WO2004042057A1

WO2004042057A1 - 遺伝子変異検出法

Info

Publication number: WO2004042057A1
Application number: PCT/JP2003/014204
Authority: WO
Inventors: Yoichi Matsubara; Shigeo Kure
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
Priority date: 2002-11-07
Filing date: 2003-11-07
Publication date: 2004-05-21
Also published as: NO20052692L; EP1580269B1; DE60321961D1; US20060127907A1; CA2506654C; KR20050086431A; CN100343389C; AU2003277612A1; NO20052692D0; CN1729289A; ATE399882T1; JPWO2004042057A1; US20080318238A1; EP1580269A4; JP4425142B2; EP1580269A1; CA2506654A1; US9677127B2; NO338640B1; KR101078977B1

Abstract

　ＤＮＡの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つが、増幅されたＤＮＡが第１の標識物質により標識されるように第１の標識物質により標識されており、ハイブリダイゼーションプローブが第２の標識物質により標識されるとともに、ＤＮＡの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイブリダイゼーションプローブの有する塩基配列が、ＤＮＡの増幅を阻害しないように設定されており、ハイブリッドの検出が第１の標識物質および第２の標識物質を利用してアフィニティークロマトグラフィーにより行われることにより、ＤＮＡの増幅のためのプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを含む一つの反応系で、ＤＮＡの増幅およびハイブリダイゼーションを順次行い、反応液中のハイブリッドをアフィニティークロマトグラフィーにより検出する。

Description

明細書

遺伝子変異検出法技術分野

本発明は、塩基配列の検出方法に関し、より詳しくは、点変異などの変異部位を含む塩基配列を含む塩基配列を検出することにより遺伝子の変異を検出する方法に関する。

ゲノム上に数多く存在する遺伝子多型は、疾病への感受性や、薬剤代謝の個人差などに深く関連していると考えられている。これらの遺伝子多型の検出は、いわゆるオーダ一メイド医療にとって必須であり、ゲノム科学の臨床応用における最重要研究課題のひとつに挙げられている。なかでも、遺伝子多型マーカ一として SNP (single nucleotide polymorphism, 一塩基置換による遺伝子多型）は最近とみに注目を浴びており、国際的にも巨額の研究費が投じられている。また一方、分子遺伝学研究の進歩によって、様々な遺伝性疾患における遺伝子変異がデ —夕ベースに蓄積されてきている。これを用い、すでに病因であることが明らかにされている既知の遺伝子変異をスクリーニングすることによって、遺伝病の診断や臨床病型の予測をおこなうことが可能となってきている。特に、特定集団内、あるいは人種を超えて高頻度に存在する遺伝子変異の場合、その診断的価値は高い。

以上のような遺伝子多型や遺伝子変異には、塩基置換、欠失、挿入、繰り返し配列数の相違などがあるが、その中で圧倒的に多数を占めているのが、一塩基置換による点変異である。ヒトゲノム研究の成果を臨床の場に還元していくためには、この点変異の簡便かつ迅速な検出法が不可欠である。

これまで点変異の検出法として、様々な手法が考案されてきた（Cotton RGH. Mutation Detection, pp.1-198, Oxford University Prese, Oxford, 1997参照) 。代表的な方法としては、対立遺伝子特異的ォリゴヌクレオチドハイプリダイゼーション (allele specific oligonucleotide hybridization, A S 0 ) 法、対立遺伝子特異的増幅法、制限酵素消化法、リガ一ゼ連鎖反応、ミニシークェンス法などが挙げられる。これらの手法はいずれも、 DNA増幅後に、ハイブリダィゼーシヨンや電気泳動をはじめとする煩雑な操作が必要とされる。一方、近年ヒトゲノム解析研究に対応するために開発された、 TaqMan法、インべ一ダ一アツセィ（invader assay)、 DNA マイクロアレイ（DNAチップ）、質量分析計を用いる TOF- MASS法などは、大量検体の処理に秀でているものの、高額の特殊専用機器を必要とし、臨床検査室レべルで簡単に施行できるものではない。また、遺伝子変異のスクリーニング法として広く用いられている SSCP法、ケミカルクリ一べッジ（chemical cleavage )法および DHPLC法は未知の遺伝子変異の大まかなスクリーニングに威力を発揮するが、既知変異の確実な検出には不適切である。さらに、シークェンス法を用いた点変異検出は、操作が複雑でコストも高く、既知変異の検出にはオーバースペックといわざるを得ない。上記のいずれの方法も、現段階では遺伝子解析実験室でおこなわれる特殊検査であり、臨床の現場（べヅドサイド）で迅速に実施することはきわめて困難である。、

A S 0法に使用されるプローブとしては、従来は 15〜25merが用いられている (Saiki RK, Erlich HA. Dection of mutations bv hybridization with sequence-specinc oligonucleotide probes. In: Mutation Detection: A Practical Approach, pp.113-129, IRL Press, Oxford, 1998参照）。また、ハイブリダィゼ一シヨンにおいて、標識プロ一ブに競合するオリゴヌクレオチドを用いてプローブの特異性を増強させることが幸艮告されている（Nozari G, Rahbar S, Wallace RB. Discrimination among the transcripts of the alleic human β -globin genes β , β ^s and β ^c using oligodeoxynucleotide hybridization probes. Gene 43:23-28, 198o麥照) 。発明の開示

本発明は、遺伝子の変異の簡便かつ迅速な検出法を提供することを目的とする。本発明者らは、特定のプライマーおよびプロ一プを特定の条件で用いると、一つの反応系で核酸の増幅とハイブリダイゼーシヨンを行うことができ、しかもハィブリダイゼーシヨンにより形成したハイブリヅドを容易に検出できるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。本発明は、以下のものを提供する。

(1) DN Aポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含む DNAの増幅を行う工程、増幅された DNAと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイプリダイゼーシヨンプロ一プとをハイプリダイズさせる工程、および、ハイプリダイゼーシヨンにより形成されたハイプリッドを検出する工程を含む塩基配列の検出方法であって、

DNAの増幅に用いるプライマ一の少なくとも一つは、増幅された DNAが第 1の標識物質により標識されるように第 1の標識物質により標識されており、ハィプリダイゼーションプロ一プは第 2の標識物質により標識されるとともに、 D N Aの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイプリダイゼ一シヨンプローブの有する塩基配列は、 DN Aの増幅を阻害しないように設定されており、ハイブリッドの検出は第 1の標識物質および第 2の標識物質を利用してァフィ二ティークロマトグラフィーにより行われる前記方法。

(2) 変異部位が点変異であり、 DN Aの増幅が行われる反応液が、増幅された D N Aと標識されたハイブリダイゼーシヨンプローブとのハイプリダイゼーションの特異性を高めるのに十分な量の、標識されたハイプリダイゼーシヨンプロープの塩基配列と点変異の位置で 1塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチドをさらに含む（1) の方法。

(3) DNAの増幅が PCRによる増幅である（1) または（2) の方法。

(4) DN Aポリメラ一ゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含む D N Aの増幅を行うためのプライマーと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイブリダィゼ一シヨンプローブと、ァフィ二ティークロマトグラフィー用試験片とを含むキットであって、

DNAの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅された DNAが第 1の標識物質により標識されるように第 1の標識物質により標識されており、ハィプリダイゼ一シヨンプローブは第 2の標識物質により標識され、ハイプリダイゼーシヨンプローブの有する塩基配列は、 D N Aの増幅を阻害しないように設定されており、試験片は第 1の標識物質および第 2の標識物質を利用して増幅された DNAとハイブリダイゼ一シヨンプローブとのハイブリヅドを検出できるもの W

4

である前言 3キヅト。

( 5 ) 変異部位が点変異であり、標識されたハイプリダイゼーシヨンプローブの塩基配列と点変異の位置で 1塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチドをさらに含む（4 ) のキヅト。

( 6 ) プライマ一が P C R用プライマーである（4 ) または（5 ) のキット。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の検出法の原理（正常 DNAを検体とした場合）の説明図である。図 2は、本発明の検出法の原理（変異 DNAを検体とした場合）の説明図である。図 3は、本発明の検出法の一例の操作の説明図である。

図 4は、 17merのハイプリダイゼーシヨンプローブを用いた場合の検出結果 (クロマトグラムの写真）を示す。

図 5は、 17merのハイブリダィゼ一シヨンプローブを用い、競合プローブを添加した場合の検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。

図 6は、種々の長さのハイブリダィゼーシヨンプローブを用い、競合プローブを添加した場合の検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。

図 7は、 12merのハイブリダィゼ一シヨンプローブを用い、競合プローブを添加した場合の検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。

図 8は、種々の変異に関する検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。

図 9は、種々の変異に関する検出結果（クロマトグラムの写真）を示す。発明を実施するための最良の形態

< 1 >本発明の検出法

本発明の検出法は、 D N Aポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含む D NAの増幅を行う工程、増幅された D NAと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイプリダイゼーシヨンプローブとをハイプリダイズさせる工程、および、ハイブリダィゼーシヨンにより形成されたハイプリッドを検出する工程を含む塩基配列の検出方法であって、

D N Aの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅された D N Aが第 1の標識物質により標識されるように第 1の標識物質により標識されており、ノヽィブリダイゼ一ションプローブは第 2の標識物質により標識されるとともに、 D . NAの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイプリダイゼ一シヨンプローブの有する塩基配列は、 DNAの増幅を阻害しないように設定されており、ハイブリヅドの検出は第 1の標識物質および第 2の標識物質を利用してァフィ二ティ一クロマトグラフィーにより行われることを特徴とする。以下、各工程毎に説明す

(1) DNAの増幅

DNAの増幅は、 DN Aポリメラ一ゼを用いて行われるものであれば、特に制限されず、 DN Aポリメラーゼを用いて DNAを合成する段階を含む増幅方法を用いることができる。 DN Aの増幅の方法の例としては、 PCR法、 TMA法、 NASBA法、 LAMP法などが挙げられる。

D N Aポリメラ一ゼにより D N Aを合成する場合には、プライマ一が必要となる。プライマーは、増幅の方法および検出対象塩基配列に依存して公知の方法により設定される。本発明においては、 DN Aの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅された D N Aが第 1の標識物質により標識されるように第 1の標識物質により標識される。

例えば、増幅が PCR法により行われる場合、プライマー対が用いられるが、少なくともその一方を標識することにより、増幅された D N Aが標識されたものとなる。また、 NA SB A法および TMA法により行われる場合には、 DNA合成段階に働くプライマ一を、 LAMP法の場合には、片方のインナ一プライマーを少なくとも標識することにより増幅された D N Aが標識されたものとなる。プライマ一の標識は、 DN Aの合成反応を阻害しないように行われる。このような標識は公知の方法に従って行うことができ、通常にはプライマ一の 5' 末端がネ示れる。

標識に用いられる標識物質は、それに対して生体特異的に結合する物質が存在するものであればよい。このような標識物質と、それに対して生体特異的に結合する物質の組み合わせとしては、抗原と抗体、酵素と阻害剤、糖鎖とレクチン、ホルモンと受容体、金属結合蛋白質と金属元素が挙げられる。具体的には、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体、ピオチンとストレプトアビジンなどの組み合わせが挙げられる。これらの組み合わせにおいて、いずれが標識物質となってもよいが、通常には、分子量の小さい方が、標識物質として用いられる。

用いられるプライマーや D N Aの増幅の条件は、採用する増幅方法および検出対象配列に基づいて適したものが設定される。例えば、 P C R法については、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.), Volume 2， Chapter 8， pp. 8.1-8.126, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001、 N A S B A法については、 PCR Methods and Applications, 1, 25-33 (1991)、 L AM P法については、 Nucleic Acids Research, Vol. 28, No. 12, pp. i-vii (2000)をそれそれ参照できる。

増幅において、錶型となる検体 D NAは、検査試料から通常の方法により調製できる。

検出対象配列は、変異部位を含む検出対象配列が特異的に増幅されるように、増幅の方法に合わせて適宜選択される。検出対象配列が含む変異部位は、通常には、遺伝子変異および遺伝子多型として知られている部位である。変異部位は、点変異でもよいし、揷入、欠失などの変異でもよい。

本発明の検出法の検出対象となる遺伝子変異および遺伝子多型の一般的な例としては、糖原病 la型の日本人患者で高頻度に認められる g727t変異、中鎖ァシル C oA脱水素酵素欠損症の白人患者で高頻度に認められる a985g変異（Lys329Glu変異）、高グリシン血症のフィンランド人患者で高頻度に認められる GLDC遺伝子の gl691t 変異（Ser564Ile変異）、薬剤代謝酵素遺伝子 CYP2C19における遺伝子多型（CYP2 C19*2, g681a) 、アルコール代謝の個人差を決定するアルデヒド脱水素酵素 2の遺伝子多型（E487K) 、嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白質遺伝子の deltaF508欠失変異、ティザックス病の HEXA遺伝子の 1277insTATC挿入変異、乳癌の BRCA1遺伝子の 5382insC挿入変異、乳癌の BRCA2遺伝子の 6174delT欠失変異、血栓症凝固系第 V因子遺伝子の G1691A点変異などが挙げられるが、本発明の検出法の検出対象はこれらの例に限定されない。 ' 糖原病 la型はグリコーゲン代謝経路におけるグルコース- 6-ホスファターゼの異常によって生じ、主として肝臓に大量のグリコーゲンが蓄積する先天性糖代謝異常症で、常染色体劣性遣伝形式をとる。低血糖、肝腫大、低身長、腎障害、高脂質血症、高尿酸血症などが見られる。この酵素遺伝子における g727t変異は、曰本人症例における病囟変異の約 90%を占める高頻度変異であり、 mRNAのスプライシング異常を生じる。ごく最近まで、本症診断には、肝臓組織を用いた酵素活性測定が行われていたが、遺伝子診断の出現によって肝生検が不要となった。本変異の日本人集団における保因者数は、約 200人に 1人である。

非ケトーシス型高グリシン血症はグリシン解裂系酵素の異常によって生じ、新生児期にけいれんをはじめとする重篤な神経症状を呈する先天性ァミノ酸代謝異常症（常染色体劣性遺伝）である。フィンランド人患者では、グリシン解裂系酵素のうち GLDC遺伝子に gl69It変異が高頻度（変異遺伝子の約 70%) に認められる。本変異はアミノ酸置換 Ser564Ileを生じる。

中鎖ァシル CoA脱水素酵素欠損症は脂肪酸/?酸化経路において重要な役割を担う酵素 (medium-chain acyl-CoA dehydrogenase, MCAD) の異常によって生じ、空腹 ·感染時の低血糖 ·意識障害をひきおこす先天性有機酸代謝異常症（常染色体劣性遺伝）である。しばしば、乳幼児突然死症候群や急性脳症（ライ症候群）と誤診されることが知られている。本酵素遺伝子における a985g変異は白人症例における病因変異の約 90%を占める高頻度変異であり、アミノ酸置換 Lys329Ghi をひきおこす。また、本遺伝子変異の保因者は、白人集団で高率（英国では 40人に 1人）に認められる。欧米では、この a985g変異を検出する遺伝子診断が本症の診断に広く用いられている。

CYP2C19遺伝子は、オメプラゾ一ル（胃酸分泌抑制剤）などの代謝に重要な役割を果たしている。本遺伝子上の SNP多型である CYP2C19*2は、ェキソン 5の 681G >A変異によってスプライシング異常を生じるため、これらの薬剤の代謝活性を低下させる。このような多型を持つ人（poor metabolizer) では、投薬にあたって減量するする必要があり、投薬前に予め遺伝子型を決定できれば、臨床的に有利である。日本人集団における遺伝子の約 23%に、この遺伝子多型が認められる。アルデヒド脱水素酵素 2の遺伝子多型（Glu487Lys) は、東洋人に多く認められる SNPで、アルコール代謝の個人差を決定する。遺伝子多型を有する酵素は活性が低く、アルコールから生じるァセトアルデヒドの代謝が遅くなるため、「酒に弱い」体質となる。日本人集団では約 30%がこの遺伝子多型のへテロ接合子、約 5 %がホモ接合子である。

( 2 ) ハイブリダィゼ一シヨン

増幅された D N Aと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイプリダイゼ一シヨンプローブとのハイブリダイゼ一シヨンは、特定のハイブリダィゼーションプローブが使用される他は、通常のハイブリダイゼーシヨンと同様に行えばよい。

本発明で使用されるハイブリダィゼ一シヨンプロ一ブは、第 2の標識物質により標識され、 D N Aの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイブリダィゼ一シヨンプローブの有する塩基配列は、 D N Aの増幅を阻害しないように設定される。

第 2の標識物質は、第 1の標識物質と異なる物質が用いられる他は、第 1の標識物質について説明したのと同様である。ハイプリダイゼ一シヨンプロ一ブの標識は、ハイブリダイゼ一シヨンを妨げないように公知の方法により行うことができる。ハイブリダィゼ一シヨンプローブの標識は、 3，末端に行うことが好ましレ、。これにより D N Aの増幅反応中のオリゴヌクレオチドの鎖長の進展を防止するためである。鎖長の進展があった場合は Tm値が上昇し、たとえミスマッチがあつてもハイブリダィズしてしまうおそれがある。

ハイブリダイゼ一シヨンプロ一ブの塩基配列を、 D N Aの増幅を阻害しないように設定することは、通常には、ハイブリダィゼーシヨンプローブのハイブリダィゼ一シヨンが D N Aの増幅の条件では生じないようにハイブリダィゼーシヨンプローブの鎖長などを設定することにより行うことができる。

本発明で使用されるハイプリダイゼーシヨンプローブの塩基配列は、 D N Aの増幅を阻害しないように設定されるので、 D N Aの増幅が行われる反応液に最初から含ませておくことができる。このため、 D N Aの増幅が終了した反応液を、そのまま、増幅された D N Aとハイプリダイゼーシヨンプローブとがハイプリダィズするような条件におくことにより、これらをハイプリダイズさせることができる。

ハイブリダイゼ一ションプローブの鎖長や、ハイブリダイズさせるときの条件は、 D NAの増幅に用いる方法に応じて適宜設定される。 D N Aポリメラ一ゼを用いる D N Aの増幅では、 D N Aポリメラーゼの活性が発揮されるのに適した温度条件で増幅が行われるので、この温度でハイプリダイゼ一シヨンが生じないように鎖長が設定される。また、ハイブリダィゼーシヨンが起こる温度は、 D N A の増幅を妨げない限り、特に限定されないが、生成したハイブリッドが室温で解離しないものであることが好ましい。

D N Aの増幅を阻害しないように塩基配列を設定する条件として具体的には、プライマーの Tm値に比べて、プロ一ブの Ta^直が 2 5〜4 0 °C (好ましくは 3 0〜 3 5 °C) 低くなるように設定することが挙げられる。

例えば、 P C R法の通常の条件を考慮すると、プローブは、通常には、 lOmer 〜13merとなる。これは、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダィゼーシヨンのプローブとして、従来用いられている 15mer〜25mer (上記非特許文献 2参照）に比較してかなり短いものである。これまで、より長い鎖長のプローブが多用されてきた背景には、全ゲノム配列（30億塩基対）の中で、 4種塩基の組み合わせによる特異性を持ったプローブを作成するためには、少なくとも 4の 15乗くらいが必要であるという論理があった。しかしながら、これは全ゲノム配列を対象にハイブリダイゼ一ションを行う場合であり、 PCR増幅された数百塩基の DNA断片を標的とする場合は、これほどの長さと特異性は要求されないと考えられるので、ハイプリダイゼーションの特異性は十分に維持される。

本発明の検出法を、任意の遺伝子変異や多型の検出に応用するにあたっては、ハイプリダイゼーシヨンプローブを最適の鎖長にすることが必要である。これは、後述の実施例に記載されているように定型的な実験により決定することが可能である。本発明の検出法では、通常、極めて短いプローブを用いることから、 1塩基長の差によつて劇的な判定線形成の違いが認められる。偽陽性の出現や微弱な陽性反応が認められた場合には、 Tm値をもとに設計したプローブよりも短いプローブあるいは長いプローブを作成し、最適のものを選択することが好ましい。この際、正常塩基配列プローブと変異塩基配列プローブでは、同じ鎖長でも塩基置換によって Tm値が異なるため、それぞれに最適な鎖長を独立して設定すべきである。

ハイプリダイゼーシヨンプローブの塩基配列は、変異部位がその中央付近となるように設定することが好ましい。

ハイブリダィゼ一シヨンは、通常には、温度を二本鎖 D N Aが変性するまで上昇させ、徐々に低下させることによって行なわれる。従って、 D N Aの増幅が終わった反応液の温度を変化させる操作のみでハイブリダィゼーシヨンを行うことができ、その他の操作が不要である。プログラム可能なサ一マルサイクラ一により D N Aの増幅を行う場合には、 D N Aの増幅に必要な温度条件に加えて、ハイブリダイゼ一ションの温度条件もプログラムしておくことにより、試料をサーマルサイクラ一にセットした後は、一連の反応として、増幅およびハイブリダィゼーシヨンを行うことができる。

上述のように設定された短いプロ一ブを使用することによって、以下の 3つの利点が生じる。 1 ) 一塩基のミスマッチがある場合とない場合の Tm値の差を、長いプローブに比べて大きくすることができ、プローブの特異性を比較的に増加させることができる。 2 ) プローブのハイプリダイゼーシヨン温度は、従来、 37〜 65°Cであるが、本発明の検出方法では、 25°Cと低く設定できるため、その後の一連の操作を室温で行うことができる。 3 ) 短いプローブは Tm値が低く、 PCR反応中はハイブリダィゼ一シヨンしないため、 PCR反応液中にあらかじめ混和しておいても PCR反応に影響を及ぼさない。これによつて、 PCR 熱変性ハイブリダィゼーシヨンを、途中で、試薬の添加などの操作を新たに加えることなく、一連の反応として行うことができる。これらの利点は、 P C R法と同様に DNAポリメラーゼの伸長反応を利用する他の D N A増幅法においても同様に得られる。

( 3 ) ハイプリヅド検出

ハイブリダイゼーシヨンにより形成されたハイブリッドは、第 1の標識物質および第 2の標識物質の両方を有している。ハイブリツドの検出は第 1の標識物質および第 2の標識物質を利用してァフィ二ティークロマトグラフィーにより行われる。

ァフィ二ティ一クロマトグラフィーは、そのために構成された試験片により行うことができる。 2種の標識物質を利用してァフィ二ティークロマトグラフィーによりハイプリッドを検出することは公知の方法に従って行うことができ、このような方法で使用される試験片も通常の方法に従って構成することができる。このような試験片の例としては、集積したときに可視的な標識物質（例えば金コロイド）を結合した、第 1の標識物質に対して特異的に結合する物質と、ハイプリツドとを反応させ、第 2の標識物質に対して特異的に結合する物質を固定したクロマト担体上を移動させ、その固定部位に集積した可視的な標識物質を観察できるように構成された試験片が挙げられる。このような試験片自体は、これまでにも特定遺伝子を簡便に検出する方法などに用いられている（J. Clin. Microbiol. 38: 2525-2529, 2000)。

以下、第 1の標識物質がジゴキシゲニン、第 2の標識物質がピオチン、集積したときに可視的な標識物質が金コ口ィドである場合を例にとって具体的な例を説明する。クロマト担体のストリップに、クロマト溶媒に浸潰されることによりク口マト溶媒を供給する浸漬部位、クロマト溶媒中に、金コロイドを結合した抗ジゴキシゲニン抗体を遊離し得るようにこの抗体（複合体）を保持するパッドを付与した複合体保持部位、ハイブリッドを含む反応液を適用する試料適用部位、ストレブトアビジンをクロマト溶媒の移動方向に対して垂直に線状に固定したストレプトアビジン固定部位、抗ジゴキシゲニン抗体に対する抗体を固定した抗体固定部位、および、クロマト溶媒を吸収するパッドを付与した吸収部位が、クロマト溶媒（通常には緩衝液）の移動方向においてこの順に設けられる。この例の試験片の使用方法について説明する。ハイブリツドを含む反応液を試料適用部位に適用し、浸漬部位をクロマト溶媒に浸漬した後、クロマト溶媒から試験片を取り上げ静置する。クロマト溶媒は、クロマト担体を毛細管現象により移動し、複合体保持部位に達すると複合体を含むクロマト溶媒が移動する。このクロマト溶媒が試料適用部位に達すると適用された反応液中のハイプリッドの有するジゴキシゲニンと複合体の抗ジゴキシゲニン抗体が結合し、金コロイドを有するハイプリッドが形成され、クロマト媒体によりさらにクロマト担体上を移動する。ハイブリッドがストレブトアビジン固定部位に達すると、ピオチンとストレブトァビジンとの結合により、このハイブリヅドがストレブトァビジン固定部位に集積されるので、ハイブリッドが存在すれば、可視的な信号が現れる。ストレブトァビジン固定部位を通過した複合体は、抗体固定部位に集積され、クロマトグラムが正常に進んだことを示す可視的な信号が現れる。さらに移動したクロマト溶媒は、吸収部位に吸収 ·保持される。

本発明の検出法において、変異部位が点変異である場合には、ハイブリダィゼ —シヨンプロ一ブと共に、増幅された D N Aと標識されたハイプリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションの特異性を高めるのに十分な量の、標識されたハイプリダイゼ一シヨンプローブの塩基配列と点変異の位置で 1塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチド（以下、「競合プロープ」ともいう）をさらに D N Aの増幅を行う反応液に含ませることが好ましい。競合プローブは、ハイプリダイゼ一シヨンプローブと点変異の位置で 1塩基異なる他は、ハイプリダイゼーシヨンプローブと同様に設定される。競合プローブはハイプリダイゼーシヨンプローブと長さが異なっていてもよい。

増幅された D N Aと標識されたハイプリダイゼーシヨンプローブとのハイプリダイゼ一シヨンの特異性を高めるのに十分な量は、検出対象塩基配列、ハイプリダイゼーシヨンプローブの塩基配列などの条件により変化するが、通常には、ハィプリダイゼ一シヨンプローブの等量〜 5倍量（モル比）を基本としてよいと思われる。しかしながら、陽性反応を著しく減ずるときは、偽陽性反応が出現しないことを確認したうえで競合プローブを省略する方が最適の結果が得られる場合がある。ハイブリダイゼーションプローブの鎖長と競合プローブの有無が判定線の形成に著しい影響を及ぼすことから、比較的容易に至適反応条件を見出すことができるものと考えられる。

ハイプリダイゼ一シヨンに際して、非標識の競合ォリゴヌクレオチドを加えることによりハイプリダイゼーションプローブの特異性を増し、非特異的なハイブリダイゼ一ションを抑制することができる。

本発明の検出法においては、正常塩基配列検出用ハイプリダイゼ一シヨンプロ —ブと変異塩基配列検出用ハイプリダイゼーシヨンプローブの標識に異なる標識物質を用い、正常塩基配列検出用の反応系と変異塩基配列検出用の反応系の 2つを 1つに統合してもよい。すなわち、正常塩基配列検出用ハイプリダイゼーションプローブと変異塩基配列検出用ハイプリダイゼーシヨンプローブに異なった標識をしておき、 1 ： 1の比で混合して互いに競合させながら反応系を一つにまとめることが可能である。反応後、それぞれの標識に対して特異的に結合する物質と、集積したときに可視的な標識との複合体でァフィ二ティ一クロマトグラフィ一を行って遺伝子型を判定する。

本発明の検出法は、次のような利点を有する。（ 1 ) 汎用性：検出法として長年にわたって汎用されてきたアレル特異的オリゴヌクレオチドハイプリダイゼ一シヨンを基にしているため、点変異はもちろんのこと、挿入 ·欠失などの塩基配列を伴う広範な変異の検出に対応できる。（2 ) 迅速性：サーマルサイクラ一により実施できる増幅およびハイブリダイゼ一ションの反応が終わつてから、遺伝子型の判定まで 1 0分以内に実施することができる。核酸増幅にキヤビラリー夕ィプの PCR増幅装置を用いることにより、 DNA検体があれば 1時間以内に全工程を終了することも可能である。（3 ) 簡便性： PCR反応後は、肉眼で遺伝子型を判定することができるため、ゲル電気泳動装置や蛍光検出装置などの機器を必要としない。 PCR反応を行うサ一マルサイクラ一は、感染症検査などに用いられる汎用臨床検査機器であり、すでに多くの病院に設置されている。また、反応操作は簡便であり、特殊な技能を要しない。上記の利点は、 PCR以外の核酸増幅反応（T MA、 NASBA_S LAMPなど）を用いた場合にも得られる。

本発明の検出法の原理を、 P C Rの場合を例として、図 1〜3を参照してさらに詳しく説明する。

図 1は正常 DNAを検体として用いた場合の反応を示す。反応系 1は正常塩基配列検出用ハイブリダイゼーションプローブを添加した系で、反応系 2は変異塩基配列検出用ハイブリダィゼーシヨンプローブを添加した系である。図中、黒丸は正常塩基、黒三角は変異塩基、 Digはジゴキシゲニン標識、 Bはピオチン標識、 GP は金粒子を意味する。

まず、点変異箇所を含む遺伝子部位（検出対象配列）を P C Rによって増幅する。このときに用いる 1対の P C Rプライマ一のうちの一方は、その 5，端をあらかじめジゴキシゲニンで標識したものを用いる。 P C R反応液中には、通常の成分に加えて、さらに 2種のオリゴヌクレオチド（ハイプリダイゼ一シヨンプロ —ブおよび競合プローブ）を混和しておく。このオリゴヌクレオチドの組み合わせには、正常塩基配列検出用のものと変異塩基配列検出用のものの 2種類が存在する。正常塩基配列検出用の組み合わせでは、その一方が正常塩基配列の点変異部位を中央部にもち、かつ 3，端をビォチン標識したオリゴヌクレオチド（正常プローブ）であり、他方が、変異塩基配列の点変異部位を中央部にもつ非標識の競合オリゴヌクレオチド（変異プローブ）である。変異塩基配列検出用の組合わせでは、その一方が、変異塩基配列の点変異部位を中央部にもち、かつ 3 ' 端をピオチン標識したオリゴヌクレオチド（変異プローブ）であり、他方が正常塩基配列の点変異部位を中央部にもつ非標識の競合ォリゴヌクレオチド（正常プローブ）である。いずれのオリゴヌクレオチドも、ジゴキシゲニンで標識した P C Rプライマーとは逆鎖になるように設計する。

P C R反応液の組成は、例えば、検体 D N A 50〜100 ng、 10 mM Tris-HCl (p H 8.3 )、 50 mM KC1、 1.5 mM MgCl ₂、各 250 zMの dNTP、 1 zM PCRフォワードブライマ一（5，端をジゴキシゲニン標識）、 1〃M PCRリバ一スプライマ一、 600 nM ハイブリダィゼ一シヨンプローブ（3，端をピオチン標識）、 3〃M競合非標識オリゴヌクレオチド、 1.25 U Taq DNAポリメラ一ゼとし、反応液量は 20〃1とする。 P C Rの条件は、例えば、まず 94°Cで 2分間加熱し、 98°C10秒— 55°C30秒— 72°C30秒のサイクルを 35回繰り返した後、 72°C 3分、 98°C 3分、 65°C 1分、 55°C

1分、 45°C 1分、 35°C 1分、 25°C 1分とする。サイクルを繰り返した後のこの過程で、ジゴキシゲニンで標識された PCR産物の持つ塩基配列に完全に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがハイブリダィズする。例えば、正常塩基配列を持つ D N Aに対して正常塩基配列検出用のオリゴヌクレオチドを組み合わせた場合は、ジゴキシゲニンで標識された PCR産物とピオチンで標識されたオリゴヌクレオチドのハイブリッドが形成される（図 1、反応系 1 ) 。この溶液 5〃1 を DNA Detection test strip (ロシュ社、 #卜 965- 484) などの、ストレプトアビジンが固定され、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体を展開可能に保持するァフィニティークロマト試験片の試料適用部位にスポットし、下端をバッファーに 5秒間浸し、室温のままで 5分間放置してバッファーを展開すると、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体がジゴキシゲ二ン標識 PCR産物—ピオチン標識オリゴヌクレオチドのハイプリッドに結合し、このハイプリヅドがさらに試験片に固定されたストレブトアビジンに捕捉され、赤いラインを形成するのを肉眼的にとらえることができる。一方、正常塩基配列を持つ D N Aに対して変異塩基配列検出用のオリゴヌクレオチドを組み合わせた場合は、ジゴキシゲニンで標識された PC R産物と非標識オリゴヌクレオチドのハイプリッドが形成される。この溶液を試験片の試料適用部位にスポットしてバッファーで展開すると、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体がジゴキシゲニン標識 PCR産物一非標識ォリゴヌクレオチドのハイプリヅドに結合するものの、このハイプリヅドは試験片上のストレプトァビジンに捕捉されないため、赤いラインを形成しない（図 1、反応系 2 ) 。以上のように 2種類の反応系のそれぞれにおける赤いラインの形成を肉眼的に観察することにより、検体となる DNAの遺伝子型を判定することが可能となる。変異塩基配列を持つ DNAにおいても、同様の反応原理である（図 2 ) 。

この態様の操作手順を図 3に示す。まず、検体とする DNAと反応試薬を PCRチュ —ブ内で混和し、サーマルサイクラ一でプログラムに従い過熱 '冷却を行って DN Aの增幅およびハイブリッド形成を行う（ステップ 1 ) 。反応液から 5〃1をとつて、試験片の試料適用部位にスポットし、試験片の下端をバッファーに浸した後、室温に放置する（ステップ 2 ) 。 5分後、遺伝子型判定ラインの有無によって判定を行う（ステップ 3 ) 。ァフィ二ティ一クロマトグラフィーが正常に完了したか否かはコントロールラインの有無によって確認できる。

本発明の検出法は、遺伝子変異の有無を迅速かつ簡便に、そして特別な装置を用いずに確実に判定できる方法であり、病院の外来診療やべッドサイドで遺伝子検査を行うのに適している。すなわち、ポイント ·ォプ，ケアとしての遺伝子診断を可能にするものである。具体的には、 CYP2C19をはじめとする薬物代謝酵素の遺伝子多型を判定し、ある薬剤がその患者にとって適切かどうかをその場で判定したり、処方量の調整に役立てたりすることが可能である。この場合、短時間に検査結果が得られることが重要な利点となる。

< 2 >本発明のキット

本発明のキットは、 D N Aポリメラ一ゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含む D N Aの増幅を行うためのプライマーと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイプリダイゼ一シヨンプローブと、ァフィ二ティ一クロマトグラフィー用試験片とを含むキッ卜であって、

D N Aの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅された D N Aが第 1の標識物質により標識されるように第 1の標識物質により標識されており、ハィプリダイゼーシヨンプロ一プは第 2の標識物質により標識され、ハイプリダイゼーシヨンプローブの有する塩基配列は、 D N Aの増幅を阻害しないように設定されており、試験片は第 1の標識物質および第 2の標識物質を利用して増幅された D N Aとハイプリダイゼ一シヨンプローブとのハイプリッドを検出できるものであることを特徴とする。本発明のキットは、本発明の検出法を実施するために使用できる。

プライマ一、ハイプリダイゼーシヨンプロ一ブ、および、ァフィ二ティーク口マトグラフィ一用試験片は、本発明の検出法に関し上記に説明した通りである。本発明のキットは、変異部位が点変異である場合には、標識されたハイブリダィゼ一シヨンプローブの塩基配列と点変異の位置において 1塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチド（競合プロ一ブ）をさらに含むことが好ましい。このオリゴヌクレオチドは、本発明の検出法に関し上記に説明したとおりである。実施例

次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによつて本発明の範囲が何ら限定されるものではない。

実施例 1 糖原病 la型 g727t変異の検出

( 1 ) 反応系および操作手順

糖原病 la型 g727t変異の検出のため、変異部位の周辺の既知の塩基配列に基づき、表 1に示すプライマーを調製した。表 1

糖原病 la型 g727t変異検出用のプライマ一およびプローブ

PCRフォワードプライマ一（G6P- E5- IF- Dig)

5， -D ig-CCCAAATCCTTCCTATCTCTCACAG-3⁵ (配列番号 1 )

PCR Uバースプラィマ一（G6P-E5- 1R(20) )

5' -TGCTGGAGTTGAGAGCCAGC-3⁵ (配列番号 2 ) また、プローブの鎖長の検討のため、ハイブリダィゼ一シヨンプローブおよび競合プローブとして表 2に示すォリゴヌクレオチドを調製した。表 2

1 ) 正常塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド

17mer: 5' -AAGCTGAACAGGAAGAA-Biotin-3⁵ (配列番号 3 )

15mer: 5⁵ -AGCTGAACAGGAAGA-Biotin-3' (配列番号 4 )

13mer : 5' -GCTGAACAGGAAG-Biotin-3' (配列番号 5 )

llmer: 5' -CTGAACAGGAA-Biotin-3⁵ (配列番号 6 )

2 ) 正常塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド

17mer: 5' -AAGCTGAAAAGGAAGAA-3⁵ (配列番号 7 )

15mer: 5' -AGCTGAAAAGGAAGA-3' (配列番号 8 )

13mer: 5' -GCTGAAAAGGAAG-3' (配列番号 9 )

llmer: 5' -CTGAAAAGGAA-3' (配列番号 1 0 )

3 ) 変異塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド

17mer: 5' -AAGCTGAAAAGGAAGAA-Biotin-3⁵ (配列番号 1 1 )

15mer: 5' -AGCTGAAAAGGAAGA-Biotin-3⁵ (配列番号 1 2 )

13mer: 5⁵ -GCTGAAAAGGAAG-Biotin-3' (配列番号 1 3 )

llmer: 5' -CTGAAAAGGAA-Biotin-3' (配列番号 1 4 )

4 ) 変異塩基配列検出用非標識競合ォリゴ

17mer: 5' -AAGCTGAACAGGAAGAA-3' (配列番号 1 5 )

15mer: 5⁵ -AGCTGAACAGGAAGA-3⁵ (配列番号 1 6 )

13mer: 5' -GCTGAACA6GAAG-3⁵ (配列番号 1 7 )

llmer : 5' -CTGAACAGGAA-3⁵ (配列番号 1 8 )

P C R反応液の組成は、検体 D N A 50-100 ng、 10 mM Tris-HCl (pH 8. 3)、 50 mM KCK 1.5 mM MgC , 各 250〃Mの dNTP、 1〃M PCRフォワードプライマ一、 1 j PCRリバースプライマー（5，端をジゴキシゲニン標識）、 600 nMハイプリダイゼーシヨンプローブ（3，端をピオチン標識）、所定濃度の競合非標識オリゴヌクレオチド、 1.25 U Taq MAポリメラーゼとし、反応液量は 20〃1とした。 P C Rの条件は、まず 94°Cで 2分間加熱し、 98°C10秒一 55°C30秒一 72°C30秒のサイクルを 35回繰り返した後、 72°C 3分、 98°C 3分、 65°C 1分、 55°C 1分、 45°C 1 分、 35°C 1分、 25°C 1分とした。

この溶液 5〃1を試験片（DNA Detection Test Strip、ロシュ社、 # 965- 484、ストレプトアビジンが固定され、金コロイド標識抗ジゴキシゲニン抗体を展開可能に保持するァフィ二ティーク口マト試験片）の試料適用部位にスポットし、下端をバッファーに 5秒間浸し、室温のままで 5分間放置してバッファーを展開した。放置後、遺伝子型判定線の有無を肉眼的に判定した。

( 2 ) 非標識オリゴヌクレオチドによる競合の検討

標識ハイプリダイゼーシヨンプローブを 17merとし、競合プローブを反応液中に添加せずに検出を行った。検体とする D N Aは g727アレルのホモ接合子（正常 DNA) と t727アレルのホモ接合子（変異 DNA) を用い、ハイプリダイゼーシヨンプローブとしては正常塩基配列検出用のものと変異塩基配列検出用のものを用いた。結果を図 4に示す。図中、 DNAに関する Wtおよび Mutはそれそれ正常 DNAおよび変異 DNAを示し、ハイブリダィゼ一シヨンプロ一ブに関する Wtおよび Mutはそれそれ正常塩基検出用および変異塩基配列検出用を示す（以下の図 5〜 7においても同様である）。

いずれの組み合わせでも赤い反応ラインが認められる偽陽性が出現し、遺伝子型を決定することができなかった（図 4、レーン 1〜4 ) 。

競合プローブ（17mer )を反応液中にハイブリダイゼーシヨンプローブの 5〜 5 0倍量（モル濃度）添加して同様の実験を行った。結果を図 5に示す。

競合プローブの添加により偽陽性の反応が著しく減少した。すなわち、正常 DN Aに対する変異塩基配列検出用プローブの反応系（図 5、レーン 6〜8 ) および変異 DNAに対する正常塩基配列検出用プローブの反応系（同、レーン 1 0〜1 2 ) において、ごくわずかな赤い反応ラインを認めるのみであった。偽陽性反応の抑制効果はいずれの添加量においても差異を認めず、 5 0倍量の添加でも偽陽性の反応を完全に抑制することはできなかった。一方、 2 5〜5 0倍量の添加では、本来の陽性反応を抑制しやや反応ラインが薄くなる傾向を認めた（同、レーン 3、 4、 1 5および 1 6 ) 。

( 3 ) ハイプリダイゼーションプローブの鎖長の検討

ハイブリダィゼーシヨンプロ一ブおよび競合プロ一ブとして 17mer、 15mer、 13 mer、 llmerのものを使用して検討を行った。ここでは、競合プローブの反応液添加量をハイブリダィゼーシヨンプローブの 3 0倍に固定した。結果を図 6に示す。正常 DNAに対する変異塩基配列検出用プローブの反応系において、 15merではわずかな偽陽性が出現し（図 6、レーン 4 ) 、 13merと llmerでは消失した（同、レーン 5および 6 ) 。変異 MAに対する正常塩基配列検出用プロープの反応系では、 15mer、 13mer、 llmerのいずれにおいても偽陽性は消失した（同、レーン 7〜9 ) 。しかしながら、 llmerでは本来の陽性反応が減弱する傾向を認めた（同、レーン 3および 1 2 ) 。

以上の検討に基づいて、ハイプリダイゼ一シヨンプローブおよび競合プローブの鎖長を 12mer (表 3 ) とし、競合プローブの添加量を 5倍として、正常 DNA (g7 27アレルのホモ接合子）、保因者 DNA (g727アレルと t727アレルのヘテロ接合子）、患者 DNA (t727アレルのホモ接合子）を対象に、上記のように検出を行った。結果を図 7に示す。

遺伝子型と完全に一致する結果が得られ、十分な陽性の反応ラインが観察された（図 7、レーン 1および 4並びに 5および 6 ) —方、偽陽性はまったく認められなかった（レーン 2および 3 ) 表 3

正常塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド（GSD727- AS0- W12-Bio) 5' -GCTGAACAGGAA-Biotin-3' (配列番号 1 9 )

正常塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド（GSD727-AS0- M12)

5' -GGTGAAAAGGAA-3⁵ (配列番号 2 0 )

変異塩基配列検出用ビォチン標識ォリゴヌクレオチド（GSD727- ASO- M12-Bio) 5⁵ -GCTGAAAAGGAA-Biotin-3⁵ (配列番号 2 1 )

変異塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド（GSD727- AS0-W12)

5' -GCTGAACAGGAA-3' (配列番号 2 2 ) 実施例 2 中鎖ァシル CoA脱水素酵素欠損症の a985g変異、高グリシン血症 GLDC 遺伝子の gl691t変異、薬剤代謝酵素遺伝子 CYP2C19の g681a、アルデヒド脱水素酵素 2の Glu487Lys多型の点変異の検出

中鎖ァシル CoA脱水素酵素欠損症の a985g変異、高グリシン血症 GLDC遺伝子の gl 691t変異、薬剤代謝酵素遺伝子 CYP2C19の g681a、アルデヒド脱水素酵素 2の Glu4 87Lys多型の点変異について、本発明の検出法による点変異の検出を行った。それそれの点変異の存在部位を含む塩基配列を増幅する PCRプライマーは、 PCR 反応におけるァニール温度が 55°Cで増幅が行えるように、鎖長を調節した。また、ハイブリダィゼ一シヨンプロ一ブは、 Tm値が 35〜40°Cとなるように設計した。結果として、鎖長は、 10mer〜15inerとなった。プライマ一、ハイブリダィゼ一ションプロープぉよび競合プロ一ブの塩基配列を表 4に示す。表 4

1 ) 中鎖ァシル CoA脱水素酵素欠損症遺伝子 a985g変異検出用のプライマ一およびプロ一ブ

PCRフォワードプライマ一（Dig- MCAD- F1 )：

5， -Dig-CTTTTTAATTCTAGCACCAAGCAATATC-3' (配列番号 2 3 )

PCRリバースブラィマ一（Dig- MCAD-R1 )：

5， -D ig-TCCAAGTATCTGCACAGCAT-3⁵ (配列番号 2 4 )

正常塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド（Bio- MCAD985- W13)

5' -GCAATGAAAGTTG-Biotin-3' (配列番号 2 5 )

正常塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド（MCAD985-M13)

5' -GCAATGGAAGTTG-3' (配列番号 2 6 )

変異塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド（Bio- MCAD985- M12) 5⁵ -AACTTCCATTGC-Biotin-3' (配列番号 2 7 )

変異塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド（MCAD985-W12)

5⁵ -AACTTTCATTGC-3' (配列番号 2 8 ) 表 4 (続き）

2 ) GLDC遺伝子 gl691t変異検出用のプライマ一およびプローブ

PCRフォワードプライマ一（Dig- GLDC-F )

5' -Dig-GTCTCTTGGTCCTACCTAATA-3⁵ (配列番号 2 9 )

PCRリバ一スプライマ一（ GLDC- R )

5⁵ -TTAGTGAAGCTAGAACACTG-3⁵ (配列番号 3 0 )

正常塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド（Bio-S564I- W13)

5' -GACGAACTGTTCA-Biotin-3' (配列番号 3 1 )

正常塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド（S564I-M13)

5' -GACGAAATGTTCA-3' (配列番号 3 2 )

変異塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド（Bio- S564I - M) 5' -GACGAAATGTTCA-Biotin-3' (配列番号 3 3 )

変異塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド（S564I-W)

5⁵ -GACGAACTGTTCA-3' (配列番号 3 4 )

3 ) CYP2C19遺伝子 CYP2C19*2多型検出用のプライマーおよびプロ一ブ PCRフォヮ一ドプライマ一（CYP2C19- P1 )

5' -AATTACAACCAGAGCTTGGC-3⁵ (配列番号 3 5 )

PCRリバースプラィマー（Dig- CYP2C19- P2)

5' -Dig-AATATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3⁵ (配列番号 3 6 )

正常塩基配列検出用ビォチン標識ォリゴヌクレオチド（Bio- CYP2C19 - W)

5' -TCCCGGGAAC-Biotiii-3' (配列番号 3 7 )

正常塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド（CYP2C19 - M)

5' -TTCCCAGGAAC-3' (配列番号 3 8 ) '

多型塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド（Bio-CYP2C19 - M) 5' -TTCCCAGGAAC-Biotin-3⁵ (配列番号 3 9 )

多型塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド（CYP2C19- W) 5' -TCCCGGGAAC-3' (配列番号 4 0 )

表 4 (続き）

4 ) アルデヒド脱水素酵素 2遺伝子多型検出用のプライマ一およびプローブ

PCRフォヮ一ドプライマ一 (Dig- ALDH2- AF )

5³ -D ig-CAAATTACAGGGTCAACTGCTATGA-3' (配列番号 4 1 )

PCRリバースブラィマ一（Dig- ALM2- AR2 )

5' -D ig-AGCAGGTCCTGAACTTCCAGCAG-3⁵ (配列番号 4 2 )

正常塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド（Bio- ALDH2- PW2 )

5， -B iot in-ATACACTGAAGTGA-B iot in-3' (配列番号 4 3 )

正常塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド（ALDH2- CM2)

5' -ATACACTAAAGTGA-3' (配列番号 4 4 )

多型塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド（Bio- ALDH2- PM2 )

5' -Biotin-ATACACTAAAGTGAA-Biotin-3' (配列番号 4 5 )

多型塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド（ALDH2- CW2)

5' -ATACACTGAAGTGAA-3' (配列番号 4 6 ) 上記プライマ一およびプローブを用いることの他の PCRの条件やプロ一ブの濃度等の条件は、上記のいずれの変異の検出においてもすべて実施例 1と同じであつた。

これらの条件下で、検出を行ったところ、全ての検出系において正しい遺伝子型の判定が可能であった（図 8の a、 b、 cおよび d ) 。アルデヒド脱水素酵素 2の Glu487Lys多型検出においては、変異塩基配列を検出するための反応系において反応ラインが薄いため、競合非標識ォリゴヌクレオチドを反応系に混和しないようにしたところ、十分な反応ラインの形成が観察された。いずれの反応においても、偽陽性は認められなかった。

サーマルサイクラ一における反応が終了してから、遺伝子型判定までに要する時間は 1 0分以内であった。また、この試験片をそのまま乾燥させたものは、室温に保存した場合、少なくとも 2年後でも肉眼的な判定が可能であった。

以上の結果から、本発明の検出法によって、プライマ一ならびにハイブリダィゼ一シヨンプロ一ブぉよび競合プロ一ブの設計および反応条件は、個々の遺伝子変異に応じて若干の調整が必要であるものの、 5つの遺伝子における各変異 ·多型を、簡便 *迅速に検出し、検体 DNAの遺伝子型を確定できることが示された。従って、本発明の検出法は汎用性を持つものであると認められる。実施例 3 嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白質遺伝子の deltaF508欠失変異、ティザックス病の HEXA遺伝子の 1277insTATC挿入変異、乳癌の BRCA1遺伝子の 5382in sC挿入変異、乳癌の BRCA2遺伝子の 6174delT欠失変異、血栓症凝固系第 V因子遺伝子の G1691A点変異の検出

嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白質遺伝子の deltaF508欠失変異、ティザックス病の HEXA遺伝子の 1277insTATC挿入変異、乳癌の BRCA1遺伝子の 5382insC挿入変異、乳癌の BRCA2遺伝子の 6174delT欠失変異、血栓症凝固系第 V因子遺伝子の G1691A 点変異について、本発明の検出法による変異の検出を行った。

それぞれの変異の存在部位を含む塩基配列を増幅する PCRプライマーは、 PCR反応におけるァニール温度が 55°Cで増幅が行えるように、鎖長を調節した。また、ハイブリダィゼ一シヨンプローブは、 Tm値が 35〜40°Cとなるように設計した。結果として、鎖長は、 10mer〜15merとなった。プライマ一、ハイプリダイゼーションプローブおよび競合プローブの塩基配列を表 5に示す。なお、 1 )〜4 ) はいずれも塩基の欠失又は挿入の変異であるため、競合プローブは用いなかった。また、 3 ) ~ 5 ) は、ヘテロ接合子でも症状を示すため、臨床的には正常塩基配列を持つ遺伝子の有無を調べる必要がないので、正常塩基配列検出用プロ一プは用いなかった。表 5

1 ) 嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白質遺伝子 deltaF508欠失変異検出用のブライマ一およびプロ一ブ

PCRフォヮ一ドプライマ一

5， -ATTATGCCTGGCACCATTAAAG-3' (配列番号 4 7 )

PCRリバースプライマー

5' -Dig-CATTCACAGTAGCTTACCCA-3' (配列番号 4 8 )

正常塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド

5， -AATATCATTGGTGTT-Biotin-3' (配列番号 4 9 )

変異塩基配列検出用ビォチン標識ォリゴヌクレオチド

5' -TATCATCTTTGGTG-Biotin-3' (配列番号 5 0 ) 表 5 (続き）

2 ) ティザヅクス病の HEXA遺伝子の 1277insTATC挿入変異検出用のプライマーおよびプローブ

PCRフォワードプライマ一

5' -CCAGGAATCTCCTCAGCTTTGTGT-3' (配列番号 5 1 )

PCRリバースプライマ一

5' -Dig-AGCCTCCTTTGGTTAGCAAGG-3⁵ (配列番号 5 2 )

正常塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド

5' -TATATCTATCCTATG-Biotin-3' (配列番号 5 3 )

変異塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド

5' -GTATATCCTATGG-Biotin-3⁵ (配列番号 5 4 )

3 ) 乳癌の BRCA1遺伝子の 5382insC揷入変異検出用のプライマーおよびプローブ

PCRフォヮ一ドプライマ一

5⁵ -CTTTCAGCATGATTTTGAAGTC-3' (配列番号 5 5 )

PCRリバ一スプライマ一

5⁵ -Dig-GGGAGTGGAATACAGAGTGG-3⁵ (配列番号 5 6 )

変異塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド

5' -AGAATCCCCAGGA-Biotin-3⁵ (配列番号 5 7 )

4 ) 乳癌の BRCA2遺伝子の 6174delT欠失変異検出用のブラィマーおよびプローブ

PCRフォヮ一ドプライマ一

5， -GATGAATGTAGCACGCATTC-3⁵ (配列番号 5 8 )

PCRリバースプライマ一

5' -Dig-TCTTGTGAGCTGGTCTGAA-3' (配列番号 5 9 )

変異塩基配列検出用ビォチン標識ォリゴヌクレオチド

5' -ACAGCAAGGGAAAAT-Biotin-3⁵ (配列番号 6 0 )

5 ) 血栓症凝固系第 V因子遺伝子の G1691A変異検出用のプライマーおよびプロ一ブ.

PCRフォワードプライマー

5' -GGTTCCAAGTAGAATATTTAAAGAA-3' (配列番号 6 1 )

PCRリバースプライマー

5' -D ig-CCATTATTTAGCCAGGAGACCT-3⁵ (配列番号 6 2 )

変異塩基配列検出用ピオチン標識ォリゴヌクレオチド

5' -ACAGGCAAGGAA-Biotin-3⁵ (配列番号 6 3 )

変異塩基配列検出用非標識競合ォリゴヌクレオチド

5' -ACAGGCGAGGAA-3⁵ (配列番号 6 4 ) 上記プライマ一およびプローブを用いることの他の PCRの条件やプローブの濃度等の条件は、上記のいずれの変異の検出においてもすべて実施例 1と同じであつた o

これらの条件下で、検出を行ったところ、全ての検出系において遺伝子型の判定が可能であった（図 9 ) 。いずれの反応においても、偽陽性は認められなかつた。

以上の結果から、本発明の検出法によって、プライマ一ならびにハイブリダィゼーシヨンプローブおよび競合プローブの設計および反応条件は、個々の遺伝子変異に応じて若干の調整が必要であるものの、挿入，欠失変異を含む変異を、簡便 -迅速に検出し、検体 DNAの遺伝子型を確定できることが示された。従って、本発明の検出法は汎用性を持つものであると認められる。産業上の利用可能性

本発明によれば、通常のサーマルサイクラ一以外に特殊な機器や装置を用いずに、簡便 ·迅速 ·確実に、病因遺伝子変異の同定や、疾患関連遺伝子および薬剤代謝酵素遺伝子の多型の検出を行うことができる。本発明の検出法は、ベッドサィドでの検出を可能にし、オーダ一メイド医療を容易にする手法であると考えられる。

Claims

請求の範囲

1 . D N Aポリメラーゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含む D NAの増幅を行う工程、増幅された D NAと、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイプリダイゼーシヨンプローブとをハイプリダイズさせる工程、および、ハイプリダイゼ一シヨンにより形成されたハイブリッドを検出する工程を含む塩基配列の検出方法であって、

D N Aの増幅に用いるブラィマ一の少なくとも一つは、増幅された D N Aが第 1の標識物質により標識されるように第 1の標識物質により標識されており、ハィブリダイゼ一シヨンプロ一ブは第 2の標識物質により標識されるとともに、 D N Aの増幅が行われる反応液に含まれており、ハイプリダイゼ一シヨンプローブの有する塩基配列は、 D N Aの増幅を阻害しないように設定されており、ハイブリッドの検出は第 1の標識物質および第 2の標識物質を利用してァフィ二ティ一クロマトグラフィーにより行われる前記方法。

2 . 変異部位が点変異であり、 D N Aの増幅が行われる反応液が、増幅された D N Aと標識されたハイプリダイゼーシヨンプローブとのハイブリダイゼ一ションの特異性を高めるのに十分な量の、標識されたハイブリダイゼ一シヨンプロ一プの塩基配列と点変異の位置で 1塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないォリゴヌクレオチドをさらに含む請求項 1記載の方法。

3 . D N Aの増幅が P C I こよる増幅である請求項 1または 2記載の方法。

4 . D N Aポリメラ一ゼを用いて、変異部位を含む検出対象塩基配列を含む D N Aの増幅を行うためのプライマ一と、検出対象塩基配列に相補的である塩基配列を有するハイプリダイゼーションプローブと、ァフィ二ティークロマトグラフィ一用試験片とを含むキッ卜であって、

D N Aの増幅に用いるプライマーの少なくとも一つは、増幅された D N Aが第 1の標識物質により標識されるように第 1の標識物質により標識されており、ハィプリダイゼーシヨンプローブは第 2の標識物質により標識され、ハイプリダイゼ一シヨンプローブの有する塩基配列は、 D N Aの増幅を阻害しないように設定されており、試験片は第 1の標識物質および第 2の標識物質を利用して増幅された D NAとハイブリダイゼ一ションプローブとのハイブリヅドを検出できるものである前言 3キヅト。

5 . 変異部位が点変異であり、標識されたハイブリダィゼ一シヨンプローブの塩基配列と点変異の位置で 1塩基異なる塩基配列を有しかつ標識されていないオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項 4記載のキット。

6 . プライマーが P C R用プライマ一である請求項 4または 5記載のキヅト。