製造す
るためのその他の方法よりも効率的である。

【０００７】当初上記増幅方法は実験室において手動に
より行われた。この手動方法は多数繰返される液体取扱
工程及び制御された温度におけるインキュベーションを
含むものである。これは単に時間がかかり退屈であるの
みならず、それは又ヒトのオペレータによる緊張のはず
れによって生ずる誤りにもつながるものである。その様
な誤りは遺伝的出産欠陥の診断ミスや不必要な妊娠中絶
が行われたり、或いは出産欠陥が存在する場合に妊娠中
絶がなされないことなどが生じ得る。更に、その様な誤
りの結果鎌状赤血球貧血その他の遺伝的障害の誤診を生
じ得る。

【０００８】更に、ある種の核酸は他のものよりもより
効率的に増幅し、その結果核酸配列増幅のあるものは他
のものよりもより多くの増幅サイクルを必要とする。実
験室労働力のコストは高いことがあり得るので、又実験
室が曝される危険性は誤って増幅を行う場合の誤りにお
いて高いので、この増幅方法を自動化し得る系の必要性
が生じた。

【０００９】

【発明の構成】本発明は、熱安定性酵素が用いられる場
合に、この増幅方法を実施するための温度−循環装置を
利用するものである。熱安定性酵素の使用は、酵素が熱
の存在下において不安定である場合に必要とされる酵素
の液体移転の必要性を回避する。

【００１０】より具体的には、本発明は下記手段を含ん
でなる少なくとも１つの特定の核酸配列の自動化された
増幅を行うための装置に関する：熱安定性酵素、増幅さ
れるべき核酸配列、４種の異なるヌクレオチドトリホス
フェート及び増幅されるべき各々異なる特定の配列につ
いて２種類のオリゴヌクレオチドプライマーよりなる反
応混合物（ここで、各プライマーは、１つのプライマー
から合成される延長生成物がそれがその相補体から分離
された後に他方のプライマーの延長生成物の合成のため
の鋳型として役立ち得るように、各特定の配列の異なる
鎖に体して実質的に相補的であるように選ばれる）を保
持するための熱伝導性容器、該容器を複数の所定の（ユ
ーザーにより規定された）温度のいずれかに加熱、冷却
及び維持するための手段であって、前記複数の所定の温
度の内のいずれかの温度に冷却もしくは加熱され又はい
ずれかの温度に維持されるかを制御する制御信号を受取
るための入力を有する手段、及び温度レベル、温度変化
率勾配、及びある温度レベルにおけるインキュベーショ
ンの時間を制御するために適当な制御信号を発生するた
めの該加熱及び冷却手段の入力に連結されたコンピュー
タ手段。

【００１１】本発明は又下記手段を含んでなる少なくと
も１つの特定の核酸配列の自動化された増幅を行うため
の装置を提供するものである；該増幅されるべき核酸配
列、４種の異なるヌクレオチドトリホスフェート、熱安
定性酵素及び増幅されるべき各々の異なる特定の配列に
つき２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでな
る反応混合物（ここで、各プライマーは、１つのプライ
マーから合成される延長生成物がそれがその相補体から
分離され後に他方のプライマーの延長生成物の合成のた
めの鋳型として役立ち得るように各特定の配列の異なる
鎖に実質的に相補的であるように選ばれる）を保持する
ための第一の手段（ここで、該保持は任意の選ばれた温
度或いは複数の温度において行われる）及び該第一の手
段にその内容物を第一の期間加熱させ、そしてその内容
物を第二の期間冷却させることを含む所定の順序の工程
を自動的に行うための第二の手段。

【００１２】又、もう１つの実施態様においては、本発
明は下記手段を含んでなる、アッセイの一連工程の一部
に加熱及び冷却工程を含むアッセイを行うための装置を
提供するものである：加熱及び冷却工程が有益である一
連の工程を行うための手段、及び該加熱及び冷却工程
を、アッセイを構成する一連の工程における適当な時点
において行わせるための該手段内の手段。

【００１３】もう１つの実施態様においては、本発明は
下記工程を含んでなる、少なくとも１つの特定の核酸配
列を増幅するための方法を提供する：コンピュータによ
り指令された機械を用いて、増幅されるべき核酸、４種
の異なるヌクレオチドトリホスフェート、熱安定性酵
素、及び増幅されるべき各々の異なる特定の配列につい
て２種類のオリゴヌクレオチドプライマーよりなるサン
プル（ここで、各プライマーは、１つのプライマーから
合成される延長生成物がそれが相補体から分離された場
合に他のプライマーの延長生成物の合成のための鋳型と
して役立ち得るように各特定の配列の異なった鎖に実質
的に相補的であるように選ばれる）（以下混合物とい
う）を所定の温度に所定時間加熱する工程、及びコンピ
ュータにより指令された機械を用いて、この混合物をユ
ーザーにより規定された温度に加熱し、そしてこの混合
物をユーザーにより規定された温度に冷却する工程。

【００１４】更にもう１つの態様においては、本発明は
下記工程を含んでなる、少なくとも１つの特定の核酸配
列を増幅するための方法を提供する： ａ） コンピュータにより指令された機械を用いて加熱
装置に加熱信号を与えて反応室を所定時間、所定温度ま
で及び／又は所定温度において加熱すさせる工程（ここ
で、該反応室は前記の混合物を含む）、 ｂ） コンピュータにより指令された機械を用いて、冷
却装置に冷却信号を与えて該反応室を所定時間所定温度
まで冷却させる工程：及び ｃ） これまでに行われたサイクル数がユーザーにより
規定されたサイクル数より少ない場合に、能動冷却信号
の経過時間がユーザーにより規定された時間に等しい時
に、工程ａ）からｃ）よりなるサイクルを繰返す工程。

【００１５】本発明の装置は又一般的に、操作のための
電力供給源、装置の全要素を収用するための構造系統及
びオペレーターによる装置の制御を可能にするキーボー
ド及びディスプレイパネルを含むものである。

【００１６】そこで反応が起こる試薬を保持する受容部
はその温度がユーザーにより規定されたあるインキュベ
ーションプロフィールに一致するようにコンピュータに
より制御される。３個の循環流体貯蔵器及びソレノイド
操作されるバルブ、或いは任意のその他の方法を用いて
温度が制御される。Materials Electronics ProductsCo
rporation(トレントン、ニュージャージー州)から市販
されているPeltier(ベルチェ)ソリッドステートヒート
ポンプ、並びにコンピュータにより制御される水熱交換
器或いは任意のその他の加熱及び冷却系も使用されてよ
い。

【００１７】ソレノイドにより操作されるバルブが用い
られる場合には、それらは、コンピュータ制御下にある
増幅操作中の適当な時点において、適当な温度の流体が
熱伝導性受容部のための支持構造を通して通過すること
のできるようにコンピュータに連結される。この受容部
は、コンピュータ制御下に、受容部の支持構造を通して
高温流体或いは低温流体のいずれかをいれるように工程
中の適当な時点において制御信号をソレノイドにより操
作されるバルブに送信することにより、２つの温度間に
スイッチされる。この反応室に温度センサーが連結さ
れ、そして実施あの温度を指示する信号を与えるために
コンピュータが使用される。コンピュータは実際の温度
を所望温度と比較する。この様にして誤差信号が発生さ
れ、それを用いて反応室を加熱及び冷却する装置を制御
する。コンピュータは又、この方法におけるインキュベ
ーションを実施するための特定の温度における経過時間
も追跡する。

【００１８】出発物質が反応ウエル内に負荷された後に
増幅処法を実行するために機械が行う基本的操作は水浴
を用いる１つの実施態様においては以下の通りである。

【００１９】反応室の支持構造体を介して高温流体を入
れるようにコンピュータがソレノイド操作バルブに信号
を出すことにより反応ウエルの内容物を高温流体の温度
まで加熱する。

【００２０】高温流体が“オン”の状態で入れられる時
間は経過時間カウンタにより測定される。

【００２１】コンピュータは高温流体が“オン”の状態
で入れられた経過時間を記憶中の変数設定値と対比す
る。好ましい実施態様においてはこの変数はユーザーイ
ンターフェースを介してユーザーにより変更することが
できる。他の実施態様においては、それは固定されてい
てもよい。

【００２２】経過時間が高温インキュベーションのため
の変数に一致した場合には、コンピュータはソレノイド
操作バルブに高温流体流れを停止させ、反応容器の支持
構造体を通して低温流体流れを入れるように信号を送
る。

【００２３】高温及び低温流体のために経験的に決定さ
れた“オン”の状態の時間の代わりに温度制御フィード
バックを用いる実施態様においては、ユーザーインター
フェースを介してコンピュータ内に、反応室についての
温度−時間特性がプログラムされる。これにより、コン
ピュータが、特定の増幅反応パラメータにより要求され
る順序で反応温度或いは反応試薬容器温度を制御する。
その様な実施態様においては、反応室の温度を追跡する
ためにサーミスタ或いはその他の温度センサーを用い反
応室の実際の温度をユーザーにより規定された温度−時
間特性（この明細書において「温度プロフィール」と称
する場合がある）と比較することにより得られる誤差信
号が発生する。この誤差信号を用いてヒートポンプその
他の加熱及び冷却装置を制御し、高温加熱及び高温イン
キュベーションの際及び冷却及び低温インキュベーショ
ンの際に所望の温度プロフィールを維持する。

【００２４】温度フィードバックの態様或いは経験的に
決定された時間の態様にいずれにおいても、コンピュー
タはタイマーをスタートさせ、高温或いは低温流体流れ
についての経過時間或いは特定の温度における経過時間
を温度プロフィールにおける各セグメント即ちレッグに
ついて記憶装置内に貯蔵されたユーザーにより規定され
た変数と対比する。好ましい実態態様においては、これ
らの変数はユーザーによりユーザーインターフェースを
介して設定することができる。温度センサーが用いられ
ない場合の実施態様においては、高温或いは低温流体流
れの提案される時間についての変数は、ユーザーにより
経験的に反応容器を出発温度から所定温度まで加熱或い
は冷却するのに必要な時間プラス所望のインキュベーシ
ョン時間として決定される。

【００２５】高温及び低温流体貯蔵器及びソレノイド操
作バルブを用いる実施態様のための上記温度プロフィー
ル制御装置及び方法は反応室に連結されたペルチエ（Pe
ltier）ヒートポンプ或いはその他の形態の加熱及び冷
却装置を用いる実施態様にも同様に適用可能である。

【００２６】

【実施例】熱安定性酵素を用いそして液体の取扱いを行わない増幅
機械 図１は熱安定性酵素を使用して核酸増幅方法を実施する
ことのできる機械の一般的ブロック線図である。増幅さ
れるべき核酸試料及び必要な試薬よりなる出発物質は先
ず熱交換器１０内の反応ウエル４０中に充填される。熱
交換器１０は反応ウエル４０を支持し、このものは熱交
換器内に機械工作された凹みであってよいが、しかし、
好ましくは反応に関与する流体を保持し、且つ熱交換器
１０（以後プレート１と称する場合がある）内に形成さ
れた凹みに置かれたプラスチック容器である。好ましい
実施態様においては、熱交換器１０は好ましくはアルミ
ニウム製の与えられた数の０．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ管をその中に嵌込むことができるような大きさの複
数の凹みを形成した熱伝導性ブロックである。

【００２７】これらの管の目的は、同一の反応ウエルが
異なった核酸配列を増幅させるために用いられた場合に
交差汚染を避けるように流体を熱交換器１０内の凹みの
壁から分離するために反応ウエルを内張りするものであ
る。熱交換器１０の目的は、管を支持し、そして反応成
分がユーザーにより規定された時間にわたり各種温度に
おいてインキューベートされるように、反応ウエル内の
管内に貯蔵された流体に或いは流体から熱エネルギーを
移動させるための熱交換器として作用することである。

【００２８】その目的のために、熱交換器１０は反応室
４０のごとき反応ウエル内の流体が操作中の適当な時点
で、しかも適当な時間にわたり且つ加熱及び冷却される
ような構造を有していなければならない。この加熱及び
冷却機能を実施するために、任意の構造或いは方法、例
えば熱交換器内或いはそれに連結された電気加熱、及び
冷蔵装置、例えばヒートポンプ或いはソリッドステート
の熱電子クーラーなどが用いられる。この加熱及び冷却
のためには使用される温度を達成しそしてそれを維持す
ることのできる装置であれば何であれ用いられ、又その
加熱及び冷却装置がユーザー規定の温度対時間のプロフ
ィールを達成するものであればよい。

【００２９】図１に示される好ましい実施態様において
は、１つのその様な電気的に駆動される加熱及び冷却装
置はMelcor Corporation（トレントン、ニュージャージ
ー州）から市販されているPeltier ソリッドステート熱
電子ヒートポンプ１２である。コンプレッサ、エバポレ
ータ及びコンデンサを用いる通常のヒートポンプも又は
ヒートポンプ１２として有用である。ペルチエ装置など
のソリッドステートヒートポンプはバック対バックのＰ
Ｎ結合を形成する配向多結晶インゴットの形態において
且つセラミック板でインターフェイスされた銅バスバー
に末端がハンダ付けされたＮ及びＰ型のテルル化ビスマ
ルよりなる。図３はその様な配置を示す。これらのヒー
トポンプは、ヒートシンク１４と熱交換器１０の間のい
ずれかの方向にも熱を移動させるための既知の方法によ
り、特にそれらの中に電流を通すことにより加熱或いは
冷却する。これらのソリッドステートヒートポンプはGi
lford Instruments Corporationによりキュベットを加
熱及び冷却するために用いられており、１５０ワットま
での範囲のワット数が利用可能である。これらの装置は
これらに熱的に連結された物質の塊を、摂氏−１５０度
乃至＋１１０度の範囲の温度まで冷却或いは加熱するこ
とができる。その様な半導体は熱交換器１０に公知の方
方法で熱的に連結することが出来、或いは挿入管或いは
ウエルに直接熱的に連結することも可能である。その様
な半導体は標準的プロセス制御アルゴリズムに従い、所
望の温度レベルに応じてそれらの中を流れる電流を調整
することにより容易に制御して特定の温度を達成し、そ
して維持することができる。その様なソリッドステート
ヒートポンプ系の設計方法はMelcor（９９０ Spruce S
treet，トレントン、ＮＪ０８６４８（６０９）−３９
３−４１７８）による出願に開示されている。

【００３０】図２に図示されたもう１つの実施態様にお
いては、流体の貯蔵器を一定温度に維持する水浴１６及
び１８が使用される。ここでも又、熱交換器１０はアル
ミニウム板或いは良好な熱伝導特性を有するその他の金
属である。この熱交換器の金属内に加熱或いは冷却流体
がポンプ送りされる流路が機械工作され或いは成形され
る。図２に図示される機械の１つの実施態様において、
熱交換器１０は管４２に連結した流体入口及び管４４に
連結した流体出口を有する。これらの２本の管は流体マ
ルチプレキサー４６の出力に連結している。この流体マ
ルチプレキサーは２対の入口／出口を有する。一方の対
４７は高温流体搬送管４８及び５０に連結されており、
そして他方の対４９は低温流体搬送管５２及び５４に連
結されている。各対の口は１つの入口路及び１つの出口
路を有する。例えば第１の対は管４８に連結されたその
入口路及び管５０に連結されたその出口路を有する。同
様に流体マルチプレキサー４６の出口対は管４２に連結
された１つの出口路及び管４４に連結された１つの入口
路を有する。流体マルチプレキサー４６の目的は第１の
入口対、管４８及び５０、或いは第２の入口対、管５２
及び５４にいずれかを選択的にライン５６上の選択信号
に従って出口対４３に選択的に連結することである。第
１の対の口４７が選ばれるならば、管４８はＳＯＶ１と
示されるソレノイド操作バルブの形の流体マルチプレキ
サー４６中の内部流体路を介して流体連通的に管４２に
連結される。同様に、管５０はＳＯＶ２で示されるソレ
ノイド操作バルブの形の流体制御マルチプレキサー４６
内の内部流体流路を介して管４４に連結される。第２の
対の口４９が選ばれる場合にも同様な接続が生ずる。

【００３１】この様にして、熱交換器１０、及びウエル
４０のごとき反応ウエル内の管に貯蔵された流体の温度
は導体５６上の温度選択（ＴＥＭＰ ＳＥＬＥＣＴ）信
号の状態により制御される。１つの実施態様において、
流体マルチプレキサー４６は適当に管４２，４４，４
８，５０，５２及び５４と相互連結されたＳＯＶ１〜４
で示される４つのソレノイド操作バルブで操作される。
しかしながら、上記流体切替えを行うことのできる任意
の装置で十分である。事実、熱交換器１０の温度の操作
に関してソリッドステートの或いは通常のヒートポンプ
１２が使用されるならば、流体マルチプレキサー４６の
必要性及び費用が除去される。

【００３２】流体マルチプレキサー４６に連結された管
内を流れる加熱及び冷却流体はそれぞれ高温流体貯蔵器
１６及び低温流体貯蔵器１８からポンプ送りされる。こ
れらの貯蔵器の目的はその様な流体の体積を維持するこ
と或いは一定温度にいて凍結防止することである。一般
的に、温度流体は８０〜１５０℃、好ましくは９０〜１
００℃の温度に維持され、及び低温流体は約３５〜６０
℃、好ましくは３７〜５０℃の一定温度に維持される。
貯蔵器１６及び１８はそれらがそれらの流体貯蔵器を維
持する温度に関して調整可能である。水浴１８は−３５
〜＋１５０℃の範囲のいずれかにおいても貯蔵器温度を
達成することができるように調整可能であるのが好まし
い。この水浴１８は１３ｌの水容積及び毎分１００℃を
越える冷却速度を有するような迅速な冷却特性を有する
のが好ましい。これは温度安定化時間を最少にするのに
役立つ。増幅操作の期間に亘ってその様な温度を達成し
そして維持することのできる任意の流体加熱及び冷却装
置が本発明の目的のために十分である。好ましい実施態
様においては、ＶＷＲ１１３５及びＶＷＲ１１５５水浴
が用いられる。

【００３３】増幅方法において用いられる酵素はまず反
応ウエル４０内のその他の試薬に添加される。

【００３４】ここに用いられる酵素は以下に規定するよ
うな核酸鎖を変性するために用いられる高温に耐えるこ
とのできる熱安定性酵素である。従って、熱安定性酵素
を温度プロフィールのいずれかの点において反応ウエル
に添加するために液体取扱器は必要ではない。酵素は常
時反応ウエル４０に留まってよい。

【００３５】反応容器の温度の制御は図１の実施態様及
び図２の実施態様のいずれかの場合にもＣＰＵ２０によ
り維持される。ＣＰＵは以下に詳細に説明される制御プ
ログラムを実行する。基本的には、記憶装置２４に格納
されている制御プログラムはヒートポンプ１２或いは流
体マルチプレキサー４６ろ制御する。ユーザーは、どの
温度プロフィールをユーザーが実行したいかに関してＣ
ＰＵ２０及びディスプレイ／キーボードユーザーインタ
ーフェース２２を介して制御プログラムにより質問され
る。ユーザーは所望プロフィール上の温度及びユーザー
がそれらの温度を達成したいと思う回数を回答する。こ
れらの回答はユーザーインターフェース２２からＣＰＵ
２０により読取られる。ユーザーへの質問はユーザーイ
ンターフェース２２上のディスプレイに表示されそして
ユーザーの回答はそのキーボードを介して受取られる。
所望プロフィール上の時間及び温度のチェックポイント
の形態でのユーザーの回答はＲＡＭ２４内に格納され
る。典型的時間対温度プロフィールを図５に示す。ＣＰ
Ｕは次いで反応容器４０を所望温度プロフィールに維持
するために熱を熱交換器１０に添加するか或いはそれか
ら除去するための適当な制御信号を発生する。

【００３６】図１に示された実施態様の場合において、
ヒートポンプを制御するためにＣＰＵ２０により発生さ
れる制御信号はパルス幅変調制御パルスのパルス列より
構成されるものである。これらのパルスはライン５６上
のヒートポンプインターフェース回路２６に連結され
る。

【００３７】ヒートポンプインターフェースの回路構成
をより詳細に図４に示す。このインターフェース回路の
目的はＣＰＵからの理論レベルであるパルス幅変調制御
パルスをソリッドステートヒートポンプ１２を通る同一
継続時間の高電流パルスに変換することである。この目
的のために４つのＮチャンネルＭＯＳＦＥＴパワートラ
ンジスタ３０，３２，３４及び３６が用いられる。これ
らのトランジスタは負荷としてのソリッドステートヒー
トポンプ１２とブリッジ配置で接続される。このブリッ
ジはライン３９及び４０上のＣＰＵからの２つの制御信
号の影響下に負荷１２を通る電流の流れの方向を反転さ
せる。ライン４０上の冷却制御信号が活性である場合に
は、トランジスタ３４及び３２がオンとなり、そしてト
ランジスタ３０及び３６がオフとなる。この理由は冷却
信号がライン５８によりトランジスタ３４のゲートに供
給され、このトランジスタがオンとなるからである。こ
の信号はトランジスタ６２をオンにし、この結果ライン
６４上のゲート電圧を接地ポテンシャルまでプルダウン
し、それによりトランジスタ３６をオフにする。

【００３８】ライン３９上の熱制御信号は常にライン４
０上の冷却制御信号と反対の２値論理状態にある。冷却
を行う場合には、トランジスタ３０のゲート６６は論理
０で低く、このトランジスタはオフとなる。ライン６６
上の論理０は又トランジスタ６８をオフにし、それはラ
イン７０上の＋１５ボルトの電圧によりトランジスタ３
２のゲート７２を論理１レベルにする。これがトランジ
スタ３２をオンにし、それにより負荷１２を介して右か
ら左への電流回路、即ちライン７０及び電力供給源から
トランジスタ３４のドレイン及びソース、ライン７６、
負荷１２、ライン７８、そしてトランジスタ３２のドレ
イン及びソースを通り接地に至る電流経路を完成する。

【００３９】熱信号が活性である場合には、上述と反対
の状況が生ずる。この場合には、トランジスタ３０，６
８及び３６がオンとなり、トランジスタ３４，６２及び
３２がオフとなる。

【００４０】図２に示された実施態様においては図４の
インターフェース回路は必要ではない。しかしながら、
ＣＰＵにソレノイド操作バルブを制御させるためにいく
つかのソレノイド駆動器インターフェースが必要であ
る。適当なインターフェースの設計は当業者によく知ら
れている。

【００４１】図１或いは図２のいずれかの実施態様にお
けるＣＰＵ２０は数多くの異なった種類のコンピュータ
のいずれか１つであってもよい。それは通常コンピュー
タと称されるもの、ＬＦＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
（クリントン、マサチューセッツ州）から市販されてい
るコントローラなどの既製のコントローラであってよ
く、或いはそれはＩＢＭその他のパーソナルコンピュー
タ、ミニコンピュータ或いはメインフレームであってよ
い。いずれの種類のコンピュータが使用されても、それ
はリアルタイムにおいて或いはコンピュータが設定され
る時点のいずれにおいても所望温度プロフィールに関
し、ユーザーからのデータを許容することのできるもの
でなければならない。図１及び図２のセンサー８０のご
とき実際の温度センサーを用いる態様において、「設定
点」を計算するための何等かの機構がなければならな
い。「設定点」とは実際の温度と目標温度の間の誤差に
基づいて誤差信号を計算する際に用いることのできるユ
ーザー規定温度プロフィールからとられる目標温度であ
る。次に図５に図示される典型的温度プロフィールを参
照する。典型的ユーザー規定温度プロフィールチェック
ポイントが小円として示されている。チェックポイント
１は時間Ｔ₀における反応容器４０中の温度レベルＬ₀に
より特徴付けられる。チェックポイント２はより遅い時
間Ｔ₁における温度レベルＬ₂により特徴付けられる。チ
ェックポイント３は時間Ｔ₂などにおける反応容器４０
における温度レベルＬ₂の存在により特徴付けられる。
これらのチェックポイントの間の区間は「レッグ」と称
される。

【００４２】実際の温度センサーを用いない実施態様に
おいてＣＰＵ２０は加熱或いは冷却作用が行われる際の
時間を追跡するようにプログラムされなければならな
い。更に、ＣＰＵは加熱或いは冷却レッグの際の実際に
経過した時間を対比させる１以上の経験的に求められた
時間を貯蔵することができなければならない。これらの
経験的に決定される時間はユーザーにより実験的に決定
されるものである。典型的にはユーザーは図４のソリッ
ドステートヒートポンプのインターフェースの設計に際
し、ある種の電流を設定し、この電流を図１の実施態様
における全ての加熱及び冷却に用いる。図２の実施態様
の場合においては、ユーザーは恒温及び低温貯蔵器１６
及び１８の温度レベルを設定しなければならない。図１
の実施態様の場合における固定された電流及び図２の実
施態様における貯蔵器の固定された温度レベルは、ある
与えられた質量の熱交換器１０及び反応容器及び内容物
についてユーザーにより規定される加熱或いは冷却変化
率を確立する。ユーザーは次いで所望のチェックポイン
トを規定し、及び固定された加熱或いは冷却速度におい
てこれらのチェックポイントまで加熱或いは冷却するま
でに必要な時間を決定する。チェックポイントに到達す
るまでの時間が許容可能でない場合には、時間が正しく
なるまで加熱或いは冷却速度を調節しなければならな
い。勿論、この手法は加熱及び冷却レッグの傾斜が「経
験的種類」の実施態様と称されるこれらの実施態様を用
いる場合には、常に同一でなければならないので加熱或
いは冷却速度がリアルタイムで調整することができない
場合には余り、柔軟性があるとは云えない。

【００４３】他の経験タイプの実施態様の種類はＣＰＵ
２０が各レッグ上において異なった加熱及び冷却速度を
用いるようにプログラムすることである。これは各レッ
グに異なった傾斜をもたせる。これはパルス幅変調を用
いて達成されるが、しかし図１及び図２の実施態様のい
ずれにおいても如何なる温度センサー及び実際の温度フ
ィードバックをも用いずに達成される（破線部の温度セ
ンサーの図示はこれらの実施態様を示すことを目的とし
たものである）。これらの代替的実施態様においては、
加熱或いは冷却電流（即ち図２の実施態様においては流
体流）はパルスの流れである。本来のサイクルはＣＰＵ
２０によってより大きな加熱或いは冷却速度が必要であ
る場合には、パルスの“オン”時間が延長されるように
ＣＰＵ２０により制御される。加熱或いは冷却速度が減
少されるべき場合には上述のことと反対のことが適用さ
れる。これらの実施態様においては経験時間及び加熱及
び冷却速度は共にチェックポイントにおける温度レベル
間の間隔が所望通りになるまで調整されるので温度プロ
フィールを調整するためのより大きな自由度を有する。

【００４４】一般的に、これは好ましい実施態様よりも
ユーザー側により多くの作業を要求し、余り正確ではな
い。その理由は、一度ユーザーが各レッグに対して固定
された加熱或いは冷却速度を確立すると、その速度がそ
のレッグに対して固定され、変化する条件を斟酌するた
めにリアルタイムに変更することができない。即ち、こ
れらの実施態様においては、変化する周囲条件或いはそ
の他の変化を補正するためにＣＰＵ２０はリアルタイム
で加熱及び冷却速度を変更しない。

【００４５】好ましい実施態様は加熱及び冷却速度を制
御するために実際の温度フィードバック及び閉ループ制
御系を用いる。これはリアルタイム誤差信号発生により
所望温度プロフィールに実際の温度プロフィールを一致
させることを可能にする。好ましい実施態様を実施する
ために、ＣＰＵ２０はユーザーに所望の温度プロフィー
ルについて「チェックポイント」を入れさせるようにプ
ログラムされる。次いでＣＰＵ２０は経過時間を測定す
るために時計の進行を開始し、そしてチェックポイント
により定義された所望の温度プロフィールに基づいて
「設定点」を定期的に計算する。これらの計算された設
定点は達成目標であり、誤差信号を発生するためにもう
１つのソフトウエアルーチンにおいて使用される。

【００４６】誤差信号発生ルーチンは温度センサー８０
からの反応室の実際の温度を読取りそれを設定点により
定義された所望温度と対比する。図５の温度プロフィー
ルについて計算された典型的な設定点はチェックポイン
ト１及び２の間のレッグ１上の３つの×印により示され
ている。この比較は誤差信号をもたらし、それはパルス
幅変調ルーチンにより用いられて加熱及び冷却装置によ
る反応室の加熱或いは冷却を引起こす制御信号を発生す
る。

【００４７】このパルス幅変調ルーチンは加熱及び冷却
制御信号のための必要な“オン”時間即ちデューティサ
イクルを計算し、そしてこれらの２つの制御信号のいず
れが活性であるべきかを決定する。次に、適当な制御信
号が発生され、ソリッドステートヒートポンプインター
フェース２６或いは流体マルチプレキサーその他の加熱
及び冷却装置に書込まれる。

【００４８】図１及び図２に示された実施態様のために
センサー８０を用いない経験時間実施態様についてこの
機械が行わなければならない増幅方法は図６及び７にお
けるフローチャート形式に与えられている。この方法は
ブロック７４におけるユーザーからの増幅処理をスター
トさせるコマンドでスタートする。この時間前にユーザ
ーは熱交換器１０内の反応室４０中に適当な酵素を増幅
されるべき核酸配列及び以下に規定する適当な試薬と共
に充填しておかねばならない。ある実施態様において
は、熱交換器１０内の反応室４０には米国特許４，４７
８，０９４号により説明されているＣｅｔｕｓ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ（エメリービル、カリフォルニア州）
からの液体取扱器などの通常の液体取扱器（図示せず）
により自動的に適当な出発物質が装填される。

【００４９】このスタートコマンドを受取ると、ＣＰＵ
２０は工程８２において第一のチェックポイントデータ
を検索し、そして図２の温度選択ライン５６上に適当な
信号を与え（図６及び７の操作方法は図１に示された実
施態様にも同様に適用可能である）、ＳＯＶ対４６の開
口部に熱交換器１０を以下において温度変数Ｌ_H と称す
るユーザー規定レベルに等しい高温に加熱させる。

【００５０】幾つかの実施態様においては、温度変数Ｌ
_H は変数ではなく、高温貯蔵器１６の温度において固定
された定数である。その他の実際の温度フィードバック
データを用いる非−経験的実施態様においては変数Ｌ_H
はユーザー規定のものであり、ＣＰＵ７０は反応室４０
の温度を監視し、温度制御装置（ソレノイド−操作バル
ブプラス貯蔵器或いはヒートポンプインターフェースプ
ラスヒートポンプ）に適当なコマンド信号を発して所望
の温度に達するまでそれに熱交換器１０を加熱させ、次
いで温度制御装置に適当なコマンドを発して所望温度を
維持させる。現在説明されている経験的実施態様におい
ては、ＣＰＵ２０によっては熱交換器１０の温度の監視
は行われない。しかしながら、好まし実施態様において
は熱交換器１０及び反応容器の温度はＣＰＵ２０により
監視され、及び誤差信号が実際の温度をユーザー−規定
チェックポイントからの計算された設定点と対比するこ
とにより発生され、ユーザー−規定時間対温度プロフィ
ールに従って熱交換器１０の温度を制御する。

【００５１】この温度インキュベーション時の反応室４
０の温度は８０〜１０５℃、好ましくは９０〜１００℃
に維持されるべきである。変性過程が生ずる最低温度は
８０℃である。温度Ｌ_Hまでの温度上昇プロフィールは
可能な限り迅速であるべきであり、１サイクル内の全完
結時間における時間を節約するために通常０．５〜５分
間、より好ましくは１〜３分間である。

【００５２】勿論全てのこれらが起こる前にユーザーは
チェックポイントデータを入れなければならない。ユー
ザーにチェックポイントの入力をうながし、その様に入
れられたデータを格納し、そしてそれを順次設定点の計
算のために検索する工程は通常のものであり、本発明の
方法に重要なものではなく、従ってそれらは示されな
い。

【００５３】これらの経験的時間の実施態様の増幅方法
は加熱のスタートからインキュベーションの終りまでの
ユーザーにより規定された経験的に決定された時間の高
温インキュベーション期間を用いる。インキュベーショ
ンの実施のために、コンピュータは工程８４において時
計をスタートさせ、加熱の開始から温度レベルＬ_Hに向
って経過時間を測り、この経過時間を工程８６により表
示されているようにユーザーにより入れられた高温イン
キュベーション時間Ｔ_Hと対比する。好ましい実施態様
においては、インキュベーション時間変数はユーザーに
よりアルタイムに任意の非経験的値に設定されてよい。

【００５４】その他の実施態様においては、時間Ｔ
_H（加熱及び高温インキュベーション時間）は実験的に
決定され次いで永久格納のためにＲＯＭ中に「書き込む
（ｂｕｒｎ）」固定時間であってよい。ある実施態様に
おいては、ＣＰＵ２０は、図１の熱交換器１０に結合さ
れライン８１を介してＣＰＵ２０に連結されている温度
センサー８０などを使用して熱交換器１０の温度を監視
し、そしてプレート１が温度変数Ｌ_Hの温度に到達する
時点で高温インキュベーション時間の計時を開始してよ
い。

【００５５】図６及び７の実施態様において、ユーザー
はプレート１が所望温度Ｌ_Hに達するのに必要な時間プ
ラス温度Ｌ_Hにおける高温インキュベーションのための
所望時間を含む経験的に確立された時間における変数Ｔ
_Hを設定する。コンピュータが、所望温度Ｌ_Hが達成され
た時にのみ経過時間の追跡をスタートする場合即ち温度
センサー８０が用いられる場合の実施態様においては、
変数Ｔ_Hはユーザーによりプレート１が温度Ｌ_Hに到達す
るに必要な時間の量を考慮することなく温度Ｌ_Hにおけ
る高温インキュベーションに所望な時間に設定されてよ
い。好ましい実施態様においては、温度Ｌ_Hは９０〜１
００℃に固定される。

【００５６】経過時間が工程８８により決定された所望
インキュベーション時間に等しい場合には、ＣＰＵ２０
は加熱及び冷却装置に適当なコマンドを送り、プレート
１をユーザーにより設定された低温インキュベーション
温度Ｌ_Lの方向に冷却させる。これは工程９０により表
示されている。工程９０は、図２の実施態様の場合にお
いては、チューブ５２及び５４を選択してチューブ４２
及び４４に連絡するための、ＣＰＵ２０によるコマンド
の流体制御マルチプレキサー４９への伝達を表わし、こ
の様にしてユーザーにより手動的にＬ_Lに設定された低
温流体貯蔵器１８の温度の流体が熱交換器１０を通って
流れ始める。その他の実施態様においては、ＣＰＵ２０
は単に加熱及び冷却装置にペルチエヒートポンプ１２の
ごときプレート１に熱的に連結している電気的に駆動さ
れる冷蔵装置のスイッチを入れるためのコマンドを送る
のみでよい。良結果をもって用いられる高温から低温へ
の冷却速度の範囲はバランスを考慮して決定される。極
めて迅速な冷却例えばドライアイスを用いて反応室の温
度を直ちに低下させることは増幅方法を阻害或いは停止
させる。他方、遅い冷却は１サイクルの全完結時間を長
引かせる。好ましくは、冷却速度は約０．５〜５分間、
好ましくは１〜３分間の範囲である。好ましい実施態様
においては約３５〜６０℃の範囲の固定温度がユーザー
により低温流体貯蔵器１８の手動調整により設定され、
図２の実施態様の場合にこの温度を維持する。図１の実
施態様の場合においては、ＣＰＵ２０がＬ_Lについてユ
ーザーの入れたデータに基づき電流の適当な方向及びデ
ューティサイクルを確立する。デューティサイクルは特
定のレッグについてユーザー規定データに基づいても良
く、或いはいづれかのタイプの実施態様において固定さ
れてよい。この増幅方法において用いられる熱安定性酵
素に対しては約３５〜６０℃の温度範囲が最適温度であ
る。この増幅方法が首尾よく実施され得る広範囲の温度
は約３０−３５℃乃至１０５℃である。

【００５７】次の工程は工程９２により示され、経過時
間を測定しそれをユーザー設定低温時間と対比する過程
である。温度Ｌ_L に到達するのに必要な最適時間は正確
には知られていないが、しかし、約１〜３分間が有効で
あることが知られている。経験的実施態様においては、
ＣＰＵ２０はプレート１の温度を追跡しない。それは単
にプレート１を冷却する旨のコマンドが発生された後で
経過時間を追跡するに過ぎない。ユーザーは経験的にプ
レート１の温度を温度Ｌ_Lまで減少させるのにどれ位時
間がかかるかを決定しなければならない。工程９２にお
けるＣＰＵ２０は常に実際に経過した時間をユーザー−
規定時間Ｔ_L と対比する。必要な時間が経過すると、処
理は工程９４に進行する。

【００５８】工程９４は低温インキュベーションの完了
に対する監視の過程を表す。ある実施態様において、コ
ンピュータＣＰＵ２０は、温度Ｌ_L が達成されると経過
時間の追跡を開始する。工程９４はコンピュータが実際
の経過時間を低温インキュベーション時間、すなわちユ
ーザー設定変数Ｔ_L と対比する過程である。ある実施態
様においてはこの変数はリアルタイムにコンピュータの
記憶装置内に貯蔵されたユーザー規定時間であるのに対
し、他の実施態様においては、時間Ｔ_L は固定され経験
的に決定された後永久に格納される。

【００５９】経過時間が所望低温インキュベーション時
間Ｔ_L に等しくなるや否や、工程９４は処理を工程９６
に進行させ、この工程はソフトウェアサイクルカウンタ
を増して第一サイクルの終りをマークする。実際の経過
時間が時間Ｔ_L に等しくならない場合は、処理はライン
９８上を工程９２に進み、もう一度経過時間を所望時間
Ｔ_Lと対比する。工程９６の後、ＣＰＵ２０は工程１０
０に進む。

【００６０】工程１００及び工程１０２はサイクルカウ
ント数を所望サイクル数を表わす記憶装置内のユーザー
規定変数と対比する過程である。ある実施態様において
は、所望サイクル数は固定された数であるが、しかし好
ましい実施態様においては所望サイクル数はユーザー−
規定数である。これはユーザーに以下に更に説明する異
なる核酸配列の増幅の異なる効率を斟酌するために行わ
れる増幅のサイクル数を変化させる柔軟性を与える。サ
イクルカウント数が所望サイクル数に一致しない場合に
は処理はライン１０４を介して工程１０６に進み、経過
時間時計を再セットし、そしてそこから処理はライン１
０８を介して工程８２に進み、そこでもう１つのサイク
ルが開始される。所望サイクル数が行われたならば、次
いで処理は工程１０８に進む。そこでユーザーがもう１
つの「ファイル」即ちデータベースに格納されているも
う１つの温度プロフィールを運転することを望むかどう
かが決定される。ユーザーにより入れられるいづれの温
度プロフィールもリンクデーターフィールドを有し、こ
れには実行されるべき次のファイル即ち温度プロフィー
ルがある場合にはそのファイル特定が格納されている。
このリンクフィールドの内容は工程１０８において読取
られる。ユーザーがリンクフィールドに何も入れていな
い場合には、次いで処理は工程１１０に進み、終了メッ
セージが表示される。工程１０８がリンクフィールドに
ファイル番号を見出す場合には、次いで処理は工程１１
２に進む。この工程は経過時間時計を再設定し、そして
新しいファイルからの第一のチェックポイントを検索す
る。処理は次いで工程８２においてスタートし、新しい
ファイルのチェックポイントにより決定される温度プロ
フィールの実行に進む。

【００６１】図６及び７の制御方法は温度プロフィール
のための二つのチェックポイントのみを示す。他の実施
態様においては、一般的に高温のインキュベーション及
び一般的に低温のインキュベーションが適当な温度にお
いて十分な時間行われることを条件としてより多くのチ
ェックポイントが使用されてよい。

【００６２】図８及び９に示された方法を実行する好ま
しい非経験的「閉鎖ループ」実施態様においては、工程
８１におけるＣＰＵ２０はユーザー規定温度プロフィー
ルのレッグ１のための加熱をデフォルト（ｄｅｆａｕｌ
ｔ）速度でスタートさせ、そして工程８３における時計
をスタートさせる。ＣＰＵ２０は次いで工程８５におい
て目標温度として設定点を計算し、そして工程８７にお
いてプレート１の温度を監視し、それをユーザー−設定
温度プロフィール上の設定点と対比する。工程８５は、
温度プロフィールの勾配をユーザー−設定チェックポイ
ント間で計算し、そしてその勾配と計算時における経過
時間とに基づき新しい設定点を計算することにより定期
的に設定点に改訂する。比較に基づく誤差信号は工程８
９においてＣＰＵ２０により発生することができる。こ
の誤差信号を次いで工程９１において、適当な制御信号
に転換して加熱及び冷却装置を制御する。ソリッドステ
ートヒートポンプの場合には、誤差信号デューティサイ
クルを変更するのに用いられる。この改訂された制御信
号を次いでライン５６上に出力し、加熱及び冷却装置に
反応室温度を調整させる。プレート１がある特定の設定
点について所望プロフィールより熱くなったならば、次
いで低温流体のスイッチを入れ、それを図２の実施態様
において冷却する。図１の実施態様の場合にはソリッド
ステートヒートポンプを通る電流の方向を逆転させるか
或いは熱パルス必須サイクルの“オン”時間を減少させ
て誤差信号の大きさをゼロの方向に減少させることが可
能である。

【００６３】図８及び９の好ましい実施態様の制御方法
においては、ＣＰＵ２０は、工程８１において、温度制
御装置にプレート１を高温インキュベーションレベルに
加熱することを開始するコマンドが送られると同時に経
過時間の計時を開始する。工程９１（或いは誤差がない
場合には工程８９）が図８及び９において行われた後、
工程９３を実行して実際に経過した時間を記憶装置内に
格納されたユーザー設定時間（その時点で次のチェック
ポイントが達成されなければならない）と対比する。経
過時間がチェックポイント時間に等しいか或はより大き
い場合には、処理は工程９５に進み、次のチェックポイ
ントの時間及び温度データを検索する。

【００６４】経過時間が次のチェックポイントへの時間
より短い場合には、処理はライン９７上を図８及び９の
工程８７に戻る。次いで、次の設定点が計算され、そし
て処理は上記と同様に継続される。

【００６５】工程８９の誤差信号計算は任意の公知の比
例的制御アルゴリズムを用いてなされる。その様なアル
ゴリズムは良く知られており、シンスキー（Ｓｈｉｎｓ
ｋｅｙ）、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ第２版第１章（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌ １９７
９）ＩＳＢＮ ０−０７−０５６８９１ｘに記載されて
いる。

【００６６】次のチェックポイントについての時間及び
温度データの検索後、ＣＰＵは工程９９において完全な
温度プロフィールが処理された否かを決定する。このサ
イクルが完結されていなかった場合には処理はライン９
７上を工程８７に戻り次の設定点を計算する。処理は工
程８７から次いで上記の如く継続される。

【００６７】温度プロフィールが完結されたならば、次
いで工程１０１を実行してサイクルカウンター（ソフト
ウェアカウンター）を増加して温度プロフィールを通じ
て１つの完全なサイクルが完結されたことを示す。次
に、ＣＰＵ２０は記憶装置から今完結された特定の温度
プロフィールの所望サイクル数を示す値をデータベース
中のデーターフィールドから検索する。これは工程１０
３により示される。この値はユーザーにより図１及び図
２のユーザーインターフェースにより供給されそしてＲ
ＡＭ２４に貯蔵されているチェックポイントデータ及び
その他の情報が充填されているデータベースから検索さ
れる。工程１０５においては、完結されたサイクル数が
ユーザー規定所望サイクル数と対比される。所望サイク
ル数が完結されていない場合には次いで処理はライン１
０７上工程８１に戻る。同一のプロフィールにおける第
一のチェックポイントを次いで検索し、そして現在の温
度プロフィールにおける同一チェックポイントの処理が
再び上記の如く開始される。

【００６８】工程１０５が、温度プロフィールによる所
望のサイクル数が完結されたことを示す場合には、次い
で工程１０９を実行してファイルリンケージを決定す
る。ユーザーのうちあるものは１つの温度プロフィール
を幾つかのサイクル数ｘ回運転し、そして次いで異った
温度プロフィールを異ったサイクル数ｙ回運転するな
ど、各温度プロフィールについて異ったサイクル数を運
転することを希望することがある。各温度プロフィール
データベースはファイル特定番号が与えられ、そして各
ファイルはそのプロフィールのためのデータベース中に
リンクフィールドを有する。このリンクフィールドの内
容が工程１０９において検索され、次の温度プロフィー
ルのファイル番号が実施される。即ち次のファイルが
「実行」される。このリンクフィールドの内容がゼロ或
いは何等かの他の所定のコードである場合には次いでリ
ンク処理は行われず、ディスプレイ上にその旨表示され
て処理が停止される。リンケージがある場合には、工程
１１１が行われ、新しいプロフィールの第一のチェック
ポイントを検索し、処理は上記の如く工程８１から継続
する。このリンキンク操作は次の温度プロフィールの終
りにおいて繰返され、リンキンクアドレスがなくなるま
で続けられる。処理は次いで完了する。

【００６９】増幅方法 本発明により自動化される増幅方法は熱安定性酵素を用
いる現存する核酸配列の増幅方法である。

【００７０】具体的には、この増幅方法は、核酸或いは
核酸混合物に含有される少なくとも１つの特定の核酸配
列を増幅することを含むものであって、その核酸が二本
鎖である場合には、それは二本の等しい或は等しくない
長さの分離された相補的鎖よりなるものであり、下記工
程を含んでなるものである： （ａ）各核酸鎖を四種の異なるヌクレオチドトリホスフ
ェート及び増幅されべき各々の異なる特定の配列につい
て二種類のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる
工程であって、各プライマーが１つのプライマーから合
致される延長生成物がそれがその相補体から分離された
場合に他のプライマーの延長生成物の合成のため鋳型と
して役立ち得るように各特定の配列の異った鎖に実質的
に相補的であるように選ばれ、該接触が各プライマーの
その相補的核酸鎖へのハイブリダイゼーションを促進す
る温度において行われる工程、（ｂ）各核酸鎖を、工程
（ａ）と同時に或いはその後にヌクレオチドトリホスフ
ェートの結合を触媒して各核酸の各鎖に相補的なプライ
マー延長生成物を形成する熱安定性酵素と接触させる工
程、（ｃ）工程（ｂ）からの混合物を有効時間にわたり
且つ有効温度において加熱して、酵素の活性を促進し、
そして増幅されるべき各々の異なる配列について、各核
酸鎖の鋳型に対して相補的である各プライマーの延長生
成物を合成するが、しかし、各延長生成物をその相補的
鎖鋳型から分離する程高温には加熱しない加熱工程、
（ｄ）工程（ｃ）からの混合物を有効時間にわたり且つ
有効温度において加熱してプライマー延長生成物をそれ
らが合成された鋳型から分離して一本鎖分子を生成する
が、しかし不可逆的に酵素を変性させる程高温には加熱
しない加熱工程、（ｅ）工程（ｄ）からの混合物を有効
時間にわたり且つ各プライマーの工程（ｄ）において、
生成された一本鎖分子の各々へのハイブリダイゼーショ
ンを促進する有効温度に冷却する工程、及び（ｆ）工程
（ｅ）からの混合物を有効時間にわたり且つ酵素の活性
を促進して増幅されるべき各々の異なる配列について、
工程（ｄ）において生成された各核酸鎖鋳型に相補的で
ある各プライマーの延長生成物を合成するに有効な温度
に加熱するがしかし、延長生成物をその相補的鎖鋳型か
ら分離する程の高温には加熱しない加熱工程（但し工程
（ｅ）〜（ｆ）は同時に或いは逐次行われてよい）。

【００７１】工程（ｄ）〜（ｆ）は配列の所望レベルの
増幅が得られる迄繰返されてよい。

【００７２】この増幅方法は既存の完全に特定された核
酸配列の多量製造のみならず、存在することは知られて
いるが完全には特定されていない核酸配列の製造にも有
用である。いづれの場合においても、増幅されるべき配
列の最初のコピーが利用可能でなければならないが、そ
れは純粋な或いは個々の分子である必要はない。

【００７３】本発明において用いられる「オリゴヌクレ
オチド」という用語は２個以上好ましくは３個を越える
デオキシリボヌクレオチド類或いはリボヌクレオチド類
よりなる分子と定義される。その正確な大きさは数多く
の要因に依存するが、それらの要因は又オリゴヌクレオ
チドの研究的機能或いは用途に応じて異なる。このオリ
ゴヌクレオチドは合成的に或いはクローニングによって
誘導されてよい。

【００７４】本発明において用いられる「プライマー」
という用語は、生成された制限消化物に天然において存
在するか或いは合成的に製造されたかを問わず、核酸鎖
に相補的であるプライマー延長生成物の合成が誘発され
る条件下、即ち適当な温度及びpHにおいて四種の異った
ヌクレオチドトリホスフェート及び熱安定性酵素の存在
下に置かれた際に合成の開始点として作用することので
きるオリゴヌクレチドを指す。

【００７５】プライマーは、増幅における最大効率のた
めには一本鎖であるのが好ましいが、或いは又二本鎖で
あってもよい。二本鎖の場合には、プライマーは先ず処
理されてその鎖を分離してから延長生成物を調製するた
めに用いられる。好ましくはプライマーはオリゴデオキ
シボヌクレオチドである。プライマーは熱安定酵素の存
在下において延長生成物の合成を開始するのに十分に長
くなければならない。プライマーの正確な長さは温度、
プライマーの由来及び使用される方法などの多くの要因
に応じて異なる。例えば、目標配列の複雑さに応じて、
オリゴヌクレオチドプライマーは典型的に１５〜２５或
いはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、それは更に
少ないヌクレオチドを含むものであってもよい。短いプ
ライマー分子は一般的に鋳型と十分に安定なハイブリッ
ド複合体を形成するためにはより低温を必要とする。

【００７６】本発明におけるプライマーは増幅されるべ
き各特定の配列の異なる鎖に「実質的に」相補的である
ように選ばれる。これはプライマーがそれらのそれぞれ
の鎖とハイブリダイズするように十分に相補的でなけれ
ばならないことを意味する。従って、プライマー配列は
鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば非−相
補的ヌクレオチド断片がプライマーの５′末端に結合
し、プライマー配列の残部が鎖と相補的であってよい。
或いは又、そのプライマー配列が増幅される鎖の配列と
それとハイブリダイズするに十分な相補性を有して他の
プライマーの延長生成物の合成のための鋳型を形成する
ならば、非相補的塩基或いはより長い配列をプライマー
中に散在させることができる。しかしながら、検出目的
のためには、特に標識配列に特異的なプローブを用いる
場合には、最良の結果を得るためにプライマーは典型的
に正確な相補性を有する。

【００７７】本発明において用いられる「制限エンドヌ
クレアーゼ」及び「制限酵素」という用語はその各々が
ある特定のヌクレオチド配列において或いはその近辺に
おいて二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を指す。

【００７８】本発明において用いられる「熱安定性酵
素」とは熱に安定であり、且つ耐熱性であり、そして適
当な方法でヌクレオチドの結合を触媒（容易化して）し
て各核酸鎖に相補的なプライマー延長生成物を形成する
酵素を指す。一般的に合成は各プライマーの３′末端か
ら開始され合成が終了して異なる長さの分子を生成する
まで鋳型鎖に沿って５′方向に進行する。しかしなが
ら、上記同一方法を用いて５′末端から合成を開始して
他の方向に進行する熱安定性酵素もある。

【００７９】本発明における熱安定性酵素は増幅反応に
対して有効でなければならないという１つの標準を満足
しなければならない。即ちこの酵素は二本鎖核酸の変性
を行うのに必要な時間高温に曝された場合に不可逆的に
変性（不活性化）されてはならない。本発明における目
的のための不可逆的変性とは酵素活性の永久的且つ完全
な喪失を指す。変性に必要な加熱条件は例えば緩衝塩濃
度及び変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成など
に応じて異なるが、典型的には約９０〜約１０５℃でそ
の時間は主として高温及び核酸長さに応じて異なるが、
典型的には約０．４〜４分間である。緩衝液濃度及び／
又は核酸のＧＣ組成が増大されるにつれてより高温が許
容可能となる。好ましくは酵素は約９０〜１００℃にお
いて可逆的に変性されないのがよい。

【００８０】本発明における熱安定性酵素は、それが機
能する最適温度を、プライマーの鋳型へのハイブリダイ
ゼーションがそれ未満で促進される温度である約４０℃
よりも高温に有するのが好ましい。酵素のための最適温
度が高ければ高い程、プライマー指令延長過程の特異性
及び／又は選択性がより大きくなる。しかしながら、４
０℃未満例えば３７℃において、活性である酵素も又そ
れらが熱−安定性である限り本発明の範囲内に含まれ
る。好ましくは最適温度は約５０〜８０℃、より好まし
くは６０〜８０℃の範囲である。

【００８１】文献に耐熱性であると報告された酵素の具
体例としては、熱安定性ポリメラーゼ類、例えば好熱細
菌サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕ
ｓ）、サーマス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅ
ｒ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモ
フィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ）（これは掲げられた他のものよりも幾
分より低い最適温度を有する）、サーマス・アクティク
ス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス
・ラクテウス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ）、サ
ーマス・ルーベンス（Ｔｈｅｒｍｕｓｒｕｂｅｎｓ）及
びメタノサーマス・フエルビドウス（Ｍｅｔｈａｎｏｔ
ｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）などが挙げられる。

【００８２】本発明において好ましい熱安定性酵素はサ
ーマス・アクティクスＹＴ−１株から単離されたＤＮＡ
ポリメラーゼであり、次の様に精製されたものである：
サーマス・アクティクスの細胞を増殖せしめ、そしてこ
のポリメラーゼを単離し、粗製抽出液からカレディン等
（Ｋａｌｅｄｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙ
ａ，４５，６４４−６５１（１９８０）により示された
最初の五つの工程を用いて精製した。第５工程（pH７．
５におけるＤＥＡＥカラム）の際に汚染デオキシリボヌ
クレアーゼ（エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアー
ゼ）についてアッセイを行い、ポリメラーゼ活性を有
し、最少のヌクレアーゼ汚染を有する画分のみをプール
した。最初のクロマトグラフィ精製工程はチエン等（Ｃ
ｈｉｎｅｅｔ ａｌ．）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２
７：１５５０−１５５７（１９７６）により示唆された
ホスホセルロースカラムを用いるものである。ヌクレア
ーゼ及びポリメラーゼ活性のアッセイを行い、最少ヌク
レアーゼ汚染のポリメラーゼ画分のみをプールした。

【００８３】カレディン等（Ｋａｌｅｄｉｎ ｅｔ ａ
ｌ．）及びチエン（Ｃｈｉｅｎ）等は６２−６３ｋダル
トンの分子量を有する精製酵素を報告しているが、上記
精製方法を用いたデータは約８６〜９０ｋダルトンの分
子量を示唆する。

【００８４】一般的に、本発明の増幅方法は含まれる反
応工程の数に対して指数的量において少なくとも１つの
特定の核酸配列を製造する連鎖反応を含むものである
が、その前提として（ａ）必要とされる配列の末端がそ
れらにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが合成で
きるように十分に詳細に知られていること、及び（ｂ）
連鎖反応を開始するために少量の配列が利用可能である
こと、が挙げられる。この連鎖反応の生成物は、用いら
れた特定のプライマーの末端に対応する末端を有する個
々の核酸二本鎖である。

【００８５】任意の核酸配列を、それが所望の特定の核
酸配列を含有するか或いは含有すると想像される限り、
精製或いは非精製形態において、出発核酸として利用す
ることができる。即ち、本発明の方法は例えばＤＮＡ、
或いはメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを使用してよ
く、そのＤＮＡ或いはＲＮＡは一本鎖であっても二本鎖
であってもよい。更に各々の一本鎖を含有するＤＮＡ−
ＲＮＡハイブリッドを利用してもよい。これらの核酸の
任意の混合物も又使用され、或いは本発明のものと同一
の或いは異なるプライマー用いる前増幅反応から生成さ
れた核酸もその様に利用されてよい。増幅される特定の
核酸配列は大分子の一部分のみであってよく、或いは当
初から個別の分子として存在し、その結果特定の配列が
全核酸を構成していてもよい。

【００８６】増幅される配列は当初純粋な形態で存在す
る必要はない。即ち、それは複雑な混合物の少部分であ
ってよい。すなわち、全ヒトＤＮＡに含まれるβ−グロ
ビン遺伝子の一部（例えば上記サイキ等の論文に例示さ
れるいうな）でもよく、或いはその生物体が特種の生物
学的試料の極めて少部分のみを構成するが故に核酸配列
の一部などであってよい。出発核酸配列は１より多くの
同一或いは異った所望の特定の核酸配列を含有してよ
い。従って、本発明の増幅方法は多量の１つの特定の核
酸配列を製造するのみならず、同一の或いは異なる核酸
分子上に位置する１つより多くの異なる特定の核酸配列
を増幅するためにも有用である。

【００８７】核酸は任意の由来、例えばｐＢＲ３２２な
どのプラスミドから、クローン化されたＤＮＡ或はＲＮ
Ａから、或いは任意の由来例えば細菌、酵母、ウイル
ス、オルガネル及び植物或いは動物などの高等動物を含
む任意の起源からの天然ＤＮＡ或いはＲＮＡから得られ
る。ＤＮＡ或いはＲＮＡは各種技術例えばマニアティス
等（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ(１９８２）、８０−２８１に記
載されている技術により血液、絨毛膜絨毛或いは羊膜細
胞などの組織材料から抽出されてよい。

【００８８】増幅される配列に対して特異的でありその
後検出されるプローブが用いられる場合には、細胞を低
張緩衝液に懸濁させ細胞溶解及び細胞内成分の分散が起
こるまで通常１〜１５分間約９０〜１００℃に加熱され
るならば核酸の抽出なしに細胞を直接使用してもよい。
加熱工程後増幅試薬は直接に溶解細胞に添加されてよ
い。

【００８９】任意の特定の核酸配列を本発明の増幅方法
により製造することができる。所望配列の異なる鎖にハ
イブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマー
が配列に沿って１つのプライマーから合成される延長生
成物がそれがその鋳型（相補体）から分離された場合に
他のプライマーを一定長さの核酸配列に延長するための
鋳型として役立ち得るような相対的位置において調製す
ることができるように十分に詳細に配列の十分な数の塩
基が知られていることのみが必要である。配列の両末端
の塩基についての知識が多ければ多い程、目標核酸配列
に対するプライマーの特異性従って方法の効率が増大す
る。

【００９０】以下に用いられる「プライマー」という用
語は特に増幅されるべき断片の末端配列に関する情報に
おいて何等かの曖昧さがある場合には１より多くのプラ
イマーを指すことが理解されるであろう。例えば核酸配
列が蛋白質列情報から推定される場合において、遺伝暗
号の縮重に基づくあらゆる可能性のあるコドン変化を表
わす配列を含むプライマーの集合体が各鎖に対して用い
られる。この集合体からの１つのプライマーは増幅され
るべき所望配列の末端と相同である。

【００９１】オリゴヌクレオチドプライマーは任意の適
当な方法例えば上記ホスホトリエステル及びホスホジエ
ステル方法或いはそれらの自動化された実施態様などに
より調製される。１つのその様な自動化された実施態様
において、ジエチルホスホルアミダイトが出発材料とし
て用いられ、ビューケージ等（Ｂｅａｕｃａｇｅｅｌ
ａｌ．）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１
９８１）２２：１８５９−１８６２により記載されるよ
うにして合成される。修飾された固定支持体上でオリゴ
ヌクレオチドを合成する１つの方法は米国特許４，４５
８，０６６号明細書に記載されている。又、細菌源から
単離されたブライマー（例えば制限エンドヌクレアーゼ
消化物）を用いることも可能である。

【００９２】特定の核酸配列はその配列を鋳型として含
有する核酸を用いることにより製造される。第一の工程
は各核酸鎖を四種のヌクレオチドトリホスフェート及び
増幅され或るいは検出されるべき各異なる核酸配列につ
き１つのオリゴヌクレオチソプライマーと接触させるこ
とを含む。増幅或いは検出されるべき核酸がＤＮＡであ
るならば、ヌクレオチドトリホスフェートはｄＡＴＰ，
ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びＴＴＰである。

【００９３】これらの核酸鎖は追加は核酸鎖の合成のた
めの鋳型として使用される。この合成は任意の適当な方
法を用いて行うことができる。一般的には、それは緩衝
化水溶液中において好ましくはｐＨ７〜９、最も好まし
くは８において行われる。好ましくは、モル濃度過剰
（クローン化核酸に対して通常約１０００：１のプライ
マー対鋳型、及びゲノム核酸に対しては通常１０⁶：１
のプライマー対鋳型）の２つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーが分離された鋳型鎖を含有する緩衝液に添加され
る。しかしながら、相補的鎖の量は本発明における方法
が診断用途に用いられるならば知られていないことがあ
り、その結果相補的鎖の量に対するプライマーの量は確
実に決定することができないことが理解される。しかし
ながら、実際問題として、添加されるプライマーの量は
一般的に増幅される配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物中
に含有されている場合には相補的鎖（鋳型）の量に対し
てあるモル濃度過剰である。この方法の能率を改良する
ためには大きなモル濃度過剰が好ましい。

【００９４】得られた溶液を次いで増幅或いは検出され
るべき核酸が二本鎖であるか或は一本鎖であるかに従っ
て処理する。核酸が一本鎖である場合には、変性工程を
使用する必要がなく、反応液をプライマーのその相補的
目標（鋳型）配列へのハイブリダイゼーションを促進す
る温度に保つ。その様な温度は通常約３５〜約６５℃よ
り好ましくは約３７℃〜約５０℃であり、有効時間通常
１．５〜５分、好ましくは１〜３分間行う。

【００９５】元の一本鎖核酸に対する相補体は１個或い
は２個のオリゴヌクレオチドプライマーをそれに添加す
ることにより合成される。適当な単一プライマーが添加
されるならば、プライマー延長生成物がプライマー、熱
安定性酵素及びヌクレオチドトリホスフェートの存在下
において合成される。この生成物は一本鎖核酸に対して
部分的に相補的であり、核酸鎖とハイブリダイズして長
さの等しくない鎖の二本鎖を形成し、これは次いで上記
の如く一本鎖に分離され、二本の単一の分離された相補
的鎖を生成する。或いは又、２つの適当なプライマーを
一本鎖核酸に添加して反応を行ってもよい。

【００９６】核酸が二本の鎖を含有する場合には、それ
を鋳型として使用する前に核酸の鎖を分離する必要があ
る。この鎖分離は物理的、化学的或いは酵素的手段を含
む任意の適当な変性方法により達成することができる。
１つの好ましい核酸の鎖を分離する物理的方法は核酸を
それが完全に（＞９９％）変性されるまで加熱すること
を含むものである。典型的な熱変性は約９０〜１０５℃
の範囲の温度を通常約０．５〜５分間の範囲の時間含む
ものである。好ましくは有効な変性温度は０．５〜３分
間の間の９０〜１００℃である。鎖分離は又ヘリカーゼ
類即ち酵素ＲｅｃＡ、として知られているヘリカーゼ活
性を有し、そしてｒｉｂｏＡＴＰの存在下においてＤＮ
Ａを変性することが知られている種類の酵素からの酵素
により誘発される。核酸の鎖をヘリカーゼ類を用いて分
離するために適した反応条件はクーンホフマン−ベーリ
ング（Ｋｕｈｎ Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ）
ＣＳＨ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ
４３：６３（１９７８）に記載されており、そしてＲｅ
ｃＡを用いる技術はＣ．ラッディング（Ｃ． Ｒａｄｄ
ｉｎｇ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１６：４
０５−３７ （１９８２）に総説されている。この変性
は等しい或いは等しくない長さの二本の分離された相補
的鎖を生成する。

【００９７】二本鎖核酸が熱により変性されたならば、
反応液を存在する各プライマーのその相補的目標（鋳
型）配列へのハイブリダイゼーションを促進する温度に
冷却させる。この温度は通常約３５〜６５℃以上、好ま
しくは約３７℃〜約５０℃であり、有効時間通常０．５
〜５分間、好ましくは１〜３分間維持される。実際的に
は、温度は単に約９５℃から約６５℃或いは３７℃程度
の低温に低下され、ハイブリダイゼーションはこの範囲
の温度において起こる。

【００９８】核酸が一本鎖であると或いは二本鎖である
とを問わず、熱安定性酵素は変性工程において或は温度
がバイブルダイゼーションを促進する範囲に低下してい
るか或いは範囲にある時点において添加されてよい。反
応液を次いで酵素の活性が促進されるか或いは最適化さ
れる温度即ちハイブリダイズされたプライマー及び鋳型
からプライマー延長生成物の合成を容易にするように酵
素の活性を増大させるのに十分な温度に加熱する。この
温度は実際に各核酸鋳型の相補的である各プライマーの
延長生成物を合成するのに十分でなければならないが、
しかし、その相補的鋳型からの各延長生成物を変性する
程高くあってはならない（即ち、温度は通常約８０〜９
０℃未満である）。

【００９９】主として用いられる酵素及び核酸の種類に
応じて、この合成反応に有効な典型的温度は約４０〜８
０℃、好ましくは５０〜７０℃の範囲である。サーマス
・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ）からのポリメラーゼが用いられる場合には温度はよ
り好ましくは約６０〜６５℃の範囲である。この合成に
必要とされる時間は、主として温度、核酸の長さ、酵素
及び核酸混合物の複雑性に応じて約０．５〜４０分以上
の範囲であるが、好ましくは１〜３分間である。核酸が
より長ければより長い時間が一般的に必要とされる。好
ましくは、増幅された生成物の検出を容易にするのに十
分な量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））も又反応
液中に存在するのがよい。ＤＭＳＯは本発明の方法のい
づれの工程において添加されてもよいが、好ましくはこ
の工程及び全ての引続く工程において存在するのがよ
い。最も好ましくは５〜１０容量％のＤＭＳＯが存在す
る。

【０１００】新たに合成された鎖及びその相補的核酸鎖
は以下の工程において用いられる二本鎖分子を形成す
る。次の段階において、二本鎖分子の鎖は分子を変性す
るのに有効であるが、しかし熱安定性酵素が完全且つ不
可逆的に変性或いは不活性化されるようには高くない温
度において熱変性により分離される。主として酵素の種
類及び核酸の長さに応じてこの温度は通常９０〜１０５
℃、より好ましくは９０〜１００℃の範囲であり、そし
て変性の時間は主として温度及び核酸の長さに応じて典
型的に０．５〜４分の範囲である。

【０１０１】この時間の後、前工程から生成されたその
相補的一本鎖分子（鋳型）へのプライマーのハイブリダ
イゼーションを促進するレベルに温度を低下せしめる。
その様な温度は上記の通りである。

【０１０２】このハイブリダイゼーション工程の後、或
いはハイブリダイゼーション工程の代りに（或いは同時
に）、温度を熱安定性酵素の活性を促進して鋳型として
前の工程から新たに合成された鎖を用いてプライマー延
長生成物の合成を可能にするのに有効である温度に調整
する。この温度も又前記の如く延長生成物をその鋳型か
ら分離（変性）する程高くあってはならない（通常４０
〜８０℃で０．５〜４０分間、好ましくは５０〜７０℃
で１〜３分間）。この工程の際に、ハイブリダイゼーシ
ョンが起こることがあり、その結果変性後の先の冷却工
程は必要とされない。同時工程を用いるその様な場合に
は、５０〜７０℃の温度範囲が好ましい。

【０１０３】これらの鎖分離、ハイブリダイゼーショ
ン、及び延長生成物合成の加熱及び冷却工程は必要な回
数繰返して究極的用途に応じて所望量の特定の核酸配列
を製造することができる。唯一の制限は存在するプライ
マー、熱安定性酵素及びヌクレオチドトリホスフェート
の量である。好ましくは、これらの工程は少なくとも一
回繰返すのがよい。検出に使用するためには、サイクル
数は例えば試料の性質に応じて異なる。例えば、増幅さ
れるべきサンプルが純粋である場合にはより少ないサイ
クル数ですむ。サンプルが核酸の複雑な混合物であるな
らばその検出シグナルを十分に増幅するためにはより多
くのサイクルが必要とされるであろう。一般的増幅及び
検出のためには、好ましくはこの方法が少なくとも２０
回繰返される。

【０１０４】標識された配列特異的プローブが以下の如
く用いられる場合には、これらの工程は少なくとも５回
繰返されるのが好ましい。ヒトゲノムＤＮＡをその様な
プローブと共に用いる場合には、この方法は明確に検出
可能なシグナルが生成されるために、即ちバックグラウ
ンドノイズが検出を妨害しないように配列を十分に増幅
するために１５〜３０回繰返すのが好ましい。

【０１０５】更に詳細に以下に説明される如く、生成さ
れる特定の核酸配列の量は指数的に蓄積する。

【０１０６】酵素が不可逆的に変性或いは不活性化され
ていない限り、最初の添加後追加のヌクレオチド、プラ
イマー或いは熱安定性酵素を追加する必要なく、不活性
化される場合には各変性工程の後酵素を補給する必要が
ある。しかしながら、各工程においてその様な物質を添
加することは反応に悪影響を及ぼさない。

【０１０７】第一の核酸或いは核酸の混合物から１つよ
り多くの特定の核酸配列を生成した場合には、適当な数
の異ったオリゴヌクレオチドプライマーが利用される。
例えば、２種の異なる特定の核酸配列が製造さっるべき
場合には、４個のプライマーが利用される。これらのプ
ライマーの２個は特定の核酸配列の一方に対して特異的
であり、他の２個のプライマーは第二の特定の核酸配列
に特異的である。この様にして、２種の異なる特定の配
列の各々を本発明の方法により指数的に製造することが
できる。

【０１０８】適当な長さの時間が経過して所望量の特定
の核酸配列を製造した後、任意の公知の方法で酵素を不
活性化することにより或いは反応の成分を分離すること
により反応を停止してよい。

【０１０９】増幅工程を模式的に後記する。ここで、相
補的な鎖［Ｓ⁺］及び［Ｓ~］を含んで成る所望の配列
［Ｓ］を含有する２本鎖ＤＮＡが核酸として使用され
る。第１の及びこれに続く各反応サイクルの間、もとの
鋳型上での各オリゴヌクレオチドプライマーの延長が、
プライマーの１つのみにより停止する無限長の新しい_SS
ＤＮＡ分子生成物を生成する。今後“長生成物”と称す
るこれらの生成物は直接的に蓄積するであろう。すなわ
ち、ある数のサイクルの後に存在する量がサイクル数に
比例するであろう。

【０１１０】こうして生成された長生成物は、その後の
サイクルの間一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライ
マーの鋳型として機能し、そして所望の配列［Ｓ⁺］又
は［Ｓ~］の分子を生成するであろう。これらの分子も
また、一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの
鋳型として機能してさらに［Ｓ⁺］及び［Ｓ~］を生成
し、そしてそれ故に、サイクル数に対して指数的速度で
の［Ｓ］の蓄積をもたらすであろう鎖反応が継続され得
る。

【０１１１】意図されるオリゴヌクレオチドハイブリダ
イゼーション以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーションにより生成される副産物は自己触媒的ではな
く、そしてそれ故に直線的速度で蓄積する。

【０１１２】

【表１】

【０１１３】

【表２】

【０１１４】

【表３】

【０１１５】一方のプライマーのオリゴヌクレオチド配
列及び他方の相補的配列で未満を終了する各鎖が製造さ
れるべき特定の核酸配列［Ｓ］であることが判る。

【０１１６】元の核酸の量はそれは複製されないので全
過程において一定に留まる。長生成物の量はそれらが元
の核酸のみから製造されるので線形的に増大する。特定
の配列の量は指数的に増大する。この様に、特異的配列
が支配的種となる。これは下表に例示され、それは各サ
イクルにおいて１００％の効率を想定してｎサイクル後
に理論的に存在するこれらの種の相対的量を示すもので
ある： ０〜ｎサイクル後の 二本鎖の数 サイクル数 鋳 型 長生成物 特定配列［Ｓ］ ０ １ − − １ １ １ ０ ２ １ ２ １ ３ １ ３ ４ ５ １ ５ ２６ １０ １ １０ １０１３ １５ １ １５ ３２,７５２ ２０ １ ２０ １,０４８,５５５ ｎ １ ｎ （２ⁿ−ｎ−１） 一本鎖核酸が鋳型として用いられる場合には、１個のみ
の長生成物が毎サイクル形成される。

【０１１７】ある与えられた配列内の配列はある与えら
れた数の増幅後に増幅されて少なくとも１サイクルの増
幅後に増幅される配列の内部配列（末端にあるものでは
ない）に相補的である一組のプライマーを添加すること
により反応のより大きな特異性を得ることができる。そ
の様なプライマーは任意の段階において添加されてよ
く、より短い増幅された断片を提供する。或いは又、よ
り長い断片を非−相補的末端を有するが、しかし、増幅
において先に利用されたプライマーと何等かの重複を有
するプライマーを用いることにより調製することができ
る。

【０１１８】この増幅方法を利用して適当な発現ベクタ
ー中に挿入するための特種の核酸配列がクローニングさ
れる。このベクターを用いて組換えＤＮＡ技術の標準的
方法により適当な宿主生成物体を形質転換してこの配列
の遺伝子生成物が製造される。その様なクローニングは
平滑−末端連結を用いたベクター中への直接連結或いは
プライマー内に含まれる部位において切断するための制
限酵素の使用を含むものである。

【０１１９】加えて、本発明の増幅方法はｉｎ ｖｉｔ
ｒｏの突然変異誘発に使用することができる。オリゴデ
オキシリボヌクレトチドプライマーは増幅されるＤＮＡ
配列に正確に相補的である必要はない。それらは熱安定
性酵素によりよく延長されるように十分に配列にハイブ
リダイズする能力があればよい。用いられたプライマー
が元の鋳型に正確に相補的でない増幅反応の生成物は鋳
型以外のプライマーの配列を含有し、それによりｉｎ
ｖｉｔｒｏの突然変異を導入する。更にサイクルを重ね
るとこの突然変異は更に不適当な対のプライミングが必
要とされないので減少されない効率をもって複製され
る。この様に製造された突然変異体は標準的分子生物学
的技術により適当なベクター中に挿入され、このベクタ
ーに例えば変更された蛋白質の製造の潜在能力などの変
異特性を与える可能性がある。

【０１２０】上記変更ＤＮＡ配列を作成する方法を異な
るプライマーを用いて変更されたＤＮＡに繰返して更に
配列変化を誘発することが可能である。この様にして、
一連の突然変異配列を徐々に製造して各々の新しい添加
が最初のものからは少ししか異ならないが、しかし元の
ＤＮＡ源配列からは次第に大きく異なるものとされる。
この様にして極めて深刻に不適当な組合せのプライマー
が機能することができないために、単一工程では実現不
能であった変更を究極的に行うことが可能である。

【０１２１】加えて、増幅されるべき鎖に相補的である
配列を十分な量のプライマーが含有するならば、プライ
マーはその配列の一部として非−相補的配列を含有する
ことができる。例えば鋳型配列に相補的でないヌクレオ
チド配列（例えば、プロモータ、リンカー、コード配列
など）をプライマーの一方或は両方の５′末端に結合
し、そしてこれによって増幅工程の生成物に付加しても
よい。延長プライマーの添加後、十分なサイクルを実施
してこの非相補的ヌクレオチドインサートを含有する所
望量の新しい鋳型が達成される。これは単純な技術を用
いて比較的短時間（例、２時間以下）に大量の組合され
た断片の製造を可能にする。

【０１２２】本発明の増幅方法は又感染症、遺伝的障害
或いは癌などに関連する特定の核酸配列例えば腫瘍形成
遺伝子の検出及び／又は特性化を可能にするために用い
られてよい。分析に利用可能な核酸の量が例えば胎児の
細胞から得られるＤＮＡを用いる鎌状赤血球貧血の胎児
期の診断におけるように極めて少ない場合に増幅が有用
である。この増幅は、その様な分析が本来感度の低い非
−放射性検出技術を用いる少量の試料についてなされる
場合、或いは放射性技術が用いられても迅速な検出が望
ましい場合には特に有用である。

【０１２３】この検討の目的のためには、遺伝病として
は、任意の生物体からのゲノムＤＮＡにおける特異的欠
失及び／又は突然変異、例えば鎌状赤血球貧血、α−サ
ラセミア、β−サラセミアなどが挙げられる。鎌状赤血
球貧血は例えばＥＰ特許公開１６４，０５４号明細書
（１９８５年１２月１１日公開）に記載されているよう
なオリゴマー制限分析を介して或いは増幅法による適当
なＤＮＡ配列の増幅に従ったＲＦＬＰ一様分析を介して
容易に検出することができる。α−サラセミアはある配
列の不存在によりそしてβ−サラセミアは病気を引起こ
す突然変異に密接に関連した多型性制御部位の存在によ
り検出することができる。

【０１２４】これらの遺伝病の全ては適当な配列を増幅
し、及びそれを放射性プローブを用いることなくＳｏｕ
ｔｈｅｒｎブロットにより分析することにより検出され
る。その様な方法において、例えば、ＤＮＡの小サンプ
ル例えば極めて低いレベルの所望配列を含有する羊水細
胞を増幅し、制限酵素で切断し、そしてＳｏｕｔｈｅｒ
ｎブロッティング技術により分析する。非−放射性プロ
ーブの使用は高いレベルの増幅されたシグナルにより容
易にされる。

【０１２５】もう１つの実施態様において、ＤＮＡの小
サンプルを便利なレベルまで増幅し、次いで容易に検出
可能なヌクレオチド誘導体（例えば³²Ｐ−標識或いはビ
オチン−標識ヌクレオチドトリホスフェート）が制限処
理及び電気泳動分離或いは任意の他の適当な方法により
分析される最終ＤＭＡ生成物中に直接に導入されるよう
に更に延長反応のサイクルが行われる。

【０１２６】更に１つの実施態様においては、核酸は増
幅前の特定の制限エンドヌクレアーゼに曝されてよい。
その様な切断された配列は増幅することができないので
ＤＮＡサンプルの前の制限処理にも拘らず増幅断片が出
現することは増幅配列内のエンドヌクレアーゼに対する
部位の不存在を意味する。増幅配列の存在或いは不存在
は適当な方法により検出することができる。

【０１２７】この増幅技術の１つの実用的応用即ちオリ
ゴマー制限技術［上記ＥＰ １６４，０５４号明細書、
及びサイキ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ
ｌ．３，ｐｐ１００８−１０１２（１９８５）に記載］
による鎌状赤血球貧血の検出を容易にすることにおける
応用は、上記サイキ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ）の記事に詳細
に記載されている。そのＳｃｉｅｎｃｅの記事におい
て、ある特種の増幅方法がβ−グロビン遺伝子セグメン
トを用いて例示されている。

【０１２８】本発明における増幅方法は又配列−特異的
オリゴヌクレオチドを用いて核酸配列（例えばゲノムＤ
ＮＡにおける）単一のヌクレオチド変化を直接検出する
ために用いられてもよい。簡単に述べると、この方法に
おいては、増幅されたサンプルを直接に一連の膜上にス
ポットし、各膜を異なる標識された配列特異的オリゴヌ
クレオチドプローブとハイブリダイズせしめる。ハイブ
リダイゼーション後、サンプルを洗浄し、標識を検出す
る。この技術は特にＤＮＡ多型性を検出するのに特に有
用である。

【０１２９】各種感染病は臨床サンプルにおける原因微
生物に特徴的な特定のＤＮＡ配列の存在により診断する
ことができる。これらにはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ネイセ
リア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）などの細菌類、肝炎ウィル
スなどのウィルス類及びマラリアの原因であるプラスモ
ジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）などの寄生虫などが挙
げられる。米国特許再審査証明書Ｂ１ ４，３５８，５
３５号（１９８６）年５月１３日ファルコウ等（Ｆａｌ
ｋｏｗ ｅｔ ａｌ．）に発行）は感染病の診断のため
の特異的ＤＮＡハイブダイゼーションプローブの使用を
記載している。感染した患者からの臨床サンプルには比
較的少数の病原生物体が存在するにすぎず、又これらか
ら抽出されたＤＮＡがサンプル中の全ＤＮＡの極めて僅
かの部分を構成するにすぎない場合がある。ＤＮＡサン
プルのハイブリダイゼーションによる固定化及び検出に
先立つ疑いをもたれた配列の特定の増幅は伝統的操作の
感度及び特異性を大きく改良することが可能である。

【０１３０】感染症の診断のためのＤＮＡプローブの日
常的な臨床的使用は非−放射性標識プローブがウォード
（Ｗａｒｄ）のＥＰ ６３，８７９号明細書に記載され
たように用いることができれば相当に簡素化されるであ
ろう。この操作において、ビオチン−含有ＤＮＡがアビ
ジン或いはビオチン−特異的抗体に結合した発色性酵素
により検出されている。このタイプの検出は便利である
が、しかし比較的感度が悪い。本発明による特定のＤＮ
Ａ増幅と安定に標識されたプローブの使用の組合わせは
ファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）等及びウォード（Ｗａｒ
ｄ）の操作を日常的な臨床的設定において有用とするた
めに必要とされる便利さ及び感度を与える可能性があ
る。

【０１３１】この増幅技術の特別の用途はＡＩＤＳウィ
ルスを検出或いは監視するためのものである。簡単に述
べると、この増幅及び検出方法をＡＩＤＳウィルス内の
核酸中に実質的に保存され、そしてＡＩＤＳウィルス内
の核酸に特異的である核酸配列をそれぞれ増幅及び検出
するように設計されたプライマー及びプローブと共に用
いられる。即ち、被検出配列は重合を好ましくは室温に
おいて酵素及びヌクレオチドトリホスフェートの存在下
において開始させるためにＡＩＤＳウィルス内の核酸に
対して十分に相補的でなければならない。

【０１３２】この増幅方法を利用して又エチジウムブロ
マイドなどの単純な非−特異的ＤＮＡ染色による検出が
ＤＮＡを診断するために直接に用いることが出来るよう
に単一コピーのヒト遺伝子からのＤＮＡを十分な量製造
することが出来る。

【０１３３】感染症及び生物体のゲノムにおける病理学
的異常に加えて、この増幅方法を用いて如何なる病理学
的状態をも伴なわないＤＮＡ多型性を検出することもで
きる。

【０１３４】要約すると、この増幅方法は引続き更にプ
ライマー延長反応の鋳型として作用することのできるプ
ライマー延長生成物が生成される連鎖反応及び熱安定性
酵素を用いて１以上の特定の核酸配列を増幅するための
方法を提供することが見られた。この方法は極めて少量
でのみ当初存在する核酸配列の検出において特に有用で
ある。

【０１３５】以下の実施例は例示を目的としてのみ提供
されるものであり、本発明の特許請求の範囲を制限する
ものでは決っしてない。これらのサンプルにおいて、全
てのパーセントは固体に対しては重量基準であり、液体
に対しては容量基準であり、全ての温度は摂氏度で与え
られている。

【０１３６】実施例１ １． プライマーの合成 次の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを下記方法に
より製造した： 5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3' (PC03) 5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3' (PC04) これらの共に２０−ｍｅｒのプライマーはゲノムＤＮＡ
の反対の鎖と１１０塩基対の距離で分離されたそれらの
５′末端でアニールする。

【０１３７】Ａ．自動化合成操作： ビューケージ及び
カルザース（Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈ
ｅｒｓ）［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ
（１９８１）２２：１８５９−１８６２］に従って合成
されたジエチルホスホルアミダイトを逐次ヌクレオシド
で誘導体化された制御された多孔ガラス支持体にＢｉｏ
ｓｅａｒｃｈ ＳＡＭ−１を用いて縮合せしめた。この
操作はジクロロメタン中トリクロロ酢酸を用いる脱トリ
チル化、活性化プロトン供与体としてベンゾトリアゾー
ルを用いる縮合及びテトラヒドロフラン及びピリジン中
無水酢酸及びジメチルアミノピリジンによるキャッピン
グを含むものであった。サイクル時間は約３０分であっ
た。各工程における収率は本質的に定量的であり、脱ト
リチル化中に放出されたジメトキシトリチルアルコール
の収集及び分光学的検査により決定した。

【０１３８】Ｂ．オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱
保護及び精製操作： 固体支持体をカラムから取り出
し、閉じられた管内で１ｍｌの濃水酸化アンモニウムに
室温において４時間曝した。次いでこの支持体を濾過に
より除去し、部分的に保護されたオリゴヌクレオチドを
５５℃に５時間置いた。アンモニアを除去し、残渣を分
取用ポリアクリルアミドゲルにかけた。電気泳動を３０
ボルト／ｃｍで９０分間行い、その後生成物を含有する
バンドを蛍光板のＵＶシャドーイングにより同定した。
このバンドを切出し、１ ｍｌ の蒸留水で４℃において
一晩溶出した。この溶液をＡｌｔｅｃｈ ＲＰ１８カラ
ムにかけ、pH６．０において１％酢酸アンモニウム緩衝
液中アセトニトリルの７−１３％勾配で溶出させた。溶
出は２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度により追跡し、そし
て適当な画分を集め、固体容量内のＵＶ吸光度により定
量し、そして真空遠心分離器内で室温で蒸発乾固させ
た。

【０１３９】Ｃ．オリゴデオキシリボヌクレオチドの特
徴付け： 精製オリゴヌクレオチドの試験アリコートを
ポリヌクレオチドキナーゼ及びγ−³²ｐ−ＡＴＰを用い
て³²ｐ標識した。この標識化合物を５０ボルト／ｃｍに
おける４５分間の電気泳動後に１４〜２０％のポリアク
リルアミドゲルのオートラジオグラフィにより検査し
た。この操作は分子量を立証するものである。塩基組成
は毒液ジエステラーゼ及び細菌アルカリホスファターゼ
を用いるオリゴデオキシリボヌクレオチドのヌクレオシ
ドへの消化及び引続く逆相ＨＰＬＣカラム及び１０％ア
セトニトリル、１％酢酸アンモニウム可動相を用い得ら
れたヌクレオシドの分離及び定量により決定した。

【０１４０】II. 細菌系からのヒトゲノムＤＮＡの単離 高分子量ゲノムＤＮＡを本質的にマニアティス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）等［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
（１９８２）２８０−２８１］の方法を用いてＨｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｐ
ｏｓｉｔｏｒｙ（ニュージャージ州、カムデン）からＧ
Ｍ２２１９Ｃとして取得可能な正常なβ−グロビンにつ
いてホモ接合性のＴ細胞系Ｍｏｌｔ４から単離した。

【０１４１】III.サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からのポリメラーゼの精
製 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ）（１２３０１パークローンドライブ、ロック
ビル、メリーランド州）からＡＴＣＣ Ｎｏ．２５，１
０４として制限なしに取得可能なサーマス・アクアティ
カス株ＹＴ１を次の培地中においてフラスコ内で増殖せ
しめた。

【０１４２】 クエン酸ナトリウム 1 mM リン酸カルシウム、pH 7.9 5 mM 塩酸アンモニウム 1 0 mM 硫酸マグネシウム 0.2 mM 塩化カルシウム 0.1 mM 塩化ナトリウム 1 g / l 酵母エキス 1 g / l トリプトン 1 g / l グルコース 2 g / l 硫酸第一鉄 0.01 mM （pH は殺菌前に８．０に調整した。） １０ ｌファーメンターに、上記培地中で７０℃で一晩
培養した種フラスコから接種した。種フラスコからの総
量６００ｍｌを用いて１０ ｌの同一培地に接種した。
pHを水酸化アンモニウムにより８．０に、溶存酸素量を
４０％に、温度を７０℃に、そして撹拌速度を４００ｒ
ｐｍに調整した。

【０１４３】細胞の増殖後、上記カレディン（Ｋａｌｅ
ｄｉｎ）等の方法（僅かに修正）の最初の５段階を用
い、且つ第６段階のために異った方法を用いてそれらを
精製した。６工程の全てを４℃において行った。カラム
上の分別速度は０．５カラム容／時間であり溶出時の勾
配の容量は１０カラム容であった。

【０１４４】簡単に説明すると、上記Ｔ．アクアティカ
ス細胞の培養液を９時間の培養後、後期対数期において
１．４ｇ乾燥重量／ｌの細胞密度において遠心分離によ
り採集した。２０ｇの細胞を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ pH７．５、０．１ｍＭＥＤＴＡよりなる８０ｍｌの
緩衝液中に再懸濁した。細胞を溶解し、そして溶解物を
ローター内において４℃で３５，０００ｒｐｍにて２時
間遠心分離した。上澄液を集め（画分Ａ）、４５〜７５
％飽和度の硫酸アンモニウムの間で沈澱する蛋白質画分
を集め、０．２Ｍリン酸カリウム（pH６．５）、１０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール及び５％グリセリンよりな
る緩衝液中に溶解し、最終的に同一緩衝液に対して透析
して画分Ｂを得た。

【０１４５】画分Ｂを上記緩衝液で平衡化されたＤＥＡ
Ｅ−セルロースの２．２×３０ｃｍカラムにかけた。カ
ラムを次いで同一緩衝液で洗浄し、蛋白質を含有する画
分(２８０ｎｍにおける吸光度により測定）を集めた。
一緒にした蛋白質画分を０．０１Ｍリン酸カリウム（pH
７．５）、１０ ｍＭ２−メルカプトエタノール及び５
％グリセリンを含有する第二の緩衝液に対して透析して
画分Ｃを得た。

【０１４６】画分Ｃを第二の緩衝液で平衡化されたヒド
ロキシアパタイトの２．６×２１ｃｍカラムにかけた。
カラムを次いで洗浄し、１０ｍＭメルカプトエタノール
及び５％グリセリンを含む０．０１−０．５Ｍリン酸カ
リウム緩衝液の線形勾配で酸素を溶出した。ＤＮＡポリ
メラーゼ活性を含む画分（９０〜１８０ｍＭリン酸カリ
ウム）を一緒にし、Ａｍｉｃｏｎ撹拌セル及びＹＭ１０
膜を用いて４倍に濃縮し、第二の緩衝液に対して透析し
て画分Ｄを得た。

【０１４７】画分Ｄを第二の緩衝液で平衡化されたＤＥ
ＡＥ−セルロースの１．６×２８ｃｍカラムにかけた。
カラムを洗浄し、ポリメラーゼを第二緩衝液中の０．０
１−０．５Ｍリン酸カリウムの線形勾配で溶出した。画
分を過剰のＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベーショ
ンした後（エンドヌクレアーゼについて）、及びＤＮＡ
を数個の断片に切断する制限酵素により処理した後（エ
キソヌクレアーゼについて）、ファージγＤＮＡ或はス
ーパコイル血漿ＤＮＡの分子量変化を電気泳動的に検出
することにより汚染エンドヌクレアーゼ及び液相ヌクレ
アーゼのアッセイを行った。最少のヌクレアーゼ汚染を
有するＤＮＡポリメラーゼ画分のみ(６５−９５ｍＭリ
ン酸カリウム）をプールした。このプールに殺菌したゼ
ラチンを２５０μｇ／ｍｌで添加し、透析を第二の緩衝
液に対し行い、画分Ｅを得た。

【０１４８】画分Ｅを９ｍｌのホスホセルロースカラム
にかけ、１００ｍｌの勾配（２０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液pH７．５中０．０１−０．４ＭＫＣｌの勾配）で溶
出した。これらの画分について上記の如く汚染エンド／
エキソヌクレアーゼ並びにポリメラーゼ活性（カレディ
ン等の方法により）のアッセイを行い次いでプールし
た。プールした画分を第二の緩衝液に対して透析し、次
いで５０％グリセリン及び第二の緩衝液に対する透析に
より濃縮した。

【０１４９】このポリメラーゼの分子量をＳＤＳ ＰＡ
ＧＢにより求めた。マーカー蛋白質（低分子量標準）は
ホスホリラーゼ（９２，５００）、ウシ血清アルブミン
（６６，２００）、オバルブミン（４５，０００）炭素
アンヒドラーゼ（３１，０００）、大豆トリプシン阻害
因子（２１，５００）及びリゾチーム（１４，４００）
であった。

【０１５０】予備的データはこのポリメラーゼは文献に
報告される６２，０００〜６３，０００ダルトン（例え
ばカレディン等による）ではなく、約８６，０００〜９
０，０００ダルトンの分子量を有することを示唆する。

【０１５１】IV. 増幅反応 １μｇの上記ゲノムＤＮＡを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ（pH８．０）、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
₂、５ｍＭジチオスレイトール、２００μｇ／ｍｌゼラ
チン、１μＭのプライマーＰＣＯ３、１μＭのプライマ
ーＰＣＯ４、１．５ｍＭ ｄＡＴＰ、１．５ｍＭ ｄＣ
ＴＰ、１．５ｍＭ ｄＧＴＰ及び１．５ｍＭ ＴＴＰを
含有する当初１００μｌの水性反応液中に稀釈した。こ
のサンプルを９８℃で１０分間加熱して、ゲノムＤＮＡ
を変性し、次いで室温に冷却した。サーマス・アクアテ
ィカスからの４μｌのポリメラーゼを反応液に添加し、
１００μｌの鉱油キャップを重層した。サンプルを次い
で液体取扱い及び加熱器具のアルミニウム加熱ブロック
内に入れた。

【０１５２】このＤＮＡサンプルにつき、次のプログラ
ムサイクルを繰返して機械内で２０サイクルの増幅を行
った： １）加熱ブロック内における２．５分に亘る３７℃から
９８℃への加熱、及び ２）プライマー及びＤＮＡをアニールさせるための３分
間に亘る９８℃から３７℃への冷却。

【０１５３】最終サイクル後、サンプルを５５℃で更に
１０分間インキュベートして最終延長反応を完結させ
た。

【０１５４】V. オリゴデオキシリボヌクレオチドプロ
ーブの合成及びリン酸化 下記配列のＲＳ２４と称される標識されたＤＮＡプロー
ブを調整した： （茲に＊は標識を示す）。このプローブは４０個の塩基
長さであり、遺伝子の４番目〜１７番目のコドンに亘り
そして正常β−グロビン対立遺伝子（β^Ａ ）に相補的
である。

【０１５５】プライマー及びプローブの概略図を以下に
示す： このプローブは実施例１の分節Ｉで説明した操作に従っ
て合成した。このプローブはその２０ｐｍｏｌを７０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ（pH７.６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１.５
ｍＭスパーミン及び１０ｍＭジチオスレイトールを含有
する４０μｌの反応液中３７℃において６０分間４単位
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び約４０ｐｍｏｌの
γ~³²ｐ−ＡＴＰ（約７０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）と接
触させることにより標識した。全容量を次いで２５ｍＭ
ＥＤＴＡで１００μｌに調整し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ
（ＴＥ）緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、pH８．０）で平衡化された１ ｍｌ のスピン透
析カラム上でマニアティス等［Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９
８２）４６６−４６７］の方法に従って精製した。反応
生成物のＴＣＡ沈澱はＲＳ２４について比活性は４．３
μＣｉ／ｐｍｏｌｅであり、最終濃度は０．１１１８ｐ
ｍｏｌｅ／μｌであることを示した。

【０１５６】VI. ドットブロットハイブリダイゼーショ
ン 分節Ｉからの増幅サンプル４μｌ及び７０，７５，８
０，８５，９０，９５、及び１００％の増幅効率を表わ
すように計算された適当な稀釈率のβ−グロビンプラス
ミドＤＮＡ５．６μｌを２００μｌの０．４Ｎ ＮａＯ
Ｈ、２５ｍＭＥＤＴＡで稀釈し、リード及びマン（Ｒｅ
ｅｄ ａｎｄ Ｍａｎｎ）［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１３，７２０２−７２２１（１９
８５）］に開示されるように、先ずフィルターを水で濡
らし、フィルターを所定位置に保持するドットブロット
作成装置内にフィルターを入れ、サンプルを適用しそし
て各ウエルを０．１ｍｌの２０×ＳＳＰＥ（３．６Ｍ
ＮａＣｌ、２００ ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、２０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）で濯ぐことによりナイロンフィルター上にスポッ
トした。次いでフィルターを取出し、２０×ＳＳＰＥ中
で濯ぎ真空オープン中において８０℃で３０分間焼付け
た。

【０１５７】焼付け後各フィルターを３×ＳＳＰＥ、５
×デンハルト溶液（１ｘ＝０．０２％ポリビニルピロリ
ドン、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ウシ血清ア
ルブミン、０．２ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、pH８．０）、０．５％ＳＤＳ、及び３０％ホルムア
ミドよりなる１６ｍｌのハイブリダイゼーション溶液と
接触させ、４２℃で２時間インキュベートした。次いで
２ｐｍｏｌｅのプローブＲＳ２４をこのハイブリダイゼ
ーション溶液に添加し、フィルターを４２℃で２時間イ
ンキュベートした。

【０１５８】最後に、各ハイブリダイズされたフィルタ
ーを１００ｍｌの２×ＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳで室
温において１０分間２回洗浄した。次いでフィルターを
１００ ｍｌの２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで６０℃
において１０分間１回処理した。

【０１５９】各フィルターを次いでオートラジオグラフ
にかけたところ、シグナルは２時間後に容易に明らかと
なった。

【０１６０】VII.オートラジオグラフの説明 ドットブロットのオートラジオグラムは２時間後の分析
され、上記サイキ等(Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）により説明されるようにＨａｅ ＩＩＩ／Ｍ
ａｅ Ｉ−消化ｐＢＲ：β^A（β^Aは野性種の対立遺伝子
である）を用いて調製された標準的逐次稀釈β−グロビ
ン再構成液に対して強度を対比した。反応生成物の分析
は総括増幅効率が約９５％であり、β−グロビン目標配
列における６３０，０００倍の増大に対応することを示
した。

【０１６１】実施例ＩＩ Ｉ．増幅反応 実施例Ｉと同様のＭｏｌｔ ４細胞系統から抽出された
二つの１μｇのゲノムＤＮＡのサンプルをそれぞれ５０
ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ８．
０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１μＭのプライマーＰＣ
０３、１μＭのプライマーＰＣ０４、２００μｇ／ｍｌ
ゼラチン、１０％ジメチルスルホキシド（容量％）、
１．５ｍＭｄＡＴＰ、１．５ｍＭ ｄＣＴＰ、及び１．
５ｍＭ ＴＴＰを含有する１００μｌの反応液中に稀釈
した。この混合物を９８℃で１０分間加熱して、ゲノム
ＤＮＡを変性後、サンプルを室温に冷却し、実施例Ｉと
同様のサーマス・アクアティスからのポリメラーゼ４μ
ｌを各サンプルに添加した。これらのサンプルに鉱油を
重層して濃縮及び蒸発損失を防止した。

【０１６２】サンプルの一方を実施例Ｉと同様の機械の
加熱ブロック内に入れ、次のプログラムサイクルを繰返
して２５サイクルの増幅に付した： （１） ２．５分間に亘る３７℃から９３℃への加熱、 （２） プライマー及びＤＮＡをアニールさせるための
３分間に亘る９３℃から３７℃への冷却、及び （３） ２分間に亘る３７℃における維持。

【０１６３】最終サイクル後、サンプルを更に６０℃で
１０分間インキュベートして最終延長反応を完結させ
た。

【０１６４】第二のサンプルは上記により詳細に説明し
た機械の熱伝導性容器内に入れた。この熱伝導性容器は
温度を上方、及び下方、に調整するＰｅｌｔｉｅｒヒー
トポンプ及びマイクロプロセッサコントローラに結合し
て自動的に増幅順序、温度レベル、温度勾配及び温度の
タイミングを制御した。

【０１６５】第二の試料は次のプログラムサイクルを繰
返して２５サイクルの増幅に付した： （１） ３分間に亘る３７℃から９５℃への加熱、
（２） 変性を起こすための０．５分間の９５℃におけ
る維持、（３） １分間に亘る９５℃から３７℃への冷
却、及び（４） １分間の３７℃における維持。

【０１６６】II. 分析 分析のために二つの試験、すなわちドットブロット及び
アガロースゲル分析を行った。

【０１６７】ドットブロット分析のためには、下記配列
のＲＳ１８と称される標識ＤＮＡプローブを調製した： 5'-^*CTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3' (RS18) （＊は標識を示す）。このプローブは１５個の塩基長で
あり、遺伝子の第４番目乃至第１７番目のコドンに亘り
そして正常なβ−グロビン対立遺伝子（β^A ）に相補的
である。プライマー及びプローブの概略図を下記に示
す： このプローブは実施例Ｉの分節Ｉに示した操作に従って
合成した。このプローブはその１０ｐｍｏｌｅを４単位
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び約４０ｐｍｏｌｅ
のγ~³²ｐ−ＡＴＰ（約７０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）と
７０ｍＭ Ｔｒｉｓ ・ＨＣｌ（pH７．６）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１．５ｍＭ スパーミン及び１０ｍＭジチ
オスレイトールを含有する４０μｌの反応液中において
３７℃で６０分間接触させることにより標識した。次い
で全容量を２５ｍＭ ＥＤＴＡで１００μｌに調整し、
そしてマニアティス等［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ（１９８２）４６６−４６７］の操作に従ってＴ
ｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ緩衝液、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、pH ８．０）で
平衡化された１ｍｌのスピン透析カラム上で精製した。
反応生成物のＴＣＡ沈澱はＲＳ１８について比活性は
４．６μＣｉ／ｐｍｏｌｅであり、最終濃度は０．１１
４ｐｍｏｌｅ／μｌであることを示した。

【０１６８】分節Ｉで得られた増幅サンプル、及び熱安
定性酵素の代りにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウ断片を用いた以外は上記と同様に
して増幅したサンプル５μｌを１９５μｌの０．４Ｎ
ＮａＯＨ、２５ｍＭ ＥＤＴＡで釈稀し、リード及びマ
ン［Ｒｅｅｄ ａｂｄ Ｍａｎｎ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，７２０２−７２２１
（１９８５）］に開示されるように先ずフィルターを水
で濡らし、それらをフィルターを所定位置に保持するド
ットブロット作成用装置内に置き、サンプルを適用し、
そして各ウエルを０．４ｍｌの２０×ＳＳＰＥ（３．６
Ｍ ＮａＣｌ，２００ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄，２０ｍＭ
ＢＤＴＡ）で濯ぐことにより２個のレプリカナイロンフ
ィルター上にスポットした。次いでこれらのフィルター
を取出し、２０×ＳＳＰＥ中で濯ぎそして真空オーブン
内で８０℃において３０分間焼付けた。

【０１６９】焼付後、各フィルターを次いで６ ｍｌ の
５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液（１×＝０．０２％
ポリビニルピロリドン、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．
０２％ウシ血清アルブミン、０．２ｍＭ Ｔｒｉｓ、
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、pH ８．０）及び０．５％ＳＤ
Ｓよりなる６ｍｌのハイブリダイゼーション溶液と接触
させ５５℃で６０分間インキュベートした。次いで、５
μｌのプローブＲＳ１８をハイブリダイゼーション溶液
に添加し、フィルターを５５℃で６０分間インキュベー
トした。

【０１７０】最後に各ハイブリダイズされたフィルター
を１００ｍｌの２×ＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳ室温に
おいて１０分間２回洗浄した。次いで、フィルターをそ
れぞれ１００ｍｌの５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで６
０℃において１）１分間及び２）３分間の２回処理し
た。

【０１７１】次いで各フィルターをオートラジオグラフ
ィにかけたところ、シグナルは９０分後に容易に明らか
となった。

【０１７２】アガロースゲル分析において、各５μｌ
の増幅反応液を１×ＴＢＥ緩衝液（０．０８９Ｍ Ｔｒ
ｉｓホウ酸塩、０．０８９Ｍホウ酸、及び２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）中の０．５％アガロースゲルに負荷し、１００Ｖ
で６０分間電気泳動させた。エチジウムブロマイド染色
後、ＤＮＡをＵＶ蛍光により可視化した。

【０１７３】これらの結果は、実施例Ｉ及び本例で用い
た機械はＤＮＡの増幅に同様に有効であり、所望配列に
対応する同様な強度の個々の高密度の１１０塩基対バン
ド並びにはるかに低い強度の僅かのその他の個々のバン
ドを示した。これに対して、各サイクル後にＥ．コリポ
リメラーゼＩのクレノウ断片を用いる試薬移転を含む増
幅方法は多くの非関連ＤＮＡ配列の非−特異的増幅から
生ずるＤＮＡスメアを与えた。

【０１７４】ＨＬＡ−ＤＱ、ＤＲ及びＤＰ領域の評価に
おいても同様の増幅及び検出における改良が達成される
ことが期待される。

【０１７５】実施例ＩＩＩ 増幅及びクローニング ヒトβ−ヘモグロビン遺伝子上の１１９塩基対断片の増
幅のために、上記の如く、Ｍｏｌｔ４細胞系或いはＧＭ
２０６４細胞系（β−及びΔ−ヘモグロビン領域のホモ
接合性削除を表わし、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍ
ｕｔａｎｔＣｅｌｌ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、ニュージ
ャージ州カムデンから取得可能）から単離されたヒトゲ
ノムＤＮＡのそれぞれ総量１μｇを、５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｈｃｌ pH ８、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、２００μｇ／ｍｌゼラチン、５ｍＭベータ
メ−ルカプトエタノール、１．５ｍＭ ｄＡＴＰ、１．
５ｍＭ ｄＴＴＰ、１．５ｍＭ ｄＴＴＰ、１．５ｍＭ
ｄＧＴＰ、及び１μＭの下記プライマーの各々を含有
する１００μｌの反応液中で増幅させた： 5'-CTTCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC-3' (GH18) 5'-CACaAgCTTCATCCACGTTCACC-3' (GH19) （茲に小文字は制限酵素部位を創出するための野性種配
列からのミスマットを示す）。

【０１７６】ＧＨ１８は負鎖に相補的な２６塩基オリゴ
ヌクレオチドであり、内部Ｐｓｔ Ｉ部位を含有しる。
ＧＨ１９は正鎖に相補的である２３塩基オリゴヌクレオ
チドであり、内部Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識部位を含有す
る。これらのプライマーは先ずバクテリオファージＭ１
３のＰｓｔ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位に対する
相同性のための遺伝子の領域をスクリーニングすること
により選択された。次いでプライマーが実施例Ｉと同様
にして調製された。

【０１７７】上記反応液を９５℃において１０分間加熱
し、次いで室温に冷却した。実施例Ｉにおいて記載した
ポリメラーゼの総量４μｌを各反応液に添加し、次いで
各混合液に鉱油を重層した。これらの反応液を次のプロ
グラムで３０サイクルの増幅に対した： ２５分間勾配、３７から９８℃ ３分間勾配、 ９８から３７℃ ２分間浸漬、 ３７℃。

【０１７８】最終サイクル後、反応混合物を次いで６５
℃で２０分間インキュベートして最終延長を完結させ
た。鉱油をクロロホルムで抽出し、反応液を２０℃で貯
蔵した。

【０１７９】総量１０μｌの増幅生成物をＢｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから市販されているＭ１３
ｍｐ１０クローニングベクター０．５μｇと共に５０ｍ
ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、pH １７．
８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０単位のＰｓｔ Ｉ及び
２６単位のＨｉｎｄ ＩＩＩを含有する５０μｌ容の液
中で３７℃において９０分間消化した。

【０１８０】２０℃に冷却することにより反応を停止さ
せた。容量をＴＥ緩衝液で１１０μｌに調整し、１ｍｌ
ＢｉｏＧｅｌＰ−４スピン透析カラム上に負荷した
（１００μｌ）。１つの０．１ ｍｌ画分を集めエタノ
ール沈澱させた。

【０１８１】（この時点において、ＧＭ２０６４サンプ
ル中にはβ−グロビン増幅生成物があることが見出され
た。引続く実験はＧＨ１８或いはＧＨ１９のいづれかの
プライマーに対する汚染源を追跡した。その他のプライ
マー源は利用可能でなかったので、実験はプライマーの
中の汚染ＤＮＡから何等かのクローン化された配列に由
来するとの理解をもって継続された。）エタノールペレ
ットを１５μｌの水に再懸濁し、次いで５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ、pH７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．
５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭジチオスレイトール及び４０
０単位のリガーゼを含有する２０μｌ容量に調整した。
この混合物を１６℃で３時間インキュベートした。

【０１８２】Ｍｏｌｔ４ＤＮＡを含有する１０μｌの結
合反応液をＢＲＬ（メリーランド州、ベテスダ）から市
販されているＥ．コリ株ＪＭ１０３コンピテント細胞中
に形質転換した。形質転換株を調製するために従った操
作はメッシング、Ｊ．［Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８
１）「巨大分子についての第三回クリーブランドシンポ
ジウム：組換えＤＮＡ（Ｔｈｉｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎ
ｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ
ｌｅｓ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）」Ａ．Ｗａ
ｌｔｏｎ編、エルセビア、アムステルダム、１４３−１
５３］に説明されている。全部で６５１個の無色プラー
ク（及び０個の青色プラーク）が得られた。これらのう
ち１１９個は（＋）−鎖インサート１８％）を有し、そ
して１９個は（−）−鎖インサート（３％）を有した。
これは反応が２５℃で２分間進行され、その後２分間１
００℃に加熱、冷却、クレノウ断片の添加、及び反応を
行う工程が９回繰返される、Ｅ．コリポリメラーゼＩの
クレノウ断片を用いる増幅技術から得られるプライマー
−陽性プラーク内のβ−グロビン陽性プラークのパーセ
ント割合に対する殆んど２０倍の増大である。これらの
結果は本発明の熱安定性酵素を用いる増幅反応の改良さ
れた特異性を確認するものである。

【０１８３】その後のＧＭ２０６４及び汚染プライマー
を用いるクローニング実験においては、５１０個の無色
プラークのうち４３個（８％）は（＋）−鎖インサート
を有した。これはＭｏｌｔ４からの１１９個のクローン
のうち約半分が汚染配列を含有することを示唆する。

【０１８４】Ｍｏｌｔ４から１０個の（＋）−鎖クロー
ンを配列決定した。５個は正常の野性種配列であり、そ
して５個は遺伝子の第二のコドンの第３番目の位置にお
いて単一のＣからＴへの変異を有した（ＣＡＣからＣＡ
Ｔへ）。ＧＭ２０６４からの４個の汚染クローンを配列
決定したところ、四つとも全て正常であった。

【０１８５】制限部位修飾プライマーを用いてヒトＮ−
ｒａｓオンコーゲンを増幅及びクローン化し、そして部
分的に配列決定し、そして上記技術を用いてＨＬＡＤＱ
−α、ＤＱ−β及びＤＲ−β遺伝子の塩基対セグメント
をクローン化することもできる。これらの増幅反応の全
ては１０容量％のジメチルスルホキシドの存在下におい
て行われる。

【０１８６】プレート化及びスクリーニング 増幅及びクローニングから生ずるインサートのパーセン
トを決定するためにプラオマーＰＣ０４を用いてフィル
ターをプローブした。増幅プライマー−陽性プラーク内
のβ−グロビン陽性プラークのパーセントは約２０％で
あった。これは反応が２５℃で２分間行われ、その後２
分間の１００℃への加熱、冷却、クレノウ断片の添加、
及び反応の工程が９回繰返されるＥ．コリポリメラーゼ
Ｉのクレノウ断片を用いる増幅技術からのプライマー−
陽性プラーク内のβ−グロビン陽性プラークのパーセン
トに対して２０倍の増大である。これらの結果は本発明
の熱安定性酵素を用いる増幅反応の改良された特異性を
確認するものである。

【０１８７】制限部位−変成プライマーを用いてヒトＮ
−ｒａｓオンコーゲンを増幅及びクローン化及び部分的
に配列決定し、及び上記技術を用いてＨＬＡ ＤＱ−
α、ＤＱ−β及びＤＲ−β遺伝子の塩基対セグメントを
クローン化することもできる。これらの増幅反応の全て
は１０容量％のジメチルスルホキシドの存在下において
行われる。

【０１８８】要約すると、本発明は温度−循環連鎖反応
及び熱安定性酵素を含む１種以上の核酸配列の自動化増
幅を行うための装置を提供するものであり、その装置は
試薬のための熱−伝導容器、容器を任意の与えられた温
度まで或いはその温度において加熱、冷却及び維持する
ための手段、及び温度レベルを制御する信号を発生する
コンピュータ手段を有する。この増幅方法の結果、増幅
生成物の増大した収率、より大きな特異性が生じ、及び
従来開示されたものに比べて操作を実施するために必要
な工程数が少なくなる。

【図面の簡単な説明】

【図１】熱安定性酵素及び反応容器の温度をサイクリン
グさせるためのペリチエヒートポンプを用いて増幅方法
を実施することのできる装置の一般的ブロック線図であ
る。

【図２】反応容器の温度をサイクリングさせるための水
浴を用いる増幅方法を実施することのできる装置の一般
的ブロック線図である。

【図３】ソリッドステートヒートポンプ及び反応室熱交
換器構造体の図表である。

【図４】ソリッドステートヒートポンプのためのインタ
ーフェースユニットの概念図である。

【図５】典型的なユーザーにより規定される温度プロフ
ィールを示す図である。

【図６】実際の反応温度のフィードバックを用いない経
験的実施態様のための制御ソフトウェアのための流れ図
の上半分を示す図である。

【図７】図６の下半分を示す図である。

【図８】反応室の実際の温度を監視し、それを所望温度
プロフィールに対比する実際の温度フィードバック信号
を用いる好ましい実施態様のための制御ソフトウェアの
ための流れ図の上半分を示す図である。

【図９】図８の下半分を示す図である。

【符号の説明】

１０ 熱交換器、 １２ ヒートポンプ、 １４ ヒー
トシンク、 １６，１８ 水浴（貯蔵器）、 ２２ ユ
ーザーインターフェース、 ２４ 記憶装置、４０ 反
応ウエル（室）、 ４６ 流体マルチプレクサー、 ４
８，５０ 高温流体搬送管、 ５２，５４ 低温流体搬
送管、 ８０ 温度センサー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ (72)発明者 ジョウジフ トーマス ウィドゥナス アメリカ合衆国， カリフォルニア 94708， バークレイ， ヘンリー スト リート 1364 (72)発明者 リチャード アラン リース アメリカ合衆国， カリフォルニア 94707， バークレイ， アラメーダ 1136 (72)発明者 ティモシー ジェイ． ウェンベルグ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94619, オークランド， マデラ 3416 (72)発明者 ルイス マイケル ミゼイ アメリカ合衆国， カリフォルニア 94539， フリモント， オンディナ コ ート 40815

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数のサイクルを有し、該サイクルのそ
   れぞれが９０〜１０５℃の範囲内での変性及び３５〜６
   ５℃の範囲内でのハイブリダイゼーションを含むポリメ
   ラーゼ連鎖反応内プロトコルを実施するための熱サイク
   リングシステムにおいて、 増幅される少なくとも１つの１本鎖又は２本鎖核酸配
   列、４つの異なったデオキシリボヌクレオチド、変性温
   度で不可逆的に変性されないＤＮＡポリメラーゼ、及び
   前記のそれぞれの核酸配列のための１対のオリゴデオキ
   シヌクレオチドからなる反応混合物と、 該反応混合物を収容する熱伝達反応室と、 前記反応室を前記ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルに基
   づき加熱及び冷却するためのコンピュータ制御可能な手
   段と、 前記反応室を加熱及び冷却するための前記手段に制御可
   能に連結されたユーザーによりプログラミング可能なコ
   ンピュータ手段とからなり、該コンピュータ手段が、ユ
   ーザーによって開始されると前記ポリメラーゼ連鎖反応
   プロトコルに基づいて前記反応室を加熱及び冷却するよ
   うに前記加熱及び冷却するための手段を作動させるよう
   にプログラミングされていることを特徴とする、ポリメ
   ラーゼ連鎖反応プロトコル実施するための熱サイクリン
   グシステム。
2. 【請求項２】 前記ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルが
   繰り返しサイクルからなり、該サイクルのそれぞれが、
   前記反応室を９０〜１０５℃の範囲内の変性温度に０．
   ５〜４分間加熱し、かつ前記反応室を３５〜６５℃の範
   囲内のハイブリダイゼーション温度に０．５〜５分間冷
   却することよりなる、請求項１記載の熱サイクリングシ
   ステム。
3. 【請求項３】 前記サイクルを少なくとも１５回繰り返
   す、請求項１記載の熱サイクリングシステム。
4. 【請求項４】 前記ポリメラーゼ連鎖反応プロトコル
   が、繰り返し、前記反応室を３５〜６５℃の範囲内のハ
   イブリダイゼーション温度に０．５〜５分間調整し、次
   いで延長生成物合成を４０〜８０℃の範囲内の温度で
   ０．５〜４０分間行い、かつ次いで前記反応室を９０〜
   １０５℃の範囲内の変性温度に０．５〜４分間加熱する
   ことよりなる、請求項１記載の熱サイクリングシステ
   ム。
5. 【請求項５】 前記サイクルを少なくとも１５回繰り返
   す、請求項４記載の熱サイクリングシステム。
6. 【請求項６】 前記反応室を冷却する手段が、熱が反応
   室から流体に伝達されるように冷却流体をポンプ輸送す
   る手段からなる、請求項１記載の熱サイクリングシステ
   ム。
7. 【請求項７】 前記反応室を加熱する手段が、熱が流体
   から反応室に伝達されるように加熱流体をポンプ輸送す
   る手段からなる、請求項１記載の熱サイクリングシステ
   ム。
8. 【請求項８】 前記反応室を冷却する手段がペルチエ装
   置からなる、請求項１記載の熱サイクリングシステム。
9. 【請求項９】 前記反応室を加熱及び冷却する手段が金
   属ブロックを有する、特許請求の範囲第１項記載の熱サ
   イクリングシステム。