JPH04222599A - 二重受容体ポリヌクレオチド検定方法 - Google Patents
二重受容体ポリヌクレオチド検定方法Info
- Publication number
- JPH04222599A JPH04222599A JP3088621A JP8862191A JPH04222599A JP H04222599 A JPH04222599 A JP H04222599A JP 3088621 A JP3088621 A JP 3088621A JP 8862191 A JP8862191 A JP 8862191A JP H04222599 A JPH04222599 A JP H04222599A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- target polynucleotide
- nucleotide sequence
- specific
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 139
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 139
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 139
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 82
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 82
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 54
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims abstract 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 41
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 12
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 10
- -1 triphosphate nucleoside Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 3
- 101000587455 Homo sapiens Single-stranded DNA-binding protein, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 2
- 102100029719 Single-stranded DNA-binding protein, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 42
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 10
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 10
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical group N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 108091006374 cAMP receptor proteins Proteins 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(5-bromo-1h-indol-3-yl)oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C=C12 LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N 0.000 description 1
- 241000235389 Absidia Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000335423 Blastomyces Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 241001148111 Brucella suis Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001660259 Cereus <cactus> Species 0.000 description 1
- 241001502567 Chikungunya virus Species 0.000 description 1
- 108020004998 Chloroplast DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005133 Chloroplast RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000222290 Cladosporium Species 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 241000223203 Coccidioides Species 0.000 description 1
- 241000204955 Colorado tick fever virus Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710945 Eastern equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000186810 Erysipelothrix rhusiopathiae Species 0.000 description 1
- 241000490229 Eucephalus Species 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 241001221585 Keratinomyces Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241001550390 Leptospira interrogans serovar Canicola Species 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 241001444195 Madurella Species 0.000 description 1
- 241000608292 Mayaro virus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001480037 Microsporum Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700560 Molluscum contagiosum virus Species 0.000 description 1
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 1
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 241000724832 Non-A, non-B hepatitis virus Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000902235 Oides Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000026681 Paratuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 206010033976 Paravaccinia Diseases 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 241000319489 Phora Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 101100505672 Podospora anserina grisea gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001026602 Quintana Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 1
- 206010039207 Rocky Mountain Spotted Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 241001085826 Sporotrichum Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 241001478878 Streptobacillus Species 0.000 description 1
- 241001478880 Streptobacillus moniliformis Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241001045770 Trichophyton mentagrophytes Species 0.000 description 1
- 241000223104 Trypanosoma Species 0.000 description 1
- 241001661641 Verrucosa Species 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 241000710951 Western equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- 229940076539 bifera Drugs 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005465 channeling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 101150054175 cro gene Proteins 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 239000010440 gypsum Substances 0.000 description 1
- 229910052602 gypsum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 208000020298 milker nodule Diseases 0.000 description 1
- 108091064355 mitochondrial RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000006552 photochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】発明の分野
本発明は、サンプル中の標的ポリヌクレオチド配列のよ
うなポリヌクレオチドの存在を測定するための方法、な
らびにそれに関連した組成物およびキットに関する。
うなポリヌクレオチドの存在を測定するための方法、な
らびにそれに関連した組成物およびキットに関する。
【０００２】発明の背景標的ポリヌクレオチドが存在す
る結果として、２種の核酸鎖に会合が起こる方法はこれ
までにも記載されている。これらの方法は、標的と２種
のプローブが関与する非共有結合サンドイッチの形成に
基づくものであり、この場合、各プローブは標的上の異
なる部位に結合する。プローブが隣接せず、ヌクレオチ
ド１個でも分離していれば、それらはリガーゼによって
共有結合サンドイッチに連結できる（Ｇｏｆｆｉｎ，Ｃ
．ら：Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５（２１）：８
７５５，１９８７）。リゲートされたプローブはついで
、既知の技術を用いて増幅させることができる（Ｓａｉ
ｋｉら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０，１９８
６）。プローブがリゲードされるかまたは増幅されるか
とは無関係に、それらが共有結合または非共有結合によ
って結合すれば、２つのプローブの密接な会合は、酵素
チャネリング、蛍光エネルギー転移等の既知方法で検出
が可能である。
る結果として、２種の核酸鎖に会合が起こる方法はこれ
までにも記載されている。これらの方法は、標的と２種
のプローブが関与する非共有結合サンドイッチの形成に
基づくものであり、この場合、各プローブは標的上の異
なる部位に結合する。プローブが隣接せず、ヌクレオチ
ド１個でも分離していれば、それらはリガーゼによって
共有結合サンドイッチに連結できる（Ｇｏｆｆｉｎ，Ｃ
．ら：Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５（２１）：８
７５５，１９８７）。リゲートされたプローブはついで
、既知の技術を用いて増幅させることができる（Ｓａｉ
ｋｉら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０，１９８
６）。プローブがリゲードされるかまたは増幅されるか
とは無関係に、それらが共有結合または非共有結合によ
って結合すれば、２つのプローブの密接な会合は、酵素
チャネリング、蛍光エネルギー転移等の既知方法で検出
が可能である。
【０００３】核酸配列の検出には、様々なハイブリダイ
ゼーション法が使用されてきた。欧州特許出願第０，１
９２，１６８号には、ポリヌクレオチド配列を検出する
ための溶液相二重ハイブリダイゼーション検定法が記載
されている。記載の方法は、反応パートナーと安定な共
有または非共有結合を形成できる反応部位をもつ分離プ
ローブを使用する。この発明の好ましい実施態様では、
反応パートナーは共有または非共有結合で固体支持体に
吸着される。
ゼーション法が使用されてきた。欧州特許出願第０，１
９２，１６８号には、ポリヌクレオチド配列を検出する
ための溶液相二重ハイブリダイゼーション検定法が記載
されている。記載の方法は、反応パートナーと安定な共
有または非共有結合を形成できる反応部位をもつ分離プ
ローブを使用する。この発明の好ましい実施態様では、
反応パートナーは共有または非共有結合で固体支持体に
吸着される。
【０００４】国際特許出願第８７／０３６２２号には、
高レベルの増幅を生じるハイブリダイゼーション検定が
記載されている。増幅は、その小セグメントが興味ある
標的ＤＮＡにハイブリダイズする一次プローブを用い、
標的の別個のセグメントを認識する第二のプローブを導
入することによって行われる。二重のプローブ系の使用
は、ハイブリダイゼーション事象を起こす際に増幅の増
大を生じる。
高レベルの増幅を生じるハイブリダイゼーション検定が
記載されている。増幅は、その小セグメントが興味ある
標的ＤＮＡにハイブリダイズする一次プローブを用い、
標的の別個のセグメントを認識する第二のプローブを導
入することによって行われる。二重のプローブ系の使用
は、ハイブリダイゼーション事象を起こす際に増幅の増
大を生じる。
【０００５】米国特許第４，７７５，６１９号には、サ
ンプルＤＮＡの二重鎖化のようなハイブリダイゼーショ
ン技術を用いる特異的配列の検出方法が記載されている
。二重鎖化とプローブが、標識と支持体の間の空間的関
係を修飾する能力に影響する。特異的配列、標的ポリヌ
クレオチドの存在はメジウム中に放出される標識の量に
よって測定される。
ンプルＤＮＡの二重鎖化のようなハイブリダイゼーショ
ン技術を用いる特異的配列の検出方法が記載されている
。二重鎖化とプローブが、標識と支持体の間の空間的関
係を修飾する能力に影響する。特異的配列、標的ポリヌ
クレオチドの存在はメジウム中に放出される標識の量に
よって測定される。
【０００６】米国特許特許第４，７６６，０６２号には
、プローブポリヌクレオチド複合体が塩基対結合可能で
あって、標的ポリヌクレオチドが複合体から標識ポリヌ
クレオチドを置換してプローブに結合し、サンプル中の
標的ポリヌクレオチドの存在を測定可能にする方法が記
載されている。この検出系が有効であるためには、検出
可能シグナルの放出が起こるのに十分な、標的系への塩
基対結合がなければならない。
、プローブポリヌクレオチド複合体が塩基対結合可能で
あって、標的ポリヌクレオチドが複合体から標識ポリヌ
クレオチドを置換してプローブに結合し、サンプル中の
標的ポリヌクレオチドの存在を測定可能にする方法が記
載されている。この検出系が有効であるためには、検出
可能シグナルの放出が起こるのに十分な、標的系への塩
基対結合がなければならない。
【０００７】核酸ハイブリダイゼーションのさらに別の
検出方法が、米国特許第４，７２４，２０２号に記載さ
れている。この特許には、既知サンプルまたは分離プロ
ーブが固体支持体上に固定して、未知サンプルと標識検
出プローブを含有する混合物と接触させる検出方法が記
載されている。標識された検出プローブは、放射能を使
用せず、ハイブリダイゼーション不能の一本鎖または二
本鎖核酸部分と連結した未知サンプルとハイブリダイズ
可能な核酸一本鎖部分をもつことにより化学的修飾なし
に創成される。ハイブリダイゼーション不能部分には特
定の蛋白質の認識部位が包含される。
検出方法が、米国特許第４，７２４，２０２号に記載さ
れている。この特許には、既知サンプルまたは分離プロ
ーブが固体支持体上に固定して、未知サンプルと標識検
出プローブを含有する混合物と接触させる検出方法が記
載されている。標識された検出プローブは、放射能を使
用せず、ハイブリダイゼーション不能の一本鎖または二
本鎖核酸部分と連結した未知サンプルとハイブリダイズ
可能な核酸一本鎖部分をもつことにより化学的修飾なし
に創成される。ハイブリダイゼーション不能部分には特
定の蛋白質の認識部位が包含される。
【０００８】ポリヌクレオチド中の標的ヌクレオチド配
列の存在を検出する方法において、第一のヌクレオチド
配列と第二のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列
の非連続部分にハイブリダイズさせ、この第一および第
二ヌクレオチド配列の存在を検出することからなる方法
が欧州特許公告第３５７，３３６号（カナダ特許出願第
６０９，３７３号および日本特許出願第０１−２１８４
４８号に対応）に記載されている。
列の存在を検出する方法において、第一のヌクレオチド
配列と第二のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列
の非連続部分にハイブリダイズさせ、この第一および第
二ヌクレオチド配列の存在を検出することからなる方法
が欧州特許公告第３５７，３３６号（カナダ特許出願第
６０９，３７３号および日本特許出願第０１−２１８４
４８号に対応）に記載されている。
【０００９】しかしながら、引用した背景技術のいずれ
においても、本発明に記載されているような核酸の検出
の問題に対する解決は与えられていない。本発明の方法
によれば、標的ポリヌクレオチド配列は、大規模な免疫
化学的分析に容易に適用できる溶液相ハイブリダイゼー
ションプロトコールを用いて検出できる。本発明に記載
の方法は、診断試験系のデザインにも容易に適用できる
。
においても、本発明に記載されているような核酸の検出
の問題に対する解決は与えられていない。本発明の方法
によれば、標的ポリヌクレオチド配列は、大規模な免疫
化学的分析に容易に適用できる溶液相ハイブリダイゼー
ションプロトコールを用いて検出できる。本発明に記載
の方法は、診断試験系のデザインにも容易に適用できる
。
【００１０】発明の要約
本発明の一態様は、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列に
応答して、共有結合または非共有結合で結合したヌクレ
オチド配列結合対を形成させ、この場合、各ヌクレオチ
ドの部分にはヌクレオチド配列特異的結合蛋白質（ＮＳ
ＳＢＰ）が存在し、ついで（ｂ）ヌクレオチド配列の結
合対と複合体を形成したＮＳＳＢＰを検出することから
なる方法である。
応答して、共有結合または非共有結合で結合したヌクレ
オチド配列結合対を形成させ、この場合、各ヌクレオチ
ドの部分にはヌクレオチド配列特異的結合蛋白質（ＮＳ
ＳＢＰ）が存在し、ついで（ｂ）ヌクレオチド配列の結
合対と複合体を形成したＮＳＳＢＰを検出することから
なる方法である。
【００１１】本発明の他の態様は、標的ポリヌクレオチ
ド配列の含有が疑われるメジウム中の標的ポリヌクレオ
チドを検出する方法において、（ａ）標的ポリヌクレオ
チド配列の３′末端に、一本鎖である第一の特異的ヌク
レオチド配列の３′末端に結合した第一のリガンドをハ
イブリダイズさせ、（ｂ）標的ポリヌクレオチド配列を
、鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼおよび三リ
ン酸ヌクレオシドを用いて、一本鎖の第一の特異的ヌク
レオチド配列に沿って延長させて、二本鎖の第一の特異
的ヌクレオチド配列を形成させ、（ｃ）二本鎖の第一の
特異的ヌクレオチド配列に、まだ結合していない場合は
、第二の特異的ヌクレオチド配列に結合した第二のリガ
ンド、ならびに二本鎖の第一および第二の特異的ヌクレ
オチド配列を結合可能なＮＳＳＢＰを結合させ、ついで
（ｄ）二本鎖の第一および第二の特異的ヌクレオチド配
列の結合対とＮＳＳＢＰとの複合体を検出する方法であ
る。
ド配列の含有が疑われるメジウム中の標的ポリヌクレオ
チドを検出する方法において、（ａ）標的ポリヌクレオ
チド配列の３′末端に、一本鎖である第一の特異的ヌク
レオチド配列の３′末端に結合した第一のリガンドをハ
イブリダイズさせ、（ｂ）標的ポリヌクレオチド配列を
、鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼおよび三リ
ン酸ヌクレオシドを用いて、一本鎖の第一の特異的ヌク
レオチド配列に沿って延長させて、二本鎖の第一の特異
的ヌクレオチド配列を形成させ、（ｃ）二本鎖の第一の
特異的ヌクレオチド配列に、まだ結合していない場合は
、第二の特異的ヌクレオチド配列に結合した第二のリガ
ンド、ならびに二本鎖の第一および第二の特異的ヌクレ
オチド配列を結合可能なＮＳＳＢＰを結合させ、ついで
（ｄ）二本鎖の第一および第二の特異的ヌクレオチド配
列の結合対とＮＳＳＢＰとの複合体を検出する方法であ
る。
【００１２】本発明のまた他の態様は、サンプル中の標
的ポリヌクレオチド配列を検出する方法において、（ａ
）液体メジウム中に、標的ポリヌクレオチド配列の第一
の部分とハイブリダイズ可能な配列を有し、第一の特異
的ヌクレオチド配列に結合した第一のリガンド、ならび
に標的配列の第二の部分とハイブリダイズ可能な配列を
有し、第二の特異的ヌクレオチド配列に結合した第二の
リガンドを組合せて提供し、（ｂ）第一および第二のリ
ガンドを標的配列の存在の関数として連結させる手段を
提供し、（ｃ）連結した第一および第二のリガンドに、
それぞれ第一および第二の特異的結合配列に結合可能な
第一および第二のＮＳＳＢＰを混合し、ついで（ｄ）サ
ンプル中の標的ポリヌクレオチド配列の存在を指示する
連結ＮＳＳＢＰ間の結合を検出する方法である。
的ポリヌクレオチド配列を検出する方法において、（ａ
）液体メジウム中に、標的ポリヌクレオチド配列の第一
の部分とハイブリダイズ可能な配列を有し、第一の特異
的ヌクレオチド配列に結合した第一のリガンド、ならび
に標的配列の第二の部分とハイブリダイズ可能な配列を
有し、第二の特異的ヌクレオチド配列に結合した第二の
リガンドを組合せて提供し、（ｂ）第一および第二のリ
ガンドを標的配列の存在の関数として連結させる手段を
提供し、（ｃ）連結した第一および第二のリガンドに、
それぞれ第一および第二の特異的結合配列に結合可能な
第一および第二のＮＳＳＢＰを混合し、ついで（ｄ）サ
ンプル中の標的ポリヌクレオチド配列の存在を指示する
連結ＮＳＳＢＰ間の結合を検出する方法である。
【００１３】本発明のさらに別の態様は、ポリヌクレオ
チド配列の結合対の別個の部分からなる２個の特異的ヌ
クレオチド配列へのＮＳＳＢＰの同時結合を検出するこ
とからなる、ポリヌクレオチド配列の結合対を検出する
方法である。
チド配列の結合対の別個の部分からなる２個の特異的ヌ
クレオチド配列へのＮＳＳＢＰの同時結合を検出するこ
とからなる、ポリヌクレオチド配列の結合対を検出する
方法である。
【００１４】本発明のまたさらに他の態様は、ポリヌク
レオチド配列の結合対の存在が疑われるサンプル中で、
第一および第二の特異的ヌクレオチド配列からなる配列
の結合対の検出を実施する方法である。この方法は（ａ
）液体メジウム中に（１）サンプル、（２）それぞれ第
一および第二の特異的ヌクレオチド配列に結合可能な第
一および第二のＮＳＳＢＰ（この場合、第一のＮＳＳＢ
Ｐは表面に結合しているかまたは結合可能であり、第二
のＮＳＳＢＰは検出可能な標識に結合しているかまたは
結合可能である）、および（３）表面を混合し、（ｂ）
表面からメジウムを分離し、（ｃ）第二のＮＳＳＢＰが
まだ標識に結合していない場合には、第二のＮＳＳＢＰ
を結合できる検出可能な標識と表面を混合し、ついで（
ｄ）表面に結合した標識を検出するものである。
レオチド配列の結合対の存在が疑われるサンプル中で、
第一および第二の特異的ヌクレオチド配列からなる配列
の結合対の検出を実施する方法である。この方法は（ａ
）液体メジウム中に（１）サンプル、（２）それぞれ第
一および第二の特異的ヌクレオチド配列に結合可能な第
一および第二のＮＳＳＢＰ（この場合、第一のＮＳＳＢ
Ｐは表面に結合しているかまたは結合可能であり、第二
のＮＳＳＢＰは検出可能な標識に結合しているかまたは
結合可能である）、および（３）表面を混合し、（ｂ）
表面からメジウムを分離し、（ｃ）第二のＮＳＳＢＰが
まだ標識に結合していない場合には、第二のＮＳＳＢＰ
を結合できる検出可能な標識と表面を混合し、ついで（
ｄ）表面に結合した標識を検出するものである。
【００１５】本発明の他の態様は、特異的ヌクレオチド
配列に結合した標的ポリヌクレオチドからなり、それぞ
れの特異的ヌクレオチドはそれぞれのＮＳＳＢＰに結合
していて、一方のＮＳＳＢＰは表面に結合しているかま
たは結合可能であり、他方のＮＳＳＢＰは標識に結合し
ているかまたは結合可能な組成物である。
配列に結合した標的ポリヌクレオチドからなり、それぞ
れの特異的ヌクレオチドはそれぞれのＮＳＳＢＰに結合
していて、一方のＮＳＳＢＰは表面に結合しているかま
たは結合可能であり、他方のＮＳＳＢＰは標識に結合し
ているかまたは結合可能な組成物である。
【００１６】本発明の他の態様は、標的ヌクレオチド配
列の測定に使用するキットであって、（１）別個のＮＳ
ＳＢＰに存在するそれぞれの部分に対して特異的な１対
のヌクレオチド配列、および（２）別個のヌクレオチド
特異的結合蛋白質を組合せて包装してなるキットである
。
列の測定に使用するキットであって、（１）別個のＮＳ
ＳＢＰに存在するそれぞれの部分に対して特異的な１対
のヌクレオチド配列、および（２）別個のヌクレオチド
特異的結合蛋白質を組合せて包装してなるキットである
。
【００１７】図面の簡単な記載
図１：標的ポリヌクレオチド配列の、予め形成させた二
本鎖の第一および第二の特異的ヌクレオチド配列とのハ
イブリダイゼーションによる標的ポリヌクレオチド配列
の検出 図２：標的ポリヌクレオチド配列に対する第一および第
二の特異的ヌクレオチド配列の化学的または酵素的いず
れかの共有結合的付着による標的ポリヌクレオチドの検
出 図３：第一の特異的ポリヌクレオチド配列の一側の延長
による標的ヌクレオチド配列の検出 図４：例１にさらに詳細に記載した本発明の態様の模式
図 図５：例２にさらに詳細に記載した本発明の態様の模式
図
本鎖の第一および第二の特異的ヌクレオチド配列とのハ
イブリダイゼーションによる標的ポリヌクレオチド配列
の検出 図２：標的ポリヌクレオチド配列に対する第一および第
二の特異的ヌクレオチド配列の化学的または酵素的いず
れかの共有結合的付着による標的ポリヌクレオチドの検
出 図３：第一の特異的ポリヌクレオチド配列の一側の延長
による標的ヌクレオチド配列の検出 図４：例１にさらに詳細に記載した本発明の態様の模式
図 図５：例２にさらに詳細に記載した本発明の態様の模式
図
【００１８】発明の詳細な記載
定義
以下に述べるように、また本発明の説明の便宜上、次の
語について定義を示す。
語について定義を示す。
【００１９】「標的ポリヌクレオチド配列」は、同定す
べきヌクレオチドの全配列または部分配列を意味する。 その同一性は、この標的ポリヌクレオチド配列と相補性
で、それとハイブリダイズする結合ポリヌクレオチド配
列の製造が十分可能な程度に知られている。標的ポリヌ
クレオチドは通常、約１２〜１０００またはそれ以上の
ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０個のヌクレオチド
を含有する。標的ポリヌクレオチド配列は、大分子の部
分であっても、そうでなくてもよい。
べきヌクレオチドの全配列または部分配列を意味する。 その同一性は、この標的ポリヌクレオチド配列と相補性
で、それとハイブリダイズする結合ポリヌクレオチド配
列の製造が十分可能な程度に知られている。標的ポリヌ
クレオチドは通常、約１２〜１０００またはそれ以上の
ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０個のヌクレオチド
を含有する。標的ポリヌクレオチド配列は、大分子の部
分であっても、そうでなくてもよい。
【００２０】「ポリヌクレオチドの結合対」は、標的ポ
リヌクレオチド配列の存在の結果として、一緒に結合す
ることになる第一および第二のポリヌクレオチド配列を
意味する。結合対を形成する第一および第二のポリヌク
レオチド配列の結合は、共有結合でも非共有結合でもよ
い。
リヌクレオチド配列の存在の結果として、一緒に結合す
ることになる第一および第二のポリヌクレオチド配列を
意味する。結合対を形成する第一および第二のポリヌク
レオチド配列の結合は、共有結合でも非共有結合でもよ
い。
【００２１】「第一のリガンド」は、標的ヌクレオチド
配列のある領域に相補性のポリヌクレオチド配列を有し
、標的ヌクレオチドのこの領域に結合することによって
、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第一の
ポリヌクレオチド配列の部分を意味する。
配列のある領域に相補性のポリヌクレオチド配列を有し
、標的ヌクレオチドのこの領域に結合することによって
、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第一の
ポリヌクレオチド配列の部分を意味する。
【００２２】「第二のリガンド」は、第一のリガンドの
場合とは異なるある領域で標的ヌクレオチド配列とハイ
ブリダイズできる第二のポリヌクレオチド配列の部分を
意味する。
場合とは異なるある領域で標的ヌクレオチド配列とハイ
ブリダイズできる第二のポリヌクレオチド配列の部分を
意味する。
【００２３】「リゲーション」は第一と第二のヌクレオ
チド配列の間の共有結合による付着を意味する。これら
の配列が標的ポリヌクレオチド配列に結合する場合、化
学的結合が形成される。共有結合による付着は、リガー
ゼたとえばＴ４ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガ
ーゼによって触媒されるリゲーションの場合のように必
要な補因子の存在下に酵素的に、または化学的に行うこ
とができる。
チド配列の間の共有結合による付着を意味する。これら
の配列が標的ポリヌクレオチド配列に結合する場合、化
学的結合が形成される。共有結合による付着は、リガー
ゼたとえばＴ４ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガ
ーゼによって触媒されるリゲーションの場合のように必
要な補因子の存在下に酵素的に、または化学的に行うこ
とができる。
【００２４】第一および第二のヌクレオチド配列の間に
共有結合による付着を化学的に形成させる一手段として
は、光化学反応を用いる方法がある。たとえば、隣接し
たヌクレオチドの一方を処理してアリールアジドを形成
させ、ついでこれを照射すると、隣接したヌクレオチド
間に共有結合を形成させることができる。
共有結合による付着を化学的に形成させる一手段として
は、光化学反応を用いる方法がある。たとえば、隣接し
たヌクレオチドの一方を処理してアリールアジドを形成
させ、ついでこれを照射すると、隣接したヌクレオチド
間に共有結合を形成させることができる。
【００２５】第一および第二のヌクレオチド配列を標的
ヌクレオチド配列の非隣接部分にハイブリダイズさせる
場合、両配列の共有結合的付着を達成させる他の手段に
は、第一および第二のヌクレオチド配列の間に横たわる
標的ヌクレオチド配列の非隣接部分に十分相補性なヌク
レオチド配列の使用が包含される。このような目的の場
合、このヌクレオチド配列は介在リンカー配列と呼ばれ
る。このリンカー配列は、第一および第二ヌクレオチド
配列の間の標的配列にハイブリダイズすることができる
。リンカー配列はついで、上述したような酵素的または
化学的手段を用いて、第一および第二の両ヌクレオチド
配列に、共有結合的に付着させる。また、第一および第
二のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列に結合さ
せる場合、この両ヌクレオチド配列の間の隣接関係を達
成するため、複数のリンカー配列とポリメラーゼの組合
せを利用することも可能である。
ヌクレオチド配列の非隣接部分にハイブリダイズさせる
場合、両配列の共有結合的付着を達成させる他の手段に
は、第一および第二のヌクレオチド配列の間に横たわる
標的ヌクレオチド配列の非隣接部分に十分相補性なヌク
レオチド配列の使用が包含される。このような目的の場
合、このヌクレオチド配列は介在リンカー配列と呼ばれ
る。このリンカー配列は、第一および第二ヌクレオチド
配列の間の標的配列にハイブリダイズすることができる
。リンカー配列はついで、上述したような酵素的または
化学的手段を用いて、第一および第二の両ヌクレオチド
配列に、共有結合的に付着させる。また、第一および第
二のヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列に結合さ
せる場合、この両ヌクレオチド配列の間の隣接関係を達
成するため、複数のリンカー配列とポリメラーゼの組合
せを利用することも可能である。
【００２６】第一および第二のヌクレオチド配列を非隣
接関係において標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズ
させる場合、この両ヌクレオチド配列を共有結合で付着
させる他の手段には、Ｄｏｌｉｎｎａｙａら（Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６（９）：３７２１〜３９
３８，１９８８）によって記載されているような、第二
のヌクレオチド配列の連鎖延長、ついで両配列のカルボ
ジイミドカップリングによる方法が包含される。
接関係において標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズ
させる場合、この両ヌクレオチド配列を共有結合で付着
させる他の手段には、Ｄｏｌｉｎｎａｙａら（Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６（９）：３７２１〜３９
３８，１９８８）によって記載されているような、第二
のヌクレオチド配列の連鎖延長、ついで両配列のカルボ
ジイミドカップリングによる方法が包含される。
【００２７】「特異的ヌクレオチド配列」とは、第一お
よび第二のリガンドの部分に結合し、それを包含しても
よい、第一および第二のポリヌクレオチド配列の部分を
意味し、これらは、ヌクレオチド配列特異的結合蛋白質
に結合できるか、または相補性ポリヌクレオチド配列に
ハイブリダイズした場合にヌクレオチド配列特異的結合
蛋白質に結合可能となることができる。
よび第二のリガンドの部分に結合し、それを包含しても
よい、第一および第二のポリヌクレオチド配列の部分を
意味し、これらは、ヌクレオチド配列特異的結合蛋白質
に結合できるか、または相補性ポリヌクレオチド配列に
ハイブリダイズした場合にヌクレオチド配列特異的結合
蛋白質に結合可能となることができる。
【００２８】「ヌクレオチド配列特異的結合蛋白質（Ｎ
ＳＳＢＰ）」とは、特異的ヌクレオチド配列を認識し、
それに特異的に結合できる蛋白質を意味する。ＮＳＳＢ
Ｐと特異的ヌクレオチド配列の好ましい対は、たとえば
、テトラサイクリン（ｔｅｔ）リプレッサー、β−ガラ
クトシダーゼ（ｌａｃリプレッサー）、およびトリプト
ファン（ｔｒｐ）リプレッサー（それらのフラグメント
または誘導体を含む）と、それらの相当する二本鎖ＤＮ
Ａオペレーター配列のような、リプレッサーとオペレー
ターである。本発明に適当な他のリプレッサーには、Ｃ
Ｉ，ａｒａ Ｃ，ＭＭＴ／ＡＲＣおよびｌｅｘＡがあ
る。さらに、ラムダ特異的リプレッサー蛋白質、ＣＲＯ
，およびアクティベーターたとえば異化物質アクティベ
ーター蛋白質、ＣＡＰ使用できる。他の適当なＮＳＳＢ
ＰはポリペプチドフラグメントおよびＲＮＡポリメラー
ゼである。
ＳＳＢＰ）」とは、特異的ヌクレオチド配列を認識し、
それに特異的に結合できる蛋白質を意味する。ＮＳＳＢ
Ｐと特異的ヌクレオチド配列の好ましい対は、たとえば
、テトラサイクリン（ｔｅｔ）リプレッサー、β−ガラ
クトシダーゼ（ｌａｃリプレッサー）、およびトリプト
ファン（ｔｒｐ）リプレッサー（それらのフラグメント
または誘導体を含む）と、それらの相当する二本鎖ＤＮ
Ａオペレーター配列のような、リプレッサーとオペレー
ターである。本発明に適当な他のリプレッサーには、Ｃ
Ｉ，ａｒａ Ｃ，ＭＭＴ／ＡＲＣおよびｌｅｘＡがあ
る。さらに、ラムダ特異的リプレッサー蛋白質、ＣＲＯ
，およびアクティベーターたとえば異化物質アクティベ
ーター蛋白質、ＣＡＰ使用できる。他の適当なＮＳＳＢ
ＰはポリペプチドフラグメントおよびＲＮＡポリメラー
ゼである。
【００２９】「オペレーター」は、リプレッサー蛋白質
に結合する特異的ヌクレオチド配列を意味する。オペレ
ーターは一般に、酵素ならびに細胞代謝および細胞構造
に用いられる他の蛋白質をコードする構造遺伝子に隣接
して見出される。特定の細胞機能に関与し、遺伝子地図
上で一緒に群を形成する構造および調節遺伝子は、オペ
ロンと呼ばれる遺伝子の協調セットを構成する。転写に
対する制御は、酵素および代謝に必要な他の蛋白質をコ
ードする遺伝子に直接隣接するオペレーターと相互作用
するリプレッサー蛋白質に依存している。
に結合する特異的ヌクレオチド配列を意味する。オペレ
ーターは一般に、酵素ならびに細胞代謝および細胞構造
に用いられる他の蛋白質をコードする構造遺伝子に隣接
して見出される。特定の細胞機能に関与し、遺伝子地図
上で一緒に群を形成する構造および調節遺伝子は、オペ
ロンと呼ばれる遺伝子の協調セットを構成する。転写に
対する制御は、酵素および代謝に必要な他の蛋白質をコ
ードする遺伝子に直接隣接するオペレーターと相互作用
するリプレッサー蛋白質に依存している。
【００３０】「リプレッサー」はオペレーターと相互作
用し、それに結合している蛋白質を意味する。あるリプ
レッサーはそれ自身のオペレーターに特異的であり、別
のオペレーターは別のリプレッサーに結合している。オ
ペレーター−リプレッサー系の例には、ｌａｃ，ｔｒｐ
，ＣＡＯ，ｔｅｔ等が包含される。
用し、それに結合している蛋白質を意味する。あるリプ
レッサーはそれ自身のオペレーターに特異的であり、別
のオペレーターは別のリプレッサーに結合している。オ
ペレーター−リプレッサー系の例には、ｌａｃ，ｔｒｐ
，ＣＡＯ，ｔｅｔ等が包含される。
【００３１】「シグナル生成系」は１個または２個以上
の成分から構成され、少なくとも１個の成分は標識また
はレポーター基である。シグナル生成系は、サンプル中
の標的ポリヌクレオチドの存在または量に関連したシグ
ナルを発生する。シグナル生成系は、測定可能なシグナ
ルの生成に必要なすべての試薬を包含する。シグナル生
成系の作用は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存
在または量に関連した検知可能なシグナルを生成するこ
とである。
の成分から構成され、少なくとも１個の成分は標識また
はレポーター基である。シグナル生成系は、サンプル中
の標的ポリヌクレオチドの存在または量に関連したシグ
ナルを発生する。シグナル生成系は、測定可能なシグナ
ルの生成に必要なすべての試薬を包含する。シグナル生
成系の作用は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存
在または量に関連した検知可能なシグナルを生成するこ
とである。
【００３２】「非隣接結合」とは、第一または第二のリ
ガンドいずれかの３′末端塩基および上記リガンドの他
方の５′末端塩基が、標的ポリヌクレオチド配列の隣接
した塩基にはハイブリダイズしないように、第一および
第二のリガンドが標的ポリヌクレオチド配列にハイブリ
ダイズする結合を意味する。一般的には、標的ポリヌク
レオチド配列の第一および第二のリガンドは少なくとも
１個のヌクレオチドによって分離されている。
ガンドいずれかの３′末端塩基および上記リガンドの他
方の５′末端塩基が、標的ポリヌクレオチド配列の隣接
した塩基にはハイブリダイズしないように、第一および
第二のリガンドが標的ポリヌクレオチド配列にハイブリ
ダイズする結合を意味する。一般的には、標的ポリヌク
レオチド配列の第一および第二のリガンドは少なくとも
１個のヌクレオチドによって分離されている。
【００３３】「三リン酸ヌクレオシド」は、５′三リン
酸置換基を有するヌクレオシド、通常は三リン酸デオキ
シヌクレオシドを意味する。ヌクレオシドは、ペントー
ス糖の１′炭素にプリンまたはピリミジン由来の窒素塩
基が共有結合したペントース糖誘導体である。プリン塩
基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）およびそれら
の誘導体が含まれる。ピリミジン塩基には、シトシン（
Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、およびそれらの
類縁体が包含される。
酸置換基を有するヌクレオシド、通常は三リン酸デオキ
シヌクレオシドを意味する。ヌクレオシドは、ペントー
ス糖の１′炭素にプリンまたはピリミジン由来の窒素塩
基が共有結合したペントース糖誘導体である。プリン塩
基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）およびそれら
の誘導体が含まれる。ピリミジン塩基には、シトシン（
Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、およびそれらの
類縁体が包含される。
【００３４】「鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラー
ゼ」とは、一次ポリヌクレオチド配列または標的ポリヌ
クレオチド配列の延長を、適宜、一本鎖型のポリヌクレ
オチドに沿って形成するための触媒、通常は酵素を意味
する。この場合、延長は鋳型配列と相補性である。鋳型
依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼは、延長の形成ブ
ロックとして三リン酸ヌクレオシドを利用する。この延
長は５′から３′（鋳型では３′から５′）の方向へ延
長が終結するまで進行する。通常、触媒は、ＲＮＡポリ
メラーゼのような酵素、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ
、たとえば原核細胞ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉ，ＩＩまた
はＩＩＩ ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼ、クレノウフラグメント、逆転写酵素、ＲＮ
Ａレプリカーゼ等、任意の原料、たとえば細胞、大腸菌
のような細菌、植物、ウイルス、高温菌等に由来する酵
素である。
ゼ」とは、一次ポリヌクレオチド配列または標的ポリヌ
クレオチド配列の延長を、適宜、一本鎖型のポリヌクレ
オチドに沿って形成するための触媒、通常は酵素を意味
する。この場合、延長は鋳型配列と相補性である。鋳型
依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼは、延長の形成ブ
ロックとして三リン酸ヌクレオシドを利用する。この延
長は５′から３′（鋳型では３′から５′）の方向へ延
長が終結するまで進行する。通常、触媒は、ＲＮＡポリ
メラーゼのような酵素、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ
、たとえば原核細胞ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉ，ＩＩまた
はＩＩＩ ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼ、クレノウフラグメント、逆転写酵素、ＲＮ
Ａレプリカーゼ等、任意の原料、たとえば細胞、大腸菌
のような細菌、植物、ウイルス、高温菌等に由来する酵
素である。
【００３５】特定の実施態様
本発明の一実施態様は、２種のプローブポリヌクレオチ
ド配列が標的ポリヌクレオチド配列の存在の関数として
連結したかどうかを測定するための一般的方法である。 このような方法においては、第一のポリヌクレオチド配
列の部分が標的ポリヌクレオチド配列に対するリガンド
であり、第二のポリヌクレオチド配列の第二の部分が標
的ポリヌクレオチド配列の別の部分に対する別のリガン
ドである。さらに、第一および第二のポリヌクレオチド
配列はそれぞれ、異なる特異的ヌクレオチド配列を有す
る。通常、リガンド配列は一本鎖である。第一および第
二のポリヌクレオチド配列は、同じ標的ポリヌクレオチ
ド配列の異なる部分に結合して、ポリヌクレオチド配列
の結合対を形成する。結合は共有結合でも非共有結合で
もよい。共有結合は、２種のポリヌクレオチド配列をい
ずれも標的ポリヌクレオチドに結合させ、ついでこれら
のポリヌクレオチド配列を互いに標的依存性リゲーショ
ンを行うことによって達成できる。好ましくは、標的ポ
リヌクレオチドの第一および第二のリガンドは少なくと
もヌクレオチド１個だけ分離している。この実施態様に
おいて生成されるポリヌクレオチド配列の結合対の例を
、図１および図２に例示する。非共有結合による結合は
塩基の対合によって行われる。
ド配列が標的ポリヌクレオチド配列の存在の関数として
連結したかどうかを測定するための一般的方法である。 このような方法においては、第一のポリヌクレオチド配
列の部分が標的ポリヌクレオチド配列に対するリガンド
であり、第二のポリヌクレオチド配列の第二の部分が標
的ポリヌクレオチド配列の別の部分に対する別のリガン
ドである。さらに、第一および第二のポリヌクレオチド
配列はそれぞれ、異なる特異的ヌクレオチド配列を有す
る。通常、リガンド配列は一本鎖である。第一および第
二のポリヌクレオチド配列は、同じ標的ポリヌクレオチ
ド配列の異なる部分に結合して、ポリヌクレオチド配列
の結合対を形成する。結合は共有結合でも非共有結合で
もよい。共有結合は、２種のポリヌクレオチド配列をい
ずれも標的ポリヌクレオチドに結合させ、ついでこれら
のポリヌクレオチド配列を互いに標的依存性リゲーショ
ンを行うことによって達成できる。好ましくは、標的ポ
リヌクレオチドの第一および第二のリガンドは少なくと
もヌクレオチド１個だけ分離している。この実施態様に
おいて生成されるポリヌクレオチド配列の結合対の例を
、図１および図２に例示する。非共有結合による結合は
塩基の対合によって行われる。
【００３６】本発明の他の実施態様は、標的ポリヌクレ
オチド配列を検出する方法において、標的ポリヌクレオ
チド配列に応答してヌクレオチド配列の共有結合または
非共有結合による結合を形成させる方法である。この場
合、ヌクレオチド配列それぞれの部分について、ヌクレ
オチド配列特異的結合蛋白質（ＮＳＳＢＰ）が存在し、
ついでヌクレオチド配列の結合対に複合体化したＮＳＳ
ＢＰを検出する。ヌクレオチド配列の結合対は、標的ポ
リヌクレオチド配列の第一の部分とハイブリダイズ可能
な配列を有し、それに特異的ヌクレオチド配列にリゲー
トした第一のリガンドと、標的ポリヌクレオチド配列の
第一の部分以外の第二の部分とハイブリダイズ可能な配
列を有し、またそれに特異的ヌクレオチド配列がリゲー
トした第二のリガンドからなる。
オチド配列を検出する方法において、標的ポリヌクレオ
チド配列に応答してヌクレオチド配列の共有結合または
非共有結合による結合を形成させる方法である。この場
合、ヌクレオチド配列それぞれの部分について、ヌクレ
オチド配列特異的結合蛋白質（ＮＳＳＢＰ）が存在し、
ついでヌクレオチド配列の結合対に複合体化したＮＳＳ
ＢＰを検出する。ヌクレオチド配列の結合対は、標的ポ
リヌクレオチド配列の第一の部分とハイブリダイズ可能
な配列を有し、それに特異的ヌクレオチド配列にリゲー
トした第一のリガンドと、標的ポリヌクレオチド配列の
第一の部分以外の第二の部分とハイブリダイズ可能な配
列を有し、またそれに特異的ヌクレオチド配列がリゲー
トした第二のリガンドからなる。
【００３７】ＮＳＳＢＰと特異的ヌクレオチド配列の好
ましい対は、テトラサイクリン（ｔｅｔ）リプレッサー
、β−カラクトシダーゼ（ｌａｃリプレッサー）、およ
びトリプトファン（ｔｒｐ）リプレッサーとそれらの相
当する二本鎖ＤＮＡオペレーター配列のような、リプレ
ッサーとオペレーターである。さらに、ラムダ特異的リ
プレッサー蛋白質、ＣＲＯ、および異化物質アクティベ
ーター蛋白質、ＣＡＰも使用できる。また、制限酵素た
とえば制限エンドヌクレアーゼと、相当する制限部位が
、酵素のヌクレアーゼ活性が抑制される条件下に使用で
きる。また、特異的ヌクレオチド配列がオペレーターで
ある場合には、ヌクレオチド配列の結合対は、ヌクレオ
チド配列の結合対への２つのリプレッサーの同時結合に
よって検出できる。
ましい対は、テトラサイクリン（ｔｅｔ）リプレッサー
、β−カラクトシダーゼ（ｌａｃリプレッサー）、およ
びトリプトファン（ｔｒｐ）リプレッサーとそれらの相
当する二本鎖ＤＮＡオペレーター配列のような、リプレ
ッサーとオペレーターである。さらに、ラムダ特異的リ
プレッサー蛋白質、ＣＲＯ、および異化物質アクティベ
ーター蛋白質、ＣＡＰも使用できる。また、制限酵素た
とえば制限エンドヌクレアーゼと、相当する制限部位が
、酵素のヌクレアーゼ活性が抑制される条件下に使用で
きる。また、特異的ヌクレオチド配列がオペレーターで
ある場合には、ヌクレオチド配列の結合対は、ヌクレオ
チド配列の結合対への２つのリプレッサーの同時結合に
よって検出できる。
【００３８】好ましい実施態様においては、第一のリガ
ンドは少なくともｔｅｔオペレーターの部分に付着し、
第二のリガンドは少なくともｌａｃオペレーターの部分
に付着する。
ンドは少なくともｔｅｔオペレーターの部分に付着し、
第二のリガンドは少なくともｌａｃオペレーターの部分
に付着する。
【００３９】本発明の一態様においては、ポリヌクレオ
チド配列の結合対が存在する場合に、一方のＮＳＳＢＰ
は表面に結合するかまたは結合可能になり、他方のＮＳ
ＳＢＰは検出可能な事象を提供するように選ばれた標識
に結合するかまたは結合可能になる。たとえば各ＮＳＳ
ＢＰは別個の粒子のセットの表面上に存在し、２種の粒
子セットの自己凝集または非凝集以外の２種のセットの
共凝集が検出可能なシグナルを提供する。
チド配列の結合対が存在する場合に、一方のＮＳＳＢＰ
は表面に結合するかまたは結合可能になり、他方のＮＳ
ＳＢＰは検出可能な事象を提供するように選ばれた標識
に結合するかまたは結合可能になる。たとえば各ＮＳＳ
ＢＰは別個の粒子のセットの表面上に存在し、２種の粒
子セットの自己凝集または非凝集以外の２種のセットの
共凝集が検出可能なシグナルを提供する。
【００４０】本発明の他の態様においては、ポリヌクレ
オチド配列の結合対は、一方は各ＮＳＳＢＰに結合して
相互に影響し合う標識対、たとえば蛍光発光体もしくは
化学発光体およびエネルギー受容体；チャネリングが可
能な２種の酵素、すなわち一方の生成物が他の基質とし
て作用する酵素；酵素と微細なｐＨ変化と酵素活性への
影響が可能なポリ陽イオンまたはポリ陰イオン；粒子と
粒子の凝集を引き起こすことができるポリ陽イオンまた
は陰イオンによって検出できる。ＮＳＳＢＰへの標識の
結合は共有結合でも非共有結合でもよく、非共有結合の
場合には、リガンド−受容体結合対、たとえば抗体−抗
原、ビオチン−アビジン、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン等が包含される。
オチド配列の結合対は、一方は各ＮＳＳＢＰに結合して
相互に影響し合う標識対、たとえば蛍光発光体もしくは
化学発光体およびエネルギー受容体；チャネリングが可
能な２種の酵素、すなわち一方の生成物が他の基質とし
て作用する酵素；酵素と微細なｐＨ変化と酵素活性への
影響が可能なポリ陽イオンまたはポリ陰イオン；粒子と
粒子の凝集を引き起こすことができるポリ陽イオンまた
は陰イオンによって検出できる。ＮＳＳＢＰへの標識の
結合は共有結合でも非共有結合でもよく、非共有結合の
場合には、リガンド−受容体結合対、たとえば抗体−抗
原、ビオチン−アビジン、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン等が包含される。
【００４１】本発明の他の適用においては（図３）、特
異的ヌクレオチド配列へのＮＳＳＢＰの結合はその配列
が二本鎖である場合にのみ起こる。第一および第二のポ
リヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオチド配列を結合
することができる。第一のポリヌクレオチド配列は一本
鎖であり、第一の特異的ヌクレオチド配列の３′末端に
結合し、標的ポリヌクレオチド配列の３′末端とハイブ
リダイズできる第一のリガンドから構成される。少なく
とも第一のポリヌクレオチド配列の標的配列へのハイブ
リダイゼーションが起こった後に、ポリヌクレオチド依
存性ヌクレオチドポリメラーゼと三リン酸ヌクレオシド
を加えて、第一のポリヌクレオチド配列に沿って標的配
列の連鎖延長を起こさせ、二本鎖の特異的ヌクレオチド
配列を形成させる。第二のポリヌクレオチド配列は、そ
れ以前にハイブリダイゼーションが行われていなければ
、ついで標的配列とハイブリダイズさせ、ポリヌクレオ
チド配列の結合対を形成させる。結合対中の特異的ヌク
レオチド配列を特異的に結合できるＮＳＳＢＰを次に加
え、結合対への同時結合の検出を上述のようにして実施
する。
異的ヌクレオチド配列へのＮＳＳＢＰの結合はその配列
が二本鎖である場合にのみ起こる。第一および第二のポ
リヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオチド配列を結合
することができる。第一のポリヌクレオチド配列は一本
鎖であり、第一の特異的ヌクレオチド配列の３′末端に
結合し、標的ポリヌクレオチド配列の３′末端とハイブ
リダイズできる第一のリガンドから構成される。少なく
とも第一のポリヌクレオチド配列の標的配列へのハイブ
リダイゼーションが起こった後に、ポリヌクレオチド依
存性ヌクレオチドポリメラーゼと三リン酸ヌクレオシド
を加えて、第一のポリヌクレオチド配列に沿って標的配
列の連鎖延長を起こさせ、二本鎖の特異的ヌクレオチド
配列を形成させる。第二のポリヌクレオチド配列は、そ
れ以前にハイブリダイゼーションが行われていなければ
、ついで標的配列とハイブリダイズさせ、ポリヌクレオ
チド配列の結合対を形成させる。結合対中の特異的ヌク
レオチド配列を特異的に結合できるＮＳＳＢＰを次に加
え、結合対への同時結合の検出を上述のようにして実施
する。
【００４２】一般的には、液体メジウム中に、標的ポリ
ヌクレオチド配列の含有が疑われるサンプル、標的ポリ
ヌクレオチド配列の第一の部分と相補性の第一のポリヌ
クレオチド配列、標的ポリヌクレオチド配列の第一の部
分以外の部分に相補性の第二のポリヌクレオチド配列、
ならびに第一および第二の配列を標的ポリヌクレオチド
配列とハイブリダイズさせるための手段からなる混合物
を準備する。
ヌクレオチド配列の含有が疑われるサンプル、標的ポリ
ヌクレオチド配列の第一の部分と相補性の第一のポリヌ
クレオチド配列、標的ポリヌクレオチド配列の第一の部
分以外の部分に相補性の第二のポリヌクレオチド配列、
ならびに第一および第二の配列を標的ポリヌクレオチド
配列とハイブリダイズさせるための手段からなる混合物
を準備する。
【００４３】混合物を形成させるための各種試薬の混合
順序には変えてもよく、同時にまたは全体もしくは一部
を順次混合することができる。一般的には、標的ポリヌ
クレオチド配列を含有するサンプルが得られる。これを
、予め調製した第一および第二のヌクレオチド配列、三
リン酸ヌクレオシド、ならびにポリヌクレオチドポリメ
ラーゼの混合物と混合してもよい。これらの添加の後、
リガーゼまたはリゲーションを生じる他の手段を任意に
使用することができる。上記の同時添加、ならびに他の
段階的または連続的順序での添加が採用できる。試薬の
濃度および添加順序ならびにこの方法の条件は、一般的
には、標的ヌクレオチド配列とすべての第一および第二
のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションの所望の
至適化によって支配される。
順序には変えてもよく、同時にまたは全体もしくは一部
を順次混合することができる。一般的には、標的ポリヌ
クレオチド配列を含有するサンプルが得られる。これを
、予め調製した第一および第二のヌクレオチド配列、三
リン酸ヌクレオシド、ならびにポリヌクレオチドポリメ
ラーゼの混合物と混合してもよい。これらの添加の後、
リガーゼまたはリゲーションを生じる他の手段を任意に
使用することができる。上記の同時添加、ならびに他の
段階的または連続的順序での添加が採用できる。試薬の
濃度および添加順序ならびにこの方法の条件は、一般的
には、標的ヌクレオチド配列とすべての第一および第二
のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションの所望の
至適化によって支配される。
【００４４】本発明の方法の実施には、水性メジウムが
採用される。メジウムのｐＨは通常約４．５〜９．５の
範囲、より通常には約５．５〜８．５の範囲、好ましく
は約６〜８の範囲とされる。ｐＨおよび温度は適宜、標
的配列の第一および第二ポリヌクレオチド配列との同時
もしくは連続的ハイブリダイゼーション、または標的ポ
リヌクレオチド配列に沿った第一および第二のポリヌク
レオチド配列の延長が起こるように選択され、変動させ
る。所望のｐＨを達成し、また測定時にそのｐＨを維持
するためには、様々な緩衝液が使用できる。緩衝液の例
には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、Ｔｒｉｓ、バルビ
タール等がある。本発明に使用される緩衝液にはとくに
制限はないが、それぞれの方法ではある緩衝液が他に比
べて好ましいということはある。
採用される。メジウムのｐＨは通常約４．５〜９．５の
範囲、より通常には約５．５〜８．５の範囲、好ましく
は約６〜８の範囲とされる。ｐＨおよび温度は適宜、標
的配列の第一および第二ポリヌクレオチド配列との同時
もしくは連続的ハイブリダイゼーション、または標的ポ
リヌクレオチド配列に沿った第一および第二のポリヌク
レオチド配列の延長が起こるように選択され、変動させ
る。所望のｐＨを達成し、また測定時にそのｐＨを維持
するためには、様々な緩衝液が使用できる。緩衝液の例
には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、Ｔｒｉｓ、バルビ
タール等がある。本発明に使用される緩衝液にはとくに
制限はないが、それぞれの方法ではある緩衝液が他に比
べて好ましいということはある。
【００４５】本発明の方法を実施するには、中等度の温
度が通常使用され、この方法の実施期間中一定の温度に
維持することが望ましい。この方法のための温度は、一
般的には約２０〜９０℃、さらに通常には約３０〜７０
℃、好ましくは３７〜５０℃である。しかしながら、温
度は、上記工程が連続的にまたは同時に行われるかによ
って変動できる。たとえば、連鎖延長工程には、約２０
〜４０℃の比較的低温度が用いられ、一方、変性および
ハイブリダイゼーションは約４０〜８０℃の温度で実施
できる。
度が通常使用され、この方法の実施期間中一定の温度に
維持することが望ましい。この方法のための温度は、一
般的には約２０〜９０℃、さらに通常には約３０〜７０
℃、好ましくは３７〜５０℃である。しかしながら、温
度は、上記工程が連続的にまたは同時に行われるかによ
って変動できる。たとえば、連鎖延長工程には、約２０
〜４０℃の比較的低温度が用いられ、一方、変性および
ハイブリダイゼーションは約４０〜８０℃の温度で実施
できる。
【００４６】本発明の方法を実施するための時間は、一
般的には、第一と第二の配列を標的ポリヌクレオチド配
列に付着させ、このような付着が起こったかどうかを測
定する場合、これらの配列の間に付着が起こるのに十分
な長さである。一般的には、この方法の実施のための時
間は、約５〜２００分である。便宜上は、この時間を最
小限にすることが、通常望ましい。
般的には、第一と第二の配列を標的ポリヌクレオチド配
列に付着させ、このような付着が起こったかどうかを測
定する場合、これらの配列の間に付着が起こるのに十分
な長さである。一般的には、この方法の実施のための時
間は、約５〜２００分である。便宜上は、この時間を最
小限にすることが、通常望ましい。
【００４７】測定すべき標的ポリヌクレオチド配列の濃
度は、サンプル中１０−２１ Ｍのような低濃度でもよ
いが、一般的には約１０−１４Ｍ〜１０−１９ Ｍ、よ
り通常では約１０−１６ 〜１０−１９ Ｍの範囲であ
る。メジウム中の第一および第二ポリヌクレオチド配列
ならびに三リン酸デオキシヌクレオシドの濃度は広範囲
に変動させることができる。これらの試薬は、期待され
る標的ポリヌクレオチド配列の量に対して大モル過剰存
在させることが好ましい。三リン酸デオキシヌクレオシ
ドは、通常、１０−６〜１０−２Ｍ、好ましくは１０−
５〜１０−３Ｍ存在させる。第二のポリヌクレオチド配
列は、第一のポリヌクレオチド配列と同様、通常は少な
くとも１０−１２ Ｍ、好ましくは１０−１０ Ｍ、さ
らに好ましくは少なくとも約１０−８Ｍ存在させる。
度は、サンプル中１０−２１ Ｍのような低濃度でもよ
いが、一般的には約１０−１４Ｍ〜１０−１９ Ｍ、よ
り通常では約１０−１６ 〜１０−１９ Ｍの範囲であ
る。メジウム中の第一および第二ポリヌクレオチド配列
ならびに三リン酸デオキシヌクレオシドの濃度は広範囲
に変動させることができる。これらの試薬は、期待され
る標的ポリヌクレオチド配列の量に対して大モル過剰存
在させることが好ましい。三リン酸デオキシヌクレオシ
ドは、通常、１０−６〜１０−２Ｍ、好ましくは１０−
５〜１０−３Ｍ存在させる。第二のポリヌクレオチド配
列は、第一のポリヌクレオチド配列と同様、通常は少な
くとも１０−１２ Ｍ、好ましくは１０−１０ Ｍ、さ
らに好ましくは少なくとも約１０−８Ｍ存在させる。
【００４８】メジウム中のポリメラーゼおよび補因子の
濃度もかなり変動させることができる。これらの試薬は
１０−１２ Ｍ程度の低濃度でもよいが、第一および第
二のポリヌクレオチド配列の濃度と少なくとも同程度ま
たはそれ以上の濃度存在させる。第一の制限因子は試薬
、通常は酵素の価格である。各試薬の最終濃度は、速度
および感度の両者に関して本発明の方法を至適化できる
ように、通常、経験的に決定される。
濃度もかなり変動させることができる。これらの試薬は
１０−１２ Ｍ程度の低濃度でもよいが、第一および第
二のポリヌクレオチド配列の濃度と少なくとも同程度ま
たはそれ以上の濃度存在させる。第一の制限因子は試薬
、通常は酵素の価格である。各試薬の最終濃度は、速度
および感度の両者に関して本発明の方法を至適化できる
ように、通常、経験的に決定される。
【００４９】標的仲介リゲーションおよび単一プライマ
ー増幅と一緒に使用する場合には、本発明の方法は、均
一ＤＮＡ検定操作を提供する。一般的には、検定操作は
、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルを、プロー
ブの標的との複合体形成が起こる条件下に一緒に混合す
ることからなる。結合標的へのプローブの連結がおこる
ようにリガーゼを加える。三リン酸ヌクレオシドは、そ
の３′末端に相補性配列を含有するプライマーおよびヌ
クレオチドポリメラーゼと一緒に加える。条件は、それ
ぞれ５′および３′末端で結合した第一および第二のリ
ガンドからなるリゲート配列の増幅が起こるように設定
する（たとえば、先に引用したＥＰ公告第３５７，３３
６号参照）。
ー増幅と一緒に使用する場合には、本発明の方法は、均
一ＤＮＡ検定操作を提供する。一般的には、検定操作は
、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルを、プロー
ブの標的との複合体形成が起こる条件下に一緒に混合す
ることからなる。結合標的へのプローブの連結がおこる
ようにリガーゼを加える。三リン酸ヌクレオシドは、そ
の３′末端に相補性配列を含有するプライマーおよびヌ
クレオチドポリメラーゼと一緒に加える。条件は、それ
ぞれ５′および３′末端で結合した第一および第二のリ
ガンドからなるリゲート配列の増幅が起こるように設定
する（たとえば、先に引用したＥＰ公告第３５７，３３
６号参照）。
【００５０】本発明の一応用においては、通常は相補性
配列と複合体を形成させた場合に、第一のリガンドおよ
び第二のリガンドに結合可能なタンパク受容体を混合し
、この場合、第一および第二のリガンドは、均一検出を
可能にする任意の上述の方法、たとえば蛍光ビーズ、炭
素粒子、チャネル可能な酵素等によって標識される。
配列と複合体を形成させた場合に、第一のリガンドおよ
び第二のリガンドに結合可能なタンパク受容体を混合し
、この場合、第一および第二のリガンドは、均一検出を
可能にする任意の上述の方法、たとえば蛍光ビーズ、炭
素粒子、チャネル可能な酵素等によって標識される。
【００５１】第一および第二の特異的ヌクレオチド配列
への結合に関連したシグナルは、検定メジウムから分離
することなく検出される。シグナルの検出は、使用され
たシグナル生成系の性質に依存する。たとえば、標識は
、酵素、触媒、蛍光発光基、化学発光基、電子活性リポ
ーター基、光吸収染料、金属クラスター、２０〜１００
０ｎｍ粒子または核酸配列からなる群より選択できる。
への結合に関連したシグナルは、検定メジウムから分離
することなく検出される。シグナルの検出は、使用され
たシグナル生成系の性質に依存する。たとえば、標識は
、酵素、触媒、蛍光発光基、化学発光基、電子活性リポ
ーター基、光吸収染料、金属クラスター、２０〜１００
０ｎｍ粒子または核酸配列からなる群より選択できる。
【００５２】標識またはリポーター基が酵素の場合には
、付加的なシグナル生成メンバーには酵素基質等が包含
される。酵素反応の生成物は、分光測光法で検出できる
酵素であることが好ましい。標識が蛍光分子である場合
には、メジウムを照射し、蛍光を測定することができる
。標識が放射活性基である場合は、メジウムをカウント
して放射能カウントを測定することができる。標識はま
た、電磁放射線によって検出することもできる。
、付加的なシグナル生成メンバーには酵素基質等が包含
される。酵素反応の生成物は、分光測光法で検出できる
酵素であることが好ましい。標識が蛍光分子である場合
には、メジウムを照射し、蛍光を測定することができる
。標識が放射活性基である場合は、メジウムをカウント
して放射能カウントを測定することができる。標識はま
た、電磁放射線によって検出することもできる。
【００５３】本発明の他の態様は、それぞれのヌクレオ
チド配列特異的結合蛋白質（ＮＳＳＢＰ）に結合した各
特異的ヌクレオチド配列に結合している標的ポリヌクレ
オチドからなる組成物を提供する。この場合、ＮＳＳＢ
Ｐの一方は表面に結合しているかまたは表面に結合可能
であり、他方のＮＳＳＢＰは標識に結合しているかまた
は標識に結合可能である。このような組成物では、特異
的ヌクレオチド配列は互いに共有結合で結合していても
よく、また好ましくは、特異的ヌクレオチド配列は二本
鎖である。このような組成物に適当な標識は上に定義し
た通りである。
チド配列特異的結合蛋白質（ＮＳＳＢＰ）に結合した各
特異的ヌクレオチド配列に結合している標的ポリヌクレ
オチドからなる組成物を提供する。この場合、ＮＳＳＢ
Ｐの一方は表面に結合しているかまたは表面に結合可能
であり、他方のＮＳＳＢＰは標識に結合しているかまた
は標識に結合可能である。このような組成物では、特異
的ヌクレオチド配列は互いに共有結合で結合していても
よく、また好ましくは、特異的ヌクレオチド配列は二本
鎖である。このような組成物に適当な標識は上に定義し
た通りである。
【００５４】本発明に使用される試薬は、サンプル中に
存在する標的ポリヌクレオチド配列を検定する本発明の
方法に使用するため、予め定められた量を組合せて包装
したキットとして提供することができる。たとえば、こ
の方法に有用なキットは、他の試薬、第一および第二の
ポリヌクレオチド配列、ならびに相当するヌクレオチド
配列特異的結合蛋白質を一緒に包装した組合せとするこ
とができる。キットにはさらに包装した組合せとして、
三リン酸デオキシヌクレオシドのような三リン酸ヌクレ
オシド、たとえば三リン酸デオキシアデノシン（ｄＡＴ
Ｐ）、三リン酸デオキシグアノシン（ｄＧＴＰ）、三リ
ン酸デオキシシチジン（ｄＣＴＰ）および三リン酸デオ
キシチミジン（ｄＴＴＰ）、ならびにその相当する誘導
体を包含させることができる。キットにはさらに、ポリ
ヌクレオチドポリメラーゼ、また第一および第二の配列
を共有結合的に付着させる手段たとえばリガーゼを包含
させることができる。
存在する標的ポリヌクレオチド配列を検定する本発明の
方法に使用するため、予め定められた量を組合せて包装
したキットとして提供することができる。たとえば、こ
の方法に有用なキットは、他の試薬、第一および第二の
ポリヌクレオチド配列、ならびに相当するヌクレオチド
配列特異的結合蛋白質を一緒に包装した組合せとするこ
とができる。キットにはさらに包装した組合せとして、
三リン酸デオキシヌクレオシドのような三リン酸ヌクレ
オシド、たとえば三リン酸デオキシアデノシン（ｄＡＴ
Ｐ）、三リン酸デオキシグアノシン（ｄＧＴＰ）、三リ
ン酸デオキシシチジン（ｄＣＴＰ）および三リン酸デオ
キシチミジン（ｄＴＴＰ）、ならびにその相当する誘導
体を包含させることができる。キットにはさらに、ポリ
ヌクレオチドポリメラーゼ、また第一および第二の配列
を共有結合的に付着させる手段たとえばリガーゼを包含
させることができる。
【００５５】キット中の各種試薬の相対量は、本方法の
実施時に起こる必要がある反応を実質的に至適化し、さ
らに検定の感度を実質的に至適化する試薬濃度を与える
ように広範囲に変動させることができる。適当な環境下
で、キット中の試薬の１種または２種以上は、賦形剤を
含み、通常は凍結乾燥した、粉末として提供することが
できる。これを溶解すると、本発明による方法または検
定の実施に適当な濃度を有する試薬溶液が得られる。各
試薬は別個の容器に充填することもできるし、また、一
部の試薬は、反応性と貯蔵寿命が許す限り、１つの容器
中に混合することもできる。
実施時に起こる必要がある反応を実質的に至適化し、さ
らに検定の感度を実質的に至適化する試薬濃度を与える
ように広範囲に変動させることができる。適当な環境下
で、キット中の試薬の１種または２種以上は、賦形剤を
含み、通常は凍結乾燥した、粉末として提供することが
できる。これを溶解すると、本発明による方法または検
定の実施に適当な濃度を有する試薬溶液が得られる。各
試薬は別個の容器に充填することもできるし、また、一
部の試薬は、反応性と貯蔵寿命が許す限り、１つの容器
中に混合することもできる。
【００５６】本発明の検定は、興味あるサンプルの部分
である特異的標的ポリヌクレオチド配列の検出に使用す
ることができる。興味あるサンプルは、標的ポリヌクレ
オチドが一本鎖である場合にはそのまま使用できるし、
また二本鎖標的配列を処理して変性させても、所望によ
り標的配列を切断して、標的ポリヌクレオチド配列を含
有するフラグメントとすることもできる。サンプルは既
知の方法で、たとえば制限エンドヌクレアーゼ処理によ
り、または他の特定部位の化学的もしくは酵素的切断法
によって切断することができる。
である特異的標的ポリヌクレオチド配列の検出に使用す
ることができる。興味あるサンプルは、標的ポリヌクレ
オチドが一本鎖である場合にはそのまま使用できるし、
また二本鎖標的配列を処理して変性させても、所望によ
り標的配列を切断して、標的ポリヌクレオチド配列を含
有するフラグメントとすることもできる。サンプルは既
知の方法で、たとえば制限エンドヌクレアーゼ処理によ
り、または他の特定部位の化学的もしくは酵素的切断法
によって切断することができる。
【００５７】標的ポリヌクレオチド配列は、たとえば、
任意の起源からの核酸の部分からなるものである。これ
らには、精製型または非精製型のＤＮＡ（ｄｓＤＮＡお
よびｓｓＤＮＡ）およびＲＮＡ、たとえばｔ−ＲＮＡ，
ｍ−ＲＮＡ，ｒ−ＲＮＡ，ミトコンドリアＤＮＡおよび
ＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡおよびＲＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリッド、またはそれらの混合物、遺伝子、染色体、
プラスミド、生物学的材料たとえば細菌、酵母、ウイル
ス、ウイロイド、カビ、真菌のような微生物、植物、動
物、ヒトのゲノム、およびそれらのフラグメント等が包
含される。標的ポリヌクレオチド配列は、生物学的サン
プルのような複雑な混合物の微小分画にすぎなくてもよ
い。標的ポリヌクレオチド配列は、様々な生物学的材料
から、本技術分野においてよく知られた操作によって得
ることができる。このような生物学的材料の一部の例を
以下の表１に例示するが、これらに限定されるものでは
ない。
任意の起源からの核酸の部分からなるものである。これ
らには、精製型または非精製型のＤＮＡ（ｄｓＤＮＡお
よびｓｓＤＮＡ）およびＲＮＡ、たとえばｔ−ＲＮＡ，
ｍ−ＲＮＡ，ｒ−ＲＮＡ，ミトコンドリアＤＮＡおよび
ＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡおよびＲＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリッド、またはそれらの混合物、遺伝子、染色体、
プラスミド、生物学的材料たとえば細菌、酵母、ウイル
ス、ウイロイド、カビ、真菌のような微生物、植物、動
物、ヒトのゲノム、およびそれらのフラグメント等が包
含される。標的ポリヌクレオチド配列は、生物学的サン
プルのような複雑な混合物の微小分画にすぎなくてもよ
い。標的ポリヌクレオチド配列は、様々な生物学的材料
から、本技術分野においてよく知られた操作によって得
ることができる。このような生物学的材料の一部の例を
以下の表１に例示するが、これらに限定されるものでは
ない。
【表１】 包含される興味ある微生物 コリネバク
テリウム Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉ
ａ（ジフテリア菌） ニューモカッカス Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（肺炎
球菌） ストレプトコッカス Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｓＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｕｓスタフ
ィロコッカス Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色
ブドウ球菌） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓナイセリ
ア Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄
膜炎菌） Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ（淋菌）腸
内細菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）腸内バ
クテリア Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓＫｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＳａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｔｙｐｈｏｓａ サルモネラ属Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓＳａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＳｈｉｇｅｌｌａ
ｅ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ シゲラ属Ｓｈｉｇｅｌ
ｌａｅ ｓｃｈｍｉｔｚｉｉＳｈｉｇｅｌｌａｅ
ａｒａｂｉｎｏｔａｒｄａＳｈｉｇｅｌｌａｅ ｆｌ
ｅｘｎｅｒｉＳｈｉｇｅｌｌａｅ ｂｏｙｄｉｉ Ｓｈｉｇｅｌｌａｅ ｓｏｎｎｅｉ 他の腸内菌 Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ プロテウス種
Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓＰｒｏｔｅｕｓ
ｍｏｒｇａｎｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＡｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓＶｉｂｒｉｏ
ｃｈｏｌｅｒａｅ ヘモフィルス−ボルデテラ群 Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｈ．ｄ
ｕｃｒｙｉ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓＨｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｃｕｓＨｅｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓＰｈｙｃｏｍｙｃｅ
ｔｅｓ パスツレラ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｅｓｔｉｓＰａｓｔｅｕ
ｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｕｓｉｓブルセラ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＢｒｕｃｅ
ｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ 好気性胞子形成バチルス Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕｍＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ 嫌気性胞子形成バチルス Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍＣｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉＣｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｎｏｖｙｉＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｅｐｔ
ｉｃｕｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔ
ｉｃｕｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍＣ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓＣ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓマイコ
バクテリウム Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓＭｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｌｅｐｒａｅＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ アクチノミセス（真菌様細菌） Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓａｅｌｉＡｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｓ ｂｏｖｉｓＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ
ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒ
ｏｉｄｅｓＮｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓ
ｉｓスピロヘータ類 Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍＴｒｅｐｏｎ
ｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅＳｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍ
ｉｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｏｉｌｉｆ
ｏｒｍｉｓ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｕｍＢｏｒｒｅｌ
ｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｓＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ
ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａトリパノゾ
ーマ マイコプラズマ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅその他
の病原体 東部ウマ脳炎ウイルス Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ西部
ウマ脳炎ウイルス Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔ
ｈｉａｅ シンドビスウイルス Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏ
ｒｍｉｓ チクングニヤウイルス Ｄｏｎｖａｎｉａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓセムリ
キ森林熱ウイルス Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ
マヤロウイルス Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕａＲｈｉｚｏｐｕ
ｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓＳｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｓｃｈｅｎｋｉｉＦｌｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒ
ｏｓｏｉＦｏｎｓｅｃａｅａ ｃｏｍｐａｃｔＦｏｎ
ｓｅｃａｅａ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓＣｌａｄｏｓｐ
ｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉＰｈｉａｌｏｐｈｏｒ
ａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓＭａｄｕｒｅｌｌａ ｍｙｃｅｔｏ
ｍｉＭａｄｕｒｅｌｌａ ｇｒｉｓｅａ Ａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉＰｈｉａｌｏ
ｐｈｏｒａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉＭｉｃｒｏｓｐｏ
ｒｕｍ ｇｙｐｓｕｍＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ
ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ Ｋｅｒａｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｊｅｌｌｏｉＭｉｃ
ｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔ
ｏｎ ｒｕｂｒｕｍＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｄ
ｏｕｉｎｉウイルス アデノウイルス ヘルペスウイルス 単純ヘルペスウイルス 水痘ウイルス 帯状疱疹ウイルス ウイルスＢ サイトメガロウイルス ポックスウイルス 痘瘡ウイルス ワクシニアウイルス ウシポックスウイルス パラワクシニアウイルス 伝染性軟属腫ウイルス ピコルナウイルス ポリオウイルス コクサッキーウイルス エコーウイルス リノウイルス ミクソウイルス インフルエンザ（Ａ，ＢおよびＣ）ウイルスパラインフ
ルエンザ（１〜４）ウイルスムンプスウイルス ニューカッスル病ウイルス 麻疹ウイルス 牛疫ウイルス イヌジステンバーウイルス 呼吸器合胞体ウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス リケッチア（細菌様寄生体） セントルイス脳炎ウイルス 発疹チフスリケッチア カリホルニア脳炎ウイルス メキシコチフスリケッチア コロラドダニ熱ウイルス ロッキー山紅斑熱リケッチア 黄熱ウイルス ブートン熱リケッチア デング熱ウイルス オーストラリアダニチフスリケッチア レオウイルス 北アジアダニチフスリケッチア レオウイルス１〜３型 リケッチア痘リケッチア ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ） ツツガ虫病リケッチア ヒトＴ細胞リンパ球ウイルスＩおよびＩＩ型（ＨＴＬＶ
）Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｂｕｒｎｅｔｔｉＲｉｃｋ
ｅｔｔｓｉａ ｑｕｉｎｔａｎａレトロウイルス 肝炎 Ａ型肝炎ウイルス Ｂ型肝炎ウイルス 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス クラミジア（分類不能寄生体、細菌／ウイルス）Ｃｈｌ
ａｍｙｄｉａ ａｇｅｎｔｓ（名称不確定）腫瘍ウイ
ルス 真菌 ラウシャー白血病ウイルス Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓグ
ロスウイルス Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓマロ
ネー白血病ウイルス Ｈｉｓｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍＣｏｃ
ｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓヒトパピローマ
ウイルス Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉ
ｅｎｓｉｓ Ｃａｎａｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓＭｕｃ
ｏｒ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃ
ｏｒｙｍｂｉｆ ｅｒａ）
テリウム Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉ
ａ（ジフテリア菌） ニューモカッカス Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（肺炎
球菌） ストレプトコッカス Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｓＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｕｓスタフ
ィロコッカス Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色
ブドウ球菌） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓナイセリ
ア Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄
膜炎菌） Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ（淋菌）腸
内細菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）腸内バ
クテリア Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓＫｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＳａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ ｔｙｐｈｏｓａ サルモネラ属Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓＳａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＳｈｉｇｅｌｌａ
ｅ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ シゲラ属Ｓｈｉｇｅｌ
ｌａｅ ｓｃｈｍｉｔｚｉｉＳｈｉｇｅｌｌａｅ
ａｒａｂｉｎｏｔａｒｄａＳｈｉｇｅｌｌａｅ ｆｌ
ｅｘｎｅｒｉＳｈｉｇｅｌｌａｅ ｂｏｙｄｉｉ Ｓｈｉｇｅｌｌａｅ ｓｏｎｎｅｉ 他の腸内菌 Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ プロテウス種
Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓＰｒｏｔｅｕｓ
ｍｏｒｇａｎｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＡｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓＶｉｂｒｉｏ
ｃｈｏｌｅｒａｅ ヘモフィルス−ボルデテラ群 Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｈ．ｄ
ｕｃｒｙｉ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓＨｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｃｕｓＨｅｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓＰｈｙｃｏｍｙｃｅ
ｔｅｓ パスツレラ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｅｓｔｉｓＰａｓｔｅｕ
ｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｕｓｉｓブルセラ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＢｒｕｃｅ
ｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ 好気性胞子形成バチルス Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇ
ａｔｅｒｉｕｍＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ 嫌気性胞子形成バチルス Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍＣｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉＣｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｎｏｖｙｉＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｅｐｔ
ｉｃｕｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔ
ｉｃｕｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍＣ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓＣ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓマイコ
バクテリウム Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓＭｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｌｅｐｒａｅＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ アクチノミセス（真菌様細菌） Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓａｅｌｉＡｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｓ ｂｏｖｉｓＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ
ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉＮｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒ
ｏｉｄｅｓＮｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓ
ｉｓスピロヘータ類 Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍＴｒｅｐｏｎ
ｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅＳｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍ
ｉｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｏｉｌｉｆ
ｏｒｍｉｓ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｕｍＢｏｒｒｅｌ
ｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｓＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ
ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａトリパノゾ
ーマ マイコプラズマ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅその他
の病原体 東部ウマ脳炎ウイルス Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ西部
ウマ脳炎ウイルス Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔ
ｈｉａｅ シンドビスウイルス Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏ
ｒｍｉｓ チクングニヤウイルス Ｄｏｎｖａｎｉａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓセムリ
キ森林熱ウイルス Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ
マヤロウイルス Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕａＲｈｉｚｏｐｕ
ｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓＳｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｓｃｈｅｎｋｉｉＦｌｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒ
ｏｓｏｉＦｏｎｓｅｃａｅａ ｃｏｍｐａｃｔＦｏｎ
ｓｅｃａｅａ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓＣｌａｄｏｓｐ
ｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉＰｈｉａｌｏｐｈｏｒ
ａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓＭａｄｕｒｅｌｌａ ｍｙｃｅｔｏ
ｍｉＭａｄｕｒｅｌｌａ ｇｒｉｓｅａ Ａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉＰｈｉａｌｏ
ｐｈｏｒａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉＭｉｃｒｏｓｐｏ
ｒｕｍ ｇｙｐｓｕｍＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ
ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ Ｋｅｒａｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｊｅｌｌｏｉＭｉｃ
ｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔ
ｏｎ ｒｕｂｒｕｍＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｄ
ｏｕｉｎｉウイルス アデノウイルス ヘルペスウイルス 単純ヘルペスウイルス 水痘ウイルス 帯状疱疹ウイルス ウイルスＢ サイトメガロウイルス ポックスウイルス 痘瘡ウイルス ワクシニアウイルス ウシポックスウイルス パラワクシニアウイルス 伝染性軟属腫ウイルス ピコルナウイルス ポリオウイルス コクサッキーウイルス エコーウイルス リノウイルス ミクソウイルス インフルエンザ（Ａ，ＢおよびＣ）ウイルスパラインフ
ルエンザ（１〜４）ウイルスムンプスウイルス ニューカッスル病ウイルス 麻疹ウイルス 牛疫ウイルス イヌジステンバーウイルス 呼吸器合胞体ウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス リケッチア（細菌様寄生体） セントルイス脳炎ウイルス 発疹チフスリケッチア カリホルニア脳炎ウイルス メキシコチフスリケッチア コロラドダニ熱ウイルス ロッキー山紅斑熱リケッチア 黄熱ウイルス ブートン熱リケッチア デング熱ウイルス オーストラリアダニチフスリケッチア レオウイルス 北アジアダニチフスリケッチア レオウイルス１〜３型 リケッチア痘リケッチア ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ） ツツガ虫病リケッチア ヒトＴ細胞リンパ球ウイルスＩおよびＩＩ型（ＨＴＬＶ
）Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｂｕｒｎｅｔｔｉＲｉｃｋ
ｅｔｔｓｉａ ｑｕｉｎｔａｎａレトロウイルス 肝炎 Ａ型肝炎ウイルス Ｂ型肝炎ウイルス 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス クラミジア（分類不能寄生体、細菌／ウイルス）Ｃｈｌ
ａｍｙｄｉａ ａｇｅｎｔｓ（名称不確定）腫瘍ウイ
ルス 真菌 ラウシャー白血病ウイルス Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓグ
ロスウイルス Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓマロ
ネー白血病ウイルス Ｈｉｓｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍＣｏｃ
ｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓヒトパピローマ
ウイルス Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉ
ｅｎｓｉｓ Ｃａｎａｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓＭｕｃ
ｏｒ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃ
ｏｒｙｍｂｉｆ ｅｒａ）
【００５８】本発明による二重受容体ポリヌクレオチド
検定法は、簡単で回りくどくなく、診断的試験系に容易
に適用できる検定法を提供するものである。この検定法
を使用して同定される特異的標的ヌクレオチド配列は、
特定の疾患状態、遺伝子特性または異常に特徴的である
場合が多い。
検定法は、簡単で回りくどくなく、診断的試験系に容易
に適用できる検定法を提供するものである。この検定法
を使用して同定される特異的標的ヌクレオチド配列は、
特定の疾患状態、遺伝子特性または異常に特徴的である
場合が多い。
【００５９】例
以下の例は例示的なものであって、本発明を限定するも
のではない。核酸ハイブリダイゼーションの一般的条件
ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ改変酵素の使用は、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉ
ｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ 著、第２版、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に見出すこ
とができる。
のではない。核酸ハイブリダイゼーションの一般的条件
ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ改変酵素の使用は、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉ
ｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ 著、第２版、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に見出すこ
とができる。
【００６０】特に指示のない限り、本発明の実施にあた
って用いる必要がある試薬の製造のための以下の材料お
よび方法は本技術分野においてよく知られていて、以下
のようにして得ることができる。
って用いる必要がある試薬の製造のための以下の材料お
よび方法は本技術分野においてよく知られていて、以下
のようにして得ることができる。
【００６１】ラクトースリプレッサー蛋白質は、文献：
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．ら：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．４（３）：５６７（１９７７）Ｍａｔｔ
ｈｅｗｓ，Ｋ．Ｓ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３
（１２）：４２７９（１９７８）Ｏ′Ｇｏｒｍａｎ，Ｒ
．Ｂ．ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：
１０１００（１９８０）Ｌｅｖｅｎｓ，Ｄ．＆Ｐ．Ｍ．
Ｈｏｗｌｅｙ：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（９）
：２３０７（１９８５）に記載されているようにして製
造できる。
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．ら：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．４（３）：５６７（１９７７）Ｍａｔｔ
ｈｅｗｓ，Ｋ．Ｓ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３
（１２）：４２７９（１９７８）Ｏ′Ｇｏｒｍａｎ，Ｒ
．Ｂ．ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：
１０１００（１９８０）Ｌｅｖｅｎｓ，Ｄ．＆Ｐ．Ｍ．
Ｈｏｗｌｅｙ：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（９）
：２３０７（１９８５）に記載されているようにして製
造できる。
【００６２】上述の引用方法を用いて製造されたラクト
ースリプレッサー蛋白質の存在、活性および純度は、文
献、とくにＢｏｕｒｇｅｏｉｓ，Ｓ．＆Ａ．Ｄ．Ｒｉｇ
ｇｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍ．３８（２）：３４８（１９７０）；Ｂａｒｋｌｅ
ｙ，Ｍ．Ｄ．＆Ｓ．Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ：Ｔｈｅ Ｏ
ｐｅｒｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎ．Ｙ．１７７〜２２０頁（１９７８）；およびＢ
ｕｒｇｅｏｉｓ，Ｓ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１巻、４９１〜５００頁（１９
７１）に記載されている操作を用いて測定できる。
ースリプレッサー蛋白質の存在、活性および純度は、文
献、とくにＢｏｕｒｇｅｏｉｓ，Ｓ．＆Ａ．Ｄ．Ｒｉｇ
ｇｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍ．３８（２）：３４８（１９７０）；Ｂａｒｋｌｅ
ｙ，Ｍ．Ｄ．＆Ｓ．Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ：Ｔｈｅ Ｏ
ｐｅｒｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎ．Ｙ．１７７〜２２０頁（１９７８）；およびＢ
ｕｒｇｅｏｉｓ，Ｓ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１巻、４９１〜５００頁（１９
７１）に記載されている操作を用いて測定できる。
【００６３】テトラサイクリン（ｔｅｔ）リプレッサー
蛋白質は以下の文献に記載されているようにして製造で
きる。Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．ら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２５７（１１）：６６０５（１９８２）Ｏｅｈｍｉｃｈ
ｅｎ，Ｒ．ら：ＥＭＢＯ Ｊ．３（３）：５３９（１
９８４）
蛋白質は以下の文献に記載されているようにして製造で
きる。Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．ら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２５７（１１）：６６０５（１９８２）Ｏｅｈｍｉｃｈ
ｅｎ，Ｒ．ら：ＥＭＢＯ Ｊ．３（３）：５３９（１
９８４）
【００６４】ｔｅｔリプレツサー蛋白質のアッセイおよ
び特性づけは以下の文献に従って実施できる。Ａｌｔｓ
ｃｈｅｍｉｅｄ，Ｌ．＆ Ｗ．Ｈｉｌｌｅｎ：Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８７：３４１（１９８７）Ｈｉｌｌ
ｅｎ，Ｗ．ら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：１８５
Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．ら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６９
：７０７（１９８３）
び特性づけは以下の文献に従って実施できる。Ａｌｔｓ
ｃｈｅｍｉｅｄ，Ｌ．＆ Ｗ．Ｈｉｌｌｅｎ：Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８７：３４１（１９８７）Ｈｉｌｌ
ｅｎ，Ｗ．ら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：１８５
Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．ら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６９
：７０７（１９８３）
【００６５】例１
サンプル中における標的ＤＮＡの存否は、サンプルの一
部を便利な容量のハイブリダイゼーション緩衝液、たと
えば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、 １ｍＭ
ＥＤＴＡに加えて測定する。ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液にはまた、たとえば図１および２に示したよう
な核酸配列を含有する第一および第二のリガンドが含ま
れている。本例の一応用においては、ＤおよびＥ領域（
図１および２参照）のヌクレオチド配列は、上記引用文
献に記載されて知られている、それぞれラクトース（ｌ
ａｃ）オペレーターおよびテトラサイクリン（ｔｅｔ）
オペレーターの配列である。少なくとも２分間約９８℃
に加熱して、存在する標的ＤＮＡを一本鎖に変性した後
、溶液の温度を低下させて、サンプル中に存在する標的
核酸にリガンド配列をハイブリダイゼーションさせる。 正確なハイブリダイゼーション温度は、標的にハイブリ
ダイズさせるリガンド配列の長さおよび％ＡＴ塩基組成
を考慮して引用文献から計算できる。実質的に完全なハ
イブリダイゼーションに必要反応時間も通常、文献でよ
く知られている式から、この場合もリガンド配列の長さ
およびその複合度によって計算される（たとえば、Ａｌ
ｂｒｅｔｓｅｎ，Ｃ．ら：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１７０：１９３，１９８８；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ａ
．＆ Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１６９：１，１９８８；Ｍｅｉｎｋｏｔｈ，Ｊ
．＆ Ｗａｈｌ，Ｇ：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
３８：２６７，１９８４；およびＭｉｙａｄａ，Ｃ．Ｇ
．＆Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４：９４，１９８７
参照）。
部を便利な容量のハイブリダイゼーション緩衝液、たと
えば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、 １ｍＭ
ＥＤＴＡに加えて測定する。ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液にはまた、たとえば図１および２に示したよう
な核酸配列を含有する第一および第二のリガンドが含ま
れている。本例の一応用においては、ＤおよびＥ領域（
図１および２参照）のヌクレオチド配列は、上記引用文
献に記載されて知られている、それぞれラクトース（ｌ
ａｃ）オペレーターおよびテトラサイクリン（ｔｅｔ）
オペレーターの配列である。少なくとも２分間約９８℃
に加熱して、存在する標的ＤＮＡを一本鎖に変性した後
、溶液の温度を低下させて、サンプル中に存在する標的
核酸にリガンド配列をハイブリダイゼーションさせる。 正確なハイブリダイゼーション温度は、標的にハイブリ
ダイズさせるリガンド配列の長さおよび％ＡＴ塩基組成
を考慮して引用文献から計算できる。実質的に完全なハ
イブリダイゼーションに必要反応時間も通常、文献でよ
く知られている式から、この場合もリガンド配列の長さ
およびその複合度によって計算される（たとえば、Ａｌ
ｂｒｅｔｓｅｎ，Ｃ．ら：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１７０：１９３，１９８８；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ａ
．＆ Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１６９：１，１９８８；Ｍｅｉｎｋｏｔｈ，Ｊ
．＆ Ｗａｈｌ，Ｇ：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
３８：２６７，１９８４；およびＭｉｙａｄａ，Ｃ．Ｇ
．＆Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４：９４，１９８７
参照）。
【００６６】三元の複合体（標的ポリヌクレオチド配列
Ａ，ＤおよびＤ領域のヌクレオチド配列、および第一お
よび第二のリガンド、ＢおよびＣ、図１および２参照）
の形成後、溶液を室温に冷却し、β−ガラクトシダーゼ
−ｌａｃリプレッサー融合蛋白質（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および抗β−ガラ
クトシダーゼマウスモノクローナル抗体（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ならびに
ウサギ−抗−マウス抗体を固定化した固体表面（たとえ
ばビーズとして、ＲＡＭビーズ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を
混合物に加える。これらの成分の濃度およびインキュベ
ーション時間（約１５分）は、核酸配列を含む全ｌａｃ
オペレーターが固体表面上に結合されるように選択され
る。固体表面を遠心分離により液相から分離する。洗浄
工程（同容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ＝７．５，
１００ｍＭＮａＣｌ）および遠心分離の後、標識ｔｅｔ
リプレッサーを加える。ｔｅｔリプレッサーの結合条件
は上記の引例に記載されている。インキュベーション（
通常１５分）、非結合蛋白質の除去、および洗浄の後、
陰性対照の場合（すなわち、サンプルまたは標識ヌクレ
オチドを欠く）以上に残存する標識リプレッサー物質の
量は、サンプル中の標的核酸の存在および量の指標とな
る。
Ａ，ＤおよびＤ領域のヌクレオチド配列、および第一お
よび第二のリガンド、ＢおよびＣ、図１および２参照）
の形成後、溶液を室温に冷却し、β−ガラクトシダーゼ
−ｌａｃリプレッサー融合蛋白質（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および抗β−ガラ
クトシダーゼマウスモノクローナル抗体（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ならびに
ウサギ−抗−マウス抗体を固定化した固体表面（たとえ
ばビーズとして、ＲＡＭビーズ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を
混合物に加える。これらの成分の濃度およびインキュベ
ーション時間（約１５分）は、核酸配列を含む全ｌａｃ
オペレーターが固体表面上に結合されるように選択され
る。固体表面を遠心分離により液相から分離する。洗浄
工程（同容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ＝７．５，
１００ｍＭＮａＣｌ）および遠心分離の後、標識ｔｅｔ
リプレッサーを加える。ｔｅｔリプレッサーの結合条件
は上記の引例に記載されている。インキュベーション（
通常１５分）、非結合蛋白質の除去、および洗浄の後、
陰性対照の場合（すなわち、サンプルまたは標識ヌクレ
オチドを欠く）以上に残存する標識リプレッサー物質の
量は、サンプル中の標的核酸の存在および量の指標とな
る。
【００６７】この例における第二のリプレッサーは、蛍
光染料、放射性マーカー（たとえば１２５−ヨウ素）に
よる修飾で、または検出反応の最終工程でその適当な基
質を与えると検出可能な生成物に変換する酵素標識を共
有結合で付着させることにより、標識してもよい。この
検定の最終形態をモデル二本鎖ＤＮＡにより図４に示す
。
光染料、放射性マーカー（たとえば１２５−ヨウ素）に
よる修飾で、または検出反応の最終工程でその適当な基
質を与えると検出可能な生成物に変換する酵素標識を共
有結合で付着させることにより、標識してもよい。この
検定の最終形態をモデル二本鎖ＤＮＡにより図４に示す
。
【００６８】例２
本発明の実施の別法を図５に示す。この例では、テトラ
サイクリンリプレッサー蛋白質を固体表面上に固定化す
る。これは受能吸着または共有結合の使用によって達成
される。蛋白質の固定化方法の例には、Ａｆｆｉｎｉｔ
ｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄｅａｎ，Ｐ．Ｄ．
Ｇ．ら編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）、とくに
第５章およびそこに含まれる引例が参考になる。
サイクリンリプレッサー蛋白質を固体表面上に固定化す
る。これは受能吸着または共有結合の使用によって達成
される。蛋白質の固定化方法の例には、Ａｆｆｉｎｉｔ
ｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄｅａｎ，Ｐ．Ｄ．
Ｇ．ら編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）、とくに
第５章およびそこに含まれる引例が参考になる。
【００６９】図５に概略を示した例では、例１のように
して製造される三元複合体を固定化された結合蛋白質に
加える。結合させるのに適当な時間（通常１５分）イン
キュベートし、洗浄工程で非結合物質を除去した後、第
二のＤＮＡ結合蛋白質、たとえばβ−ガラクトシダーゼ
−ｌａｃ−リプレッサー融合蛋白質を加える。第二のＤ
ＮＡ結合蛋白質を結合させ、ついで非結合および非特異
的結合β−ガラクトシダーゼ活性を除去できるように洗
浄する。次に、β−ガラクトシダーゼの基質を加え（た
とえば ”Ｂｌｕｏｇａｌ”，ｐＮＰＧ，またはＸ−ｇ
ａｌ；ＢＢＬ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、
標的核酸の存在を着色した染料の形成から推定する。
して製造される三元複合体を固定化された結合蛋白質に
加える。結合させるのに適当な時間（通常１５分）イン
キュベートし、洗浄工程で非結合物質を除去した後、第
二のＤＮＡ結合蛋白質、たとえばβ−ガラクトシダーゼ
−ｌａｃ−リプレッサー融合蛋白質を加える。第二のＤ
ＮＡ結合蛋白質を結合させ、ついで非結合および非特異
的結合β−ガラクトシダーゼ活性を除去できるように洗
浄する。次に、β−ガラクトシダーゼの基質を加え（た
とえば ”Ｂｌｕｏｇａｌ”，ｐＮＰＧ，またはＸ−ｇ
ａｌ；ＢＢＬ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、
標的核酸の存在を着色した染料の形成から推定する。
【００７０】以上の記述および例は、本発明を、その好
ましい実施態様を含めて、完全に開示するものである。 分子生物学および関連科学分野における通常の熟練者に
は自明な上述の方法の改変は、特許請求の範囲内に包含
されるものである。
ましい実施態様を含めて、完全に開示するものである。 分子生物学および関連科学分野における通常の熟練者に
は自明な上述の方法の改変は、特許請求の範囲内に包含
されるものである。
【図１】標的ポリヌクレオチド配列の、予め形成させた
二本鎖の第一および第二の特異的ヌクレオチド配列との
ハイブリダイゼーションによる標的ポリヌクレオチド配
列の検出を示す模式図
二本鎖の第一および第二の特異的ヌクレオチド配列との
ハイブリダイゼーションによる標的ポリヌクレオチド配
列の検出を示す模式図
【図２】標的ポリヌクレオチド配列に対する第一および
第二の特異的ヌクレオチド配列の化学的または酵素的い
ずれかの共有結合的付着による標的ポリヌクレオチドの
検出を示す模式図
第二の特異的ヌクレオチド配列の化学的または酵素的い
ずれかの共有結合的付着による標的ポリヌクレオチドの
検出を示す模式図
【図３】第一の特異的ポリヌクレオチド配列の一側の延
長による標的ヌクレオチド配列の検出を示す模式図
長による標的ヌクレオチド配列の検出を示す模式図
【図
４】例１にさらに詳細に記載した本発明の態様の模式図
４】例１にさらに詳細に記載した本発明の態様の模式図
【図５】例２にさらに詳細に記載した本発明の態様の模
式図
式図
Claims (10)
- 【請求項１】 標的ポリヌクレオチド配列を検出する
方法において、ａ）標的ポリヌクレオチド配列に応答し
て、共有結合または非共有結合で結合したヌクレオチド
配列結合対を形成させ、この場合、各ヌクレオチドの部
分にはヌクレオチド配列特異的結合蛋白質（ＮＳＳＢＰ
）が存在し、ついでｂ）ヌクレオチド配列の結合対と複
合体を形成したＮＳＳＢＰを検出することを特徴とする
方法 - 【請求項２】 ヌクレオチド配列対の間の結合は共有
結合である、標的ポリヌクレオチド配列を検出するため
の請求項１に記載の方法 - 【請求項３】 ヌクレオチド配列対は、標的ポリヌク
レオチド配列の２個の非隣接部分に結合される請求項２
に記載の方法 - 【請求項４】 ヌクレオチド配列の結合対は、（ａ）
標的ポリヌクレオチド配列の第一の部分とハイブリダイ
ズできる配列を有する第一のリガンド、（ｂ）標的ポリ
ヌクレオチド配列の第一の部分以外の第二の部分とハイ
ブリダイズできる配列を有する第二のリガンド、および
（ｃ）第一のリガンドにリゲートした特異的ヌクレオチ
ド配列と第二のリガンドにリゲートした特異的ヌクレオ
チド配列からなる請求項１に記載の方法 - 【請求項５】
第一および第二のリガンドは、標的分子の存在に応答
して互いに共有結合的に結合可能になる請求項４に記載
の方法 - 【請求項６】 第一および第二のリガンドは、リプレ
ッサー、アクティベーター、制限エンドヌクレアーゼ、
ポリペプチドフラグメントおよびＲＮＡポリメラーゼか
らなる群より選ばれ、ＮＳＳＢＰを結合できる、それぞ
れ異なる特異的ヌクレオチド配列に結合している請求項
４に記載の方法 - 【請求項７】 ヌクレオチド配列結合対は、標的ポリ
ヌクレオチド配列の少なくとも１個のヌクレオチドで分
離された部分にハイブリダイズした第一および第二のリ
ガンドのリゲーションによって形成される、標的ポリヌ
クレオチド配列を検出するための請求項１に記載の方法
- 【請求項８】 標的ポリヌクレオチド配列の含有が疑
われるメジウム中の標的ポリヌクレオチドを検出する方
法において、ａ）標的ポリヌクレオチド配列の３′末端
に、第一の特異的ヌクレオチド配列の３′末端に結合し
た第一のリガンドをハイブリダイズさせ、この場合特異
的ヌクレオチド配列は一本鎖とし、ｂ）標的ポリヌクレ
オチド配列を、鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラー
ゼおよび三リン酸ヌクレオシドを用いて、一本鎖の第一
の特異的ヌクレオチド配列に沿って延長させて、二本鎖
の第一の特異的ヌクレオチド配列を形成させ、ｃ）第一
の特異的ヌクレオチド配列を有する二本鎖の第一の特異
的ヌクレオチド配列に、まだ結合させていない場合は、
第二の特異的ヌクレオチド配列に結合した第二のリガン
ド、ならびに、二本鎖の第一および第二の特異的ヌクレ
オチド配列を結合可能なヌクレオシド配列特異的結合蛋
白質（ＮＳＳＢＰ）を結合させ、ついでｄ）二本鎖の第
一および第二の特異的ヌクレオチド配列の結合対と、Ｎ
ＳＳＢＰとの複合体を検出する方法 - 【請求項９】 特異的ヌクレオチド配列に結合した標
的ポリヌクレオチドからなり、それぞれの特異的ヌクレ
オチド配列はそれぞれのヌクレオチド配列特異的結合蛋
白質（ＮＳＳＢＰ）に結合していて、一方のＮＳＳＢＰ
は表面に結合しているかまたは結合可能であり、他方の
ＮＳＳＢＰは標識に結合しているかまたは結合可能であ
る組成物 - 【請求項１０】 標的ヌクレオチド配列の測定に使用
するキットであって、それぞれの一部分に異なるヌクレ
オチド配列特異的結合蛋白質（ＮＳＳＢＰ）が存在する
一対のヌクレオチド配列、および異なるヌクレオチド配
列特異的結合蛋白質を組合せて包装したキット
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US511651 | 1983-07-07 | ||
| US51165190A | 1990-04-20 | 1990-04-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04222599A true JPH04222599A (ja) | 1992-08-12 |
Family
ID=24035828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3088621A Pending JPH04222599A (ja) | 1990-04-20 | 1991-04-19 | 二重受容体ポリヌクレオチド検定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US6093537A (ja) |
| EP (1) | EP0453301A3 (ja) |
| JP (1) | JPH04222599A (ja) |
| CA (1) | CA2040896C (ja) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5424413A (en) * | 1992-01-22 | 1995-06-13 | Gen-Probe Incorporated | Branched nucleic acid probes |
| US20030104361A1 (en) | 1997-09-29 | 2003-06-05 | Susan Weininger | Method of detection of nucleic acids with a specific sequence composition |
| US5871902A (en) * | 1994-12-09 | 1999-02-16 | The Gene Pool, Inc. | Sequence-specific detection of nucleic acid hybrids using a DNA-binding molecule or assembly capable of discriminating perfect hybrids from non-perfect hybrids |
| US6852487B1 (en) | 1996-02-09 | 2005-02-08 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
| WO1997045559A1 (en) | 1996-05-29 | 1997-12-04 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions |
| IL121312A (en) * | 1997-07-14 | 2001-09-13 | Technion Res & Dev Foundation | Microelectronic components, their manufacture and electronic networks containing them |
| US7745142B2 (en) | 1997-09-15 | 2010-06-29 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
| US8063190B2 (en) * | 1998-06-02 | 2011-11-22 | Tom Robin Caine Boyde | Nucleic acid-linked conjugates and methods for making and using them |
| WO2002070662A2 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-12 | Gpc Biotech Ag | Three hybrid assay system |
| EP1546380A4 (en) | 2002-05-28 | 2007-02-14 | Us Genomics Inc | METHODS AND APPARATUSES FOR ANALYZING SIMPLE POLYMERS |
| US6984277B2 (en) * | 2003-07-31 | 2006-01-10 | Siemens Westinghouse Power Corporation | Bond enhancement for thermally insulated ceramic matrix composite materials |
| EP1651778A1 (en) * | 2003-08-01 | 2006-05-03 | U.S. Genomics, Inc. | Methods and compositions related to the use of sequence-specific endonucleases for analyzing nucleic acids under non-cleaving conditions |
| US20090123468A1 (en) | 2003-10-24 | 2009-05-14 | Gencia Corporation | Transducible polypeptides for modifying metabolism |
| US20090208478A1 (en) * | 2003-10-24 | 2009-08-20 | Gencia Corporation | Transducible polypeptides for modifying metabolism |
| AU2004297533B2 (en) | 2003-10-24 | 2010-04-29 | Gencia Corporation | Methods and compositions for delivering polynucleotides |
| US8062891B2 (en) | 2003-10-24 | 2011-11-22 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants |
| US8507277B2 (en) | 2003-10-24 | 2013-08-13 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides |
| US8133733B2 (en) | 2003-10-24 | 2012-03-13 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues |
| EP1704256A4 (en) | 2004-01-13 | 2008-01-16 | Us Genomics Inc | DETECTION AND QUANTIFICATION OF ANALYTES IN SOLUTION USING POLYMERS |
| US7752853B2 (en) | 2005-10-21 | 2010-07-13 | Emerson Retail Services, Inc. | Monitoring refrigerant in a refrigeration system |
| JP6408552B2 (ja) | 2013-03-13 | 2018-10-17 | メソ スケール テクノロジーズ エルエルシー | 改善されたアッセイ方法 |
| US10114015B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-10-30 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods |
| WO2015175856A1 (en) | 2014-05-15 | 2015-11-19 | Meso Scale Technologies, Llc. | Improved assay methods |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4556643A (en) * | 1982-07-26 | 1985-12-03 | Agracetus | Assay method and probe for polynucleotide sequences |
| US4777129A (en) * | 1983-12-12 | 1988-10-11 | Molecular Diagnostics, Inc. | Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein |
| US4724202A (en) * | 1983-12-12 | 1988-02-09 | Molecular Diagnostics, Inc. | Use of non-hybridizable nucleic acids for the detection of nucleic acid hybridization |
| US4766062A (en) * | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor |
| US4775619A (en) * | 1984-10-16 | 1988-10-04 | Chiron Corporation | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites |
| US4883750A (en) * | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
| CA1272443A (en) * | 1985-02-22 | 1990-08-07 | Nanibhushan Dattagupta | Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences |
| US4868104A (en) * | 1985-09-06 | 1989-09-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Homogeneous assay for specific polynucleotides |
| US4882269A (en) * | 1985-12-13 | 1989-11-21 | Princeton University | Amplified hybridization assay |
| US4851331A (en) * | 1986-05-16 | 1989-07-25 | Allied Corporation | Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase |
| GB8612087D0 (en) * | 1986-05-19 | 1986-06-25 | Ici Plc | Hybridisation probes |
| EP0379559B1 (en) * | 1988-06-24 | 1996-10-23 | Amgen Inc. | Method and reagents for detecting nucleic acid sequences |
| US5185243A (en) * | 1988-08-25 | 1993-02-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for detection of specific nucleic acid sequences |
-
1991
- 1991-04-19 EP EP19910303516 patent/EP0453301A3/en not_active Withdrawn
- 1991-04-19 CA CA002040896A patent/CA2040896C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-04-19 JP JP3088621A patent/JPH04222599A/ja active Pending
-
1993
- 1993-04-22 US US08/051,512 patent/US6093537A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-02 US US08/432,616 patent/US5629157A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-05-02 US US08/433,853 patent/US5985550A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-05-26 US US08/451,706 patent/US6063565A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0453301A3 (en) | 1993-07-21 |
| US5985550A (en) | 1999-11-16 |
| CA2040896C (en) | 2002-01-29 |
| US5629157A (en) | 1997-05-13 |
| US6063565A (en) | 2000-05-16 |
| CA2040896A1 (en) | 1991-10-21 |
| EP0453301A2 (en) | 1991-10-23 |
| US6093537A (en) | 2000-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH04222599A (ja) | 二重受容体ポリヌクレオチド検定方法 | |
| JP3109810B2 (ja) | 単一プライマーを用いる核酸の増幅 | |
| US5185243A (en) | Method for detection of specific nucleic acid sequences | |
| US5595891A (en) | Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification | |
| US6368801B1 (en) | Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase | |
| AU669365B2 (en) | Chemical method for the analysis of DNA sequences | |
| EP0857218B1 (en) | Detection of nucleic acids by formation of template-dependent product | |
| US5985548A (en) | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication | |
| US6368803B1 (en) | Detection of nucleic acids by target-catalyzed formation | |
| US5876976A (en) | Method for reducing carryover contamination in an amplification procedure | |
| US5439793A (en) | Method for producing a polynucleotide having an intramolecularly base-paired structure | |
| US5741637A (en) | Process for the production of modified nucleic acids | |
| CN110551623A (zh) | 用于核酸检测的纸质微流体芯片、装置、试剂盒及其应用 | |
| JP2673162B2 (ja) | 核酸の高感度検出方法 |