PT99177B - Processo para a deteccao especifica de acidos nucleicos - Google Patents

Processo para a deteccao especifica de acidos nucleicos Download PDF

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Description

presente pedido refere-se a um processo para a detecção específica de um ácido nucleico ou de uma sua fracção.
A detecção de ácidos nucleicos em diagnósticos clínicos e em biologia molecular tem ultimamente ganho muita importância em relação aos testes imunológicos clássicos. Isto está ligado ao progresso que tem sido feito em relação à investigação da sequência de nucleótidos de ácidos nucleicos de diferente origem.
Dado que as informações contidas na sequência de nucleótidos são muito discriminantes, os diagnósticos de ácido nucleico podem ser utilizados de forma particularmente vantajosa de forma a distinguir as mais pequenas características. Isto é por exemplo importante quando se ensaiam os produtos para a detecção de mutações e diferenças em sequências produzidas artificialmente. A sensibilidade dos ensaios de ácidos nucleicos tem aumentado consideravelmente através da introdução de processos de amplif icação.
Esse processo é descrito por exemplo no documento EP-A-0 200 362. O efeito de amplificação é principalmente baseado no facto de que partindo de um assim designado ácido nucleico alvo como molde e utilizando um primário e trifosfatos de mononucleótidos, é formado um produto de alongamento do primário que é detectado ou pode ser ele próprio utilizado como ácido nucleico molde. Neste processo pode também ser incorporado um nucleótido detectável do produto de alongamento. O produto de alongamento formado pode ser detectável de forma electroforética.
Este processo de detecção é, contudo, desvantajoso dado que a fase de electroforese é complicada e consome muito tempo.
O produto de alongamento não marcado pode também ser detectado de acordo com o documento EP-A- 201 184 por hibridização com uma sonda de ácido nucleico
- 2 marcada de
forma a ser detectada. Contudo, devido às interacções não específicas a separação do híbrido formado a partir do produto de alongamento e sonda da sonda não reagida utilizando o processo descrito neste pedido é também ineficaz ou envolve muitas fases de lavagem que reduzem a sensibilidade.
É proposto um processo no documento WO 89/11546 em que os ácidos nucleicos ampliados ligados a uma fase sólida são feitos reagir com um primário e mononucleótidos marcados em que os ácidos nucleicos marcados que são formados neste processo podem ser detectados. Este processo tem a desvantagem de todas as reacções essenciais ocorrerem em fase sólida o que resultam uma redução da velocidade da reacção. Este processo é também proposto no documento EP-A-0 324 474 em que são incorporados mononucleótidos marcados e estes ácidos nucleicos marcados são capturados por ácidos nucleicos imobilizados que são complementares ao ácido nucleico que se pretende detectar. Não é nada afirmado àcerca do processo utilizado para desnaturar os ácidos nucleicos amplificados e sobre as condições de hibridização. Uma outra desvantagem deste processo é que a produção de ácidos nucleicos que são eficazmente ligados a uma fase sólida é complicada.
É descrito um processo no documento EP-A-0 3570 011 em que são utilizados dois primários na reacção de alongamento em que um deles é marcado com detecção e outro é adequado para se ligar a uma fase sólida. Este processo tem a desvantagem de ser mais difícil separar os oligonucleótidos marcados com detecção dos produtos de alongamento contendo estes oligonucleótidos. Se não for efectuada uma separação deve esperar-se uma sensibilidade reduzida devido às reacções de competição.
É descrito um processo nos documentos EP-À-0 297 379 e EP-A-0 348 529 em que é alongado um primário imobilizado ou imobilizãvel com um mononucleótido detectável com o auxílio do ãcido nucleico alvo como molde para formar um imobilizado e ao mesmo tempo um ácido nucleico marcado com detecção. Este processo tem a desvantagem entre outras de a especificidade do ensaio não ser muito elevada. 0 processo gue também é descrito no documento EP-A-0 297 379 em que apenas é utilizado um primário imobilizado ou imobilizãvel, e em seguida se faz reagir o produto de alongamento com um oligonucleótido marcado tem a desvantagem descrita no documento EP-A-0 357 011 dado que o oligonucleótido é difícil de isolar.
É descrito um processo no documento WO 89/09281 em que os dois primários têm o mesmo grupo químico que é utilizado, por um lado, para a imobilização e por outro lado para a detecção. Isto aumenta a desvantagem descrita acima de um fraco poder de separação.
É também descrito um processo em Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 86, pág. 6230-6234 em que é alongado um primário marcado com detecção. A detecção é efectuada após se ligar o produto de alongamento a uma sonda de captura. Também neste caso a separação do primário marcado com detecção não é possível sem fases adicionais e o processo interfere com a reacção de detecção.
Constitui assim o objecto da presente invenção evitar as desvantagens dos processos da técnica anterior e em particular proporcionar um processo para a detecção de ácidos nucleicos que combina uma elevada especificidade ou selectividade com um baixo sinal de fundo.
A invenção refere-se a um processo para a detecção específica de um ácido nucleico numa amostra que compreende as seguintes fases:
a) fazer-se reagir a amostra com um ou mais trifosfatos de mononucleósido marcados e uma ou mais enzimas que catalisam a produção de um ácido nucleico marcado B que contém este nucleótido,
b) fazer-se reagir a amostra com uma sonda de ácido nucleico C que é suficientemente complementar do ácido nucleico B,
c) detectar-se o híbrido de ácido nucleico D formado a partir do ácido nucleico marcado B e sonda de ácido nucleico C,
d) em que a sonda de ácido nucleico C contém pelo menos um grupo imobilizável,
e) a mistura reaccional é submetida a uma desnaturação não térmica após a fase a),
f) o híbrido de ácido nucleico D é levado ao contacto com uma fase sólida que pode ligar especificamente a sonda de ácido nucleico C imobilizável,
g) a fase líquida é separada da fase sólida e
h) o grupo detectável ligado ao sólido é detectado.
O processo de acordo com a presente invenção é uma forma especial de efectuar o assim designado ensaio de hibridização que é conhecido na generalidade pelo especialista no campo dos diagnósticos de ácidos nucleicos. Dado que não são apresentados nesta descrição os pormenores experimentais o leitor é referido para mais pormenores para Hibridisação do ácido nucleico, editores B.D. Hames e S.J. Higgins, IRL Press, 1986, nos capítulos 1 (Hybridisation Strategy), 3 (Quantitative Analysis of
Solution Hibridisation) (Quantitative Fílter
Hybridisation), Current Protocols in Molecular Biology, Edt. F.M. Ausubel e col., J. Wiley and Son, 1987, 2.9.1 2.9.10 e Molecular Cloning, Edt. J. Sambrook e col., CSH, 1989, 9.4.7 - 9.5.8. Estas referências incluem em particular os processos conhecidos para a produção de trifosfatos de nucleósido marcados que são também descritos no documento EP-A-0 329 474, a síntese química de oligonucleótidos modificados e não modificados, clivagem de ácidos nucleicos por meio de enzimas de restrição, selecção de condições de hibridização em que se pode conseguir a especificidade que depende do grau da homologia entre os ácidos nucleicos que se pretendem hibridizar, o seu teor em GC e o seu comprimento, bem como a formação de ácidos nucleicos de trifosfatos de nucleósidos utilizando polimerases, e se desejado com a utilização dos designados primários.
Uma marcação dentro do conceito da presente invenção consiste num grupo L detectável directamente ou indirectamente. Os grupos directamente detectáveis são por exemplo grupos radioactivos (32p), grupos coloridos ou grupos fluorescentes ou átomos metálicos. Os grupos indirectamente detectáveis são por exemplo compostos imunologicamente ou enzimaticamente activos como por exemplo anticorpos, antigénios, haptenos ou enzimas ou enzimas parciais enzimaticamente activas. Estes compostos são detectáveis numa reacção posterior ou numa sequência de reacções posteriores. Os haptenos são particularmente preferidos dado que os trifosfatos de nucleósidos marcados que são em geral substratos particularmente bons de polimerases podem ser utilizados com eles e pode ser facilmente efectuada uma reacção posterior com um anticorpo marcado contra o hapteno ou o nucleósido haptenizado. Estes trifosfatos de nucleósidos são por exemplo os trifosfatos de bromo-nucleósidos ou trifosfatos de nucleósidos acoplados a digoxigenina-, digoxina- ou fluorescina. Os esteróides mencionados no documento EP-A-0 324 474 a sua detecção provaram ser particularmente adequados. A este respeito é feita referência ao documento EP-A-0 324 474 para sua incorporação nos ácidos nucleicos.
Os trifosfatos de nucleósidos (NTP) são ribo (rNTP) ou desoxiribonucleótidos (dNTP).
E considerado um ácido nucleico alvo um ácido
nucleico que é o alvo de detecção e material de partida para o processo de acordo com a presente invenção.
Um ácido nucleico molde A é um ácido nucleico ao qual uma banda de ácido nucleico que é substancialmente complementar é de novo formada. Em relação à informação da sequência, o ácido nucleico molde serve como molde e contem a informação da sequência que é transcrita na reacção a) para o ácido nucleico B. O ácido nucleico A é o ácido nucleico alvo ou é um seu derivado de ácido nucleico. Ele pode por exemplo ser uma parte do ácido nucleico alvo ou conter uma parte do ácido nucleico alvo afastada de outras partes tal como o ácido nucleico altamente complexo. Ele pode também conter uma parte da banda complementar ao ácido nucleico alvo.
A desnaturação significa a separação das bandas duplas de ácido nucleico em bandas simples. Existem várias variantes para serem escolhidas pelo especialista.
Considera-se uma detecção específica um processo em gue, se desejado, se podem detectar certos ácido nucleicos mesmo na presença de outros ácidos nucleicos. É, contudo, também possível detectar vários ácidos nucleicos ou um grupo de ácidos nucleicos com uma sequência de nucleótidos parcialmente idêntica ou semelhante ou várias secções de um ácido nucleico na presença de outros ácidos nucleicos. Pode ser utilizada qualquer das duas bandas complementares para detectar os ácidos nucleicos de dupla banda.
Um ácido nucleico ou sequência de ácidos nucleicos essencialmente complementar é considerada como ácidos nucleicos ou sequências que se podem hibridizar com o ácido nucleico correspondente cuja sequência de nucleótidos é exactamente complementar ao outro ácido nucleico na região de hibridização ou que difere apenas em algumas bases do ácido nucleico exactamente complementar. A este respeito a especificidade depende do grau de complementaridade bem como das condições de hibridização.
As fases liquidas são as fases aquosas normalmente utilizadas em ensaios de ácidos nucleicos com constituintes orgânicos ou inorgânicos dissolvidos por exemplo tampão de hibridização, nucleótidos em excesso, outros ácidos nucleicos que não devem ser detectados, proteínas, etc.
processo de acordo com a presente invenção serve para detectar um ácido nucleico. A este respeito são considerados ácidos nucleicos de qualquer origem, por exemplo ácidos nucleicos de origem viróide, virai, bacteriana ou celular. Eles podem estar presentes em solução, suspensão, e mesmo imobilizados em sólidos ou estarem presentes em meios contendo células, em manchas de células, células fixadas, pedaços de tecido ou em organismos fixados. Os ácidos nucleicos estão de preferência presentes em solução. A sequência de reacção é geralmente iniciada partindo do ácido nucleico que se pretende examinar com reagentes adequados. A este respeito
as alterações no valor de pH (alcalino), calor, repetição de alterações extremas na temperatura (congelação/descongelação), alteração das condições de crescimento fisiológico (pressão osmótica), a acção de detergentes, sais caotrópicos ou enzimas (por exemplo proteases, lipases) isoladamente ou em combinação podem contribuir para libertar os ácidos nucleicos. Dado que o processo de acordo com a presente invenção é muito sensível e selectivo, mesmo pequenas quantidades de ácido nucleico podem ser detectadas na presença de outros materiais como por exemplo proteínas, células, fragmentos de células ou mesmo ácidos nucleicos que não devam ser detectados. Isto evita assim uma purificação das amostras se puder ser assegurado que os ácidos nucleicos a serem detectados são suficientemente acessíveis aos reagentes utilizados.
Os ácidos nucleicos podem também ser prétratados. Os pré-tratamentos conhecidos incluem em particular a fragmentação, por exemplo por meio de enzimas de restrição, ou síntese de cADN a partir de ARN. De modo a usar totalmente as vantagens do processo de acordo com a presente invenção provou-se ser adequado que o ácido nucleico tenha um tamanho de pelo menos 40 pb.
Além disto o ácido nucleico e de preferência o produto de uma ampliação especifica ou não específica anterior de ácido nucleico. Estes processos de ampliação de ácido nucleico são conhecidos por exemplo de
EP-A-0 201 184, EP-A-0 272 098, DE-A-37 26 934,
EP-A-0 237 362, WO 88/10315, WO 90/01069, WO 87/06270, EP-A-0 300 796, EP-A-0 310 229, WO 89/09835,
EP-A-0 370 694, EP-A-0 356 021, EP-A-0 373 960,
EP-A-0 379 369, WO 89/12696 OU EP-A-0 361 983.
Contudo, o ácido nucleico pode também ser um ácido nucleico obtido por clonação e ampliação in vivo.
Os ácidos nucleicos que se pretendem detectar (ácidos nucleicos alvo) podem ser utilizados directamente como ácidos nucleicos molde A na reacção a) se eles cumprirem as condições necessárias para o sistema escolhido de enzima. Para algumas enzimas isto necessita que eles sejam ácidos nucleicos de banda única, para outros é necessário que eles incluam pontos ou promotores de reconhecimento para o sistema de enzima.
Se não for este o caso os ácidos nucleicos alvo devem ser então convertidos nesses ácidos nucleicos molde A numa fase anterior da reacção a).
A pode ser um ácido ribonucleico ou um ácido deoxirribonucleico. Os ácidos deoxirribonucleicos são particularmente preferidos como ácido nucleico A.
Incluído na significação da invenção a enzima E é uma enzima ou um sistema de enzimas que catalisa a síntese dependente de molde de ácidos nucleicos a partir de trifosfatos de mononucleósidos. As enzimas preferidas são as polimerases e as transcriptases que resultam na ligação de mononucleósidos. Essas enzimas são conhecidas dos especialistas.
Numa primeira fase é produzido um ácido nucleico marcado B a partir do ácido nucleico molde A. Isto pode em princípio ser efectuado de qualquer forma desde que apenas a informação específica da sequência de nucleótidos do ácido nucleico A ou uma parte dele seja essencialmente conservada.
Um dos processos é por exemplo a permuta de nucleótidos individuais de ácido nucleico A para nucleótidos marcados, por exemplo por reparação de entalhe (J. Mol. Biol. 113, 237 (1977)). Nesta reacção a enzima E é a E. coli ADN polimerase ou enzima de Kornberg. Este processo é, contudo, não muito particularmente vantajoso dado que a marcação é introduzida de forma relativamente não específica, isto é, para além do ácido nucleico A todos os outros ácidos nucleicos presentes na amostra são marcados. É assim portanto especialmente adequado para a reacção a) quando, tal como acima referido, os ácidos nucleicos a serem detectados tenham sido especificamente ampliados numa reacção de ampliação anterior.
Num outro processo que também tem a desvantagem acima mencionada, o ácido nucleico A é alongado (em cauda) com a incorporação de nucleótidos marcados. Outros processos deste tipo são a fotomarcação e a primagem aleatória.
Nas fases até agora descritas para a produção do ácido nucleico B, o ácido nucleico alvo é utilizado directamente na reacção a). Ele pode estar presente sob a
forma de banda única ou de banda dupla.
Os ácidos nucleicos alvo das realizações preferidas a seguir apresentadas devem ser tornados de banda única antes ou durante a reacção a). Pode ser necessário efectuar uma separação das bandas por tratamento com substâncias alcalinas, ou mesmo termicamente, enzimaticamente ou por meio de sais caotrópicos.
A utilização das reacções a) que são dependentes da presença de um iniciador específico é particularmente preferida devido à maior especificidade. Esses iniciadores específicos têm o efeito de a enzima apenas actuar no ácido nucleico que está ligado a este iniciador. O iniciador é de preferência um primário específico designado por Pl, um promotor ou uma região de iniciação de replicação.
Os primários específicos Pl são especialmente oligonucleótidos ou oligonucleótidos modificados que têm uma sequência de nucleótidos que é essencialmente complementar do ácido nucleico A. Os oligonucleótidos modificados são por exemplo oligonucleótidos que contêm um didesoxinucleótido na extremidade 3'. Esses oligonucleótidos podem ser produzidos enzimaticamente. O ácido nucleico alvo pode ser usado directamente como ácido nucleico molde A.
A utilização desses primários Pl requer assim que pelo menos uma parte da sequência do ãcido nucleico deva ser conhecida. Além disso, a sequência do primário é escolhida de forma a que uma das suas extremidades, de
preferência a extremidade 3', seja mais pequena do que o ácido nucleico. Ela tem portanto um pedaço de banda única que se estende para além da extremidade 3* do primário.
Na fase da reacção podem ser utilizados um ou vários primários específicos por ácido nucleico de banda única que se pretende detectar. No caso de vários primários, é preferível que as regiões no ácido nucleico com as quais os primários se podem hibridizar não se sobreponham e particularmente e de preferência existem regiões de banda única do ácido nucleico A entre estas regiões. Para além de uma parte que é essencialmente complementar ao ácido nucleico A o primário pode também incluir uma sequência de nucleótidos Sl, de preferência na extremidade 5', que não se pode hibridizar com o ácido nucleico, em particular na região que está adjacente à região complementar.
Esta sequência Sl pode por exemplo ser de banda única ou de dupla banda e pode também conter uma sequência de reconhecimento para uma enzima. Esta pode ser por exemplo um ponto de clivagem de restrição. Em relação a uma primagem eficaz o primário pode também conter por exemplo uma proteína ligada que é reconhecida por uma enzima E, de preferência uma polimerase.
Para que a reacção a) possa prosseguir, o ácido nucleico A e o primário PI devem cada um ser em primeiro lugar separados na região complementar das bandas complementares que possam estar presentes. Esta separação
pode ser efectuada por processos conhecidos por exemplo termicamente ou não termicamente. É preferida a desnaturação não térmica. A reacção a) é em seguida iniciada em condições em que A e Pl se podem hibridizar um com o outro.
Quando se utiliza um primário como iniciador, é também adicionada à amostra uma enzima E que pode sintetizar os ácidos nucleicos complementares A na reacção dependente de primário. Isto inclui em particular as polimerases.
seu substrato depende especificamente do ácido nucleico A. Se A for ARN são tidos então em cinsideração especialmente polimerases de ADN dependentes de ARN tais como a transcriptase inversa (por exemplo de AMV ou MMuLV). Se A for ADN então as polimerases de ADN dependentes de ADN tais como a enzima de Klenow ou polimerase de taq ADN são as preferidas.
São também adicionados trifosfatos de desoxirribonucleósido (dNTP) à amostra dos quais pelo menos um é marcado.
produto da reacção de polimerase é um ácido desoxirribonucleico marcado B em que o primário Pl bem como o trifosfato de dessoxirribinucleósido marcado são incorporados. Este ácido nucleico B tem o mesmo tamanho ou é mais pequeno do que o molde, mas tem uma região em que pelo menos uma parte é essencialmente complementar ao molde.
Este ácido nucleico B pode ser agora utilizado directamente na fase b). Contudo, é vantajoso submetê-lo uma vez mais como molde de ácido nucleico a reacções análogas à fase a). Para isto o primário P2 é adicionado à amostra que é essencialmente complementar a uma parte do ácido nucleico B, de preferência a uma parte da região recém-formada de dNTPs. 0 par de primários PI e P2 cumprem de preferência as condições descritas no documento EP-A-0 201 184. PI e P2 são de preferência adicionados simultaneamente ao molde A.
Para conseguir uma ainda maior sensibilidade é possível efectuar a reacção a) muito mais vezes, de preferência 1 a 60 vezes, em particular de preferência de 20 a 60 vezes em que os produtos da reacção são cada um utilizados de novo na reacção a). Isto resulta teoricamente numa multiplicação quase exponencial de ácidos nucleicos marcados. Neste processo ambas as bandas de ácido nucleico são formadas e o seu comprimento é determinado pelas extremidades que não podem estender dos primários PI e P2. É também possível em analogia com o documento EP-A-0 201 184 utilizar os primários designados por combinados nas últimas passagens da reacção a) cuja sequência é escolhida de forma a que os ácidos nucleicos que são formados sejam mais pequenos do que os formados em primeiro lugar. Antes de cada passagem da reacção a) é adequado separar as duplas bandas formadas de A e B na reacção a). Isto pode ser efectuado termicamente ou não termicamente. Em cada um dos casos os primários PI e P2 tem de novo estar presentes.
O iniciador pode também ser um promotor. Um promotor é uma sequência de nucleótidos que é reconhecida por uma ARN polimerase o que faz com que ela sintetize uma banda de ácido nucleico B complementar à sequência de nucleótidos que se segue ao promotor. Neste processo o NTP marcado é também incorporado na banda de ácido nucleico formada em adição aos NTPs não marcados.
São conhecidos promotores adequados, por exemplo pontos de ligação de ARN polimerase de bacteriofagos tais como T3, T7 OU SP6 (Melton e COl.: NAR 12, 1984, 7035-56? Pfeiffer & Gilbert: Protein Sequences and ADN-Analysis I, 1988, 269-280; Uhlembeck e col.; Nature 328, 1987, 596600).
Numa realização preferida do processo de detecção o promotor constitui parte de um primário específico para a produção do ácido nucleico molde A a partir do ácido nucleico alvo. Este primário tem uma sequência de nucleótidos Sl que ê essencialmente complementar a uma parte do ácido nucleico alvo e uma sequência de nucleótidos S2 que é reconhecida por uma ARN polimerase e inclui pelo menos uma sequência promotora. Numa primeira reacção, é formada uma banda de ácido nucleico AI que é pelo menos parcialmente complementar ao ácido nucleico alvo e inclui o primário com o promotor que é formado, utilizando o primário, uma ADN polimerase que depende do tipo de ácido nucleico alvo e dNTPs. Se ele já
não estiver ligado ao primário o novo pedaço formado de ácido nucleico é covalentemente ligado ao primário por adição de uma outra enzima que é de preferência uma ligase por exemplo a E. coli ADN ligase. A ligase pode também ser termicamente estável. AI é de preferência mais pequeno do que o ácido nucleico alvo. Nesta reacção de transcrição é utilizado de preferência um segundo primário P3 que é complementar à banda de ácido nucleico alvo e o intervalo entre os dois primários é fechado por exemplo por uma reacção de preenchimento de intervalos. Neste caso a utilização de dNTPs marcados não é ainda necessária dado que esta fase apenas conduziria a uma ampliação ligeira do sinal medido no processo de acordo com a presente invenção mas ela é possível.
Se o ácido nucleico alvo for o ARN então ele é de preferência selectivamente degradado numa fase posterior. São adequados métodos conhecidos para efectuar esta operação, por exemplo o tratamento com substâncias alcalinas ou ARNases. Posteriormente é formada uma banda de ácido nucleico A2 que é complementar a Al. Para isto é adicionado um primário P2 à mistura reaccional que é complementar a uma parte, de preferência a uma parte recentemente formada, da hélica Al. O primário P2 também contém de preferência a sequência promotora S2. Esta é alongada para A2 da forma acima descrita para Al. Essas fases do processo são por exemplo descritas nos documentos EP-A-0 329 822, DE-A-37 26 934, WO 88/10315, WO 87/06270,
EP-A-0 310 229 e EP-A-0 373 960 em que fazem referências de detalhe completa a estas descobertas. Em particular o leitor é enviado para esta referência em relação aos pormenores que são úteis e necessários para a transcrição inversa de ARN ou a transcrição de ADN.
Nesta realização é particularmente preferido que a amostra contenha também a banda complementar ao ácido nucleico alvo em que PI e P2 são simultaneamente alongados.
Na referida realização é posteriormente adicionada uma ARN polimerase de ARN dependente de ADN controlada especificamente pelo promotor à amostra prétratada desta maneira. Estas polimerases são por exemplo T3, T7 ou SP6 ARN polimerase. Utilizando estes produtos, são formados ácidos nucleicos marcados B a partir de NTPs e o NTP marcado. O ácido nucleico de dupla banda A1/A2 serve neste caso como ácido nucleico molde de preferência por várias vezes.
Os NTPs preferidos são os trifosfatos de ribonucleótidos. Dado que nesta variante da reacção a) são formados ácidos nucleicos de banda única B, não é absolutamente necessária mas é possível uma desnaturação de modo a separar as bandas.
Uma realização preferida é procedimento de acordo com DE-A-4010465 mas utilizando trifosfatos de ribonucleótidos marcados com detecção.
aplicador é de preferência uma região de iniciação de replicação (RIR). Uma região de iniciação de replicação é, por exemplo, uma sequência de nucleótidos que é reconhecida por uma enzima de replicação ou por um complexo de enzima de replicação, por exemplo uma polimerase dependente de ADN tal como de φ 29 (P2, P3). É particularmente preferido que a RIR constitua parte de um primário específico. Este primário tem uma sequência de nucleótidos SI que é essencialmente complementar a uma parte do ácido nucleico alvo e adjacente a ela uma sequência S2 que tem um ponto de reconhecimento, de preferência proteínas, para um complexo de replicação. Esse primário é designado por adaptador Ad no texto que se segue. A reacção é iniciada fazendo reagir o ácido nucleico alvo que é efectivamente a espécie que se pretende detectar com Ad em condições de hibridização. É particularmente preferido utilizar dois adaptadores Adi e Ad2 por ácido nucleico alvo de banda única em que as sequências específicas do alvo se podem hibridizar com sequências afastadas do ácido nucleico alvo de dupla banda e as sequências específicas do alvo dos adaptadores são dirigidas uma para outra no ácido nucleico alvo.
intervalo de banda única entre os adaptadores é preenchido com uma reacção de preenchimento de intervalos (Maniatis e col., Molecular Cloning, 1982, CHS). A utilização de NTPs marcados não é necessária mas é possível. Como resultado disso é formado um ácido nucleico de dupla banda que contem uma banda do ácido nucleico alvo e uma banda do recem-formado ácido nucleico A. Este contem
pelo menos uma, de preferência duas, regiões de iniciação de replicação que são particularmente e preferivelmente dispostas em direcções opostas de replicação.
A partir desta banda dupla pode ser obtido o ácido nucleico B de uma forma de acordo com a presente invenção por replicação sem mais adição de adaptadores e utilizando trifosfato de nucleósidos marcados e não marcados na reacção a). Estes por sua vez contem pelo menos uma, de preferência duas, regiões de iniciação de replicação e podem assim ser utilizados na reacção a) como ácido nucleico molde. Assim é conseguida uma ampliação considerável de B. No caso de ambos os adaptadores possuírem cada uma RIR ou quando dois ácidos nucleicos A que são complementares um ao outro são utilizados na reacção a), podem ser formados dois ácidos nucleicos B que são complementares um ao outro. Estes devem ser separados um do outro antes de se dar a fase b) por desnaturação.
Após a fase a) a mistura reaccional é submetida a uma desnaturação não térmica (reacção e)) no processo de acordo com a presente invenção. Também se a fase a) for efectuada várias vezes a desnaturação não térmica tem lugar directamente antes da fase b). Em particular as bandas duplas de ácidos nucleicos são separadas uma da outra neste processo. A desnaturação não térmica refere que a temperatura de desnaturação não é superior a 50°C, de preferência não superior a 37°C e tem lugar de preferência numa gama de temperaturas compreendida entre 22 e 37°C. Na
desnaturação, as bandas duplas de ácidos nucleicos que podem estar presentes são separadas uma da outra de forma a que o ácido nucleico B esteja presente como banda única. Isto pode ser por exemplo efectuado alterando a estringência e também por meio de enzimas, por exemplo helicase, proteína recA, proteína E. coli ssb, proteína do gene-32 e por substâncias alcalinas ou por adição de substâncias químicas que desestabilizam as bandas duplas tais como por exemplo substâncias orgânicas tal como a ureia, formamida (concentração > 70%, NAR 1977, Vol. 4, 5, 1539-1553) ou sais caotropicos. Os sais caotrópicos são descritos em J . Biol. Chem. 1966, 241/17, 4030-4042, J. Amer. Chem. Soc. USA 1962, 84/8, 1329-1338 ou Anal. Biochem. 129, 357-364 (1983). São particularmente preferidos Nal, tiocianato de guanidínio ou NaC104 dentro do âmbito da invenção. A concentração destes sais necessária para a desnaturação pode ser determinada por experiências simples. Contudo, eles são por exemplo para Nal de preferência cerca de 12,2 mol/1, para sais de guanidínio cerca de 4 mol/1 e para NaC104 cerca de 7 mol/1.
A desnaturação alcalina provou ser particularmente vantajosa neste caso. Para isto a mistura reaccional da reacção a) é ajustada a um valor de pH na gama de 10 a 14, de preferência de 12 a 14. Isto pode ser por exemplo efectuado por adição de uma adição de NaOH, ou KOH em água.
A temperatura da mistura durante a incubação de a 30 minutos, de preferência de 5 a 10 minutos está numa gama de 17 a 50°C, de preferência de 22 a 37°C.
Na fase da reacção b) seguinte é feito reagir o ácido nucleico B com a sonda C de forma a que eles constituam em conjunto um híbrido de ácido nucleico D.
Como sonda de ácido nucleico C são tidos em consideração em particular os oligonucleótidos ou polinucleótidos com o comprimento de 6 a 5000, de preferência 15 a 2000. A sonda C pode ser um plasmídio, um fragmento de ácido nucleico ou um oligonucleótido. Ela pode ser ARN ou ADN. A sonda de ácido nucleico C é adicionada à mistura reaccional em excesso em relação à quantidade expectável de ácido nucleico B e está preferivelmente sob a forma de uma solução aquosa. A sonda C tem uma sequência de nucleótidos que é essencialmente complementar a B, e assim ela não se hibridiza ou fá-lo uma extensão muito pequena com ácidos nucleicos presentes na amostra ou em ácidos nucleicos recem-formados que não se pretendem detectar. Combinando a utilização de primários específicos com hibridização com uma sonda específica torna-se particularmente selectivo o processo de acordo com a presente invenção.
C pode ser um ácido nucleico de dupla banda, em que as bandas Cl são complementares a uma parte de B. A outra banda C2 da sonda de ácido nucleico é de preferência complementar aos outros ácidos nucleicos B, em particular àqueles que são formados durante a reacção a) com B como ácido nucleico molde. A desnaturação de C pode ser neste caso efectuada separadamente de B. É contudo preferível desnaturar C juntamente com B. Isto ocorre em particular no caso da desnaturação alcalina. Para isto C é de preferência adicionado à mistura reaccional de a) antes da alcalinização. Após um periodo de incubação a mistura é ajustada a um valor de pH de 5,0 a 8,5, de preferência 7 a 8, após o que os híbridos de ácido nucleico são formados a partir de B e Cl ou C2.
É preferido o caso em que C é uma sonda de ácido nucleico de banda única Cl e a banda C2 complementar a Cl não é adicionada. Mesmo assim é ainda possível adicionar Cl antes da desnaturação de B. Contudo, no caso da desnaturação alcalina de B é particularmente preferível incubar apenas em primeiro lugar B numa substância alcalina e em seguida adicionar uma solução ácida da sonda Cl. O valor de pH da solução ácida de Cl está na gama de 3,0 a 6,5, de preferência 4,5 a 6,0, sem existir evidência de uma instabilidade notável da sonda. A solução fracamente ácida deve ser adequada para ajustar o valor de pH de 5,0 até 8,0 após a adição da solução de hibridização. A solução pode também ser tamponada nesta gama e conter outros reagentes que ajudam a hibridização tais como por exemplo SSC, formamida ou agentes de bloqueamento para ácidos nucleicos que não se pretende que sejam detectados. O valor de pH da mistura após a adição de Cl deve também neste caso estar na gama de 5,0 a 8,5. A regulação fina do valor de pH pode por
exemplo ser efectuada por meio da quantidade de solução de hibridização bem como pelo seu valor de pH.
Os ácidos que podem ser utilizados para a neutralização ou como componentes da solução de hibridização são por exemplo o ácido clorídrico ou o ácido fórmico; contudo, são preferidos o ácido acético ou o ácido fosfórico. 0 valor do pH da solução da hibridização antes da adição da amostra é de 3,0 a 6,5. A concentração do ácido acético por exemplo é de preferência de 0,05 a 0,5 mol/1, particularmente e de preferência entre 0,1 e 0,2 mol/1.
As sondas de ácido nucleico de banda única Cl podem por exemplo ser obtidas por síntese de ácidos nucleicos de acordo com DE-A-39 16 871 ou também de acordo com EP-A0 184 056.
Esta realização tem a vantagem de a utilização da solução de sonda se neutralizar a solução da amostra e ser portanto possível aplicá-la com uma fase que utiliza uma pipeta. Além disso mostrou-se que a adição de um ácido concentrado a uma amostra tratada com uma substância alcalina que tem um elevado teor de proteínas conduz a aglomerações, razão pela qual o procedimento proposto é particularmente vantajoso.
Se for efectuada uma desnaturação por meio de uma substância desestabilizante de banda dupla antes da fase b) então as condições para a hibridização com a sonda C podem ser ajustadas por diluição da mistura.
A sonda C contem por banda de ácido nucleico um ou vários grupos I (imobilizáveis) que são susceptíveis de imobilização.
Os grupos I susceptíveis de imobilização são por exemplo grupos químicos que podem ser covalentemente ligados a uma fase sólida por exemplo através de uma reacção química ou fotoquímica, ou grupos ou partes de moléculas que podem ser reconhecidas e ligadas por outra molécula ou parte de uma molécula por meio de interacções específicas de grupo. Estes grupos são portanto por exemplo haptenos, antigénios e anticorpos, sequências de nucleótidos, receptores, sequências de regulação, glicoproteínas, por exemplo lectinas, ou mesmo os pares de ligação de proteínas de ligação como por exemplo a biotina ou a iminobiotina. São preferidas as vitaminas e os haptenos, e particularmente preferidos a biotina, fluoresceína ou esteróides como por exemplo a digoxigenina ou digoxina. É importante para a invenção que em cada hibrido D o grupo imobilizável da sonda seja diferente do grupo detectável do ácido nucleico B.
A mistura, que contem um híbrido de ácido nucleico D se o ácido nucleico que se pretende detectar estiver presente na amostra, é posteriormente levada a contacto com uma fase sólida que pode ser especificamente ligada ao híbrido D através de grupos imobilizáveis da sonda de ácido nucleico C.
tipo de fase sólida depende do grupo I que é susceptível de imobilização. Ele tem de preferência um grupo de imobilização R que pode participar numa interacção de ligação com I. Se o grupo imobilizável for por exemplo um hapteno então pode ser utilizada uma fase sólida que tem anticorpos contra este hapteno na sua superfície. Se o grupo imobilizável for uma vitamina tal como por exemplo a biotina então a fase sólida pode conter proteínas de ligação imobilizadas tais como a avidina ou a estreptavidina. Os grupos particularmente preferidos I e R são a biotina e a estreptavidina. A imobilização através de um grupo do ácido nucleico modificado é particularmente vantajosa dado que pode ter lugar em condições mais moderadas do que por exemplo as reacções de hibridização.
Para imobilizar os ácidos nucleicos formados é preferível que após a formação do híbrido do ácido nucleico D a mistura reaccional seja deitada num recipiente em que pode reagir com o grupo imobilizável à sua superfície. A reacção de hibridização com a sonda tem de preferência lugar ao mesmo tempo que a imobilização. 0 recipiente pode ser por exemplo uma cuvete, um tubo ou uma placa de microtitulação. É, contudo, também possível utilizar uma fase sólida sob a forma de um material poroso tal como uma membrana, um tecido ou uma esponja na qual é aplicada a mistura reaccional. É também possível utilizar as designadas pérolas ou partículas de látex. A fase sólida deve pelo menos ter tantos pontos de ligação para o grupo imobilizável da sonda como o número de híbridos de ácido
nucleico D e portanto de ácidos nucleicos B que estão presentes.
A produção de uma fase sólida preferida é descrita no documento EP-AO 344 578 em que é referida com maior pormenor.
Após um período de incubação durante o qual tem lugar a reacção de imobilização, a fase líquida é removida do recipiente, do material poroso ou das pérolas agregadas. A fase sólida pode posteriormente ser lavada com um tampão adequado dado que a ligação dos híbridos D à fase sólida é muito eficaz. O processo de acordo com a presente invenção permite particularmente que sejam utilizadas poucas fases de lavagem neste processo dado que ao contrário das sondas detectáveis utilizadas na técnica actual não é absolutamente necessário remover completamente as sondas dificilmente separáveis, ou conduz a sinais de fundo comparativamente pequenos.
A quantidade de ácidos nucleicos modificados ligados à fase sólida pode em princípio ser determinada de forma conhecida em que as fases que tem ser efectuadas dependem do grupo detectável. No caso de grupos directamente detectáveis como por exemplo os marcadores fluorescentes, a quantidade de marcação é determinada de forma fluorométrica. Se o grupo detectável for um hapteno então o ácido nucleico modificado é feito de preferência reagir com um anticorpo marcado contra o hapteno de forma análoga à descrição em EP-A-0 324 474. 0 marcador pode por
exemplo ser um marcador de enzima, como por exemplo a Bgalactosidase, fosfatase alcalina ou peroxidase. No caso de uma marcação de enzima, a quantidade de ácido nucleico é medida por meio das técnicas fotométricas habituais, quimioluminométricas ou fluorométricas de monitoração de uma reacção da enzima com um substrato cromogénico, quimioluminogénico ou fluorogénico. É também, contudo, possível monitorar a reacção de forma electroquímica se for utilizada uma enzima de redox como marcador, ou monitorar uma alteração no valor de pH por meio de um eléctrodo de pH. O sinal medido é uma medida da quantidade de ácido nucleico alvo originalmente presente.
A detecção do ácido nucleico pode ser efectuada de forma qualitativa e quantitativa. No caso de uma avaliação quantitativa revelou ser eficaz efectuar pelo menos uma experiência comparativa com uma amostra de teor de ácido nucleico conhecido. É possível e recomendável construir uma curva de calibração.
Numa realização do processo que utiliza o PCR (reacção em cadeia de polimerase), são adicionados oligonucleótidos à amostra como primários PI e P2. Neste caso Pl é complementar a uma parte da banda única do ácido nucleico A que simultaneamente representa o ácido nucleico alvo e molde. P2 é homólogo a uma parte de A que está a uma certa distância dele. A mistura é agora tratada da forma descrita no documento EP-A-0 201 184 em que, contudo, aparte os trifosfatos de desoximononucleótidos não
desoximononucleótido marcado com digoxigenina ou marcado com fluorosceína. São efectuados de preferência 20 a 30 ciclos de ampliação. Em seguida são adicionados a sonda de dupla banda marcada com biotina C e a solução de hidróxido de sódio até a um pH de 10 a 14. A mistura é incubada a cerca de 37°C e posteriormente é adicionada uma solução das substâncias auxiliares de hibridização ao valor de pH de cerca de 5 de forma a ser obtido um pH cerca de 7 a 8,5. A mistura é transferida para um recipiente revestido com estreptavidina e de novo incubada. A solução é removida e o recipiente é lavado. É adicionado um conjugado de anticorpo contra digoxigenina e é adicionada uma enzima e em seguida é de novo incubada a mistura. Após remoção da solução e lavagem de recipiente, é feita reagir a mistura com um substrato cromogénico da enzima e é observada a formação de cor.
Uma realização preferida é uma variante do processo de replicação descrito no documento DE-A-39 29 030. A descoberta de DE-A-39 29 030 é aqui referida com maior pormenor. Para efectuar o processo a amostra, que contem o ácido nucleico alvo de dupla banda, é misturada com dois adaptadores que são complementares à mesma banda e cujos terminais, que se hibridizam com A, são orientados um para outro e as extremidades não hibridizantes contem uma sequência de iniciação de replicação para a polimerase φ 29. Em condições de hibridização o intervalo entre os
utilizando ADN polimerase ou transcriptase inversa (como enzima El) e uma reacção de ligase. Os trifosfatos de desoximononucleósidos utilizados para este efeito podem ser não modificados, contudo, é preferível que um deles seja o trifosfato de monodesoxirribonucleósido marcado com digoxigenina. Para efectuar a replicação, são adicionados o sistema de replicação de φ 29 (P2, P3, e ATP) bem como o trifosfato de monodesoxirribonucleótiso marcado com digoxigenina ou fluoresceína, para além do trifosfatos de mononucleótisos não modificados se eles não tiverem sido já utilizados para a reacção de preenchimento de intervalos. Os ácidos nucleicos marcados com detecção B que são formados por replicação servem de novo como ácidos nucleicos molde sem outra adição de adaptadores para produzir outros ácidos nucleicos B. Com o tempo isto conduz teoricamente a uma ampliação exponencial dos ácidos nucleicos marcados com detecção B. Logo que tenham sido formados ácido nucleicos suficientes, a mistura é submetida a uma fase de desnaturação não térmica e é adicionada uma sonda de banda única marcada com biotina Cl numa solução contendo reagentes de hibridização a pH de 3,0 a 6,5 até um pH de 5,0 a 8,5, de preferência 7,0 a 8,0. Introduzindo a fase de desnaturação não térmica é possível efectuar todo o procedimento de ensaio numa gama de temperaturas compreendida entre 17 e 50 °C e preferivelmente a uma única temperatura. A mistura é transferida para um recipiente
revestido com estreptavidina e incubada. Após se aspirar o líquido e lavagem do recipiente, é adicionada uma solução de um conjugado de um anticorpo marcado com enzima contra digoxigenina ou fluoresceína e é de novo incubada a mistura. Após se aspirar a solução e lavagem posterior, é adicionada uma solução de um substrato cromogénico e é observada a formação de cor.
Nos processos actuais tem sido até agora sempre utilizadas sondas marcadas com detecção. Era necessário uma separação completa das sondas não hibridizantes para a precisão dos resultados das medidas mas isto era relativamente complicado.
o processo de acordo com a presente invenção não tem esta desvantagem porque mede esta presença de mononucleótidos incorporados e marcados e utiliza isto como medida para detectar a presença ou medir a quantidade de ácidos nucleicos que se pretendem detectar em vez de hibridizar e determinar as sondas marcadas. Os mononucleótidos marcados não incorporados podem ser particularmente e simplesmente completamente removidos de acordo com o presente processo dado que eles não estão ligados aos ácidos nucleicos nem à superfície. Um excesso de sonda imobilizável C não interfere por outro lado com a determinação dado que os grupos imobilizáveis da sonda C não são utilizados como marcação e assim não podem contribuir para os resultados das medidas. Em particular a capacidade de ligação da fase sólida pode ser mais
facilmente calculada do que quando se incorporam NTPs imobilizáveis.
processo de acordo com a presente invenção é portanto muito sensível e selectivo e além disso pode ser efectuado num tempo muito curto.
o processo de acordo com a presente invenção é adequado para a detecção de ácidos nucleicos tal e qual , organismos contendo ácidos nucleicos tais como bactérias, vírus e células e para a detecção das alterações em ácidos nucleicos tais como mutações ou translocações cromossómicas e para localizar genes e determinar o seu grau de expressão. Podem ser detectados ácidos ribonucleicos e também ácidos desoxirribonucleicos. É também possível identificar diferenças selectivas em ácidos nucleicos quando os resultados das experiências são comparados com aqueles em que'é utilizado um primário na reacção a) que é complementar ao ácido nucleico A na sua extremidade 3' e no outro é utilizado um primário que não é complementar ao ácido nucleico A na sua extremidade 3' mas que contudo se hibridiza com ele. Um alongamento do primário e assim a formação do ácido nucleico B é apenas possível no primeiro caso. A escolha destes primários é descrita por exemplo em PNAS 86, 2757 (1980).
A Figura 1 mostra um diagrama de uma realização que utiliza um alongamento de primário (utilização de apenas um primário Pl).
A Figura 2 mostra um diagrama de uma realização
ácidos nucleicos B que são formados em primeiro lugar são de novo utilizados como ácido nucleico molde.
A Figura 3 mostra um diagrama do curso da realização preferida que utiliza uma ampliação de replicação.
A Figura 4 mostra o resultado de uma experiência realizada de acordo com a Figura 1 na curva I. A absorvância medida na solução é representada em função da quantidade de ácido nucleico A que se pretende detectar; a curva II mostra o resultado na ausência do ácido nucleico que se pretende detectar.
A Figura 5 mostra uma curva de calibração para a determinação de HBV ADN por meio de PCR e de um oligonucleótido de banda simples marcado com biotina de acordo com o Exemplo 2. A curva 2 mostra o valor em branco (sem a adição de Bio-Oli 25).
A Figura 6 mostra uma curva de calibração 3 para a determinação de HVB no processo de acordo com o Exemplo 3. A curva 4 mostra o valor em branco (sem a adição de BioOli 25).
Símbolos de referência:
A ácido nucleico molde
Al banda oposta de A PI primário complementar a A E complexo de enzima/enzima
EI polimerase de ADN ou transcriptase inversa
L grupo detectável (marcação)
B produto da reacção a)
C sonda de ácido nucleico I grupo imobilizável D híbrido de ácido nucleico de B e C R grupo imibilizante F fase sólida sequência complementar a A
SI' outra sequência complementar a A sequência promotora ou iniciação da primeira replicação (origem de replicação)
S2' sequência promotora ou iniciação da segunda replicação (origem de replicação)
Adi adaptador 1, complementar ao ácido nucleico alvo Adi adaptador 2, complementar ao ácido nucleico alvo
A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos.
Exemplo 1
Ampliação do ADN alvo utilizando um trifosfato de desoxirribonucleósido marcado com detecção (fase a))
Ê efectuada a reacção em cadeia de polimerase com sequências específicas de HBV clonadas. Os primários utilizados ligam-se nas posições 1937-1960 e 2434-2460 no genoma de HBV, isto é, é ampliada uma sequência de 523 nucleótidos (R. Sumazaki e col., 1989, J. Med. Virol, 27. 304-308). A concentração do ADN que se pretende ampliar no plasmídio corresponde a 100 ag até 100 pg na diluição em série utilizada neste caso. São efectuados 30 ciclos de PCR (2 min 92°C; 2 min 50°C; 2 min 70°C) em 100 μΐ com primários cada um numa concentração de 200 nM, KCL, 50 mM; Tris-HCl pH 8,5, 10 mM; MgC^, 1,5 mM; gelatina 100 ptg/ml; dATP, 200 μΜ; dCTP, 200 μΜ, dGTP, 200 μΜ; DTTP, 150 μΜ; digoxigenina-11-2’-desoxi-uridina-5 *-dUTP (DIG-[11]-dUTP, Boehringer Mannheim), 50 μΜ; 2,5 U Thermus aquaticus (Tag) ADN polimerase.
Desnaturação não térmica f fase e))
São desnaturados 20 μΐ desta mistura após PCR e 40 ng de amostra de ADN marcado com biotina (ADN de HBV primado aleatoriamente, cionado entre as posições 27 e 2604, de dupla banda) num volume total de 44 μΐ em NaOH 0,5 M durante 10 minutos a 37°C.
Hibridizacão com a sonda Ç f fase b)) e ligação em fase sólida (fase f11.
Posteriormente é feita a neutralização por adição de 156 μΐ de solução de hibridização a um valor de pH de 5 e é transferida a mistura por meio de uma pipeta para uma placa de microtitulação revestida com estreptavidina (solução de hibridização - fosfato de sódio
62,5 mM, 6,25 x SSC [1 X SSC = NaCl, 0,15 M; citrato de sódio, 0,015 M] e formamida 62,5%). A reacção de hibridização/reacção de ligação de parede é efectuada durante 18 horas a 37°C com uma agitação moderada.
Detecção do híbrido D (fase c), g) e h)).
Após remover o líquido e lavagem por 5 vezes com NaCl a 0,025% e sulfato de cobre a 1 oo/o, é adicionado o conjugado de peroxidase de rábano anti-digoxigenina a 200 mU/ml e incuba-se durante 60 minutos a 37°C em Tris-HCl, pH 7,5/10 mM; NaCl, 0,9 %; BSA, 1 %; Pluronic T68, 0,5 %. Após lavagem por 5 vezes (sendo as condições idênticas às anteriores) é incubada a mistura com 2,2-azino-di-[3etilbenziatol]-(ABTS) a 0,1 % durante 60 min a 37°C e a absorvância é medida a 405 nm.
As absorvâncias para esta reacção e para as reacções de controlo com a amostra bio-marcada são apresentadas na Figura 4.
Exemplo 2
A reacção de ampliação (reacção em cadeia de polimerase) é efectuada com um soro de controlo (negativo a ADN de HBV) que é enriquecido com ADN específico de HBV. É formado um fragmento de ADN com o comprimento de 523 pb na ampliação devido à posição do primário de PCR seleccionado (primário de PCR 1: posição 1937-1960, primário de PCR 2: posição 2434-2460 no genoma de HBV, ver Exemplo 1 para a literatura). É feita uma diluição em série a partir deste plasmídio numa gama de 10 pg/ml até 1,25 pg/ml no soro de controlo. Em relação à região de ADN do plasmídio que se
.............. .iiwniiniiHMiiiflEMteaaSSffi%^^SSgaaÍ»w_ pretende ampliar, isto corresponde a quantidades na gama de 40 ag até 320 ag de ADN que são utilizados na reacção de ampliação. São adicionados 50 μΐ de Tris-HCl 10 mM (pH 8,3) e 20 μΐ de NaOH 0,5 N a 10 μΐ do soro de controlo suplementado com ADN de plasmídio para a lise alcalina e incuba-se durante 1 hora a 37a C. São utilizados 10 μΐ da preparação de lise na reacção de ampliação após neutralização com 20 μΐ de HC1 0,5 N. A reacção é efectuada num volume total de 100 μΐ com 200 nM de cada um dos primários de PCR, dATP 200 μιη, dCTP e dGTP em cada caso, dTTP 175 μΜ, digoxigenina-ll-2/-dUTP 25 μΜ (Boeringer Mannheim), 2,5 U de Polimerase de ADN de Thermus aquaticus. KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl2 1,5 mM, e gelatina a 0,01%. Após cobrir a solução com 100 μΐ de óleo mineral ela é incubada num termociclador (Perkin Elmer): 30 segundos a 92°C, 30 segundos a 50°C, 60 segundos a 70°C, 30 ciclos no total. Após o fim da ampliação são adicionados 10 μΐ de NaOH 0,5 N a 40 μΐ da preparação e incuba-se durante 10 min à temperatura ambiente. Em seguida neutraliza-se por adição de 450 μΐ de solução de hibridização (tampão de fosfato de Na 50 mM, NaCl 0,75 M, citrato de Na 0,075 M, HC1 0,05 N, BSA a 0,05%, pH 5,4) a que são adicionados 220 ng/ml de oligonucleótido marcado com biotina (Bio-Oli 25, marcado com biotina de acordo com Applied Biosystems, User Bulletin, DNÀ Sinthesizer No. 49, 1988, posições 2327-2356 no genoma de HBV), que é complementar a uma região da região de ADN ampliada. São
incubados 200 μΐ da preparação de hibridização durante 3 h a 37 °C num furo de uma placa de microtitulação revestida com estraptavidina. Após se aspirar a solução ela é posteriormente lavada por 2 x 10 min a 37°C com NaCl 0,3 M, citrato de sódio 0,03 M, SDS a 0,2 % e 1 vez durante um curto período de tempo à temperatura ambiente com NaCl a 0,9%. São adicionados 200 mU/ml de conjugado de peroxidase de rábano com anticorpo de anti-digoxigenina em Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), NaCl a 0,9 %, BSA a 1 % e incuba-se a mistura durante 30 min a 37°C. Após a lavagem por 3 vezes com NaCl a 0,9 % a solução de substrato (ABTSR 1,9 mM) é adicionada e é medida a absorvância a 405 nm.
Os resultados obtidos na reacção são apresentados em diagrama na Figura 5.
Exemplo 3.
É diluído plasma humano positivo a HB e com um título de vírus de 1 x 1010 vírus da Hepatite B por mol no soro normal de forma a que o teor de vírus nas diluições esteja compreendido entre 0,25 x 105/ml a 2 x 105/ml. Da modo a efectuar a lise dos vírus são adicionados 10 μΐ de NaOH 0,2 N a 10 μΐ de diluição de soro e incuba-se a mistura durante 1 hora a 37°C. Posteriormente é feita a neutralização por adição de 30 μΐ de solução de neutralização (KC1 100 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,3)), MgCl2 3 mM, gelatina a 0,02 % a 10 μΐ da preparação de lise. A reacção é efectuada num volume total de 100 μΐ com 200 nM
de cada um dos dois primários de PCR, dATP 200 mM, dCTP e dGTP, dTTP 175 μΜ, digoxigenina-ll-2'-dUTP 25μΜ (Boehringer Mannheim), KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl2 1,5 mM, gelatina a 0,01 %, 2,5 U polimerase de ADN de Thermus aquaticus. A preparação da reacção é coberta com 100 μΐ de óleo mineral e incubada num termocliclador (Perkin Elmer) durante 30 ciclos: 30 segundos a 92 °C, 30 segundos a 50°C e 1 minuto a 70°C.
É produzido um fragmento de ADN com 523 pb pela fase de ampliação (primário de PCR de HBV 1: posições 19371960, primário de PCR de HBV 2: posições 2434-2460 no genoma de HBV). A detecção específica dos produtos de PCR é efectuada num sistema de ensaio a dois componentes da fase sólida. 20 μΐ de tampão TE (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) EDTA 1 mM e 10 μΐ de NaOH 0,5 N são adicionados em primeiro lugar a 20 μΐ de mistura de ampliação e incuba-se a mistura durante 10 min à temperatura ambiente. Neutraliza-se por adição de 450 μΐ de solução de hibridização acidificada (tampão de fosfato de sódio 50 mM , HCl 0,05 N, NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0.075 M, BSA a 0,05 %, pH 5,4) a que são adicionados 100 ng/ml de um oligonucleótido marcado com biotina que corresponde a uma região de região de ADN ampliada (oligonucleótido de biotina HBV, 30 meros, duas vezes marcado com biotina, posições 2327-2356 no genoma de HBV, Bio-Oli 25, produzido em síntese de fase sólida, marcado com biotina da forma descrita no Exemplo 2). São incubados 200 μΐ desta preparação de hibridização num furo de uma placa de microtitulação revestida com estreptavidina durante 3 h a 37°C com agitação. Após a reacção de hibridização e reacção de ligação de parede a solução é aspirada e lavada 2 x 10 min com NaCl 0,3 M, citrato de sódio 0,03 M, de SDS a 0,2 % durante um curto período de tempo à temperatura ambiente. Após a adição de 200 mU/ml de conjugado de peroxidase de rábano anti-digoxigenina anticorpo em Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), NaCl a 0,9 %, BSA a 1 %, a mistura é incubada durante 30 min a 37°C com agitação. É removido o conjugado não ligado por lavagem por três vezes com NaCl a 0,9% à temperatura ambiente. Após a incubação durante 30 minutos com ABTSR 1,9 mM (ácido 2,27azino-di-[3-etil-benztiazolino-sulfónico (6)]-sal de diamónio) a 37°C, a absorvância é medida a 405 nm utilizando um leitor de ELISA. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 6.

Claims (1)

  1. Processo para a detecção específica de um ácido nucleico numa amostra que compreende as seguintes fases:
    a) fazer-se reagir a amostra com um ou mais trifosfatos de mononucleósido marcados e uma ou mais enzimas que catalisam a produção de um ácido nucleico marcado B que contém este nucleótido,
    b) fazer-se reagir a amostra com uma sonda de ácido nucleico C que é suficientemente complementar do ácido nucleico B,
    c) detectar-se o híbrido de ácido nucleico D formado a partir do ácido nucleico marcado B e sonda de ácido nucleico C, caracterizado por
    d) a sonda de ácido nucleico C conter pelo menos um grupo imobilizável,
    e) a mistura reaccional ser submetida a uma desnaturação não térmica após a fase a),
    f) o híbrido de ácido nucleico D ser levado ao contacto com uma fase sólida que pode ligar especificamente a sonda de ácido nucleico C imobilizável,
    g) a fase líquida ser separada da fase sólida e
    h) o grupo detectável ligado ao sólido ser detectado.
    - 2a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a reacção a) se dar na presença de um iniciador específico.
    - 3a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2 caracterizado por a enzima ou complexo de enzima, catalisar a polimerização de trifosfatos de nucleósido para um ácido nucleico B que é essencialmente complementar ao ácido nucleico A.
    - 4a Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por os trifosfatos de nucleósido incluírem trifosfatos de ribonucleósido.
    - 5â Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por se utilizar um primário Pl como iniciador específico na reacção a) que é essencialmente complementar a uma parte do ácido nucleico À e que é alongado pela enzima para um ácido nucleico B que é essencialmente complementar ao ácido nucleico B com a incorporação do trifosfato de mononucleósido.
    - 6â Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por se utilizar também um primário P2 que é essencialmente complementar a uma parte do ãcido nucleico B.
    - 7a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 3 ou 5 caracterizado por os trifosfatos de nucleósido incluirem trifosfatos de ribonucleósido.
    - 8a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 caracterizado por o ácido nucleico a ser detectado ser de banda única ou ser tornado de banda única, e em seguida se adicionar pelo menos um adaptador á amostra por banda única a ser detectada contendo uma sequência de nucleótidos que é essencialmente complementar a uma parte do ácido nucleico a ser detectado e contendo uma região de iniciação de replicação, o adaptador ser alongado por uma sequência que é complementar ao ácido nucleico e o ácido nucleico assim formado ser utilizado como ácido nucleico molde na reacção
    a).
    - 9® Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 caracterizado por o ácido nucleico a ser detectado ser de banda única ou ser tornado de banda única, e em seguida se adicionar pelo menos um primário á amostra por banda única a ser detectada contendo uma sequência de nucleótidos que é essencialmente complementar a uma parte do ácido nucleico a ser detectado e contendo uma região de iniciação de transcrição, o primário ser alongado por uma sequência que é complementar ao ácido nucleico e o ácido nucleico assim formado ser utilizado como ácido nucleico molde na reacção a).
    - 10a Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por o ácido nucleico B formado na fase a) ser de novo utilizado como ácido nucleico molde na reacção a).
    - 11a Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por a reacção a) ser efectuada várias vezes em sucessão em que de cada vez os produtos da reacção servem de novo como matérias primas para a nova reacção.
    - 12a 44
    Processo de acordo com qualquer as reivindicações 10 ou 11 caracterizado por se formar um ácido nucleico híbrido na reacção a) a partir do ácido nucleico A e ácido nucleico B.
    - 13a Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por a desnaturação ter lugar a um valor de pH alcalino.
    - 14a Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por a desnaturação ser efectuada por adição de sais caotrópicos.
    - 15a Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por a desnaturação ser efectuada a uma temperatura compreendida entre 17’C e 50°C.
    - 16a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 13, 14 ou 15 caracterizado por todo o procedimento de ensaio ter lugar a uma temperatura compreendida entre 17°C e 50° C.
    - 17a Processo de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por todo o procedimento de ensaio ter lugar a uma única temperatura.
    - 18a Processo de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por a sonda de ácido nucleico ser adicionada sob a forma de uma solução com um pH entre 3,9 e 6,5.
    - 19a Processo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por a solução conter também todos os reagentes necessários para efectuar a hibridização.
    - 20a Processo de acordo com as reivindicações 18 ou 19 caracterizado por a sonda de ácido nucleico C ser um ácido nucleico de banda única Cl cuja banda oposta não está presente na solução.
    - 21a Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por a sonda de ácido nucleico C ser adicionada sob a forma de uma solução com um pH compreendido entre 10 e 14 e posteriormente a' mistura ser ajustada com a solução de hibridização a um pH entre 5,0 e 8,5.
    - 22a Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por se combinar em primeiro lugar a sonda com a amostra, em seguida se ajustar a um pH compreendido entre 10 e 14 e posteriormente se ajustar o pH da mistura a valores compreendidos entre 5,0 e 8,5.
    - 23“ Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por se fazerem de novo reagir os ácidos nucleicos formados por alongamento dos primários PI e P2 com Pl e P2 após separação de bandas em que as bandas recern46 formadas utilizando o primário de cada vez serve de molde para o alongamento do outro primário.
    A requerente reivindica as prioridades dos pedidos alemães apresentados em 9 de Outubro de 1990, 5 de Dezembro de 1990 e 22 de Dezembro de 1990, sob os números Nos. P 40 32 024.3, P 40 38 804.2 e P 40 41 608.9 respectivamente.
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