JP2843586B2 - 転写に基づいた核酸増幅/検出系 - Google Patents

転写に基づいた核酸増幅/検出系

Info

Publication number
JP2843586B2
JP2843586B2 JP63506404A JP50640488A JP2843586B2 JP 2843586 B2 JP2843586 B2 JP 2843586B2 JP 63506404 A JP63506404 A JP 63506404A JP 50640488 A JP50640488 A JP 50640488A JP 2843586 B2 JP2843586 B2 JP 2843586B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
subsegment
sequence
primer
segment
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP63506404A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH02500565A (ja
Inventor
ジンジェラス,トーマス・レイモンド
マーテン,アルリッチ
コー,デボラ・ヤンティス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Akzo NV
Original Assignee
Akzo NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26744190&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2843586(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Akzo NV filed Critical Akzo NV
Publication of JPH02500565A publication Critical patent/JPH02500565A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2843586B2 publication Critical patent/JP2843586B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6867Replicase-based amplification, e.g. using Q-beta replicase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701Specific hybridization probes
    • C12Q1/702Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703Viruses associated with AIDS
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158Expression markers

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は一般に分子生物学および分子遺伝学の進歩に
関する。
より詳細には、本発明はRNA、DNAまたはそれらの両方
でありうる1種以上の核酸を含む試料中の少なくとも1
種の所定の核酸セグメント(配列)またはその相補鎖も
しくはハイブリツド形成性相同セグメントのin vitroま
たはx−vivoコピー数を増加させる(すなわち、増幅さ
せる)ための新規な方法、必要な試薬類を含むキツト、
および手段に関する。
本発明の方法およびキツトが利用される適用例には、
1)in vitroまたはx−vivo核酸プローブハイブリダイ
ゼーシヨン検定により遺伝病または病原体による疾患に
特徴的な特定の核酸配列を検出するための体液および組
織の分析、並びに2)単一コピーの、珍しい、または低
発現率の遺伝子の選択的クローニングが含まれる。
発明の背景 分子生物学、分子遺伝学およびそれらの応用(例え
ば、血液由来の病原体や欠損遺伝子の核酸プローブハイ
ブリダイゼーシヨン検定)における研究の多くは、特定
の核酸配列の検出または分離を包含する。このような研
究の根本的問題は、対象となる核酸配列を検出または分
離し、その後定量化することにある。その問題は細胞培
養物、組織標本および血液試料のような生物学的材料が
RNAおよびDNAの複雑な混合物から成り、しかも非常に小
さい画分が対象配列を含むにすぎないので難しいものと
なつている。
実際に、核酸プローブハイブリダイゼーシヨン検定の
応用は、日常一般的使用に適する試薬を使用し且つ許容
しうる程度に短い時間で実施する場合、試料中に含まれ
る対象配列の低い濃度では、検定の感度が低すぎてそれ
らを検出できないために制限されている。
複雑な核酸混合物中に低濃度で存在する対象の核酸配
列(標的セグメント)を検出する問題を解決するため
に、基本的に異なる2つの手法が考えられた。
第一の手法では、試料中に含まれる核酸(標的セグメ
ントを含む)の量を変えず、その代わりに、信号発生系
を標的セグメントに結合させて、標的セグメントの分子
数に相当する検出可能な信号を発生させる。例えば、標
的セグメントのサブセグメントに相補的な配列を有する
核酸プローブをアルカリ性ホスフアターゼのような酵素
に結合させ、それをプローブと標的セグメントの間でハ
イブリダイゼーシヨンが起こる(しかし、プローブと試
料中の他の核酸配列の間では起こらない)ハイブリダイ
ゼーシヨン条件下で試料と混合する。ハイブリダイズし
なかつた酵素結合プローブを除いた後、アルカリ性ホス
フアターゼ用の発色性基質を適当な条件下で加え、そし
て、原理的には標的セグメントにハイブリダイズした各
プローブ分子に対して多数の検出しうる着色分子を速や
かに形成させる。
試料中の標的核酸の量を変えずに核酸配列を検出する
方法は他にも当分野で多数知られている。例えば、32P
のような放射性原子で核酸プローブを慣例的にラベリン
グし、その後放射性核種の崩壊により生ずる増幅信号か
ら標的にハイブリダイズしたプローブを検出する。さら
に別の例は標的セグメントに対するプローブを複製可能
な別の核酸に結合させて、既知技術で容易に検出できる
ようにしたものである。ある種のRNAはバクテリオフア
ージRNA依存性RNAポリメラーゼ(例えば、Qβレプリカ
ーゼやブロームモザイクウイルス(brome mosaic viru
s:BMV)由来のレプリカーゼ)のようなポリメラーゼに
よるレプリカーゼ誘導複製(自己触媒的に誘導される複
製)を受けやすいことが知られている。このような系に
おいては、RNAと相補的配列のRNAとの両方がRNAポリメ
ラーゼによる複製の鋳型となり、その結果複製RNAの量
は(RNA鋳型分子の数が系中のRNAポリメラーゼ分子の数
を越えない限り)時間がたつにつれて指数的に増加す
る。Miele et at.,J.Mol.Biol.171、281(1983)を参照
されたい。標的セグメントに対するプローブがQβレプ
リカーゼによつて複製され得るRNAに結合された系はChu
et al.,Nucl.Acids Res.14、5591(1986)に記載され
ており、BMVレプリカーゼによつて複製され得るRNAに結
合された系はMarsh et al.,Positive Strand RNA Virus
es,Alan R.Liss(publr.;New York)(1987;Proceeding
s of UCLA Symposium,1986)に記載されている。
第一の手法は2つの重大な欠点を有している。まず第
一に、多くの場合において、実際の大きさの試料に含ま
れる標的セグメントのコピー数は非常に低いので、かな
り迅速な信号発生系でさえも、バツクグラウンドを有意
に越える検出可能な信号を発生させるのに要する時間が
長くなり、実用的でない。第二に、“バツクグラウン
ド”信号発生分子と標的に結合した信号発生分子とは本
質的に同じ速度で信号を発する。標的セグメントの検定
において、“バツクグラウンド”による信号は避けられ
ず、すなわち、フイルターや他の担体に非特異的に付着
したプローブ、または標的セグメントによく似ている配
列をもつセグメントにハイブリダイズしたプローブによ
つて発せられる信号が若干存在する。標的なコピー数が
あまりに低い場合は、標的+バツクグラウンドからの信
号(すなわち、“信号”)対バツクグラウンドからの信
号(すなわち、“ノイズ”)の時間定数比はあまりに低
すぎて有意にバツクグラウンドを越えて検出できないで
あろう。これらの欠点および他の欠点は、複雑な核酸混
合物中に低レベルで存在する標的セグメントを検出する
問題を解決する第二の手法へ導いた。
この第二の手法は根本的に相違しており、標的セグメ
ントそれ自体のコピー数を、好ましくは試料中の他の配
列(特に配列の類似性ゆえに標的セグメントとして誤つ
て検出される恐れのあるもの)よりも多くなるまで、増
加させることを包含する。この第二の手法の例は、標的
セグメントを保有する細胞の数を、往々にして多数の他
の細胞よりも一層速やかに増殖させる培養技術、あるい
は標的セグメントを含む特定の核酸(例えばプラスミド
やRNA)の数を増加させる種々の培養技術を必要とす
る。
このような培養技術は煩わしく、疑わしく、しかも時
間がかかるという難点を有しており、避けられない事
実:すなわち、標的セグメントを含むもの以外の核酸も
そのコピー数が同時に増加し、“バツクグラウンド”を
高める可能性があるという事実、が明らかになつた。そ
の他の難点は、増幅を達成させるのに必要な工程が危険
でありうる微生物を結果的に増やすことになるというも
のである。
この第二の手法のもう一つの例は、いわゆる“ポリメ
ラーゼ鎖伸長反応(PCR)”によるDNA標的セグメントの
増幅である。この技術は、例えば、ある種のウイルスの
1本鎖DNAゲノムの複製過程で起こることが知られた自
然界の方法を借りて適合させたものであり、いずれにせ
よ、Hong,Bioscience Reports 1、243(1981);Cooke e
t al.,J.Biol.Chem.255、6502(1980);およびZoller
et al.,Methods in Enzymology 100、468−500(1983)
に記載されるcDNA作製に類似した方法である。この技術
によれば、特定セグメントのコピー数が多数のサイクル
を重ねるたびに指数的に増加し、各サイクルは(1)標
的セグメントおよびその相補鎖(すなわち、標的セグメ
ント相補的な配列をもつセグメント)のそれぞれの3′
末端サブセグメントにDNAプライマーをハイブリダイズ
させ、(2)そのプライマーをDNAポリメラーゼで伸長
させ、そして(3)段階(2)で得られた2本鎖を熱変
性して1本鎖にする、ことを包含している。この技術は
Saiki et al.,Science 230、1350(1985)、およびMull
is et al.,欧州特許出願公開第200362号および第201184
号に開示されている。この技術を約3時間にわたつて20
回繰り返すことにより、標的セグメントのコピー数を約
105倍まで増加しうることが報告されている。これらの
セグメントのみに特定のプライマーが十分安定した状態
でハイブリダイズしてポリメラーゼによる鎖伸長を開始
し、それにより相補鎖を形成し、またはこれらのセグメ
ントが相補鎖を有し、その相補鎖に別の特定プライマー
が同様にハイブリダイズして鎖伸長の際に標的セグメン
トを生成するので、それらのコピー数は指数的に増加す
る。一方、用いたプライマーと誤つてハイブリダイズし
た他の非標的セグメントはそのコピー数が、増加するに
しても、せいぜいサイクル数の関数として線状に増加す
るにすぎない。このポリメラーゼ鎖伸長反応技術は、標
的セグメントのコピー数ばかりでなく、標的セグメント
の量対バツクグラウンドの原因となるセグメントの量の
比を非常に高めることができる。
もちろん、この第二手法は増幅された標的セグメント
に対して適用される第一の手法と併用することによつ
て、さらに強い検出信号を得ることができる。
本発明の目的は、従来技術によつて提出された問題点
を解決し且つこれらの問題点を解決しようとして研究者
らが列挙した難点を克服することである。本発明の他の
目的は、既知試薬の有利性を利用し且つ一定の科学的結
果に到達するのに必要な精度を有し、短時間で利用でき
る簡便な技術、すなわち再現可能な検定設備で使用する
ことができ且つ実験室/臨床分析用キツトとして応用し
うる技術を提供することである。
従つて、本発明の目的は、ある種の核酸配列(標的セ
グメント)の検出可能性を、従来技術の努力によつて列
挙された難点を排除したin vitroまたはx−vivo系での
標的配列の増幅により高めることである。
本発明は、複雑な核酸混合物中に低レベルで存在する
標的セグメントを検出する第二の手法を実施するための
新規な技術に関する。それは完全なサイクルとして標的
配列の合成2本鎖cDNAコピーと共に、それらから誘導さ
れる新規なRNA転写生産段階を用いるものである。多数
のサイクルが実施される。この転写段階は新規な面を構
成するので、本明細書においては便宜上転写に基づいた
増幅系(transcription−based amplificati−on syste
m:TAS)と呼ぶことにする。本発明の新規なTAS技術は、
DNA依存性RNAポリメラーゼの2つの性質:すなわち
(1)各ポリメラーゼに対し特異的なほんの少数の配列
からの転写開始、例えばBrown et al.,Nucl.Acids Res.
14、3521(1986)を参照;および(2)RNAポリメラー
ゼによつて認識されるプロモーターの各コピーからの多
数の転写物の迅速な生産(一般的には102〜104/時)、
例えばMilligan et al.,Nucleic Acids Res.15、8783
(1987)を参照;を利用することによつて所定の標的セ
グメントのコピー数を速やかに増加させる。本発明のこ
の技術は、RNA依存性RNAレプリカーゼによつて迅速に
(自己触媒的に)複製されるある配列のRNAの能力をも
利用し得る。Mieleらの上記文献を参照されたい。さら
に、それは試料中に存在する標的DNAの量の疑う余地の
ない測定を可能にする標準化技術を提供する。
本発明は、(もし自己触媒的複製を誘導しないなら
ば)標的セグメントの配列または標的セグメントに相補
的な配列のサブセグメントを有し且つ相補配列のサブセ
グメントを有する核酸に比べて大過剰で存在する1本鎖
RNA転写物、またはそれから形成された2本鎖RNA−DNA
(その形成を妨げる測定が行われない場合)をもたら
す。初期におけるこの過剰の1本鎖RNA転写物は増幅産
物を標識核酸プローブにより検出する方法において有利
である。その理由は、増幅産物にハイブリダイズするプ
ローブと競合する相補配列のセグメントが少ししか存在
しないからである。また、1本鎖RNA転写物は多かれ少
なかれ連続して切り落とされ、厄介な、誤りやすい反復
PCRサイクルおよび鎖分離の必要がない標的セグメント
の直接検出をもたらす。このような利点は、検出前に、
しかも許容しうる増幅レベルに到達するのに必要な多数
回の反復サイルクの後に、分離する必要のある2本鎖DN
A(一方の鎖は標的セグメントを含み、他方の鎖は標的
セグメントの相補鎖を含む)をもたらすPCR技術によつ
ては得られない。
本発明の技術は、ほぼ同じ時間にわたつてPCR技術と
少なくとも同じくらい多量に所定の標的セグメントを増
幅させるが、はるかに簡単でしかも再現性のある方法で
あり、自然界の方法または他の技術と明瞭に区別し得
る。
発明の要約 本発明者らは、バクテリオフアージDNA依存性RNAポリ
メラーゼを用いて、核酸試料中に存在する所定の標的核
酸配列(標的配列または標的セグメント)を迅速に増幅
する(すなわち、標的配列のコピー数を増加する)方法
を見出した。さらに、我々はバクテリオフアージDNA依
存性RNAポリメラーゼをバクテリオフアージRNA依存性RN
Aポリメラーゼと併用することによつて同じ結果を得る
方法を発見した。これまで、このようなバクテリオフア
ージRNAポリメラーゼがこの目的のために利用できるこ
とは知られていなかつた。
本発明はこれらの発見に基づいた方法およびその方法
を実施するためのキツトを提供する。
これらの方法およびキツトは特に、本発明に従つて増
幅される標的セグメントを含む核酸の核酸プローブハイ
ブリダイゼーシヨン検定に関連して適用される。従つ
て、本発明はまた、特定のセグメントを含む核酸試料中
の該セグメントの有無を、本発明による増幅後に、該セ
グメントとハイブリダイズするプローブによつて検出す
る方法、並びにその方法を実施するためのキツトを提供
する。
本発明はある種のRNA転写物、それらの生産、任意の
複製、および(塩基配列において)対応する標的核酸配
列の所望の増幅および検出を達成するためのその使用と
いう新規性に基づいている。本発明はin viroまたはx
−vivoの環境で実施され、2本鎖核酸鋳型(上記RNA転
写物の生産のために用いられる)をつくるための標的配
列の2本鎖cDNAコピーの合成と共同して用いられる。2
本鎖cDNA合成とRNA転写から成るこの過程は、本発明の
転写に基づいた増幅系(TAS)の単一サイクルを構成す
る。所望により、このサイクルを繰り返し行つてより一
層高レベルの増幅を達成してもよい。それらが生産(お
よび複製)される方法であるために、それらの転写物は
核酸混合物のまじつたもとの試料に含まれる標的核酸配
列に塩基配列の点で対応(一致もしくは相補的)してい
る。それ故に、増幅された形の転写物の存在はそれらの
検出のために、ひいては、上記試料中の標的核酸配列の
存在のin vitroまたはx−vivo検出のために利用され
る。
従つて、本発明は核酸含有試料中の少なくとも1種の
特定の核酸配列(標的配列または標的セグメント)のin
vitroまたはx−vivo検出を包含する。本発明は、プロ
モーターに連結された標的配列に対応する配列を含む2
本鎖核酸を作製し;該2本鎖核酸を2本鎖核酸鋳型とし
て使用して、それらから多数のRNA転写物(それぞれ上
記標的配列に対応するRNA配列を有する)をつくり;そ
して該RNA配列の存在を検出して標的配列の存在を類推
する、ことから成る方法を提供する。
本発明はこのようなRNA転写物の作製および使用に関
連したあらゆる方法および手段に向けられる。従つて、
本発明は標的配列のセグメントに対応する配列に連結さ
れたプロモーター配列を含む第一の核酸プライマーを用
意し;第一の核酸プライマーを核酸含有試料中の標的配
列と適当な条件下でハイブリダイズさせ;ハイブリダイ
ズした第一の核酸プライマーをポリメラーゼ伸長反応に
より標的配列に対し相補的に伸長させて、対応する2本
鎖核酸を形成させ;該2本鎖核酸を1本鎖に分離し;分
離したプロモーター含有配列鎖に適当な条件下で該プロ
モーター配列と反対の末端で第二の核酸プライマーをハ
イブリダイズさせ;そしてハイブリダイズした第二の核
酸プライマーをポリメラーゼ伸長反応により該プロモー
ター含有配列に対し相補的に伸長させる、ことから成る
上記の2本鎖核酸鋳型を作製するための任意に反復しう
る方法に向けられる。
本発明はさらに、標的配列のセグメントに相補的な配
列に作動可能な状態で連結されたプロモーター配列を含
む第一核酸プライマー、および標的配列のセグメントと
同一の配列を有する第二核酸プライマー(前記プライマ
ー類は標的配列の異なる領域に対応するが、標的へのそ
れらの対応において重複せず、または実質的に重複せ
ず、一方の伸長産物がその相補鎖から分離されるとき他
方の伸長産物のための鋳型として役立つように選ばれ
る)を用意し;標的配列を有する核酸を含む試料と前記
のプライマー類とを、ハイブリダイゼーシヨンおよびそ
の後の鎖分離の条件下で接触させて、順次前記のプライ
マー類の伸長産物を作る;ことから成る2本鎖核酸鋳型
(上記参照)のもう1つの作製方法および手段(例え
ば、本質的にシングルポツト(singlu−pot)の反応か
ら成る方法)に向けられる。
本発明はさらに、DNA依存性RNAポリメラーゼ(そのプ
ロモーターを認識する)により触媒される反応において
多数のRNA転写物を作るための鋳型として前記の2本鎖
核酸を使用し、該RNA転写物の存在を検出および測定す
る方法および手段に向けられる。
本発明はさらに、内部標準として用いた既知核酸の存
在に相関させることにより(検出されたRNA転写物の量
に対応させて)検出された標的配列の量を標準化する方
法および手段に向けられる。標準のコピー数は予め決定
されており、本発明の実施中、標準は標的配列と同じ条
件を経験するので、それは平行して作られたその転写物
と標的配列の転写物との相対量を決定する際の評価手段
として役立つであろう。
本発明はさらに、得られた前記のRNA転写物中にレプ
リカーゼ認識部位が存在するために、該RNA転写物を複
製することに向けられる。これはレプリカーゼ認識部位
配列を、好ましくはプロモーター配列と標的配列に対応
する配列との間に、保有する上記の第一核酸プライマ
ー、および/またはレプリカーゼ認識部位を有する上記
の第二核酸プライマーを用意することにより有利に達成
される。その後の転写において、結果的に生じた転写物
はレプリカーゼ認識部位を有し、それ故にレプリカーゼ
の存在(例えば、反応の場またはキツトに含まれる)は
転写物の複製を(自己触媒的に)誘導して、検出を容易
にする追加コピーをもたらす。
本発明はさらに、上記の方法および手段を用いて、核
酸含有試料中の少なくとも1種の特定の核酸配列(標的
配列)をin vitroまたはx−vivo検出するのに有用な試
薬類および関連手段を含むキツトに向けられる。
発明の詳細な説明 1.図面の簡単な説明 第1A、1Bおよび1C図は核酸(DNAまたはRNA)の標的セ
グメント(核酸A)を増幅するための本発明方法を示し
ており、標的セグメントに相補的な配列のセグメントを
含む第一RNA(RNA I)が多コピー数つくられる。
第2A、2B、2C図は第1A、1Bおよび1C図に示したRNA I
セグメントの別の本発明増幅を示しており、RNA Iつく
るために増幅された標的セグメントのサブセグメントと
同じ配列のセグメントを含む第二RNA(RNA II)が多コ
ピー数つくられる。
第3図は一定濃度のヒトβ−グロビン核酸と同時にTA
Sにより増幅された、いろいろな濃度のHIV RNAを示すオ
ートラジオグラムである。
第4図はDNA依存性RNAポリメラーゼによりつくられた
RNAがRNA依存性レプリカーゼの鋳型として役立つRNA分
子をもたらす一般的計略法を示している。
2.一般方法および定義 本発明の基本的技術:例えば、DNA合成を含めたDNAプ
ローブまたはプライマーの作製;標的DNA配列に対する
プライマーの相同性の程度により多かれ少なかれハイブ
リダイゼーシヨンの確実性をもたらすストリンジエント
条件の変化を含めた、ハイブリダイゼーシヨン方法論;
プロモーターの同定、単離または調製、より詳細にはバ
クテリオフアージDNA依存性RNAポリメラーゼおよびバク
テリオフアージRNA依存性RNAポリメラーゼ、あるいは真
核細胞系を用いる場合は、ウイルスDNA−およびRNA−依
存性RNAポリメラーゼ(例えば、アデノウイルスにより
コードされるRNAポリメラーゼおよびブロームモザイク
ウイルスRNAポリメラーゼ)によつて認識されるプロモ
ーターまたは部位の同定、単離または調製;いわゆる転
写エンハンサー配列を含めたRNA転写物の作製に役立つ
条件;(誘導された)複製の機構および方法論;ポリメ
ラーゼ鎖伸長反応方法(そのための試薬を含む);など
を実施するための定義および方法並びに手段は分子生物
学の標準教則本に論及される。例えば、Maniatis et a
l.,Molecu-lar Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spr
ing Harbor Laboratory,New York,(1982)、およびこ
こに引用した種々の文献;米国特許第4683195号;米国
特許第4683202号;Hong,Bioscience Reports 1、243(19
81);Cooke et al.,J.Biol.Chem.255 6502(1980);Zol
ler et al.,Methods in Enzymology 100、468−500(19
83);Crea et al.,Nucleic Acids Res.8、2331(198
0);Narang et al.,Meth.Enzym.68、90(1979);Beauca
ge et al.,Tetrahedron Letters 22、1859(1981);Bro
wn et al.,Meth.Enzym. 68、109(1979);Caruthers et
al.,Meth.Enzym154、287(1985);Hitzeman et al.,
J.Biol.Chem. 255、2073(1980);Lee et al.,Seience 2
39、1288(1988);Milligan et al.,Nucleic Acide Re
s.15、8783(1987);Miller et al.,Virology 125、236
(1983)、Ahlquist et al.,J.Mol.Biol.153、23(198
1);Millier et al.,Nature 313、68(1985);Ahlquist
et al.,J.Mol.Biol.172、369(1984);Ahlquist et a
l.,Plant Mol.Biol.3、37(1984);Ou et al.,PNAS 7
9、5235(1982);Chu et al.,Nucl.Acids Res14、559
1(1986);欧州特許出願公開(EPA)第194809号;Marsh
et al.,Positive Strand RNA Viruses,p.327−336、Al
an R.Liss(publ.;New York)(1987;Proceedings of U
CLA Symposium,1986);Miller et al.,J.Mol.Biol.18
7、537(1986);Stoflet et al.,Science 239、491(198
8);およびMurakawa et al.,DNA 7、287(1988)を参照
されたい。
先に列挙した刊行物は参照によりここに引用される。
“プロモーター”なる用語は、RNAポリメラーゼ(認
識した配列に結合した転写過程を開始させ、それにより
RNA転写物を生産する)によつて特異的に認識される核
酸配列(自然界に存在するもの、合成されたものまたは
制限消化の産物)を意味する。それは分解に対して安定
性を付与すると考えられる、実際の認識部位を越えて伸
長するヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。原理的に
は、その開始配列を認識しうる入手可能な既知ポリメラ
ーゼが存在するならば、どのプロモーターを使用しても
よい。代表的で、有用な既知プロモーターはバクテリオ
フアージT3、T7またはSP6のようなバクテリオフアージ
ポリメラーゼによつて認識されるものである。Siebenli
st et al.,Cell 20,269(1980)を参照されたい。これ
らは関連したプロモーター配列と共に本発明の実施にお
いて使用できるポリメラーゼの例にすぎない。
“RNA転写物”はプロモーター配列のRNAポリメラーゼ
認識に続いて起こる転写開始後に生産されたリボ核酸配
列を意味する(上記参照)。このような転写物の生産は
多かれ少なかれ連続的であり、存在するポリメラーゼの
量によつても若干左右される。
本明細書において、“プライマー”とは適当なハイブ
リダイゼーシヨン条件下で標的配列にハイブリダイズし
得る(すなわち、結合し得る)ように標的配列との十分
な相同性を有する核酸配列(自然界に存在するもの、合
成されたもの、または制限消化の産物)を意味する。代
表的なプライマーは鎖長が少なくとも約10ヌクレオチド
であり、最も好ましくは約35以上のヌクレオチド長であ
り、その最適な実施態様において、それは標的配列との
同一性または極めて高い相同性を共有している。例え
ば、EPA第128042号(1984年12月12日発行)を参照され
たい。
プライマー配列中のプロモーター配列の結合に関して
特に用いられる“作動可能な状態で連結された”という
表現は、本発明の最終的な“2本鎖核酸鋳型”が、適当
なポリメラーゼがプロモーターを認識したときに、対応
するRNA転写物を生産しうるような、その鋳型の機能性
を意味する……上記参照。
2本鎖核酸を製造するためのプライマー伸長反応はそ
れ自体既知である。上記文献を参照されたい。この目的
に適したポリメラーゼはE.coli DNAポリメラーゼI、E.
coli DNAポリメラーゼIのKlenow断片、T4 DNAポリメラ
ーゼ、逆転写酵素などである。
検出信号を形成する技術(例えば、放射性ラベリング
または色素産生酵素を用いる発色手段によるもの)は周
知であり、当分野において論じられている。上記の論議
を参照されたい。
本発明のRNA転写物の複製を(自己触媒的に)誘導す
るための“レプリカーゼ”の使用は一般に当分野で知ら
れている。本発明で用いられるこの種のレプリカーゼの
例は、所定のRNA転写物の3′末端と5′末端の両方に
存在する核酸配列部位を認識するいわゆるQβウイルス
レプリカーゼ、および所定のRNA転写物の3′末端の核
酸配列を認識すると考えられるいわゆるブロームモザイ
クウイルス(brome mosaic viurs:BMV)およびアルフア
ウイルスのレプリカーゼである。これらのレプリカーゼ
はRNA転写物および相補鎖を複製する(すなわち、再生
産する)のに役立ち、そのコピー数を増幅させる。この
ような酵素が転写過程で反応位置に存在する場合、転写
の間に生産された多数の転写物それら自体が複製を受け
てRNA転写産物の量を指数的に増加させると予測するこ
とができる。
内部標準法(internal standardization)はa)TAS
増幅法が操作手順の誤りのために失敗したことを確か
め;且つb)対象の試料を常に関連した所定量の核酸に
対する標的核酸のレベルを測定する;ために用いられる
方法として定義される。このような内部標準法は標的配
列の一部と内因性配列とを同一反応で同時増幅させるこ
とにより行われる。例えば、生物学的試料中に存在する
細胞数を知ることにより、単一コピー遺伝子(例えばβ
−グロビン)を内部標準として使用することができるで
あろう。それはRNAの形で発現されないので、その初期
コピー数は試料中の細胞の総数の2倍に等しい。β−グ
ロビンの一部と対象の標的配列とを同時増幅させること
により、増幅された信号の比率を比べて対象の標的配列
のレベルを定量化することが可能である。各細胞は、生
物学的試料が別の標的配列(例えばHIV)を含むかどう
かにかかわりなく、この内部標準を(2倍体細胞中に)
2コピー含んでいるので、各試料は内部標準から生ずる
陽性の増幅信号を発することが期待される。Groundine
et al.,Nucleic Acids Research 12、1427(1984)およ
びMcknight,Cell 31、355(1982)を参照されたい。ま
た、英国特許出願公開第2187283 A号(1987年9月3日
発行)を参照されたい。
3.好適な態様の詳細な説明 その態様の1つとして、本発明は式I: 〔ここで(第一サブセグメント)tは(第二サブセグメ
ント)tの3′末端に隣接する少なくとも10ヌクレオチ
ドの既知配列の核酸セグメントであり、(第二サブセグ
メント)tは0またはそれ以上のヌクレオチドの核酸セ
グメントであり、そして(第三サブセグメント)t
(第二サブセグメント)tの5′末端に隣接する少なく
とも10ヌクレオチドの既知配列の核酸セグメントであ
る〕で表される標的核酸セグメントの増幅方法に関し、
その方法は: (1)上記標的セグメントの(第一サブセグメント)t
に、式II: 〔ここで(プロモーター)1はバクテリオフアージDNA依
存性RNAポリメラーゼ特異的プロモーターのプラス鎖の
配列を有する1本鎖DNAセグメントであり、(可変サブ
セグメント)1は(プロモーター)1の3′末端ヌクレオ
チドおよび(3′−プライマーサブセグメント)1
5′末端ヌクレオチドに隣接する0〜100ヌクレオチド
の1本鎖DNAセグメントであり、そして(3′−プライ
マーサブセグメント)1は(第一サブセグメント)t
3′末端ヌクレオチドで終わる(第一サブセグメント)
tのサブセグメント配列に相補的な配列を有する少なく
とも10ヌクレオチドの1本鎖DNAセグメントであり、
(可変サブセグメント)1が0ヌクレオチドである場
合、(プロモーター)1は(3′−プライマーサブセグ
メント)1の5′末端に隣接する〕 で表される3′末端サブセグメントから成る1本鎖DNA
の第一プライマーをハイブリダイズさせ; (2)工程(1)に従つてハイブリダイズさせた第一プ
ライマーを、第一DNAポリメラーゼにより触媒される反
応で伸長させて、式III: 〔ここで(第一サブセグメント)tcは(第一サブセグメ
ント)tに相補的な配列を有するDNAセグメントであり、
(第二サブセグメント)tcは(第二サブセグメント)t
に相補的な配列を有するDNAセグメントであり、そして
(第三セグメント)tcは(第三サブセグメント)tに相
補的な配列を有するDNAセグメントである〕 で表されるサブセグメントから成る第一の相補DNAセグ
メントを形成させ(但し、標的セグメントがRNAセグメ
ントである場合、第一DNAポリメラーゼは逆転写酵素で
ある); (3)工程(2)の反応で形成された2本鎖核酸を1本
鎖となし; (4)式IIIの第一相補DNAの(第三サブセグメント)tc
に、式IV: 〔ここで(5′−プライマーサブセグメント)2は(第
三サブセグメント)tの5′末端ヌクレオチドで終わる
(第三サブセグメント)tのサブセグメント配列を有
し、(可変サブセグメント)2は(5′−プライマーサ
ブセグメント)2の5′末端に隣接する0〜100ヌクレオ
チドのセグメントである〕 で表される少なくとも10ヌクレオチドの1本鎖DNAの第
二プライマーをハイブリダイズさせ; (5)工程(4)に従つてハイブリダイズさせた第二プ
ライマーセグメントを第二DNAポリメラーゼによつて触
媒される反応で伸長させて、式V: 〔ここで(可変サブセグメント)1cは(可変サブセグメ
ント)1に相補的な配列を有するDNAセグメントであり、
(プロモーター)1cは(プロモーター)1に相補的な配
列を有するDNAセグメントである〕 で表されるサブセグメントから成る第二相補DNAセグメ
ントを形成させ(但し、第二DNAポリメラーゼは第一DNA
ポリメラーゼと同一であつても異なつていてもよい);
そして (6)工程(5)の2本鎖産物を、(プロモーター)1
である一方の鎖のプロモーターを認識する第一のバクテ
リオフアージDNA依存性RNAポリメラーゼにより触媒され
る反応において鋳型として使用して、式VI: 〔ここで(可変サブセグメント)1rは(可変サブセグメ
ント)1の配列を有するRNAセグメントであり、(第一サ
ブセグメント)tcrは(第一サブセグメント)tに相補的
な配列を有するRNAセグメントであり、(第二サブセグ
メント)tcrは(第二サブセグメント)tに相補的な配列
を有するRNAセグメントであり、(第三サブセグメン
ト)tcrは(第三サブセグメント)tに相補的な配列を有
するRNAセグメントであり、そして(可変サブセグメン
ト)2crは(可変サブセグメント)2に相補的な配列を有
するRNAセグメントである〕 で表される第一RNA産物を形成させる; ことから成つている。
別の態様として、本発明は、(第一サブセグメント)
tが少なくとも10ヌクレオチドの鎖長であつて式XIII: 〔ここで(第一サブセグメント)t2またはそれ以上のヌ
クレオチドを有し、0より多い場合は(第一サブセグメ
ント)t1の3′末端に隣接し、そして(第一サブセグメ
ント)t1は少なくとも10ヌクレオチドの鎖長である〕で
表され;(第三サブセグメント)tが式XIV: 〔ここで(第三サブセグメント)t2−は0またはそれ以
上のヌクレオチドを有し、0より多い場合は(第三サブ
セグメント)t1の5′末端に隣接し、そして(第三サブ
セグメント)t1は少なくとも10ヌクレオチドの鎖長であ
る〕で表され;(3′−プライマーサブセグメント)1
が(第一サブセグメント)t2の全部と(第一サブセグメ
ント)t1の0またはそれ以上のヌクレオチドから成る標
的セグメントのサブセグメントに相補的な配列を有し;
(5′−プライマーサブセグメント)2が(第三サブセ
グメント)t2の全部と(第三サブセグメント)t1の0ま
たはそれ以上のヌクレオチドから成るサブセグメントで
あり;そして上記の工程(1)〜(6)の後に、下記の
工程(7)〜(12)から成る方法によつて式VII: 5′−(第一サブセグメント)t1cr−(第二サブセグメ
ント)tcr−(第三サブセグメント)t1cr−3′ 〔ここで(第一サブセグメント)t1crは(第一サブセグ
メント)t1に相補的な配列を有するRNAセグメントであ
り、そして(第三サブセグメント)t1crは(第三サブセ
グメント)t1に相補的な配列を有するRNAセグメントで
ある〕で表されるRNAサブセグメントがさらに増幅され
る方法を提供する: (7)式VIの第一RNA産物に、式VIII: 〔ここで(プロモーター)3はバクテリオフアージDNA依
存性RNAポリメラーゼ特異的プロモーターのプラス鎖の
配列を有する1本鎖DNAセグメントであり、該(プロモ
ーター)3の配列は(プロモーター)1の配列と同一であ
つても異なつていてもよく、(可変サブセグメント)3
は(プロモーター)3の3′末端ヌクレオチドおよび
(3′−プライマーサブセグメント)3の5′末端ヌク
レオチドに隣接する0〜100ヌクレオチドの1本鎖DNAセ
グメントであり、そして(3′−プライマーサブセグメ
ント)3は(第三サブセグメント)t1と同じ配列を有し
且つ(可変サブセグメント)3が0ヌクレオチドである
場合は(プロモーター)3の3′末端ヌクレオチドに隣
接する1本鎖DNAセグメントである〕の3′末端サブセ
グメントから成る1本鎖DNAの第三プライマーをハイブ
リダイズさせ; (8)工程(7)に従つてハイブリダイズさせた第三プ
ライマーを、第三DNAポリメラーゼ(逆転写酵素であ
り、上記の第一および第二DNAポリメラーゼと同一であ
つても異なつていてもよい)により触媒される反応で伸
長させて、式IX: 〔ここで(可変サブセグメント)1cは(可変サブセグメ
ント)1に相補的な配列を有するDNAである〕の3′末端
サブセグメントから成る第三の相補DNAセグメントを形
成させ; (9)工程(8)の反応で形成された2本鎖核酸を1本
鎖となし; (10)工程(8)の反応で形成された第三の相補DNA
に、式X: {ここで(可変サブセグメント)4は0〜100ヌクレオチ
ドのセグメントであり、そして(5′−プライマーサブ
セグメント)4は、(可変サブセグメント)4が0より多
いヌクレオチドを有する場合、(可変サブセグメント)
4の3′ヌクレオチドに隣接し且つ式XX: 〔ここで(第一サブセグメント)t2cは(第一サブセグ
メント)t2に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
り、(第一サブセグメント)t1cは(第一サブセグメン
ト)t1に相補的な配列を有するDNAセグメントである〕
のセグメントの少なくとも10個のヌクレオチドから成る
既知配列のサブセグメントである、但し上記の少なくと
も10個のヌクレオチドのうち少なくとも1個は(第一サ
ブセグメント)t1cの5′末端ヌクレオチドに存在する
か、またはその5′末端ヌクレオチドから5′側に存在
する}の第四プライマーをハイブリダイズさせ; (11)工程(10)に従つてハイブリダイズさせた第四プ
ライマーを第四DNAポリメラーゼ(第一、第二および第
三DNAポリメラーゼと同一であつても異なつていてもよ
い)により触媒される反応で伸長させて、式XI: 〔ここで(第二サブセグメント)tcは(第二サブセグメ
ント)tに相補的な配列を有するDNAセグメントであり、
(第三サブセグメント)t1cは(第三サブセグメント)
t1に相補的な配列を有するDNAセグメントであり、(可
変サブセグメント)3cは(可変サブセグメント)3に相
補的な配列を有するDNAセグメントであり、そして(プ
ロモーター)3cは(プロモーター)3に相補的な配列を
有するDNAセグメントである〕のセグメントから成る第
四の相補DNAを形成させ;そして (12)工程(11)の2本鎖産物を、第二のバクテリオフ
アージDNA依存性RNAポリメラーゼ(上記の第一バクテリ
オフアージDNA依存性RNAポリメラーゼと同一であつても
異なつていてもよく、(プロモーター)3である一方の
鎖のプロモーターを認識する)により触媒される反応に
おいて鋳型として用いて、式XII: 〔ここで(可変サブセグメント)3rは(可変サブセグメ
ント)3の配列を有するRNAセグメントであり、(第三サ
ブセグメント)t1rは(第三サブセグメント)t1の配列
を有するRNAセグメントであり、(第二サブセグメン
ト)trは(第二サブセグメント)tの配列を有するRNAセ
グメントであり、(第一サブセグメント)t1rは(第一
サブセグメント)t1の配列を有するRNAセグメントであ
り、(可変サブセグメント)4crは(可変サブセグメン
ト)4に相補的な配列を有するRNAセグメントであり、そ
してX12は(第一サブセグメント)t1cの5′末端から
5′側にある(5′−プライマーサブセグメント)4
サブセグメントに相補的な配列を有するRNAセグメント
である〕の5′末端サブセグメントを有する第二RNA産
物を形成させる。
上述したように、本発明はまた本発明の増幅法を実施
するためのキツトを提供する。第一RNA産物を作る本発
明方法の場合には、本発明キツトは2つのプライマー、
対応するバクテリオフアージDNA依存性RNAポリメラー
ゼ、およびDNAポリメラーゼを含むであろう。第一RNA産
物と第二RNA産物の両方を作る本発明方法を実施するた
めのキツトは、4つの適当なプライマー(1組2つのプ
ライマーを2組)と対応するポリメラーゼを含むであろ
う。
本発明に従つて標的セグメントを増幅することを含む
核酸ハイブリダイゼーシヨンプローブ検定を実施するた
めの本発明方法およびキツトは、それぞれ増幅方法の工
程およびキツトの成分のほかに、本発明増幅方法により
生ずるRNA産物を検出するのに必要な工程および成分を
包含する。当業者は当分野で知られた多数の核酸プロー
ブハイブリダイゼーシヨン検定法の増幅工程から得られ
るRNA産物を検出するのに必要とされる種々の追加工程
および成分に精通しているであろう。標識RNA増幅のビ
ーズ捕獲を伴う好適な核酸プローブハイブリダイゼーシ
ヨン検定法が以下の実施例IIに示される。
(3′−プライマーサブセグメント)1、(5′−プ
ライマーサブセグメント)2、(3′−プライマーサブ
セグメント)3および(5′−プライマーサブセグメン
ト)4は20〜40ヌクレオチドを有し、より好ましくは、
増幅しようとする標的セグメントの末端に種々のプライ
マーが結合する特異性を高めるために約30ヌクレオチド
を有するのが好適である。
(第一サブセグメント)tおよび(第三サブセグメン
ト)tの選択により増幅のために選ばれる対象の標的核
酸セグメントは、(第二サブセグメント)trが少なくと
も30、より好ましくは少なくとも約50、のヌクレオチド
を有するように選ばれるのが好適である。これによりプ
ライマーサブセグメントのどれとも重複しない配列を有
する核酸プローブの標的として、増幅RNA産物中の(第
二サブセグメント)tcrまたは(第二サブセグメント)
trを使用することが可能である。
バクテリオフアージDNA依存性RNAポリメラーゼは1000
bpよりも長い鋳型を使用し得るが、それらの転写効率は
鋳型が長くなるにつれて低下する。従つて、1000塩基長
より短い標的セグメントが好適である。
TASの第二サイクルにおいてRNAを作るために、RNA合
成で用いるプライマーは同一の組を使用するのが好まし
い。RNAの製造のところで述べたように、プライマー対
は重複すべきでない。RNAの製造が望まれる本発明方法
を実施する場合に、(5′−プライマーサブセグメン
ト)4に相補的な配列を有する標的セグメントのサブセ
グメントは(3′−プライマーサブセグメント)1に相
補的な配列を有する標的セグメントのサブセグメントか
ら5′方向にあつて、それと重複しないであろう。同様
に、(3′−プライマーサブセグメント)3と同じ配列
を有する標的セグメントのサブセグメントは(5′−プ
ライマーサブセグメント)2と同じ配列を有する標的セ
グメントのサブセグメントから3′方向にあつて、それ
と重複しないことが好ましい。この計略は、同一部位に
対する異なるプライマーの競合を減じ、それによつて本
発明の増幅効率を著しく高めるので有益であるだろう。
重ね合わせたプライマーの組に若干の重複が存在する場
合は、第二組のプライマーを使用する前に未使用の第一
組プライマーを除くことが好ましい。
本発明の焦点は、ある種のプロモーターに対する特異
性ゆえに、バクテリオフアージDNA依存性RNAポリメラー
ゼに集中している。特定のプロモーターに対して同様に
高い特異性を示す他のポリメラーゼもバクテリオフアー
ジポリメラーゼの代わりに本発明において利用され、本
発明はこのような他のポリメラーゼも包含するものであ
る。
好適なバクテリオフアージDNA依存性RNAポリメラーゼ
はT7、T3およびSP6からのものである。これらのポリメ
ラーゼと共に使用するのに適したプロモーターは実施例
および請求の範囲に記載されるが、これらのポリメラー
ゼ用の他のプロモーターも当分野で数多く知られてお
り、同様に使用できる。
さらに、好適な3種以外のバクテリオフアージからの
ポリメラーゼ、およびこのような他のポリメラーゼによ
つて認識されるプロモーターも本発明に従つて使用され
る。
本発明方法で用いるDNAポリメラーゼとしては、5′
→3′エキソヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼ
および逆転写酵素を用いるのが好適である。本方法の全
工程において、1種類のDNAポリメラーゼを用いるのが
最も好ましい。最適なDNAポリメラーゼはAMV逆転写酵素
および組み換えMMLV逆転写酵素である。しかしながら、
Thermus aquaticusからの熱安定性DNAポリメラーゼ(Ch
ien et alJ.Bacteriol127、1550(1976)を参
照)、米国オハイオ州クリーブランドU.S.Biochemicals
社からの商標名Sequenaseという組み換えT7 DNAポリメ
ラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼIの公知のKlenow断
片、およびウシ胸腺DNAポリメラーゼαのような他のポ
リメラーゼも許容される。
“可変サブセグメント”は種々のプライマーに任意に
含まれ、3つの機能を果す。実際、それらは“多目的サ
ブセグメント”とより適切に呼ぶことができる。まず第
一に、プロモーターを含む第一および第三プライマーに
おいて、そのプロモーターサブセグメントは好ましくは
そのプロモーターに対応するRNAポリメラーゼによつて
認識される転写開始配列を含む。第二番目は、すべての
プライマーにおいて、可変サブセグメントは増幅からの
RNA産物が核酸プローブハイブリダイゼーシヨン検定で
検出できるように特定のセグメントを任意に含むことが
できる。実際、増幅(および検定)は認識セグメント
(例えば(3′−プライマーサブセグメント)1)を異
にするが共通の可変サブセグメントを含むプライマーの
組を用いることにより、いくつかの異なる標的セグメン
トにおいて同時に行われる。また、可変セグメントはそ
の後のクローニングを容易にするための制限部位を多数
もつているポリリンカー配列を含むこともできる。最後
に、可変サブセグメントはQβレプリカーゼ(Mieleら
の上記文献参照)のようなバクテリオフアージRNA特異
的RNAポリメラーゼによりRNA産物を(自己触媒的に)複
製させるのに必要な配列、およびコートmRNAの合成を促
進する植物ウイルスのRNA−3クロモソームからのBMV配
列を、増幅からのRNA産物に組み入れるために使用され
る。Ahlquist et al.,J.Mol.Biol172、369(1984);A
hlquist et al.,Plant Mol.Biol.3、37(1984);Ahlqui
st et al.,J.Mol.Biol.153、23(1981);Miller,et a
l.,Nature 313、68(1985);Miller et al.,Virology
125、236(1983);およびOu et al.,PNAS 79、5235(1
982)を参照されたい。
Qβレプリカーゼ(当分野で知られている)の場合
は、(可変サブセグメント)2に配列: を挿入し、(可変サブセグメント)1に配列: を挿入し、その後第一RNA産物(すなわち、第1図のRNA
I;第4図も参照)を(自己触媒的に)複製させるか、
あるいは(可変サブセグメント)4に配列: を挿入し、(可変サブセグメント)3に配列: を挿入し、その後第二RNA産物(すなわち、第1図のRNA
II;第4図も参照)を(自己触媒的に)複製させること
により有利に実施できる。
BMVレプリカーゼ(これも既知である)を使用する場
合は、(下記のHIV実施例の特定使用において)可変配
列2(塩基1−25)中に次のBMV配列: (54塩基)をコア配列として含めることにより有利に実
施され、さらにBMVからのレプリカーゼ活性を高めるた
めにその5′末端にAUに富む配列を挿入することもでき
る。このオリゴは第二プライマーとして使用される。こ
の第二プライマーと共に用いられる第一プライマーはT7
に由来するHIV特異的プライマーである。
本発明の理解に役立つ非制限的細部を以下の実施例に
おいて示すことにする。
4.実施例 実施例I ヒト免疫不全ウイルス−1型(HIV−1)に感染した
疑いのある患者から採取した血液10mlをSepracellTM
置(米国オクラホマ州オクラホマシテイ、Sepratech
社)により、あるいはフイコール勾配により分画化して
リンパ球を分離する。その後リンパ球を溶解し、それら
からの核酸をExtractor(米国カリフオルニア州サンジ
エゴ、Molecular Biosystems社)で分離するか、あるい
は別法として、リンパ球を標準的なドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS)−酵素処理により溶解し、核酸をDEAEセル
ロースの逆相クロマトグラフイーにかけて分離する。こ
れは次のようにして行われる: 細胞を沈殿させる:1mlのTris緩衝液(TBS)、pH7.5、
から5K rpmで4分。
上清を除く。
ペレツトを下記溶液に再懸濁する: 激しくボルテツクス攪拌し、50℃で45分インキユベー
トする(その間10ごとに10〜15秒ボルテツクス混合を行
う)。
排水した抽出器カラムにかける。
カラムを1×4mlの0.3M NaCl/20mM Tris,pH7.5、で洗
う。
4mlの0.5M NaCl/20mM Tris,pH7.5、でDNA/RNAを溶出
する。
溶出物に次の諸成分を加える: 5μl グリコーゲン 400μl 3M NaOAc 9.0ml 氷冷 EtOH 十分に混合 −20℃で一晩沈殿させる。ドライアイス/エタノール
浴を1時間使用してもよい。
スイングバケツトローターで10,000rpm、15分遠心
し、EtOHをデカントし、キムワイプ(Kimwipe)で2分
乾かす。
10分凍結乾燥する。
170μl TEにペレツトを再懸濁する。
37℃で5分インキユベートする。
次のようにして1mlスピンカラムを調製する: 1mlシリンジに少量のガラスウール(オートクレーブ
滅菌済)を詰める。
シリンジをピロ炭酸シエチル(DEPC)で処理した(TE
(Tris−EDTA)で満たす。
すばやくセフアデツクスG−50(TE中;オートクレー
ブ滅菌)を加える。
固体マトリツクスがシリンジの頂部に山のように堆積
するまで加え続ける。
TECテーブルトツプ遠心機で1000rpm、30秒遠心する。
100μl TEで洗い、中間速度(約1000rpm)で1分遠心
し、洗液を捨てる。
抽出物をカラムに入れ、再度1分間遠心する。
150μl TEですすぎ、1000rpmで1分遠心する。すすぎ
液と最初の画分をプールする。この段階で多数の反応の
ために試料を分割してもよい。
1/10容量の8M LiClを加える。2.5×容量の100% EtOH
と混合する。十分にボルテツクス混合を行う。ドライア
イス/EtOHで30分沈殿させる。
微量遠心機を用いて4℃、最高速度で15分遠心する。
ペレツトを乾かす。
分離後、試料からの全核酸を100μlのTE緩衝液(10m
M Tris.Cl,1mM EDTA,pH8)に溶解する。100μlの全核
酸のうち10μlを次の諸成分: 40mM Tris.Cl,pH8 25mM NaCl 10mM MgCl2 10mM ジチオトレイトール(DTT) 2mM スペルミジン 100μg/mlウシ血清アルブミン 400mMずつのdATP、dCTP、dGTPおよびTTP を含む混合物中に溶解して最終容量を100μlとする。
次の配列: で表わされる30nMの101塩基の1本鎖DNAプライマーAを
加える。配列: で表される30nMの29塩基のDNAプライマーBを加える。
第二プライマーであるプライマーBはHIV−1のSOR遺伝
子中の塩基5151−5179の配列を有する。第二プライマー
の別のセグメントはHIV−1のSOR遺伝子の塩基5357−53
87に対応し、配列: で表され、使用する場合はこれも30nM加えられる。プラ
イマーAは第一プライマーであり、その64個の5′−ヌ
クレオチドはSP6 DNA依存性RNAポリメラーゼに対するプ
ロモーターのプラス鎖を形成する。配列:5′−GAATAC−
3′のセグメントは(可変サブセグメント)1であり、
転写開始部位(5′−G)とSP6 RNAポリメラーゼによ
つて明らかに好まれる他の塩基類を5′末端に含んでい
る。最後に、31個の3′末端ヌクレオチドは(プライマ
ーサブセグメント)1を形成し、HIV−1単離物のSOR遺
伝子の塩基5577−5547の配列に相補的な配列を有する
(完全な配列についてはRatner et al.,Nature 313、277
(1985)を参照されたい。)(HIV単離物はこれらの実
施例において“HIV−1"と表される。) これらの実施例で用いる全てのオリゴヌクレオチドは
Applied Biosystems社(米国カリフオルニア州フオスタ
ーシテイ)の自動合成機(380A型)を用いて固相合成に
より作られ、C8逆相カラムを用いるHPLCにより本質的に
均一にクロマトグラフイー精製されることに注意された
い。これとは別に、他の市販されている合成機と標準精
製法を用いてオリゴヌクレオチドを製造することもでき
る。
100μlの溶液を65℃で2分加熱し、その後1分間で4
2℃に冷却する。この加熱および42℃またはそれ以上で
の保持は、溶液の組成と組み合わせて、(3′−プライ
マーサブセグメント)1をそれに相補的な配列へ高度に
特異的に且つDNA合成を開始させるに足る安定した状態
でハイブリダイズさせるのに十分なストリンジエント条
件を提供する。
その後、この溶液に10単位のトリ筋芽球症ウイルス
(avian myoblastosis virus:AMV)の逆転写酵素または
500単位の組み換えモロニーマウス白血病ウイルス(Mol
oney murine leukemia virus:MMLV)の逆転写酵素(米
国フロリダ州St.ピータースバーグ、Life Sciences社か
ら購入)を加え、42℃で10分インキユベートする。(Ho
uts et al.,J.Virol29、517(1979)によつて定めら
れる鋳型−プライマーとしてポリ(A)オリゴ(T)12-18
を使用し、37℃、10分間で1n moleのTTPを酸沈殿形体へ
組み入れるのに要する量を1単位とする。10分インキユ
ベーシヨン後、この溶液を沸騰水浴に1分間入れる。こ
の加熱は逆転写酵素により形成された2本鎖核酸の鎖分
離を起こさせる。
その後、この溶液を1分かけて42℃に冷却する。この
冷却の間に、第二プライマーが逆転写酵素により触媒さ
れる反応において形成された標的セグメントの相補鎖の
3′末端セグメントにハイブリダイズする。この場合
も、ハイブリダイゼーシヨン条件は第二プライマーとそ
れに相補的な配列との十分に特異的なハイブリダイゼー
シヨンのために十分にストリンジエントである。
冷却後、追加の10単位のAMV逆転写酵素または500単位
のクローン化MMLV逆転写酵素を加え、42℃で10分さらに
インキユベートする。
次に、米国ウイスコンシン州マジソン、Promega Biot
ec社からのRNasinR(商品名)リボヌクレアーゼ阻害剤
を1単位/mlの濃度で(任意に)加える。(1単位は50n
gのリボヌクレアーゼAの活性を50%阻害するのに必要
な阻害剤の量である。Roth,Meth.Cancer Res.3、151(1
976)さらに、リボヌクレオシド−5′−三リン酸ATP、
GTP、CTPおよびUTPをそれぞれ400mMずつ加える。最後
に、Promega Biotec社から購入した10〜20単位のSP6 DN
A依存性RNAポリメラーゼを加え、この溶液を42℃で30〜
60分インキユベートする。(1単位は標準反応条件(40
mM Tris.Cl.pH7.9、6mM MaCl2,10mM DTT、2mMスペルミ
ジン、0.5mMずつのATP、GTP、CTPおよびUTP、0.5Ciの3H
−CTP、1gのSP6 DNAおよび酵素;全容量50μl)下37
℃、60分で1n moleのリボヌクレオシド三リン酸を酸不
溶性産物へ組み入れる反応を触媒するのに必要なRNAポ
リメラーゼの量である。) その後、次のオリゴヌクレオチドを加えてその濃度を
それぞれ30nMとする: 第三プライマーにおいて、5′末端の64塩基は第一プ
ライマーと同様にプロモーターセグメントであり、次の
6塩基は可変セグメントである。この可変セグメントは
SP6 RNAポリメラーゼによりプロモーターから転写され
る最初の6個の塩基であり、これらの塩基はこのような
転写レベルを高めるために選ばれる。最後に、第三プラ
イマーの(3′−プライマーサブセグメント)3部分は
3′末端の33塩基であり、HIV−1のシヨート・オープ
ン・リーデイング・フレーム(SOR)遺伝子中の塩基538
8−5420と同じ配列である。第四プライマーはHIV−1の
SOR遺伝子の塩基5546−5517の配列に相補的な配列を有
する。
第三および第四プライマーの添加後、この溶液を42℃
で1分インキユベートする。この期間中に、第三プライ
マーの(3′−プライマーサブセグメント)3とSP6 RNA
ポリメラーゼにより触媒される反応で形成された第一RN
Aとの間にハイブリダイゼーシヨンが起こる。ハイブリ
ダイゼーシヨン条件がストリンジエントであるために、
(3′−プライマーサブセグメント)3は第一RNAの相補
配列のセグメントに対して高度に特異的に、しかもDNA
合成を開始させるべく十分安定した状態でハイブリダイ
ズする。
インキユベーシヨン後、10単位のAMV逆転写酵素また
は500単位のクローン化MMLV逆転写酵素を加え、この溶
液を42℃で10分インキユベートして第三の相補DNAを形
成させる。
この溶液はその後沸騰水浴中に1分間置き、1分かけ
て42℃で冷却し、これにより第三相補DNAと第一RNAから
成る2本鎖を1本鎖となし、次に第四プライマーと第三
相補DNAとをハイブリダイズさせる。他のハイブリダイ
ゼーシヨンと同様に、この条件は十分にストリンジエン
トであるので、第四プライマーのハイブリダイゼーシヨ
ンは第四プライマーに相補的な配列の第三相補DNAのセ
グメントに対し高度に特異的に、かつDNA合成を開始さ
せるに足る安定した状態で起こる。
その後、再び、10単位のAMV逆転写酵素または500単位
のクローン化MMLV逆転写酵素を加え、42℃で10分インキ
ユベートする。
続いて、RNasinR(商品名)リボヌクレアーゼ阻害剤
を1単位/mlの濃度で(任意に)加え、その後10〜20単
位のSP6 RNAポリメラーゼを加えてこの溶液を42℃で30
分〜1時間インキユベートする。
得られた第二RNAは核酸プローブハイブリダイゼーシ
ヨン法により検出することができる。
実施例II 実施例Iの方法に従うが、以下で述べるような変更を
有し、3種類の試料:(A)HIVを含まないヒト血液10m
l、(B)約103HIV−1感染細胞/mlを有する培養物10m
l、および(C)HIV−1に感染した疑いのあるヒトから
の血液10mlを用いる。この方法の変更は、第二RNAを作
るためのSP6 RNAポリメラーゼにより触媒される反応中
に基質としてα−32P−標識リボヌクレオシド三リン酸
を加えるという点である。その結果、第二RNAは32P−標
識される。
セフアクリル−S500TMマクロ孔質ビーズはカルボキシ
ル基末端リンカー(式−C(=NH)NH(CH2)5CO2−で表
されるもの)を用いて誘導体化し、続いてHIV−1のSOR
遺伝子中の塩基5357−5387の配列に相補的な配列である
配列: の5′−(6−アミノヘキシルホスホルアミデート)−
誘導体化オリゴヌクレオチドを用いて誘導体化する。
(SOR遺伝子の塩基4901−4932の配列は、試料からの核
酸の増幅中に作られる第二RNAに見いだされる。)ビー
ズの作製は1986年8月11日付けの米国特許出願第895756
号(参照によりここに引用される)に記載される方法に
従つた。要約すると、支持材料はアミノ末端リンカーで
誘導体化された多孔質のケイ酸ガラスまたはマクロ孔質
の架橋デキストラン(その際、捕獲プローブの末端ヌク
レオシドにホスホルアミデート基を介して共有結合され
ていないアミノ基は実質的に全部、脂肪族アシル基をも
つ核酸と非特異的に相互作用しないように遮断され
る);臭化シアンで活性化されたマクロ孔質架橋デキス
トラン(アミンと反応してアミノアルキルホスホルアミ
デート誘導体化オリゴヌクレオチドに結合する);カル
ボキシル末端リンカーまたはスクシンイミドエステル末
端リンカーで誘導体化された多孔質ケイ酸ガラス、マク
ロ孔質架橋デキストランまたはジビニルベンゼン架橋ポ
リスチレン(カルボキシル基の部分はジアミノアルカン
の1つのアミノ基にアミド結合で結合され、ジアミノア
ルカンの他方のアミノ基はホスホルアミデートの一部で
あつて、その後捕獲プローブの末端ヌクレオシドに直接
結合される)である。好適な支持材料は米国イリノイ州
ロツクフオード、Pierce Chemical社からそれぞれ製品
番号24875および23735として市販されている呼称孔径50
0オングストローム、粒径約125〜177ミクロンのビーズ
の形をした、長鎖アルキルアミン−誘導体化およびカル
ボキシル−誘導体化コントロールドポアガラス(contro
lled pore glass)、および米国ニユージヤージー州ピ
スカタウエー、Pharmacia社からコード番号17−0475−0
1として市販されている湿潤直径約40〜105ミクロンおよ
び約2×107ダルトン以上の分子量をもつデキストラン
の排除容量を有するビーズの形をした、臭化シアンで又
はアミノ末端リンカーやカルボキシル末端リンカーで誘
導体化されたセフアクリルS−500である。1つの面に
おいて、その支持体は (A)ケイ素原子が (1)式−(CH2)n(NH)(CO)(CH2)cCH3および−(CH2)n(N
H)(PO2)O-(Oligo)の基 (式中、cは0〜5であり、nは2〜8であり、−O−
(Oligo)はオリゴヌクレオチドプローブであり、(Oli
go)に結合された炭素原子はプローブの5′−ヌクレオ
シドの5′−酸素または3′−ヌクレオシドの3′−酸
素である) で誘導体化された(但し、末端にアミノ基が付いた基で
誘導体化されたケイ素原子を実質的に含まない)、ある
いは、 (2)式−(CH2)n(NH)(CO)(CH2)mCO2Hおよび−(CH2)n(N
H)(CO)(CH2)m(CO)(NH)(CH2)pNH(PO2)O-(Oligo)の基 (式中m、nおよびpは同一であるか又は異なり、それ
ぞれ2〜8である) で誘導体化された、多孔質ケイ酸ガラス; (B)非誘導体化ヒドロキシル基を有する少なくとも1
個の隣接炭素原子をもつ糖部分の炭素原子上に存在する
ヒドロキシル酸素が (1)式−C(=NH)NH(CH2)q(NH)(CO)(CH2)cCH3およ
び −C(=NH)NH(CH2)p(NH)(PO2)O-Oligo)の基 で誘導体化された(但し、末端アミノ基を有する基で誘
導体化されたヒドロキシル酸素を実質的に含まない)、
あるいは、 (2)式−C(=NH)NH(CH2)qCO2Hおよび −C(=NH)NH(CH2)q(CO)(NH)(CH2)pNH(PO2)O-(Oligo)
の基 (式中c、qおよびpは同一であるか又は異なり、qは
2〜10である) で誘導体化された、架橋デキストランマクロ孔質材料;
および (C)フエニル基が 式−(CH2)SCO2Hおよび −(CH2)S(CO)(NH)(CH2)pNH(PO2)O-(Oligo)の基 (式中Sおよびpは同一であるか又は異なり、Sは2〜
10である) で誘導体化された、ジビニルベンゼン−架橋ポリスチレ
ン; のうちの1つである。Ghosh et al.,Nucleic Acids Res
earch 15、5353(1987)を参照されたい。
上記のような誘導体化されたセフアクリルビーズ50mg
を含む3つのバツチはそれぞれ0.1%SDS、10%デキスト
ラン硫酸、1mg/mlサケ精子DNA、および5×SSPE(0.75M
NaCl,50mM NaH2PO4,pH7.4、および5mM EDTA)を含有す
るプレハイブリダイゼーシヨン溶液250μl中に37℃で1
5分間浸漬する。浸漬後、ビーズ材料を遠心により沈殿
させ、プレハイブリダイゼーシヨン溶液を吸引除去す
る。
3つの試料のそれぞれに対する増幅法から得られた核
酸をエタノール沈殿により分離し、サケ精子DNAを除い
たプレハイブリダイゼーシヨン溶液と同じ溶液250μl
中に溶解する。その後、この核酸溶液のそれぞれをプレ
ハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチド誘導体化セフ
アクリルビーズの1つのバツチと混合し、得られた混合
物を穏やかに攪拌しながら42℃で90分インキユベートす
る。
セフアクリルビーズを遠心により沈殿させ、ハイブリ
ダイゼーシヨン溶液を吸引除去し、その後ビーズを2×
SSC(0.30M NaCl、0.03Mクエン酸Na、pH7.0)の溶液1ml
で37℃、10分、3回洗浄する。洗浄ごとに、ビーズを遠
心により沈殿させて洗液を吸引除去する。
3回目の洗浄後直ちにビーズをチエレンコフ(Cerenk
ov)カウンテイングにかける。
試料Aからの増幅核酸を有するビーズは、シンチレー
シヨン液体単独からのバツクグラウンドカウント数をか
ろうじて越える低レベルのカウント数を生ずる。試料B
からの増幅核酸を有するビーズは、試料Aと関係したビ
ーズの場合に観測されたレベルよりも一層高いレベルの
カウント数をもたらす。試料Cからの増幅核酸を有する
ビーズは、もしもそれらが試料Aと関係したビーズより
も有意に高いレベルのカウント数を生ずるならば、試料
Cのために採血されたヒトがHIV−1に感染しているこ
とを示す。
実施例III 実施例IおよびIIの方法は、SP6 RNAポリメラーゼの
代わりにT7 RNAポリメラーゼ(Promega Biotec社)を使
用し、第一プライマーのサブセグメント5′−(プロモ
ーター)1−(可変サブセグメント)1−3′および第三
プライマーのサブセグメント5′−(プロモーター)3
−(可変セグメント)3−3′がそれぞれ配列: (ここで17個の5′末端塩基はプロモーターサブセグメ
ントであり、4個の3′−塩基は可変セグメントであ
る)を有するプライマーを用いて実施する。可変セグメ
ントはプロモーターからの転写物の4個の5′末端塩基
に対応する。この方法ではどの工程においても、少なく
ともPromega Biotec社製のポリメラーゼを使用する場
合、リボヌクレアーゼ阻害剤を使用しない。
実施例IV 実施例IおよびIIの方法は、SP6 RNAポリメラーゼの
代わりにT3 RNAポリメラーゼ(カリフオルニア州サンジ
エゴ、Stragene社製)を使用し、第一プライマーの(プ
ロモーター)1−(可変サブセグメント)1サブセグメン
トおよび第三プライマーの(プロモーター)3−(可変
サブセグメント)3サブセグメントとして次の (ここで17個の5′末端塩基はプロモーターセグメント
であり、4個の3′末端塩基はプロモーターからの転写
物の4個の5′末端塩基に対応する可変セグメントであ
る)を用いて実施する。
実施例V 実施例IIIのようにT7 RNAポリメラーゼを使用し、ま
た実施例Iに記載したプライマーの代わりに次のプライ
マーを用いて、ヒト血液試料からのHIVゲノムの標的セ
グメントを増幅させる: 実施例VI 実施例IIIのようにT7 RNAポリメラーゼを使用し、ま
た実施例Iに記載したプライマーの代わりに次のプライ
マーを用いて、ヒト血液試料からのHIVゲノム中の標的
セグメントを増幅させる: 実施例VII 実施例Iの方法に従つて、1)106非感染CEM細胞と混
合した103HIV感染CEM細胞を含む試料(Cancer Center R
esearch Foundation,CCRF−CEM;ATCCNo.CCL119);およ
び2)106非感染CEM細胞を含む試料から核酸を分離す
る。これらの試料はExtractorTMカラム(MBI)から得ら
れた試料を濃縮するために、エタノール沈殿工程後100
μlの10mM Tris−HCl、pH7.4、1mM EDTA(TE)に再懸
濁する。再懸濁した試料はセフアデツクスG−50スピン
カラム(Maniatisの上記文献参照)にかけ、TEで溶出し
て分画化する。溶出した試料をエタノール沈殿(0.8M L
iCl、3倍容量のエタノール中、ドライアイス/エタノ
ール浴中で15分間)により濃縮する。濃縮した試料を遠
心によりペレツトとなし、そのペレツトを排水し、乾燥
し、その後40mM Tris−HCl、pH8.1、8mM MgCl2、25mM N
aCl、2mM スペルミジン、5mM ジチオトレイトール、100
μMずつのdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP、1mMずつのrAT
P、rCTP、rGTPおよびrUTP、100μg/ml BSA(ヌクレアー
ゼ不含)、250nMずつのDNAオリゴヌクレオチドプライマ
ーA: を含有する緩衝液100μlに再懸濁する。
対照として、0.01fmの濃度の精製HIV RNAを含む2通
りの試料を上記の緩衝液100μlに懸濁する。最後に、H
ind IIIで線状化したプラスミドHβ19A(Wallace et a
l.,Nuel.Acids Res9、3647(1981)中に含まれる10fm
のβ−グロビン配列を、オリゴヌクレオチドプライマー
を除いた上記の緩衝液100μlに懸濁する。オリゴヌク
レオチドプライマーD(5′−ACATTGCTTGTGACACAACTGT
GTTCA−3′)およびプライマーC(5′−TAATACGACTC
ACTATAGGGACAAAGGACTCAAA−3′)はβ−グロビン配列
に特異的であり、これらを250nMずつβ−グロビン反応
混合物に加える。
β−グロビン試料を除いた、反応混合物を65℃で1分
加熱する。β−グロビン試料は1分沸騰させる。全部の
試料を1分間42℃に冷却し、その後10単位のAMV逆転写
酵素を加える。これらの反応混合物を42℃で15分インキ
ユベートし、1分沸騰させた後42℃で1分冷却する。追
加の10単位のAMV逆転写酵素を加え、42℃で15分インキ
ユベートする。100単位のT7 RNAポリメラーゼを加え、
反応混合物を37℃で30分インキユベートする。
試料を1分沸騰させ、42℃で1分冷却し、続いて10単
位のAMV逆転写酵素を加える。反応混合物を42℃で15分
インキユベートし、1分沸騰させ、42℃で1分冷却す
る。追加の10単位の逆転写酵素を加え、その後42℃で15
分インキユベートする。100単位のT7 DNAポリメラーゼ
を加え、37℃で30分インキユベートする。このサイクル
をさらに2回繰り返す。
その後、増幅された標的は以下で述べるOligo Beade
TMを用いて検出する。
HIV−1特異的オリゴヌクレオチドを含むセフアクリ
ルビーズは記載される通りに作製し、250μlの懸濁液
が50mgのセフアクリルビーズを含むような濃度でTE中に
4℃で貯蔵する。オリゴヌクレオチドは記載される通り
に合成し、HPLCで精製する。
ビーズへの結合と検出の両方のために用いたオリゴヌ
クレオチドはHIV−1ゲノムのSOR領域に相同である。こ
れらの実験において用いたオリゴヌクレオチドは86−31
(オリゴヌクレオチドの検出)(5′−GCACACAAGTAGAC
CCTGAACTAGCAGACCA−3′)および87−83(ビーズ上で
のオリゴヌクレオチドの捕獲:(5′−ATGCTAGATTGGTA
ATAACAACATATT−3′)であり、これらはSOR領域や非セ
ンス鎖に相同であり、約100個のヌクレオチドにより隔
てられる。検出のために、オリゴヌクレオチドは標準プ
ロトコルに従つて32Pで末端標識した。組み込まれなか
つた標識はセフアデツクスG−50カラムでのゲル過に
より除き、オリゴヌクレオチドを−20℃で貯蔵した。
一般的なビーズを用いたサンドイツチハイブリダイゼ
ーシヨンシステム(BBSHS)の実験において、標的と32P
−標識検出用オリゴヌクレオチドはエツペンドルフチユ
ーブ中の0.2%SDSを含むTE10μl中で65℃、5分間変性
を起こさせる。これに、10μlの2×溶液ハイブリダイ
ゼーシヨン混合物(10×SSPE/10%デキストラン硫酸)
を加える。この溶液を混合し、2秒遠心し、42℃で1時
間インキユベートする。
その間に、セフアクリルビーズをプレハイブリダイズ
させる。ビーズの貯蔵懸濁液を十分に混合し、250μl
のアリコート(ビーズ50mg)を、それぞれの移し変えの
間混合して均一な懸濁液を保ちながら、エツペンドルフ
チユーブに移す。そのアリコートを10秒遠心し、TEを抜
き取り用パスツールピペツトを用いて除去する。250μ
lのハイブリダイゼーシヨン溶液(5×SSPE(0.9M NaC
l、50mM NaH2PO4、pH7.4、1mM EDTA)10%デキストラン
硫酸/0.1%SDS)を加え、ビーズを穏やかに攪拌しなが
ら懸濁し、37℃で30〜60分時々混合しながらインキユベ
ートする。捕獲工程の直前に、ビーズを10秒遠心し、プ
レハイブリダイゼーシヨン溶液を除き、37℃のハイブリ
ダイゼーシヨン溶液80μlを加えて、ビーズを37℃に戻
す。
溶液ハイブリダイゼーシヨンを2秒遠心し、ビーズと
ハイブリダイゼーシヨン溶液に移す。ビーズを懸濁さ
せ、時々混合して懸濁液を保ちながら37℃で1時間イン
キユベートする。
捕獲後、ビーズを10秒遠心し、未捕獲標的と検出用オ
リゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーシヨン溶液を
シンチレーシヨン計測器バイアルに移す。その後、ビー
ズを2×SSCにより37℃で5回洗う。初めの3回の洗浄
は迅速である;1mlの洗液を加え、ビーズを十分に混合し
て10秒遠心し、その洗液を計測用バイアルに移す。最後
の2回の洗浄では、1mlの洗液を加え、ビーズを混合
し、37℃で5分インキユベートした後遠心にかける。そ
れぞれの洗液はその手法を監視するために別々に計測す
る。
ハイブリダイゼーシヨン溶液、5つの洗液およびビー
ズのチエレンコフカウントは5〜10分間計測する。計測
器のバツクグラウンドを全ての試料から差し引く。検出
されたfm標的は次のようにして計算する: (ビーズのCPM/全CPM)×fmオリゴヌクレオチド ここで全CPMはハイブリダイゼーシヨン溶液、5つの洗
液およびビーズのCPMの合計である。
実施例VIII 実施例Iの方法に従つて、2つの試料:a)106非感染C
EM細胞を含む103HIV感染CEM細胞、およびb)106非感染
培養CEM細胞(抽出後0.01fmoleの精製HIVを加える)か
ら核酸を分離する。Extractorカラム工程後セフアデツ
クスG−50(フアイン)スピンカラム(Maniatisの上記
文献参照)に通しTEで溶出することによりさらに精製す
る。続いて、核酸のエタノール沈殿(0.8M LiCl中;2.5
倍容量のEtOH)を行う。その後核酸を下記成分を含む溶
液100μl中に再懸濁する: この溶液100μlを65℃で1分加熱し、1分にわたつ
て42℃に冷却する。この加熱およびその後の42℃または
それ以上での保持は、溶液の組成と組み合わせて、
(3′−プライマーセブセグメント)1(第1図参照)
をそれに相補的な標的HIV RNAの配列へ高度に特異的に
しかも十分に安定した状態でハイブリダイズさせるのに
足るストリンジエント条件を提供する。
その後、10単位のトリ筋芽球症ウイルス(AMV)逆転
写酵素(Life Sciences社)を加え、この溶液を42℃で1
0分インキユベートする。〔1単位はHouts et al. J.Vir
ol.29、517、(1979)に記載されるような鋳型−プライ
マーとしてポリ(A)オリゴ(T)12−18を用いて1nmo
lのTTPを酸沈殿形体へ37℃、10分で組み入れる。〕10分
インキユベーシヨン後、この溶液を1分間沸騰水浴に入
れる。この加熱は逆転写酵素により形成された2本鎖核
酸の鎖分離と逆転写酵素の不活化を起こさせる。
次に、この溶液を1分で42℃に冷却する。この冷却期
間中に、第二プライマー(プライマーB)が前工程で逆
転写酵素により触媒される反応から形成された標的相補
DNA鎖の3′末端(第三サブセグメント)t2c(第1図参
照)にハイブリダイズする。この場合も、ハイブリダイ
ゼーシヨン条件は第二プライマーとその第二プライマー
に相補的な配列とを特異的にハイブリダイズさせるのに
十分なストリンジエント条件である。
冷却後、追加の10単位のAMV逆転写酵素を加え、42℃
で10分さらにインキユベートする。
この反応混合物に100単位のT7ポリメラーゼを加え、3
7℃で30分インキユベートする。逆転写酵素により新た
に合成された2本鎖DNA鋳型の5′末端に存在するT7プ
ロモーターから出発して、もとの標的HIV RNAに相補的
なRNA転写物が合成される。この転写物は配列5′−GGG
Aを有し、その後に標的配列の第二サブセグメントに相
補的な配列(すなわち、第二サブセグメントter,第1図
参照)が続く、この工程以前では逆転写酵素は不活化さ
れておらず、しかもプライマーBおよびデオキシヌクレ
オチド三リン酸が存在するので、2回目の合成がこの段
階で起こる。プライマーBはそれに相補的な、新たに合
成されたRNA転写物(第三サブセグメント)t2cr(第1
図参照)の3′領域にハイブリダイズする。(前工程で
加えられた)逆転写酵素は鋳型として新たに合成された
RNA転写物(T7ポリメラーゼにより作られたもの)を使
用し、5′末端にプライマーとしてオリゴヌクレオチド
Bを用いてDNA鎖を合成する。
この反応混合物を1分沸騰させ、2本鎖RNA:DNAを変
性する。その後この混合物を1分で42℃へ冷却する。こ
の冷却工程中に、プライマーAの標的相補セグメントが
前工程で合成されたDNA鎖にハイブリダイズする。同時
に、プライマーBが前工程で合成されたRNA転写物の相
補配列にハイブリダイズする。
冷却後、追加の10単位のAMV逆転写酵素を加え、42℃
で10分さらにインキユベートする。逆転写酵素はプライ
マーとしてオリゴヌクレオチドAを使用し、また鋳型と
して前工程で作られたDNAを用いてHIV標的に相補的なDN
Aを合成する。第二DNA鎖はプライマーとしてオリゴヌク
レオチドBを、そして鋳型として前工程で作られたRNA
転写物を用いることにより合成される。
反応混合物を1分沸騰させて2本鎖DNAおよび2本鎖R
NA:DNAを変性する。この反応混合物を1分で42℃に冷却
する。プライマーAは前工程で鋳型としてRNA転写物を
用いて合成されたcDNAにハイブリダイズする。(鋳型鎖
の3′末端が逆転写酵素プライマーとして使用される場
合、次の反応の目的産物と同じ産物が作られる。)プラ
イマーBは標的HIV RNAに相補的なDNA鎖にハイブリダイ
ズする。この第二合成は5′末端にT7プロモーター配列
と4bpの“可変”セグメント5′−GGGA−3′を含む2
本鎖DNAの産物をもたらす。
この反応混合物に100単位のT7ポリメラーゼを加え
る。37℃で30分インキユベートする。T7 RNAポリメラー
ゼは鋳型として2本鎖T7プロモーターを含む2本鎖DNA
を使用して、5′末端に追加配列5′−GGGA−3′を含
む標的第二サブセグメントに相補的なRNAに転写する。
このサイクル(1分沸騰、42℃で1分、RT42℃で10
分、RT42℃で10分、T7ポリメラーゼ37℃で10分)は標的
配列の希望する増幅が得られるまで何回も繰り返すこと
ができる。得られた生産物はその後核酸プローブハイブ
リダイゼーシヨン技法により検出される。
実施例IX 1fmoleの濃度で精製HIV RNAを下記溶液に再懸濁す
る: この溶液100μlを65℃で1分加熱し、1分かけて42
℃に冷却する。この加熱および冷却工程は、溶液の組成
と組み合わせて、プライマーAを標的HIV RNAのプライ
マーA領域に相補的な配列〔(第一サブセグメン
ト)t2、第1図参照〕へ、十分安定した状態でしかも高
度に特異的にハイブリダイズさせるに足るストリンジエ
ント条件を提供する。
その後、10単位のトリ筋芽球症ウイルス(AMV)逆転
写酵素(Life Science社)を加え、この溶液を42℃で10
分インキユベートする。10分インキユベーシヨン後、溶
液を沸騰水浴中に1分入れる。この加熱は逆転写酵素に
より形成された2本鎖核酸の鎖分離および逆転写酵素の
不活化を引き起こす。
この溶液を1分にわたり42℃へ冷却する。この冷却中
に、第二プライマーBは新たに合成された標的相補鎖
〔または第1図の(第三サブセグメント)t2c〕の3′
末端へハイブリダイズする。この場合も、ハイブリダイ
ゼーシヨン条件は第二プライマーとその第二プライマー
に相補的な配列とを特異的にハイブリダイズさせるに足
るストリンジエント条件である。
冷却後、追加の10単位のAMV逆転写酵素を加え、42℃
で10分さらにインキユベートする。
この反応混合物に100単位のT7 RNAポリメラーゼ(New
Endland Biolabs社)を加える。その後37℃で30分イン
キユベートする。逆転写酵素により合成された2本鎖DN
A鋳型の5′末端に存在するT7プロモーターから出発し
て、もとの標的HIV RNAに相補的なRNA転写物が合成され
る。このRNA転写物は5′−GGGAの配列を有し、その後
に標的配列の第二サブセグメントに相補的な配列(すな
わち第二サブセグメントtcr、第1図)が続く。この工
程以前では、逆転写酵素は不活化されておらず、しかも
プライマーBとデオキシヌクレオチド三リン酸が存在す
るので、この段階において2回目の合成が起こる。プラ
イマーBはそれに相補的な、新たに合成されたRNA転写
物〔(第三サブセグメント)t2cr、第1図参照〕の3′
領域にハイブリダイズする。(前工程で添加された)逆
転写酵素は鋳型として新たに合成されたRNA転写物(T7
RNAポリメラーゼにより作られたもの)を使用し、また
5′末端にプライマーとしてオリゴヌクレオチドBを用
いてDNA鎖を合成する。
その後、反応混合物を1分間沸騰させてRNA:DNA2本鎖
を変性させる。次いで1分にわたつて42℃に冷却する。
この冷却工程中に、プライマーAの標的相補セグメント
が前工程で合成されたDNA鎖にハイブリダイズする。同
時に、プライマーBが前工程で合成されたRNA転写物の
相補配列にハイブリダイズする。
冷却後、10単位のAMV逆転写酵素を加え、42℃で10分
さらにインキユベーシヨンを実施する。逆転写酵素は
5′末端にプライマーとしてオリゴヌクレオチドAを使
用し且つ鋳型として前工程で合成したDNAを用いて、HIV
標的に相補的なDNAを合成する。鋳型鎖の3′末端をプ
ライマーとして使用すると、5′末端に2本鎖T7プロモ
ーター部位を有する最終の2本鎖DNAが合成される。第
二DNA鎖はプライマーとしてオリゴヌクレオチドBを、
鋳型として前工程で作られたRNA転写物を用いて合成さ
れる。
この反応混合物に100単位のT7ポリメラーゼを加え、3
7℃で30分インキユベートする。T7 RNAポリメラーゼは
鋳型として5′末端にポリメラーゼ結合部位(T7プロモ
ーター)を含む2本鎖DNAを用いてRNA転写物を合成す
る。このRNA転写物をその5′末端に追加配列5′−GGG
A−3′を含む標的第二サブセグメント(第1図参照)
に相補的なRNAである。増幅を高めるために、これ以上
のサイクルを繰り返し行つてもよい。得られた生産物は
核酸ハイブリダイゼーシヨン法により検出できる。
実施例X TAS増幅産物の最終回ラベリングプロトコル A.組み込まれなかつたヌクレオチドを除去するためのカ
ラム 1.最終TASサイクルでのcDNA合成後に、TAS反応混合物10
0μlを取り出す。これに試薬A(0.1M Tris−HCl、pH
7.7、10mMトリエチルアミン、1mM EDTAジナトリウム
塩)400μlを加える。
2.NENSORB20 TM(Dupont)プレパツクカラムのカラム材
料を100%メタノール(HPLC級)中で湿潤させることに
より平衡化し、次いで2mlの試薬Aで平衡化する。
3.カラムに試料を入れる。
4.カラムを1mlの試薬Aで3回洗う。
5.カラムを1mlの水で3回洗う。
6.核酸を50%メタノールで溶出し、250〜300μlの画分
を集める(総容量1ml以下)。(初めの2つの画分に大
部分の核酸が含まれるであろう。) 7.画分をスピード・バツク(speed−vac)または凍結乾
燥機で乾かす。
B.増幅産物のラベリングプロトコル 1.NENSORB20 TMカラムからの画分(最初の2画分を合わ
せてもよい)を40mM Tris−HCl、pH8.1、8mM MgCl2、25
mM NaCl、2mM スペルミジン(HCl)3、5mMジチオトレイト
ール、400μMずつのrATP、rCTP、およびrGTP、12μM
のrUTP、および25μCiのα−32P−rUTP(800Ci/mmol)
中に再懸濁する。
2.それぞれ50μlの試料に対して50単位のT7 RNAポリメ
ラーゼ(New England Biolabs)を加え、37℃で30分イ
ンキユベートする。
3.G−50スピンカラム(Maniatisらの上記文献)により
組み込まれなかつた標識を除く。
4.標識した試料をシークエンシング用のポリアクリルア
ミドゲルにかけて、増幅産物の大きさを決定する。標識
産物はOligo−BeadsTMを用いても検出できる。
実施例XI TAS増幅における内部標準の使用 試料i)0.1fmHIV RNAおよび0.1fm β−グロビンDNA
配列(Pst Iで切断したHβ19A);2)0.01fmHIV RNAお
よび0.1fm β−グロビンDNA(Pst Iで切断したHβ19
A);3)0.1fmHIV RNA;または4)0.1fm β−グロビンDN
A(Pst Iで切断したHβ19A)を40mM Tris−HCl、pH8.
1、8mM MaCl2、25mM NaCl、2mM スペルミジン−(HC
l)3、5mMジチオトレイトール、100μlずつのdATP、dTT
P、dCTPおよびdGTP、1mMずつのrATP、rUTP、rCTP、およ
びrGTP、100μg/ml BSA(ヌクレアーゼ不含)、および2
50nMプライマーA(5′−AATTTAATACGACTCACTATAGGGAC
ACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG−3′)、250nMプラ
イマーB(5′−ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA−
3′)、250nMプライマーC(5′−TAATACGACTCACTATA
GGGAACTAAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCC−3′)、および250
nMプライマーD(5′−ACATTGCTTCTGACACAACTGTGTTCA
−3′)を含有する溶液100μlに加えて調製した。1/2
0の出発核酸を含む試料をゼロ回試料として変性用溶液
7.4%ホルムアルデヒド、10×SSC(1.5M NaCl、0.15M
クエン酸Na、pH7.4)に入れた。
上記の試料を1分沸騰させ、42℃で1分冷却し、続い
て10単位のAMV逆転写酵素を加える。この反応混合物を4
2℃で15分インキユベートし、1分沸騰させ、42℃で1
分冷却する。追加の10単位のAMV逆転写酵素を加え、42
℃で15分インキユベートする。100単位のT7 RNAポリメ
ラーゼを加え、37℃で30分インキユベートする。このサ
イクルを2回繰り返す。(必要とされる増幅の程度に応
じて、それ以上のサイクルを行つてもよい。)1/20の出
発核酸を含む2つの試料を2回転写試料として変性用溶
液に入れた。
全ての試料を55℃で30分加熱し、その後2枚のニトロ
セルロース膜上に過した。254nmのUV光線を4分照射
することにより核酸を膜に固定した。対照として、全HI
VゲノムcDNAを含むプラスミドpARV7/2〔Luciw et al.
Nature 312,760(1984)〕およびプラスミドHβ19A〔W
allace et al.,Nucl.Acids Res.9,3647(1981)〕の
1、0.1および0.01fmを0.2N NaOH中で変性し、等容量の
2M酢酸アンモニウムで中和し、その後ニトロセルロース
膜上に過した。一方の膜はHIVの増幅産物を特異的な
32P−標識オリゴヌクレオチド86−311とハイブリダイズ
させた。他方の膜は増幅されたβ−グロビン産物および
標的β−グロビンプラスミドにハイブリダイズする32P
−標識オリゴヌクレオチド87−4592にハイブリダイズさ
せた。
ハイブリダイゼーシヨンは1% SDS、0.9M NaCl、50n
M NaH2PO4(pH7.4)、5mM EDTA(pH7.4)、および106cp
m/mの32P−標識オリゴヌクレオチド中で55℃で1時間行
つた。膜を1%SDS、0.18M NaCl、10mM NaH2PO4(pH7.
4)および1mM EDTA中室温で3回洗い、次に同一緩衝液
中55℃で1回洗つた。
その後、膜は1枚の増感スクリーンを使用してコダツ
クXARフイルム上−70℃で16時間オートラジオグラフイ
ーにかけた。
第3図のオートラジオグラフは、HIVおよびβ−グロ
ビン核酸に対して同時に実施した2サイクルのTAS後に
検出されたHIVとβ−グロビン配列の量を示す。β−グ
ロビンの出発量は一定のままであるが、HIV標的の量は
変化した。
本発明は本明細書においてかなり特定的に記載されて
いるが、関連分野において通常の知識を有する者は本発
明の精神に含まれる本発明の変更および修飾を認めるで
あろう。このような変更および修飾もまたここに記載の
本発明の範囲内に含まれるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コー,デボラ・ヤンティス アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールスバッド,ジャカランダ・アベニ ュー 2404 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 15/00 C12Q 1/68

Claims (55)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】核酸を含有する試料中の標的配列を増幅す
    る方法であって: (A)標的配列の第一セグメントに対応する配列に作動
    可能な状態で連結されたプロモーター配列を含む第一核
    酸プライマーであってその第一セグメントが標的配列の
    3′−末端を含むもの、および標的配列の第二セグメン
    トの配列に対し相補的な配列にハイブリダイズし得る第
    二核酸プライマーであってその第二セグメントが標的配
    列の5′−末端を含むものを用意し; (B)適当な条件下で、該第一核酸プライマーを核酸含
    有試料中の標的配列とハイブリダイズさせ; (C)ハイブリダイズした第一核酸プライマーをポリメ
    ラーゼ伸長反応により標的配列に対し相補的に伸長させ
    て、第一2本鎖核酸を形成し; (D)工程(C)でつくられた2本鎖を1本鎖となし; (E)得られたプロモーター配列含有鎖に適当な条件下
    で第二核酸プライマーをハイブリダイズさせ; (F)ハイブリダイズした第二核酸プライマーをポリメ
    ラーゼ伸長反応によりプロモーター配列含有鎖に対し相
    補的に伸長させて、第二2本鎖核酸を形成し; (G)第一プライマーのプロモーター配列に対応するプ
    ロモーターを認識するRNAポリメラーゼにより触媒され
    る反応により、第二2本鎖をそれからRNA転写物を多数
    つくるための鋳型として使用し、その際それらの転写物
    はそれぞれ標的配列に対応するRNA配列を保有し; (H)第二2本鎖からつくられたRNA転写物に適当な条
    件下で第二核酸プライマーをハイブリダイズさせ; (I)ハイブリダイズした第二核酸プライマーを、RNA
    依存性DNAポリメラーゼにより触媒されるポリメラーゼ
    伸長反応により該RNA転写物に対し相補的に伸長させ
    て、第三2本鎖核酸を形成し; (J)第三2本鎖を1本鎖となし; (K)適当な条件下で、第一プライマーと第三2本鎖か
    ら得た第二プライマーを含む鎖とをハイブリダイズさ
    せ; (L)第一プライマーと第三2本鎖の分離により得た第
    二プライマーを含む鎖とのハイブリッド中の、第一プラ
    イマーおよび第二プライマーの両方を含む鎖をポリメラ
    ーゼ伸長反応により伸長させて、第四2本鎖核酸を形成
    し;そして (M)第一プライマーのプロモーター配列に対応するプ
    ロモーターを認識するRNAポリメラーゼにより触媒され
    る反応により、第四2本鎖をそれからRNA転写物を多数
    つくるための鋳型として使用し、その際それらの転写物
    はそれぞれ標的配列に対応するRNA配列を保有する 工程から成る方法。
  2. 【請求項2】さらに工程(H)〜(M)を少なくとも1
    回繰り返し、その際常に工程(H)においてそのすぐ前
    の工程MでつくられたRNA転写物への第二プライマーの
    ハイブリダイゼーションを採用することを含む、請求項
    1記載の方法。
  3. 【請求項3】核酸含有試料中の少なくとも1種の特定の
    核酸標的配列の検出に有用な方法であって、請求項1ま
    たは2に従って該標的配列に対応する配列を含むRNA転
    写物をつくらせ、そして該RNA配列の存在を検出するこ
    とから成る方法。
  4. 【請求項4】第一プライマーにおいて標的配列の第一セ
    グメントに対応する配列が第一セグメントに対し相補的
    であり;第二プライマーが標的配列の第二セグメントの
    配列と同一の配列を有し;標的配列の第一および第二セ
    グメントが重複せず;かつすべてのポリメラーゼ伸長反
    応を同一の逆転写酵素により触媒する、請求項1〜3の
    いずれか1項記載の方法。
  5. 【請求項5】さらに請求項4記載の方法によりつくられ
    たRNA転写物を検出することを含む、請求項4記載の方
    法。
  6. 【請求項6】該転写物はレプリカーゼ誘導により該転写
    物を複製するためのレプリカーゼ認識部位を含む、請求
    項3または5記載の方法。
  7. 【請求項7】該RNA転写物の検出されたRNA配列を標準化
    方法により測定して、2本鎖核酸鋳型の製造において使
    用した核酸試料中に含まれる標的配列の量を測定する、
    請求項3、5または6記載の方法。
  8. 【請求項8】該RNA転写物の検出されたRNA配列を、やは
    り試料中に含まれる既知コピー数の核酸の存在により内
    部標準化された方法で測定する、請求項7記載の方法。
  9. 【請求項9】標的配列は遺伝的な、または病原体による
    病気や症状の特徴と関連した核酸配列内に配置されてい
    る、請求項3または5記載の方法。
  10. 【請求項10】該核酸配列はヒト免疫不全症ウイルスの
    セグメントである、請求項9記載の方法。
  11. 【請求項11】該核酸配列は欠陥遺伝子のセグメントで
    ある、請求項9記載の方法。
  12. 【請求項12】第一プライマーのプロモーター配列に対
    応するプロモーターはバクテリオファージT7プロモータ
    ーであり、RNA転写物はT7 RNAポリメラーゼを用いてつ
    くられる、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
  13. 【請求項13】第一プライマーのプロモーター配列に対
    応するプロモーターはバクテリオファージSP6プロモー
    ターであり、RNA転写物はSP6 RNAポリメラーゼを用いて
    つくられる、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
  14. 【請求項14】標的配列はDNA配列であり、ポリメラー
    ゼ伸長反応は大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼIによ
    り触媒される、請求項1記載の方法。
  15. 【請求項15】標的配列はDNA配列であり、ポリメラー
    ゼ伸長反応は大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノー断片
    により触媒される、請求項1記載の方法。
  16. 【請求項16】標的配列はDNA配列であり、ポリメラー
    ゼ伸長反応はT4 DNAポリメラーゼにより触媒される、請
    求項1記載の方法。
  17. 【請求項17】すべてのポリメラーゼ伸長反応は逆転写
    酵素により触媒される、請求項1または2記載の方法。
  18. 【請求項18】検出前に該RNA転写物を標識する、請求
    項3または5記載の方法。
  19. 【請求項19】該RNA転写物を放射性標識する、請求項1
    8記載の方法。
  20. 【請求項20】該RNA転写物を発色団標識する、請求項1
    8記載の方法。
  21. 【請求項21】逆転写酵素はAMV逆転写酵素およびMMLV
    逆転写酵素よりなる群から選ばれる、請求項17記載の方
    法。
  22. 【請求項22】標識配列は1000以下のヌクレオチドを有
    し、標的配列の第一セグメントは15〜45ヌクレオチドを
    有し、標的配列の第二セグメントは15〜45ヌクレオチド
    を有する、請求項1〜21のいずれか1項記載の方法。
  23. 【請求項23】鎖を熱変性により分離する、請求項1〜
    22のいずれか1項記載の方法。
  24. 【請求項24】核酸含有試料中の少なくとも1種の特定
    の核酸標的配列の検出に有用なキットであって、標的配
    列のセグメントに対し相補的な配列に作動可能な状態で
    連結されたプロモーター配列を含む第一核酸プライマー
    および標的配列のセグメントと同一の配列を有する第二
    核酸プライマー(これらのプライマーは標的配列の異な
    る領域に対応するが、標的配列へのそれらの対応におい
    て重複しないか、または実質的に重複せず、一方の伸長
    産物がその相補鎖から分離されるとき他方の伸長産物の
    鋳型として役立ち得るように選ばれる);ならびに該第
    一プライマーを標的配列にハイブリダイズさせ、ハイブ
    リダイズしたプライマーを鎖伸長させ、得られた2本鎖
    を1本鎖となし、プロモーター配列を含む分離鎖に第二
    核酸プライマーをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ
    したプライマーを鎖伸長させ、得られたプロモーター配
    列を含む2本鎖核酸に転写物をつくらせ、そして該転写
    物を検出するための手段;を含むキット。
  25. 【請求項25】プライマーを鎖伸長させる手段はAMV逆
    転写酵素およびMMLV逆転写酵素よりなる群から選ばれる
    逆転写酵素であり、第一プライマーのプロモーター配列
    に対応するプロモーターは、T7 RNAポリメラーゼおよび
    SP6 RNAポリメラーゼよりなる群から選ばれるRNAポリメ
    ラーゼによる転写に対して認識され、該プロモーターを
    含む2本鎖核酸に転写物をつくらせる手段は、プロモー
    ターがT7 RNAポリメラーゼによる転写に対して認識され
    る場合にはT7 RNAポリメラーゼであり、プロモーターが
    SP6 RNAポリメラーゼによる転写に対して認識される場
    合にはSP6 RNAポリメラーゼである、請求項24記載のキ
    ット。
  26. 【請求項26】検出すべき標識配列は1000以下のヌクレ
    オチドを有し、標的配列のセグメントに対し相補的な第
    一プライマーの配列は15〜45ヌクレオチドを有し、標的
    配列のセグメントと同一の第二プライマーの配列は15〜
    45ヌクレオチドを有する、請求項24または25記載のキッ
    ト。
  27. 【請求項27】式I: [式中(第一サブセグメント)tは(第二サブセグメン
    ト)tの3′末端に隣接する少なくとも10ヌクレオチド
    の既知配列の核酸セグメントであり、(第二サブセグメ
    ント)tは0またはそれ以上のヌクレオチドの核酸セグ
    メントであり、そして(第三サブセグメント)tは(第
    二サブセグメント)tの5′末端に隣接する少なくとも1
    0ヌクレオチドの既知配列の核酸セグメントである]の
    標的核酸セグメントを増幅する方法であって: (1)該標的セグメントの(第一サブセグメント)
    tに、式II: [式中、(プロモーター)1はバクテリオファージDNA依
    存性RNAポリメラーゼ特異的プロモーターの配列を有す
    る1本鎖DNAセグメントであり、(可変サブセグメン
    ト)1は(プロモーター)1の3′末端ヌクレオチドおよ
    び(3′−プライマーサブセグメン)1の5′末端ヌク
    レオチドに隣接する0〜100ヌクレオチドの1本鎖DNAセ
    グメントであり、そして(3′−プライマーサブセグメ
    ント)1は(第一サブセグメント)tの3′末端ヌクレオ
    チドで終わる(第一サブセグメント)tのサブセグメン
    トの配列に相補的な配列を有する少なくとも10ヌクレオ
    チドの1本鎖DNAセグメントであり、(可変サブセグメ
    ント)1が0ヌクレオチドである場合、(プロモータ
    ー)1は(3′−プライマーサブセグメント)1の5′末
    端に隣接する]の3′末端サブセグメントから成る1本
    鎖DNAの第一プライマーをハイブリダイズさせ; (2)工程(1)に従ってハイブリダイズさせた第一プ
    ライマーを第一DNAポリメラーゼにより触媒される反応
    で伸長させて、式III: [式中(第一サブセグメント)tcは(第一サブセグメン
    ト)tの配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    り、(第二サブセグメント)tcは(第二サブセグメン
    ト)tの配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    り、そして(第三サブセグメント)tcは(第三サブセグ
    メント)tの配列に相補的な配列を有するDNAセグメント
    である]のサブセグメントから成る第一相補DNAセグメ
    ントをつくり(但し、標的セグメントがRNAセグメント
    である場合、該第一DNAポリメラーゼは逆転写酵素であ
    る); (3)工程(2)の反応で形成された2本鎖を1本鎖と
    なし; (4)式IIIの第一相補DNAセグメントの(第三サブセグ
    メント)tcに、式IV: [式中(5′−プライマーサブセグメント)2は(第三
    サブセグメント)tの5′末端ヌクレオチドで終わる
    (第三サブセグメント)tのサブセグメント配列を有
    し、(可変サブセグメント)2は(5′−プライマーサ
    ブセグメント)2の5′末端に隣接する0〜100ヌクレオ
    チドのセグメントである]の少なくとも10ヌクレオチド
    の1本鎖DNAである第二プライマーをハイブリダイズさ
    せ; (5)工程(4)に従ってハイブリダイズさせた第二プ
    ライマーセグメントを第二DNAポリメラーゼにより触媒
    される反応で伸長させて、式V: [式中(可変サブセグメント)1cは(可変サブセグメン
    ト)1の配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    り、(プロモーター)1cは(プロモーター)1の配列に
    相補的な配列を有するDNAセグメントである]のサブセ
    グメントから成る第二相補DNAセグメントをつくり(但
    し、第二DNAポリメラーゼは第一DNAポリメラーゼと同一
    であっても異なってもよい);そして (6)工程(5)の2本鎖産物を、一方の鎖が(プロモ
    ーター)1であるプロモーターを認識する第一バクテリ
    オファージDNA依存性RNAポリメラーゼにより触媒される
    反応において鋳型として使用して、式VI: [式中(可変サブセグメント)1rは(可変サブセグメン
    ト)1の配列を有するRNAセグメントであり、(第一サブ
    セグメント)tcrは(第一サブセグメント)tの配列に相
    補的な配列を有するRNAセグメントであり、(第二サブ
    セグメント)tcrは(第二サブセグメント)tの配列に相
    補的な配列を有するRNAセグメントであり、(第三サブ
    セグメント)tcrは(第三サブセグメント)tの配列に相
    補的な配列を有するRNAセグメントであり、そして(可
    変サブセグメント)2crは(可変サブセグメント)2の配
    列に相補的な配列を有するRNAセグメントである]の第
    一RNA産物をつくることから成り; 下記を特徴とする:工程(1)〜(6)の後に繰り返し
    サイクルにおいてさらに標的核酸セグメントの増幅を行
    い、その際(第一サブセグメント)tは長さが少なくと
    も10ヌクレオチドであって、式XIII: [式中(第一サブセグメント)t2は0またはそれ以上の
    ヌクレオチドを有し、0より多い場合は(第一サブセグ
    メント)t1の3′末端に隣接し、そして(第一サブセグ
    メント)t1は長さが少なくとも10ヌクレオチドである]
    で表され;(第三サブセグメント)tは式XIV: [式中(第三サブセグメント)t2は0またはそれ以上の
    ヌクレオチドを有し、0より多い場合は(第三サブセグ
    メント)t1の5′末端に隣接し、そして(第三サブセグ
    メント)t1は長さが少なくとも10ヌクレオチドである]
    で表され;(3′−プライマーサブセグメント)1
    (第一サブセグメント)t2の全部と(第一サブセグメン
    ト)t1の0またはそれ以上のヌクレオチドから成る標的
    セグメントのサブセグメントの配列に相補的な配列を有
    し;(5′−プライマーサブセグメント)2は(第三サ
    ブセグメント)t2の全部と(第三サブセグメント)t1
    0またはそれ以上のヌクレオチドから成るサブセグメン
    トであり;(可変サブセグメント)2は0ヌクレオチド
    であり;そして工程(1)〜(6)の後に、式VII: [式中(第一サブセグメント)t1crは(第一サブセグメ
    ント)t1の配列に相補的な配列を有するRNAセグメント
    であり、そして(第三サブセグメント)t1crは(第三サ
    ブセグメント)t1の配列に相補的な配列を有するRNAセ
    グメントである]のRNAセグメントが下記から成る方法
    によってさらに増幅される: (7)式VIの第一RNA産物に、式VIII: [式中(プロモーター)3はバクテリオファージDNA依存
    性RNAポリメラーゼ特異的プロモーターの配列を有する
    1本鎖DNAセグメントであり、(プロモーター)3の配列
    は(プロモーター)1の配列と同一であっても異なって
    いてもよく、(可変サブセグメント)3は(プロモータ
    ー)3の3′末端ヌクレオチドおよび(3′−プライマ
    ーサブセグメント)3の5′末端ヌクレオチドに隣接す
    る0〜100ヌクレオチドの1本鎖DNAセグメントであり、
    そして(3′−プライマーサブセグメンント)3は(第
    三サブセグメント)t1と同じ配列を有し、且つ(可変サ
    ブセグメント)3が0ヌクレオチドである場合、(プロ
    モーター)3の3′末端ヌクレオチドに隣接する1本鎖D
    NAセグメントである]の3′末端サブセグメントから成
    る1本鎖DNAセグメントの第三プライマーをハイブリダ
    イズさせ; (8)工程(7)に従ってハイブリダイズさせた第三プ
    ライマーを、第三DNAポリメラーゼ(逆転写酵素であ
    り、第一および第二DNAポリメラーゼと同一であっても
    異なっていてもよい)により触媒される反応で伸長させ
    て、式IX: [式中(可変サブセグメント)1cは(可変サブセグメン
    ト)1の配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    る]の3′末端サブセグメントから成る第三相補DNAセ
    グメントをつくり; (9)工程(8)の反応で形成された2本鎖を1本鎖と
    なし; (10)工程(8)の反応でつくられた第三相補DNAに、
    式X: {式中(可変サブセグメント)4は0〜100ヌクレオチド
    のセグメントであり、そして(5′−プライマーサブセ
    グメント)4は、(可変サブセグメント)4が0より多い
    ヌクレオチドを有する場合、(可変サブセグメント)4
    の3′ヌクレオチドに隣接し且つ式XX: [式中(第一サブセグメント)t2cは(第一サブセグメ
    ント)t2の配列に相補的な配列を有するDNAセグメント
    であり、そして(第一サブセグメント)t1cは(第一サ
    ブセグメント)t1の配列に相補的な配列を有するDNAセ
    グメントである]のセグメントの少なくとも10個のヌク
    レオチドから成る既知配列のサブセグメントであり、但
    し、上記の少なくとも10個のヌクレオチドのうち少なく
    とも1個は(第一サブセグメント)t1cの5′末端ヌク
    レオチドに存在するか、またはその5′末端ヌクレオチ
    ドから5′側に存在する}の第四プライマーをハイブリ
    ダイズさせ; (11)工程(10)に従ってハイブリダイズさせた第四プ
    ライマーを第四DNAポリメラーゼ(第一、第二および第
    三DNAポリメラーゼと同一であっても異なっていてもよ
    い)により触媒される反応で伸長させて、式XI: 5′−(第一サブセグメント)t1c−(第二サブセグメ
    ント)tc[式中(第二サブセグメント)tcは(第二サブセグメン
    ト)tの配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    り、(第三サブセグメント)t1cは(第三サブセグメン
    ト)t1の配列に相補的な配列を有するDNAセグメントで
    あり、(可変サブセグメント)3cは(可変サブセグメン
    ト)3の配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    り、そして(プロモーター)3cは(プロモーター)3
    配列に相補的な配列を有するDNAセグメントである]の
    セグメントから成る第四相補DNAをつくり;そして (12)工程(10)の2本鎖産物を、第二バクテリオファ
    ージDNA依存性RNAポリメラーゼ(第一バクテリオファー
    ジDNA依存性RNAポリメラーゼと同一であっても異なって
    いてもよく、一方の鎖が(プロモーター)3であるプロ
    モーターを認識する)により触媒される反応において鋳
    型として使用して、式XII: [式中(可変サブセグメント)3rは(可変サブセグメン
    ト)3の配列を有するRNAセグメントであり、(第三サブ
    セグメント)t1cは(第三サブセグメント)t1の配列を
    有するRNAセグメントであり、(第二サブセグメント)
    trは(第二サブセグメント)tの配列を有するRNAセグメ
    ントであり、(第一サブセグメント)t1rは(第一サブ
    セグメント)t1の配列を有するRNAセグメントであり、
    (可変サブセグメント)4crは(可変サブセグメント)4
    の配列に相補的な配列を有するRNAセグメントであり、
    そしてX12は(第一サブセグメント)t1rの5′末端から
    5′側にある(5′−プライマーサブセグメント)4
    サブセグメントの配列に相補的な配列を有するRNAセグ
    メントである]の5′末端サブセグメントを有する第二
    RNA産物をつくる方法。
  28. 【請求項28】(可変サブセグメント)1および(可変
    サブセグメント)2はそれぞれ0〜60個のヌクレオチド
    を有し、(3′−プライマーサブセグメント)1および
    (5′−プライマーサブセグメント)2はそれぞれ15〜4
    5個のヌクレオチドを有し、(第二サブセグメント)t
    少なくとも30個のヌクレオチドを有し、そして標的セグ
    メントは1000個以下のヌクレオチドを有する、請求項27
    記載の方法。
  29. 【請求項29】標的セグメントはDNAセグメントであ
    り、工程(2)の産物は熱変性により1本鎖となし、
    (可変サブセグメント)2は0個のヌクレオチドを有
    し、第一および第二DNAポリメラーゼはそれぞれ大腸菌D
    NAポリメラーゼIのクレノー断片、AMV逆転写酵素、ク
    ローン化MMLV逆転写酵素、ウシ胸腺DNAポリメラーゼア
    ルファ、テルムス・アクアティカス(Thermus aquaticu
    s)熱安定性DNAポリメラーゼ、および商標名シーケナー
    ゼ(SequenaseTM)のクローン化T7 DNAポリメラーゼよ
    り成る群から選ばれ、バクテリオファージDNA依存性RNA
    ポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラー
    ゼおよびSP6 RNAポリメラーゼより成る群から選ばれ
    る、請求項27記載の方法。
  30. 【請求項30】第一および第二DNAポリメラーゼはそれ
    ぞれ大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノー断片、AMV逆転
    写酵素、およびクローン化MMLV逆転写酵素より成る群か
    ら選ばれる、請求項29記載の方法。
  31. 【請求項31】(1)バクテリオファージDNA依存性RNA
    ポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼであり、(プロモー
    ター)1は5′−TAATACGACTCACTATA−3′であり、そし
    て(可変サブセグメント)1はその5′末端に配列5′
    −GG−3′のジヌクレオチドを有する;または(2)バ
    クテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼはT3 RNAポ
    リメラーゼであり、(プロモーター)1は5′−TATTAAC
    CCTCACTAAA−3′であり、そして(可変サブセグメン
    ト)1はその5′末端に配列5′−GGGA−3′のテトラ
    ヌクレオチドを有する;あるいは(3)バクテリオファ
    ージDNA依存性RNAポリメラーゼはSP6 RNAポリメラーゼ
    であり、(プロモーター)1は5′−GAACGCGGCTACAATTA
    ATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA−
    3′であり、そして(可変サブセグメント)1はその
    5′末端に配列5′−GAATAC−3′のヘキサヌクレオチ
    ドを有する、請求項30記載の方法。
  32. 【請求項32】第一プライマーの5′末端は(プロモー
    ター)1の5′−ヌクレオチドである、請求項31記載の
    方法。
  33. 【請求項33】バクテリオファージDNA依存性RNAポリメ
    ラーゼがT7またはT3RNAポリメラーゼである場合、(可
    変サブセグメント)1は配列5′−GGGATGGGGAACCCCCCTT
    CGGGGGTCACCTCGCGCAGC−3′を有し、そしてバクテリオ
    ファージDNA依存性RNAポリメラーゼがSP6 RNAポリメラ
    ーゼである場合、(可変サブセグメント)1は配列5′
    −GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−3′
    を有する、請求項32記載の方法。
  34. 【請求項34】標的セグメントはRNAセグメントであ
    り、工程(2)の産物は熱変性により1本鎖となし、
    (可変サブセグメント)2は0個のヌクレオチドを有
    し、第一DNAポリメラーゼはAMV逆転写酵素およびクロー
    ン化MMLV逆転写酵素より成る群から選ばれ、第二DNAポ
    リメラーゼは大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノー断
    片、AMV逆転写酵素、クローン化MMLV逆転写酵素、ウシ
    胸腺DNAポリメラーゼアルファ、テルムス・アクアティ
    カス熱安定性DNAポリメラーゼ、および商標名シーケナ
    ーゼのクローン化T7 DNAポリメラーゼより成る群から選
    ばれ、そしてバクテリオファージDNA依存性RNAポリメラ
    ーゼはT7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼおよび
    SP6 RNAポリメラーゼより成る群から選ばれる、請求項2
    8記載の方法。
  35. 【請求項35】第二DNAポリメラーゼは大腸菌DNAポリメ
    ラーゼIのクレノー断片、AMV逆転写酵素、およびクロ
    ーン化MMLV逆転写酵素より成る群から選ばれる、請求項
    34記載の方法。
  36. 【請求項36】(1)バクテリオファージDNA依存性RNA
    ポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼであり、(プロモー
    ター)1は5′−TAATACGACTCACTATA−3′であり、そし
    て(可変サブセグメント)1はその5′末端に配列5′
    −GG−3′のジヌクレオチドを有する;または(2)バ
    クテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼはT3 RNAポ
    リメラーゼであり、(プロモーター)1は5′−TATTAAC
    CCTCACTAAA−3′であり、そして(可変サブセグメン
    ト)1はその5′末端に配列5′−GGGA−3′のテトラ
    ヌクレオチドを有する;あるいは(3)バクテリオファ
    ージDNA依存性RNAポリメラーゼはSP6 RNAポリメラーゼ
    であり、(プロモーター)1は5′−GAACGCGGCTACAATTA
    ATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA−
    3′であり、そして(可変サブセグメント)1はその
    5′末端に配列5′−GAATAC−3′のヘキサヌクレオチ
    ドを有する、請求項35記載の方法。
  37. 【請求項37】第一プライマーの5′末端は(プロモー
    ター)1の5′−ヌクレオチドである、請求項36記載の
    方法。
  38. 【請求項38】第一および第二DNAポリメラーゼはそれ
    ぞれAMV逆転写酵素およびクローン化MMLV逆転写酵素か
    ら選ばれる、請求項37記載の方法。
  39. 【請求項39】バクテリオファージDNA依存性RNAポリメ
    ラーゼがT7またはT3 RNAポリメラーゼである場合、(可
    変サブセグメント)1は配列5′−GGGATGGGGAACCCCCCTT
    CGGGGGTCACCTCGCGCAGC−3′を有し、そしてバクテリオ
    ファージDNA依存性RNAポリメラーゼがSP6 RNAポリメラ
    ーゼである場合、(可変サブセグメント)1は配列5′
    −GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−3′
    を有する、請求項38記載の方法。
  40. 【請求項40】標的セグメントはヒト免疫不全症ウイル
    ス、すなわちHIV−1ウイルス、のゲノムのセグメント
    であり、その場合(1)(3′−プライマーサブセグメ
    ント)1は配列5′−TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT
    −3′を有し、そして(5′−プライマーサブセグメン
    ト)2は配列5′−ACAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAG−
    3′を有する;または(2)(3′−プライマーサブセ
    グメント)1は配列5′−TTTCGTAACACTAGGCAAAGGTGGCTT
    TATC−3′を有し、そして(5′−プライマーサブセグ
    メント)2は5′−GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA−
    3′および5′−ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA−
    3′より成る群から選ばれる配列を有する、請求項34、
    35、36、37、38または39記載の方法。
  41. 【請求項41】(可変サブセグメント)1および(可変
    サブセグメント)3はそれぞれ0〜60個のヌクレオチド
    を有し、(3′−プライマーサブセグメント)1
    (5′−プライマーサブセグメント)2、(3′−プラ
    イマーサブセグメント)3および(5′−プライマーサ
    ブセグメント)4はそれぞれ15〜45個のヌクレオチドを
    有し、(第二サブセグメント)tは少なくとも30個のヌ
    クレオチドを有し、そして標的セグメントは1000個以下
    のヌクレオチドを有する、請求項27記載の方法。
  42. 【請求項42】(A)標的セグメントがDNAセグメント
    である場合、工程(2)の産物は熱変性により1本鎖と
    なし、工程(8)の産物も熱変性により1本鎖となし;
    第一、第二および第四DNAポリメラーゼはそれぞれ大腸
    菌DNAポリメラーゼIのクレノー断片、AMV逆転写酵素、
    クローン化MMLV逆転写酵素、ウシ胸腺DNAポリメラーゼ
    アルファ、テルムス・アクアティカス熱安定性DNAポリ
    メラーゼ、および商標名シーケナーゼのクローン化T7 D
    NAポリメラーゼより成る群から選ばれ;第三DNAポリメ
    ラーゼはAMV逆転写酵素およびクローン化MMLV逆転写酵
    素から選ばれ;そして第一および第二バクテリオファー
    ジDNA依存性RNAポリメラーゼはそれぞれT7 RNAポリメラ
    ーゼ、T3 RNAポリメラーゼおよびSP6 RNAポリメラーゼ
    より成る群から選ばれる;ならびに(B)標的セグメン
    トがRNAセグメントである場合、工程(2)の産物およ
    び工程(8)の産物はそれぞれ熱変性により1本鎖とな
    し;第二および第四DNAポリメラーゼはそれぞれ大腸菌D
    NAポリメラーゼIのクレノー断片、AMV逆転写酵素、ク
    ローン化MMLV逆転写酵素、ウシ胸腺DNAポリメラーゼア
    ルファ、テルムス・アクアティカス熱安定性DNAポリメ
    ラーゼ、および商標名シーケナーゼのクローン化T7 DNA
    ポリメラーゼより成る群から選ばれ;第一および第三DN
    AポリメラーゼはそれぞれAMV逆転写酵素およびクローン
    化MMLV逆転写酵素より成る群から選ばれ;そして第一お
    よび第二バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼ
    はそれぞれT7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、
    およびSP6 RNAポリメラーゼより成る群から選ばれる、
    請求項41記載の方法。
  43. 【請求項43】標的セグメントはRNAセグメントであ
    り、第二および第四DNAポリメラーゼはそれぞれ大腸菌D
    NAポリメラーゼIのクレノー断片、AMV逆転写酵素、お
    よびクローン化MMLV逆転写酵素より成る群から選ばれ、
    それぞれ第一および第三DNAポリメラーゼはそれぞれAMV
    逆転写酵素およびクローン化MMLV逆転写酵素より成る群
    から選ばれる、請求項42記載の方法。
  44. 【請求項44】(3′−プライマーサブセグメント)1
    の配列に相補的な配列を有する標的セグメントのサブセ
    グメントは(5′−プライマーサブセグメント)4の配
    列に相補的な配列を有する標的セグメントのサブセグメ
    ントから3′方向にあってそれと重複せず、(5′−プ
    ライマーサブセグメント)2の配列を有する標的セグメ
    ントのサブセグメントは(3′−プライマーサブセグメ
    ント)3の配列を有する標的セグメントのサブセグメン
    トと重複しない、請求項42記載の方法。
  45. 【請求項45】(3′−プライマーサブセグメント)1
    の配列に相補的な配列を有する第三相補DNAのサブセグ
    メントは(5′−プライマーサブセグメント)4の配列
    に相補的な配列を有する第三相補DNAのサブセグメント
    から5′方向にあってそれと重複せず、そして(5′−
    プライマーサブセグメント)2の配列を有する標的セグ
    メントのサブセグメントは(3′−プライマーサブセグ
    メント)3の配列を有する標的セグメントのサブセグメ
    ントと重複しない、請求項44記載の方法。
  46. 【請求項46】第三相補DNAにおいて、(可変サブセグ
    メント)1cは0より多いヌクレオチドを有し、そして
    (5′−プライマーサブセグメント)4と第三相補DNAと
    の2本鎖核酸において、少なくとも(5′−プライマー
    サブセグメント)4のサブセグメントが(可変サブセグ
    メント)1cにハイブリダイズする、請求項45記載の方
    法。
  47. 【請求項47】(3′−プライマーサブセグメント)1
    の配列に相補的な配列を有する標的セグメントのサブセ
    グメントは(5′−プライマーサブセグメント)4の配
    列に相補的な配列を有する標的セグメントのサブセグメ
    ントから3′方向にあってそれと重複せず、(5′−プ
    ライマーサブセグメント)2の配列を有する標的セグメ
    ントのサブセグメントは(3′−プライマーサブセグメ
    ント)3の配列を有する標的セグメントのサブセグメン
    トと重複しない、請求項45記載の方法。
  48. 【請求項48】(3′−プライマーサブセグメント)1
    の配列に相補的な配列を有する第三相補DNAのサブセグ
    メントは(5′−プライマーサブセグメント)4の配列
    に相補的な配列を有する第三相補DNAのサブセグメント
    から5′方向にあってそれと重複せず、そして(5′−
    プライマーサブセグメント)2の配列を有する標的セグ
    メントのサブセグメントは(3′−プライマーサブセグ
    メント)3の配列を有する標的セグメントのサブセグメ
    ントと重複しない、請求項45記載の方法。
  49. 【請求項49】第三相補DNAにおいて、(可変サブセグ
    メント)1cは0より多いヌクレオチドを有し、そして
    (5′−プライマーサブセグメント)4と第三相補DNAと
    の2本鎖核酸において、少なくとも(5′−プライマー
    サブセグメント)4のサブセグメントが(可変サブセグ
    メント)1cにハイブリダイズする、請求項48記載の方
    法。
  50. 【請求項50】(1)工程(6)または(12)において
    T7 RNAポリメラーゼを用いる場合、(プロモーター)1
    (その工程が工程(6)である場合)または(プロモー
    ター)3(その工程が工程(12)である場合)は配列
    5′−TAATACGACTCACTATA−3′を有し、そして(可変
    サブセグメント)1(その工程が工程(6)である場
    合)または(可変サブセグメント)3(その工程が工程
    (12)である場合)はその5′末端に配列5′−GG−
    3′のジヌクレオチドを有する;あるいは(2)工程
    (6)または(12)においてT3 RNAポリメラーゼを用い
    る場合、(プロモーター)1(その工程が工程(6)で
    ある場合)または(プロモーター)3(その工程が工程
    (12)である場合)は配列5′−TATTAACCCTCACTAAA−
    3′を有し、そして(可変サブセグメント)1(その工
    程が工程(6)である場合)または(可変サブセグメン
    ト)3(その工程が工程(12)である場合)はその5′
    末端に配列5′−GGGA−3′のテトラヌクレオチドを有
    する;あるいは(3)工程(6)または(12)において
    SP6 RNAポリメラーゼを用いる場合、(プロモーター)1
    (その工程が工程(6)である場合)または(プロモー
    ター)3(その工程が工程(12)である場合)は配列 5′−GAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACAT
    ACGATTTAGGTGACACTATA−3′を有し、そして(可変サブ
    セグメント)1(その工程が工程(6)である場合)ま
    たは(可変サブセグメント)3(その工程が工程(12)
    である場合)はその5′末端に配列5′−GAATAC−3′
    のヘキサヌクレオチドを有し、第一プライマーの5′末
    端は(プロモーター)1の5′−ヌクレオチドであり、
    そして第三プライマーの5′末端は(プロモーター)3
    の5′−ヌクレオチドである、請求項44、45、46、47、
    48または49記載の方法。
  51. 【請求項51】(A)(i)第一バクテリオファージDN
    A依存性RNAポリメラーゼがT7またはT3 RNAポリメラーゼ
    である場合、(可変サブセグメント)1は配列5′−GGG
    ATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−3′を有し、
    そして第二プライマー(可変サブセグメント)2は配列
    5′−CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGT
    GC−3′を有する;あるいは(ii)第一バクテリオファ
    ージDNA依存性RNAポリメラーゼがSP6 RNAポリメラーゼ
    である場合、(可変サブセグメント)1は配列5′−GAA
    TACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−3′を有
    し、そして第二プライマー(可変サブセグメント)2
    配列5′−CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCT
    TCGTGC−3′を有する;(B)(i)第二バクテリオフ
    ァージDNA依存性RNAポリメラーゼがT7またはT3 RNAポリ
    メラーゼである場合、(可変サブセグメント)3は配列
    5′−GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−
    3′を有する;(ii)第二バクテリオファージDNA依存
    性RNAポリメラーゼがSP6 RNAポリメラーゼである場合、
    (可変サブセグメント)3は配列5′−GAATAGGGACTGGGG
    AACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−3′を有し、そして
    第四プライマーは5′−末端の40ヌクレオチドとして
    5′−CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGT
    GC−3′を有する;そして(C)工程(12)の後に、第
    二RNAはQβレプリカーゼにより自己触媒的に複製され
    る、請求項44、45、46、47、48または49記載の方法。
  52. 【請求項52】標的セグメントはヒト免疫不全症ウイル
    ス、すなわちHIV−1ウイルス、のゲノムのセグメント
    であり、(1)(3′−プライマーサブセグメント)1
    は配列5′−TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT−3′を
    有し、(5′−プライマーサブセグメント)2は配列
    5′−ACAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAG−3′を有し、
    (3′−プライマーサブセグメント)3は配列5′−AAA
    GGTATCCTTTGAGCCAATTCCCATA−3′を有し、そして第四
    プライマーは配列5′−AGTTGATACTACTGGCCTAATT−3′
    を有する;または(2)(3′−プライマーサブセグメ
    ント)1は配列5′−TTTCGTAACACTAGGCAAAGGTGGCTTTATC
    −3′を有し、(5′−プライマーサブセグメント)2
    は5′−GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA−3′およ
    び5′−ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA−3′より成
    る群から選ばれる配列を有し、(3′−プライマーサブ
    セグメント)3は配列5′−ACTAATTCATCTGTATTACTTTGAC
    TGTTTTTCを有し、そして第四プライマーは配列5′−TT
    TTTTGGTGTTATTAATGCTGCTAGTGCC−3′を有する、請求項
    41、42、43、44、45、46、47、48または49記載の方法。
  53. 【請求項53】(A)標的セグメントがDNAセグメント
    である場合、工程(2)の産物は熱変性により1本鎖と
    なし;第一および第二DNAポリメラーゼはそれぞれ大腸
    菌DNAポリメラーゼIのクレノー断片、AMV逆転写酵素、
    クローン化MMLV逆転写酵素、ウシ胸腺DNAポリメラーゼ
    アルファ、テルムス・アクアティカス熱安定性DNAポリ
    メラーゼ、および商標名シーケナーゼのクローン化T7 D
    NAポリメラーゼより成る群から選ばれ;そして第一バク
    テリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼはT7 RNAポリ
    メラーゼ、T3 RNAポリメラーゼおよびSP6 RNAポリメラ
    ーゼより成る群から選ばれる;ならびに(B)標的セグ
    メントがRNAセグメントである場合、工程(2)の産物
    は熱変性により1本鎖となし;第二DNAポリメラーゼは
    大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノー断片、AMV逆転写酵
    素、クローン化MMLV逆転写酵素、ウシ胸腺DNAポリメラ
    ーゼアルファ、テルムス・アクアティカス熱安定性DNA
    ポリメラーゼ、および商標名シーケナーゼのクローン化
    T7 DNAポリメラーゼより成る群から選ばれ;第一DNAポ
    リメラーゼはAMV逆転写酵素およびクローン化MMLV逆転
    写酵素より成る群から選ばれ;そして第一バクテリオフ
    ァージDNA依存性RNAポリメラーゼはT7 RNAポリメラー
    ゼ、T3 RNAポリメラーゼ、およびSP6 RNAポリメラーゼ
    より成る群から選ばれる、請求項28記載の方法。
  54. 【請求項54】第一および第二DNAポリメラーゼはAMV逆
    転写酵素およびクローン化MMLV逆転写酵素より成る群か
    ら選ばれる、請求項53記載の方法。
  55. 【請求項55】第一プライマーの5′末端は(プロモー
    ター)1の5′−ヌクレオチドであり、バクテリオファ
    ージDNA依存性RNAポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼで
    ある場合、第一プライマーのサブセグメント(プロモー
    ター)1−(可変サブセグメント)1は配列 を有し;バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼ
    がT3 RNAポリメラーゼである場合、第一プライマーのサ
    ブセグメント(プロモーター)1−(可変サブセグメン
    ト)1は配列 を有し;バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼ
    がSP6 RNAポリメラーゼである場合、第一プライマーの
    サブセグメント(プロモーター)1−(可変サブセグメ
    ント)1は配列 を有し;(可変サブセグメント)2は配列5′−TGGGGAA
    CCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−3′を有し;そして工
    程(6)の後に、第一RNAはQβレプリカーゼにより自
    己触媒的に複製される、請求項54記載の方法。
JP63506404A 1987-06-19 1988-06-17 転写に基づいた核酸増幅/検出系 Expired - Lifetime JP2843586B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6414187A 1987-06-19 1987-06-19
US20297888A 1988-06-06 1988-06-06
US064,141 1988-06-06
US202,978 1988-06-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02500565A JPH02500565A (ja) 1990-03-01
JP2843586B2 true JP2843586B2 (ja) 1999-01-06

Family

ID=26744190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63506404A Expired - Lifetime JP2843586B2 (ja) 1987-06-19 1988-06-17 転写に基づいた核酸増幅/検出系

Country Status (17)

Country Link
EP (2) EP0368906B2 (ja)
JP (1) JP2843586B2 (ja)
KR (1) KR960014107B1 (ja)
AT (2) ATE114335T1 (ja)
BR (1) BR8807097A (ja)
DE (2) DE3856428T2 (ja)
DK (1) DK175614B1 (ja)
ES (1) ES2009286A6 (ja)
FI (1) FI93743C (ja)
GR (1) GR880100396A (ja)
HU (1) HU216317B (ja)
IE (1) IE65089B1 (ja)
IL (1) IL86724A (ja)
NO (1) NO303068B1 (ja)
NZ (1) NZ225077A (ja)
PT (1) PT87769B (ja)
WO (1) WO1988010315A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012029993A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Riken Method of detecting type ii diabetes
WO2013129542A1 (ja) 2012-02-29 2013-09-06 独立行政法人理化学研究所 Hla-a*31:01アレルの検出方法
US8852868B2 (en) 2010-04-28 2014-10-07 Shimadzu Corporation Method for real-time nucleic acid amplification by droplet manipulation
US9517472B2 (en) 2010-12-21 2016-12-13 Shimadzu Corporation Device and method for processing target component in tube
US9714445B2 (en) 2011-12-22 2017-07-25 Shimadzu Corporation Chip device for manipulating object component, and method using the same

Families Citing this family (415)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5356774A (en) * 1986-04-16 1994-10-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Replicative RNA-based amplification/detection systems
WO1989001050A1 (en) * 1987-07-31 1989-02-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
EP0359789B1 (en) * 1988-01-21 1993-08-04 Genentech, Inc. Amplification and detection of nucleic acid sequences
EP0358737A4 (en) * 1988-01-28 1992-04-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Genomic amplification with direct sequencing
CA1340807C (en) * 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5130238A (en) * 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
WO1990002819A1 (en) * 1988-09-08 1990-03-22 The Salk Institute For Biological Studies Replicative rna-based amplification detection systems
CA1339991C (en) * 1988-09-08 1998-08-11 The Trustees Of Columbia University Replicative rna-based amplification/detection system
JP3020602B2 (ja) * 1988-12-05 2000-03-15 ザ・ソーク・インステチュート・フォー・バイオロジカル・スタデイーズ ターゲット核酸増幅/検出システム
AU4829690A (en) * 1988-12-16 1990-07-10 Siska Diagnostics, Inc. Self-sustained, sequence replication system
US5237016A (en) * 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
WO1990009457A2 (en) * 1989-02-14 1990-08-23 Biogen, Inc. Oligonucleotide primer pairs for sequence independent gene amplification and methods which employ them
IE66597B1 (en) * 1989-05-10 1996-01-24 Akzo Nv Method for the synthesis of ribonucleic acid (RNA)
US5112734A (en) * 1989-05-26 1992-05-12 Gene-Trak Systems Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna
US5683896A (en) * 1989-06-01 1997-11-04 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US6589734B1 (en) 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
US7009041B1 (en) 1989-07-11 2006-03-07 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for nucleic acid amplification and for the detection of Mycobacterium tuberculosis
DK0408295T3 (da) * 1989-07-11 1996-09-16 Gen Probe Inc Fremgangsmåder til opformering af nukleinsyresekvenser
US5766849A (en) * 1989-07-11 1998-06-16 Gen-Probe Incorporated Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
US5219727A (en) * 1989-08-21 1993-06-15 Hoffmann-Laroche Inc. Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction
DE3929030A1 (de) * 1989-09-01 1991-03-07 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur vermehrung von nukleinsaeuren
US7049102B1 (en) 1989-09-22 2006-05-23 Board Of Trustees Of Leland Stanford University Multi-gene expression profile
US5545522A (en) * 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
US5215899A (en) * 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
US7585512B1 (en) 1990-05-08 2009-09-08 Thomas Jefferson University Composition and method of using tumor cells
US5194370A (en) * 1990-05-16 1993-03-16 Life Technologies, Inc. Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences
US5645994A (en) * 1990-07-05 1997-07-08 University Of Utah Research Foundation Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences
JPH04141098A (ja) * 1990-09-29 1992-05-14 Shimadzu Corp Rna検出用試薬及びそれを用いたrnaの検出方法
WO1992008808A1 (en) * 1990-11-14 1992-05-29 Siska Diagnostics, Inc. Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor
EP0519053B1 (en) * 1990-12-31 1997-10-29 Promega Corporation Nucleic acid amplification with dna-dependent rna polymerase activity of rna replicases
US5518900A (en) * 1993-01-15 1996-05-21 Molecular Tool, Inc. Method for generating single-stranded DNA molecules
WO1992020820A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Vanderbilt University Method to determine metastatic potential of tumor cells
US5169766A (en) * 1991-06-14 1992-12-08 Life Technologies, Inc. Amplification of nucleic acid molecules
EP0534640B1 (en) * 1991-09-23 1996-10-02 Pfizer Inc. Process for detecting specific mRNA and DNA in cells
DE4132133A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen herstellung von ribonukleinsaeuren
DE4213029A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleins aeuresequenzen
US5981179A (en) * 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
CA2135073C (en) * 1992-05-06 2002-11-19 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
WO1994003624A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Auerbach Jeffrey I Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
CA2141430C (en) * 1992-08-04 2009-05-12 Sherrol H. Mcdonough Nucleic acid sequence amplification
US5614389A (en) * 1992-08-04 1997-03-25 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US5733733A (en) * 1992-08-04 1998-03-31 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US6261808B1 (en) 1992-08-04 2001-07-17 Replicon, Inc. Amplification of nucleic acid molecules via circular replicons
US5834202A (en) 1992-08-04 1998-11-10 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
JP4108118B2 (ja) 1993-03-26 2008-06-25 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド ヒト・免疫不全ウイルス1型の検出
AU689789B2 (en) * 1993-07-23 1998-04-09 Gen-Probe Incorporated Methods for enhancing nucleic acid amplification
EP1251182A3 (en) * 1993-12-01 2002-11-27 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method of amplifying and detecting target nucleic acid sequence by using thermostable enzymes
FR2714062B1 (fr) * 1993-12-22 1996-02-16 Bio Merieux Promoteur modifié pour ARN polymérase, sa préparation et ses applications.
CA2185239C (en) * 1994-03-16 2002-12-17 Nanibhushan Dattagupta Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
US5863724A (en) * 1994-04-13 1999-01-26 Baylor College Of Medicine Methods of screening for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy
FR2724934B1 (fr) * 1994-09-26 1997-01-24 Bio Merieux Oligonucleotide chimere et son utilisation dans l'obtention de transcrits d'un acide nucleique
US5514551A (en) * 1994-10-14 1996-05-07 Gen-Probe Incorporated Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis
FR2726277B1 (fr) 1994-10-28 1996-12-27 Bio Merieux Oligonucleotide utilisable comme amorce dans une methode d'amplification basee sur une replication avec deplacement de brin
US5849879A (en) * 1994-11-03 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5789169A (en) * 1994-11-03 1998-08-04 Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5606043A (en) 1994-11-03 1997-02-25 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5654141A (en) * 1994-11-18 1997-08-05 Thomas Jefferson University Amplification based detection of bacterial infection
US6001610A (en) * 1994-11-23 1999-12-14 Roche Diagnostics, Gmbh Method for the particularly sensitive detection of nucleic acids
DE4441626A1 (de) * 1994-11-23 1996-05-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum besonders sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren
US5652126A (en) * 1995-06-07 1997-07-29 Gen-Probe Incorporated Use of restriction endonuclease sequences for cleaving phosphorothioate oligonucleotides
US5916777A (en) * 1995-06-07 1999-06-29 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers
US5739311A (en) * 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5932450A (en) * 1995-06-07 1999-08-03 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using digestible templates
CA2255624C (en) 1996-05-22 2007-09-04 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for the detection of mycobacterium kansasii
US5914229A (en) * 1996-06-14 1999-06-22 Sarnoff Corporation Method for amplifying a polynucleotide
JPH1028585A (ja) * 1996-07-16 1998-02-03 Toyobo Co Ltd 耐熱性リボヌクレアーゼhを用いる核酸増幅法
US6132954A (en) * 1996-08-20 2000-10-17 Baylor College Of Medicine Methods of screening for agents that delay a cell cycle and compositions comprising era and an analogue of wild-type era
US6071493A (en) 1996-09-20 2000-06-06 Baylor College Of Medicine Method of screening for an agent that inhibits mononuclear phagocyte-plaque component complex formation
US6043283A (en) * 1996-09-20 2000-03-28 Baylor College Of Medicine Tyramine compounds and their neuronal effects
WO1998022625A1 (en) 1996-11-20 1998-05-28 The Regents Of The University Of Michigan Microfabricated isothermal nucleic acid amplification devices and methods
US6025133A (en) * 1996-12-30 2000-02-15 Gen-Probe Incorporated Promoter-sequestered oligonucleoside and method of use
JP3968810B2 (ja) * 1997-01-24 2007-08-29 東ソー株式会社 核酸配列分析方法
US6171788B1 (en) 1997-01-28 2001-01-09 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US7138511B1 (en) 1997-01-28 2006-11-21 The Regents Of The University Of California Nucleic acids, kits and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US6475724B1 (en) 1997-01-28 2002-11-05 The Regents Of The University Of California Nucleic acids, kits, and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US6262242B1 (en) 1997-01-30 2001-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor suppressor designated TS10Q23.3
US6482795B1 (en) 1997-01-30 2002-11-19 Myriad Genetics, Inc. Tumor suppressor designated TS10q23.3
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
US6713300B1 (en) 1997-02-27 2004-03-30 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid and amino acid sequences for ATP-binding cassette transporter and methods of screening for agents that modify ATP-binding cassette transporter
DE69837913T2 (de) 1997-04-01 2008-02-07 Solexa Ltd., Saffron Walden Verfahren zur vervielfältigung von nukleinsäure
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US6110678A (en) 1997-05-02 2000-08-29 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US6881537B1 (en) 1997-08-08 2005-04-19 Biomerieux, B.V. Nucleic acid sequences that can be used as primers and probes in the amplification and detection of all subtypes of HIV-1
EP1040192B1 (en) 1997-12-18 2006-08-09 Monsanto Technology LLC Insect-resistant transgenic plants and methods for improving delta-endotoxin activity against insects
US6673914B1 (en) 1998-01-22 2004-01-06 John Wayne Cancer Institute Human tumor-associated gene
JP2002510464A (ja) * 1998-01-27 2002-04-09 サイトセル・リミテッド Rnaプロモーターからのインビトロ転写を伴う核酸標的配列の検出方法
US20020147143A1 (en) 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
ES2322859T3 (es) 1998-05-01 2009-06-30 Gen-Probe Incorporated Analizador de diagnostico automatizado.
DE19834948A1 (de) * 1998-08-03 2000-02-17 Monika Jecht Verfahren zur spezifischen Detektion von RNA
US6207379B1 (en) 1998-09-11 2001-03-27 One Lambda Method for amplification of DNA
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
WO2000029008A2 (en) 1998-11-16 2000-05-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Hiv-specific t-cell induction
US6156515A (en) * 1999-02-09 2000-12-05 Urocor, Inc. Prostate-specific gene for diagnosis, prognosis and management of prostate cancer
JP2002542805A (ja) 1999-04-30 2002-12-17 ユニバーシティ オブ フロリダ アデノ随伴ウイルス送達リボザイム組成物および使用方法
DE60045350D1 (de) 1999-06-01 2011-01-20 Baylor College Medicine Zusammensetzungen und verfahren zur therapeutischen anwendung einer mit dem gen atonal assoziierten sequenz
NZ516278A (en) 1999-06-22 2004-03-26 Invitrogen Corp Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US6830902B1 (en) 1999-07-02 2004-12-14 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
US6692918B2 (en) 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
EP1218542B1 (en) 1999-09-13 2004-03-24 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
US6902891B2 (en) 1999-12-17 2005-06-07 Bio Merieux Process for labeling a nucleic acid
US6489114B2 (en) 1999-12-17 2002-12-03 Bio Merieux Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
EP1278855B1 (en) 2000-04-21 2008-03-12 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
JP2004513617A (ja) 2000-06-26 2004-05-13 ニューゲン テクノロジーズ, インコーポレイテッド 転写に基づく核酸増幅のための方法および組成物
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
ATE396265T1 (de) 2000-06-28 2008-06-15 Corixa Corp Zusammensetzungen und verfahren für therapie und diagnose von lungenkrebs
ATE414794T1 (de) 2000-09-01 2008-12-15 Gen Probe Inc Amplifizierung von hiv-1 sequenzen zur detektion von sequenzen, die mit wirkstoff-resistenz mutationen einhergehen
CA2422956C (en) 2000-10-23 2010-10-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting human immunodeficiency virus 2 (hiv-2)
AR031640A1 (es) 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
CA2430329A1 (en) 2000-12-13 2002-06-20 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
KR20030088035A (ko) * 2001-03-07 2003-11-15 바이오메리욱스 비.브이. 전사 기초한 증폭을 이용하는 dna의 증폭 및 검출 방법
BR0205268A (pt) 2001-03-09 2004-11-30 Nugen Technologies Inc Processos e composições para a mplificação de sequências de rna
JP2005504513A (ja) 2001-05-09 2005-02-17 コリクサ コーポレイション 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法
EP1399541A4 (en) 2001-05-22 2005-04-13 Univ Chicago RNA POLYMERASE DEPENDENT ON SINGLE VIBRATION N4 DNA
EP1908851A3 (en) 2001-09-19 2008-06-25 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk
WO2003025141A2 (en) 2001-09-19 2003-03-27 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk
WO2003027309A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 One Lambda Diagnostic probe detection system
US20030165859A1 (en) 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
AU2002365279B2 (en) 2001-12-17 2009-08-13 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease
EP2221377B2 (en) 2002-02-01 2017-05-17 Life Technologies Corporation Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
BRPI0310060B8 (pt) 2002-05-17 2021-07-27 Becton Dickinson Co sistema automatizado para isolar, amplificar e detectar uma seqüência de ácido nucléico alvo ou uma proteína
EP1513958B1 (en) 2002-06-14 2011-08-10 Gen-Probe Incorporated Compositions for detecting hepatitis b virus
US7504215B2 (en) 2002-07-12 2009-03-17 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling methods
US6916474B2 (en) 2002-07-15 2005-07-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibodies with increased affinities for anthrax antigens
EP2269619A1 (en) 2002-08-12 2011-01-05 Jennerex Biotherapeutics ULC Methods and compositions concerning poxviruses and cancer
AU2002951411A0 (en) 2002-09-16 2002-09-26 The University Of Sydney Genotype screen
CA3081071A1 (en) 2002-10-16 2004-04-29 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting west nile virus
US7074561B2 (en) 2002-10-22 2006-07-11 Biomerieux, Inc. Isothermal amplification based assay for the detection and quantitation of alpha-fetoprotein mRNA
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
MXPA05007295A (es) 2003-01-06 2005-09-30 Corixa Corp Ciertos compuestos de fosfato de aminoalquil glucosaminida y su uso.
US6852494B2 (en) 2003-01-10 2005-02-08 Linden Technologies, Inc. Nucleic acid amplification
DE602004024034D1 (de) 2003-01-29 2009-12-24 454 Corp Nukleinsäureamplifikation auf basis von kügelchenemulsion
WO2004081225A2 (en) 2003-03-07 2004-09-23 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process
EP1606419A1 (en) 2003-03-18 2005-12-21 Quantum Genetics Ireland Limited Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
WO2004092418A2 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
CA3084542A1 (en) 2003-06-10 2005-01-06 The Trustees Of Boston University Gene expression analysis of airway epithelial cells for diagnosing lung cancer
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
ATE554166T1 (de) 2003-07-25 2012-05-15 Life Technologies Corp Verfahren und zusammensetzungen zur herstellung von rna aus einer fixierten probe
EP1668111A4 (en) 2003-08-08 2008-07-02 Genenews Inc OSTEOARTHRITIS BIOMARKERS AND USES THEREOF
CA2538222A1 (en) 2003-09-12 2005-03-24 Stephen Bryant Liggett Methods for risk assessment, survival prediction and treatment of heart failure and other conditions based on adrenergic receptor polymorphisms
US8173785B2 (en) 2003-11-26 2012-05-08 Advandx, Inc. Peptide nucleic acid probes for analysis of certain Staphylococcus species
CA2547750C (en) 2003-12-19 2014-04-08 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting the nucleic acids of hiv-1 and hiv-2
US20050191682A1 (en) 2004-02-17 2005-09-01 Affymetrix, Inc. Methods for fragmenting DNA
ATE510928T1 (de) 2004-02-19 2011-06-15 Univ Alberta Leptinpromotor-polymorphismen und verwendungen davon
EP1598428A1 (en) 2004-05-18 2005-11-23 Georg Dewald Methods and kits to detect Hereditary angioedema type III
EP2527446A1 (en) 2004-06-03 2012-11-28 Athlomics Pty Ltd Agents and methods for diagnosing stress
ES2392445T3 (es) 2004-07-13 2012-12-10 Gen-Probe Incorporated Composiciones y métodos para la detección de ácido nucleico del virus de la hepatitis A
US7713697B2 (en) 2004-08-27 2010-05-11 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for amplifying DNA
EP1975242B1 (en) 2004-08-27 2011-03-02 Gen-Probe Incorporated Single-primer nucleic acid amplification methods
EP1630236A3 (de) 2004-08-30 2006-05-03 FBF- Förderverein Biologieforschung der Deutschen Schweineproduktion e.V. Hernia inguinalis/scrotalis assozieerte Genomregionen
CA2581086C (en) 2004-09-14 2023-11-07 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Method for treatment with bucindolol based on genetic targeting
EP1647600A3 (en) 2004-09-17 2006-06-28 Affymetrix, Inc. (A US Entity) Methods for identifying biological samples by addition of nucleic acid bar-code tags
AU2005291899A1 (en) 2004-09-30 2006-04-13 Gen-Probe Incorporated Assay for detecting and quantifying HIV-1
EP1645640B1 (en) 2004-10-05 2013-08-21 Affymetrix, Inc. Method for detecting chromosomal translocations
JP2006126204A (ja) 2004-10-29 2006-05-18 Affymetrix Inc ポリマーアレイを製造するための自動化方法
US7682782B2 (en) 2004-10-29 2010-03-23 Affymetrix, Inc. System, method, and product for multiple wavelength detection using single source excitation
EP2280085A3 (en) 2004-11-01 2011-02-23 George Mason University Compositions and methods for diagnosing colon disorders
CA2582661C (en) 2004-11-09 2015-08-11 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group a streptococci
CN101495498B (zh) 2005-02-07 2013-09-18 基因信息公司 轻度骨关节炎生物标志物及其用途
EP1861414B9 (en) 2005-02-07 2011-04-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group b streptococci
EP2243832A3 (en) 2005-02-18 2011-01-05 Gen-Probe Incorporated Sample preparation method incorporating an alkaline shock
WO2006090987A1 (en) 2005-02-28 2006-08-31 Bioquest, Inc. Methods for performing direct enzymatic reactions involving nucleic acid molecules
WO2006095941A1 (en) 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
PL1856257T3 (pl) 2005-03-05 2012-03-30 Seegene Inc Procesy wykorzystujące oligonukleotyd o podwójnej specyficzności oraz oligonukleotyd o podwójnej specyficzności
CA2605158A1 (en) 2005-04-14 2006-10-26 The Trustees Of Boston University Diagnostic for lung disorders using class prediction
EP1712557A1 (en) 2005-04-14 2006-10-18 RWTH Aachen New s-adenosyl-L-methionine analogues with extended activated groups for transfer by methyltransferases
US8124335B2 (en) 2005-05-06 2012-02-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect influenza virus A and B nucleic acids
ES2357902T3 (es) 2005-05-13 2011-05-03 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Cebadores, sondas, procedimientos y usos de los mismos para la detección de mycobacteriium kansasii.
EP1882036B1 (en) 2005-05-17 2012-02-15 Ozgene Pty Ltd Sequential cloning system
EP2476761A3 (en) 2005-07-07 2012-10-17 Athlomics Pty Ltd Polynucleotide marker genes and their expression, for diagnosis of endotoxemia
US7494788B2 (en) 2005-07-11 2009-02-24 Molecular Kinetics, Inc. Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production
US7838646B2 (en) 2005-08-18 2010-11-23 Quest Diagnostics Investments Incorporated Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
US7939258B2 (en) 2005-09-07 2011-05-10 Nugen Technologies, Inc. Nucleic acid amplification procedure using RNA and DNA composite primers
JP2009511086A (ja) 2005-10-17 2009-03-19 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド レジオネラ・ニューモフィラ核酸を検出するための組成物及び方法
US8239136B2 (en) 2005-10-21 2012-08-07 Genenews Inc. Method, computer system and computer-readable medium for determining a probability of colorectal cancer in a test subject
EP1940755A2 (en) 2005-10-28 2008-07-09 Praecis Pharmaceuticals Inc. Methods for identifying compounds of interest using encoded libraries
EP1785434A1 (en) 2005-11-11 2007-05-16 Ludwig-Maximilians-Universität München Targeting and tracing of antigens in living cells
US7831417B2 (en) 2005-11-14 2010-11-09 Gen-Probe Incorporated Parametric calibration method
US8014957B2 (en) 2005-12-15 2011-09-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Genes associated with progression and response in chronic myeloid leukemia and uses thereof
AU2007223788B2 (en) 2006-03-09 2012-11-29 The Trustees Of Boston University Diagnostic and prognostic methods for lung disorders using gene expression profiles from nose epithelial cells
ATE553220T1 (de) 2006-03-13 2012-04-15 Wako Pure Chem Ind Ltd Verfahren zur erkennung eines mutierten gens
WO2007106579A2 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Micronics, Inc. Integrated nucleic acid assays
CN101432426B (zh) 2006-05-02 2012-09-19 和光纯药工业株式会社 胞内分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的胞内分枝杆菌的检测方法
JP5154548B2 (ja) 2006-05-12 2013-02-27 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 腸球菌核酸を検出するための組成物及び方法
CA2740812C (en) 2006-05-25 2016-01-12 Monsanto Technology Llc A method to identify disease resistant quantitative trait loci in soybean and compositions thereof
JP2009539404A (ja) 2006-06-12 2009-11-19 オンコメチローム サイエンシズ エス.エイ. 大腸癌の早期検出および予後のためのメチル化マーカー
WO2008021290A2 (en) 2006-08-09 2008-02-21 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
CN102026645B (zh) 2006-09-15 2016-01-27 渥太华医院研究机构 溶瘤弹状病毒
US9845494B2 (en) 2006-10-18 2017-12-19 Affymetrix, Inc. Enzymatic methods for genotyping on arrays
CA2668235A1 (en) 2006-11-02 2008-06-05 Yale University Assessment of oocyte competence
US8293684B2 (en) 2006-11-29 2012-10-23 Exiqon Locked nucleic acid reagents for labelling nucleic acids
DK2102239T3 (da) 2006-11-30 2012-05-29 Res Dev Foundation Forbedrede immunoglobulin-biblioteker
CN104531684A (zh) 2006-12-18 2015-04-22 和光纯药工业株式会社 鸟分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用它们检测鸟分枝杆菌的方法
US20100150863A1 (en) 2006-12-20 2010-06-17 Bayer Pharmaceuticals Corporation Hydroxy methyl phenyl pyrazolyl urea compound useful in treatment of cancer
WO2008080029A2 (en) 2006-12-21 2008-07-03 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
US7794937B2 (en) 2006-12-22 2010-09-14 Quest Diagnostics Investments Incorporated Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations
GB0701253D0 (en) 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
EP2121983A2 (en) 2007-02-02 2009-11-25 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US8183359B2 (en) 2007-03-01 2012-05-22 Gen-Probe Incorporated Kits for amplifying DNA
PL2191001T3 (pl) 2007-04-09 2017-01-31 University Of Florida Research Foundation, Inc. Kompozycje wektora RAAV mające białka kapsydu zmodyfikowane tyrozyną i sposoby ich zastosowania
DK2076289T3 (da) 2007-04-13 2015-02-09 Dana Farber Cancer Inst Inc Fremgangsmåder til behandling af cancerresistens over for ErbB-lægemider
DK2155789T3 (da) 2007-05-01 2013-10-21 Res Dev Foundation Immunoglobulin-Fc-biblioteker
WO2009085704A2 (en) 2007-12-26 2009-07-09 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect candida albicans nucleic acid
EP2546344A3 (en) 2008-02-08 2013-04-03 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Primer and probe for detecting chlamydophilia caviae, as well as chlamydophilia caviae detection method using the same
US8034568B2 (en) 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
EP2677041A3 (en) 2008-02-19 2014-04-09 MDxHealth SA Detection and prognosis of lung cancer
CA2718092C (en) 2008-03-21 2019-03-19 Oncomethylome Sciences S.A. Detection and prognosis of cervical cancer
WO2009117698A2 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Nugen Technologies, Inc. Methods of rna amplification in the presence of dna
EP2808405B1 (en) 2008-04-21 2018-06-06 Gen-Probe Incorporated Method for Detecting Chikungunya Virus
ES2650066T3 (es) 2008-05-28 2018-01-16 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Cebador y sonda para la detección de Mycobacterium intracellulare, y método para la detección de Mycobacterium intracellulare empleando el cebador o la sonda
EP2151502A1 (en) 2008-07-30 2010-02-10 Lohmann Tierzucht GmbH Genetic variations associated with feather pecking behaviour in avians
CA2679750A1 (en) 2008-09-23 2010-03-23 Nexus Dx, Inc. Methods for detecting nucleic acids in a sample
WO2010038042A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Illumina Cambridge Ltd. Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
EP2210944A1 (en) 2009-01-22 2010-07-28 ATG:biosynthetics GmbH Methods for generation of RNA and (poly)peptide libraries and their use
EP3301446B1 (en) 2009-02-11 2020-04-15 Caris MPI, Inc. Molecular profiling of tumors
AU2010217928B2 (en) 2009-02-26 2013-06-06 Gen-Probe Incorporated Assay for detection of human parvovirus nucleic acid
CA2759611C (en) 2009-04-22 2018-11-13 Indiana University Research And Technology Corporation Compositions and methods for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease and asthma
WO2010126913A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for use in the selective amplification of target sequences
EP2446057B1 (en) 2009-06-23 2014-11-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acid from mollicutes
US9587270B2 (en) 2009-06-29 2017-03-07 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
EP2449132B1 (en) 2009-07-01 2015-05-13 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
US9409983B2 (en) 2009-07-23 2016-08-09 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases
US10174368B2 (en) 2009-09-10 2019-01-08 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods and systems for sequencing long nucleic acids
WO2011032040A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Centrillion Technology Holding Corporation Methods of targeted sequencing
WO2011032088A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Arca Biopharma, Inc. Polymorphisms in the pde3a gene
ES2848650T3 (es) 2009-09-14 2021-08-11 Sillajen Biotherapeutics Inc Terapia combinada contra el cáncer con virus vaccinia oncolítico
US8182994B2 (en) 2009-09-15 2012-05-22 Illumina Cambridge Limited Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing
WO2011036173A1 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Oncomethylome Sciences S.A. Detection and prognosis of cervical cancer
CA2779223A1 (en) 2009-10-27 2011-05-12 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling for personalized medicine
KR20110050327A (ko) 2009-11-07 2011-05-13 주식회사 씨젠 Thd 프라이머 타겟 검출
US8501122B2 (en) 2009-12-08 2013-08-06 Affymetrix, Inc. Manufacturing and processing polymer arrays
AU2010329551B2 (en) 2009-12-10 2016-02-11 Turnstone Limited Partnership Oncolytic rhabdovirus
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
WO2011078441A1 (en) 2009-12-21 2011-06-30 Seegene, Inc. Tsg primer target detection
DK2515899T3 (en) 2009-12-23 2016-08-15 Arca Biopharma Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR CARDIOVASCULAR DISEASES AND CONDITIONS
EP2529026B1 (en) 2010-01-25 2013-11-13 Rd Biosciences Inc. Self-folding amplification of target nucleic acid
CA2786569C (en) 2010-01-29 2019-04-09 Micronics, Inc. Sample-to-answer microfluidic cartridge
WO2011103274A1 (en) 2010-02-17 2011-08-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid
EP2557156B1 (en) 2010-03-23 2015-02-11 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Primer and probe for detecting chlamydia trachomatis, and method for detecting chlamydia trachomatis using same
ES2713873T3 (es) 2010-04-16 2019-05-24 Nuevolution As Complejos bifuncionales y métodos para hacer y utilizar tales complejos
CN103079567A (zh) 2010-04-17 2013-05-01 拜尔健康护理有限责任公司 用于疾病和病症的治疗和预防的氟取代的ω-羧基芳基二苯脲的合成代谢产物
CA3011697C (en) 2010-04-21 2020-04-07 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect herpes simplex virus nucleic acids
KR101176139B1 (ko) 2010-05-20 2012-08-22 광주과학기술원 관절염 동물모델로서 연골 특이적 HIF?2α 형질전환 마우스 및 이의 용도
KR101223660B1 (ko) 2010-05-20 2013-01-17 광주과학기술원 HIF-2α 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
EP2593569B1 (en) 2010-07-12 2018-01-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect seasonal h1 influenza a virus nucleic acids
EP2743704A3 (en) 2010-07-23 2014-06-25 Beckman Coulter, Inc. System or method of including analytical units
WO2012030856A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and reaction mixtures for the detection of xenotropic murine leukemia virus-related virus
GB2497495B (en) 2010-10-04 2018-06-06 Gen Probe Prodesse Inc Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
US8563298B2 (en) 2010-10-22 2013-10-22 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
ES2576927T3 (es) 2010-10-22 2016-07-12 T2 Biosystems, Inc. Sistemas de RMN y métodos para la detección rápida de analitos
WO2012090073A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity
CN103429258B (zh) 2011-01-04 2016-03-09 新罗杰公司 通过施用溶瘤痘苗病毒生成针对肿瘤抗原的抗体和生成肿瘤特异性补体依赖性细胞毒性
AU2012214643B2 (en) 2011-02-07 2016-12-15 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin Fc polypeptides
WO2012109500A2 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of nucleic acids
EP2813851B1 (en) 2011-02-24 2016-06-08 Hill's Pet Nutrition, Inc. Compositions and methods for diagnosing kidney disorders in a feline
CA2828532A1 (en) 2011-02-28 2012-11-22 University Of Iowa Research Foundation Anti-mullerian hormone changes in pregnancy and prediction of adverse pregnancy outcomes and gender
AU2012226530B2 (en) 2011-03-08 2016-12-01 King Abdullah University Of Science And Technology Molecular biomarker set for early detection of ovarian cancer
WO2012122571A1 (en) 2011-03-10 2012-09-13 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for the selection and optimization of oligonucleotide tag sequences
US20120252682A1 (en) 2011-04-01 2012-10-04 Maples Corporate Services Limited Methods and systems for sequencing nucleic acids
EP2694678A2 (en) 2011-04-04 2014-02-12 Netherland Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
AU2012240240A1 (en) 2011-04-04 2013-05-09 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors
KR101291668B1 (ko) 2011-04-21 2013-08-01 서울대학교산학협력단 미코박테리아―대장균용 셔틀 벡터 및 이의 용도
US9657352B2 (en) 2011-04-25 2017-05-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid
CN103945864A (zh) 2011-04-25 2014-07-23 先进生物学实验室股份有限公司 截短的hiv包膜蛋白(env)、其相关方法和组合物
WO2012167382A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
JP5930556B2 (ja) 2011-06-15 2016-06-08 ヒルズ・ペット・ニュートリシャン・インコーポレーテッド ネコ科動物における甲状腺機能亢進症を診断および監視する組成物および方法
CA2839896A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
MX2013013627A (es) 2011-06-21 2014-04-25 Oncofactor Corp Composiciones y metodos para la terapia y diagnostico de cancer.
ES2945966T3 (es) 2011-07-15 2023-07-11 Gen Probe Inc Composiciones y procedimiento para detectar ácido nucleico del parvovirus humano y ácido nucleico del virus de la hepatitis A
WO2013024173A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Technische Universität München Computer implemented method for identifying regulatory regions or regulatory variations
AU2012304327B2 (en) 2011-09-08 2015-07-09 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid
US10040853B2 (en) 2011-09-09 2018-08-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving NKG2D inhibitors and cancer
FR2981088B1 (fr) 2011-10-06 2013-11-29 Biomerieux Sa Arn polymerases mutees
WO2013064163A1 (en) 2011-11-01 2013-05-10 Academisch Medisch Centrum Methylation markers for colorectal cancer
KR20140091033A (ko) 2011-11-07 2014-07-18 베크만 컬터, 인코포레이티드 검체 컨테이너 검출
EP3373015A1 (en) 2011-11-07 2018-09-12 Beckman Coulter Inc. Aliquotter system and workflow
KR20140091032A (ko) 2011-11-07 2014-07-18 베크만 컬터, 인코포레이티드 검체 수송 시스템의 자기 감쇠
JP6082018B2 (ja) 2011-11-07 2017-02-15 ベックマン コールター, インコーポレイテッド サンプルを処理するためのシステムおよび方法
CN104105969B (zh) 2011-11-07 2016-10-12 贝克曼考尔特公司 离心机系统和工作流程
ES2844324T3 (es) 2011-11-07 2021-07-21 Beckman Coulter Inc Brazo robótico
KR102035877B1 (ko) 2011-11-14 2019-10-23 알파시그마 에스.피.에이. 우울증이 있는 대상체를 위한 치료 양생법 선택을 위한 검정법 및 치료 방법
DE102011120550B4 (de) 2011-12-05 2013-11-07 Gen-Probe Prodesse, Inc. Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren
JP6189857B2 (ja) 2011-12-19 2017-08-30 ヒルズ・ペット・ニュートリシャン・インコーポレーテッド 伴侶動物において甲状腺機能亢進症を診断および治療するための組成物および方法
WO2013093629A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Netherlands Cancer Institute Modular vaccines, methods and compositions related thereto
US20140349858A1 (en) 2011-12-22 2014-11-27 Ibis Bioscience, Inc. Amplification of a sequence from a ribonucleic acid
US9701959B2 (en) 2012-02-02 2017-07-11 Invenra Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
AU2013205010B2 (en) 2012-02-24 2016-10-20 Gen-Probe Incorporated Detection of Shiga toxin genes in bacteria
US11177020B2 (en) 2012-02-27 2021-11-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
SG11201405274WA (en) 2012-02-27 2014-10-30 Cellular Res Inc Compositions and kits for molecular counting
EP3461910B1 (en) 2012-04-19 2020-08-26 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
CN114854832A (zh) 2012-04-19 2022-08-05 生命技术公司 核酸扩增
AU2013205110B2 (en) 2012-04-24 2016-10-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, Methods and Kits to Detect Herpes Simplex Virus Nucleic Acids
AU2013205064B2 (en) 2012-06-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid
AU2013205087B2 (en) 2012-07-13 2016-03-03 Gen-Probe Incorporated Method for detecting a minority genotype
US9932628B2 (en) 2012-07-27 2018-04-03 Gen-Probe Incorporated Dual reference calibration method and system for quantifying polynucleotides
AU2013202808B2 (en) 2012-07-31 2014-11-13 Gen-Probe Incorporated System and method for performing multiplex thermal melt analysis
US9139870B2 (en) 2012-08-30 2015-09-22 Gen-Probe Incorporated Multiphase nucleic acid amplification
WO2014043143A1 (en) 2012-09-11 2014-03-20 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
EP2895620B1 (en) 2012-09-11 2017-08-02 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
EP2904120B1 (en) 2012-10-04 2018-01-10 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Methods and reagents for detection, quantitation, and serotyping of dengue viruses
AU2013205122B2 (en) 2012-10-11 2016-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Human Papillomavirus Nucleic Acid
AU2013205090B2 (en) 2012-12-07 2016-07-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Gastrointestinal Pathogen Nucleic Acid
ES2730690T3 (es) 2012-12-07 2019-11-12 Suppremol Gmbh Estratificación y tratamiento de pacientes que padecen púrpura trombocitopénica idiopática
EP3549674B1 (en) 2012-12-21 2020-08-12 PerkinElmer Health Sciences, Inc. Low elasticity films for microfluidic use
KR20150097764A (ko) 2012-12-21 2015-08-26 마이크로닉스 인코포레이티드. 휴대형 형광 검출 시스템 및 미량분석 카트리지
JP6498125B2 (ja) 2012-12-21 2019-04-10 マイクロニクス, インコーポレイテッド 流体回路および関連する製造方法
US10125373B2 (en) 2013-01-22 2018-11-13 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
US10077475B2 (en) 2013-01-24 2018-09-18 California Institute Of Technology FRET-based analytes detection and related methods and systems
EP2948566A4 (en) 2013-01-24 2016-10-05 California Inst Of Techn CHROMOPHORE-BASED CHARACTERIZATION AND DETECTION METHODS
RU2684211C2 (ru) 2013-02-21 2019-04-04 Тёрнстоун Лимитед Партнершип Композиция вакцины
AU2013202805B2 (en) 2013-03-14 2015-07-16 Gen-Probe Incorporated System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer
US9255265B2 (en) 2013-03-15 2016-02-09 Illumina, Inc. Methods for producing stranded cDNA libraries
AU2014228343B2 (en) 2013-03-15 2019-11-07 Gen-Probe Incorporated Calibration method, apparatus and computer program product
KR101403507B1 (ko) 2013-03-21 2014-06-09 주식회사 현일바이오 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트
US9340817B2 (en) 2013-03-27 2016-05-17 Sample6 Technologies, Inc. Methods of making recombinant phage, compositions and articles of manufacture of same for bacterial detection
KR101507505B1 (ko) 2013-04-18 2015-04-07 사회복지법인 삼성생명공익재단 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법
CA2911308C (en) 2013-05-07 2021-10-19 Micronics, Inc. Device for preparation and analysis of nucleic acids
EP2994532B1 (en) 2013-05-07 2017-11-15 Micronics, Inc. Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions
US10386377B2 (en) 2013-05-07 2019-08-20 Micronics, Inc. Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching
WO2014183023A1 (en) 2013-05-09 2014-11-13 Trustees Of Boston University Using plexin-a4 as a biomarker and therapeutic target for alzheimer's disease
EP3011062A4 (en) 2013-06-19 2017-06-14 Sample6 Technologies Inc. Phage-based bacterial detection assay
WO2015018943A2 (en) 2013-08-08 2015-02-12 Institut Pasteur Correlation of disease activity with clonal expansions of human papillomavirus 16-specific cd8+ t-cells in patients with severe erosive oral lichen planus
US10047406B2 (en) 2013-08-14 2018-08-14 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting HEV nucleic acid
KR20230074639A (ko) 2013-08-28 2023-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
WO2015051110A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare
EP3068903B1 (en) 2013-11-15 2019-02-13 Institut Pasteur A molecular marker of plasmodium falciparum artemisinin resistance
CN106103713B (zh) 2014-02-03 2021-05-28 赛默飞世尔科技波罗的海封闭股份公司 用于经控制dna片段化的方法
KR20170016915A (ko) 2014-06-11 2017-02-14 마이크로닉스 인코포레이티드. 핵산의 분석을 위한 통합 검정 대조군을 갖는 마이크로 유체 공학적 카트리지 및 장치
GB201415349D0 (en) 2014-08-29 2014-10-15 Univ Leuven Kath Cofactor analogues for methyltransferases
EP3224362A4 (en) 2014-11-26 2018-06-06 The Regents of The University of California Therapeutic compositions comprising transcription factors and methods of making and using the same
AU2015360694B2 (en) 2014-12-08 2021-10-14 Berg Llc Use of markers including filamin a in the diagnosis and treatment of prostate cancer
EP3736346B1 (en) 2015-01-09 2023-12-20 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for diagnosing bacterial vaginosis
KR101718800B1 (ko) 2015-01-21 2017-03-24 주식회사 디알나노 약물 및 siRNA의 공동―운반용 나노복합체 및 이의 용도
JP6724023B2 (ja) 2015-02-09 2020-07-15 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 改善された補体活性化を示す操作された免疫グロブリンfcポリペプチド
EP3064592A1 (en) 2015-03-06 2016-09-07 Brigitte König Methods for the qualitative and quantitative detection of microbes in a sample
JP6796593B2 (ja) 2015-03-16 2020-12-09 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物
JP6698708B2 (ja) 2015-06-09 2020-05-27 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 分子タグ付けのための方法、システム、組成物、キット、装置、及びコンピュータ可読媒体
CN108026575B (zh) 2015-07-17 2022-08-19 哈佛学院董事及会员团体 扩增核酸序列的方法
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
RU2706203C1 (ru) 2015-10-18 2019-11-14 Эффиметрикс, Инк. Мультиаллельное генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов и индел-мутаций
KR101651817B1 (ko) 2015-10-28 2016-08-29 대한민국 Ngs 라이브러리 제작용 프라이머 세트 및 이를 이용한 ngs 라이브러리 제작방법 및 키트
WO2017100283A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Life Technologies Corporation Detection and quantification of nucleic acid molecules associated with a surface
EP3400309A2 (en) 2016-01-04 2018-11-14 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting candida species
LT3402880T (lt) 2016-01-15 2024-03-12 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Termofiliniai dnr polimerazės mutantai
WO2017127727A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 T2 Biosystems, Inc. Rapid antimicrobial susceptibility testing using high-sensitivity direct detection methods
KR101845957B1 (ko) 2016-02-23 2018-04-05 전남대학교기술지주회사(주) 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법
CA3020581A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 T2 Biosystems, Inc. Methods and systems for amplification in complex samples
EP3465200A4 (en) 2016-06-05 2020-07-08 Berg LLC PATIENT STRATIFICATION SYSTEMS AND METHODS AND IDENTIFICATION OF POTENTIAL BIOMARKERS
AU2017278065B2 (en) 2016-06-10 2020-09-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Zika virus nucleic acid
ES2919927T3 (es) 2016-08-10 2022-07-29 Pasteur Institut Métodos y reactivos para la detección del paludismo por Plasmodium falciparum resistente a la piperaquina
WO2018071522A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Life Technologies Corporation Rapid amplification of nucleic acids
CA3040907A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis c virus
EP3541959A1 (en) 2016-11-21 2019-09-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis b virus
CA3046303A1 (en) 2016-12-29 2018-07-05 Seegene, Inc. Method for reducing primer dimer formation and increasing amplification efficiency
KR101936799B1 (ko) 2017-01-09 2019-01-11 주식회사 엠이티라이프사이언스 구강전암의 치료용 약학 조성물 및 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단 방법
US20190390278A1 (en) 2017-01-26 2019-12-26 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare
WO2018146162A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Academisch Medisch Centrum Molecular biomarker for prognosis of sepsis patients
EP4279613A2 (en) 2017-03-24 2023-11-22 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus
JP6994513B2 (ja) 2017-03-24 2022-03-04 ジェン-プローブ・インコーポレーテッド 試料中のウイルス病原体を検出するための組成物および方法
US11603557B2 (en) 2017-06-02 2023-03-14 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
US11441174B2 (en) 2017-06-02 2022-09-13 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
CA3064603A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Gen-Probe Incorporated Detecting babesia species nucleic acid in a sample
US11542540B2 (en) 2017-06-16 2023-01-03 Life Technologies Corporation Control nucleic acids, and compositions, kits, and uses thereof
WO2019002178A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab DNA MUTANTS THERMOPHILIC POLYMERASES
JP6997287B2 (ja) 2017-07-10 2022-02-03 ジェン-プローブ・インコーポレーテッド 試料割り当てパラメータを使用した核酸増幅のための分析システムおよび方法
WO2019017680A2 (ko) 2017-07-19 2019-01-24 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miRNA 및 이를 이용한 진단키트
KR101956315B1 (ko) 2017-07-19 2019-03-08 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miR494 및 이를 이용한 진단키트
AU2018316218A1 (en) 2017-08-11 2020-03-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Staphylococcus aureus
WO2019094578A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Assays and methods for determining expression of the lect2 gene
EP3710595A1 (en) 2017-11-17 2020-09-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting c1orf43 nucleic acid
CN111902213B (zh) 2018-01-29 2022-12-06 简·探针公司 分析系统和方法
GB2597567B (en) 2018-06-13 2022-11-23 Gen Probe Inc Compositions and methods for detecting group B streptococcus nucleic acid
WO2020014400A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Gen-Probe Incorporated Methods and systems for detecting and quantifying nucleic acids
CA3106975A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acids of epstein-barr virus
CN109306376B (zh) * 2018-08-03 2022-06-24 国家卫生计生委科学技术研究所 检验核酸扩增均一性的质量控制标准品及其制备方法
CA3108105A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
AU2019326462A1 (en) 2018-08-21 2021-03-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus
AU2019324196A1 (en) 2018-08-24 2021-03-18 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis
WO2020053808A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Georg Dewald Method of diagnosing vasoregulatory disorders
EP3856934A2 (en) 2018-09-27 2021-08-04 Gen-Probe Incorporated COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING BORDETELLA PERTUSSIS AND BORDETELLA
PARAPERTUSSIS NUCLEIC ACID
EP3870722A1 (en) 2018-10-22 2021-09-01 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human polyomavirus bk virus
AU2019371161A1 (en) 2018-10-31 2021-06-17 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Biomarkers and methods of use for radiation-induced lung injury
MX2021006234A (es) 2018-11-30 2021-09-10 Caris Mpi Inc Perfilado molecular de proxima generacion.
TW202030333A (zh) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
WO2020142347A2 (en) 2018-12-31 2020-07-09 Gen-Probe Incorporated Systems and methods for filling multi-well cartridges with solid reagents
US20220220564A1 (en) 2019-04-17 2022-07-14 Igenomix, S.L. Improved methods for the early diagnosis of uterine leiomyomas and leiomyosarcomas
AU2020265250A1 (en) 2019-04-30 2021-11-18 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for determining effectiveness of frataxin replacement therapy
CN114080361B (zh) 2019-05-03 2024-02-02 简·探针公司 用于分析系统的容器输送系统
US20220180971A1 (en) 2019-06-14 2022-06-09 Seegene, Inc. Computer-implemented method for collaborative development of reagents for detection of target nucleic acids
CN114096683A (zh) 2019-07-03 2022-02-25 简·探针公司 用于确定样品中阴道毛滴虫的存在的寡核苷酸
WO2021041056A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
EP4025715A1 (en) 2019-09-05 2022-07-13 Gen-Probe Incorporated Detection of chlamydia trachomatis nucleic acid variants
EP4069865A4 (en) 2019-12-02 2023-12-20 Caris MPI, Inc. PLATINUM RESISTANCE TEST FOR PAN CANCER
CA3163936A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Gen-Probe Incorporated Quantification of polynucleotide analytes from dried samples
JP2023516683A (ja) 2020-03-04 2023-04-20 ジェン-プローブ・インコーポレーテッド SARS-CoV-2核酸を検出するための組成物および方法
US20230220499A1 (en) 2020-05-07 2023-07-13 Grifols Diagnostic Solutions Inc. Methods and compositions for detecting sars-cov-2 nucleic acid
KR20230007464A (ko) 2020-06-05 2023-01-12 주식회사 씨젠 호흡기 병원체 검출을 위한 검체수송 키트 및 이를 이용한 호흡기 병원체 검출방법
EP4172370A1 (en) 2020-06-30 2023-05-03 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting lung cancer
WO2022047359A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Berg Llc Protein biomarkers for pancreatic cancer
JP2023546566A (ja) 2020-10-21 2023-11-06 ジェン-プローブ・インコーポレーテッド 流体コンテナ管理システム
CA3214833A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Bpgbio, Inc. Protein markers for the prognosis of breast cancer progression
WO2022216846A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Berg Llc Protein markers for estrogen receptor (er)-positive-like and estrogen receptor (er)-negative-like breast cancer
IL307530A (en) 2021-04-06 2023-12-01 Bpgbio Inc Estrogen receptor-like (ER) breast cancer protein markers LUMINAL A (LA) and LUMINAL B1 (LB1)
KR20240035874A (ko) 2021-07-21 2024-03-18 주식회사 씨젠 검수 수집 장치 및 검체 수집 방법
AU2022319876A1 (en) 2021-07-27 2024-01-18 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens
WO2023075394A1 (ko) 2021-10-29 2023-05-04 주식회사 씨젠 검체 채취 스왑 도구 및 호흡기 병원체의 검출 방법
US20230357851A1 (en) 2022-04-06 2023-11-09 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring frataxin-replacement therapy
EP4282980A1 (en) 2022-05-23 2023-11-29 Mobidiag Oy Methods for amplifying a nucleic acid
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023240201A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring progression and treatment of leigh syndrome
US20240010742A1 (en) 2022-06-10 2024-01-11 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof
WO2024054924A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0128042A3 (en) 1983-06-06 1985-01-16 Genentech, Inc. A process for indentifying or isolating a dna sequence, and a dna hybridization probe therefor
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
AU606043B2 (en) * 1985-03-28 1991-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of viruses by amplification and hybridization
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DK171161B1 (da) * 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
CA1339653C (en) * 1986-02-25 1998-02-03 Larry J. Johnson Appartus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
FI76119C (fi) 1986-02-27 1988-09-09 Orion Yhtymae Oy Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8852868B2 (en) 2010-04-28 2014-10-07 Shimadzu Corporation Method for real-time nucleic acid amplification by droplet manipulation
WO2012029993A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Riken Method of detecting type ii diabetes
US9517472B2 (en) 2010-12-21 2016-12-13 Shimadzu Corporation Device and method for processing target component in tube
US9714445B2 (en) 2011-12-22 2017-07-25 Shimadzu Corporation Chip device for manipulating object component, and method using the same
WO2013129542A1 (ja) 2012-02-29 2013-09-06 独立行政法人理化学研究所 Hla-a*31:01アレルの検出方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE3856428D1 (de) 2000-11-02
DE3852177T3 (de) 2000-06-15
KR890701741A (ko) 1989-12-21
PT87769B (pt) 1992-10-30
HU216317B (hu) 1999-06-28
DE3852177D1 (de) 1995-01-05
NO895090D0 (no) 1989-12-18
DE3852177T2 (de) 1995-04-06
EP0623683B1 (en) 2000-09-27
FI93743C (fi) 1995-05-26
JPH02500565A (ja) 1990-03-01
DE3856428T2 (de) 2001-04-19
NO303068B1 (no) 1998-05-25
DK175614B1 (da) 2004-12-27
IE950293L (en) 1988-12-19
KR960014107B1 (ko) 1996-10-14
ATE114335T1 (de) 1994-12-15
PT87769A (pt) 1989-05-31
NZ225077A (en) 1991-06-25
DK644489D0 (da) 1989-12-19
WO1988010315A1 (en) 1988-12-29
EP0368906B1 (en) 1994-11-23
BR8807097A (pt) 1989-10-17
EP0623683A1 (en) 1994-11-09
IE65089B1 (en) 1995-10-04
FI93743B (fi) 1995-02-15
IL86724A0 (en) 1988-11-30
DK644489A (da) 1990-02-19
EP0368906A1 (en) 1990-05-23
HUT52823A (en) 1990-08-28
NO895090L (no) 1990-02-19
ATE196657T1 (de) 2000-10-15
GR880100396A (el) 1989-03-08
ES2009286A6 (es) 1989-09-16
IL86724A (en) 1995-01-24
FI896077A0 (fi) 1989-12-19
EP0368906B2 (en) 1999-08-04
IE881848L (en) 1988-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2843586B2 (ja) 転写に基づいた核酸増幅/検出系
US5466586A (en) Method for the synthesis of ribonucleic acid (RNA)
JP3152927B2 (ja) 自己持続性、配列複製システム
DK175944B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af en dobbeltstrenget nucleinsyre som inkluderer en promotor der er operabelt forbundet til en sekvens, som skal detekteres, og en fremgangsmåde, der er anvendelig til detektion af en specifik nucleinsyresekvens ......
US5554517A (en) Nucleic acid amplification process
EP0329822A2 (en) Nucleic acid amplification process
JPH04503451A (ja) 自己持続性、配列複製システム
AU623602B2 (en) Transcription-based nucleic acid amplification/detection systems
IE19950293A1 (en) Transcription-based nucleic acid amplification/detection systems
IE83297B1 (en) Transcription-based nucleic acid amplification/detection systems

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071023

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081023

Year of fee payment: 10

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081023

Year of fee payment: 10