JP2843586B2 - 転写に基づいた核酸増幅／検出系 - Google Patents

転写に基づいた核酸増幅／検出系

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は一般に分子生物学および分子遺伝学の進歩に
関する。
より詳細には、本発明はRNA、DNAまたはそれらの両方
でありうる１種以上の核酸を含む試料中の少なくとも１
種の所定の核酸セグメント（配列）またはその相補鎖も
しくはハイブリツド形成性相同セグメントのin vitroま
たはｘ−vivoコピー数を増加させる（すなわち、増幅さ
せる）ための新規な方法、必要な試薬類を含むキツト、
および手段に関する。
本発明の方法およびキツトが利用される適用例には、
１）in vitroまたはｘ−vivo核酸プローブハイブリダイ
ゼーシヨン検定により遺伝病または病原体による疾患に
特徴的な特定の核酸配列を検出するための体液および組
織の分析、並びに２）単一コピーの、珍しい、または低
発現率の遺伝子の選択的クローニングが含まれる。
発明の背景 分子生物学、分子遺伝学およびそれらの応用（例え
ば、血液由来の病原体や欠損遺伝子の核酸プローブハイ
ブリダイゼーシヨン検定）における研究の多くは、特定
の核酸配列の検出または分離を包含する。このような研
究の根本的問題は、対象となる核酸配列を検出または分
離し、その後定量化することにある。その問題は細胞培
養物、組織標本および血液試料のような生物学的材料が
RNAおよびDNAの複雑な混合物から成り、しかも非常に小
さい画分が対象配列を含むにすぎないので難しいものと
なつている。
実際に、核酸プローブハイブリダイゼーシヨン検定の
応用は、日常一般的使用に適する試薬を使用し且つ許容
しうる程度に短い時間で実施する場合、試料中に含まれ
る対象配列の低い濃度では、検定の感度が低すぎてそれ
らを検出できないために制限されている。
複雑な核酸混合物中に低濃度で存在する対象の核酸配
列（標的セグメント）を検出する問題を解決するため
に、基本的に異なる２つの手法が考えられた。
第一の手法では、試料中に含まれる核酸（標的セグメ
ントを含む）の量を変えず、その代わりに、信号発生系
を標的セグメントに結合させて、標的セグメントの分子
数に相当する検出可能な信号を発生させる。例えば、標
的セグメントのサブセグメントに相補的な配列を有する
核酸プローブをアルカリ性ホスフアターゼのような酵素
に結合させ、それをプローブと標的セグメントの間でハ
イブリダイゼーシヨンが起こる（しかし、プローブと試
料中の他の核酸配列の間では起こらない）ハイブリダイ
ゼーシヨン条件下で試料と混合する。ハイブリダイズし
なかつた酵素結合プローブを除いた後、アルカリ性ホス
フアターゼ用の発色性基質を適当な条件下で加え、そし
て、原理的には標的セグメントにハイブリダイズした各
プローブ分子に対して多数の検出しうる着色分子を速や
かに形成させる。
試料中の標的核酸の量を変えずに核酸配列を検出する
方法は他にも当分野で多数知られている。例えば、32P
のような放射性原子で核酸プローブを慣例的にラベリン
グし、その後放射性核種の崩壊により生ずる増幅信号か
ら標的にハイブリダイズしたプローブを検出する。さら
に別の例は標的セグメントに対するプローブを複製可能
な別の核酸に結合させて、既知技術で容易に検出できる
ようにしたものである。ある種のRNAはバクテリオフア
ージRNA依存性RNAポリメラーゼ（例えば、Ｑβレプリカ
ーゼやブロームモザイクウイルス（brome mosaic viru
s:BMV）由来のレプリカーゼ）のようなポリメラーゼに
よるレプリカーゼ誘導複製（自己触媒的に誘導される複
製）を受けやすいことが知られている。このような系に
おいては、RNAと相補的配列のRNAとの両方がRNAポリメ
ラーゼによる複製の鋳型となり、その結果複製RNAの量
は（RNA鋳型分子の数が系中のRNAポリメラーゼ分子の数
を越えない限り）時間がたつにつれて指数的に増加す
る。Miele et at.,J.Mol.Biol.171、281（1983）を参照
されたい。標的セグメントに対するプローブがＱβレプ
リカーゼによつて複製され得るRNAに結合された系はChu
et al.,Nucl.Acids Res.14、5591（1986）に記載され
ており、BMVレプリカーゼによつて複製され得るRNAに結
合された系はMarsh et al.,Positive Strand RNA Virus
es,Alan R.Liss（publr.;New York）（1987;Proceeding
s of UCLA Symposium,1986）に記載されている。
第一の手法は２つの重大な欠点を有している。まず第
一に、多くの場合において、実際の大きさの試料に含ま
れる標的セグメントのコピー数は非常に低いので、かな
り迅速な信号発生系でさえも、バツクグラウンドを有意
に越える検出可能な信号を発生させるのに要する時間が
長くなり、実用的でない。第二に、“バツクグラウン
ド”信号発生分子と標的に結合した信号発生分子とは本
質的に同じ速度で信号を発する。標的セグメントの検定
において、“バツクグラウンド”による信号は避けられ
ず、すなわち、フイルターや他の担体に非特異的に付着
したプローブ、または標的セグメントによく似ている配
列をもつセグメントにハイブリダイズしたプローブによ
つて発せられる信号が若干存在する。標的なコピー数が
あまりに低い場合は、標的＋バツクグラウンドからの信
号（すなわち、“信号”）対バツクグラウンドからの信
号（すなわち、“ノイズ”）の時間定数比はあまりに低
すぎて有意にバツクグラウンドを越えて検出できないで
あろう。これらの欠点および他の欠点は、複雑な核酸混
合物中に低レベルで存在する標的セグメントを検出する
問題を解決する第二の手法へ導いた。
この第二の手法は根本的に相違しており、標的セグメ
ントそれ自体のコピー数を、好ましくは試料中の他の配
列（特に配列の類似性ゆえに標的セグメントとして誤つ
て検出される恐れのあるもの）よりも多くなるまで、増
加させることを包含する。この第二の手法の例は、標的
セグメントを保有する細胞の数を、往々にして多数の他
の細胞よりも一層速やかに増殖させる培養技術、あるい
は標的セグメントを含む特定の核酸（例えばプラスミド
やRNA）の数を増加させる種々の培養技術を必要とす
る。
このような培養技術は煩わしく、疑わしく、しかも時
間がかかるという難点を有しており、避けられない事
実：すなわち、標的セグメントを含むもの以外の核酸も
そのコピー数が同時に増加し、“バツクグラウンド”を
高める可能性があるという事実、が明らかになつた。そ
の他の難点は、増幅を達成させるのに必要な工程が危険
でありうる微生物を結果的に増やすことになるというも
のである。
この第二の手法のもう一つの例は、いわゆる“ポリメ
ラーゼ鎖伸長反応（PCR）”によるDNA標的セグメントの
増幅である。この技術は、例えば、ある種のウイルスの
１本鎖DNAゲノムの複製過程で起こることが知られた自
然界の方法を借りて適合させたものであり、いずれにせ
よ、Hong,Bioscience Reports 1、243（1981）;Cooke e
t al.,J.Biol.Chem.255、6502（1980）；およびZoller
et al.,Methods in Enzymology 100、468−500（1983）
に記載されるcDNA作製に類似した方法である。この技術
によれば、特定セグメントのコピー数が多数のサイクル
を重ねるたびに指数的に増加し、各サイクルは（１）標
的セグメントおよびその相補鎖（すなわち、標的セグメ
ント相補的な配列をもつセグメント）のそれぞれの３′
末端サブセグメントにDNAプライマーをハイブリダイズ
させ、（２）そのプライマーをDNAポリメラーゼで伸長
させ、そして（３）段階（２）で得られた２本鎖を熱変
性して１本鎖にする、ことを包含している。この技術は
Saiki et al.,Science 230、1350（1985）、およびMull
is et al.,欧州特許出願公開第200362号および第201184
号に開示されている。この技術を約３時間にわたつて20
回繰り返すことにより、標的セグメントのコピー数を約
105倍まで増加しうることが報告されている。これらの
セグメントのみに特定のプライマーが十分安定した状態
でハイブリダイズしてポリメラーゼによる鎖伸長を開始
し、それにより相補鎖を形成し、またはこれらのセグメ
ントが相補鎖を有し、その相補鎖に別の特定プライマー
が同様にハイブリダイズして鎖伸長の際に標的セグメン
トを生成するので、それらのコピー数は指数的に増加す
る。一方、用いたプライマーと誤つてハイブリダイズし
た他の非標的セグメントはそのコピー数が、増加するに
しても、せいぜいサイクル数の関数として線状に増加す
るにすぎない。このポリメラーゼ鎖伸長反応技術は、標
的セグメントのコピー数ばかりでなく、標的セグメント
の量対バツクグラウンドの原因となるセグメントの量の
比を非常に高めることができる。
もちろん、この第二手法は増幅された標的セグメント
に対して適用される第一の手法と併用することによつ
て、さらに強い検出信号を得ることができる。
本発明の目的は、従来技術によつて提出された問題点
を解決し且つこれらの問題点を解決しようとして研究者
らが列挙した難点を克服することである。本発明の他の
目的は、既知試薬の有利性を利用し且つ一定の科学的結
果に到達するのに必要な精度を有し、短時間で利用でき
る簡便な技術、すなわち再現可能な検定設備で使用する
ことができ且つ実験室／臨床分析用キツトとして応用し
うる技術を提供することである。
従つて、本発明の目的は、ある種の核酸配列（標的セ
グメント）の検出可能性を、従来技術の努力によつて列
挙された難点を排除したin vitroまたはｘ−vivo系での
標的配列の増幅により高めることである。
本発明は、複雑な核酸混合物中に低レベルで存在する
標的セグメントを検出する第二の手法を実施するための
新規な技術に関する。それは完全なサイクルとして標的
配列の合成２本鎖cDNAコピーと共に、それらから誘導さ
れる新規なRNA転写生産段階を用いるものである。多数
のサイクルが実施される。この転写段階は新規な面を構
成するので、本明細書においては便宜上転写に基づいた
増幅系（transcription−based amplificati−on syste
m:TAS）と呼ぶことにする。本発明の新規なTAS技術は、
DNA依存性RNAポリメラーゼの２つの性質：すなわち
（１）各ポリメラーゼに対し特異的なほんの少数の配列
からの転写開始、例えばBrown et al.,Nucl.Acids Res.
14、3521（1986）を参照；および（２）RNAポリメラー
ゼによつて認識されるプロモーターの各コピーからの多
数の転写物の迅速な生産（一般的には102〜104／時）、
例えばMilligan et al.,Nucleic Acids Res.15、8783
（1987）を参照；を利用することによつて所定の標的セ
グメントのコピー数を速やかに増加させる。本発明のこ
の技術は、RNA依存性RNAレプリカーゼによつて迅速に
（自己触媒的に）複製されるある配列のRNAの能力をも
利用し得る。Mieleらの上記文献を参照されたい。さら
に、それは試料中に存在する標的DNAの量の疑う余地の
ない測定を可能にする標準化技術を提供する。
本発明は、（もし自己触媒的複製を誘導しないなら
ば）標的セグメントの配列または標的セグメントに相補
的な配列のサブセグメントを有し且つ相補配列のサブセ
グメントを有する核酸に比べて大過剰で存在する１本鎖
RNA転写物、またはそれから形成された２本鎖RNA−DNA
（その形成を妨げる測定が行われない場合）をもたら
す。初期におけるこの過剰の１本鎖RNA転写物は増幅産
物を標識核酸プローブにより検出する方法において有利
である。その理由は、増幅産物にハイブリダイズするプ
ローブと競合する相補配列のセグメントが少ししか存在
しないからである。また、１本鎖RNA転写物は多かれ少
なかれ連続して切り落とされ、厄介な、誤りやすい反復
PCRサイクルおよび鎖分離の必要がない標的セグメント
の直接検出をもたらす。このような利点は、検出前に、
しかも許容しうる増幅レベルに到達するのに必要な多数
回の反復サイルクの後に、分離する必要のある２本鎖DN
A（一方の鎖は標的セグメントを含み、他方の鎖は標的
セグメントの相補鎖を含む）をもたらすPCR技術によつ
ては得られない。
本発明の技術は、ほぼ同じ時間にわたつてPCR技術と
少なくとも同じくらい多量に所定の標的セグメントを増
幅させるが、はるかに簡単でしかも再現性のある方法で
あり、自然界の方法または他の技術と明瞭に区別し得
る。
発明の要約 本発明者らは、バクテリオフアージDNA依存性RNAポリ
メラーゼを用いて、核酸試料中に存在する所定の標的核
酸配列（標的配列または標的セグメント）を迅速に増幅
する（すなわち、標的配列のコピー数を増加する）方法
を見出した。さらに、我々はバクテリオフアージDNA依
存性RNAポリメラーゼをバクテリオフアージRNA依存性RN
Aポリメラーゼと併用することによつて同じ結果を得る
方法を発見した。これまで、このようなバクテリオフア
ージRNAポリメラーゼがこの目的のために利用できるこ
とは知られていなかつた。
本発明はこれらの発見に基づいた方法およびその方法
を実施するためのキツトを提供する。
これらの方法およびキツトは特に、本発明に従つて増
幅される標的セグメントを含む核酸の核酸プローブハイ
ブリダイゼーシヨン検定に関連して適用される。従つ
て、本発明はまた、特定のセグメントを含む核酸試料中
の該セグメントの有無を、本発明による増幅後に、該セ
グメントとハイブリダイズするプローブによつて検出す
る方法、並びにその方法を実施するためのキツトを提供
する。
本発明はある種のRNA転写物、それらの生産、任意の
複製、および（塩基配列において）対応する標的核酸配
列の所望の増幅および検出を達成するためのその使用と
いう新規性に基づいている。本発明はin viroまたはｘ
−vivoの環境で実施され、２本鎖核酸鋳型（上記RNA転
写物の生産のために用いられる）をつくるための標的配
列の２本鎖cDNAコピーの合成と共同して用いられる。２
本鎖cDNA合成とRNA転写から成るこの過程は、本発明の
転写に基づいた増幅系（TAS）の単一サイクルを構成す
る。所望により、このサイクルを繰り返し行つてより一
層高レベルの増幅を達成してもよい。それらが生産（お
よび複製）される方法であるために、それらの転写物は
核酸混合物のまじつたもとの試料に含まれる標的核酸配
列に塩基配列の点で対応（一致もしくは相補的）してい
る。それ故に、増幅された形の転写物の存在はそれらの
検出のために、ひいては、上記試料中の標的核酸配列の
存在のin vitroまたはｘ−vivo検出のために利用され
る。
従つて、本発明は核酸含有試料中の少なくとも１種の
特定の核酸配列（標的配列または標的セグメント）のin
vitroまたはｘ−vivo検出を包含する。本発明は、プロ
モーターに連結された標的配列に対応する配列を含む２
本鎖核酸を作製し；該２本鎖核酸を２本鎖核酸鋳型とし
て使用して、それらから多数のRNA転写物（それぞれ上
記標的配列に対応するRNA配列を有する）をつくり；そ
して該RNA配列の存在を検出して標的配列の存在を類推
する、ことから成る方法を提供する。
本発明はこのようなRNA転写物の作製および使用に関
連したあらゆる方法および手段に向けられる。従つて、
本発明は標的配列のセグメントに対応する配列に連結さ
れたプロモーター配列を含む第一の核酸プライマーを用
意し；第一の核酸プライマーを核酸含有試料中の標的配
列と適当な条件下でハイブリダイズさせ；ハイブリダイ
ズした第一の核酸プライマーをポリメラーゼ伸長反応に
より標的配列に対し相補的に伸長させて、対応する２本
鎖核酸を形成させ；該２本鎖核酸を１本鎖に分離し；分
離したプロモーター含有配列鎖に適当な条件下で該プロ
モーター配列と反対の末端で第二の核酸プライマーをハ
イブリダイズさせ；そしてハイブリダイズした第二の核
酸プライマーをポリメラーゼ伸長反応により該プロモー
ター含有配列に対し相補的に伸長させる、ことから成る
上記の２本鎖核酸鋳型を作製するための任意に反復しう
る方法に向けられる。
本発明はさらに、標的配列のセグメントに相補的な配
列に作動可能な状態で連結されたプロモーター配列を含
む第一核酸プライマー、および標的配列のセグメントと
同一の配列を有する第二核酸プライマー（前記プライマ
ー類は標的配列の異なる領域に対応するが、標的へのそ
れらの対応において重複せず、または実質的に重複せ
ず、一方の伸長産物がその相補鎖から分離されるとき他
方の伸長産物のための鋳型として役立つように選ばれ
る）を用意し；標的配列を有する核酸を含む試料と前記
のプライマー類とを、ハイブリダイゼーシヨンおよびそ
の後の鎖分離の条件下で接触させて、順次前記のプライ
マー類の伸長産物を作る；ことから成る２本鎖核酸鋳型
（上記参照）のもう１つの作製方法および手段（例え
ば、本質的にシングルポツト（singlu−pot）の反応か
ら成る方法）に向けられる。
本発明はさらに、DNA依存性RNAポリメラーゼ（そのプ
ロモーターを認識する）により触媒される反応において
多数のRNA転写物を作るための鋳型として前記の２本鎖
核酸を使用し、該RNA転写物の存在を検出および測定す
る方法および手段に向けられる。
本発明はさらに、内部標準として用いた既知核酸の存
在に相関させることにより（検出されたRNA転写物の量
に対応させて）検出された標的配列の量を標準化する方
法および手段に向けられる。標準のコピー数は予め決定
されており、本発明の実施中、標準は標的配列と同じ条
件を経験するので、それは平行して作られたその転写物
と標的配列の転写物との相対量を決定する際の評価手段
として役立つであろう。
本発明はさらに、得られた前記のRNA転写物中にレプ
リカーゼ認識部位が存在するために、該RNA転写物を複
製することに向けられる。これはレプリカーゼ認識部位
配列を、好ましくはプロモーター配列と標的配列に対応
する配列との間に、保有する上記の第一核酸プライマ
ー、および／またはレプリカーゼ認識部位を有する上記
の第二核酸プライマーを用意することにより有利に達成
される。その後の転写において、結果的に生じた転写物
はレプリカーゼ認識部位を有し、それ故にレプリカーゼ
の存在（例えば、反応の場またはキツトに含まれる）は
転写物の複製を（自己触媒的に）誘導して、検出を容易
にする追加コピーをもたらす。
本発明はさらに、上記の方法および手段を用いて、核
酸含有試料中の少なくとも１種の特定の核酸配列（標的
配列）をin vitroまたはｘ−vivo検出するのに有用な試
薬類および関連手段を含むキツトに向けられる。
発明の詳細な説明 1.図面の簡単な説明 第1A、1Bおよび1C図は核酸（DNAまたはRNA）の標的セ
グメント（核酸Ａ）を増幅するための本発明方法を示し
ており、標的セグメントに相補的な配列のセグメントを
含む第一RNA（RNA I）が多コピー数つくられる。
第2A、2B、2C図は第1A、1Bおよび1C図に示したRNA I
セグメントの別の本発明増幅を示しており、RNA Iつく
るために増幅された標的セグメントのサブセグメントと
同じ配列のセグメントを含む第二RNA（RNA II）が多コ
ピー数つくられる。
第３図は一定濃度のヒトβ−グロビン核酸と同時にTA
Sにより増幅された、いろいろな濃度のHIV RNAを示すオ
ートラジオグラムである。
第４図はDNA依存性RNAポリメラーゼによりつくられた
RNAがRNA依存性レプリカーゼの鋳型として役立つRNA分
子をもたらす一般的計略法を示している。
2.一般方法および定義 本発明の基本的技術：例えば、DNA合成を含めたDNAプ
ローブまたはプライマーの作製；標的DNA配列に対する
プライマーの相同性の程度により多かれ少なかれハイブ
リダイゼーシヨンの確実性をもたらすストリンジエント
条件の変化を含めた、ハイブリダイゼーシヨン方法論；
プロモーターの同定、単離または調製、より詳細にはバ
クテリオフアージDNA依存性RNAポリメラーゼおよびバク
テリオフアージRNA依存性RNAポリメラーゼ、あるいは真
核細胞系を用いる場合は、ウイルスDNA−およびRNA−依
存性RNAポリメラーゼ（例えば、アデノウイルスにより
コードされるRNAポリメラーゼおよびブロームモザイク
ウイルスRNAポリメラーゼ）によつて認識されるプロモ
ーターまたは部位の同定、単離または調製；いわゆる転
写エンハンサー配列を含めたRNA転写物の作製に役立つ
条件；（誘導された）複製の機構および方法論；ポリメ
ラーゼ鎖伸長反応方法（そのための試薬を含む）；など
を実施するための定義および方法並びに手段は分子生物
学の標準教則本に論及される。例えば、Maniatis et a
l.,Molecu-lar Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spr
ing Harbor Laboratory,New York,（1982）、およびこ
こに引用した種々の文献；米国特許第4683195号；米国
特許第4683202号;Hong,Bioscience Reports 1、243（19
81）;Cooke et al.,J.Biol.Chem.255 6502（1980）;Zol
ler et al.,Methods in Enzymology 100、468−500（19
83）;Crea et al.,Nucleic Acids Res.8、2331（198
0）;Narang et al.,Meth.Enzym.68、90（1979）;Beauca
ge et al.,Tetrahedron Letters 22、1859（1981）;Bro
wn et al.,Meth.Enzym. 68、109（1979）;Caruthers et
al.,Meth.Enzym．154、287（1985）;Hitzeman et al.,
J.Biol.Chem. 255、2073（1980）;Lee et al.,Seience 2
39、1288（1988）;Milligan et al.,Nucleic Acide Re
s.15、8783（1987）;Miller et al.,Virology 125、236
（1983）、Ahlquist et al.,J.Mol.Biol.153、23（198
1）;Millier et al.,Nature 313、68（1985）;Ahlquist
et al.,J.Mol.Biol.172、369（1984）;Ahlquist et a
l.,Plant Mol.Biol.3、37（1984）;Ou et al.,PNAS 7
9、5235（1982）;Chu et al.,Nucl.Acids Res．14、559
1（1986）；欧州特許出願公開（EPA）第194809号;Marsh
et al.,Positive Strand RNA Viruses,p.327−336、Al
an R.Liss（publ.;New York）（1987;Proceedings of U
CLA Symposium,1986）;Miller et al.,J.Mol.Biol.18
7、537（1986）;Stoflet et al.,Science 239、491（198
8）；およびMurakawa et al.,DNA 7、287（1988）を参照
されたい。
先に列挙した刊行物は参照によりここに引用される。
“プロモーター”なる用語は、RNAポリメラーゼ（認
識した配列に結合した転写過程を開始させ、それにより
RNA転写物を生産する）によつて特異的に認識される核
酸配列（自然界に存在するもの、合成されたものまたは
制限消化の産物）を意味する。それは分解に対して安定
性を付与すると考えられる、実際の認識部位を越えて伸
長するヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。原理的に
は、その開始配列を認識しうる入手可能な既知ポリメラ
ーゼが存在するならば、どのプロモーターを使用しても
よい。代表的で、有用な既知プロモーターはバクテリオ
フアージT3、T7またはSP6のようなバクテリオフアージ
ポリメラーゼによつて認識されるものである。Siebenli
st et al.,Cell 20,269（1980）を参照されたい。これ
らは関連したプロモーター配列と共に本発明の実施にお
いて使用できるポリメラーゼの例にすぎない。
“RNA転写物”はプロモーター配列のRNAポリメラーゼ
認識に続いて起こる転写開始後に生産されたリボ核酸配
列を意味する（上記参照）。このような転写物の生産は
多かれ少なかれ連続的であり、存在するポリメラーゼの
量によつても若干左右される。
本明細書において、“プライマー”とは適当なハイブ
リダイゼーシヨン条件下で標的配列にハイブリダイズし
得る（すなわち、結合し得る）ように標的配列との十分
な相同性を有する核酸配列（自然界に存在するもの、合
成されたもの、または制限消化の産物）を意味する。代
表的なプライマーは鎖長が少なくとも約10ヌクレオチド
であり、最も好ましくは約35以上のヌクレオチド長であ
り、その最適な実施態様において、それは標的配列との
同一性または極めて高い相同性を共有している。例え
ば、EPA第128042号（1984年12月12日発行）を参照され
たい。
プライマー配列中のプロモーター配列の結合に関して
特に用いられる“作動可能な状態で連結された”という
表現は、本発明の最終的な“２本鎖核酸鋳型”が、適当
なポリメラーゼがプロモーターを認識したときに、対応
するRNA転写物を生産しうるような、その鋳型の機能性
を意味する……上記参照。
２本鎖核酸を製造するためのプライマー伸長反応はそ
れ自体既知である。上記文献を参照されたい。この目的
に適したポリメラーゼはE.coli DNAポリメラーゼＩ、E.
coli DNAポリメラーゼＩのKlenow断片、T4 DNAポリメラ
ーゼ、逆転写酵素などである。
検出信号を形成する技術（例えば、放射性ラベリング
または色素産生酵素を用いる発色手段によるもの）は周
知であり、当分野において論じられている。上記の論議
を参照されたい。
本発明のRNA転写物の複製を（自己触媒的に）誘導す
るための“レプリカーゼ”の使用は一般に当分野で知ら
れている。本発明で用いられるこの種のレプリカーゼの
例は、所定のRNA転写物の３′末端と５′末端の両方に
存在する核酸配列部位を認識するいわゆるＱβウイルス
レプリカーゼ、および所定のRNA転写物の３′末端の核
酸配列を認識すると考えられるいわゆるブロームモザイ
クウイルス（brome mosaic viurs:BMV）およびアルフア
ウイルスのレプリカーゼである。これらのレプリカーゼ
はRNA転写物および相補鎖を複製する（すなわち、再生
産する）のに役立ち、そのコピー数を増幅させる。この
ような酵素が転写過程で反応位置に存在する場合、転写
の間に生産された多数の転写物それら自体が複製を受け
てRNA転写産物の量を指数的に増加させると予測するこ
とができる。
内部標準法（internal standardization）はａ）TAS
増幅法が操作手順の誤りのために失敗したことを確か
め；且つｂ）対象の試料を常に関連した所定量の核酸に
対する標的核酸のレベルを測定する；ために用いられる
方法として定義される。このような内部標準法は標的配
列の一部と内因性配列とを同一反応で同時増幅させるこ
とにより行われる。例えば、生物学的試料中に存在する
細胞数を知ることにより、単一コピー遺伝子（例えばβ
−グロビン）を内部標準として使用することができるで
あろう。それはRNAの形で発現されないので、その初期
コピー数は試料中の細胞の総数の２倍に等しい。β−グ
ロビンの一部と対象の標的配列とを同時増幅させること
により、増幅された信号の比率を比べて対象の標的配列
のレベルを定量化することが可能である。各細胞は、生
物学的試料が別の標的配列（例えばHIV）を含むかどう
かにかかわりなく、この内部標準を（２倍体細胞中に）
２コピー含んでいるので、各試料は内部標準から生ずる
陽性の増幅信号を発することが期待される。Groundine
et al.,Nucleic Acids Research 12、1427（1984）およ
びMcknight,Cell 31、355（1982）を参照されたい。ま
た、英国特許出願公開第2187283 A号（1987年９月３日
発行）を参照されたい。
3.好適な態様の詳細な説明 その態様の１つとして、本発明は式I: 〔ここで（第一サブセグメント）tは（第二サブセグメ
ント）tの３′末端に隣接する少なくとも10ヌクレオチ
ドの既知配列の核酸セグメントであり、（第二サブセグ
メント）tは０またはそれ以上のヌクレオチドの核酸セ
グメントであり、そして（第三サブセグメント）tは
（第二サブセグメント）tの５′末端に隣接する少なく
とも10ヌクレオチドの既知配列の核酸セグメントであ
る〕で表される標的核酸セグメントの増幅方法に関し、
その方法は： （１）上記標的セグメントの（第一サブセグメント）t
に、式II: 〔ここで（プロモーター）1はバクテリオフアージDNA依
存性RNAポリメラーゼ特異的プロモーターのプラス鎖の
配列を有する１本鎖DNAセグメントであり、（可変サブ
セグメント）1は（プロモーター）1の３′末端ヌクレオ
チドおよび（３′−プライマーサブセグメント）1の
５′末端ヌクレオチドに隣接する０〜100ヌクレオチド
の１本鎖DNAセグメントであり、そして（３′−プライ
マーサブセグメント）1は（第一サブセグメント）tの
３′末端ヌクレオチドで終わる（第一サブセグメント）
tのサブセグメント配列に相補的な配列を有する少なく
とも10ヌクレオチドの１本鎖DNAセグメントであり、
（可変サブセグメント）1が０ヌクレオチドである場
合、（プロモーター）1は（３′−プライマーサブセグ
メント）1の５′末端に隣接する〕 で表される３′末端サブセグメントから成る１本鎖DNA
の第一プライマーをハイブリダイズさせ； （２）工程（１）に従つてハイブリダイズさせた第一プ
ライマーを、第一DNAポリメラーゼにより触媒される反
応で伸長させて、式III: 〔ここで（第一サブセグメント）tcは（第一サブセグメ
ント）tに相補的な配列を有するDNAセグメントであり、
（第二サブセグメント）tcは（第二サブセグメント）t
に相補的な配列を有するDNAセグメントであり、そして
（第三セグメント）tcは（第三サブセグメント）tに相
補的な配列を有するDNAセグメントである〕 で表されるサブセグメントから成る第一の相補DNAセグ
メントを形成させ（但し、標的セグメントがRNAセグメ
ントである場合、第一DNAポリメラーゼは逆転写酵素で
ある）； （３）工程（２）の反応で形成された２本鎖核酸を１本
鎖となし； （４）式IIIの第一相補DNAの（第三サブセグメント）tc
に、式IV: 〔ここで（５′−プライマーサブセグメント）2は（第
三サブセグメント）tの５′末端ヌクレオチドで終わる
（第三サブセグメント）tのサブセグメント配列を有
し、（可変サブセグメント）2は（５′−プライマーサ
ブセグメント）2の５′末端に隣接する０〜100ヌクレオ
チドのセグメントである〕 で表される少なくとも10ヌクレオチドの１本鎖DNAの第
二プライマーをハイブリダイズさせ； （５）工程（４）に従つてハイブリダイズさせた第二プ
ライマーセグメントを第二DNAポリメラーゼによつて触
媒される反応で伸長させて、式V: 〔ここで（可変サブセグメント）1cは（可変サブセグメ
ント）1に相補的な配列を有するDNAセグメントであり、
（プロモーター）1cは（プロモーター）1に相補的な配
列を有するDNAセグメントである〕 で表されるサブセグメントから成る第二相補DNAセグメ
ントを形成させ（但し、第二DNAポリメラーゼは第一DNA
ポリメラーゼと同一であつても異なつていてもよい）；
そして （６）工程（５）の２本鎖産物を、（プロモーター）1
である一方の鎖のプロモーターを認識する第一のバクテ
リオフアージDNA依存性RNAポリメラーゼにより触媒され
る反応において鋳型として使用して、式VI: 〔ここで（可変サブセグメント）1rは（可変サブセグメ
ント）1の配列を有するRNAセグメントであり、（第一サ
ブセグメント）tcrは（第一サブセグメント）tに相補的
な配列を有するRNAセグメントであり、（第二サブセグ
メント）tcrは（第二サブセグメント）tに相補的な配列
を有するRNAセグメントであり、（第三サブセグメン
ト）tcrは（第三サブセグメント）tに相補的な配列を有
するRNAセグメントであり、そして（可変サブセグメン
ト）2crは（可変サブセグメント）2に相補的な配列を有
するRNAセグメントである〕 で表される第一RNA産物を形成させる； ことから成つている。
別の態様として、本発明は、（第一サブセグメント）
tが少なくとも10ヌクレオチドの鎖長であつて式XIII: 〔ここで（第一サブセグメント）t2またはそれ以上のヌ
クレオチドを有し、０より多い場合は（第一サブセグメ
ント）t1の３′末端に隣接し、そして（第一サブセグメ
ント）t1は少なくとも10ヌクレオチドの鎖長である〕で
表され；（第三サブセグメント）tが式XIV: 〔ここで（第三サブセグメント）t2−は０またはそれ以
上のヌクレオチドを有し、０より多い場合は（第三サブ
セグメント）t1の５′末端に隣接し、そして（第三サブ
セグメント）t1は少なくとも10ヌクレオチドの鎖長であ
る〕で表され；（３′−プライマーサブセグメント）1
が（第一サブセグメント）t2の全部と（第一サブセグメ
ント）t1の０またはそれ以上のヌクレオチドから成る標
的セグメントのサブセグメントに相補的な配列を有し；
（５′−プライマーサブセグメント）2が（第三サブセ
グメント）t2の全部と（第三サブセグメント）t1の０ま
たはそれ以上のヌクレオチドから成るサブセグメントで
あり；そして上記の工程（１）〜（６）の後に、下記の
工程（７）〜（12）から成る方法によつて式VII: ５′−（第一サブセグメント）t1cr−（第二サブセグメ
ント）tcr−（第三サブセグメント）t1cr−３′ 〔ここで（第一サブセグメント）t1crは（第一サブセグ
メント）t1に相補的な配列を有するRNAセグメントであ
り、そして（第三サブセグメント）t1crは（第三サブセ
グメント）t1に相補的な配列を有するRNAセグメントで
ある〕で表されるRNAサブセグメントがさらに増幅され
る方法を提供する： （７）式VIの第一RNA産物に、式VIII: 〔ここで（プロモーター）3はバクテリオフアージDNA依
存性RNAポリメラーゼ特異的プロモーターのプラス鎖の
配列を有する１本鎖DNAセグメントであり、該（プロモ
ーター）3の配列は（プロモーター）1の配列と同一であ
つても異なつていてもよく、（可変サブセグメント）3
は（プロモーター）3の３′末端ヌクレオチドおよび
（３′−プライマーサブセグメント）3の５′末端ヌク
レオチドに隣接する０〜100ヌクレオチドの１本鎖DNAセ
グメントであり、そして（３′−プライマーサブセグメ
ント）3は（第三サブセグメント）t1と同じ配列を有し
且つ（可変サブセグメント）3が０ヌクレオチドである
場合は（プロモーター）3の３′末端ヌクレオチドに隣
接する１本鎖DNAセグメントである〕の３′末端サブセ
グメントから成る１本鎖DNAの第三プライマーをハイブ
リダイズさせ； （８）工程（７）に従つてハイブリダイズさせた第三プ
ライマーを、第三DNAポリメラーゼ（逆転写酵素であ
り、上記の第一および第二DNAポリメラーゼと同一であ
つても異なつていてもよい）により触媒される反応で伸
長させて、式IX: 〔ここで（可変サブセグメント）1cは（可変サブセグメ
ント）1に相補的な配列を有するDNAである〕の３′末端
サブセグメントから成る第三の相補DNAセグメントを形
成させ； （９）工程（８）の反応で形成された２本鎖核酸を１本
鎖となし； （10）工程（８）の反応で形成された第三の相補DNA
に、式X: ｛ここで（可変サブセグメント）4は０〜100ヌクレオチ
ドのセグメントであり、そして（５′−プライマーサブ
セグメント）4は、（可変サブセグメント）4が０より多
いヌクレオチドを有する場合、（可変サブセグメント）
4の３′ヌクレオチドに隣接し且つ式XX: 〔ここで（第一サブセグメント）t2cは（第一サブセグ
メント）t2に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
り、（第一サブセグメント）t1cは（第一サブセグメン
ト）t1に相補的な配列を有するDNAセグメントである〕
のセグメントの少なくとも10個のヌクレオチドから成る
既知配列のサブセグメントである、但し上記の少なくと
も10個のヌクレオチドのうち少なくとも１個は（第一サ
ブセグメント）t1cの５′末端ヌクレオチドに存在する
か、またはその５′末端ヌクレオチドから５′側に存在
する｝の第四プライマーをハイブリダイズさせ； （11）工程（10）に従つてハイブリダイズさせた第四プ
ライマーを第四DNAポリメラーゼ（第一、第二および第
三DNAポリメラーゼと同一であつても異なつていてもよ
い）により触媒される反応で伸長させて、式XI: 〔ここで（第二サブセグメント）tcは（第二サブセグメ
ント）tに相補的な配列を有するDNAセグメントであり、
（第三サブセグメント）t1cは（第三サブセグメント）
t1に相補的な配列を有するDNAセグメントであり、（可
変サブセグメント）3cは（可変サブセグメント）3に相
補的な配列を有するDNAセグメントであり、そして（プ
ロモーター）3cは（プロモーター）3に相補的な配列を
有するDNAセグメントである〕のセグメントから成る第
四の相補DNAを形成させ；そして （12）工程（11）の２本鎖産物を、第二のバクテリオフ
アージDNA依存性RNAポリメラーゼ（上記の第一バクテリ
オフアージDNA依存性RNAポリメラーゼと同一であつても
異なつていてもよく、（プロモーター）3である一方の
鎖のプロモーターを認識する）により触媒される反応に
おいて鋳型として用いて、式XII: 〔ここで（可変サブセグメント）3rは（可変サブセグメ
ント）3の配列を有するRNAセグメントであり、（第三サ
ブセグメント）t1rは（第三サブセグメント）t1の配列
を有するRNAセグメントであり、（第二サブセグメン
ト）trは（第二サブセグメント）tの配列を有するRNAセ
グメントであり、（第一サブセグメント）t1rは（第一
サブセグメント）t1の配列を有するRNAセグメントであ
り、（可変サブセグメント）4crは（可変サブセグメン
ト）4に相補的な配列を有するRNAセグメントであり、そ
してX12は（第一サブセグメント）t1cの５′末端から
５′側にある（５′−プライマーサブセグメント）4の
サブセグメントに相補的な配列を有するRNAセグメント
である〕の５′末端サブセグメントを有する第二RNA産
物を形成させる。
上述したように、本発明はまた本発明の増幅法を実施
するためのキツトを提供する。第一RNA産物を作る本発
明方法の場合には、本発明キツトは２つのプライマー、
対応するバクテリオフアージDNA依存性RNAポリメラー
ゼ、およびDNAポリメラーゼを含むであろう。第一RNA産
物と第二RNA産物の両方を作る本発明方法を実施するた
めのキツトは、４つの適当なプライマー（１組２つのプ
ライマーを２組）と対応するポリメラーゼを含むであろ
う。
本発明に従つて標的セグメントを増幅することを含む
核酸ハイブリダイゼーシヨンプローブ検定を実施するた
めの本発明方法およびキツトは、それぞれ増幅方法の工
程およびキツトの成分のほかに、本発明増幅方法により
生ずるRNA産物を検出するのに必要な工程および成分を
包含する。当業者は当分野で知られた多数の核酸プロー
ブハイブリダイゼーシヨン検定法の増幅工程から得られ
るRNA産物を検出するのに必要とされる種々の追加工程
および成分に精通しているであろう。標識RNA増幅のビ
ーズ捕獲を伴う好適な核酸プローブハイブリダイゼーシ
ヨン検定法が以下の実施例IIに示される。
（３′−プライマーサブセグメント）1、（５′−プ
ライマーサブセグメント）2、（３′−プライマーサブ
セグメント）3および（５′−プライマーサブセグメン
ト）4は20〜40ヌクレオチドを有し、より好ましくは、
増幅しようとする標的セグメントの末端に種々のプライ
マーが結合する特異性を高めるために約30ヌクレオチド
を有するのが好適である。
（第一サブセグメント）tおよび（第三サブセグメン
ト）tの選択により増幅のために選ばれる対象の標的核
酸セグメントは、（第二サブセグメント）trが少なくと
も30、より好ましくは少なくとも約50、のヌクレオチド
を有するように選ばれるのが好適である。これによりプ
ライマーサブセグメントのどれとも重複しない配列を有
する核酸プローブの標的として、増幅RNA産物中の（第
二サブセグメント）tcrまたは（第二サブセグメント）
trを使用することが可能である。
バクテリオフアージDNA依存性RNAポリメラーゼは1000
bpよりも長い鋳型を使用し得るが、それらの転写効率は
鋳型が長くなるにつれて低下する。従つて、1000塩基長
より短い標的セグメントが好適である。
TASの第二サイクルにおいてRNAを作るために、RNA合
成で用いるプライマーは同一の組を使用するのが好まし
い。RNAの製造のところで述べたように、プライマー対
は重複すべきでない。RNAの製造が望まれる本発明方法
を実施する場合に、（５′−プライマーサブセグメン
ト）4に相補的な配列を有する標的セグメントのサブセ
グメントは（３′−プライマーサブセグメント）1に相
補的な配列を有する標的セグメントのサブセグメントか
ら５′方向にあつて、それと重複しないであろう。同様
に、（３′−プライマーサブセグメント）3と同じ配列
を有する標的セグメントのサブセグメントは（５′−プ
ライマーサブセグメント）2と同じ配列を有する標的セ
グメントのサブセグメントから３′方向にあつて、それ
と重複しないことが好ましい。この計略は、同一部位に
対する異なるプライマーの競合を減じ、それによつて本
発明の増幅効率を著しく高めるので有益であるだろう。
重ね合わせたプライマーの組に若干の重複が存在する場
合は、第二組のプライマーを使用する前に未使用の第一
組プライマーを除くことが好ましい。
本発明の焦点は、ある種のプロモーターに対する特異
性ゆえに、バクテリオフアージDNA依存性RNAポリメラー
ゼに集中している。特定のプロモーターに対して同様に
高い特異性を示す他のポリメラーゼもバクテリオフアー
ジポリメラーゼの代わりに本発明において利用され、本
発明はこのような他のポリメラーゼも包含するものであ
る。
好適なバクテリオフアージDNA依存性RNAポリメラーゼ
はT7、T3およびSP6からのものである。これらのポリメ
ラーゼと共に使用するのに適したプロモーターは実施例
および請求の範囲に記載されるが、これらのポリメラー
ゼ用の他のプロモーターも当分野で数多く知られてお
り、同様に使用できる。
さらに、好適な３種以外のバクテリオフアージからの
ポリメラーゼ、およびこのような他のポリメラーゼによ
つて認識されるプロモーターも本発明に従つて使用され
る。
本発明方法で用いるDNAポリメラーゼとしては、５′
→３′エキソヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼ
および逆転写酵素を用いるのが好適である。本方法の全
工程において、１種類のDNAポリメラーゼを用いるのが
最も好ましい。最適なDNAポリメラーゼはAMV逆転写酵素
および組み換えMMLV逆転写酵素である。しかしながら、
Thermus aquaticusからの熱安定性DNAポリメラーゼ（Ch
ien et al．J.Bacteriol．127、1550（1976）を参
照）、米国オハイオ州クリーブランドU.S.Biochemicals
社からの商標名Sequenaseという組み換えT7 DNAポリメ
ラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼＩの公知のKlenow断
片、およびウシ胸腺DNAポリメラーゼαのような他のポ
リメラーゼも許容される。
“可変サブセグメント”は種々のプライマーに任意に
含まれ、３つの機能を果す。実際、それらは“多目的サ
ブセグメント”とより適切に呼ぶことができる。まず第
一に、プロモーターを含む第一および第三プライマーに
おいて、そのプロモーターサブセグメントは好ましくは
そのプロモーターに対応するRNAポリメラーゼによつて
認識される転写開始配列を含む。第二番目は、すべての
プライマーにおいて、可変サブセグメントは増幅からの
RNA産物が核酸プローブハイブリダイゼーシヨン検定で
検出できるように特定のセグメントを任意に含むことが
できる。実際、増幅（および検定）は認識セグメント
（例えば（３′−プライマーサブセグメント）1）を異
にするが共通の可変サブセグメントを含むプライマーの
組を用いることにより、いくつかの異なる標的セグメン
トにおいて同時に行われる。また、可変セグメントはそ
の後のクローニングを容易にするための制限部位を多数
もつているポリリンカー配列を含むこともできる。最後
に、可変サブセグメントはＱβレプリカーゼ（Mieleら
の上記文献参照）のようなバクテリオフアージRNA特異
的RNAポリメラーゼによりRNA産物を（自己触媒的に）複
製させるのに必要な配列、およびコートmRNAの合成を促
進する植物ウイルスのRNA−３クロモソームからのBMV配
列を、増幅からのRNA産物に組み入れるために使用され
る。Ahlquist et al.,J.Mol.Biol．172、369（1984）;A
hlquist et al.,Plant Mol.Biol.3、37（1984）;Ahlqui
st et al.,J.Mol.Biol.153、23（1981）;Miller,et a
l.,Nature 313、68（1985）;Miller et al.,Virology
125、236（1983）；およびOu et al.,PNAS 79、5235（1
982）を参照されたい。
Ｑβレプリカーゼ（当分野で知られている）の場合
は、（可変サブセグメント）2に配列： を挿入し、（可変サブセグメント）1に配列： を挿入し、その後第一RNA産物（すなわち、第１図のRNA
I;第４図も参照）を（自己触媒的に）複製させるか、
あるいは（可変サブセグメント）4に配列： を挿入し、（可変サブセグメント）3に配列： を挿入し、その後第二RNA産物（すなわち、第１図のRNA
II;第４図も参照）を（自己触媒的に）複製させること
により有利に実施できる。
BMVレプリカーゼ（これも既知である）を使用する場
合は、（下記のHIV実施例の特定使用において）可変配
列２（塩基１−25）中に次のBMV配列： （54塩基）をコア配列として含めることにより有利に実
施され、さらにBMVからのレプリカーゼ活性を高めるた
めにその５′末端にAUに富む配列を挿入することもでき
る。このオリゴは第二プライマーとして使用される。こ
の第二プライマーと共に用いられる第一プライマーはT7
に由来するHIV特異的プライマーである。
本発明の理解に役立つ非制限的細部を以下の実施例に
おいて示すことにする。
4.実施例 実施例Ｉ ヒト免疫不全ウイルス−１型（HIV−１）に感染した
疑いのある患者から採取した血液10mlをSepracellTM装
置（米国オクラホマ州オクラホマシテイ、Sepratech
社）により、あるいはフイコール勾配により分画化して
リンパ球を分離する。その後リンパ球を溶解し、それら
からの核酸をExtractor（米国カリフオルニア州サンジ
エゴ、Molecular Biosystems社）で分離するか、あるい
は別法として、リンパ球を標準的なドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）−酵素処理により溶解し、核酸をDEAEセル
ロースの逆相クロマトグラフイーにかけて分離する。こ
れは次のようにして行われる： 細胞を沈殿させる:1mlのTris緩衝液（TBS）、pH7.5、
から5K rpmで４分。
上清を除く。
ペレツトを下記溶液に再懸濁する： 激しくボルテツクス攪拌し、50℃で45分インキユベー
トする（その間10ごとに10〜15秒ボルテツクス混合を行
う）。
排水した抽出器カラムにかける。
カラムを１×4mlの0.3M NaCl/20mM Tris,pH7.5、で洗
う。
4mlの0.5M NaCl/20mM Tris,pH7.5、でDNA/RNAを溶出
する。
溶出物に次の諸成分を加える： 5μｌ グリコーゲン 400μｌ 3M NaOAc 9.0ml 氷冷 EtOH 十分に混合 −20℃で一晩沈殿させる。ドライアイス／エタノール
浴を１時間使用してもよい。
スイングバケツトローターで10,000rpm、15分遠心
し、EtOHをデカントし、キムワイプ（Kimwipe）で２分
乾かす。
10分凍結乾燥する。
170μl TEにペレツトを再懸濁する。
37℃で５分インキユベートする。
次のようにして1mlスピンカラムを調製する： 1mlシリンジに少量のガラスウール（オートクレーブ
滅菌済）を詰める。
シリンジをピロ炭酸シエチル（DEPC）で処理した（TE
（Tris−EDTA）で満たす。
すばやくセフアデツクスＧ−50（TE中；オートクレー
ブ滅菌）を加える。
固体マトリツクスがシリンジの頂部に山のように堆積
するまで加え続ける。
TECテーブルトツプ遠心機で1000rpm、30秒遠心する。
100μl TEで洗い、中間速度（約1000rpm）で１分遠心
し、洗液を捨てる。
抽出物をカラムに入れ、再度１分間遠心する。
150μl TEですすぎ、1000rpmで１分遠心する。すすぎ
液と最初の画分をプールする。この段階で多数の反応の
ために試料を分割してもよい。
1/10容量の8M LiClを加える。2.5×容量の100％ EtOH
と混合する。十分にボルテツクス混合を行う。ドライア
イス/EtOHで30分沈殿させる。
微量遠心機を用いて４℃、最高速度で15分遠心する。
ペレツトを乾かす。
分離後、試料からの全核酸を100μｌのTE緩衝液（10m
M Tris.Cl,1mM EDTA,pH8）に溶解する。100μｌの全核
酸のうち10μｌを次の諸成分： 40mM Tris.Cl,pH8 25mM NaCl 10mM MgCl2 10mM ジチオトレイトール（DTT） 2mM スペルミジン 100μg/mlウシ血清アルブミン 400mMずつのdATP、dCTP、dGTPおよびTTP を含む混合物中に溶解して最終容量を100μｌとする。
次の配列： で表わされる30nMの101塩基の１本鎖DNAプライマーＡを
加える。配列： で表される30nMの29塩基のDNAプライマーＢを加える。
第二プライマーであるプライマーＢはHIV−１のSOR遺伝
子中の塩基5151−5179の配列を有する。第二プライマー
の別のセグメントはHIV−１のSOR遺伝子の塩基5357−53
87に対応し、配列： で表され、使用する場合はこれも30nM加えられる。プラ
イマーＡは第一プライマーであり、その64個の５′−ヌ
クレオチドはSP6 DNA依存性RNAポリメラーゼに対するプ
ロモーターのプラス鎖を形成する。配列:5′−GAATAC−
３′のセグメントは（可変サブセグメント）1であり、
転写開始部位（５′−Ｇ）とSP6 RNAポリメラーゼによ
つて明らかに好まれる他の塩基類を５′末端に含んでい
る。最後に、31個の３′末端ヌクレオチドは（プライマ
ーサブセグメント）1を形成し、HIV−１単離物のSOR遺
伝子の塩基5577−5547の配列に相補的な配列を有する
（完全な配列についてはRatner et al.,Nature 313、277
（1985）を参照されたい。）（HIV単離物はこれらの実
施例において“HIV−1"と表される。） これらの実施例で用いる全てのオリゴヌクレオチドは
Applied Biosystems社（米国カリフオルニア州フオスタ
ーシテイ）の自動合成機（380A型）を用いて固相合成に
より作られ、C8逆相カラムを用いるHPLCにより本質的に
均一にクロマトグラフイー精製されることに注意された
い。これとは別に、他の市販されている合成機と標準精
製法を用いてオリゴヌクレオチドを製造することもでき
る。
100μｌの溶液を65℃で２分加熱し、その後１分間で4
2℃に冷却する。この加熱および42℃またはそれ以上で
の保持は、溶液の組成と組み合わせて、（３′−プライ
マーサブセグメント）1をそれに相補的な配列へ高度に
特異的に且つDNA合成を開始させるに足る安定した状態
でハイブリダイズさせるのに十分なストリンジエント条
件を提供する。
その後、この溶液に10単位のトリ筋芽球症ウイルス
（avian myoblastosis virus:AMV）の逆転写酵素または
500単位の組み換えモロニーマウス白血病ウイルス（Mol
oney murine leukemia virus:MMLV）の逆転写酵素（米
国フロリダ州St.ピータースバーグ、Life Sciences社か
ら購入）を加え、42℃で10分インキユベートする。（Ho
uts et al.,J.Virol．29、517（1979）によつて定めら
れる鋳型−プライマーとしてポリ（Ａ）オリゴ(T)12-18
を使用し、37℃、10分間で1n moleのTTPを酸沈殿形体へ
組み入れるのに要する量を１単位とする。10分インキユ
ベーシヨン後、この溶液を沸騰水浴に１分間入れる。こ
の加熱は逆転写酵素により形成された２本鎖核酸の鎖分
離を起こさせる。
その後、この溶液を１分かけて42℃に冷却する。この
冷却の間に、第二プライマーが逆転写酵素により触媒さ
れる反応において形成された標的セグメントの相補鎖の
３′末端セグメントにハイブリダイズする。この場合
も、ハイブリダイゼーシヨン条件は第二プライマーとそ
れに相補的な配列との十分に特異的なハイブリダイゼー
シヨンのために十分にストリンジエントである。
冷却後、追加の10単位のAMV逆転写酵素または500単位
のクローン化MMLV逆転写酵素を加え、42℃で10分さらに
インキユベートする。
次に、米国ウイスコンシン州マジソン、Promega Biot
ec社からのRNasinR（商品名）リボヌクレアーゼ阻害剤
を１単位/mlの濃度で（任意に）加える。（１単位は50n
gのリボヌクレアーゼＡの活性を50％阻害するのに必要
な阻害剤の量である。Roth,Meth.Cancer Res.3、151（1
976）さらに、リボヌクレオシド−５′−三リン酸ATP、
GTP、CTPおよびUTPをそれぞれ400mMずつ加える。最後
に、Promega Biotec社から購入した10〜20単位のSP6 DN
A依存性RNAポリメラーゼを加え、この溶液を42℃で30〜
60分インキユベートする。（１単位は標準反応条件（40
mM Tris.Cl.pH7.9、6mM MaCl2,10mM DTT、2mMスペルミ
ジン、0.5mMずつのATP、GTP、CTPおよびUTP、0.5Ciの3H
−CTP、1gのSP6 DNAおよび酵素；全容量50μｌ）下37
℃、60分で1n moleのリボヌクレオシド三リン酸を酸不
溶性産物へ組み入れる反応を触媒するのに必要なRNAポ
リメラーゼの量である。） その後、次のオリゴヌクレオチドを加えてその濃度を
それぞれ30nMとする： 第三プライマーにおいて、５′末端の64塩基は第一プ
ライマーと同様にプロモーターセグメントであり、次の
６塩基は可変セグメントである。この可変セグメントは
SP6 RNAポリメラーゼによりプロモーターから転写され
る最初の６個の塩基であり、これらの塩基はこのような
転写レベルを高めるために選ばれる。最後に、第三プラ
イマーの（３′−プライマーサブセグメント）3部分は
３′末端の33塩基であり、HIV−１のシヨート・オープ
ン・リーデイング・フレーム（SOR）遺伝子中の塩基538
8−5420と同じ配列である。第四プライマーはHIV−１の
SOR遺伝子の塩基5546−5517の配列に相補的な配列を有
する。
第三および第四プライマーの添加後、この溶液を42℃
で１分インキユベートする。この期間中に、第三プライ
マーの（３′−プライマーサブセグメント）3とSP6 RNA
ポリメラーゼにより触媒される反応で形成された第一RN
Aとの間にハイブリダイゼーシヨンが起こる。ハイブリ
ダイゼーシヨン条件がストリンジエントであるために、
（３′−プライマーサブセグメント）3は第一RNAの相補
配列のセグメントに対して高度に特異的に、しかもDNA
合成を開始させるべく十分安定した状態でハイブリダイ
ズする。
インキユベーシヨン後、10単位のAMV逆転写酵素また
は500単位のクローン化MMLV逆転写酵素を加え、この溶
液を42℃で10分インキユベートして第三の相補DNAを形
成させる。
この溶液はその後沸騰水浴中に１分間置き、１分かけ
て42℃で冷却し、これにより第三相補DNAと第一RNAから
成る２本鎖を１本鎖となし、次に第四プライマーと第三
相補DNAとをハイブリダイズさせる。他のハイブリダイ
ゼーシヨンと同様に、この条件は十分にストリンジエン
トであるので、第四プライマーのハイブリダイゼーシヨ
ンは第四プライマーに相補的な配列の第三相補DNAのセ
グメントに対し高度に特異的に、かつDNA合成を開始さ
せるに足る安定した状態で起こる。
その後、再び、10単位のAMV逆転写酵素または500単位
のクローン化MMLV逆転写酵素を加え、42℃で10分インキ
ユベートする。
続いて、RNasinR（商品名）リボヌクレアーゼ阻害剤
を１単位/mlの濃度で（任意に）加え、その後10〜20単
位のSP6 RNAポリメラーゼを加えてこの溶液を42℃で30
分〜１時間インキユベートする。
得られた第二RNAは核酸プローブハイブリダイゼーシ
ヨン法により検出することができる。
実施例II 実施例Ｉの方法に従うが、以下で述べるような変更を
有し、３種類の試料：（Ａ）HIVを含まないヒト血液10m
l、（Ｂ）約103HIV−１感染細胞/mlを有する培養物10m
l、および（Ｃ）HIV−１に感染した疑いのあるヒトから
の血液10mlを用いる。この方法の変更は、第二RNAを作
るためのSP6 RNAポリメラーゼにより触媒される反応中
に基質としてα−32P−標識リボヌクレオシド三リン酸
を加えるという点である。その結果、第二RNAは32P−標
識される。
セフアクリル−S500TMマクロ孔質ビーズはカルボキシ
ル基末端リンカー（式−Ｃ（＝NH）NH(CH2)5CO2−で表
されるもの）を用いて誘導体化し、続いてHIV−１のSOR
遺伝子中の塩基5357−5387の配列に相補的な配列である
配列： の５′−（６−アミノヘキシルホスホルアミデート）−
誘導体化オリゴヌクレオチドを用いて誘導体化する。
（SOR遺伝子の塩基4901−4932の配列は、試料からの核
酸の増幅中に作られる第二RNAに見いだされる。）ビー
ズの作製は1986年８月11日付けの米国特許出願第895756
号（参照によりここに引用される）に記載される方法に
従つた。要約すると、支持材料はアミノ末端リンカーで
誘導体化された多孔質のケイ酸ガラスまたはマクロ孔質
の架橋デキストラン（その際、捕獲プローブの末端ヌク
レオシドにホスホルアミデート基を介して共有結合され
ていないアミノ基は実質的に全部、脂肪族アシル基をも
つ核酸と非特異的に相互作用しないように遮断され
る）；臭化シアンで活性化されたマクロ孔質架橋デキス
トラン（アミンと反応してアミノアルキルホスホルアミ
デート誘導体化オリゴヌクレオチドに結合する）；カル
ボキシル末端リンカーまたはスクシンイミドエステル末
端リンカーで誘導体化された多孔質ケイ酸ガラス、マク
ロ孔質架橋デキストランまたはジビニルベンゼン架橋ポ
リスチレン（カルボキシル基の部分はジアミノアルカン
の１つのアミノ基にアミド結合で結合され、ジアミノア
ルカンの他方のアミノ基はホスホルアミデートの一部で
あつて、その後捕獲プローブの末端ヌクレオシドに直接
結合される）である。好適な支持材料は米国イリノイ州
ロツクフオード、Pierce Chemical社からそれぞれ製品
番号24875および23735として市販されている呼称孔径50
0オングストローム、粒径約125〜177ミクロンのビーズ
の形をした、長鎖アルキルアミン−誘導体化およびカル
ボキシル−誘導体化コントロールドポアガラス（contro
lled pore glass）、および米国ニユージヤージー州ピ
スカタウエー、Pharmacia社からコード番号17−0475−0
1として市販されている湿潤直径約40〜105ミクロンおよ
び約２×107ダルトン以上の分子量をもつデキストラン
の排除容量を有するビーズの形をした、臭化シアンで又
はアミノ末端リンカーやカルボキシル末端リンカーで誘
導体化されたセフアクリルＳ−500である。１つの面に
おいて、その支持体は （Ａ）ケイ素原子が （１）式−(CH2)n(NH)(CO)(CH2)cCH3および−(CH2)n(N
H)(PO2)O-(Oligo)の基 （式中、ｃは０〜５であり、ｎは２〜８であり、−Ｏ−
（Oligo）はオリゴヌクレオチドプローブであり、（Oli
go）に結合された炭素原子はプローブの５′−ヌクレオ
シドの５′−酸素または３′−ヌクレオシドの３′−酸
素である） で誘導体化された（但し、末端にアミノ基が付いた基で
誘導体化されたケイ素原子を実質的に含まない）、ある
いは、 （２）式−(CH2)n(NH)(CO)(CH2)mCO2Hおよび−(CH2)n(N
H)(CO)(CH2)m(CO)(NH)(CH2)pNH(PO2)O-(Oligo)の基 （式中ｍ、ｎおよびｐは同一であるか又は異なり、それ
ぞれ２〜８である） で誘導体化された、多孔質ケイ酸ガラス； （Ｂ）非誘導体化ヒドロキシル基を有する少なくとも１
個の隣接炭素原子をもつ糖部分の炭素原子上に存在する
ヒドロキシル酸素が （１）式−Ｃ（＝NH）NH(CH2)q(NH)(CO)(CH2)cCH3およ
び −Ｃ（＝NH）NH(CH2)p(NH)(PO2)O-Oligo)の基 で誘導体化された（但し、末端アミノ基を有する基で誘
導体化されたヒドロキシル酸素を実質的に含まない）、
あるいは、 （２）式−Ｃ（＝NH）NH(CH2)qCO2Hおよび −Ｃ（＝NH）NH(CH2)q(CO)(NH)(CH2)pNH(PO2)O-(Oligo)
の基 （式中ｃ、ｑおよびｐは同一であるか又は異なり、ｑは
２〜10である） で誘導体化された、架橋デキストランマクロ孔質材料；
および （Ｃ）フエニル基が 式−(CH2)SCO2Hおよび −(CH2)S(CO)(NH)(CH2)pNH(PO2)O-(Oligo)の基 （式中Ｓおよびｐは同一であるか又は異なり、Ｓは２〜
10である） で誘導体化された、ジビニルベンゼン−架橋ポリスチレ
ン； のうちの１つである。Ghosh et al.,Nucleic Acids Res
earch 15、5353（1987）を参照されたい。
上記のような誘導体化されたセフアクリルビーズ50mg
を含む３つのバツチはそれぞれ0.1％SDS、10％デキスト
ラン硫酸、1mg/mlサケ精子DNA、および５×SSPE（0.75M
NaCl,50mM NaH2PO4,pH7.4、および5mM EDTA）を含有す
るプレハイブリダイゼーシヨン溶液250μｌ中に37℃で1
5分間浸漬する。浸漬後、ビーズ材料を遠心により沈殿
させ、プレハイブリダイゼーシヨン溶液を吸引除去す
る。
３つの試料のそれぞれに対する増幅法から得られた核
酸をエタノール沈殿により分離し、サケ精子DNAを除い
たプレハイブリダイゼーシヨン溶液と同じ溶液250μｌ
中に溶解する。その後、この核酸溶液のそれぞれをプレ
ハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチド誘導体化セフ
アクリルビーズの１つのバツチと混合し、得られた混合
物を穏やかに攪拌しながら42℃で90分インキユベートす
る。
セフアクリルビーズを遠心により沈殿させ、ハイブリ
ダイゼーシヨン溶液を吸引除去し、その後ビーズを２×
SSC（0.30M NaCl、0.03Mクエン酸Na、pH7.0）の溶液1ml
で37℃、10分、３回洗浄する。洗浄ごとに、ビーズを遠
心により沈殿させて洗液を吸引除去する。
３回目の洗浄後直ちにビーズをチエレンコフ（Cerenk
ov）カウンテイングにかける。
試料Ａからの増幅核酸を有するビーズは、シンチレー
シヨン液体単独からのバツクグラウンドカウント数をか
ろうじて越える低レベルのカウント数を生ずる。試料Ｂ
からの増幅核酸を有するビーズは、試料Ａと関係したビ
ーズの場合に観測されたレベルよりも一層高いレベルの
カウント数をもたらす。試料Ｃからの増幅核酸を有する
ビーズは、もしもそれらが試料Ａと関係したビーズより
も有意に高いレベルのカウント数を生ずるならば、試料
Ｃのために採血されたヒトがHIV−１に感染しているこ
とを示す。
実施例III 実施例ＩおよびIIの方法は、SP6 RNAポリメラーゼの
代わりにT7 RNAポリメラーゼ（Promega Biotec社）を使
用し、第一プライマーのサブセグメント５′−（プロモ
ーター）1−（可変サブセグメント）1−３′および第三
プライマーのサブセグメント５′−（プロモーター）3
−（可変セグメント）3−３′がそれぞれ配列： （ここで17個の５′末端塩基はプロモーターサブセグメ
ントであり、４個の３′−塩基は可変セグメントであ
る）を有するプライマーを用いて実施する。可変セグメ
ントはプロモーターからの転写物の４個の５′末端塩基
に対応する。この方法ではどの工程においても、少なく
ともPromega Biotec社製のポリメラーゼを使用する場
合、リボヌクレアーゼ阻害剤を使用しない。
実施例IV 実施例ＩおよびIIの方法は、SP6 RNAポリメラーゼの
代わりにT3 RNAポリメラーゼ（カリフオルニア州サンジ
エゴ、Stragene社製）を使用し、第一プライマーの（プ
ロモーター）1−（可変サブセグメント）1サブセグメン
トおよび第三プライマーの（プロモーター）3−（可変
サブセグメント）3サブセグメントとして次の （ここで17個の５′末端塩基はプロモーターセグメント
であり、４個の３′末端塩基はプロモーターからの転写
物の４個の５′末端塩基に対応する可変セグメントであ
る）を用いて実施する。
実施例Ｖ 実施例IIIのようにT7 RNAポリメラーゼを使用し、ま
た実施例Ｉに記載したプライマーの代わりに次のプライ
マーを用いて、ヒト血液試料からのHIVゲノムの標的セ
グメントを増幅させる： 実施例VI 実施例IIIのようにT7 RNAポリメラーゼを使用し、ま
た実施例Ｉに記載したプライマーの代わりに次のプライ
マーを用いて、ヒト血液試料からのHIVゲノム中の標的
セグメントを増幅させる： 実施例VII 実施例Ｉの方法に従つて、１）106非感染CEM細胞と混
合した103HIV感染CEM細胞を含む試料（Cancer Center R
esearch Foundation,CCRF−CEM;ATCCNo.CCL119）；およ
び２）106非感染CEM細胞を含む試料から核酸を分離す
る。これらの試料はExtractorTMカラム（MBI）から得ら
れた試料を濃縮するために、エタノール沈殿工程後100
μｌの10mM Tris−HCl、pH7.4、1mM EDTA（TE）に再懸
濁する。再懸濁した試料はセフアデツクスＧ−50スピン
カラム（Maniatisの上記文献参照）にかけ、TEで溶出し
て分画化する。溶出した試料をエタノール沈殿（0.8M L
iCl、３倍容量のエタノール中、ドライアイス／エタノ
ール浴中で15分間）により濃縮する。濃縮した試料を遠
心によりペレツトとなし、そのペレツトを排水し、乾燥
し、その後40mM Tris−HCl、pH8.1、8mM MgCl2、25mM N
aCl、2mM スペルミジン、5mM ジチオトレイトール、100
μＭずつのdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP、1mMずつのrAT
P、rCTP、rGTPおよびrUTP、100μg/ml BSA（ヌクレアー
ゼ不含）、250nMずつのDNAオリゴヌクレオチドプライマ
ーA: を含有する緩衝液100μｌに再懸濁する。
対照として、0.01fmの濃度の精製HIV RNAを含む２通
りの試料を上記の緩衝液100μｌに懸濁する。最後に、H
ind IIIで線状化したプラスミドＨβ19A（Wallace et a
l.,Nuel.Acids Res．9、3647（1981）中に含まれる10fm
のβ−グロビン配列を、オリゴヌクレオチドプライマー
を除いた上記の緩衝液100μｌに懸濁する。オリゴヌク
レオチドプライマーＤ（５′−ACATTGCTTGTGACACAACTGT
GTTCA−３′）およびプライマーＣ（５′−TAATACGACTC
ACTATAGGGACAAAGGACTCAAA−３′）はβ−グロビン配列
に特異的であり、これらを250nMずつβ−グロビン反応
混合物に加える。
β−グロビン試料を除いた、反応混合物を65℃で１分
加熱する。β−グロビン試料は１分沸騰させる。全部の
試料を１分間42℃に冷却し、その後10単位のAMV逆転写
酵素を加える。これらの反応混合物を42℃で15分インキ
ユベートし、１分沸騰させた後42℃で１分冷却する。追
加の10単位のAMV逆転写酵素を加え、42℃で15分インキ
ユベートする。100単位のT7 RNAポリメラーゼを加え、
反応混合物を37℃で30分インキユベートする。
試料を１分沸騰させ、42℃で１分冷却し、続いて10単
位のAMV逆転写酵素を加える。反応混合物を42℃で15分
インキユベートし、１分沸騰させ、42℃で１分冷却す
る。追加の10単位の逆転写酵素を加え、その後42℃で15
分インキユベートする。100単位のT7 DNAポリメラーゼ
を加え、37℃で30分インキユベートする。このサイクル
をさらに２回繰り返す。
その後、増幅された標的は以下で述べるOligo Beade
TMを用いて検出する。
HIV−１特異的オリゴヌクレオチドを含むセフアクリ
ルビーズは記載される通りに作製し、250μｌの懸濁液
が50mgのセフアクリルビーズを含むような濃度でTE中に
４℃で貯蔵する。オリゴヌクレオチドは記載される通り
に合成し、HPLCで精製する。
ビーズへの結合と検出の両方のために用いたオリゴヌ
クレオチドはHIV−１ゲノムのSOR領域に相同である。こ
れらの実験において用いたオリゴヌクレオチドは86−31
（オリゴヌクレオチドの検出）（５′−GCACACAAGTAGAC
CCTGAACTAGCAGACCA−３′）および87−83（ビーズ上で
のオリゴヌクレオチドの捕獲：（５′−ATGCTAGATTGGTA
ATAACAACATATT−３′）であり、これらはSOR領域や非セ
ンス鎖に相同であり、約100個のヌクレオチドにより隔
てられる。検出のために、オリゴヌクレオチドは標準プ
ロトコルに従つて32Pで末端標識した。組み込まれなか
つた標識はセフアデツクスＧ−50カラムでのゲル過に
より除き、オリゴヌクレオチドを−20℃で貯蔵した。
一般的なビーズを用いたサンドイツチハイブリダイゼ
ーシヨンシステム（BBSHS）の実験において、標的と32P
−標識検出用オリゴヌクレオチドはエツペンドルフチユ
ーブ中の0.2％SDSを含むTE10μｌ中で65℃、５分間変性
を起こさせる。これに、10μｌの２×溶液ハイブリダイ
ゼーシヨン混合物（10×SSPE/10％デキストラン硫酸）
を加える。この溶液を混合し、２秒遠心し、42℃で１時
間インキユベートする。
その間に、セフアクリルビーズをプレハイブリダイズ
させる。ビーズの貯蔵懸濁液を十分に混合し、250μｌ
のアリコート（ビーズ50mg）を、それぞれの移し変えの
間混合して均一な懸濁液を保ちながら、エツペンドルフ
チユーブに移す。そのアリコートを10秒遠心し、TEを抜
き取り用パスツールピペツトを用いて除去する。250μ
ｌのハイブリダイゼーシヨン溶液（５×SSPE（0.9M NaC
l、50mM NaH2PO4、pH7.4、1mM EDTA）10％デキストラン
硫酸/0.1％SDS）を加え、ビーズを穏やかに攪拌しなが
ら懸濁し、37℃で30〜60分時々混合しながらインキユベ
ートする。捕獲工程の直前に、ビーズを10秒遠心し、プ
レハイブリダイゼーシヨン溶液を除き、37℃のハイブリ
ダイゼーシヨン溶液80μｌを加えて、ビーズを37℃に戻
す。
溶液ハイブリダイゼーシヨンを２秒遠心し、ビーズと
ハイブリダイゼーシヨン溶液に移す。ビーズを懸濁さ
せ、時々混合して懸濁液を保ちながら37℃で１時間イン
キユベートする。
捕獲後、ビーズを10秒遠心し、未捕獲標的と検出用オ
リゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーシヨン溶液を
シンチレーシヨン計測器バイアルに移す。その後、ビー
ズを２×SSCにより37℃で５回洗う。初めの３回の洗浄
は迅速である;1mlの洗液を加え、ビーズを十分に混合し
て10秒遠心し、その洗液を計測用バイアルに移す。最後
の２回の洗浄では、1mlの洗液を加え、ビーズを混合
し、37℃で５分インキユベートした後遠心にかける。そ
れぞれの洗液はその手法を監視するために別々に計測す
る。
ハイブリダイゼーシヨン溶液、５つの洗液およびビー
ズのチエレンコフカウントは５〜10分間計測する。計測
器のバツクグラウンドを全ての試料から差し引く。検出
されたfm標的は次のようにして計算する： （ビーズのCPM/全CPM）×fmオリゴヌクレオチド ここで全CPMはハイブリダイゼーシヨン溶液、５つの洗
液およびビーズのCPMの合計である。
実施例VIII 実施例Ｉの方法に従つて、２つの試料:a）106非感染C
EM細胞を含む103HIV感染CEM細胞、およびｂ）106非感染
培養CEM細胞（抽出後0.01fmoleの精製HIVを加える）か
ら核酸を分離する。Extractorカラム工程後セフアデツ
クスＧ−50（フアイン）スピンカラム（Maniatisの上記
文献参照）に通しTEで溶出することによりさらに精製す
る。続いて、核酸のエタノール沈殿（0.8M LiCl中;2.5
倍容量のEtOH）を行う。その後核酸を下記成分を含む溶
液100μｌ中に再懸濁する： この溶液100μｌを65℃で１分加熱し、１分にわたつ
て42℃に冷却する。この加熱およびその後の42℃または
それ以上での保持は、溶液の組成と組み合わせて、
（３′−プライマーセブセグメント）1（第１図参照）
をそれに相補的な標的HIV RNAの配列へ高度に特異的に
しかも十分に安定した状態でハイブリダイズさせるのに
足るストリンジエント条件を提供する。
その後、10単位のトリ筋芽球症ウイルス（AMV）逆転
写酵素（Life Sciences社）を加え、この溶液を42℃で1
0分インキユベートする。〔１単位はHouts et al. J.Vir
ol.29、517、（1979）に記載されるような鋳型−プライ
マーとしてポリ（Ａ）オリゴ（Ｔ）12−18を用いて1nmo
lのTTPを酸沈殿形体へ37℃、10分で組み入れる。〕10分
インキユベーシヨン後、この溶液を１分間沸騰水浴に入
れる。この加熱は逆転写酵素により形成された２本鎖核
酸の鎖分離と逆転写酵素の不活化を起こさせる。
次に、この溶液を１分で42℃に冷却する。この冷却期
間中に、第二プライマー（プライマーＢ）が前工程で逆
転写酵素により触媒される反応から形成された標的相補
DNA鎖の３′末端（第三サブセグメント）t2c（第１図参
照）にハイブリダイズする。この場合も、ハイブリダイ
ゼーシヨン条件は第二プライマーとその第二プライマー
に相補的な配列とを特異的にハイブリダイズさせるのに
十分なストリンジエント条件である。
冷却後、追加の10単位のAMV逆転写酵素を加え、42℃
で10分さらにインキユベートする。
この反応混合物に100単位のT7ポリメラーゼを加え、3
7℃で30分インキユベートする。逆転写酵素により新た
に合成された２本鎖DNA鋳型の５′末端に存在するT7プ
ロモーターから出発して、もとの標的HIV RNAに相補的
なRNA転写物が合成される。この転写物は配列５′−GGG
Aを有し、その後に標的配列の第二サブセグメントに相
補的な配列（すなわち、第二サブセグメントter,第１図
参照）が続く、この工程以前では逆転写酵素は不活化さ
れておらず、しかもプライマーＢおよびデオキシヌクレ
オチド三リン酸が存在するので、２回目の合成がこの段
階で起こる。プライマーＢはそれに相補的な、新たに合
成されたRNA転写物（第三サブセグメント）t2cr（第１
図参照）の３′領域にハイブリダイズする。（前工程で
加えられた）逆転写酵素は鋳型として新たに合成された
RNA転写物（T7ポリメラーゼにより作られたもの）を使
用し、５′末端にプライマーとしてオリゴヌクレオチド
Ｂを用いてDNA鎖を合成する。
この反応混合物を１分沸騰させ、２本鎖RNA:DNAを変
性する。その後この混合物を１分で42℃へ冷却する。こ
の冷却工程中に、プライマーＡの標的相補セグメントが
前工程で合成されたDNA鎖にハイブリダイズする。同時
に、プライマーＢが前工程で合成されたRNA転写物の相
補配列にハイブリダイズする。
冷却後、追加の10単位のAMV逆転写酵素を加え、42℃
で10分さらにインキユベートする。逆転写酵素はプライ
マーとしてオリゴヌクレオチドＡを使用し、また鋳型と
して前工程で作られたDNAを用いてHIV標的に相補的なDN
Aを合成する。第二DNA鎖はプライマーとしてオリゴヌク
レオチドＢを、そして鋳型として前工程で作られたRNA
転写物を用いることにより合成される。
反応混合物を１分沸騰させて２本鎖DNAおよび２本鎖R
NA:DNAを変性する。この反応混合物を１分で42℃に冷却
する。プライマーＡは前工程で鋳型としてRNA転写物を
用いて合成されたcDNAにハイブリダイズする。（鋳型鎖
の３′末端が逆転写酵素プライマーとして使用される場
合、次の反応の目的産物と同じ産物が作られる。）プラ
イマーＢは標的HIV RNAに相補的なDNA鎖にハイブリダイ
ズする。この第二合成は５′末端にT7プロモーター配列
と4bpの“可変”セグメント５′−GGGA−３′を含む２
本鎖DNAの産物をもたらす。
この反応混合物に100単位のT7ポリメラーゼを加え
る。37℃で30分インキユベートする。T7 RNAポリメラー
ゼは鋳型として２本鎖T7プロモーターを含む２本鎖DNA
を使用して、５′末端に追加配列５′−GGGA−３′を含
む標的第二サブセグメントに相補的なRNAに転写する。
このサイクル（１分沸騰、42℃で１分、RT42℃で10
分、RT42℃で10分、T7ポリメラーゼ37℃で10分）は標的
配列の希望する増幅が得られるまで何回も繰り返すこと
ができる。得られた生産物はその後核酸プローブハイブ
リダイゼーシヨン技法により検出される。
実施例IX 1fmoleの濃度で精製HIV RNAを下記溶液に再懸濁す
る： この溶液100μｌを65℃で１分加熱し、１分かけて42
℃に冷却する。この加熱および冷却工程は、溶液の組成
と組み合わせて、プライマーＡを標的HIV RNAのプライ
マーＡ領域に相補的な配列〔（第一サブセグメン
ト）t2、第１図参照〕へ、十分安定した状態でしかも高
度に特異的にハイブリダイズさせるに足るストリンジエ
ント条件を提供する。
その後、10単位のトリ筋芽球症ウイルス（AMV）逆転
写酵素（Life Science社）を加え、この溶液を42℃で10
分インキユベートする。10分インキユベーシヨン後、溶
液を沸騰水浴中に１分入れる。この加熱は逆転写酵素に
より形成された２本鎖核酸の鎖分離および逆転写酵素の
不活化を引き起こす。
この溶液を１分にわたり42℃へ冷却する。この冷却中
に、第二プライマーＢは新たに合成された標的相補鎖
〔または第１図の（第三サブセグメント）t2c〕の３′
末端へハイブリダイズする。この場合も、ハイブリダイ
ゼーシヨン条件は第二プライマーとその第二プライマー
に相補的な配列とを特異的にハイブリダイズさせるに足
るストリンジエント条件である。
冷却後、追加の10単位のAMV逆転写酵素を加え、42℃
で10分さらにインキユベートする。
この反応混合物に100単位のT7 RNAポリメラーゼ（New
Endland Biolabs社）を加える。その後37℃で30分イン
キユベートする。逆転写酵素により合成された２本鎖DN
A鋳型の５′末端に存在するT7プロモーターから出発し
て、もとの標的HIV RNAに相補的なRNA転写物が合成され
る。このRNA転写物は５′−GGGAの配列を有し、その後
に標的配列の第二サブセグメントに相補的な配列（すな
わち第二サブセグメントtcr、第１図）が続く。この工
程以前では、逆転写酵素は不活化されておらず、しかも
プライマーＢとデオキシヌクレオチド三リン酸が存在す
るので、この段階において２回目の合成が起こる。プラ
イマーＢはそれに相補的な、新たに合成されたRNA転写
物〔（第三サブセグメント）t2cr、第１図参照〕の３′
領域にハイブリダイズする。（前工程で添加された）逆
転写酵素は鋳型として新たに合成されたRNA転写物（T7
RNAポリメラーゼにより作られたもの）を使用し、また
５′末端にプライマーとしてオリゴヌクレオチドＢを用
いてDNA鎖を合成する。
その後、反応混合物を１分間沸騰させてRNA:DNA2本鎖
を変性させる。次いで１分にわたつて42℃に冷却する。
この冷却工程中に、プライマーＡの標的相補セグメント
が前工程で合成されたDNA鎖にハイブリダイズする。同
時に、プライマーＢが前工程で合成されたRNA転写物の
相補配列にハイブリダイズする。
冷却後、10単位のAMV逆転写酵素を加え、42℃で10分
さらにインキユベーシヨンを実施する。逆転写酵素は
５′末端にプライマーとしてオリゴヌクレオチドＡを使
用し且つ鋳型として前工程で合成したDNAを用いて、HIV
標的に相補的なDNAを合成する。鋳型鎖の３′末端をプ
ライマーとして使用すると、５′末端に２本鎖T7プロモ
ーター部位を有する最終の２本鎖DNAが合成される。第
二DNA鎖はプライマーとしてオリゴヌクレオチドＢを、
鋳型として前工程で作られたRNA転写物を用いて合成さ
れる。
この反応混合物に100単位のT7ポリメラーゼを加え、3
7℃で30分インキユベートする。T7 RNAポリメラーゼは
鋳型として５′末端にポリメラーゼ結合部位（T7プロモ
ーター）を含む２本鎖DNAを用いてRNA転写物を合成す
る。このRNA転写物をその５′末端に追加配列５′−GGG
A−３′を含む標的第二サブセグメント（第１図参照）
に相補的なRNAである。増幅を高めるために、これ以上
のサイクルを繰り返し行つてもよい。得られた生産物は
核酸ハイブリダイゼーシヨン法により検出できる。
実施例Ｘ TAS増幅産物の最終回ラベリングプロトコル A.組み込まれなかつたヌクレオチドを除去するためのカ
ラム 1.最終TASサイクルでのcDNA合成後に、TAS反応混合物10
0μｌを取り出す。これに試薬Ａ（0.1M Tris−HCl、pH
7.7、10mMトリエチルアミン、1mM EDTAジナトリウム
塩）400μｌを加える。
2.NENSORB20 TM（Dupont）プレパツクカラムのカラム材
料を100％メタノール（HPLC級）中で湿潤させることに
より平衡化し、次いで2mlの試薬Ａで平衡化する。
3.カラムに試料を入れる。
4.カラムを1mlの試薬Ａで３回洗う。
5.カラムを1mlの水で３回洗う。
6.核酸を50％メタノールで溶出し、250〜300μｌの画分
を集める（総容量1ml以下）。（初めの２つの画分に大
部分の核酸が含まれるであろう。） 7.画分をスピード・バツク（speed−vac）または凍結乾
燥機で乾かす。
B.増幅産物のラベリングプロトコル 1.NENSORB20 TMカラムからの画分（最初の２画分を合わ
せてもよい）を40mM Tris−HCl、pH8.1、8mM MgCl2、25
mM NaCl、2mM スペルミジン(HCl)3、5mMジチオトレイト
ール、400μＭずつのrATP、rCTP、およびrGTP、12μＭ
のrUTP、および25μCiのα−32P−rUTP（800Ci/mmol）
中に再懸濁する。
2.それぞれ50μｌの試料に対して50単位のT7 RNAポリメ
ラーゼ（New England Biolabs）を加え、37℃で30分イ
ンキユベートする。
3.G−50スピンカラム（Maniatisらの上記文献）により
組み込まれなかつた標識を除く。
4.標識した試料をシークエンシング用のポリアクリルア
ミドゲルにかけて、増幅産物の大きさを決定する。標識
産物はOligo−BeadsTMを用いても検出できる。
実施例XI TAS増幅における内部標準の使用 試料ｉ）0.1fmHIV RNAおよび0.1fm β−グロビンDNA
配列（Pst Iで切断したＨβ19A）;2）0.01fmHIV RNAお
よび0.1fm β−グロビンDNA（Pst Iで切断したＨβ19
A）;3）0.1fmHIV RNA;または４）0.1fm β−グロビンDN
A（Pst Iで切断したＨβ19A）を40mM Tris−HCl、pH8.
1、8mM MaCl2、25mM NaCl、2mM スペルミジン−(HC
l)3、5mMジチオトレイトール、100μｌずつのdATP、dTT
P、dCTPおよびdGTP、1mMずつのrATP、rUTP、rCTP、およ
びrGTP、100μg/ml BSA（ヌクレアーゼ不含）、および2
50nMプライマーＡ（５′−AATTTAATACGACTCACTATAGGGAC
ACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG−３′）、250nMプラ
イマーＢ（５′−ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA−
３′）、250nMプライマーＣ（５′−TAATACGACTCACTATA
GGGAACTAAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCC−３′）、および250
nMプライマーＤ（５′−ACATTGCTTCTGACACAACTGTGTTCA
−３′）を含有する溶液100μｌに加えて調製した。1/2
0の出発核酸を含む試料をゼロ回試料として変性用溶液
7.4％ホルムアルデヒド、10×SSC（1.5M NaCl、0.15M
クエン酸Na、pH7.4）に入れた。
上記の試料を１分沸騰させ、42℃で１分冷却し、続い
て10単位のAMV逆転写酵素を加える。この反応混合物を4
2℃で15分インキユベートし、１分沸騰させ、42℃で１
分冷却する。追加の10単位のAMV逆転写酵素を加え、42
℃で15分インキユベートする。100単位のT7 RNAポリメ
ラーゼを加え、37℃で30分インキユベートする。このサ
イクルを２回繰り返す。（必要とされる増幅の程度に応
じて、それ以上のサイクルを行つてもよい。）1/20の出
発核酸を含む２つの試料を２回転写試料として変性用溶
液に入れた。
全ての試料を55℃で30分加熱し、その後２枚のニトロ
セルロース膜上に過した。254nmのUV光線を４分照射
することにより核酸を膜に固定した。対照として、全HI
VゲノムcDNAを含むプラスミドpARV7/2〔Luciw et al.，
Nature 312,760（1984）〕およびプラスミドＨβ19A〔W
allace et al.,Nucl.Acids Res.9,3647（1981）〕の
１、0.1および0.01fmを0.2N NaOH中で変性し、等容量の
2M酢酸アンモニウムで中和し、その後ニトロセルロース
膜上に過した。一方の膜はHIVの増幅産物を特異的な
32P−標識オリゴヌクレオチド86−311とハイブリダイズ
させた。他方の膜は増幅されたβ−グロビン産物および
標的β−グロビンプラスミドにハイブリダイズする32P
−標識オリゴヌクレオチド87−4592にハイブリダイズさ
せた。
ハイブリダイゼーシヨンは１％ SDS、0.9M NaCl、50n
M NaH2PO4（pH7.4）、5mM EDTA（pH7.4）、および106cp
m/mの32P−標識オリゴヌクレオチド中で55℃で１時間行
つた。膜を１％SDS、0.18M NaCl、10mM NaH2PO4（pH7.
4）および1mM EDTA中室温で３回洗い、次に同一緩衝液
中55℃で１回洗つた。
その後、膜は１枚の増感スクリーンを使用してコダツ
クXARフイルム上−70℃で16時間オートラジオグラフイ
ーにかけた。
第３図のオートラジオグラフは、HIVおよびβ−グロ
ビン核酸に対して同時に実施した２サイクルのTAS後に
検出されたHIVとβ−グロビン配列の量を示す。β−グ
ロビンの出発量は一定のままであるが、HIV標的の量は
変化した。
本発明は本明細書においてかなり特定的に記載されて
いるが、関連分野において通常の知識を有する者は本発
明の精神に含まれる本発明の変更および修飾を認めるで
あろう。このような変更および修飾もまたここに記載の
本発明の範囲内に含まれるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コー，デボラ・ヤンティス アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールスバッド，ジャカランダ・アベニ ュー 2404 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 C12Q 1/68

Claims (55)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】核酸を含有する試料中の標的配列を増幅す
    る方法であって： （Ａ）標的配列の第一セグメントに対応する配列に作動
    可能な状態で連結されたプロモーター配列を含む第一核
    酸プライマーであってその第一セグメントが標的配列の
    ３′−末端を含むもの、および標的配列の第二セグメン
    トの配列に対し相補的な配列にハイブリダイズし得る第
    二核酸プライマーであってその第二セグメントが標的配
    列の５′−末端を含むものを用意し； （Ｂ）適当な条件下で、該第一核酸プライマーを核酸含
    有試料中の標的配列とハイブリダイズさせ； （Ｃ）ハイブリダイズした第一核酸プライマーをポリメ
    ラーゼ伸長反応により標的配列に対し相補的に伸長させ
    て、第一２本鎖核酸を形成し； （Ｄ）工程（Ｃ）でつくられた２本鎖を１本鎖となし； （Ｅ）得られたプロモーター配列含有鎖に適当な条件下
    で第二核酸プライマーをハイブリダイズさせ； （Ｆ）ハイブリダイズした第二核酸プライマーをポリメ
    ラーゼ伸長反応によりプロモーター配列含有鎖に対し相
    補的に伸長させて、第二２本鎖核酸を形成し； （Ｇ）第一プライマーのプロモーター配列に対応するプ
    ロモーターを認識するRNAポリメラーゼにより触媒され
    る反応により、第二２本鎖をそれからRNA転写物を多数
    つくるための鋳型として使用し、その際それらの転写物
    はそれぞれ標的配列に対応するRNA配列を保有し； （Ｈ）第二２本鎖からつくられたRNA転写物に適当な条
    件下で第二核酸プライマーをハイブリダイズさせ； （Ｉ）ハイブリダイズした第二核酸プライマーを、RNA
    依存性DNAポリメラーゼにより触媒されるポリメラーゼ
    伸長反応により該RNA転写物に対し相補的に伸長させ
    て、第三２本鎖核酸を形成し； （Ｊ）第三２本鎖を１本鎖となし； （Ｋ）適当な条件下で、第一プライマーと第三２本鎖か
    ら得た第二プライマーを含む鎖とをハイブリダイズさ
    せ； （Ｌ）第一プライマーと第三２本鎖の分離により得た第
    二プライマーを含む鎖とのハイブリッド中の、第一プラ
    イマーおよび第二プライマーの両方を含む鎖をポリメラ
    ーゼ伸長反応により伸長させて、第四２本鎖核酸を形成
    し；そして （Ｍ）第一プライマーのプロモーター配列に対応するプ
    ロモーターを認識するRNAポリメラーゼにより触媒され
    る反応により、第四２本鎖をそれからRNA転写物を多数
    つくるための鋳型として使用し、その際それらの転写物
    はそれぞれ標的配列に対応するRNA配列を保有する 工程から成る方法。
  2. 【請求項２】さらに工程（Ｈ）〜（Ｍ）を少なくとも１
    回繰り返し、その際常に工程（Ｈ）においてそのすぐ前
    の工程ＭでつくられたRNA転写物への第二プライマーの
    ハイブリダイゼーションを採用することを含む、請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】核酸含有試料中の少なくとも１種の特定の
    核酸標的配列の検出に有用な方法であって、請求項１ま
    たは２に従って該標的配列に対応する配列を含むRNA転
    写物をつくらせ、そして該RNA配列の存在を検出するこ
    とから成る方法。
  4. 【請求項４】第一プライマーにおいて標的配列の第一セ
    グメントに対応する配列が第一セグメントに対し相補的
    であり；第二プライマーが標的配列の第二セグメントの
    配列と同一の配列を有し；標的配列の第一および第二セ
    グメントが重複せず；かつすべてのポリメラーゼ伸長反
    応を同一の逆転写酵素により触媒する、請求項１〜３の
    いずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】さらに請求項４記載の方法によりつくられ
    たRNA転写物を検出することを含む、請求項４記載の方
    法。
  6. 【請求項６】該転写物はレプリカーゼ誘導により該転写
    物を複製するためのレプリカーゼ認識部位を含む、請求
    項３または５記載の方法。
  7. 【請求項７】該RNA転写物の検出されたRNA配列を標準化
    方法により測定して、２本鎖核酸鋳型の製造において使
    用した核酸試料中に含まれる標的配列の量を測定する、
    請求項３、５または６記載の方法。
  8. 【請求項８】該RNA転写物の検出されたRNA配列を、やは
    り試料中に含まれる既知コピー数の核酸の存在により内
    部標準化された方法で測定する、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】標的配列は遺伝的な、または病原体による
    病気や症状の特徴と関連した核酸配列内に配置されてい
    る、請求項３または５記載の方法。
  10. 【請求項１０】該核酸配列はヒト免疫不全症ウイルスの
    セグメントである、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】該核酸配列は欠陥遺伝子のセグメントで
    ある、請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】第一プライマーのプロモーター配列に対
    応するプロモーターはバクテリオファージT7プロモータ
    ーであり、RNA転写物はT7 RNAポリメラーゼを用いてつ
    くられる、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】第一プライマーのプロモーター配列に対
    応するプロモーターはバクテリオファージSP6プロモー
    ターであり、RNA転写物はSP6 RNAポリメラーゼを用いて
    つくられる、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
  14. 【請求項１４】標的配列はDNA配列であり、ポリメラー
    ゼ伸長反応は大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼＩによ
    り触媒される、請求項１記載の方法。
  15. 【請求項１５】標的配列はDNA配列であり、ポリメラー
    ゼ伸長反応は大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断片
    により触媒される、請求項１記載の方法。
  16. 【請求項１６】標的配列はDNA配列であり、ポリメラー
    ゼ伸長反応はT4 DNAポリメラーゼにより触媒される、請
    求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】すべてのポリメラーゼ伸長反応は逆転写
    酵素により触媒される、請求項１または２記載の方法。
  18. 【請求項１８】検出前に該RNA転写物を標識する、請求
    項３または５記載の方法。
  19. 【請求項１９】該RNA転写物を放射性標識する、請求項1
    8記載の方法。
  20. 【請求項２０】該RNA転写物を発色団標識する、請求項1
    8記載の方法。
  21. 【請求項２１】逆転写酵素はAMV逆転写酵素およびMMLV
    逆転写酵素よりなる群から選ばれる、請求項17記載の方
    法。
  22. 【請求項２２】標識配列は1000以下のヌクレオチドを有
    し、標的配列の第一セグメントは15〜45ヌクレオチドを
    有し、標的配列の第二セグメントは15〜45ヌクレオチド
    を有する、請求項１〜21のいずれか１項記載の方法。
  23. 【請求項２３】鎖を熱変性により分離する、請求項１〜
    22のいずれか１項記載の方法。
  24. 【請求項２４】核酸含有試料中の少なくとも１種の特定
    の核酸標的配列の検出に有用なキットであって、標的配
    列のセグメントに対し相補的な配列に作動可能な状態で
    連結されたプロモーター配列を含む第一核酸プライマー
    および標的配列のセグメントと同一の配列を有する第二
    核酸プライマー（これらのプライマーは標的配列の異な
    る領域に対応するが、標的配列へのそれらの対応におい
    て重複しないか、または実質的に重複せず、一方の伸長
    産物がその相補鎖から分離されるとき他方の伸長産物の
    鋳型として役立ち得るように選ばれる）；ならびに該第
    一プライマーを標的配列にハイブリダイズさせ、ハイブ
    リダイズしたプライマーを鎖伸長させ、得られた２本鎖
    を１本鎖となし、プロモーター配列を含む分離鎖に第二
    核酸プライマーをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ
    したプライマーを鎖伸長させ、得られたプロモーター配
    列を含む２本鎖核酸に転写物をつくらせ、そして該転写
    物を検出するための手段；を含むキット。
  25. 【請求項２５】プライマーを鎖伸長させる手段はAMV逆
    転写酵素およびMMLV逆転写酵素よりなる群から選ばれる
    逆転写酵素であり、第一プライマーのプロモーター配列
    に対応するプロモーターは、T7 RNAポリメラーゼおよび
    SP6 RNAポリメラーゼよりなる群から選ばれるRNAポリメ
    ラーゼによる転写に対して認識され、該プロモーターを
    含む２本鎖核酸に転写物をつくらせる手段は、プロモー
    ターがT7 RNAポリメラーゼによる転写に対して認識され
    る場合にはT7 RNAポリメラーゼであり、プロモーターが
    SP6 RNAポリメラーゼによる転写に対して認識される場
    合にはSP6 RNAポリメラーゼである、請求項24記載のキ
    ット。
  26. 【請求項２６】検出すべき標識配列は1000以下のヌクレ
    オチドを有し、標的配列のセグメントに対し相補的な第
    一プライマーの配列は15〜45ヌクレオチドを有し、標的
    配列のセグメントと同一の第二プライマーの配列は15〜
    45ヌクレオチドを有する、請求項24または25記載のキッ
    ト。
  27. 【請求項２７】式I: ［式中（第一サブセグメント）tは（第二サブセグメン
    ト）tの３′末端に隣接する少なくとも10ヌクレオチド
    の既知配列の核酸セグメントであり、（第二サブセグメ
    ント）tは０またはそれ以上のヌクレオチドの核酸セグ
    メントであり、そして（第三サブセグメント）tは（第
    二サブセグメント）tの５′末端に隣接する少なくとも1
    0ヌクレオチドの既知配列の核酸セグメントである］の
    標的核酸セグメントを増幅する方法であって： （１）該標的セグメントの（第一サブセグメント）
    tに、式II: ［式中、（プロモーター）1はバクテリオファージDNA依
    存性RNAポリメラーゼ特異的プロモーターの配列を有す
    る１本鎖DNAセグメントであり、（可変サブセグメン
    ト）1は（プロモーター）1の３′末端ヌクレオチドおよ
    び（３′−プライマーサブセグメン）1の５′末端ヌク
    レオチドに隣接する０〜100ヌクレオチドの１本鎖DNAセ
    グメントであり、そして（３′−プライマーサブセグメ
    ント）1は（第一サブセグメント）tの３′末端ヌクレオ
    チドで終わる（第一サブセグメント）tのサブセグメン
    トの配列に相補的な配列を有する少なくとも10ヌクレオ
    チドの１本鎖DNAセグメントであり、（可変サブセグメ
    ント）1が０ヌクレオチドである場合、（プロモータ
    ー）1は（３′−プライマーサブセグメント）1の５′末
    端に隣接する］の３′末端サブセグメントから成る１本
    鎖DNAの第一プライマーをハイブリダイズさせ； （２）工程（１）に従ってハイブリダイズさせた第一プ
    ライマーを第一DNAポリメラーゼにより触媒される反応
    で伸長させて、式III: ［式中（第一サブセグメント）tcは（第一サブセグメン
    ト）tの配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    り、（第二サブセグメント）tcは（第二サブセグメン
    ト）tの配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    り、そして（第三サブセグメント）tcは（第三サブセグ
    メント）tの配列に相補的な配列を有するDNAセグメント
    である］のサブセグメントから成る第一相補DNAセグメ
    ントをつくり（但し、標的セグメントがRNAセグメント
    である場合、該第一DNAポリメラーゼは逆転写酵素であ
    る）； （３）工程（２）の反応で形成された２本鎖を１本鎖と
    なし； （４）式IIIの第一相補DNAセグメントの（第三サブセグ
    メント）tcに、式IV: ［式中（５′−プライマーサブセグメント）2は（第三
    サブセグメント）tの５′末端ヌクレオチドで終わる
    （第三サブセグメント）tのサブセグメント配列を有
    し、（可変サブセグメント）2は（５′−プライマーサ
    ブセグメント）2の５′末端に隣接する０〜100ヌクレオ
    チドのセグメントである］の少なくとも10ヌクレオチド
    の１本鎖DNAである第二プライマーをハイブリダイズさ
    せ； （５）工程（４）に従ってハイブリダイズさせた第二プ
    ライマーセグメントを第二DNAポリメラーゼにより触媒
    される反応で伸長させて、式V: ［式中（可変サブセグメント）1cは（可変サブセグメン
    ト）1の配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    り、（プロモーター）1cは（プロモーター）1の配列に
    相補的な配列を有するDNAセグメントである］のサブセ
    グメントから成る第二相補DNAセグメントをつくり（但
    し、第二DNAポリメラーゼは第一DNAポリメラーゼと同一
    であっても異なってもよい）；そして （６）工程（５）の２本鎖産物を、一方の鎖が（プロモ
    ーター）1であるプロモーターを認識する第一バクテリ
    オファージDNA依存性RNAポリメラーゼにより触媒される
    反応において鋳型として使用して、式VI: ［式中（可変サブセグメント）1rは（可変サブセグメン
    ト）1の配列を有するRNAセグメントであり、（第一サブ
    セグメント）tcrは（第一サブセグメント）tの配列に相
    補的な配列を有するRNAセグメントであり、（第二サブ
    セグメント）tcrは（第二サブセグメント）tの配列に相
    補的な配列を有するRNAセグメントであり、（第三サブ
    セグメント）tcrは（第三サブセグメント）tの配列に相
    補的な配列を有するRNAセグメントであり、そして（可
    変サブセグメント）2crは（可変サブセグメント）2の配
    列に相補的な配列を有するRNAセグメントである］の第
    一RNA産物をつくることから成り； 下記を特徴とする：工程（１）〜（６）の後に繰り返し
    サイクルにおいてさらに標的核酸セグメントの増幅を行
    い、その際（第一サブセグメント）tは長さが少なくと
    も10ヌクレオチドであって、式XIII: ［式中（第一サブセグメント）t2は０またはそれ以上の
    ヌクレオチドを有し、０より多い場合は（第一サブセグ
    メント）t1の３′末端に隣接し、そして（第一サブセグ
    メント）t1は長さが少なくとも10ヌクレオチドである］
    で表され；（第三サブセグメント）tは式XIV: ［式中（第三サブセグメント）t2は０またはそれ以上の
    ヌクレオチドを有し、０より多い場合は（第三サブセグ
    メント）t1の５′末端に隣接し、そして（第三サブセグ
    メント）t1は長さが少なくとも10ヌクレオチドである］
    で表され；（３′−プライマーサブセグメント）1は
    （第一サブセグメント）t2の全部と（第一サブセグメン
    ト）t1の０またはそれ以上のヌクレオチドから成る標的
    セグメントのサブセグメントの配列に相補的な配列を有
    し；（５′−プライマーサブセグメント）2は（第三サ
    ブセグメント）t2の全部と（第三サブセグメント）t1の
    ０またはそれ以上のヌクレオチドから成るサブセグメン
    トであり；（可変サブセグメント）2は０ヌクレオチド
    であり；そして工程（１）〜（６）の後に、式VII: ［式中（第一サブセグメント）t1crは（第一サブセグメ
    ント）t1の配列に相補的な配列を有するRNAセグメント
    であり、そして（第三サブセグメント）t1crは（第三サ
    ブセグメント）t1の配列に相補的な配列を有するRNAセ
    グメントである］のRNAセグメントが下記から成る方法
    によってさらに増幅される： （７）式VIの第一RNA産物に、式VIII: ［式中（プロモーター）3はバクテリオファージDNA依存
    性RNAポリメラーゼ特異的プロモーターの配列を有する
    １本鎖DNAセグメントであり、（プロモーター）3の配列
    は（プロモーター）1の配列と同一であっても異なって
    いてもよく、（可変サブセグメント）3は（プロモータ
    ー）3の３′末端ヌクレオチドおよび（３′−プライマ
    ーサブセグメント）3の５′末端ヌクレオチドに隣接す
    る０〜100ヌクレオチドの１本鎖DNAセグメントであり、
    そして（３′−プライマーサブセグメンント）3は（第
    三サブセグメント）t1と同じ配列を有し、且つ（可変サ
    ブセグメント）3が０ヌクレオチドである場合、（プロ
    モーター）3の３′末端ヌクレオチドに隣接する１本鎖D
    NAセグメントである］の３′末端サブセグメントから成
    る１本鎖DNAセグメントの第三プライマーをハイブリダ
    イズさせ； （８）工程（７）に従ってハイブリダイズさせた第三プ
    ライマーを、第三DNAポリメラーゼ（逆転写酵素であ
    り、第一および第二DNAポリメラーゼと同一であっても
    異なっていてもよい）により触媒される反応で伸長させ
    て、式IX: ［式中（可変サブセグメント）1cは（可変サブセグメン
    ト）1の配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    る］の３′末端サブセグメントから成る第三相補DNAセ
    グメントをつくり； （９）工程（８）の反応で形成された２本鎖を１本鎖と
    なし； （10）工程（８）の反応でつくられた第三相補DNAに、
    式X: ｛式中（可変サブセグメント）4は０〜100ヌクレオチド
    のセグメントであり、そして（５′−プライマーサブセ
    グメント）4は、（可変サブセグメント）4が０より多い
    ヌクレオチドを有する場合、（可変サブセグメント）4
    の３′ヌクレオチドに隣接し且つ式XX: ［式中（第一サブセグメント）t2cは（第一サブセグメ
    ント）t2の配列に相補的な配列を有するDNAセグメント
    であり、そして（第一サブセグメント）t1cは（第一サ
    ブセグメント）t1の配列に相補的な配列を有するDNAセ
    グメントである］のセグメントの少なくとも10個のヌク
    レオチドから成る既知配列のサブセグメントであり、但
    し、上記の少なくとも10個のヌクレオチドのうち少なく
    とも１個は（第一サブセグメント）t1cの５′末端ヌク
    レオチドに存在するか、またはその５′末端ヌクレオチ
    ドから５′側に存在する｝の第四プライマーをハイブリ
    ダイズさせ； （11）工程（10）に従ってハイブリダイズさせた第四プ
    ライマーを第四DNAポリメラーゼ（第一、第二および第
    三DNAポリメラーゼと同一であっても異なっていてもよ
    い）により触媒される反応で伸長させて、式XI: ５′−（第一サブセグメント）t1c−（第二サブセグメ
    ント）tc− ［式中（第二サブセグメント）tcは（第二サブセグメン
    ト）tの配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    り、（第三サブセグメント）t1cは（第三サブセグメン
    ト）t1の配列に相補的な配列を有するDNAセグメントで
    あり、（可変サブセグメント）3cは（可変サブセグメン
    ト）3の配列に相補的な配列を有するDNAセグメントであ
    り、そして（プロモーター）3cは（プロモーター）3の
    配列に相補的な配列を有するDNAセグメントである］の
    セグメントから成る第四相補DNAをつくり；そして （12）工程（10）の２本鎖産物を、第二バクテリオファ
    ージDNA依存性RNAポリメラーゼ（第一バクテリオファー
    ジDNA依存性RNAポリメラーゼと同一であっても異なって
    いてもよく、一方の鎖が（プロモーター）3であるプロ
    モーターを認識する）により触媒される反応において鋳
    型として使用して、式XII: ［式中（可変サブセグメント）3rは（可変サブセグメン
    ト）3の配列を有するRNAセグメントであり、（第三サブ
    セグメント）t1cは（第三サブセグメント）t1の配列を
    有するRNAセグメントであり、（第二サブセグメント）
    trは（第二サブセグメント）tの配列を有するRNAセグメ
    ントであり、（第一サブセグメント）t1rは（第一サブ
    セグメント）t1の配列を有するRNAセグメントであり、
    （可変サブセグメント）4crは（可変サブセグメント）4
    の配列に相補的な配列を有するRNAセグメントであり、
    そしてX12は（第一サブセグメント）t1rの５′末端から
    ５′側にある（５′−プライマーサブセグメント）4の
    サブセグメントの配列に相補的な配列を有するRNAセグ
    メントである］の５′末端サブセグメントを有する第二
    RNA産物をつくる方法。
  28. 【請求項２８】（可変サブセグメント）1および（可変
    サブセグメント）2はそれぞれ０〜60個のヌクレオチド
    を有し、（３′−プライマーサブセグメント）1および
    （５′−プライマーサブセグメント）2はそれぞれ15〜4
    5個のヌクレオチドを有し、（第二サブセグメント）tは
    少なくとも30個のヌクレオチドを有し、そして標的セグ
    メントは1000個以下のヌクレオチドを有する、請求項27
    記載の方法。
  29. 【請求項２９】標的セグメントはDNAセグメントであ
    り、工程（２）の産物は熱変性により１本鎖となし、
    （可変サブセグメント）2は０個のヌクレオチドを有
    し、第一および第二DNAポリメラーゼはそれぞれ大腸菌D
    NAポリメラーゼＩのクレノー断片、AMV逆転写酵素、ク
    ローン化MMLV逆転写酵素、ウシ胸腺DNAポリメラーゼア
    ルファ、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticu
    s）熱安定性DNAポリメラーゼ、および商標名シーケナー
    ゼ（SequenaseTM）のクローン化T7 DNAポリメラーゼよ
    り成る群から選ばれ、バクテリオファージDNA依存性RNA
    ポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラー
    ゼおよびSP6 RNAポリメラーゼより成る群から選ばれ
    る、請求項27記載の方法。
  30. 【請求項３０】第一および第二DNAポリメラーゼはそれ
    ぞれ大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断片、AMV逆転
    写酵素、およびクローン化MMLV逆転写酵素より成る群か
    ら選ばれる、請求項29記載の方法。
  31. 【請求項３１】（１）バクテリオファージDNA依存性RNA
    ポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼであり、（プロモー
    ター）1は５′−TAATACGACTCACTATA−３′であり、そし
    て（可変サブセグメント）1はその５′末端に配列５′
    −GG−３′のジヌクレオチドを有する；または（２）バ
    クテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼはT3 RNAポ
    リメラーゼであり、（プロモーター）1は５′−TATTAAC
    CCTCACTAAA−３′であり、そして（可変サブセグメン
    ト）1はその５′末端に配列５′−GGGA−３′のテトラ
    ヌクレオチドを有する；あるいは（３）バクテリオファ
    ージDNA依存性RNAポリメラーゼはSP6 RNAポリメラーゼ
    であり、（プロモーター）1は５′−GAACGCGGCTACAATTA
    ATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA−
    ３′であり、そして（可変サブセグメント）1はその
    ５′末端に配列５′−GAATAC−３′のヘキサヌクレオチ
    ドを有する、請求項30記載の方法。
  32. 【請求項３２】第一プライマーの５′末端は（プロモー
    ター）1の５′−ヌクレオチドである、請求項31記載の
    方法。
  33. 【請求項３３】バクテリオファージDNA依存性RNAポリメ
    ラーゼがT7またはT3RNAポリメラーゼである場合、（可
    変サブセグメント）1は配列５′−GGGATGGGGAACCCCCCTT
    CGGGGGTCACCTCGCGCAGC−３′を有し、そしてバクテリオ
    ファージDNA依存性RNAポリメラーゼがSP6 RNAポリメラ
    ーゼである場合、（可変サブセグメント）1は配列５′
    −GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−３′
    を有する、請求項32記載の方法。
  34. 【請求項３４】標的セグメントはRNAセグメントであ
    り、工程（２）の産物は熱変性により１本鎖となし、
    （可変サブセグメント）2は０個のヌクレオチドを有
    し、第一DNAポリメラーゼはAMV逆転写酵素およびクロー
    ン化MMLV逆転写酵素より成る群から選ばれ、第二DNAポ
    リメラーゼは大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断
    片、AMV逆転写酵素、クローン化MMLV逆転写酵素、ウシ
    胸腺DNAポリメラーゼアルファ、テルムス・アクアティ
    カス熱安定性DNAポリメラーゼ、および商標名シーケナ
    ーゼのクローン化T7 DNAポリメラーゼより成る群から選
    ばれ、そしてバクテリオファージDNA依存性RNAポリメラ
    ーゼはT7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼおよび
    SP6 RNAポリメラーゼより成る群から選ばれる、請求項2
    8記載の方法。
  35. 【請求項３５】第二DNAポリメラーゼは大腸菌DNAポリメ
    ラーゼＩのクレノー断片、AMV逆転写酵素、およびクロ
    ーン化MMLV逆転写酵素より成る群から選ばれる、請求項
    34記載の方法。
  36. 【請求項３６】（１）バクテリオファージDNA依存性RNA
    ポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼであり、（プロモー
    ター）1は５′−TAATACGACTCACTATA−３′であり、そし
    て（可変サブセグメント）1はその５′末端に配列５′
    −GG−３′のジヌクレオチドを有する；または（２）バ
    クテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼはT3 RNAポ
    リメラーゼであり、（プロモーター）1は５′−TATTAAC
    CCTCACTAAA−３′であり、そして（可変サブセグメン
    ト）1はその５′末端に配列５′−GGGA−３′のテトラ
    ヌクレオチドを有する；あるいは（３）バクテリオファ
    ージDNA依存性RNAポリメラーゼはSP6 RNAポリメラーゼ
    であり、（プロモーター）1は５′−GAACGCGGCTACAATTA
    ATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATA−
    ３′であり、そして（可変サブセグメント）1はその
    ５′末端に配列５′−GAATAC−３′のヘキサヌクレオチ
    ドを有する、請求項35記載の方法。
  37. 【請求項３７】第一プライマーの５′末端は（プロモー
    ター）1の５′−ヌクレオチドである、請求項36記載の
    方法。
  38. 【請求項３８】第一および第二DNAポリメラーゼはそれ
    ぞれAMV逆転写酵素およびクローン化MMLV逆転写酵素か
    ら選ばれる、請求項37記載の方法。
  39. 【請求項３９】バクテリオファージDNA依存性RNAポリメ
    ラーゼがT7またはT3 RNAポリメラーゼである場合、（可
    変サブセグメント）1は配列５′−GGGATGGGGAACCCCCCTT
    CGGGGGTCACCTCGCGCAGC−３′を有し、そしてバクテリオ
    ファージDNA依存性RNAポリメラーゼがSP6 RNAポリメラ
    ーゼである場合、（可変サブセグメント）1は配列５′
    −GAATACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−３′
    を有する、請求項38記載の方法。
  40. 【請求項４０】標的セグメントはヒト免疫不全症ウイル
    ス、すなわちHIV−１ウイルス、のゲノムのセグメント
    であり、その場合（１）（３′−プライマーサブセグメ
    ント）1は配列５′−TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT
    −３′を有し、そして（５′−プライマーサブセグメン
    ト）2は配列５′−ACAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAG−
    ３′を有する；または（２）（３′−プライマーサブセ
    グメント）1は配列５′−TTTCGTAACACTAGGCAAAGGTGGCTT
    TATC−３′を有し、そして（５′−プライマーサブセグ
    メント）2は５′−GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA−
    ３′および５′−ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA−
    ３′より成る群から選ばれる配列を有する、請求項34、
    35、36、37、38または39記載の方法。
  41. 【請求項４１】（可変サブセグメント）1および（可変
    サブセグメント）3はそれぞれ０〜60個のヌクレオチド
    を有し、（３′−プライマーサブセグメント）1、
    （５′−プライマーサブセグメント）2、（３′−プラ
    イマーサブセグメント）3および（５′−プライマーサ
    ブセグメント）4はそれぞれ15〜45個のヌクレオチドを
    有し、（第二サブセグメント）tは少なくとも30個のヌ
    クレオチドを有し、そして標的セグメントは1000個以下
    のヌクレオチドを有する、請求項27記載の方法。
  42. 【請求項４２】（Ａ）標的セグメントがDNAセグメント
    である場合、工程（２）の産物は熱変性により１本鎖と
    なし、工程（８）の産物も熱変性により１本鎖となし；
    第一、第二および第四DNAポリメラーゼはそれぞれ大腸
    菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断片、AMV逆転写酵素、
    クローン化MMLV逆転写酵素、ウシ胸腺DNAポリメラーゼ
    アルファ、テルムス・アクアティカス熱安定性DNAポリ
    メラーゼ、および商標名シーケナーゼのクローン化T7 D
    NAポリメラーゼより成る群から選ばれ；第三DNAポリメ
    ラーゼはAMV逆転写酵素およびクローン化MMLV逆転写酵
    素から選ばれ；そして第一および第二バクテリオファー
    ジDNA依存性RNAポリメラーゼはそれぞれT7 RNAポリメラ
    ーゼ、T3 RNAポリメラーゼおよびSP6 RNAポリメラーゼ
    より成る群から選ばれる；ならびに（Ｂ）標的セグメン
    トがRNAセグメントである場合、工程（２）の産物およ
    び工程（８）の産物はそれぞれ熱変性により１本鎖とな
    し；第二および第四DNAポリメラーゼはそれぞれ大腸菌D
    NAポリメラーゼＩのクレノー断片、AMV逆転写酵素、ク
    ローン化MMLV逆転写酵素、ウシ胸腺DNAポリメラーゼア
    ルファ、テルムス・アクアティカス熱安定性DNAポリメ
    ラーゼ、および商標名シーケナーゼのクローン化T7 DNA
    ポリメラーゼより成る群から選ばれ；第一および第三DN
    AポリメラーゼはそれぞれAMV逆転写酵素およびクローン
    化MMLV逆転写酵素より成る群から選ばれ；そして第一お
    よび第二バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼ
    はそれぞれT7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、
    およびSP6 RNAポリメラーゼより成る群から選ばれる、
    請求項41記載の方法。
  43. 【請求項４３】標的セグメントはRNAセグメントであ
    り、第二および第四DNAポリメラーゼはそれぞれ大腸菌D
    NAポリメラーゼＩのクレノー断片、AMV逆転写酵素、お
    よびクローン化MMLV逆転写酵素より成る群から選ばれ、
    それぞれ第一および第三DNAポリメラーゼはそれぞれAMV
    逆転写酵素およびクローン化MMLV逆転写酵素より成る群
    から選ばれる、請求項42記載の方法。
  44. 【請求項４４】（３′−プライマーサブセグメント）1
    の配列に相補的な配列を有する標的セグメントのサブセ
    グメントは（５′−プライマーサブセグメント）4の配
    列に相補的な配列を有する標的セグメントのサブセグメ
    ントから３′方向にあってそれと重複せず、（５′−プ
    ライマーサブセグメント）2の配列を有する標的セグメ
    ントのサブセグメントは（３′−プライマーサブセグメ
    ント）3の配列を有する標的セグメントのサブセグメン
    トと重複しない、請求項42記載の方法。
  45. 【請求項４５】（３′−プライマーサブセグメント）1
    の配列に相補的な配列を有する第三相補DNAのサブセグ
    メントは（５′−プライマーサブセグメント）4の配列
    に相補的な配列を有する第三相補DNAのサブセグメント
    から５′方向にあってそれと重複せず、そして（５′−
    プライマーサブセグメント）2の配列を有する標的セグ
    メントのサブセグメントは（３′−プライマーサブセグ
    メント）3の配列を有する標的セグメントのサブセグメ
    ントと重複しない、請求項44記載の方法。
  46. 【請求項４６】第三相補DNAにおいて、（可変サブセグ
    メント）1cは０より多いヌクレオチドを有し、そして
    （５′−プライマーサブセグメント）4と第三相補DNAと
    の２本鎖核酸において、少なくとも（５′−プライマー
    サブセグメント）4のサブセグメントが（可変サブセグ
    メント）1cにハイブリダイズする、請求項45記載の方
    法。
  47. 【請求項４７】（３′−プライマーサブセグメント）1
    の配列に相補的な配列を有する標的セグメントのサブセ
    グメントは（５′−プライマーサブセグメント）4の配
    列に相補的な配列を有する標的セグメントのサブセグメ
    ントから３′方向にあってそれと重複せず、（５′−プ
    ライマーサブセグメント）2の配列を有する標的セグメ
    ントのサブセグメントは（３′−プライマーサブセグメ
    ント）3の配列を有する標的セグメントのサブセグメン
    トと重複しない、請求項45記載の方法。
  48. 【請求項４８】（３′−プライマーサブセグメント）1
    の配列に相補的な配列を有する第三相補DNAのサブセグ
    メントは（５′−プライマーサブセグメント）4の配列
    に相補的な配列を有する第三相補DNAのサブセグメント
    から５′方向にあってそれと重複せず、そして（５′−
    プライマーサブセグメント）2の配列を有する標的セグ
    メントのサブセグメントは（３′−プライマーサブセグ
    メント）3の配列を有する標的セグメントのサブセグメ
    ントと重複しない、請求項45記載の方法。
  49. 【請求項４９】第三相補DNAにおいて、（可変サブセグ
    メント）1cは０より多いヌクレオチドを有し、そして
    （５′−プライマーサブセグメント）4と第三相補DNAと
    の２本鎖核酸において、少なくとも（５′−プライマー
    サブセグメント）4のサブセグメントが（可変サブセグ
    メント）1cにハイブリダイズする、請求項48記載の方
    法。
  50. 【請求項５０】（１）工程（６）または（12）において
    T7 RNAポリメラーゼを用いる場合、（プロモーター）1
    （その工程が工程（６）である場合）または（プロモー
    ター）3（その工程が工程（12）である場合）は配列
    ５′−TAATACGACTCACTATA−３′を有し、そして（可変
    サブセグメント）1（その工程が工程（６）である場
    合）または（可変サブセグメント）3（その工程が工程
    （12）である場合）はその５′末端に配列５′−GG−
    ３′のジヌクレオチドを有する；あるいは（２）工程
    （６）または（12）においてT3 RNAポリメラーゼを用い
    る場合、（プロモーター）1（その工程が工程（６）で
    ある場合）または（プロモーター）3（その工程が工程
    （12）である場合）は配列５′−TATTAACCCTCACTAAA−
    ３′を有し、そして（可変サブセグメント）1（その工
    程が工程（６）である場合）または（可変サブセグメン
    ト）3（その工程が工程（12）である場合）はその５′
    末端に配列５′−GGGA−３′のテトラヌクレオチドを有
    する；あるいは（３）工程（６）または（12）において
    SP6 RNAポリメラーゼを用いる場合、（プロモーター）1
    （その工程が工程（６）である場合）または（プロモー
    ター）3（その工程が工程（12）である場合）は配列 ５′−GAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACAT
    ACGATTTAGGTGACACTATA−３′を有し、そして（可変サブ
    セグメント）1（その工程が工程（６）である場合）ま
    たは（可変サブセグメント）3（その工程が工程（12）
    である場合）はその５′末端に配列５′−GAATAC−３′
    のヘキサヌクレオチドを有し、第一プライマーの５′末
    端は（プロモーター）1の５′−ヌクレオチドであり、
    そして第三プライマーの５′末端は（プロモーター）3
    の５′−ヌクレオチドである、請求項44、45、46、47、
    48または49記載の方法。
  51. 【請求項５１】（Ａ）（ｉ）第一バクテリオファージDN
    A依存性RNAポリメラーゼがT7またはT3 RNAポリメラーゼ
    である場合、（可変サブセグメント）1は配列５′−GGG
    ATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−３′を有し、
    そして第二プライマー（可変サブセグメント）2は配列
    ５′−CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGT
    GC−３′を有する；あるいは（ii）第一バクテリオファ
    ージDNA依存性RNAポリメラーゼがSP6 RNAポリメラーゼ
    である場合、（可変サブセグメント）1は配列５′−GAA
    TACTGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−３′を有
    し、そして第二プライマー（可変サブセグメント）2は
    配列５′−CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCT
    TCGTGC−３′を有する；（Ｂ）（ｉ）第二バクテリオフ
    ァージDNA依存性RNAポリメラーゼがT7またはT3 RNAポリ
    メラーゼである場合、（可変サブセグメント）3は配列
    ５′−GGGATGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−
    ３′を有する；（ii）第二バクテリオファージDNA依存
    性RNAポリメラーゼがSP6 RNAポリメラーゼである場合、
    （可変サブセグメント）3は配列５′−GAATAGGGACTGGGG
    AACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−３′を有し、そして
    第四プライマーは５′−末端の40ヌクレオチドとして
    ５′−CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGT
    GC−３′を有する；そして（Ｃ）工程（12）の後に、第
    二RNAはＱβレプリカーゼにより自己触媒的に複製され
    る、請求項44、45、46、47、48または49記載の方法。
  52. 【請求項５２】標的セグメントはヒト免疫不全症ウイル
    ス、すなわちHIV−１ウイルス、のゲノムのセグメント
    であり、（１）（３′−プライマーサブセグメント）1
    は配列５′−TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT−３′を
    有し、（５′−プライマーサブセグメント）2は配列
    ５′−ACAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAG−３′を有し、
    （３′−プライマーサブセグメント）3は配列５′−AAA
    GGTATCCTTTGAGCCAATTCCCATA−３′を有し、そして第四
    プライマーは配列５′−AGTTGATACTACTGGCCTAATT−３′
    を有する；または（２）（３′−プライマーサブセグメ
    ント）1は配列５′−TTTCGTAACACTAGGCAAAGGTGGCTTTATC
    −３′を有し、（５′−プライマーサブセグメント）2
    は５′−GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA−３′およ
    び５′−ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA−３′より成
    る群から選ばれる配列を有し、（３′−プライマーサブ
    セグメント）3は配列５′−ACTAATTCATCTGTATTACTTTGAC
    TGTTTTTCを有し、そして第四プライマーは配列５′−TT
    TTTTGGTGTTATTAATGCTGCTAGTGCC−３′を有する、請求項
    41、42、43、44、45、46、47、48または49記載の方法。
  53. 【請求項５３】（Ａ）標的セグメントがDNAセグメント
    である場合、工程（２）の産物は熱変性により１本鎖と
    なし；第一および第二DNAポリメラーゼはそれぞれ大腸
    菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断片、AMV逆転写酵素、
    クローン化MMLV逆転写酵素、ウシ胸腺DNAポリメラーゼ
    アルファ、テルムス・アクアティカス熱安定性DNAポリ
    メラーゼ、および商標名シーケナーゼのクローン化T7 D
    NAポリメラーゼより成る群から選ばれ；そして第一バク
    テリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼはT7 RNAポリ
    メラーゼ、T3 RNAポリメラーゼおよびSP6 RNAポリメラ
    ーゼより成る群から選ばれる；ならびに（Ｂ）標的セグ
    メントがRNAセグメントである場合、工程（２）の産物
    は熱変性により１本鎖となし；第二DNAポリメラーゼは
    大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断片、AMV逆転写酵
    素、クローン化MMLV逆転写酵素、ウシ胸腺DNAポリメラ
    ーゼアルファ、テルムス・アクアティカス熱安定性DNA
    ポリメラーゼ、および商標名シーケナーゼのクローン化
    T7 DNAポリメラーゼより成る群から選ばれ；第一DNAポ
    リメラーゼはAMV逆転写酵素およびクローン化MMLV逆転
    写酵素より成る群から選ばれ；そして第一バクテリオフ
    ァージDNA依存性RNAポリメラーゼはT7 RNAポリメラー
    ゼ、T3 RNAポリメラーゼ、およびSP6 RNAポリメラーゼ
    より成る群から選ばれる、請求項28記載の方法。
  54. 【請求項５４】第一および第二DNAポリメラーゼはAMV逆
    転写酵素およびクローン化MMLV逆転写酵素より成る群か
    ら選ばれる、請求項53記載の方法。
  55. 【請求項５５】第一プライマーの５′末端は（プロモー
    ター）1の５′−ヌクレオチドであり、バクテリオファ
    ージDNA依存性RNAポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼで
    ある場合、第一プライマーのサブセグメント（プロモー
    ター）1−（可変サブセグメント）1は配列 を有し；バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼ
    がT3 RNAポリメラーゼである場合、第一プライマーのサ
    ブセグメント（プロモーター）1−（可変サブセグメン
    ト）1は配列 を有し；バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼ
    がSP6 RNAポリメラーゼである場合、第一プライマーの
    サブセグメント（プロモーター）1−（可変サブセグメ
    ント）1は配列 を有し；（可変サブセグメント）2は配列５′−TGGGGAA
    CCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC−３′を有し；そして工
    程（６）の後に、第一RNAはＱβレプリカーゼにより自
    己触媒的に複製される、請求項54記載の方法。
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