PT87769B - Processo de preparacao de um acido nucleico de cadeia dupla e processo de amplificacao de um segmento de acido nucleico - Google Patents

Description

MEMORIA descritiva

Este pedido é uma continuação do Pedido, de acordo com a 35 U.S.C. 120/l21 dos E.U. 07/064141 depositado a 19 de Ounho de 1987, cujo conteúdo é aqui incorporado para referência.

A

Âmbito do Invento presente invento relaciona-se, na generalidade, com pro gressos em biologia molecular e em genética molecular.

Mais particularmente, o presente invento refere-se a novos métodos e conjuntos contendo reagentes e meios necessários para aumentar o número de cópias in vitro ou x-vivo, isto é, amplifica, ção, de, pelo menos, um segmento seleccionado (sequência) de ác_i do nucleico ou do seu complemento, ou para hibridação de segmentos homólogos, numa amostra incluindo um ou mais ácidos nucleicos, que podem incluir ARN, ADN ou ambos.

Entre as aplicaçães nas quais os métodos e conjuntos deste invento são úteis estão: (l) em análise de tecidos e fluidos do organismo para detecção de sequências de ácido nucleico especificas, caracteristicas duma dada doença ou condição, genética ou patogénica, por ensaios de hibridação de sondas de ácido nuclei. co in vitro ou x-vitro; (2) na clonação selectiva de genes de cópia única ou de rara ou reduzida expressão.

Antecedentes do Invento

Muito do trabalho em biologia molecular, genética molecular e suas aplicaçães, como por exemplo, ensaios de hibridação de sondas de ácido nucleico para patogénios do sangue (blood-bojr ne) ou genes defeituosos, envolve a detecção ou isolamento duma sequência particular de ácido nucleico. Um problema fundamental em tal trabalho é detectar ou isolar e depois quantificar uma s£ quência de ácido nucleico de interesse. 0 problema tem sido difícil de resolver parque os materiais biológicos, como culturas de células, espécimes de tecidos e amostras de sangue, contêm, ti picamente, uma mistura complexa de ARN e ADN, dos quais, no máxi_ mo, apenas uma fracção minúscula apresenta uma sequência com interesse.

Na verdade, as aplicações práticas de ensaios de hibrida67 879

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-3ção de sondas de ácido nucleico têm sido limitadas porque a sensibilidade dos ensaios, quando realizados com reagentes adequados para uso de rotina e durante períodos de tempo aceitavelmente curtos, é demasiado baixa para detectar sequências de interejs se à baixa concentração com que elas surgem nas amostras reais.

Duas abordagens fundamentalmente diferentes foram feitas para tratar o problema da detecçSo de uma sequência de ácido nucleico de interesse (segmento alvo) presente num baixo nível numa mistura complexa de ácidos nucleicos.

Na primeira abordagem, a quantidade de ácido nucleico (incluindo o segmento alvo) duma amostra não é alterada; em vez disso, um sistema gerador de sinal é associado com o segmento al. vo e produz um sinal detectável representativo do número de molé cuias do segmento alvo. Por exemplo, uma sonda de ácido nucleico com a sequência complementar à de um subsegmento do segmento alvo é ligada a uma enzima como a fosfatase alcalina e misturada com a amostra sob condições de hibridação que vão produzir a hibridação entre a sonda e o segmento alvo (mas não apreciavelmente entre a sonda e outras sequências de ácido nucleico da amostra). Após remoção da sonda ligada à enzima que não hibridou, um substrato cromogénico para a fosfatase alcalina é adicionado sob condições apropriadas e, em princípio, um grande número de moléculas coradas e detectáveis é rapidamente produzido para cada molécula de sonda hibridada com o segmento alvo.

São também conhecidos na técnica numerosos outros sistemas para detecção de sequências de ácido nucleico sem alteração da quantidade de ácido nucleico alvo da amostra. Outro exemplo é a vulgar marcação duma sonda de ácido nucleico com átomos ra32 dioactivos como P, seguida de detecção da sonda hibridada com o alvo por meio do sinal amplificado iniciado pela desintegração dos núcleos radioactivos. Ainda outro exemplo envolve a ligação à sonda para o segmento alvo de um outro ácido nucleico que ê ca paz de replicação de tal modo que possa ser prontamente detectada por técnicas conhecidas. São conhecidos alguns ARN que são susceptíveis de replicação induzida por replicase (auto cataliti camente) por meio de certas polimerases, tal como ARN polimerase dependente de ARN de bacteriófago, tal como Qreplicase e a re

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-4plicase do vírus do mosaico da ceuadinha (Bromus) (BMU). Nesse sistema, tanto um ARN como o ARN da sequência complementar são moldes para replicação pela ARN polimerase; consequentemente, a quantidade de ARN replicado aumenta exponencialmente com o tempo (enquanto o número de moléculas molde de ARN não exceder o número de moléculas de ARN polimerase num sistema). Ver Miele e colab., 0. Mol. Biol. 177, 281 (1985). Um sistema no qual a sonda para um segmento alvo está ligada a um ARN capaz de ser replicado pela Qreplicase é descrito por Chu e colab., Nucl. Acids Res. 14, 5591 (1986) e pela BMU replicase ê descrito por Marsh e colab., Positive Strand RNA Viruses, Alan R. Liss (edit., Nova Iorque) (1987; actas do Simpósio da UCLA, 1986).

A primeira abordagem apresenta duas desvantagens sérias. Sm primeiro lugar, em muitos casos, o número de cópias do segmert to alvo numa amostra de tamanho prático é tão baixo que, até para sistemas geradores de sinais razoavelmente rápidos, o tempo necessário para produzir um sinal detectável que esteja significativamente acima do fundo é impraticavelmente longo. Em segundo lugar, a geração de sinal a partir das moléculas geradoras de sinal do fundo e a partir das moléculas geradoras de sinal associadas com o alvo, ocorre essencialmente b mesma velocidade. Em qualquer ensaio para um segmento alvo, um sinal proveniente do fundo é inevitável; isto é, invariavelmente aparece algum sinal proveniente da sonda que adere, não especificamente, a fi_l tros ou outros suportes sólidos ou hibrida com segmentos de sequências muito semelhantes à do segmento alvo. Se o número de cópias do alvo é demasiado baixo, a razão constante no tempo, eri tre o sinal proveniente do alvo mais o fundo (isto é sinal) e o sinal proveniente do fundo (isto é ruído) será muito bai. xa para ser significativamente detectável acima do fundo. Estas e outras desvantagens conduziram os especialistas da técnica a uma segunda abordagem para tratar o problema da detecção dum segmento alvo presente com um nível baixo numa mistura complexa de ácidos nucleicos.

Esta segunda abordagem é fundamentalmente diferente e implica o aumento do número de cópias do próprio segmento alvo, preferencialmente numa extensão maior que a de outras sequências

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-5da amostra, particularmente daquelas que possam erroneamente ser detectadas como segmento aluo devido à similaridade na sequência. Exemplos desta segunda abordagem incluem várias técnicas de cultura nas quais as células que albergam o segmento alvo são aumen tadas em número, por vezes mais rapidamente do que várias outras células, ou em que certos ácidos nucleicos (por exemplo, plasmideos, ARN) tendo neles o segmento alvo são aumentados em número.

Tais técnicas de cultura têm os inconvenientes de serem incómodas, problemáticas e demoradas e manifestam o inevitável: ácidos nucleicos diferentes dos que incluem o segmento alvo são simultaneamente aumentados em número de cópias, e portanto é potencialmente aumentado o fundo. Outro inconveniente ê o crescimento de organismos potencialmente perigosos como um passo necessário para alcançar a amplificação.

Outro exemplo desta segunda abordagem é a amplificação de um segmento alvo de ADN numa denominada reacção em cadeia de p_q limerase (RCP). Esta técnica é uma adaptação de processos c_o nhecidos que ocorrem naturalmente no processo de replicação de, por exemplo, genomas de ADN de cadeia simples de certas entidades virais, e em todos os casos representa um aplicação semelhante para preparação de ADNc por Hong, Bioscience Reports 1, 243 (l98l) ; Cooke e colab., 0. Biol. Chem. 255, 6502 (1980) ; e Zoller e colab., Methods in Enzymology 100, 468-500 (1983). Por esta técni ca, um segmento particular aumenta exponencial mente o número de cópias com vários ciclos, cada um dos quais compreende: (l) hibridar um primário de ADN a um subsegmento terminal 3' de cada segmento alvo e seu complemento (isto é, o segmento de sequê_n cia complementar à do segmento alvo); (2) prolongar cada um dos primários com uma ADN polimerase; e (3) transformar em cadeias simples, por desnaturação térmica, os duplex resultantes do passo (2). Esta técnica é descrita por Saiki e colab., Science 230, 1350 (1985), e Mullis e colab., Publicação do Pedido de Patente Europeia nQs. 200362 e 201184. Ver também Patentes dos EUA 4683195 e 4683202. Como reportado, na aplicação da técnica durante 20 ciclos por cerca de 3 horas, o número de cópias de um segmento alvo pode ser aumentado num factor de cerca de 1θ\ Em consequência, apenas aqueles segmentos com os quais híbrida um

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-6primário específico com uma estabilidade suficiente para iniciar o prolongamento da cadeia pela polimerase para formar o complemento e que têm um complemento com o qual hibrida outro primário específico de modo semelhante para produzir segmento alvo por prolongamento da cadeia, aumentam exponencial mente em número de cópias enquanto outros segmentos não aluo que não hibridaram erroneamente com o primário empregue aumentam, se assim for, no rná ximo, linearmente em número de cópias em função do número de ciclos. A técnica da reacção em cadeia com polimerase pode aumentar muito numa amostra não só o número de cópias do segmento alvo mas também a proporção da quantidade de segmento alvo em re lação aos segmentos originando o fundo.

Claro que esta segunda abordagem pode ser aplicada a uma amostra em conjunção com o uso da primeira abordagem aplicada com o segmento alvo amplificado para originar um sinal de detecção ainda mais forte.

E objectivo do presente invento resolver os problemas apontados pelas técnicas anteriores e ultrapassar as desvantagens enumeradas em anteriores objectivos de pesquisa orientados para a resolução de tais problemas. E ainda objectivo do preseri te invento fornecer uma técnica simples que possa ser utilizada num intervalo de tempo aceitavelmente curto, empregando comodamente reagentes conhecidos e tendo a precisão necessária para al_ cançar resultados científicos consistentes; uma técnica que pos_ sa ser utilizada num meio de ensaio reprodutível e que seja adaptável para uso em conjuntos para análises clínicas/laboratoriais.

E portanto um objectivo do presente invento aumentar a detectabilidade de certas sequências de ácido nucleico (segmentos alvo) por amplificação das referidas sequências alvo num sis_ tema in vitro ou x-vivo destituído das desvantagens enumeradas até aqui das tentativas da técnica anterior.

presente invento refere-se a uma nova técnica para realizar a segunda abordagem a fim de detectar um segmento alvo prje sente, a um nível baixo, numa mistura complexa de ácidos nucleicos. Utiliza um novo passo de produção do transcrito de ARN em

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-7conjunção e derivado de uma cópia de ADNc de cadeia dupla sintetizada a partir da sequência alvo como ciclo completo.

Podem ser empregues vários ciclos. Em virtude do passo de transcrição ser o aspecto dominante da novidade, ê convenientemente referido aqui como sistema de amplificação baseado na transcrição (TAS). A nova técnica do presente invento, TAS, resulta num aumento rápido do número de cópias de um segmento alvo seleccionado utilizando duas propriedades da ARN polimerase dependente de ADN: (l) apreciável iniciação de transcrição a partir somente de um pequeno número de sequências especificas para cada polimerase (ver, por exemplo, Brouun e colab., Nucl, Acids Res. 14, 3521 (1986); e (2) rápida produção de um grande número de transcritos a partir de cada cópia de um promotor (geralmente 10^-10^ por hora) reconhecido por uma ARN polimerase. Ver, Milligan e colab., Nucl. Acids. Res. 15, 8783 (1987). A técnica do invento pode também utilizar a capacidade dos ARN com certas sequências de serem rapidamente (auto cataiiticamente) replicados por ARN replicases dependentes de ARN. Ver também Miele e colab., acima. Em adição, fornece uma técnica padronizada que to_r na possíveis mediçães não ambíguas da quantidade de ADN alvo pre^ sente numa amostra.

presente invento (a menos que se empregue a replicação (autocataliticamente) induzida origina um transcrito de ARN de cadeia simples ou um duplex ARN-ADN, formados a partir dele quando não são tomadas medidas para evitar a sua formação, que tem um subsegmento que tem a sequência do segmento alvo ou a sequência complementar à do segmento alvo e que está presente em grande excesso relativamente ao ácido nucleico com um subsegmento de sequência complementar.

Este excesso, inicialmente, de transcrito de ARN de cadeia simples é vantajoso em certos métodos para detectar o produto am plificado com sonda de ácido nucleico marcada devido a estar pre sente um pequeno segmento de sequência complementar para competir com a sonda na hibridação com o produto amplificado. Também o produto do transcrito do ARN de cadeia simples está dividido mais ou menos continuamente e leva à detecção directa do segmento alvo sem a necessidade de ciclos RCP repetidos propensos a e_r

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-8ros e separação de cadeias inconvenientes. Estas vantagens não são fornecidas pela técnica RCP que produz ADN de cadeias duplas (uma cadeia que contém o segmento alvo e outra cadeia que contém o complemento do segmento alvo) que necessitam de ser separadas antes da detecção, e só depois de um grande número de ciclos repetidos, necessários para alcançar níveis de amplificação aceitá veis.

As técnicas do presente invento proporcionam amplificação de um segmento alvo seleccionado numa extensão pelo menos tão grande como na técnica RCP, no mesmo período de tempo, mas de uma maneira muito mais simples e reprodutível, e distinta de pro cessos naturais ou de outras técnicas.

Sumário do Invento

Verificámos como a ADN polimerase dependente de ADN de bacteriófago pode ser utilizada para rapidamente amplificar (isto é, aumentar o número de cópias) uma sequência de ácidos nuclei_ cos alvo seleccionada (sequência ou segmento alvo) presente numa amostra de ácidos nucleicos. Além disso, verificámos como a ARN polimerase dependente de ADN de bacteriófago pode ser utilizada em conjunto com a ARN polimerase dependente de ARN de bacteriófa go para obter o mesmo resultado. Até agora ainda não tinha sido avaliado que a ARN polimerase podia ser utilizada para este fim.

invento refere métodos baseados nestas verificaçães e conjuntos para realizar os métodos.

Estes métodos e conjuntos são particularmente úteis aplicados em conjunção com ensaios de hibridação de sonda de ácido nucleico para um ácido nucleico que inclui um segmento alvo amplificado de acordo com o invento. Assim, o invento também refe re métodos, e conjuntos para aplicar os métodos, para detectar a presença ou ausência de um segmento numa amostra de um ácido nucleico que inclui um segmento particular, por intermédio de uma sonda hibridada com o segmento após amplificação de acordo com o invento.

presente invento é baseado na novidade de certos transcritos de ARN, sua produção, replicação facultativa, e uso, para

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-9realizar a amplificação desejada e detecção da sequência de ácido nucleico alvo correspondente (em sequência). 0 invento ê usa do em meios quer in vitro quer x-vivo, e é empregue conjuntamente com a síntese de uma cópia de AONc de cadeia dupla de sequência alvo, de maneira a produzir um molde de ácido nucleico de cadeia dupla, usado por sua vez para produção dos referidos transcritos de ARN. Este processo de síntese de ADNc de cadeia dupla e trans. crição de ARN constitui um ciclo simples do presente sistema de amplificação baseado na transcrição (TAS). Se desejado, este ciclo pode ser repetido de maneira a alcançar ainda maiores níveis de amplificação. Em virtude do método pelo qual eles são produzidos (e reproduzidos), os transcritos correspondem (identi camente ou complementarmente) em sequência a uma sequência de ácido nucleico alvo contida numa amostra original de entre uma mistura de ácidos nucleicos, e, portanto, a presença de transcri. tos em forma amplificada leva à sua detecção, e dal, por correspondência, à detecção in vitro ou x-vivo da presença da sequência de ácido nucleico na referida amostra.

Assim, o presente invento envolve a detecção in vitro ou x-vivo de, pelo menos, uma sequência de ácido nucleico especifica (sequência ou segmento alvo) numa amostra contendo ácido nucleico. 0 presente invento reduz-se a um método que compreende a preparação de um ácido nucleico de cadeia dupla contendo uma sequência correspondente a uma sequência alvo operacional mente ligada a um promotor para tal, empregaram o referido ácido nuclei. co de cadeia dupla como um molde de ácido nucleico de cadeia dupla para a preparação de uma pluralidade de transcritos de ARN, cada um destes contendo uma sequência de ARN correspondendo à referida sequência alvo e detectar a presença da referida sequência de ARN e por analogia a presença de sequência alvo.

presente inventa é dirigido a todos os métodos e meios associados com a preparação e uso destes transcritos de ARN. Ljo go, o presente invento é dirigido ao método, facultativamente repetitivo, de preparação do referido molde de ácido nucleico de cadeia dupla definido acima, compreendendo proporcionar um primeiro primário de ácido nucleico contendo uma sequência promotora, operacionalmente ligada a uma sequência correspondendo a um

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-10segmento de uma sequência aluo, como definida acima, hibridar sob condições adequadas, o referido primeiro primário de ácido nucleico com a sequência alvo numa amostra contendo ácido nucle_i co prolongar o hibridado do referido primeiro ácido nucleico numa reacção de prolongamento com polimerase complementarmente à sequência aluo para formar o correspondente ácido nucleico duplex separar as cadeias do referido duplex, hibridar com o promotor s.e parado, contendo a cadeia de sequência, sob condições adequadas, um segundo primário de ácido nucleico na extremidade oposta à re ferida sequência promotora, e prolongar o referido segundo primá rio de ácido nucleico hibridado numa reacção de prolongamento com polimerase, complementarmente à referida sequência, contendo o promotor.

presente inuento é ainda dirigido a outros métodos e meios alternativos de preparação do referido molde de ácido nucleico de cadeia dupla (acima), por exemplo, uma reacção esseri cialmente em recipiente único compreendendo proporcionar um primeiro primário de ácido nucleico que contém uma sequência promotora operacionalmente ligada a uma sequência complementar a um segmento de uma sequência aluo, e um segundo primário de ácido nucleico tendo uma sequência idêntica a um segmento de uma sequência aluo, correspondendo os ditos primários a diferentes regiões da referida sequência aluo, mas não se sobrepondo ou não se sobrepondo substancialmente na sua correspondência ao aluo e sen do seleccionados de modo que um produto de prolongamento de um, quando separado do seu complemento, pode servir como molde para um produto de prolongamento do outro, fazer contactar uma amostra contendo ácido nucleico que inclui a sequência aluo, com os refe ridos primários sob condições de hibridação sequencial e de sepa ração de cadeias, de modo a produzir, por sua uez, produtos de prolongamentos dos primários referidos.

presente inuento é também dirigida a métodos e meios de emprego do referido ácido nucleico de cadeia dupla (acima) como molde para a preparação, a partir dele, de uma pluralidade de transcritos de ARN, numa reacção catalisada por uma ARN polímera se dependente de ADN que reconhece o seu promotor, e detectar e medir a presença dos referidos transcritos de ARN.

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-110 presente invento ê ainda dirigido a métodos e meios para padronizar a quantidade de sequência aluo detectada (por correspondência com a quantidade de transcritos de ARN detectados) por correlação adicional com a presença de ácido nucleico conhecido, utilizado como padrão interno. 0 número de cópias do padrão é predeterminado e o padrão experimentara as mesmas condições (é. para isso destinado) que a sequência alvo, durante a prática deste invento, e deverá servir portanto como meio de avaliaçõo na determinação de quantidades relativas de transcritos preparados em paralelo, para ela e para a sequência alvo.

presente invento ê ainda dirigido à replicação adicional dos transcritos obtidos de ARN acima referidos por intermédio da presença de sítios de reconhecimento da replicase. Isto é convenientemente realizado fornecendo o referido primeiro primário de ácido nucleico, definido acima, tendo adicionalmente uma sequência de sitio de reconhecimento da replicase, preferencialmente entre a sequência promotora e a sequência correspondejn te à sequência alvo, e/ou contendo adicionalmente um sítio de re conhecimento da replicase no segundo primário de ácido nucleico, acima referido. Na subsequente transcrição, os transcritos consequentes contêm os sítios de reconhecimento da replicase; de tal modo que a presença de uma replicase (no lócus da reacção ou no conjunto, por exemplo) ( autocatal i ti carne nte) induz replic_a ção dos transcritos produzindo cópias adicionais para maior faci_ lidade de detecção.

presente invento é principalmente dirigido a conjuntos compreendendo os reagentes indispensáveis e meios úteis associados na detecção in vitro ou x-vivo de, pelo menos, uma sequência de ácido nucleico específica (sequência alvo), numa amostra contendo ácido nucleico, empregando os métodos e meios acima definjL dos.

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-12Descrição Detalhada do Invento

1. Breve descrição dos desenhos

Figuras IA, IB e 1C ilustram um método de acordo com o invento para amplificação de um segmento alvo de um ácido nucle_i z

co (Acido Nucleico A), o qual é um ADN ou ARN, no qual são feitas muitas cópias de um primeiro ARN (ARN I) com um segmento com uma sequência complementar à do segmento alvo.

Figuras 2A, 2B e 2C ilustram a outra amplificação, de acordo com o invento, de um segmento dum ARN I, feito como ilustrado nas figuras IA, IB e 1C, para produzir muitas cópias dum segundo ARN (ARN II) com um segmento com uma sequência igual à de um subsegmento do segmento alvo, o qual foi amplificado para produzir o ARN I.

Figura 3 representa auto-radiogramas mostrando várias con centraçães de ARN de HIV amplificado por TAS simultaneamente com uma concentração fixa do ácido nucleico de /3-globina humana.

Figura 4 mostra uma estratégia geral por meio da qual o ARN produzido por uma ARN polimerase dependente de ADN origina uma molécula de ARN que pode servir como um molde para uma repli case dependente de ARN.

2. Métodos Gerais e Definiçães z

E feita referência a livros de texto clássicos da biologia molecular que contêm definiçães, métodos e meios para realizar as técnicas básicas do presente invento tais como: preparação da sonda de ADN ou de ADN primário, incluindo síntese de ADN; metodologia de hibridação incluindo variaçães nas condiçães de rigor para produzir maior ou menor certeza- de hibridação dependendo do grau de homologia do primário para uma sequência de ADN alvo; identificação, isolamento ou preparação de promotores, ou mais e.s pecificamente de promotores ou sítios reconhecidos pela ARN polimerase dependente de ADN de bacteriófago e ARN polimerase dependente de ARN de bacteriófago, ou pelo emprego de sistemas eucari.ó ticos, de polimerases dependente de ADN e ARN virais, por exemplo, ARN polimerase codificada por adenovirus, ARN polimerase de vírus do mosaico da cevadinha; condiçães conducentes à produção de transcritos de ARN, incluindo as denominadas sequências melhorado

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-13ras da transcrição; o mecanismo e metodologia para replicação i_n duzida; métodos de reacção em cadeia de polimerase incluindo os reagentes nela utilizados; e assim por diante. Ver, por exemplo Maniatis e colb. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1982) e as várias referências aí citadas; Patente dos EUA 4683195; Patente dos EUA 4683202; Hong, Bioscience Reports 1, 243 (l98l); Cooke e colab. 0. Biol, Chem. 255 6502 (1980) ; Zoller e colab., Methods in Enzy mology 100, 468-500 (1983); Crea e colab., Nucleic Açjds Res. 8, 2331 (1980); Narang e colab., Meth. Enzym. 68, 90 (1979); Beaicage e colab., Tetrahedron Letters 22, 1859 (l98l); Broiun e colab., Meth. Enzym. 68, 109 (1979); Caruthers e colab., Meth.

E nzym. 154, 287 (1985); Hitzeman e colab., 0. Biol. Chem. 255, 2073 (1980); Lee e colab., Science 239, 1288 (1988); Milligan e colab., Nucleic Açjds Res. 15, 8783 (1987); Miller e colab., Uirology 125, 236 (1983); Ahlquist e colab., 0. Mol. Biol. 153, 23 (l98l); Miller e colab., Nature 313, 68 (1985); Ahlquist e colab., 0. Mol. Biol. 172, 369 (1984); Ahlquist e colab., Plant Mol, Biol, 3, 37 (1984); 0u e colab., PNAS 79, 5235 (1982); Chu e colab., Nucl. Acids Res. 14, 5591 (1986); Publicação do Pedido de Patente Europeia NS. (EPA) 194809; Marsh e colab., Positive Strand RNA Viruses, p. 327-336, Alan R. Liss (publ.; Neui York) (1987; Actas do Simpósio da UCLA, 1986); Miller e colab., 0.

Mol. Biol. 187, 537 (1986); Stoflet e colab., Science 239, 491 (1988); e Murakauja e colab., ADN 7, 287 (1988).

Todas as publicaçSes supracitadas são por este motivo incorporadas por referência inclusa.

Pelo termo promotor pretende-se significar uma sequência de ácido nucleico (ocorrendo naturalmente ou produzida sinteticamente ou um produto de digestão de restrição) que é especificame_n te reconhecida por uma ARN polimerase que se liga a uma sequência reconhecida e inicia o processo de transcrição pelo qual um trans. crito de ARN é produzido. Pode, facultativamente, conter bases do nucleótido prolongando-se para além do verdadeiro sítio de reconhecimento, para proporcionar estabilidade adicional para os processos de degradação. Em princípio, pode ser empregue qualquer sequência promotora para a qual exista uma polimerase conhe67 879

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-14cida e disponível que seja capaz de reconhecer a sequência de iniciação. Promotores conhecidos e úteis, típicos, são aqueles que são reconhecidos por certas polimerases de bacteriófago como bacteriófago T3, T7 ou SP6. Ver Siebenlist e colab., Cell 20,

269 (l980). Estas são só exemplos das polimerases que podem ser utilizadas na prática do presente invento em conjunto com as sequências promotoras associadas.

transcrito de ARN referido é a sequência de ácido ribonucleico produzida após iniciação da transcrição após o reconheci, mento da sequência promotora pela ARN polimerase (ver acima). A produção de tais transcritos ê mais ou menos contínua, dependendo em parte da quantidade de polimerase presente.

termo primário no presente contexto significa uma sequência de ácido nucleico (ocorrendo naturalmente ou produzida sinteticamente ou um produto de digestão de restrição) que tem ho mologia suficiente com a sequência alvo de modo que, sob condições de hibridação adequada, é capaz de hibridação, isto é ligação à sequência alvo. Um primário típico tem, pelo menos, cerca de 10 nucleotidos de comprimento, e preferencialmente tem aproximadamen te 35 ou mais bases de nucleótidos, de comprimento, e nas concretizações mais preferidas, apresenta identidade ou tem homologia muito elevada com a sequência alvo. Ver, por exemplo, EPA 128042 (public. 12 Dez. 84).

termo ligado operacional mente, em particular em relação à ligação de uma sequência promotora dentro de uma sequência primária, refere-se à funcionalidade do molde de ácido nucleico de cadeia dupla básico do presente invento, de modo que ele, o molde, é capaz de produzir transcritos de ARN correspondentes quando o promotor ê reconhecido pela polimerase adequada (ver aci ma).

A reacção de prolongamento do primário para produzir um duplex é conhecida per se. Ver referências acima. Polimerases úteis para este propósito incluem ADN polimerase I de E. coli, fragmento de Klenou/ de ADN polimerase I de E. coli, ADN polimerase de T4, transcriptase inversa e assim por diante.

As técnicas para formar um sinal de detecção, tais como por meio de marcação radioactiva ou meios cromogénicos usando uma

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-15enzima cromogénica susceptível, são também bem conhecidas e documentadas. Ver discussão acima.

A utilização de uma replicase para indução (autocatalibi camente) de replicação de transcritos de ARN do presente invento é, na generalidade, conhecida dos especialistas no assunto. Exemplos adequados de tais replicases que são úteis no presente invejn to incluem a denominada replicase de vírus Qfí , que reconhece certos sítios da sequência de ácido nucleico em ambas extremidades 3'- e 5'- de um dado transcrito de ARN e as denominadas repli cases do vírus do mosaico de cevadinho (BMV) e dos vírus oõ, que se pensa reconhecerem sítios da sequência de ácido nucleico, na extremidade 3'-, de um dado transcrito de ARN. Estas replicases servem para replicar, isto é reproduzir, os transcritos e complementos de ARN, bem como para multiplicar as suas cópias. Quando tal enzima está presente no lugar da reacção durante o processo de transcrição, pode-se prever que os múltiplos transcritos que são produzidos durante a transcrição podem ser eles próprios submetidos a replicação de maneira a aumentarem exponencial mente a quantidade de produto de transcrito de ARN.

A padronização interna é definida como o processo que é utilizado para: a) assegurar que o processo de amplificação de TAS não falhou devido a um erro operacional, e, b) medir os níveis de ácido nucleico alvo em relação a uma quantidade predeterminada de ácido nucleico o qual está sempre associado com a amostra de interesse. Tal padronização interna ocorre por co-amplifi cação de uma porção da sequência alvo, bem como de uma sequência endógena, na mesma reacção. Por exemplo, conhecendo a contagem de células presentes numa amostra biológica, um gene de cópia úni ca (por exemplo, £>-globina) podia ser utilizado como um padrão interno e, dado que não é expressa sob a forma de ARN, o seu núme ro de cópias inicial ê igual a duas vezes o número total de células na amostra. Por co-amplificação de porçães das sequências de /3-globina e alvo, de interesse, as proporçães dos sinais amplifi cados podem ser comparadas para quantificar os níveis da sequência alvo de interesse. Dado que cada célula tem duas cópias (nas células diplóides) deste padrão interno, independentemente de a amostra biológica conter sequências alvo separadas (por ex., HIV),

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-16cada amostra deverá produzir um sinal de amplificação positivo, resultante do padrão interno. Ver Groudine e colab., Nucleic flcids Research 12, 1427 (1984), e McKnight, Cell 31, 355 (1982).

Ver também Public, do Pedido de Patente Britânico nQ. 2187283 A (public. 3 Set. 87).

3. Descrição detalhada dos aspectos preferidos

Num dos seus aspectos, o invento é um método para amplificação dum segmento de ácido nucleico alvo de fórmula I:

3'-(primeiro subsegmento) ^.-(s egundo subsegmento)^.-(terceiro subsegmento) _t~ 5 ’

I na qual o (primeiro subsegmento)é um segmento de ácido nucleico de sequência conhecida com pelo menos 10 nucleótidos contíguo ao terminal 3'- do (segundo subsegmento)^., o (segundo subsegmento) é um segmento de ácido nucleico com 0 ou mais nucleótidos, e o (terceiro subsegmento)^. é um segmento de ácido nucleico de sequêri cia conhecida com pelo menos 10 nucleótidos, contíguo ao terminal 5’ do (segundo subsegmento)^., método que abrange:

(l) hibridação do (primeiro subsegmento)^. do referido segmento alvo com o primeiro primário, que é um ADN de cadeia simples que compreende um subsegmento do terminal 3’, de fórmula II:

5'-(promotor)^-(subsegmento variável )^-(3'-subsegmento primário)^-3'

II na qual o (promotor)^ é um segmento de ADN de cadeia simples com a sequência da cadeia mais de um promotor específico da ARN polimerase dependente de ADN do bacteriófago, o (subsegmento variável)^ é um segmento de ADN de cadeia simples com 0 a 10D nucleótidos contíguo ao nucleótido do terminal 3’ do (promotor)^ e ao nucleótido do terminal 5' do (3'-subsegmento primário)^, e o (3'-subsegmento primário)^ é um segmento de ADN de cadeia simples com pelo menos 10 nucleótidos com uma sequência que é complementar da sequência de um subsegmento do (primeiro subsegmento) que termina com o nucleótido do terminal 3’ do (primeiro subsegmento)_t;

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-17o referido (promotor)^ é contíguo ao terminal 5' do referido (3’-subsegmento primário)^, se o referido (subsegmento variável)^ tem 0 nucleótidos;

(2) extensão do referido primeiro primário, hibridado de acordo com 0 passo (l), numa reacção catalisada com uma primeira AON polimerase para originar um primeiro segmento complementar de AON, que compreende um subsegmento de fórmula III:

5'-(promotor)^-(subsegmento variável ^-(primeiro subsegmento)^-(segundo subsegmento) (terceiro subsegmento) ^.-3 ·

III na qual 0 (primeiro subsegmento)á o segmento de ADN com a sequência complementar à do (primeiro subsegmento) 0 (segundo subsegmento)é o segmento de ADN com a sequência complementar à do (segundo subsegmento)^., e o (terceiro subsegmento) é o segmento de ADN com a sequência complementar à do (terceiro subsegmento)^, sob a condição de, se o segmento alvo é um segmento de ARN, a referida primeira ADN polimerase é uma transcriptase inveje S3 J (3) transformar em cadeias simples o duplex formado na reacção do passo (2);

(4) hibridação do (terceiro subsegmento) do referido primeiro AON complementar de fórmula III com um segundo primário, que ê um ADN de cadeia simples com pelo menos 10 nucleótidos de fórmula IV:

3’-(5'-subsegmento primário)₂-(subsegmento variável)₂~5'

IV na qual 0 (5'-subsegmento primário)₂ tem a sequência de um subsegmento do (terceiro subsegmento) que termina com o nucleótido do terminal 5’ do (terceiro subsegmento)^. e na qual o (subsegmeri to variável)₂ é um segmento com 0 a 100 nucleótidos que é contíguo ao terminal 5' do (5'-subsegmento primário)₂;

(5) extensão do referido segundo segmento primário, hibri dado de acordo com 0 passo (4), numa reacção catalisada por uma segunda ADN polimerase para originar um segundo segmento comple67 879

File NS. 47104

-18mentar de ADN que compreende um subsegmento de fórmula U:

5'-(subsegmento variável )2-( terceiro subsegmento )*.-( segundo subsegmento) ^.-(primeiro subsegmento )*_-( subsegmento variável)^_c~ -(promotor)^_c-3'

V na qual 0 (subsegmento variável)^ é 0 segmento de ADN com a sequência complementar à do (subsegmento variável)^, e 0 (promotor).^ é o segmento de ADN com a sequência complementar à do (promotor)y, sob a condição de a referida segunda ADN polimerase ser igual ou diferente da referida primeira ADN polimerase; e (6) utilização do produto de cadeia dupla do passo (5) co mo molde para a reacção catalisada por uma primeira ARN polimerase dependente de ADN de bacteriófago, que reconhece o promotor do qual uma cadeia é o (promotor), para originar um primeiro produto de ARN de fórmula VI:

5'-(subsegmento variável)^^-(primeiro subsegmento)*. -(segundo subsegmento)^_cr-(terceiro subsegmento)*._cr.-(subsegmento variável)2_Cr

-3' ,

UI na qual 0 (subsegmento variável)^ é 0 segmento de ARN com a sequência do (subsegmento variável)·*, o (primeiro subsegmento) *. é 0 segmento de ARN com a sequência complementar à do (primeiro sujb segmento)*., o (segundo subs egmento) *__cr é o segmento de ARN com a sequência complementar à do (segundo subsegmento)*., 0 (terceiro subsegmento) *._cr é o segmento de ARN com a sequência complementar à do (terceiro subsegmento)*., e 0 (subsegmento variável)2_cr é 0 segmento de ARN com a sequência complementar à do (subsegmento va riável)2·

Noutro dos seus aspectos, 0 invento refere-se a um método no qual 0 (primeiro subsegmento)*. tem, pelo menos, 10 nucleótidos em comprimento e é de fórmula XIII:

3'-(primeiro subsegmento)(primeiro XIII subsegmento)^^-5', na qual o (primeiro subsegmento)^^em θ ou mais nucleótidos e, se mais de 0, é contíguo ao terminal 3' do (primeiro subsegmento)*..*

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-19e o (primeiro subsegmento)tem psl° menos 10 nucleótidos de com primento; em que o (terceiro subsegmento)^. é de fórmula XIV:

3'-(terceiro subsegmento) ^-( terceiro subsegmento) ' >

XIV na qual o (terceiro subsegmento) tem θ ^{ou ma}i-^s nucleótidos e, se mais de 0, é contíguo ao terminal 5’ do (terceiro subsegmento)^ e o (terceiro subsegmento)tem pelo menos 10 nucleótidos em comprimento; na qual o (3¹-subsegmento primário)^ tem a sequência complementar à de um subsegmento do segmento alvo o qual compreeri de todo o (primeiro subsegmento)^ θ θ ^ou mais nucleótidos do (pr_i meiro subsegmento)^.^; na qual (5 '-subsegmento primário^ é um subsegmento que compreende todo o (terceiro subsegmento)^ e 0 ou mais nucleótidos do (terceiro subsegmento)^; e na qual, após os passos (1) a (6) já referidos, o subsegmento de ARN de fórmula VII:

> ’ -1, prime iro subseç subsegmento)

VII na qual o (primeiro subsegmento)_tlcr é o segmento de ARN com a s.e quência complementar à do (primeiro subsegmento)^.^ e o (terceiro subsegmento) tlcr é o segmento de ARN com a sequência complementar à do (terceiro subsegmento)^^, um método que compreende:

é adicionalmente amplificado por (7) hibridação do referido primeiro produto de ARN de fó.r mula VI com um terceiro primário, que é um ADN de cadeia simples que inclui um subsegmento do terminal 3' de fórmula VIII:

5'-(promotor)^-(subsegmento variável)^-(3¹-subsegmento primário) ^-3 ’

VIII na qual o (promotor)} é um segmento de ADN de cadeia simples com a sequência da cadeia mais dum promotor especifico da ARN polimerase dependente de ADN de bacteriófago, sendo a referida sequência do (promotor)} igual ou diferente à do (promotor^, 0 (subsegmento variável)^ é um segmento de ADN de cadeia simples com 0 a 100 nucleótidos que é contíguo ao nucleótido do terminal 3' do (promo.

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-20tor).j e ao nucleótido do terminal 5’ do (3'-subsegmento primário)^ e o (3'-subsegmento primário)^ é um segmento de ADN de cadeia sim pies que tem a mesma sequência que o (terceiro subsegmento)^ e é contíguo ao nucleótido do terminal 3' do (promotor)-j se o (subsegmento variável)^ tem 0 nucleótidos;

(8) extensão do referido terceiro primário hibridado de acordo com o passo (7) numa reacção catalisada por uma terceira ADN polimerase, que é uma transcriptase inversa e ó igual ou dife rente das referidas primeira e segunda ADN polimerases, para originar um terceiro segmento de ADN complementar que inclui um subsegmento do terminal 3' de fórmula IX:

5'-(pro mo tor)-j-(subseg mento variável)(terceiro subsegmento)^.^(segundo subsegmento)^.-(primeiro subsegmento)^^-(primeiro subsegmento )^2~(^subsegmento variável )^-3'

IX na qual o (subsegmento variável)-^ é um ADN com a sequência complementar à do (subsegmento variável)^;

(9) trans formaçSo do duplex formado na reacção do passo (a) em cadeias simples;

(10) hibridação do terceiro ADN complementar produzido na reacção do passo (8) com um quarto primário de fórmula X:

5'-(subsegmento variável)^-(5'-subsegmento primário)_Zl-3'

X na qual o (subsegmento variável)^ é um segmento de 0 a 100 nucle_ó tidos e o (5'-subsegmento primária)^ é um subsegmento de sequência conhecida que á contíguo ao nucleótido de 3' do (subsegmento variável)^, se o (subsegmento variável)^ tem mais de 0 nucleótidos, e que inclui pelo menos 10 nucleótidos do segmento de fórmula XX:

5'-(subsegmento variável),-(primeiro subsegmento)-(primeiro 1 tz c ^r subsegmento)ti_c~3

XX na qual o (primeiro subsegmento)^_2c & ^um segmento de quência complementar à do (primeiro subsegmento)^e

ADN com a se o (primeiro

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-21subsegmento)é o segmento de ADN com a sequência complementar à do (primeiro subsegmento)^, com a condição de que pelo menos um dos referidos pelo menos 10 nucleótidos está em ou a 5’ do nucleótido do terminal 5' do (primeiro subsegmento) ;

(ll) extensão do referido quarto primário hibridado de acordo com o passo (10) numa reacção catalisada por uma quarta ADN polimerase, que é igual ou diferente das referidas primeira, segunda e terceira ADN polimerases, para originar um quarto ADN complementar que inclui um segmento de fórmula XI:

su bseg me nt o) tj__c-( segundo ^.^_c-(subsegmento variável) '-(primeiro subsegmento) subsegmento)^_c~(terceiro _3c-(promotor)_3c-3',

XI na qual o (segundo subsegmento)é o segmento de AON com a sequência complementar à do (segundo subsegmento)^., o (terceiro subsegmento) é o segmento de ADN com a sequência complementar à do (terceiro subsegmento)^, o (subsegmento variáuel)j_c é o segmento de ADN com a sequência complementar à do (segmento variável)^ e o (promotor) .j_c é o segmento de ADN com a sequência complementar à do (promotor)-j; e (12) utilização do produto de cadeia dupla do passo (ll) como molde numa reacção catalisada por uma segunda ARN polimerase dependente de ADN de bacteriófago, que é igual ou diferente da re ferida primeira ARN polimerase dependente de ADN de bacteriófago e que reconhece 0 promotor do qual uma cadeia é o (promotor)^, pa. ra produzir um segundo produto de ARN com um subsegmento do termi nal 5' de fórmula XII:

5'-(subsegmento variável) subsegmento)^-(primeiro vel). -3',

4cr j_r~(terceiro subsegmento)^-(segundo subsegmento)^.^_r~X^2“(subsegmento variáXII na qual o (subsegmento variável)-^ é o segmento de ARN com a sequência do (subsegmento variável)^, 0 (terceiro subsegmento)_tlr é o segmento de ARN com a sequência do (terceiro subsegmento) o (segundo subsegmento)ê 0 segmento de ARN com a sequência do (segundo subsegmento)_t, 0 (primeiro subsegmento)é o segmento de ARN com a sequência do (primeiro subsegmento)^, o (subsegmen67 879

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-22to uariável)^^ é o segmento de ARN com a sequência complementar à do (subsegmento variável)^, e & ⁰ segmento de ARN com a sequência complementar do subsegmento do (5'-subsegmento primário)^ que está a 5' do terminal 5' do (primeiro subsegmento)

Como notado anteriormente, o invento também fornece conjun tos para a realização dos métodos de amplificação do invento. No caso do método do invento que compreende a produção dum primeiro produto de ARN, um conjunto do invento conteria os dois primários, a correspondente ARN polimerase dependente de ADN de bacteriófago, e a ADN polimerase. Um conjunto para a realização do método de acordo com o invento que permite a produção de ambos um primeiro e um segundo produtos de ARN, conteria quatro primários adequados (dois conjuntos de dois) com as polimerases correspondentes neces. sárias.

Métodos e conjuntos de acordo com o invento para a realização de ensaios de hibridação de sonda de ácido nucleico que asse guram a amplificação de um segmento alvo de acordo com o invento, permite em adição aos passos e componentes, respectivamente, dos métodos e conjuntos para amplificação, passos e componentes neces sários para a detecção do produto de ARN resultante da amplificação de acordo com o invento. Os especialistas compreendem os vários passos e componentes adicionais, respectivamente, que são ne cessários para detectar ARN a partir dum processo de amplificação por qualquer dos numerosos métodos de ensaio de hibridação de son da de ácido nucleico conhecidos. Um método de ensaio de hibridação de sonda de ácido nucleico preferido, envolvendo a amplificação de ARN marcado e capturado por pérolas, é ilustrada no Exemplo II.

Prefere-se que o (3'-subsegmento primário)^, o (5'-subsegmento primário^, o (3'-subsegmento primário)^, e o (5'-subsegmento primário)^ tenham entre 20 e 40 nucleótidos, e mais preferivelmente cerca de 30 nucleótidos para melhorar a especificida^ de com que os vários primários se ligam às extremidades dos segmentos alvo que se pretendem amplificar.

z

E também preferido que o segmento alvo dum ácido nucleico de interesse, que é seleccionado para amplificação (em virtude da en 879

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-23selecção do (primeiro subsegmento)e do (terceiro subsegmento) serem seleccionados de maneira que o (segundo subsegmento) tem pelo menos 30, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 50, nucleótidos. Isto permite a utilização do (segundo subsegmento) ou do (segundo subsegmento)no produto de ARN amplificado como alvos para sondas de ácido nucleico que não possuirão sequências que se sobreponham bs de qualquer subsegmento primário.

Enquanto que a ARN polimerase dependente de ADN de bacteriáfago pode utilizar moldes com mais de 1000 pb, a sua eficiência de transcrição diminui à medida que o molde se torna mais com prido. Portanto, segmentos alvo com menos de 1000 pb de comprimento são preferidos.

E preferível utilizar um conjunto de primários idêntico ao usado na síntese de ARN, para num segundo ciclo de TAS produzir ARN. Como foi dito na secção que descreve a produção de ARN, o par primário não se deverá sobrepôr. Na realização do método do invento em que a produção de ARN ê desejada, é possível que o subsegmento do segmento alvo com a sequência complementar b do (5¹-subsegmento primário)^ esteja na direcção 5'- desde o e não se sobreponha ao, subsegmento do segmento alvo com a sequência complementar b do (3’-subsegmento primário)^. De modo similar, é preferido que o subsegmento do segmento alvo com a sequência igual à do (3'-subsegmento primário)^ esteja na direcção 3' desde o, e não se sobreponha ao, subsegmento do segmento alvo com a sequência igual à do (5'-subsegmento primário^· Esta estratégia pode ser preferida porque reduz a competição dos diferentes primários para os mesmos sítios e, portanto, pode melhorar significativamente a eficiência da amplificação de acordo com o invento. Onde existe alguma sobreposição entre conjuntos de primários afins é preferível remover qualquer primeiro conjunto de primários não usado, a_n tes de empregnar o segundo conjunto.

foco do presente invento está na ARN polimerase dependeri te de ADN de bacteriófago devido b sua alta especificidade para certos promotores. Outras polimerases que semelhantemente têm a_l ta especificidade para promotores particulares, podem ser utiliza das de acordo com o invento em lugar da polimerase de bacteriófago e entende-se que o invento abrange também essas outras polime67 879

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-24rases.

As ARN polimerases dependentes de ADN de bacteriófago pre feridas são as de T7, T3 e SP6. Os promotores preferidos para utilização com estas polimerases estão descritos nos exemplos e nas reivindicações, mas conhecem-se na especialidade e podem também ser empregues, numerosos outros promotores para estas polimerases .

Além disto, polimerases de bacteriófago que não as três preferidas e promotores reconhecidos por tais polimerases, podem ser utilizados de acordo com o invento.

Nos métodos do invento é preferida a utilização para ADN polimerase de transcriptases inversas e ADN polimerase sem actiz vidade de exonuclease de 5' para 3'. E preferível que uma única ADN polimerase seja utilizada em todos os passos do processo. As ADN polimerases preferidas são a transcriptase inversa de AMV e a transcriptase inversa de MMLV recombinante. Outras polimerases são, contudo, aceitáveis, tais como a ADN polimerase termo-estável de Thermus aquaticus (ver Chien e colab., 0. Bacteriol, 127,

1550 (1976)), ADN polimerase de T7 recombinante da marca SequenaTM se da U.S. Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio, E.U.A., e a bem conhecida ADN polimerase I do fragmento de Klenou/ de E. coli, e ADN polimerase c< de timo de vitelo.

Os subsegmentos variáveis que são facultativamente inclLi Idos nos vários primários servem três funções. De facto, eles p.o dem ser mais adequadamente denominados subsegmentos para fins múltiplos. Em primeiro lugar, para o primeiro e terceiro primários, os quais incluem os promotores, os subsegmentos dos promoto res incluem preferencialmente sequências de iniciação da transcri^ ção que são preferidas pela ARN polimerase correspondente ao promotor. Em segundo lugar, para todos os primários, um subsegmento variável pode facultativamente conter um segmento particular pelo qual o produto de ARN da amplificação pode ser detectado num ensaio de hibridação da sonda de ácido nucleico. De facto, amplifi cação (e ensaio) pode ocorrer simultaneamente para vários segmentos alvo diferentes com a utilização de conjuntos primários que diferem nos seus segmentos de reconhecimento (por ex., (3'-sub879

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-25segmento primário)^) mas que incluem um subsegmento variável comum. 0 subsegmento variável pode também conter uma sequência de poliligandos que convenientemente contém uma pluralidade de sítios de restrição para Facilitar a clonação subsequente. Finalmente os subsegmentos variáveis podem ser utilizados para incorporar no produto de ARN da amplificação sequências necessárias, para permitir que o produto de ARN seja (autocataliticamente) replicado por uma ARN polimerase dependente de ADN de bacteriófago, tais como a Q/T> replicase (ver Miele e colab. , acima) e sequências de BMV do cromossoma 3 de ARN do vírus da planta que promove a síntese de ARNm de revestimento. Ver Ahlquist e colab., 3. Mol. Biol. 172, 369 (19B4); Ahlquist e colab., Plant Mol. Biol. 3, (1984); Ahlquist e colab., 3. Mol. Biol. 153, 23 (l98l);

Miller e colab., Nature 313, 68 (1985); Miller e colab., Virology 125, 236 (1983); e Ou e colab., PNAS 79, 5235 (1982).

No caso da Q/S replicase, que ê conhecida na especialidade, é realizada preferivelmente pela inclusão, no (subsegmento v_a riável^» da sequência

5'-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3' e no (subsegmento variável)^ da sequência

5’-TGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3’, e depois replicação (autocataliticamente) do primeiro produto de ARN (isto é, ARN I na figura 1; ver também figura 4), ou inclusão no (subsegmento variável)^ da sequência

5’-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3' e no (subsegmento variável)^ da sequência ’-TGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3', e depois replicação (a_u tocataliticamente) do segundo produto de ARN (isto é, ARN II na figura 1; ver também figura 4).

No caso da utilização da replicase de BMV, também conhecida, é realizado de preferência pela inclusão da sequência seguinte para BMV na sequência variável 2 (bases 1-25) (no uso específi co do exemplo de HIV abaixo):

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-26Promotor de BMV TCS = 87-29 (HlV-específico)

ACAGCATATGTATGTTCAGGGA

AAGCTA-3' (53 bases), como uma sequência núcleo; adieionalmente sequência rica em AU a 5' pode ser utilizada para aumentar a actiuidade da replicase de BMV. Este oligo deve ser utilizado como segundo primário. 0 primeiro primário usado com este segundo primário é um primário HIV-especifico, baseado em T7.

Promotor T7 TCS = 87-34 +1S I I I

120 30 40 50 ι ,! ι , ι ι ι taatacgactcactata|GGGA|CACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG (52 bases).

Pormenores adicionais, não restritivos, para auxiliar à compreensão do invento são fornecidos nos exemplos seguintes:

4. Exemplos

EXEMPLO I ml de sangue dum paciente suspeito de estar infectado com um vírus de imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-l) é fraccioTM z nado com um aparelho Sepracell (Sepratech Corp., Dklahoma City, Ohlahoma, E.U.A.) ou, alternativamente, com um gradiente de Ficoll, para isolar os linfócitos. Os linfúcitos são em seguida lisados e o seu ácido nucleico é isolado com um aparelho extractor (Molecular Biosystems Inc., San Diego, Califórnia, E.U.A.) ou, alternativamente, os linfócitos são lisados por tratamento p.a drão com enzima-dodecil sulfata de sódio (SOS) e o ácido nucleico é isolado por cromatografia de fase inversa em celulose DEAE. Is. to ê feito como se segue:

Centrifugar as células: 5k rpm durante 4' a partir de 1 ml de so lução salina tamponada com Tris (TBS), pH 7,5.

Retirar o sobrenadante.

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-27Ressuspender a pelota em:

500yxl NaCl 0,3 M/Tris 20 mM, pH 7,5 100 yul SDS a 2%

00 yxl proteinase K a 5 mg/ml 200 ^1 0,25 M EDTA

Mexer bem e depois ad_i cionar à pelota.

Submeter a vortex vigorosamente e incubar a 50s durante 45', submetendo a vortex durante 10-15 segundos em cada 10'.

Carregar numa coluna de extractor drenada e permitir a entrada.

Lavar a coluna 1 vez 4 ml de NaCl 0,3 M/Tris 20 mM, pH 7,5.

Eluir ADN/ARN com 4 ml de NaCl 0,5 M/Tris 20 mM, pH 7,5.

Para eluir adicionar: 5 ^*1 de glicogênio

400 ^1 NaOAc 3 M

9,0 ml de EtOH gelado mexer bem

Precipitar a -20SC durante toda a noite. Pode ser utilizado um banho de gelo seco/etanol durante uma hora.

Centrifugar ADN/ARN durante 15' a 10 000 rpm num rotor de tina basculante? escoar o EtOH e secar num kimuiipe durante ~2'. Liofilizar durante 10'.

Ressuspender a pelota em 170^.1 de TE.

Incubar a 373C durante 5'.

Verter uma coluna de centrífuga de 1 ml como se segue:

Tapar uma seringa de 1 ml com uma pequena quantidade de 13 de vidro (esterilização em autoclave).

Encher a seringa com TE (Tris-EDTA) tratado com dietilpirocarbonato (DEPC).

Adicionar rapidamente Sephadex G-50 fino (em TE; esterilizado em autoclave).

Continuar a adicionar até que a matriz sólida ultrapasse o topo da seringa.

Centrifugar 30 segundos a 1000 rpm numa centrífuga de mesa IEC. Lavar com 100 ^1 de TE, centrifugar durante 1' a velocidade média (cerca de 1000 rpm). Rejeitar a lavagem.

879

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-28Carregar o extracto na coluna. Centrifugar novamente durante 1’.

Lavar com 150^ul de TE, centrifugar a -1000 rpm durante 1*. Ret_i rar a lavagem e a primeira fracção. Amostras para múltiplas reaç çães podem ser retiradas neste passo.

Adicionar ί/lO volume de LiCl 8 M. Misturar com 2,5 x vol. EtOH a 100%. Submeter a bom vortex. Precipitar com gelo seco/EtOH durante 30’.

Centrifugar durante 15’ à velocidade máxima numa microcentrifuga a 49C. Secar a pelota.

Após o isolamento, o ácido nucleico total· da amostra é dis solvido em 100 de tampão TE (Tris.Cl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8).

^ul dos 100 2*1 de ácido nucleico total são dissolvidos até um

volume final	de	100	^m.1 contendo:
Tris.Cl 40	mM,	pH	8
NaCl 25 mM
MgCl2 10 mM

ditiotreitol (DTT) 10 mM espermidina 2 mM lOO^g/ml de albumina de soro bovino

400 mM de cada de dATP, dCTP, dGTP ε TTP adiciona-se AON de cadeia simples com 101 bases 30 nM com a sequência 5 '-GAACGCGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC ACATACGATT TAGGTGACAC TATA GAATAC TTTCGTAACA CTAGGCAAAG GTGGCTTTAT C -3' pri mário A, Adiciona-se ADN com 29 bases 30 nM com a sequência 5’-ACACCATATG TATGTTTCAG GGAAAGCTA-3 · , primário B. 0 primário B, que é o segundo primário, tem a sequência de bases 5151-5179 no gene SOR do HIV-1. Um segmento alternativo para o segundo primário, correspondendo às bases 5357-5387 do gene SOR do HIV-1, tem a sequência 5 '-GCACACAAGT AGACCCTGAA CTAGCAGACC A-3’, e, se utili. zado, está também presente a 30 nM. 0 primário A é o primeiro primário; os seus 64 nucleótidos em 5’ formam a cadeia mais dum promotor para o ARN polimerase dependente de ADN de SP6. 0 seu segmento de sequência 5’-GAATAC-3' é o (subsegmento alternativo)^, que inclui o sitio de iniciação da transcrição (o 5'-G) e outras bases aparentemente favorecidas pela ARN polimerase de SP6 no te_r minai 5' das sequências por ela transcritas. Finalmente, os 31

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-29nucleótidos do terminal 3’ formam o (subsegmento primário)·^ e têm a sequência complementar à das bases 5577-5547 no gene SOR dum HIV-1 isolado (ver Ratner e colab., Nature 513, 277 (1985) p.a ra a sequência completa). (0 HIV isolado é referido nestes Exemplos como HIV-1).

De notar que todos os oligonucleótidos empregues nestes· exemplos são feitos por síntese de fase sólida num sintetizador automático (Modelo η². 380A) de Applied Biosystems, Inc. (Foster City, Califórnia, E.U.A.) e são purificados por cromatografia essencialmente atê à homogeneidade por HPCL utilizando uma coluna de fase inversa C8. Alternativamente outros sintetizadores disponíveis comercial mente e procedimentos de purificação padrão podem ser usados para preparar os oligonucleótidos.

Os 100 ^ul de solução são aquecidos a 65²C durante 2 minutos e em seguida arrefecidos até 42SC num 1 minuto. Este aquecimento, seguido da manutenção a 429C ou mais, em combinação com a composição da solução, proporciona condições de rigor suficientes para determinar a hibridação do (3'-subsegmento primário)·^, com suficiente estabilidade para preparar a síntese de ADN, de alta especificidade à sequência complementar à do (3'-subsegmento primário)^.

Em seguida, 10 unidades da transcriptase inversa do vírus da mioblastose de aves (AMV) ou 500 unidades da transcriptase inversa do vírus da leucémia murina de Moloney do recombinante (MMLV), tal como adquirido a Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida, E.U.A., são adicionadas à solução e esta é incubada durante 10 minutos a 422C. (Uma unidade incorpora 1 nmole de TTP numa forma precipitável pelo ácido em 10 minutos a 3720 utilizando poli(A).oligo(T)^₂_^g como molde-primário tal como definido por Houts e colab., 0. Virol. 29, 517 (1979)). Após a incubação de 10 minutos, a solução é colocada em banho de água a ferver durante 1 minuto. Este aquecimento provoca separação das cadeias do duplex formado pela transcriptase inversa.

Em seguida, a solução é arrefecida até 4220 em 1 minuto. Durante este arrefecimento, o segundo primário hibrida com o segmento do terminal 3’ do complemento do segmento alvo formado na

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-30reacção catalisada pela transcriptase inversa. Novamente, as cori dições de hibridação são suficientemente rigorosas para originar hibridação suficientemente específica entre o segundo primário e a sequência complementar à do segundo primário.

Após o arrefecimento adiciona-se mais 10 unidades transcriptase inversa de A MV ou mais 500 unidades de transcriptase inversa de MMLV clonado e realiza-se nova incubação a 42QC durante 10 minutos.

Fm seguida adiciona-se inibidor de ribonuclease da marca

P

RNasin da Promega Biotec, Madison, Wisconsin, E.U.A., é adicionado (facultativamente) até uma concentração de 1 unidade por ml. (l unidade é a quantidade de inibidor necessária para inibir em 50% a actividade de 5 ng de ribonuclease A. Roth, Meth. Câncer Res. 3, 151 (1976)). Posteriormente, cada um dos ribonucleósidos 5 ’ - tri f os f atos , ATP, GTP, CTP e UTP, é adicionado até 400 mM, Fi^ nalmente entre 10 e 20 unidades de ARN polimerase dependente de ADN SP6, adquirida à Promega Biotec, são adicionados e a solução resultante é incubada a 42QC durante 30 a 60 minutos. (l unidade é a quantidade de ARN polimerase necessária para catalisar a incorporação de 1 nmole de ribonucleósido trifosfato num produto i_n solúvel em ácido, em 60 minutos a 37QC sob condições padrão de reacção Tris.Cl 40 mM, pH 7,9, MgC^ 6 mM, DTT 10 mM, espermidina 2 mM, de cada um dos ATP, GTP, CTP e UTP, 0,5 mM de cada, 0,5 Ci de ^H-CTP, 1 g de ADN SP6 e a enzima, num volume total de 50^nl).

Em seguida cada um dos seguintes oligonucleótidos é adicio nado para levar a sua concentração a 30 nM:

terceiro primário:

'-GAACGCGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC ACATACGATT

TAGGTGACAC TATA GAATAC ACTAATTCAT CTGTATTACT TTGACTGTTT

TTC-3’ quarto primário:

5'-TTTTTTGGTG TTATTAATGC TGCTAGTGCC-3'

No terceiro primário, tal como no primeiro, as 64 bases do terminal 5' são o segmento promotor e as 6 bases seguintes são o segmento variável. 0 segmento variável consiste nas primeiras 6

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-31bases transcritas a partir do promotor pela ARN polimerase de SP6, e estas bases são seleccionadas para aumentar o nível de tal transcrição. Finalmente, a porção do (3'-subsegmento primário)^ do terceiro primário consiste nas 33 bases do terminal 3', na me£ ma sequência das bases 5388-5420 do gene da estrutura, de leitura aberta pequena (SOR) do HIV-1. 0 quarto primário tem a sequência complementar à das bases 5546-5517 do gene SOR do HIV-1.

Após adição dos terceiro e quarto primários, a solução é incubada a 4220 durante 1 minuto. Durante este período, ocorre a hibridação entre o (3'-subsegmento primário)^ do terceiro primário e o primeiro ARN formado na reacção catalisada pela ARN polimerase de SP6. Devido ao rigor das condiçães de hibridação, o (3'-subsegmento primário)^ hibrida, com estabilidade suficiente para preparar a sintese de ADN, com alta estabilidade ao segmento de sequência complementar, no primeiro ARN.

Após incubação, 10 unidades de transcriptase inversa de AMV ou 500 unidades de transcriptase inversa de MMLV clonado são adicionadas e a solução é incubada a 422C durante 10 minutos para originar o terceiro ADN complementar.

A solução é, em seguida, suspensa num banho de água a ferver durante um minuto e arrefecida atê 422C durante 1 minuto para, primeiro, transformar em cadeias simples o duplex entre o terceiro ADN complementar e o primeiro ARN e, em segundo, permitir a hi. bridação entre o quarto primário e o terceiro ADN complementar.

Tal como com as outras hibridaçães, as condiçães são suficientemente rigorosas para que ocorra com estabilidade suficiente para preparar a síntese de ADN, a hibridação do quarto primário, com alta especificidade do segmento do terceiro ADN complementar de sequência complementar à do quarto primário.

Em seguida, novamente, 10 unidades de transcriptase inversa de AMU ou 500 unidades de transcriptase inversa de MMLV clonado são adicionadas e a solução é incubada durante 10 minutos a 422C.

R

Depois inibidor de ribonuclease da marca RNasin é adicionado (facultativamente) para uma concentração até 1 unidade por ml, seguido por 10-20 unidades de ARN polimerase de SP6, e a solu

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-32ção é incubada a 422C durante 30 minutos a 1 hora.

segundo ARN resultante pode ser detectado por uma técnica de hibridação de sonda de ácido nucleico.

EXEMPLO II

Segue-se o procedimento do Exemplo I, com uma modificação anotada abaixo, com três amostras: (A) uma de 10 ml de sangue humano, que se sabe ser isento de HIU; (B) uma de 10 ml de cultura que se sabe ter cerca de 10^ de células infectadas com HIU-1, por ml; e (C) uma de 10 ml de sangue de uma pessoa suspeita de estar infectada com HI1/-1. A modificação do procedimento é que 32 um ribonucleósido trifosfato marcado com of- P é incluído como substrato na reacção catalisada pela ARN polimerase de SP6 para originar o segundo ARN. 0 segundo ARN está, consequentemente, marcado com ^^P.

TM

Pérolas macroporosas de Sephacryl-S500 são derivadas com um ligante terminado por grupo-carboxilo (de fórmula -C(=NH)NH(Ch^^CC^-) e depois com oligonucleótido derivado de 5’-(6-amino-hexil fosforamidato) de sequência 5'-TGGTCTGCTA GTTCAGGGTC TACTTGTGTG C-3' que ê a sequência complementar à das bases 5357-5387 do gene SOR do HIU-1. (A sequência de bases 4901-4932 do gene SOR ocorre em qualquer segundo ARN produzido durante a ampli ficação do ácido nucleico a partir de uma amostra). A preparação das pérolas foi feita de acordo com procedimentos descritos no Pedido de Patente dos Estados Unidos, n2. de série 895 756, depositado em 11 de Agosto de 1986, e vulgarmente transmitido e aqui incorporado como referência. Resumidamente, os materiais de suporte são vidro de silicato poroso ou dextrano reticulado macropo roso, derivado com um ligante terminado por amino com substancia^ mente todos os grupos, que não estão ligados covalentemente através dum grupo fosforamidato ao nucleósido terminal da sonda de captura, sendo bloqueados por interacção não específica com o ác_i do nucleico tendo um grupo acilo alifático; dextrano reticulado macroporoso activado com brometo de cianogéneo, o qual reage com aminas, para se ligar a oligonucleótidos derivados de aminoalquil fosforamidato; e vidro de silicato poroso, dextrano reticulado macroporoso e polistireno reticulado com divinilbenzeno com um

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-33ligante terminado por carboxilo ou terminado por ester-succinirni do, com uma fracção dos grupos carboxil ligadas numa ligação ami da a um grupo amino de um diaminoalcano, do qual o outro amino faz parte dum fosforamidato que, por sua vez, está ligado directa mente ao nucleósido terminal da sonda de captura. Materiais de suporte preferidos são vidro poroso controlado derivado de alquil. amina de cadeia longa e derivado de carboxilo tal como vendido por Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, E.U.A., sob os números de produto 24875 e 23735, respectivamente, sob a forma de pérolas com diâmetro nominal de poros de 500 Angstroms e diâmetro das partículas entre 125 e 177 micra e Sephacryl S500 vendido por Pharmacia Inc., Piscataiuay, Neui Oersey, E.U.A., sob o número de código 17-0475-01, sob a forma de pérolas com um diâmetro em molhado de cerca de 40 a cerca de 105 micra e um volume de exclusão para dextranos de peso molecular superior a cerca de 2 x 10 daltons, sendo o referido Sephacryl derivado com brometo de cianogéneo ou com um ligante terminado por amino ou terminado por carboxilo. Num aspecto, o suporte sólido é um de:

(A) vidro de silicato poroso derivado em silicones com (1) grupos de fórmula

-(CH₂)_n(NH)(C0)(CH₂)_cCH₃ e

-(CH₂)_n(NH)(P0₂)0-(0ligo), com substancial mente nenhum silicone derivado com um grupo terminado com um grupo amino, em que c é 0 a 5, né2a8, -0-(01igo) ê a sonda oligonucleótida, e o átomo de oxigénio ligado ao (Oligo) ê a sonda oligonucleótida, e o átomo de oxigénio ligado ao (Oligo) é o oxigénio de 5’ do nucleósido de 5' ou o oxigénio de 3’ do nucleósido de 3’ da sonda, ou (2) grupos de fórmula

-(CH₂)_n(NH)(C0)(CH₂)_mC0₂H e

-(CH₂)_n(NH)(C0)(CH₂)_m(C0)(NH)(CH₂)_pNH(P0₂)0-(Oligo) em que m, n e p são iguais ou diferentes e é cada um 2 a 8; ou (B) um material macroporoso de dextrano reticulado derivado nos oxigénios dos hidroxilos, que se encontram nos carbonos dos grupos açúcar que têm pelo menos um carbono vizinho com um

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-34hidroxilo não derivado, com (1) grupos de Fórmula

-C(=NH)NH(CH₂) (NH)(CO)(CH₂)_cCH₃ e

-C(=NH)NH(CH₂)_p(NH)(P0₂)0-(01igo), com substancial mente nenhum oxigénio hidroxil derivado com um grjj po terminado com um grupo amino, ou (2) grupos de fórmula

-C(=NH)NH(CH₂)_qC0₂K e

-C(=NH)NH(CH ) (CO)(NH)(CH₂)NH(P0„)0-(01igo), z q ζ p z em que c, q e p s2to iguais ou diferentes e q é 2 a 10; e (C) polistereno reticulado com divinilbenzenD derivado nos grupos fenil com grupos de fórmula

-(CH₂)_sC0₂H e

-(CH₂)_s(C0)(NH)(CH₂)_pNH(P0₂)0-(0ligo), em que s e p são iguais ou diferentes e s ê 2 a 10. 1/er Ghosh e colab., Nucleic Acids Research 15, 5353 (1987).

Cada um dos três lotes de 50 mg de pérolas de Sephacryl, derivados como descrito acima, ê embebido durante 15 minutos a 37SC em 250 ^ul de uma solução de pré-hibridação contendo 0,1% de SDS, 10% de sulfato' de dextrano, 1 mg/ml de ADN de esperma de sa_l mão, e 5 x SSPE (NaCl 0,75 M, NaH^O^ 50 mM, pH 7,4 e EDTA 5 mM). Após embebição, o material em pérolas é pelotizado por centrífuga ção e a solução de pré-hibridação é removida por aspiração.

ácido nucleico do procedimento de amplificação em cada uma das três amostras é isolado por precipitação em etanol e é, em seguida, dissolvido até 250 em solução que é igual à solução de pré-hibridação mas sem o ADN de esperma de salmão. Cada uma das soluçães de ácido nucleico resultantes é em seguida combi nada com um lote de pérolas de Sephacryl derivadas com oligonucleó^ tido pré-hibridado e a mistura resultante é incubada com agitação suave a 429C durante 90 minutos.

As pérolas de Sephacryl são depois pelotizadas por centrifugação, a solução de hibridação é removida por aspiração, e as pérolas são em seguida lavadas três vezes, 10 minutos de cada vez

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-35a 378C, com 1 ml de uma solução de 2 x SSC (NaCl 0,30 M, Na.Citra to 0,03 M, pH 7,0). Após cada lavagem as pérolas são pelotizadas por centrifugação e a solução é removida por aspiração.

Imediatamente após a terceira lavagem, as pérolas são submetidas a contagem de Cerenkov.

As pérolas com ácido nucleico amplificado da amostra A pro duzem um baixo nível de contagem, muito pouco acima da contagem de fundo a partir apenas do fluido de cintilação. As pérolas com ácido nucleico amplificado de amostra B produzem uma contagem num nível muito mais elevado que o observado com as pérolas associadas à amostra A. As pérolas com ácido nucleico amplificado da amostra C, se produzem num nível de contagem significativamente superior ao nível produzido pelas pérolas associadas com a amostra A, ind_i cam que a pessoa, cujo sangue foi colhido para a amostra C, está infectada com HIU-1.

EXEMPLO III

Os procedimentos dos Exemplos I e II são realizados com ARN polimerase de T7 (Promega Biotec) em vez da ARN polimerase de SP6, com cada um do subsegmento 5'-(promotor)^-(subsegmento variá vel)^-3' do primeiro primário e do subsegmento 5'-(promotor)^-(subsegmento variável)^-3' do terceiro primário, tendo a sequência 5'-TAATACGACT CACTATA GGGA-3', em que as 17 bases do terminal 5’ são o subsegmento promotor e as 4 bases do terminal 3' são o subsegmento variável. 0 segmento variável corresponde às 4 bases do terminal 5' do transcrito a partir do promotor. 0 inibidor da ribonuclease não é utilizado em nenhum passo deste processo, pelo menos com o preparado de polimerase da Promega Biotec.

EXEMPLO IU

Os procedimentos dos Exemplos I e II são realizados com ARN polimerase de T3 (de Stratagene, San Diego, Califórnia) em vez da ARN polimerase de SP6 e com o seguinte segmento sendo usado como subsegmento do primeiro primário, (promotor)^-(subsegmento variável)^ e subsegmento do terceiro primário (promotor)(sub segmento variável)^: 5'-TATTAACCCT CACTAAA GGGA-3', em que as 17 bases do terminal 5' são o segmento promotor e as 4 bases do ter67 879

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-36minal 3' são o segmento variável, incluindo o terminal 5' 4 bases em transcritos a partir do promotor.

EXEMPLO V

Utilizando a ARN polimerase T7 tal como no Exemplo III, o segmento alvo no genoma de HIV obtido a partir de amostras de sari gue humano, é amplificado utilizando os seguintes primários em vez dos primários especificados no Exemplo I.

Primeiro primário: 5'-TAATACGACT CACTATA GGGA TCTAATTACT ACCTCTTCTT CTGCTAGACT-3 ' , em que as 30 bases do terminal 3' sSo complementares em sequência às bases 7076-7047 no gene ENV do HIV-1.

Segundo primário: 5'-ACAAGTTGTA ACACCTCAGT CATTACA CAG-3' com a sequência das bases 6838-6866 no gene ENV do HIV-1.

Terceiro primário: mesmas 21 bases do terminal 5' que o primeiro primário deste exemplo associadas às 27 bases do terminal 3' seguintes: 5'-AAAGGTATCC TTTGAGCCAA TTCCCATA-3', que têm a sequência das bases 6875-6902 no gene ENV do HIV-1.

Quarto primário: 5'-AGTTGATACTACTGGCCTAATT-3', com a sequência complementar à das bases 7033-7007 no gene ENV do HIV-1.

EXEMPLO VI

Utilizando ARN polimerase de T7 tal como no Exemplo III, o segmento alvo no genoma de HIV obtido a partir de amostras de sangue humano é amplificado utilizando os seguintes primários em vez dos primários especificados no Exemplo I:

Primeiro primário: os mesmos 21 nucleótidos do terminal 5’ que os do primeiro e terceiro primário do Exemplo V associados com os 31 nucleótidos do terminal 3' seguintes: 5'-CACCTAGGGC TAACTATGTG TCCTAATAAG G-3’, que têm a sequência complementar à das bases 5471-5441 no gene SOR de HIV-1.

Segundo primário: 5 '-ACACCATATG TATGTTTCAG GGAAAGCTA-3', que tem a mesma sequência que as bases 5151-5179 do gene SOR de HIV-1.

Terceiro primário: os mesmos 21 nucleótidos do terminal 5 que os primeiro e terceiro primários do Exemplo V associados aos

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-3731 nucleótidos do terminal 3', seguintes:

5'-AAGAATAAGTTCAGAAGTACACATCCCACT-3', que têm a mesma sequência que as bases 5220-5249 do gene SOR de HIU.

Quarto primário: 5’-TGGTCTGCTAGTTCAGGGTCTACTTGTGTC-3', que têm a sequência complementar à das bases 5387-5357 do gene SOR de HIV-1.

EXEMPLO VII procedimento do Exemplo I é seguido para o isolamento de ácido nucleico a partir de: (l) uma amostra contendo 10⁵ células CEM infectadas por HIU misturadas com 10^ células CEM não infectadas (Câncer Center Research Foundation; CCRF-CEM; ATCC NQ. CCL 119) ; e (2) uma amostra contendo 10^ células CEM não infectadas. Estas amostras são resuspensas em 100 ^ul de Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM (TE) apôs o passo de precipitação pelo etanol para concentrar a amostra obtida a partir da coluna de ExT M tractor (MBI). As amostras resuspensas são fraccionadas numa coluna fina de centrífuga Sephadex G-50 (Maniatis, referido acima), eluindo com TE. As amostras eluídas são concentradas por precipitação pelo etanol (em LiCl 0,8 M, 3 volumes de etanol, em banho de gelo seco/etanol durante 15 minutos). A amostra precipitada é pelotizada por centrifugação. A pelota é drenada, seca e depois ressuspensa em 100^1 de uma solução contendo Tris-HCl 40 mM, pH 8,1, MgC^ 8 mM, NaCl 25 mM, espermidina 2 mM, ditiotreitol 5 mM, dATP, dGTP, dCTP e dTTP, 100 ^mM de cada, rATP, rCTP. rGTP e rUTP, 1 mM de cada, lOO^xg/ml de BSA (livre de nuclease) e primário A de oligonucleótido de ADN (5•-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTCCTAATAAGG-3) e primário B (5'-ACACCATATGTATGTTTCAGGGGAAAGCTA-3'), 250 nM de cada.

Como controlos, ressuspenderam-se amostras duplicadas de ARN de HIU purificado na concentração de 0,01-fm em IOO^hI do tampão descrito acima. Finalmente, uma sequência de /3-globina de 10-fm, contida no plasmídeo Ηβ19Α /~^{Wallace e} colab., Nucl. Açjds. Res, £, 3647 (l98l)_7, que foi linearizado por Hind III, é ressus pensa em 100 yxl do tampão acima descrito, excepto sem os primários oligonucleótidos. Primário D oligonucleótidos (5’-ACATTGCTT£>? 879

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-38CTGACACAACTGTGTTCA-3¹) e primário C (5 '-TAATACGACTCACTATAGGGACAAAGGACTCAAA-3·), que são específicos para a sequência da /J-globina, foram adicionados à reacção da ^-globina a 250 nM cada.

Excepto para a amostra de /i-globina, as reacçães são aque cidas até 659C durante 1'. A amostra de /S-globina é fervida durante 1'. Todas as amostras são arrefecidas até 42SC durante 1 minuto; em seguida são adicionadas 10 unidades de transcriptase inversa de AMV. As reacçães são incubadas a 42SC durante 15 minjj tos, fervidas durante 1 minuto, e depois arrefecidas a 429C duraji te 1 minuto. São adicionadas mais 10 unidades de transcriptase inversa de AMV, incubando a 429C durante 15 minutos. Cem unidades de ARN polimerase de T7 são adicionadas às reacçães e estas são incubadas a 379C durante 30 minutos.

As amostras são fervidas durante 1 minuto e arrefecidas a 42SC durante 1 minuto, seguido pela adição de 10 unidades de transcriptase inversa de AMV. As reacçães são incubadas a 4290 durante 15 minutos, fervidas durante 1 minuto e arrefecidas a 4290 durante 1 minuto. Mais dez unidades de transcriptase inversa são adicionadas, seguidas por incubação a 4290 durante 15 minu tos. Cem unidades de ARN polimerase de T7 são adicionadas, com uma incubação de 30 minutos a 379C. Este ciclo é repetido mais duas vezes.

TM alvo amplificado ê então detectado usando OligoBeads tal como descrito a seguir.

Pérolas de Sephacryl contendo oligonucleótidos específicos de HIV-1 foram preparadas tal como descrito e armazenadas em TE a 49C numa concentração tal que 250^1 da suspensão contêm 50 mg de pérolas de Sephacryl. Os oligonucleótidos foram sintetizados e purificados por HPLC, tal como descrito.

Os oligonucleótidos empregues tanto para ligação às pérolas como para detecção são homólogos da região SOR do genoma do HIV-1. 0s oligonucleótidos utilizados nestes estudos foram 86-31 (oligonucleótidos de detecção) (5'-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3’) e 87-83 (oligonucleótidos de captura na pérola:

5'-ATGCTAGATTGGTAATAACAACATATT-3') , que são homólogos da cadeia sem sentido da região SOR e separados por aproximadamente 100

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-39nucleótidos. Para detecção, os oligonucleótidos foram marcados 32 na extremidade com P de acordo com o protocolo padrão. 0 marcador não incorporado foi removido por filtração de gel numa coluna fina de Sephadex G-50, e o oligonucleótido foi armazenado a -205C.

Numa experiência típica com sistema de hibridação interealada baseado em pérolas (BBSHS), o alvo e o oligonucleótido de d_e 32 tecção marcado com P são desnaturados em 10de TE contendo 0,2% de SDS a 65SC durante 5 minutos num tubo de Eppendorf. A is to, são adicionados 10 ^wl de 2X Solução mista de Hibridação (lOX SSPE/lO% de Sulfato de dextrano). A solução é misturada, centrifugada durante 2 segundos e incubada a 42SC durante 1 hora.

Durante este tempo as pérolas de Sephacryl são pré-hibridadas. A suspensão concentrada de pérolas é bem misturada e 250 ^ul de alíquotas (50 mg de pérolas) são transferidas para tubos de Eppendorf, agitando entre cada remoção para assegurar uma suspensão uniforme. As alíquotas são centrifugadas durante 10 segundos e o TE é removido com uma pipeta de secagem Pasteur. Em seguida, 250de Solução de Hibridação (5X SSPE NaCl 0,9M, NaH2P0^ 50 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM_7 10% de sulfato de dextrano/θ,1% de SDS) é adicionada, as pérolas são suspensas por agitação suave e incubadas a 37SC durante 30-60 minutos com agitação ocasional. Imediatamente antes do passo de captura, as pérolas são centrifugadas durante 10 segundos, a solução de pré-hibridação ê removida, são adicionados 8 0^1 de Solução de Hibridação a 37SC e as pérolas são levadas de novo a 372C.

A solução de hibridação é centrifugada durante 2 segundos e transferida para as pérolas e solução de Hibridação. As pérolas são suspensas e incubadas a 372C durante 1 hora com agitação frequente para manter a suspensão.

Após a captura, as pérolas são centrifugadas durante 10 s_e gundos e a Solução de Hibridação, contendo alvo não capturado e oligonucleótido de detecção, é transferida para um frasco contador de cintilação. As pérolas são depois lavadas 5 vezes com 2X SSC a 37SC. As primeiras 3 lavagens são rápidas; 1 ml de líquido de lavagem é adicionado, as pérolas são bem agitadas e centri67 879

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-40fugadas durante 10 segundos, e o liquido de lavagem é transferido para o frasco de contagem. Para as 2 lavagens finais, 1 ml de liquido de lavagem é adicionado e as pérolas são agitadas e incubadas a 37QC durante 5 minutos antes de serem centrifugadas. Cada lavagem é contada separadamente para monitorizar o procedimento.

Contagens de Cerenkov da Solução de Hibridação, as 5 lavagens e as pérolas são medidas durante 5-10 minutos. A contagem do fundo é subtraída de todas as amostras. 0 fm detectado do alvo é calculado do seguinte modo:

(CPM nas pérolas/CPM total) X fm do Oligonucleótido em que CPM total é a soma do CPM para a Solução de Hibridação, 5 lavagens e pérolas.

DETECÇftO DOS ALVOS AMPLIFICADOS POR BBSHS (io”i5_moi_es)

Alvo	usados 0,33	detectadas (FM) 0,06
105 células	infectadas com HIV
106 células	CEM não infectadas	0,66	0,13
106 células	CEM não infectadas	0,07	0,01
		0,14	0,015
		0,7	0,01
		10	0,008
0,01 fm ARN	de HIV	0,007	0,14
		0,014	0,29
10 fm ADN de	/L-globina	10	0,014

EXEMPLO VIII procedimento do Exemplo I é seguida para o isolamento dos ácidos nucleicos de duas amostras: a) 10^ células CEM, infectadas com HIV com 10^ células CEM não infectadas; e b) 10^ células CEM de cultura não infectadas, às quais 0,01 fmoles de HIV purificado foi adicionado após extracção. 0 procedimento é então modificado pela purificação posterior através de uma coluna de centrífuga Sephadex G-50 (fina) (Maniatis acima referida) eluIndo com TE, após o passo de coluna de Extractor. Isto é seguido

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-41por uma precipitação por etanol do ácido nucleico (LiCl 0,8 M e EtOH a 2,5 volumes). 0 ácido nucleico é então ressuspenso em 100 yvd contendo:

Tris-HCl 40 mM, pH 8,1

MgCl₂ 8 mM

NaCl 25 mM espermidina 2 mM

DTT (ditiotreitol) 5 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP, IOOjaM (de cada) rATP, rCTP, rGTP, rLITP, 1 mM

100 ^wg/ml de BSA (livre de nuclease) oligonucleótido de ADN com 29 pb 250 nM com a sequência ·-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3' (primário B) oligonucleótido de ADN de 56 pb 250 nM com a sequência '-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAA

TAAGG-3' (primário A)

0s 100 da solução são aquecidos até 65SC durante 1 minu to e arrefecidos a 42SC em 1 minuto. Este aquecimento e manutenção a 42SC ou mais, em combinação com a composição da solução, fornece condiçães de rigor suficiente para hibridação do (3'-subsegmento primário)^ (ver figura l) com estabilidade suficiente pa, ra a sequência complementar à do (3’-subsegmento primário)^, no ARN de HIV alvo com alta especificidade.

Em seguida, 10 unidades de transcriptase inversa de vírus de mioblastose de aves (AMV) (Life Sciences, Inc.) são adicionadas à solução, e esta é incubada durante 10 minutos a 429C. /^-Uma unidade incorpora 1 nmole de TTP para uma forma precipitável em ácido em 10 minutos a 3720, usando poli(A)-oligo (T) 12-18 como molde primário, tal como definido por Houts e colab., 3. Virol. 29, 517 (l979)_/· Após uma incubação de 10 minutos, a solução é colocada em banho de água a ferver durante um minuto. Este aquecimento origina separação das cadeias do duplex formado pela transcriptase inversa e inactivação da transcriptase inversa.

Depois, a solução é arrefecida a 429C em 1 minuto. Durante este arrefecimento, o segundo primário, primário B, hibrida com a extremidade do terminal 3' do (terceiro subsegmento),₉ V c

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-42(uer Figura l) do complemento alvo da cadeia de ADN formada na reacção catalisada pela transcriptase inversa no passo anterior. Novamente, as condições de hibridação são suficientemente rigorj) sas para a hibridação específica entre o segundo primário e a sequência complementar à do segundo primário.

Após arrefecimento, 10 unidades adicionais de transcriptase inversa de AMV são adicionadas e posterior incubação ó realiz£ da durante 10 minutos a 42SC.

Cem unidades de polimerase de T7 são adicionadas à reacção. A reacção é então incubada a 372C durante 30 minutos. E sintetizado um transcrito de ARN que ê complementar ao ARN de HIV alvo original iniciando-se a partir do promotor T7 presente na extremi dade 5' do molde de ADN duplex recentemente sintetizado pela trans criptase inversa. 0 transcrito tem a sequência 5’-GGGA, continuando-se depois com a sequência que é complementar da do segundo subsegmento da sequência alvo (isto é, (segundo subsegmento)^_crj ver figura l). Dado que a transcriptase inversa não foi inactiva^ da antes deste passo, e dado que o primário 8 está presente, assim como o desoxinucleótido trifosfato, uma síntese secundária ocorre neste ponto. 0 primário B hibrida com a região 3' do trans crito de ARN recentemente sintetizado (terceiro subsegmento)^_2cr (ver figura l), que é complementar ao primário Β. A transcriptase inversa (que foi adicionada no passo anterior) sintetiza uma cadeia de ADN utilizando o transcrito de ARN recentemente sinteti zado (feito pela polimerase de T7) como um molde e usando o oligjo nucleótido B como o primário na extremidade 5’.

A reacção é, em seguida, fervida durante 1 minuto para de.s naturar o duplex ARN:ADN. A reacção é então arrefecida a 422C em 1 minuto. Durante este passo de arrefecimento, o segmento com plementar do alvo do primário A hibrida com a cadeia de ADN sinte tizada durante o passo anterior. Ao mesmo tempo, o primário B hi brida com a sua sequência complementar no transcrito de ARN sinte tizado no passo anterior.

Após arrefecimento, 10 unidades adicionais de transcriptase inversa de AMV são adicionadas, e é realizada nova incubação a 422C durante 10 minutos. A transcriptase inversa sintetiza ADN

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-43complementar do alvo de HIV utilizando o oligonucleótido A como um primário na extremidade 5' e o ADN produzido no passo anterior como um molde. Uma segunda cadeia de ADN é sintetizada utilizando o oligonucleótido B como um primário e o transcrito de ARN pro duzido no passo anterior como um molde.

A reacção é fervida durante 1 minuto para desnaturar o duplex de ADN e o duplex ARN:ADN. A reacção é arrefecida a 423 num minuto. 0 primário A hibrida com o ADNc produzido no passo anterior utilizando o transcrito de ARN como molde. (Se a extremidade 3' da cadeia molde também é utilizada como um primário da trans. criptase inversa, é produzido um produto idêntico ao produto final da próxima reacção). 0 primário B hibrida com a cadeia de ADN que é complementar ao ARN de HIV alvo. Esta segunda síntese produz um produto que é um ADN duplex contendo uma sequência do promotor de T7 na sua extremidade 5', assim como um segmentovariável de 4 pb, 5’-GGGA-3’.

Cem unidades de polimerase de T7 são adicionadas à reacção. A reacção é incubada a 37QC durante 30 minutos. A ARN polimerase de T7 utiliza o ADN duplex de cadeia dupla incluindo um promotor de T7 duplex como um molde para transcrever um ARN que é complementar ao segundo subsegmento alvo contendo a sequência adicional 5'-GGGA-3' na sua extremidade 5'.

Este ciclo (ferver 1’, 1' a 42SC, TR 10’ a 42QC, TR 10’ a 42QC, Polimerase de T7 30' a 37QC) pode ser repetido tantas vezes quantas as necessárias para atingir a amplificação desejada da S£ quência alvo. 0 produto resultante pode ser detectado por uma técnica de hibridação com sonda de ácido nucleico.

EXEMPLO IX

ARN de HIV purificado numa concentração de 1 fmole foi resuspenso em:

Tris-HCl 40 mM, pH 8,1 MgCl₂ 8 mM NaCl 25 mM espermidina 2 mM ditiotreitol 5 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP, IOO^mM (de cada)

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-44rATP, rCTP, rGTP, rUTP, 1 mM de cada 100^g/ml de BSA (liure de nuclease) oligonucleótido de ADN com 29 pb, 250 nM, com a sequência

5'-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3' (primário B) oligonucleótido de ADN com 56 pb 250 nM com a sequência '-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTA ATAAGG-3’ (primário A)

Os 100 y^l de solução são aquecidos até 65SC durante 1 minu, to e arrefecidos a 429C em 1 minuto. Este passo de aquecimento e arrefecimento, em associação com a composição da solução, forne ce condiçães de rigor suficiente para a hibridação do primário A com suficiente estabilidade com a sequência complementar à da região do primário A no ARN de HIV alvo / (primeiro subsegmento)_t2, na figura 1_7, com alta especificidade.

Em seguida, 10 unidades de transcriptase inversa de vírus de mioblastose de aves (AMV) (Life Science, Inc.) são adicionadas à solução, e esta é incubada durante 10 minutos a 42QC. Após uma incubação de 10 minutos, a solução é colocada em banho de água a ferver durante 1 minuto. Este aquecimento provoca a separação das cadeias do duplex formado pela transcriptase inversa e inacti. vação da transcriptase inversa.

A solução ê arrefecida a 429C num minuto. Durante o arrefecimento, o segundo primário B hibrida com a extremidade 3’ da recentemente sintetizada cadeia alvo complementar /~ou (terceiro subsegmento) _t2c, na figura 1_/· Novamente, as condiçães de hibri. dação são suficientemente rigorosas para a hibridação específica entre o segundo primário e a sequência complementar à do segundo primário.

Após arrefecimento, mais 10 unidades de transcriptase inver. sa de AMV são adicionadas e nova incubação é realizada durante 10 minutos a 42SC.

Cem unidades de ARN polimerase de T7 (Nem England Biolabs) são adicionadas à reacção. A reacção é então incubada a 37QC durante 30 minutos. E sintetizado um transcrito de ARN que é complementar ao ARN de HIV alvo original iniciando-se a partir do promotor de T7 presente na extremidade 5* do molde de ADN duplex

67,879

File Ν°. 47104

-45sintetizado pela transcriptase inversa. 0 transcrito de ARN tem a sequência 5'-GGGA, continuando-se depois com a sequência que é complementar à do segundo subsegmento da sequência alvo (isto é, (segundo subsegmento) ^._cr, figura l). Dado que a transcriptase inversa não foi inactivada antes deste passo, e dado que o primário B está presente assim como o desoxinucleótido trifosfatos, ocorre uma sintese secundária neste passo. 0 primário B hibrida com a região 3’ do transcrito de ARN recentemente sintetizado /~(terceiro subsegmento)^2cr’ ^ver fi9^ura 1—7 9^ue & complementar ao primário Β. A transcriptase inversa (que foi adicionada no passo anterior) sintetiza uma cadeia de ADN utilizando o transcri. to de ARN recentemente sintetizado (feito pela ARN polimerase de T7) como um molde, e o oligonucleótido B como um primário na extremidade 5'.

A reacção é em seguida fervida durante um minuto para desnaturar o duplex ARN:ADN. A reacção é depois arrefecida a 42QC num minuto. Durante este passo de arrefecimento o segmento complementar do alvo, do primário A, hibrida com a cadeia de ADN siri tetizada no passo anterior. Simultaneamente o primário B hibrida com a sua sequência complementar no transcrito de ARN sintetizado no passo anterior.

Após arrefecimento, são adicionadas 10 unidades de transcriptase inversa de AMV, e é realizada nova incubação a 42QC durante 10 minutos. A transcriptase inversa sintetiza ADN complementar ao do alvo de HIV utilizando o oligonucleótido A como um primário na extremidade 5' e o ADN produzido no passo anterior c_o mo um molde. A extremidade 3' da cadeia de molde ê usada como um primário para produzir um ADN duplex final com um promotor de T7 de cadeia dupla na sua extremidade 5'. Uma segunda cadeia de ADN é sintetizada utilizando o oligonucleótido B como primário e o transcrito de ARN produzido no passo anterior como um molde.

Cem unidades de polimerase T7 são adicionadas à reacção. A reacção é incubada a 37QC durante 30 minutos. A ARN polimerase de T7 sintetiza um transcrito de ARN utilizando o ADN duplex que contém o sítio de ligação da polimerase (promotor T7) na extremidade 5’ como um molde. 0 transcrito de ARN é complementar ao segundo subsegmento alvo (ver figura l) contendo a sequência adicio

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-46nal 5'-GGGA-3' na sua extremidade 5*. Mais ciclos podem ser efe£ tuados para aumentar a amplificação. Os produtos resultantes podem ser detectados por um protocolo de hibridação de ácido nu cl ei. co.

EXEMPLO X

Protocolo para última volta de marcação do Produto Amplificado por TAS:

A. Coluna para remoção de nucleótidos frios não incorporados.

1. A reacção de TAS (lOO^n.1) é tomada após a síntese do ADNc no ciclo final do TAS. Adicionar 400^1 do Reagente A (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,7, trietilamina 10 mM, EDTA dissódico 1 mM) à reacção.

TM

2. Equilibrar uma coluna pré-carregada de NENSORE^g (Dupont) molhando o material da coluna com metanol a 100% (grau HPLC), e depois equilibrando com 2 ml de reagente A.

3. Carregar a amostra na coluna.

4. Lavar a coluna 3 vezes com 1 ml de reagente A.

5. Lavar a coluna 3 vezes com 1 ml de água.

6. Eluir os ácidos nucleicos com metanol a 50%, e colectar fracçães de 250-300^1 até um volume total de 1 ml (as primei ras duas fracçães conterão a maioria do ácido nucleico).

7. Secar as fracçães no speed-vac ou no liofilizador.

B. Protocolo para marcar o Produto Amplificado

T M

1. Resuspender as fracçães da coluna de NENS0RB₂q (as duas primeiras fracçães podem ser combinadas) em Tris-HCl 40 mM, pH 8,1, MgCl₂ 8 mM, NaCl 25 mM, espermidina-( HCl)^ 2 mM, ditiotrei. tol 5 mM, rATP, rCTP e rGTP 400ynM de cada, rUTP 12^μΜ e 25 y-iCi a -³²P-rUTP (800 Ci/mmol).

2. Adicionar 50 unidades de ARN polimerase de T7 (Nem England Biolabs) por cada 50da amostra. Incubar a 379C dura_n te 30 minutos.

3. 0 marcador não incorporado pode ser removido por uma coluna de centrífuga G-50 (Maniatis acima referido).

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-474. A amostra marcada pode ser processada num gel de poliacrilamida sequenciador a fim de determinar o tamanho do produto amplificado. 0 produto marcado pode também ser detectado utiliTM zando Oligo-Beads .

EXEMPLO XI

Utilização de um Padrão Interno durante a Amplificação por TAS

Foram preparadas amostras contendo: l) 0,1 fm de ARN de HIV e 0,1 fm de sequências de ADN de /J-globina (H/119A clivado com Pstl); 2) 0,01 fm de ARN de HIV e 0,1 fm de ADN de /2-globina (H^19A clivado com Pstl); 3) 0,1 fm de ARN de HIV; ou 4) 0,1 fm de ADN de β-globina (H/319A clivado com Pstl em 100^,1 contendo Tris-HCl 40 mM, pH 8,1, MgC^ 8 mM, NaCl 25 mM, espermidina-(HCl)^ 2 mM, ditiotreitol 5 mM, dATP, dTTP, dCTP e dGTP, lOO^wl de cada, rATP, rUTP, rCTP e rGTP 1 mM de cada, 100^ug/ml de BSA (livre de nuclease), e primário A 250 nM (5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG-3'), de primário B 250 nM (5'-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3'), primário C 250 _nM (5’-TAATACGACTCACTATAGGGAACTAAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCC-3'), primário D 250 nM (5'-ACATTGCTTCTGACACAACTGTGTTCA-3'). Uma amostra contendo um vigésimo dos ácidos nucleicos de partida foi colocada numa solução de desnaturação de 7,4% de formaldeído, lOx SSC (NaCl 1,5 M, citrato de sódio 0,15 M, pH 7,4) para as amostras no ponto zero do tempo.

As amostras foram fervidas durante 1 minuto e arrefecidas a 425C durante 1 minuto, sendo depois adicionadas 10 unidades de transcriptase inversa de AMV. As reacções são incubadas a 4220 durante 15 minutos, fervida durante 1 minuto, e arrefecidas a 4220 durante 1 minuto. Mais 10 unidades de transcriptase inversa de AMV são adicionadas, seguidas pela incubação a 4290 durante 15 mi nutos. Cem unidades de ARN polimerase de T7 são adicionadas, seguidas pela incubação a 3720 durante 30 minutos. Este ciclo é re petido uma segunda vez. (Mais ciclos podem ser efectuados, deperi dendo da amplificação exigida). Duas amostras contendo um vigés_i mo dos ácidos nucleicos alvo de partida foram colocadas numa sol]j ção de desnaturação para as amostras de transcrição do segundo ponto do tempo.

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-48Todas as amostras foram aquecidas até 55SC durante 30 minutos antes da filtração por duas membranas de nitrocelulose. Os ácidos nucleicos foram fixados à membrana por irradiação com luz UV a 254 nm durante 4 minutos. Como controlos, desturaram-se, 1, 0,1 e 0,01 fm do plasmídeo pARV7/2 Luciu/ e colab., Nature 312, 760 (1984)_7, o qual contém o ADNc do genoma de HIV completo bem como o plasmídeo H/319A Wallace e colab., Nucl. Acids Res. 9,

3647 (1981/7, em NaOH 0,2 N, neutralizados com igual volume acetato de amónio 2 M, e depois filtrados por uma membrana de nitrocelulose. Uma membrana foi hibridada com oligonucleótido 86-31^^ 32 marcado com P, que é específico para o produto de HIV amplifica ( 2*7 do. A outra membrana foi hibridada com oligonucleótido 87-459 32 marcado com P, que hibridará com o produto de /3-globina amplificado assim como ao plasmídeo de β-globina alvo.

As hibridaçães foram efectuadas em SDS a 1%, NaCl 0,9 M,

NaH^PO. 50 nM (pH 7,4), CDTA 5 mM (pH 7,4), e 10^ cpm/m de oligoz 4 32 nucleótido marcado com P durante uma hora a 5590. As membranas foram lavadas 3 vezes à temperatura ambiente em SDS a 1%, NaCl 0,18 M, NaH₂P0^ 10 mM (pH 7,4), e EDTA 1 mM, seguidas por uma lavagem no mesmo tampão a 559C.

As membranas foram então autorradiografadas durante 16 horas num filme KODAK XAR a -70SC com um écran de intensificação. Notas:

1. 86-31 : 5 ’-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3'

2. 87-459: 5 ’-AGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACT-3' autorradiograma na figura 3 mostra a quantidade de sequências de HIV e ^“Çllobina detectada após dois ciclos de TAS realizados simultaneamente em ácido nucleico de HIV e de ^2-globina.

A quantidade de partida de ^j-globina manteve-se constante enquari to a quantidade de alvo de HIV foi variada.

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-49Embora o invento tenha sido descrito com alguma especifj. cidade na presente descrição, pessoas com experiência comum nas técnicas pertinentes admitirão variações e modificações ao invento tal como descrito, as quais estão no espirito do invento. Tais variações e modificações estão também dentro do âmbito do invento tal como descrito e reivindicado aqui.

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Claims (5)

-53 REIVINDICAÇÕES

1 - Processo de preparação de um ácido nucleico de cadeia dupla, contendo uma sequência correspondente a uma sequência al_ vo, operacional mente ligada a um promotor caracterizado por com preender

- proporcionar um primeiro primário de ácido nucleico contendo uma sequência promotora ligada a uma sequência correspondente a um segmento da sequência alvo;

- hibridar, sob condições adequadas, o referido primeiro primário de ácido nucleico com a sequência alvo, numa amostra contendo ácido nucleico,

- prolongar o referido primeiro primário de ácido nuclei. co, hibridado numa reacção de extensão com polimerase, complementarmente à sequência alvo, para formar um ácido nucleico duplo, correspondente,

- separar as cadeias do referido ácido nucleico duplo,

- hibridar com um promotor separado, contendo a cadeia de sequência, sob condições adequadas, um segunda segmento primário de ácido nucleico, na extremidade oposta de cadeia conteri do a sequência promotora,

- prolongar o referido segundo primário de ácido nucleico, numa reacção de extensão com polimerase, complementarmente à re ferida cadeia contendo a sequência promotora.

(2) a extensão do referido primeiro primário, hibridado de acordo com o passo (l), numa reacção catalisada por uma primeira ADN polimerase originando um primeiro segmento complementar de ADN, que compreende urr, subsegmento de férmula III:

5'-(promotor)^-(subsegmento variáuel)(prime iro subsegmento) -(segundo subsegmento)(terceiro subs egmento) *.^-3 ' tc' (III) tc na qual o (primeiro subs egmento) ê o segmento de ADN com a s_e quência complementar ã do (primeiro subsegmento)5 o (segundo subs egmento) é o segmento de ADN com a sequência complementar à do (segundo subsegmento)^.; e 0 (terceiro subsegmento) _t é 0 segmento de ADN com a sequência complementar à do (terceiro subs egmento) ^, a condição de que se 0 segmento alvo á um segmeri to de ARN, a referida primeira ADN polimerase á uma transcripta. se inversa;

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File NQ. 47 104

2 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri. zado por se repetir o processo pelo menos uma vez.

3'-(5’-subsegmento primário)₂~(subsegmento variável)₂~5' (IV) na qual o (5 '-subsegmento primário)₂ tem a sequência dum subsegmeri to do (terceiro subsegmento)que termina com o nucleótido do terminal 5' do (terceiro subsegmento) e na qual o (subsegmeri to variável)₂ é um segmento com 0 a 100 nucleótidos que é contí guo ao terminal 5' do (5'-subsegmento primário)₂;

(5) a extensão do referido segundo segmento primário, hibridado de acordo com o passo (4), numa reacção catalisada por uma segunda ADN polimerase originando um segundo segmento complementar de ADN, que compreende um subsegmento de fórmula V:

5 subsegmento variável)₂-(terceiro subs egme nto) ^.-(segundo sub segmento)^-(Pri me iro subsegmento)(subsegmento vsriável)^^-(promotor)-3' (7) na qual o (subsegmento variável)^ é o segmento de ADN com a S£ quência complementar à do (subsegmento variável)^; e o (promotor ) 1 é o segmento de ADN com a sequência complementar ã do (promotor)^, com a condição de que a referida segunda ADN polimerase seja igual ou diferente da referida primeira ADN polimerase; e (6) a util ização do produto de cadeia dupla do passo (5) como molde numa reacção catalisada por uma primeira ARN-polimerase dependente de ADN de bacteriófago, que reconhece 0 pr£ motor do qual uma cadeia é 0 (promotor)^, para produzir um primeiro produto de ARN de fórmula VI:

(3) a transformação em cadeias simples do duplex formado na reacção do passo (2);

3'-(primeiro subsegmento)^-(segundo subsegmento)^-(terceiro sub s egmento) ^.-5 ’ (I) na qual (primeiro subsegmento)^. é um segmento de ácido nucleico de sequência conhecida com, pelo menos, 10 nucleótidos, contíguo ao terminal 3' do (seoundo subsegmento)^; o (sequndo subsegmento)^. é um segmento de ácido nucleico com 0 ou mais nucleó tidos; e o (terceiro subsegmento)^. é um segmento de ácido nucleico, de sequência conhecida com, pelo menos, 10 nucleótidos contíguo ao terminal 5' do (segundo subsegmento)^., caracteriza67 879

File Ν°. 47 104 do por compreender:

(l) a hibridação de um (primeiro subsegmento)_t do referido segmento aluo com um primeiro primário, que ê um ADN de c_s deia simples que compreende um subsegmento do terminal 3' de fármula II:

5'-(promotor)₁-(subsegmento variávei )^-(3'-subsegmento primário) 3 ' (II) na qual o (promotor)^ é um segmento de ADN de cadeia simples com a sequência da cadeia mais dum promotor especifico da ARN polimerase dependente de ADN do bacteriáfago, (subsegmento vari& uei)i é um segmento de ADN de cadeia simples com 0 a 100 nuclejá tidos, contíguo ao nucleátido do terminal 3' dc (promotor)-^ e ao nucleátido do terminal 5' do (3'-subsegmento primário)^; e o (3'-subsegmento primário)^ é um segmento de ADN de cadeia sim pies com, pelo menos, 10 nucleátidos com uma sequência que á complementar da sequência dum subsegmento do (primeiro subsegmeni to) t que termina com o nucleátido do terminal 3' do (primeiro subsegmento)> sendo o referido (promotor)^ contíguo ao terminal 5' do referido (3'-subsegmento primário)^, se o dito (subsegmento variável)^ tiver 0 nucleátidos;

3 - Método para a detecção de, pelo menos, uma sequência alvo específica de ácido nucleico, numa amostra contendo ácido nucleico, caracterizado por compreender o emprego de ácido nuclei co de cadeia dupla de acordo com a reivindicação 1 como molde de ácido nucleico de cadeia dupla para a preparação duma pluralida^ de de transcritos de ARN, cada um comportando uma sequência de ARN correspondente à referida sequência alvo, e detecção da presença da referida sequência de ARN.

(4) a hibridação do (terceiro subgmento)^_c do referido primeiro ADN complementar de fórmula III com um segundo primário que ê um ADN de cadeia simples com, pelo menos, 10 nucleóti dos, de fórmula IV:

4 - Método de preparação dum ácido nucleico de cadeia

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File N9 . 47 104 dupla contendo a sequência correspondente à sequência alvo operacionalmente ligada a um promotor, caracterizado por compreender proporcionar um primeiro primária de ácido nucleico contendo a sequência do promotor operacionalmente ligada a uma sequê_n cia complementar dum segmento da sequência alvo, e um segundo primário de ácido nucleico tendo uma sequência idêntica a um segmento de uma sequência alvo, correspondendo os referidos pri. mários a regiões diferentes da referida sequência alvo mas não se sobrepondo, ou não se sobrepondo substancialmente, na sua correspondência ao alvo, e sendo seleccionados de modo que um produto da extensão de um deles, quando separado do seu complemento, possa servir como molde para um produto da extensão do outro, o contacto de uma amostra contendo ácido nucleico incluindo a sequência alvo com os referidos primários sob condições de hibridação sequêncial e de separação das cadeias a fim de produzir, por sua vez, os produtos da extensão dos referidos primários.

5 - Método para a preparação duma pluralidade de transcritos de ARN, caracterizado por se utilizar ácido nucleico de cadeia dupla, de acordo com as reivindicações 1 ou 4, como molde numa reacção catalisada por uma polimerase que reconhece o promotor, e detecção da presença dos referidos transcritos de ARN.

6 - Método de acorda com as reivindicações 3 ou 5, carac terizado por os referidos transcritos conterem um sítio de reco nhecimento da replicase para replicação dos ditos transcritos por indução da replicase.

7 - Método de acordo com as reivindicações 3, 5 ou 6, cq racterizado por a sequência de ARN dos referidos transcritos de ARN detectada ser medida duma forma padronizada de modo a deter; minar a quantidade de sequência alvo contida numa amostra de ácido nucleico utilizada na preparação do molde de ácido nuclej. co de cadeia dupla.

8 - Método de'acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a sequência de ARN dos referidos transcritos de ARN detectada ser medida duma forma padronizada e internamente com a

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File N9. 47 104 presença de um número conhecido de cópias de ácido nucleico tam bém contidas na referida amostra.

9 - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a dita sequência alvo estar disposta numa sequência de ácido nucleico associada às características duma doença ou situação genética ou patogánica.

10 - Método de acordo com a reivindicação 9, caracteriza. do por a referida sequência de ácido nucleico ser um segmento de um vírus de imunodeficiência humana.

11 - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a referida sequência de ácido nucleico ser um segmento dum gene defeituoso.

12 - Método de acordo com a reivindicação 5, caracteriza. do por o promotor ser um promotor do bacteriófago T7 e os trans. critos de ARN serem produzidos utilizando ARN polimerase de T7.

13 - Método de acordo com a reivindicação 5, curacteriza do por o promotor ser um promotor de SP6 e os transcritcs de ARN serem produzidos utilizando ARN polimerase de SP6.

14 - Método de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado por a reacção de extensão ser catalisada pela ADN polimerase I da E. coli.

15 - Mêtcdo de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado por a reacção de extensão ser catalisada pelo fragmento Klenow da ADN polimerase I da E. coli.

16 - Método de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado por a reacção de extensão ser cataiisada pela ADN polimerase de T4.

17 - Método de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado por a reacção de extensão ser catalisada pela trans. criptase inversa.

18 - Método de acordo com as reivindicações 3 ou 5, caracterizado por os referidos transcritos de ARN serem marcados antes de detecção.

Método de acordo com a reivindicação 18, caracteriza

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File N°. 47 104 do por os referidos transcritos de ARN serem radio-marcados.

20 - Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por os referidos transcritos de ARN serem marcados com cro móforo.

21 - Conjunto para a detecção de, pelo menos, uma sequêjg cia alvo específica de ácido nucleico numa amostra contendo áci. do nucleico, caracterizado por incluir um primeiro primário de ácido nucleico contendo uma sequência do promotor operacionalmente ligada a uma sequência complementar dum segmento de uma sequência alvo e um segundo primário de ácido nucleico tendo uma sequência idêntica a um segmento de uma sequência alvo correspondendo os referidos primários a regiões diferentes da refe rida sequência alvo, mas não se sobrepondo ou não se sobrepondo substancialmente, na sua correspondência ao alvo, e sendo seleç. cionados de modo que um produto da extensão de um deles, quando separado do seu complemento, possa servir como molde para um produto da extensão do outro, e meios para hibridação do dito primeiro primário com a referida sequência alvo, extensão da ca deia do primário hibridado, separação das cadeias do duplex resultante, hibridação do promotor contendo a cadeia separada do dito segundo primário de ácido nucleico, extensão da cadeia do primário hibridado, levando o ácido nucleico de cadeia dupla assim preparado, contendo uma sequência do promotor, a produzir transcritos e detecção dos referidos transcritos.

22 - Processo para amplificar um segmento de ácido nucle. do alvo de fórmula I:

5’-(subsegmento variável)(primeiro subsegmento)-(segundo subs egmento) _r-(terceiro subs egme nt 0) - (subs egmento variá^vel^2cr“³' (VI)