JP6409233B2 - キットおよび方法 - Google Patents
キットおよび方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6409233B2 JP6409233B2 JP2016192924A JP2016192924A JP6409233B2 JP 6409233 B2 JP6409233 B2 JP 6409233B2 JP 2016192924 A JP2016192924 A JP 2016192924A JP 2016192924 A JP2016192924 A JP 2016192924A JP 6409233 B2 JP6409233 B2 JP 6409233B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- kit
- probe
- sample
- dna polymerase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
- G01N2333/91235—Phosphotransferases in general with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
- G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- G01N2333/9125—Nucleotidyltransferases (2.7.7) with a definite EC number (2.7.7.-)
- G01N2333/9126—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7)
Description
真核細胞中には、少なくとも3つのデオキシリボヌクレオシドキナーゼ、チミジンキナーゼ1および2(TKおよびTK2)、デオキシシチジンキナーゼ(dCK)およびデオキシグアノシンキナーゼ(dGK)が存在している。
1980年代前半に、チミジンキナーゼ活性は種々の腫瘍疾患を患っている患者からの血清中で検出されるだけでなく、通常非常に低いTK活性を示す健康なヒト個体とは大幅に異なり得ることが示された。
3H−チミジンなどの放射性基質は、フィルター結合アッセイにおいてTKおよびdCK活性の決定のために広く使用されている。ルーチン臨床診断のためには、放射性ベースのアッセイは魅力的な選択肢ではない。
本明細書中の全ての用語および単語は、関連技術分野におけるその通常の意味および使用に従って解釈されるべきである。明白にするためにいくつかの用語は以下により具体的に議論される。
ATP アデノシン5’−三リン酸
AZTMP アジド−チミジン一リン酸
BrdU ブロモデオキシウリジン
dCDP デオキシシチジン二リン酸
dCK デオキシシチジンキナーゼEC2.7.1.21;ATP:シチジン−5’−ホスホトランスフェラーゼ
dCMP デオキシシチジン一リン酸
dCMPK シチジル酸キナーゼ:EC2.7.4.14;ATP:dCMPホスホトランスフェラーゼ
dsDNA 二本鎖DNA
hrdCK ヒト組換えデオキシヌクレオシドキナーゼ
hrTK1 ヒト組換えチミジンキナーゼ1
MMX MasterMix[サンプルなしの試薬混合物]
NdPK ヌクレオシド二リン酸キナーゼ:EC2.7.4.6;ATP:ヌクレオシド二リン酸ホスホトランスフェラーゼ
hrTK1 ヒト組換えチミジンキナーゼ1
ssDNA 一本鎖DNA
TDP デオキシチミジン二リン酸
TK チミジンキナーゼ:EC2.7.1.21;ATP:チミジン−5’−ホスホトランスフェラーゼ
TMPK dTMPキナーゼ:EC2.7.4.9;ATP:TMPホスホトランスフェラーゼ
TMP デオキシチミジン一リン酸
TaqDNAポリメラーゼは、サーマス・アクアチクス(Thermus aquaticus)由来のDNA依存性DNAポリメラーゼである。Taqポリメラーゼまたは単にTaqは、65〜75℃の間の最適温度間隔を有する。TaqDNAポリメラーゼは、5’→3’ヌクレアーゼ活性も組み込む。
本発明の全ての好ましい態様において、プライマー−鋳型−プローブシステムを設計することが重要である。DNA依存性DNAポリメラーゼの選択は、プライマー−鋳型−検出器の選択と整合しなければならない。
シグナル検出のための機器は、優先的に、リアルタイムPCR機器であり得る。機器の加熱−冷却原理または励起および発光検出原理に関してどんな優先も本発明に従う方法には適用されない。
DNA依存性DNAポリメラーゼおよび天然TまたはdC基質は1つまたは複数の反応容器に分配されてもよい。蛍光検出機器において本発明に従う方法を実行するのに適した反応容器は、好ましくは、20μl〜200μlの全容積を保持することができる。さらにより好ましくは、反応容器は、25μlまたは50μlの容積を保持することができる。本発明に従う方法の反応容積は、好ましくは、5μl〜100μlの範囲であり得る。さらにより好ましい反応容積は25μl〜50μlである。
MMXを反応容器に加えた後、サンプルが容器に添加される。容器は閉められ、測定機器に入れられ、インキュベートされる。蛍光サンプリングが始まり、選択されたサイクル数だけ継続される。TK/dCKサンプルは、好ましくは、血清または血漿を構成することができる。さらにより好ましいのは、血清およびクエン酸血漿である。反応容積のサンプルの割合は、好ましくは、1〜20%であるものとする。
− 反応チューブおよびPCR機器は、実施例1に続く全ての実施例について同一である。
− 緩衝混合物は、実施例1に続く全ての実施例について同一である。
− MMXは、試験すべきデオキシリボヌクレオシドキナーゼ含有サンプル(デオキシリボヌクレオシドキナーゼサンプルが緩衝液で置き換えられた負の対照を含む)を除く全ての成分を含むと定義される。
− サンプルは、組換えもしくは精製デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、またはこれらを含む血清もしくは血漿のいずれかであり得る。
− デオキシリボヌクレオシドキナーゼの希釈は、全ての実施例に対して、表2に記載される緩衝液中で行われる。
− 反応容積は検出システムに関係なく25μlである。
− 全てのサンプルは、使用される検出システムに関係なく3通り実行される。
検出システム1に従うhrTK1標準曲線
200pg、20pgおよび2pgのhrTK1から、hrTK1触媒活性値を示す標準曲線を作成した。hrTK1の負の対照として、そして規格化された蛍光の閾値レベルの決定のために、0pgの標準点を含有させた。hrTK1の比活性は、2.1μmol・分−1・mg−1であった。各標準点を3通り実行した。hrTK1は、TK希釈緩衝液(表2)中に希釈した。
蛍光の規格化はサイクル1から行った。90サイクル(分)の後に交差する0pgのhrTK1に対する閾値を選択した。この実施例では、0.000標準蛍光単位における閾値を得た。X軸には、それぞれの標準点からの活性(デオキシリボヌクレオシドキナーゼのpgで与えられる)が与えられる。各標準点は、pg(x);Ct(y)値を保有する。0.965のR2値が得られ、標準曲線が、サンプル中のTKU/lの量を決定するための手段としての役割を果たすことができることが示される。
検出システム1に従うhrdCKからのdCK標準曲線
20000pg、2000pg、200pg、20pgおよび2pgの酵素から、hrdCK触媒活性値を示す標準曲線を作成した。hrdCKの負の対照として、そして規格化された蛍光の閾値レベルの決定のために、0pgの標準点を含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、hrTK1の各標準点と、実施例1と同様のNdPKと、50×に希釈(1回の反応につき48ngの酵素に等しい)したdCMPKとを含有するように調製した(表4)。組換えdCMPKの比活性は、35μmol/分/mgであると推定される。3.2*25μlのMMXは、緩衝混合物、基質混合物およびオリゴヌクレオチドを0.8UのKlenow exo−断片DNAポリメラーゼと一緒に混合することによって、各標準点に対して、1.5mlのポリプロピレン微小遠心機中室温で調製した(0pgのhrdCKの負の対照を含む)。MMX調製物は、dCTPがMMX中TTPで置き換えられることを除いて、実施例1の場合と同一であった。オリゴヌクレオチド混合物は表4に従う。
蛍光の規格化はサイクル1からである。90分後の0pgに対する閾値を選択した。閾値を0.017標準蛍光単位に設定した。X軸には、それぞれの標準点からの活性(デオキシリボヌクレオシドキナーゼのpgで与えられる)が与えられる。各標準点は、pg(x);Ct(y)値を保有する(図4)。
検出システム2に従うhrTK1標準曲線
200pg、20pgおよび2pgのhrTK1から、触媒活性値を示す標準曲線を作成した。0pgの標準点を負の対照として含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、hrTK1標準点と、実施例1の場合と同様のNdPKおよびTMPKとを含有するように調製した。MMXは、0.4UのTaqDNAポリメラーゼがKlenow DNAポリメラーゼの代わりに用いられ、オリゴヌクレオチドが表5に従ったことを除いて、実施例1の場合と同様に調製した。最後に、それぞれの標準点の酵素混合物を各専用MMXに添加した。200pgの酵素混合物をNTC中に含有させた。各標準点混合物から25μlを3つのPCRチューブに分配した。チューブにフタをし、PCR機器に入れた。サイクリングプロファイルは、(1)42℃で1分間保持、(2)35℃で1分間保持、(3)サイクリング:37℃で30秒間→37℃で30秒間であり、SYBR GreenI(登録商標)/FAMチャネル(470nmで励起、510nmで検出)に対してシグナルを獲得した。各1分間サイクルを60回繰り返した。全アッセイ時間は65分間である。
図12は、この実験から得られる生の蛍光を示す。生の蛍光を標準規格化した。すなわち、最初の5回のサイクルにわたって単に計算し、サイクル1から開始して直線化した(図5)。それぞれの標準点に対するCtの数(X軸)を決定するために、閾値レベルを約60分後の2pgに対して選択した。閾値は、標準蛍光単位の0.12(Y軸)であることが分かった。内臓ソフトウェアRotor−gene v.6.01を用いて、選択された閾値に対してCt値を決定した。各標準点Ctの平均(Y軸)およびhrTK1のpg値(X軸)の対数回帰プロットによって、得られた標準曲線を使用して本当のサンプルの単位活性値を決定することの妥当性を示す0.98のR2値が得られた。アッセイの精度性能(CV%)結果は、以下の表6に要約される。Ct値が反応中のhrTKのピコグラムからの活性に対応することに注意されたい。この特定の構築物の比活性が2.1μmol/分/酵素1mgであることが分かれば、実際の触媒濃度を推定することが可能である。しかしながら、国際単位定義(すなわち、1U=1μmol/分/l)に従うためのTK活性の標準化がまだ存在しないので、単純な理由だけで、この実施例では対応する「ピコグラム」活性が与えられる。
20000pg、2000pg、200pg、20pgおよび2pgの酵素から、HrdCK触媒活性値を示す標準曲線を作成した。負の対照として0pgの標準点を含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、標準点と、実施例1および2で与えられるようなNdPKおよびdCMPKとを含有するように調製した。3.2*25μlのMMXは、緩衝混合物、基質混合物、オリゴヌクレオチド混合物(表7)を0.4UのTaqDNAポリメラーゼと一緒に混合することによって、各標準点に対して、1.5mlのポリプロピレン微小遠心管中室温で調製した(0pgのdCKの負の対照を含む)。オリゴヌクレオチドを以下の表7で与えられるもので置き換えたことに注意されたい。最後に、それぞれの標準点からの酵素混合物をMMXに添加した。20000pgの酵素混合物をNTC MMX中に含有させた。25μlのMMXおよび標準点混合物を3つのPCRチューブに分配した。チューブにフタをし、リアルタイムPCR機器に入れた。サイクリングプロファイルは、(1)42℃で1分間保持、(2)35℃で1分間保持、(3)サイクリング:37℃で30秒間→37℃で30秒間であり、JOEチャネル(530nmで励起、555nmで検出)に対してシグナルを獲得した。各サイクルを60回繰り返した。全アッセイ時間は65分間である。
dCKのpg値の各標準点に対するCt値は、実施例3に記載されるように得た。直線的な蛍光の対数回帰によって、この標準曲線を使用して本当の臨床サンプルからのdCK活性値を決定することの妥当性を示す0.98のR2値が得られた。精度性能結果は、表8に要約される。対数スケールの線形回帰は図7に示される。
検出システム3に従うhrTK1標準曲線
200pg、20pgおよび2pgの酵素から、hrTK1触媒活性値を示す標準曲線を作成した。簡単に言うと、それぞれのヌクレオシドキナーゼのための酵素混合物は、実施例3に記載されるようなNdPKおよびTMPKと一緒にヌクレオシド標準点を含有するように調製した。3.2*25μlmpMMXは、以下の点:DNA依存性DNAポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドを以下の表9に与えられるもので置き換えた点を除いて、実施例3に従って調製した。
図xは、置換されたFAM/Dabcyl分子ビーコンプローブからの生の蛍光の減少をリアルタイムで示す。閾値は0.012標準蛍光単位に設定される。図14は、3つの標準点から得られたCt値の平均の対数回帰を示す。R2値は0.96である。直線的な蛍光の対数回帰によって、この標準曲線を使用して本当の臨床サンプルからのdCK活性値を決定することの妥当性を示す0.98のR2値が得られる。
検出システム3に従うhrdCK標準曲線
2000pg、200pg、および20pgおよび2pgの酵素から、hrdCK触媒活性値を示す標準曲線を作成した。0pgの標準点を負の対照として、そして規格化された蛍光値の閾値を設定するために含有させた。簡単に言うと、それぞれのヌクレオシドキナーゼのための酵素混合物は、ヌクレオシド標準点と、実施例2および4に従うNdPKおよびdCMPKとを含有するように調製した。3.2*25μlのMMXは、オリゴヌクレオチドが以下の表10に従うことを除いて、実施例5に従って調製した。
蛍光シグナルの規格化はサイクル1からである。閾値は、90分後の0pgに対して選択した。平均Ct値の対数回帰は4つの標準点からである。R2値は0.96である。
異なる量の各デオキシリボヌクレオシドキナーゼを有する混合物を用いる検出システム2に従うhrTK1およびhrdCKの多重決定
以下の表11で与えられる異なるhrTK1およびhrdCKの触媒活性値を有する混合物から標準曲線を作成した。簡単に言うと、酵素混合物は、実施例1および2に従うNdPK、TMPKおよびdCMPKと一緒に、各標準点hrTK1/hrdCK点を含むように調製した。MMXは、以下の点:実施例4からのオリゴヌクレオチドを含有させ、NdPKが0.02U/反応である点を除いて、実施例3に従って調製した。
図8は、多重化実験からの対数スケールの線形回帰結果を示す。Y軸は、検出に必要とされるCtの数である。X軸は、それぞれのデオキシリボヌクレオシドキナーゼからの任意の「pg」活性である。結果は明らかに、いずれのデオキシリボヌクレオシドキナーゼの量も他方のプライマー伸長効率に影響を与えないことを示す。関連する2つのデオキシリボヌクレオシドキナーゼの異なる傾斜は、恐らく、これらの酵素が示し得る異なる比活性によるものである。
検出システム2に従うイヌ血清サンプル中の野生型TKの触媒濃度の決定およびTK−REA法との相関
事前に悪性疾患を有することが診断されたイヌ血清サンプルを、検出システム2に従ってhrTK1触媒濃度について試験した。各血清は、TK−REA法によって予め測定されている。標準曲線には、200pg、20pgおよび2pgのhrTK1からの触媒活性を含有させた。実験は、以下の点:1)血清サンプルTK希釈緩衝液がhrTK1の代わりに使用され、血清を5%の最終濃度まで添加したこと、すなわち、各反応中に1.25μlの血清を含有させた(MMX/酵素混合物当たり4μlの血清)ことと、2)サイクリングプロファイルが実施例1に従ったこととを除いて、実施例2に従って実行した。規格化はサイクル1からであった。閾値は、90分後の0pgのTKに対して選択した。
Rotor−Gene v.6.1ソフトウェア(Qiagen GmbH)を用いて、各標準点および血清サンプルに対するCtを得た。サンプルおよび標準曲線において対数スケールの線形回帰を実行した(図9)。2つの血清が最初に得られたTK−REAU/l値に適合できないことがすぐに分かるであろう。「>80」値を有する第3の血清は直線に適合し得るはずがないので、これも適合されることはできない。従って、これらの3つの血清は「異常値」であると考えられ、これらの3つの血清を除いた回帰直線を作成した。標準点に対する式と、3つの異常値(「>80」、33.2および9.8のTK−REAU/l)を除いた血清サンプルに対する式とは、曲線の傾斜に関して2.4Ctだけ異なる。2つの曲線は同じ傾斜を共有することは明らかである。本発明に従う方法を用いてこの実施例の血清から得られるU/lを評価する際、これは、血清点に対する回帰直線式、すなわち、式
y=−10.79Ln(x)+93.784
だけを用いて行われる。血清サンプル回帰直線に対するhrTK1のpgの相関は、標準点回帰曲線に対して与えられるTKの「pg」活性量に関して、式U/l=e^((11.79ln(pg(x))+21.085)/10.67)を用いるだけで解決される。図9において、各標準点は[「pg」TK(X);Ct(Y)]で表され、各血清は、[「TK−REAU/l」TK(X);Ct(Y)]で表される。R2値は、各曲線に対して与えられる。図9中の「OL」は、異常値の血清を示す。図9からの結果は精度データと共に、表12および13において一覧にされる。興味深いことに、「>80U/l」サンプルは、延長された血清回帰直線への外挿による希釈を必要とせずに、本発明に従う方法を用いて評価されて、450U/lTK−REAの対応する単位を有し得る。
SYBR Green I技術の原理、すなわち検出システム1を用いる血清添加hrTK1サンプルの決定
Diasorin s.r.l.(Saluggia Italy)からのTK−REA製品を用いてTK1活性が予め測定されているイヌからの血清を、SYBR green技術の原理を用いて試験した。血液提供者からの10%ヒト正常血清が添加された、40pg、20pg、4pg、2pgおよび0pgのhrTK1からの触媒活性を示す標準曲線サンプルを、血清サンプル(最終10%)と一緒に測定した。0pgの添加標準点サンプルを負の対照および規格化された蛍光の閾値決定因子として含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、0.002UのNdPKと、1回の反応につき18ngのdTMPキナーゼと、各hrTK1標準点サンプルまたは各血清サンプルとを含有するように調製した。緩衝混合物、基質混合物およびオリゴヌクレオチド混合物は表3に従って調製した。各サンプルに対するMMXは、1.5mlのポリプロピレン微量遠心管中室温で、水と、混合物と、0.5UのKlenow exo−DNAポリメラーゼ(Fermentas AG)とを混合することによって調製した。MMX200pgのhrTK1の酵素混合物標準点サンプルは、No−Template−Control(NTC)として使用した。
蛍光の規格化を獲得し、標準規格化を用いてサイクル1から直線にした(図10)(すなわち、最初の5回のサイクルからの平均蛍光を使用して、ソフトウェア供給者に従って、その後のサイクルから得られる蛍光から推定されるバックグラウンド蛍光を決定した)。NTC閾値(カットオフ)は、蛍光の最高の増大を有するサンプルの4%である。内臓ソフトウェアRotor−gene v.6.01(Corbett Research,Australia)を用いて、選択された閾値対してCt値を決定した。約56サイクル(Ct)の後に交差する0pgのhrTK1に対して閾値を選択した。この実施例では、0.03295標準蛍光単位における閾値を得た。図11は、得られたCt値の対数スケールの線形回帰を示す。X軸には、hrTK1のpgとして、あるいはTK−REAU/lとして、それぞれのサンプルからの活性が与えられる。各サンプル点は、pg/TK−REAU/l(X);Ct(y)値を有する。血清添加hrTK1標準点サンプル対して線形回帰および0.9688のR2スコアが得られ、サンプル中のTKU/lの量を決定するために相関が十分良好であることが示された。傾斜間の関係をさらに決定するために、2つの別々の回帰曲線に対してスチューデントのt検定を適用した。データセットが小さいため、t検定は手作業で計算した。分散は等しいがサンプルサイズが等しくない検定を実施した。データセットにおける0.07のスコアは、傾斜が等しいと考えられる可能性が高いことを示した。
鎖置換技術の原理を用いて、すなわち検出システム3に従って得られたhrTK1標準曲線
80pg、40pg、20pg、8pg、4pg、2pgおよび0pgのhrTK1から、触媒活性値を示す標準曲線を作成した。簡単に言うと、MMXは、各標準点に対して、実施例2および表7に記載されるように調製した。
図12は、置換されたFAM分子ビーコンヘアピンプローブからの規格化された蛍光からの減少をリアルタイムで示す。使用した規格化方法は、ソフトウェア提供者の説明書(Corbett−Research)に従うダイナミックチューブ規格化であった。閾値は、−(マイナス)0.02118標準蛍光単位に設定した。図13は、6つの標準点から得られる平均Ct値の対数スケールの線形回帰を示す。R2値は0.9422であり、血清または血漿からの臨床サンプル中のTK活性の決定のために標準曲線が適用され得ることが示される。
・ Eriksson S,Munch−Petersen B,Johansson K,Eklund H.Structure and function of cellular deoxyribonucleoside kinases.Cell Mol Life Sci.2002 59(8):1327−46.
・ Topolcan O and Holubec L.Jr.The role of thymidine kinase in cancer diseases.Expert.Opin.Med.Diagn.2008 2(2):129−141
・ 特許:米国特許出願公開第2008/0248472号明細書、欧州特許第1385005号明細書、国際公開第2009/063254号パンフレット
Claims (19)
- サンプル中のデオキシヌクレオシドキナーゼ活性のリアルタイム測定用均一方法であって、
a)前記サンプルを、容器中において
・DNA依存性DNAポリメラーゼ、
・少なくとも1つの天然デオキシヌクレオシド、
・少なくとも1つのシチジル酸キナーゼおよび/またはdTMPキナーゼ、
・ヌクレオシド二リン酸塩キナーゼ、
・鋳型DNA分子、DNAプライマー分子、および前記DNA依存性DNAポリメラーゼによって合成されるdsDNAに取り込まれるか前記dsDNAから置換されるかあるいは前記dsDNAに結合されることが可能である蛍光部分を含む検出システム
を含む反応混合物と接触させるステップ;
b)前記容器を閉じてインキュベートするステップ;
c)プライマー伸長中に前記蛍光部分からのシグナルを測定するステップ;および
d)前記蛍光部分からのシグナルを、前記サンプル中のデオキシヌクレオシドキナーゼ活性と関連付けるステップ;
からなり、前記方法が温度サイクリングシフトを含まないことを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記少なくとも1つの天然デオキシヌクレオシドが、デオキシチミジンおよび/またはデオキシシチジン、またはこれらの混合物から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1または2に記載の方法において、前記反応混合物が修飾デオキシヌクレオシドも含むことを特徴とする方法。
- 請求項3に記載の方法において、前記修飾デオキシヌクレオシドが、BrdUおよび/またはIdU、またはこれらの混合物などの修飾チミジンおよび修飾シチジンから選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の方法において、前記蛍光部分が一本鎖DNAプローブに結合されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至5のいずれか一項に記載の方法において、前記蛍光部分が一本鎖DNAプローブに結合されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至6のいずれか一項に記載の方法において、前記蛍光部分が、PicoGreen(登録商標)、EvaGreen(登録商標)またはSYBR(登録商標)GreenIなどの二本鎖DNA表面結合または挿入分子であることを特徴とする方法。
- 請求項5に記載の方法において、前記一本鎖DNAプローブがその無傷の形態である場合に、前記プローブに結合された前記蛍光部分が消光されることを特徴とする方法。
- 請求項8に記載の方法において、前記DNA依存性DNAポリメラーゼが、TaqDNAポリメラーゼまたはTthポリメラーゼなどの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする方法。
- 請求項8または9に記載の方法において、前記一本鎖DNAプローブに結合された前記蛍光部分が、前記一本鎖DNAプローブがその無傷の形態でその標的鋳型とハイブリッド形成した場合に最大蛍光を達成することを特徴とする方法。
- サンプル中のデオキシヌクレオシドキナーゼ活性の均一リアルタイム測定用キットであって、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNA依存性DNAポリメラーゼと少なくとも1つの天然デオキシヌクレオシドとを含み、前記少なくとも1つの天然デオキシヌクレオシドが、デオキシチミジンおよび/またはデオキシシチジン、またはこれらの混合物から選択され、
鋳型DNA分子、DNAプライマー分子、および前記DNA依存性DNAポリメラーゼによって合成されるdsDNAから置換されるかあるいは前記dsDNAに結合されることが可能である蛍光部分を含む検出システムをさらに含むことを特徴とするキット。 - 請求項11に記載のキットが、サンプル中のデオキシヌクレオシド・キナーゼ活性を温度サイクリングシフトなしに測定することを特徴とするキット。
- 請求項11または12に記載のキットが、少なくともホスホトランスフェラーゼをさらに含むことを特徴とするキット。
- 請求項11乃至13のいずれか一項に記載のキットが、少なくとも1つの修飾デオキシヌクレオシドをさらに含むことを特徴とするキット。
- 請求項11乃至14のいずれか一項に記載のキットにおいて、前記蛍光部分が一本鎖DNAプローブに結合されることを特徴とするキット。
- 請求項15に記載のキットにおいて、前記蛍光部分が一本鎖DNAプローブに結合されることを特徴とするキット。
- 請求項11乃至14のいずれか一項に記載のキットにおいて、前記蛍光部分が、PicoGreen(登録商標)、EvaGreen(登録商標)またはSYBR(登録商標)GreenIなどの二本鎖DNA表面結合または挿入分子であることを特徴とするキット。
- 請求項15または16に記載のキットにおいて、前記一本鎖DNAプローブがその無傷の形態である場合に、前記プローブに結合された前記蛍光部分が消光されることを特徴とするキット。
- 請求項11乃至18のいずれか一項に記載のキットであって、請求項1−10のいずれか一項に記載の方法のために使用することを特徴とするキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE1050473 | 2010-05-14 | ||
SE1050473-6 | 2010-05-14 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013510047A Division JP2013526273A (ja) | 2010-05-14 | 2011-05-13 | キットおよび方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017042169A JP2017042169A (ja) | 2017-03-02 |
JP2017042169A5 JP2017042169A5 (ja) | 2017-06-29 |
JP6409233B2 true JP6409233B2 (ja) | 2018-10-24 |
Family
ID=44641364
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013510047A Pending JP2013526273A (ja) | 2010-05-14 | 2011-05-13 | キットおよび方法 |
JP2016192924A Active JP6409233B2 (ja) | 2010-05-14 | 2016-09-30 | キットおよび方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013510047A Pending JP2013526273A (ja) | 2010-05-14 | 2011-05-13 | キットおよび方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9429518B2 (ja) |
EP (1) | EP2569441B2 (ja) |
JP (2) | JP2013526273A (ja) |
CN (1) | CN103038361B (ja) |
DK (1) | DK2569441T4 (ja) |
WO (1) | WO2011142719A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9429518B2 (en) | 2010-05-14 | 2016-08-30 | Csens Ab | Kit and method |
CN110904187A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-03-24 | 翌圣生物科技(上海)有限公司 | 一种Taq酶活性测定方法 |
WO2023208361A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Biovica International Ab | Thymidine kinase as a marker for immune checkpoint inhibitor efficacy |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5273879A (en) * | 1987-07-23 | 1993-12-28 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Amplification method for polynucleotide assays |
US5328827A (en) * | 1987-08-27 | 1994-07-12 | Institut National De La Recherche Agronomique - Inra | Specific DNA molecular probes for Bos-type male genome |
DE4020529A1 (de) * | 1989-09-12 | 1991-03-21 | Roxana Vasiloiu | Multifunktionelle(s) enzym(e) mit nucleosid-didesoxyribosyltransferase(n) und/oder nucleoside-desoxyribosyltransferasen(n) und/oder kinease- und/oder reduktase- und/oder desaminase- und/oder polymerase-aktivitaet |
US5189019A (en) * | 1990-04-23 | 1993-02-23 | Merck & Co., Inc. | Antistasin derived anticoagulant protein |
US5321010A (en) * | 1991-12-10 | 1994-06-14 | Merck & Co., Inc. | Proteins for inhibiting adhesion of platelets to collagen |
EP0726708A1 (en) * | 1993-11-05 | 1996-08-21 | Pathogenesis Corporation | Virus associated multiple sclerosis: treatments, prevention and diagnosis thereof |
EP0745686A1 (en) * | 1995-06-01 | 1996-12-04 | Roche Diagnostics GmbH | The use of DNA polymerase 3'-intrinsic editing activity |
GB0022458D0 (en) * | 2000-09-13 | 2000-11-01 | Medical Res Council | Directed evolution method |
US7045319B2 (en) | 2001-10-30 | 2006-05-16 | Ribomed Biotechnologies, Inc. | Molecular detection systems utilizing reiterative oligonucleotide synthesis |
ATE352039T1 (de) | 2002-07-27 | 2007-02-15 | Diasorin Ab | Verfahren zur bestimmung der aktivität von thymidinkinase-1 und dessen verwendung |
US9505846B2 (en) | 2005-01-28 | 2016-11-29 | Life Technologies Corporation | Multi-component inhibitors of nucleic acid polymerases |
BRPI0609044B8 (pt) | 2005-02-25 | 2021-07-27 | Roennerbol Holding Ab | método e kit de ensaio para a determinação de atividade de timidina cinase em uma amostra biológica, uso de método e/ou de kit de ensaio, método para uso em diagnóstico, monitoramento e/ou prognóstico de doenças ou distúrbios de proliferação celular, e, método para uso em triagem de compostos |
WO2008024052A1 (en) | 2006-08-24 | 2008-02-28 | Rönnerbol International Ab | A method and a kit for determination of an enzyme activity involved in metabolic production of a deoxynucleoside triphosphate and use thereof |
GB0722449D0 (en) | 2007-11-15 | 2007-12-27 | Univ Abertay Dundee | bIOASSAY |
US20090197254A1 (en) * | 2007-12-14 | 2009-08-06 | Ming-Chou Lee | Variant scorpion primers for nucleic acid amplification and detection |
JP2009268381A (ja) * | 2008-05-01 | 2009-11-19 | Univ Of Fukui | 癌特異的酢酸代謝を標的とした癌バイオマーカー・検査方法・治療剤 |
GB0814591D0 (en) * | 2008-08-08 | 2008-09-17 | Randox Lab Ltd | Assay |
WO2010036359A2 (en) * | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Allelogic Biosciences Corporation | Methods of polymerase activity assay |
US9429518B2 (en) | 2010-05-14 | 2016-08-30 | Csens Ab | Kit and method |
-
2011
- 2011-05-13 US US13/697,279 patent/US9429518B2/en active Active
- 2011-05-13 WO PCT/SE2011/050605 patent/WO2011142719A1/en active Application Filing
- 2011-05-13 CN CN201180024021.1A patent/CN103038361B/zh active Active
- 2011-05-13 DK DK11780890.7T patent/DK2569441T4/en active
- 2011-05-13 EP EP11780890.7A patent/EP2569441B2/en active Active
- 2011-05-13 JP JP2013510047A patent/JP2013526273A/ja active Pending
-
2016
- 2016-08-22 US US15/243,764 patent/US10190149B2/en active Active
- 2016-09-30 JP JP2016192924A patent/JP6409233B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103038361A (zh) | 2013-04-10 |
EP2569441A4 (en) | 2013-11-27 |
US10190149B2 (en) | 2019-01-29 |
DK2569441T4 (en) | 2017-12-18 |
EP2569441A1 (en) | 2013-03-20 |
EP2569441B2 (en) | 2017-09-13 |
CN103038361B (zh) | 2017-02-08 |
EP2569441B1 (en) | 2014-11-19 |
US9429518B2 (en) | 2016-08-30 |
WO2011142719A1 (en) | 2011-11-17 |
JP2017042169A (ja) | 2017-03-02 |
JP2013526273A (ja) | 2013-06-24 |
DK2569441T3 (en) | 2015-01-05 |
US20130071846A1 (en) | 2013-03-21 |
US20170029867A1 (en) | 2017-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11208688B2 (en) | Small RNA capture, detection and quantification | |
EP3268491B1 (en) | Methods, compositions and kits for small rna capture, detection and quantification | |
JP4558932B2 (ja) | ハイブリダイゼーション及び不一致識別のための、ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン含有オリゴヌクレオチド | |
KR102351434B1 (ko) | 고도로 선택적인 핵산 증폭 프라이머 | |
RU2630999C2 (ru) | Композиции для реакции обратной транскрипции с горячим стартом или для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией с горячим стартом | |
JP3045084B2 (ja) | 核酸増幅の蛍光偏光検出法 | |
JP2008533983A (ja) | 多型検出法 | |
US9315860B2 (en) | Conjugates of nucleotides and method for the application thereof | |
JP2004532615A (ja) | 核酸の検出および識別のためのプライマーおよび方法 | |
JP6409233B2 (ja) | キットおよび方法 | |
US20110212451A1 (en) | Rna detection method | |
JP2003210199A (ja) | 高度ダイナミックレンジを有する定量的多重pcr | |
US10087482B2 (en) | Amplification of bisulfite-reacted nucleic acids | |
CN101671672B (zh) | 用于改进的核酸扩增的聚阴离子 | |
JP2023552693A (ja) | 標的遺伝子変異及びウイルスゲノムの検出システム並びにその製造及び使用の方法 | |
KR20230012467A (ko) | 표적 핵산을 검출하기 위한 루프형 프라이머 및 루프-드-루프 방법 | |
US20220136040A1 (en) | Using tethered enzymes to detect nucleic acids | |
WO2023035110A1 (zh) | 一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法 | |
CA3223987A1 (en) | Methods, compositions, and kits for preparing sequencing library | |
JP2024502293A (ja) | 変性のない挿入物および識別子の配列決定 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170516 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170829 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171128 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180320 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180424 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180807 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20180906 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180906 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180906 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6409233 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |