WO2019004195A1 - クロマトグラフィー用のキット、クロマトグラフィー用の展開液、及びクロマトグラフィー - Google Patents

クロマトグラフィー用のキット、クロマトグラフィー用の展開液、及びクロマトグラフィー Download PDF

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彰大 田谷
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    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine

Definitions

  • the present invention relates to a kit for chromatography, a developing solution for chromatography, and chromatography.
  • 8-Oxo-2'-deoxyguanosine 8 oxo 2 'deoxy guanosine, hereinafter sometimes abbreviated as 8 OH d G
  • 8 OH d G 8-Oxo-2'-deoxyguanosine
  • 8OHdG 8 oxo 2 'deoxy guanosine
  • Patent Document 1 JP-A-2010-156639 discloses a system for determining an oxidative stress state using an antibody that specifically reacts with 8OHdG. Specifically, a sample is added to a test kit in which a conjugate in which a gold colloid is bound to an antibody that specifically reacts to 8OHdG is added, and the amount of the conjugate not bound to 8OHdG is determined by color By doing this, 8OHdG is detected.
  • the solution for developing the sample since the solution for developing the sample is not used, it is difficult for the conjugate to reach the position where the amount of the conjugate is to be determined, and it may not be possible to make an accurate determination.
  • Patent Document 2 discloses a method and an apparatus for quantifying 8OHdG concentrated by pretreatment by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • Patent Document 1 discloses separation and concentration using a solution obtained by concentrating 8OH dG using silica gel or ethanol as pretreatment for quantitative determination by HPLC.
  • Patent Document 2 ethanol is used in separation and concentration of 8OH dG, but when the sample is urine, 8 OH dG and uric acid can not be sufficiently separated, and it is difficult to detect 8 OH d G with high accuracy.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and it is an object of the present invention to provide a kit capable of detecting 8OHdG in urine more accurately than in the prior art.
  • the kit for chromatography separates the 8 oxo 2 'deoxy guanosine and the contaminants among the sample, and the introduction portion into which the sample including 8 oxo 2' deoxy guanosine and the contaminants is introduced.
  • the method is characterized in that the rate of development of the 8 oxo 2 'deoxyguanosine by the developing solution is faster than the rate of development of the contaminants by the developing solution.
  • Another chromatography kit includes an introduction unit into which a sample containing a detection target is introduced, a developing solution for separating the detection target among the samples, and the sample containing the developing solution. And a detection unit for detecting the amount or concentration of the detection target contained in the solution obtained by developing the solution, the developing solution comprising methanol, ethanol, propanol and isopropanol And at least one of potassium hydroxide and sodium hydroxide.
  • the developing solution for chromatography according to the present invention contains at least one of alcohol and ether, and an inorganic electrolyte.
  • the chromatography according to the present invention is a chromatography for detecting 8 oxo 2 'deoxy guanosine, which comprises the steps of introducing a sample containing said 8 oxo 2' deoxy guanosine and a contaminant, and developing a developing solution in said sample Thereby separating and extracting 8OHdG from the sample, and detecting the amount or concentration of the separated and extracted 8 oxo 2'-deoxyguanosine.
  • the figure for demonstrating the kit for thin layer chromatography which concerns on embodiment of this invention The figure for demonstrating the method to detect 8OHdG using the kit for thin layer chromatography which concerns on embodiment of this invention.
  • FIG. 1 is an example of thin layer chromatography having a thin layer of support on a plate-like support.
  • the kit according to the present embodiment includes an introducing unit 102 for introducing a sample onto a support 104, a separating unit 103 for separating an object to be detected in the sample and at least a part of the other substances. It has a detection unit 106 for detecting the amount or concentration of an object to be detected.
  • the introduction unit 102 and the detection unit 106 are provided in part of the separation unit 103.
  • a developing solution L to be described later is introduced from the developing solution introducing unit 105, and the sample 101 introduced to the introducing unit 102 starts moving toward the detecting unit 106 by the developing solution L.
  • FIG. 1 shows an example in which the developing solution is held in the holding unit 110, the present invention is not limited thereto, and the developing solution may be introduced into the developing solution introducing unit 105 from the outside.
  • the speed of the sample moving in the separation unit 103 changes depending on the physical properties of each component in the sample, and by the time the developing solution reaches the detection unit 106, each component in the sample is a region from the separation unit 103 to the detection unit 106 Distributed in different places of The detection illumination object 107 is irradiated on the detection target object 109 to be quantified, and the signal reception unit 108 quantitatively detects the detection target object.
  • the quantitative detection of the detection object strictly means that the amount and concentration are known, for example, A (0 to 10%) B (10% to 30%) C (30% to 50) %) This is a concept that includes knowing which one of a plurality of ranges belongs to, such as D (50% or more).
  • information on the amount and concentration of the detection target can be obtained using the kit according to the present embodiment.
  • the kit according to the present embodiment only needs to attach a sample and deploy the sample 101 with the developing solution L, and has a simple structure and high design freedom.
  • the detection target to be quantified in the present embodiment is 8OH dG
  • urine is assumed as a sample including the detection target to be quantified.
  • the kit according to this embodiment is considered to be able to obtain the same effect with 8-oxo-guanosine, deoxyguanosine, etc., which have a guanine skeleton similar to 8OHdG.
  • 8 OH d G may be described including those considered to have the same effect.
  • uric acid is similar in structure to 8OHdG, and the amount of uric acid in urine is several dozen to several thousand times the amount of 8OHdG. ing. In order to detect and quantify 8OHdG accurately, separation from uric acid is necessary.
  • the urine introduced to the introducing unit 102 proceeds to the separating unit 103.
  • the sample is preferably dried once at this stage.
  • the sample of the separation unit 103 contains many components such as 8OHdG and uric acid.
  • the method for drying the sample is not particularly limited, but a method of leaving the water to evaporate naturally by leaving for a predetermined time, a method of contacting a material that absorbs the water, heating to evaporate the water Methods etc.
  • the sample introduced into the introduction unit 102 is developed and separated at different locations on the separation unit 103 for each component.
  • the kit according to the present embodiment quantitatively describes the principle of quantitatively detecting a detection target in a sample, by way of an example.
  • the separation unit 103 fluoresces by ultraviolet light (UV light). Since many organic compounds including 8OHdG absorb UV light, the region where 8OHdG is present has a weak fluorescence intensity. That is, since the intensity of the fluorescence by the UV light becomes weaker in the region where the 8OHdG concentration is higher, the 8OHdG concentration can be measured by the detected fluorescence intensity.
  • UV light ultraviolet light
  • the sample containing the object to be detected includes urine, blood, sweat, tears and liquid samples based thereon. Moreover, the dilution which made the quantity of the contained water increase and decrease, and a concentrate are mentioned. Urine is often used as a sample of 8OHdG. Urinary 8OH dG levels are known to be useful as markers of oxidative stress. Urine contains uric acid, creatinine, urea, various salts, etc. in addition to 8OHdG.
  • the support 104 Glass, plastic, aluminum or the like is used as the material of the support 104, and can be appropriately selected depending on the type of sample, the type of developing solution, and the like.
  • a square having a length of 3 cm to 15 cm and a width of 1 cm to 5 cm in the moving direction of the sample is preferable in terms of ease of handling. That is, from the viewpoint of ease of use, the support is preferably a hand-shaped stick shape.
  • the support 104 may be cylindrical. In the case of a cylindrical support, the separation part described later can be filled inside, and the robustness of the separation part is improved.
  • the inner diameter of the cylindrical shape is preferably 0.5 mm to 10 mm, and more preferably 1 mm to 3 mm.
  • the introducing unit 102 is a site into which the sample 101 is introduced.
  • a tubular one for introducing the sample 101 onto the introducing part 102 may be attached, or the sample may be introduced by dropping the sample 101 onto the separating part 103 with a dropper or the like.
  • the size of the introduction portion is preferably smaller. When the sample is in a small spot, the resolution improves.
  • the separation ability as referred to herein means the separation accuracy of each component, and when the separation ability is high, other components are not mixed with the separated component.
  • the shape of the introduction part may be circular or rectangular. In the case of a circular shape, a diameter of 5 mm or less is preferable, and a diameter of 3 mm or less is more preferable.
  • the longitudinal direction is preferably 5 mm or more in the direction perpendicular to the direction in which the developing solution flows, and more preferably 10 mm or more. 3 mm or less is preferable and, as for the width
  • the introduction part is rectangular, the width of the region to which the sample is added is easily narrowed in the traveling direction of the developing solution, so that the difference in the development speed between the detection target and the contaminants in the sample can be easily seen.
  • the sample introduced in the introduction part it is preferable to dry the sample introduced in the introduction part in situ. By removing the water in the sample, the reproducibility of development by the developing solution is improved, and the sample is also concentrated, so that the detection sensitivity is also improved.
  • a step of concentrating may be performed separately at the time of sample introduction.
  • the separation unit 103 includes a carrier (stationary phase) used for chromatography.
  • the carrier is composed of, for example, particulate silica gel or cellulose of about several tens to several hundreds of microns.
  • the carrier may be bound by a casting agent, an organic polymer or the like.
  • the silica gel may have an organic substance modified on its surface, and for example, silica gel to which an octadecyl group is bonded may be used. Unmodified silica gel is strongly hydrophilic on the surface, but a hydrophobic surface can be obtained by modifying the octadecyl group. Silica gel on the hydrophobic surface is easy to adsorb uric acid in alcohol, and can improve the separation ability with 8OH dG.
  • the carrier may be configured to include a plurality of silica gels having different hydrophobicities.
  • the separation unit 103 may contain a substance that emits fluorescence or phosphorescence, or a coloring substance.
  • the fluorescent substance fluorescent agent
  • 8OHdG has a carbon ring structure in its structure and absorbs UV light. Therefore, it can be visually recognized as a black shadow by UV light on the separation part containing the fluorescent material.
  • the separation unit 103 may include a component that reacts with 8OHdG and emits fluorescence. Further, it may be a component which reacts with 8OHdG to make a color. These components allow detection by the detection unit 106.
  • the detection unit 106 is a place to measure the amount or concentration of 8OH dG.
  • the detection unit 106 needs to visualize the 8OHdG concentration, and the following example can be given as a means for visualization.
  • the separation unit 103 is made to contain a fluorescent material that absorbs UV light and emits fluorescence, and the UV light is irradiated. The higher the 8OHdG concentration, the more it will be visualized as a black shadow. In this case, the detection illumination 107 is a UV light source.
  • Visualization means 2 After development, a reagent that reacts with 8OHdG and is colored is dispersed to the separation unit 103. Although the state of color development changes depending on the reagent to be dispersed, color development basically occurs according to the 8OH dG concentration. In this case, the detection illumination 107 may be omitted.
  • UV light provides fluorescence with an intensity according to the 8OH dG concentration.
  • the detection illumination 107 is a UV light source.
  • Signal receiving unit 108 for measuring the amount of 8OHdG there are the following means.
  • Measurement means 1 The distribution of the 8OH dG concentration is analyzed as an image by a digital camera or the like having a CCD or CMOS sensor.
  • Measurement means 2 Measure the amount of light reflection and the amount of fluorescence with a photodiode or the like.
  • a UV light source of 254 nm is prepared in the upper part of the detection unit, UV light is irradiated, and a shadow of 8OH dG is photographed using a digital camera.
  • FIG. 3 shows an example of a photographed image.
  • Reference numeral 201 denotes an introduction unit
  • 202 denotes a separation unit
  • 203 denotes a detection unit.
  • 8 OH dG aqueous solution of a known concentration (for example, 2 ⁇ l of 1 mg / ml) is dropped in advance and dried.
  • a sample is introduced in 201, and the shadow of 8OHdG in the sample after being developed is captured.
  • An area 204 does not include 8OHdG and no shadow is captured.
  • the R, G, and B values of each pixel in the region 204 are averaged to obtain an average R, an average G, and an average B value.
  • the values of the average R, average G, and average B are often subtracted from the RGB values of each pixel of the entire image to obtain a difference.
  • the values of R, G, and B of the pixel become almost 0 in the area not including 8OHdG, and take a negative value in the area including 8OHdG.
  • the RGB values of the pixels in the region 203 are integrated, and the average value of RGB ((R ⁇ 2 + G ⁇ 2 + B ⁇ 2) ⁇ (1/2)) is calculated (hereinafter, this RGB average value is referred to as sample luminance ).
  • the RGB average value of the pixels in the area 205 is calculated (hereinafter, this RGB average value is referred to as reference luminance).
  • the sample luminance value is divided by the reference luminance value and multiplied by the amount of 8OH dG given to 205 to obtain information on the concentration of 8OH dG in the sample.
  • the kit in this embodiment has a configuration in which the developing liquid held in the holding portion flows into the developing liquid introduction portion and flows to the introduction portion. it can.
  • the developing solution according to this embodiment is a mobile phase in chromatography, and plays a role of expanding a detection target in a sample.
  • the developing solution according to this embodiment is selected such that the developing rate of 8OH dG by the developing solution is faster than that of the contaminants.
  • the developing solution is selected such that the solubility of 8OHdG in the developing solution is higher than the solubility of the contaminants, the relationship of the above-mentioned developing speed can be realized.
  • a developing solution for example, a solution containing at least one of alcohol and ether and an inorganic electrolyte can be mentioned.
  • the main components of the developing solution are alcohol and ether.
  • the alcohol include methanol, ethanol, propanol and / or isopropanol.
  • the ether are at least one of dimethyl ether, ethyl methyl ether, diethyl ether, diethylene glycol monoethyl ether, diethylene glycol monomethyl ether and triethylene glycol monobutyl ether.
  • the inorganic electrolyte was effective in suppressing the development of urinary impurities, particularly uric acid in chromatography. Although the detailed mechanism is unknown, it is thought that the water remaining slightly in the main component of the developing solution is adsorbed to the silica gel in the solid phase while the inorganic electrolyte holds it, thereby suppressing the involvement of the water in uric acid. Be It is also considered that uric acid is ionized by the inorganic electrolyte and is in a form that is easily adsorbed to silica gel in the solid phase. This effect facilitates separation of 8OHdG and uric acid. It is preferable that the inorganic electrolyte be deliquescent which easily retains water. Here, deliquescent means that when the substance is placed in the air, the water in the air is taken in to form an aqueous solution.
  • Examples of the inorganic electrolyte include potassium hydroxide and sodium hydroxide.
  • the concentration of the inorganic electrolyte is preferably 0.09 mol / l or more.
  • the amount of water in the main component of the developing solution is preferably 1.5% or less based on the weight of the developing solution. More preferably, it is 1% or less and 0.5% or less is more preferable.
  • the molar concentration of water is preferably 3.2 times or less the molar concentration of the inorganic electrolyte. Below this concentration, 8OHdG and uric acid can be separated even if they contain water.
  • the thin layer chromatography for detecting 8 oxo 2 'deoxy guanosine includes the following steps. (1) introducing a sample containing 8 oxo 2 'deoxy guanosine and impurities. (2) A step of separating and extracting 8OHdG from the sample by developing a developing solution on the sample. (3) detecting the amount or concentration of separated and extracted 8 oxo 2 'deoxy guanosine.
  • the support may be plate-like thin layer chromatography or the support may be cylindrical column chromatography.
  • a developing solution was prepared by containing water and potassium hydroxide in absolute ethanol.
  • Anhydrous ethanol contained molecular sieve 3A, was stirred, and was allowed to stand for 24 hours to sufficiently remove the water content.
  • the contents of water and potassium hydroxide are as shown in Table 2 below. Each unit is mol / l.
  • Example 1 A silica gel plate (PLC silica gel RP-18F254 manufactured by Merck) cut into 2 cm ⁇ 5 cm was used as a separation part.
  • the support is glass
  • the silica gel layer in the separation part contains a UV-absorbing fluorescent substance (fluorescent agent).
  • One of the short sides of the silica gel plate was used as a base, and a position of 10 mm from the base was used as an introduction part, and 2 ⁇ l of sample 1 was applied using a glass tube dropper. The sample was dried on a 60 ° C. hot plate.
  • the developing solution 1 was added to the bottom of the TLC developing layer (manufactured by As One Corporation) to a depth of about 2 mm, and the developing layer was covered and allowed to stand for 10 minutes. Then, the bottom of the silica gel plate was placed in the developing layer so that the bottom side was down, and the developing solution was allowed to stand up to 20 mm above the introduction portion. The silica gel plate was taken out, and 2 ⁇ l of sample 1 was applied with a glass tube dropper at 5 mm from another short side to be paired with the base (reference).
  • the area of 10 mm from the portion where the sample 1 developing solution rose to the bottom side was used as a detection portion, and a UV light source of 254 nm (Handy UV lamp manufactured by As One Corp.) was irradiated and photographed with a digital camera. The photographed image was digitized according to the method of 8OHdG quantification in the above detection unit.
  • Example 2 The same experiment as in Example 1 was conducted except that the developing solution 2 was used.
  • Example 3 The same experiment as in Example 1 was conducted except that the developing solution 3 was used.
  • the amount of 8OH dG was quantified similarly to sample 1 for samples 2 to 7. All references were set to sample 1.
  • the amount of 8OHdG contained at the time of sample preparation is taken on the horizontal axis in FIG. 3, the amount of 8OHdG quantified on the vertical axis is taken, and samples 1 to 7 are plotted.
  • the amount almost equivalent to 8OHdG contained at the time of preparation can be quantified, and 8OHdG could be easily quantified by this method.
  • Example 4 The same experiment as in Example 1 was conducted except that the developing solution 4 was used.
  • Example 5 The same experiment as in Example 1 was conducted except that the developing solution 5 was used.
  • 8OHdG in urine can be detected more accurately than in the prior art.

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Abstract

クロマトグラフィーで、検出対象物を含む試料が導入されるクロマトグラフィー用のキットであって、特定の展開液を用いることで、検出対象物を精度良く検出できる。

Description

クロマトグラフィー用のキット、クロマトグラフィー用の展開液、及びクロマトグラフィー
　本発明はクロマトグラフィー用のキット、クロマトグラフィー用の展開液、及びクロマトグラフィーに関する。
　８－Ｏｘｏ－２’－ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ（８オキソ２’デオキシグアノシン、以下８ＯＨｄＧと略すことがある）は活性酸素による生体への影響を反映する物質として知られており、広く用いられている酸化ストレスマーカーの一つである。体内で生成される８ＯＨｄＧの量を測定する事で、病態把握、病気予防などに繋がると考えられている。８ＯＨｄＧは化学的に安定な物質で２次代謝などを受けずに尿中に排出される事から、尿中の８ＯＨｄＧの量を測定する事で非侵襲的に酸化ストレスマーカーを計測することが可能である。
　特開２０１０－１５６６３９号公報（特許文献１）では８ＯＨｄＧに特異的に反応する抗体を用いて酸化ストレス状態を判定するシステムが開示されている。具体的には、８ＯＨｄＧに対して特異的に反応する抗体に金コロイドを結合させた結合体が固定された検査キットに試料を添加し、８ＯＨｄＧと結合しなかった結合体の量を色で判定することで、８ＯＨｄＧの検出を行っている。しかし、特許文献１のシステムでは、試料を展開する溶液を使用していないため、結合体の量を判定する位置に結合体が到達しにくく、精度の良い判定ができない可能性がある。
　特開２００７－１２１２７１号公報（特許文献２）では前処理によって濃縮された８ＯＨｄＧを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量する方法および装置が開示されている。特許文献１ではＨＰＬＣによる定量の前処理として、シリカゲルやエタノールを用いて８ＯＨｄＧを濃縮した溶液を用いた分離・濃縮を行うことが開示されている。
　ここで、特許文献２の手法では課題が生じることを本発明者らは見出した。特許文献２では、８ＯＨｄＧの分離・濃縮の際にエタノールを用いているが、試料が尿である場合、８ＯＨｄＧと尿酸の分離が十分にできず、８ＯＨｄＧを精度よく検出することが難しいことがわかった。
特開２０１０－１５６６３９号公報 特開２００７－１２１２７１号公報
　本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、従来に比べて尿中の８ＯＨｄＧを精度よく検出することができるキットを提供することを目的とする。
　本発明に係るクロマトグラフィー用のキットは、８オキソ２’デオキシグアノシンと夾雑物を含む試料が導入される導入部と、前記試料のうち、前記８オキソ２’デオキシグアノシンと前記夾雑物を分離するための展開液と、前記試料が前記展開液によって展開されて得られる溶液に含まれる前記８オキソ２’デオキシグアノシンの量または濃度を検出するための検出部と、を有するクロマトグラフィー用のキットであって、前記展開液による前記８オキソ２’デオキシグアノシンの展開速度が、前記展開液による前記夾雑物の展開速度よりも速いことを特徴とする。
　別の本発明に係るクロマトグラフィー用のキットは、検出対象物を含む試料が導入される導入部と、前記試料のうち前記検出対象物を分離するための展開液と、前記試料が前記展開液によって展開されて得られる溶液に含まれる前記検出対象物の量又は濃度を検出するための検出部と、を有するクロマトグラフィー用のキットであって、前記展開液は、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールの少なくともいずれかと、水酸化カリウム及び水酸化ナトリウムの少なくともいずれか一方とを含むことを特徴とする。
　本発明に係るクロマトグラフィー用の展開液はアルコール及びエーテルの少なくともいずれか一方と、無機電解質と、を含む。
　本発明に係るクロマトグラフィーは、８オキソ２’デオキシグアノシンを検出するクロマトグラフィーであって、前記８オキソ２’デオキシグアノシンと夾雑物を含む試料を導入する工程と、前記試料に展開液を展開することによって、前記試料から８ＯＨｄＧを分離抽出する工程と、分離抽出された前記８オキソ２’デオキシグアノシンの量または濃度を検出する工程と、を有する。
本発明の実施形態に係る薄層クロマトグラフィー用のキットを説明するための図。 本発明の実施形態に係る薄層クロマトグラフィー用のキットを用いて８ＯＨｄＧを検出する方法を説明するための図。 本発明に実施形態に係る薄層クロマトグラフィー用のキットを用いて８ＯＨｄＧを定量した結果を表すグラフ。
　以下、本発明の実施形態について説明するが本発明はこれらに限られない。
　＜クロマトグラフィー用のキット＞
　本実施形態に薄層クロマトグラフィー用の検出キットの一例について図１を用いて説明する。図１は板状の支持体上に担体の薄層を有する薄層クロマトグラフィーの例である。本実施形態に係るキットは支持体１０４上に試料を導入するための導入部１０２と、試料中の検出対象物と、それ以外の物質の少なくとも一部とを分離するための分離部１０３と、検出対象物の量または濃度を検出するための検出部１０６を有する。本実施形態では、分離部１０３の一部に導入部１０２と検出部１０６が設けられている。
　１０５の展開液導入部から後述する展開液Ｌを導入し、導入部１０２に導入された試料１０１は展開液Ｌによって検出部１０６に向けて移動を開始する。図１は、保持部１１０に展開液が保持された例を示すが、それに限定されず、外部から展開液導入部１０５に展開液を導入しても良い。
　分離部１０３を移動する試料の速さは試料中の各成分の物性によって変化し、展開液が検出部１０６に達する頃には、試料中の各成分は分離部１０３から検出部１０６にかけての領域の異なる場所に分布する。定量を行う検出対象物１０９に対して検出用照明１０７を照射し、信号受信部１０８によって検出対象物を定量的に検出する。本明細書において検出対象物の定量的な検出とは、厳密には量や濃度がわかることが望ましいが、例えばＡ（０～１０％）Ｂ（１０％～３０％）Ｃ（３０％～５０％）Ｄ（５０％以上）のように複数の範囲のいずれかに属するかがわかることも含む概念である。または、本実施形態に係るキットを用いて検出対象物の量や濃度に関する情報を取得することができる。
　このように本実施形態にかかるキットは、試料を付与し、展開液Ｌで試料１０１を展開できれば良く、構造が簡単であり、設計自由度も高い。
　本実施形態に係るキットについてより詳細に説明する。本実施形態における定量を行う検出対象物は８ＯＨｄＧであり、定量を行う検出対象物を含む試料としては尿を想定している。なお、本実施形態に係るキットは、８ＯＨｄＧと同じようなグアニン骨格をもつ、８－ｏｘｏ－Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ、ＤｅｏｘｙＧｕａｎｏｓｉｎｅ等でも同様の効果を得られると考えられる。本明細書では、同様の効果が得られると考えられるものも含めて８ＯＨｄＧと記載することがある。
　尿中には様々な成分が存在し、特に尿酸は８ＯＨｄＧと構造が似ている上に、尿中の尿酸の存在量は、８ＯＨｄＧの存在量の数十から数千倍である事が知られている。８ＯＨｄＧを精度よく検出し定量するためには尿酸との分離が必要である。
　導入部１０２に導入された尿は分離部１０３に進む。試料はこの段階で一度乾燥させた方が好ましい。分離部１０３の試料はこの段階では８ＯＨｄＧや尿酸等、多数の成分を含む。なお、本実施形態において試料を乾燥する方法としては特に限定されないが、所定の時間放置して水分を自然に蒸発させる方法や、水分を吸収する材料を接触させる方法、加熱して水分を蒸発させる方法等が挙げられる。
　１０５の展開液導入部から後述する展開液を導入し、展開液が導入部１０２を通過すると、試料の展開が開始される。展開液中の試料成分は固相である分離部１０３と吸脱着を繰り返し、検出部に向けて展開される。この際、後述する展開液を用いることで、夾雑物としての尿酸は固相である分離部１０３に強く吸着し、展開液によって展開されにくい。一方、８ＯＨｄＧは展開液と共に展開される。すなわち、展開液に対する８ＯＨｄＧの展開速度を、尿酸やクレアチニンといった夾雑物の展開速度よりも速くすることができる。その他の夾雑物に関しては８ＯＨｄＧとの構造の差から、８ＯＨｄＧとは異なる場所に展開される。
　このようにして、導入部１０２に導入された試料は分離部１０３上で成分ごとに異なる場所に展開され、分離される。
　次に、本実施形態にかかるキットが、試料中の検出対象物を定量的に検出する原理について、一例を挙げて説明する。本例では、分離部１０３が担体を含み構成され、その担体が、オクタデシル基が結合したシリカゲルである場合について説明する。
　分離部１０３上で分離された８ＯＨｄＧは無色である為、基本的に目視では確認できない。分離部１０３を構成するシリカゲルに予め蛍光物質を混合しておくと、紫外光（ＵＶ光）によって分離部１０３が蛍光する。８ＯＨｄＧを含む多くの有機化合物はＵＶ光を吸収する為、８ＯＨｄＧが存在する領域は蛍光の強度が弱くなる。つまり、８ＯＨｄＧ濃度が高い領域ほど、ＵＶ光による蛍光の強度は弱くなるため、検出される蛍光強度によって８ＯＨｄＧ濃度を測定する事が出来る。
　次に、本実施形態に係る検査キットを構成する各部位、及びそれらを構成する各部材の材料等の具体例について説明する。
　（試料）
　検出対象物を含有する試料としては尿、血液、汗、涙およびこれらをもとにする、液体状の試料が挙げられる。また、含有する水の量を増減させた希釈、濃縮液が挙げられる。８ＯＨｄＧの試料としては尿が使われる事が多い。尿中８ＯＨｄＧ量は酸化ストレスのマーカーとして有用である事が知られている。尿中には８ＯＨｄＧの他、尿酸、クレアチニン、尿素、各種塩等が含まれている。
　（支持体）
　支持体１０４の材質は、ガラス、プラスチック、アルミ等が用いられ、試料の種類、展開液の種類等により適宜選択できる。支持体１０４の寸法や形状については、取り扱いの簡便さからは試料が移動する方向の長さ３ｃｍ～１５ｃｍ、幅１ｃｍ～５ｃｍの方形が好ましい。すなわち、支持体は、使いやすさの観点から、手の平サイズのスティック形状であることが好ましい。また、支持体１０４は円筒状であっても構わない。円筒状の支持体の場合、後述する分離部を内部に充填させる事ができ分離部の堅牢性が向上する。但し、後述する検出部を支持体内に配置したい場合は円筒状の支持体の材質としてはＵＶ光を吸収しないものが好ましい。円筒状の内径は０．５ｍｍ～１０ｍｍが好ましく、１ｍｍ～３ｍｍがより好ましい。
　（導入部）
　導入部１０２は試料１０１が導入される部位である。試料１０１を導入部１０２上に導入する管状のものが付随していても良いし、スポイトのようなもので試料１０１を分離部１０３上に滴下することで試料を導入しても良い。
　導入部の大きさは小さい方が好ましい。試料が小さいスポットにまとまっていると、分離能が向上する。ここで言う分離能とは、各成分の分離精度を意味しており、分離能が高い場合は分離後の成分に他成分が混ざらない。
　導入部の形状は円形であっても矩形であってもよい。円形の場合は直径５ｍｍ以下が好ましく、直径３ｍｍ以下がより好ましい。また矩形が正方形でない場合、長手方向は展開液が流れる方向に対して垂直方向に５ｍｍ以上の長さであることが好ましく、１０ｍｍ以上の長さがであることより好ましい。短手方向の幅は３ｍｍ以下が好ましく、１ｍｍ以下がより好ましい。導入部が矩形である場合、展開液の進行方向において、試料が添加される領域の幅を狭くしやすいため、試料中の検出対象物と夾雑物との展開速度の差が見やすくなる。
　導入部で導入した試料は、その場で乾燥させる事が好ましい。試料中の水分を除く事で展開液による展開の再現性が向上し、試料も濃縮される為検出感度も向上する。試料導入時に別途、濃縮する工程を行っても良い。
　（分離部）
　分離部１０３はクロマトグラフィーに用いられる担体（固定相）を含み構成されている。担体は、例えば、数十から数百ミクロン程度の粒子状シリカゲルまたはセルロースで構成されている。また、担体がギプス剤や有機高分子等によって結着していても良い。
　シリカゲルは表面に有機物を修飾していても良く、例えばオクタデシル基が結合したシリカゲルを用いても良い。未修飾のシリカゲルは表面が強い親水性であるが、オクタデシル基を修飾する事で疎水性表面を得る事が出来る。疎水性表面のシリカゲルはアルコール中の尿酸を吸着し易く、８ＯＨｄＧとの分離能を向上させることが出来る。なお、担体は、互いに疎水性が異なる複数のシリカゲルを含み構成されていてもよい。
　分離部１０３には蛍光あるいは燐光を発する物質、または発色物質が含まれていても良い。蛍光物質（蛍光剤）が含まれているとＵＶ光で分離部１０３上の有機物の一部を視認する事が出来る。８ＯＨｄＧはその構造中に炭素の環状構造を有しＵＶ光を吸収する。その為、蛍光物質を含む分離部上ではＵＶ光で黒い影として視認できる。
　分離部１０３に８ＯＨｄＧと反応し蛍光を発する成分が含まれていても良い。また、８ＯＨｄＧと反応し呈色する成分でも良い。これらの成分によって検出部１０６で検出する事が出来るようになる。
　（検出部）
　検出部１０６は８ＯＨｄＧの量または濃度を測定する場所である。検出部１０６では８ＯＨｄＧ濃度を可視化する必要があり、可視化するための手段として以下の例が挙げられる。
　（可視化手段１）
　分離部１０３にＵＶ光を吸収して蛍光を発する蛍光物質を含有させ、ＵＶ光を照射する。８ＯＨｄＧ濃度が高い程、黒い影として可視化される。この場合、検出用照明１０７はＵＶ光源になる。
　（可視化手段２）
　展開後、８ＯＨｄＧと反応し呈色する試薬を分離部１０３に散布する。散布する試薬によって発色の様子は変化するが、基本的に８ＯＨｄＧ濃度に従った発色が起こる。この場合、検出用照明１０７は無くても構わない。
　（可視化手段３）
　展開後、８ＯＨｄＧと反応し蛍光する試薬を分離部１０３に散布する。ＵＶ光によって８ＯＨｄＧ濃度に従った強度の蛍光が得られる。この場合、検出用照明１０７はＵＶ光源になる。
　（信号受信部）
　８ＯＨｄＧの量の計測のための信号受信部１０８の例として以下の手段がある。
　（計測手段１）
　ＣＣＤやＣＭＯＳセンサーを有するデジタルカメラ等により８ＯＨｄＧ濃度の分布を画像として解析する。
　（計測手段２）
　フォトダイオード等で光の反射量、蛍光量を計測する。
　（計測手段３）
　目視にて８ＯＨｄＧ濃度を判断する。ここでは可視化手段１と計測手段１を用いた場合の例を具体的に説明する。
　（検出部での８ＯＨｄＧ定量）
　検出部上部に２５４ｎｍのＵＶ光源を用意し、ＵＶ光を照射して８ＯＨｄＧの影をデジタルカメラを用いて撮影する。
　ＵＶ光を照射して８ＯＨｄＧの影を撮影すると、８ＯＨｄＧ量が多い程暗い影として記録される。図３は撮影した画像の例であり、２０１は導入部、２０２は分離部、２０３は検出部である。２０５には予め既知の濃度の８ＯＨｄＧ水溶液（例えば１ｍｇ／ｍｌを２μｌ）を滴下、乾燥させてある。２０３には２０１にサンプルを導入し、展開した後のサンプル中の８ＯＨｄＧの影が写っている。２０４は８ＯＨｄＧを含まない領域で何の影も写っていない。まず２０４の領域の各画素のＲ、Ｇ、Ｂ値其々を平均化し、平均Ｒ、平均Ｇ、平均Ｂの値を得る。次に、前記画像全体の各画素のＲＧＢ値から其々平均Ｒ、平均Ｇ、平均Ｂの値を減算し差分を得る。この段階で前記画像は８ＯＨｄＧを含まない領域では画素のＲ、Ｇ、Ｂの値がほぼ０となり、８ＯＨｄＧを含む領域ではマイナスの値を取る。さらに２０３の領域の画素のＲＧＢ値を積算し、ＲＧＢの平均値（（Ｒ＾２＋Ｇ＾２＋Ｂ＾２）＾（１／２））を算出する（以下、このＲＧＢ平均値をサンプル輝度と表記する）。同様に２０５の領域の画素のＲＧＢ平均値を算出する（以下、このＲＧＢ平均値をリファレンス輝度と表記する）。サンプル輝度値をリファレンス輝度値で除算し、２０５に付与した８ＯＨｄＧ量を乗算すればサンプル中の８ＯＨｄＧの濃度に関する情報が得られる。
　（保持部、展開液導入部）
　本実施形態におけるキットは、例えば保持部を押すなどして圧力をかけると、保持部に保持された展開液が展開液導入部に流入して、導入部へと流れていく構成とすることができる。
　＜展開液＞
　本実施形態に係る展開液はクロマトグフィーにおける移動相であり、試料中の検出対象物を展開させる役割を担う。本実施形態に係る展開液は、その展開液による８ＯＨｄＧの展開速度が、夾雑物の展開速度よりも速くなるようなものを選ぶ。
　例えば、展開液に対する８ＯＨｄＧの溶解度が、夾雑物の溶解度よりも高くなるように展開液を選べば、上記のような展開速度の関係を実現することができる。そのような展開液として例えばアルコール及びエーテルの少なくともいずれか一方と、無機電解質を含む溶液が挙げられる。
　（展開液の主成分）
　本実施形態において、展開液の主成分はアルコール及びエーテルである。アルコールの例はメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールのうち少なくともいずれか一種が挙げられる。エーテルの例は、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジエチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコールモノブチルエーテルのうち少なくともいずれか一種である。
　これらのアルコールは尿中の８ＯＨｄＧ以外の物質（以下、夾雑物）、特に尿酸の溶解度が低い。一方８ＯＨｄＧは溶解させる為、分離に最適である。
　（無機電解質）
　これまで、展開液中に無機電解質を含有させても、多くの無機電解質は固相中のシリカゲルに吸着してしまい、展開結果に影響を及ぼさないと考えられていた。その為、一般的には薄層クロマトグラフィーの展開液に無機電解質は使用されてこなかった。
　ところが、本発明者らが検討したところ無機電解質は尿中の夾雑物、特にクロマトグラフィーにおける尿酸の展開を抑える効果がある事が分かった。詳細なメカニズムは不明であるが、展開液の主成分中に僅かに残存する水分を無機電解質が保持したまま固相中のシリカゲルに吸着し、尿酸に水分が関与する事を抑えていると考えられる。また、尿酸が無機電解質によって電離し、固相中のシリカゲルに吸着し易い形態になっているとも考えられる。この効果によって、８ＯＨｄＧと尿酸を分離しやすく出来る。無機電解質は水分を保持し易い潮解性である事が好ましい。なお、潮解性であるとはその物質を空気中においたときに、空気中の水分を取り込んで水溶液になるものである。
　無機電解質として例えば、水酸化カリウムや水酸化ナトリウムが挙げられる。無機電解質の濃度は０．０９ｍｏｌ／ｌ以上である事が好ましい。
　（水分）
　展開液が水分を含有すると尿酸が溶解するようになる為、分離能が低下する。そのため、展開液の主成分中の水分量は展開液重量に対して１．５％以下が好ましい。より好ましくは１％以下で、０．５％以下が更に好ましい。また、水のモル濃度が、無機電解質のモル濃度の３．２倍以下であることが好ましい。この濃度以下であれば水分を含有していても８ＯＨｄＧと尿酸を分離する事が出来る。
　（クロマトグラフィー）
　本実施形態に係る、８オキソ２’デオキシグアノシンを検出する薄層クロマトグラフィーは、以下の各工程を含む。
（１）８オキソ２’デオキシグアノシンと夾雑物を含む試料を導入する工程。
（２）試料に展開液を展開することによって、試料から８ＯＨｄＧを分離抽出する工程。（３）分離抽出された８オキソ２’デオキシグアノシンの量または濃度を検出する工程。
　また、支持体が板状の薄層クロマトグラフィーであっても、支持体が円筒状のカラムクロマトグラフィーであっても良い。
　なお、展開液を展開する前に、試料に含まれる水分を除去する工程を含んでいても良い。水分を除去することで、前述のように、８ＯＨｄＧと尿酸を分離しやすくなる。また、試料を濃縮する工程をさらに有していても良い。なお、試料が尿である場合、夾雑物は、クレアチニン及び尿酸の少なくともいずれか一方を含む。
　（サンプルの調製）
　下記表１に記載の含有量となるように各材料を混合し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を含有させて１ｍｌに調整した。各サンプルは使用直前に１Ｎ硫酸溶液を等量入れて中和した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（展開液の調製）
　無水エタノールに水および水酸化カリウムを含有させて展開液を調製した。無水エタノールはモレキュラーシーブ３Ａを含有させ撹拌し、２４時間静置して充分に含有水分を除去したものを使用した。水および水酸化カリウムの含有量は下記表２の通りである。何れも単位はｍｏｌ／ｌである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（実施例１）
　分離部として２ｃｍ×５ｃｍに切断したシリカゲルプレート（ＰＬＣシリカゲルＲＰ－１８Ｆ２５４　メルク社製）を用いた。このシリカゲルプレートは支持体がガラスで分離部のシリカゲル層にはＵＶを吸収する蛍光物質（蛍光剤）が含まれている。シリカゲルプレートの短辺の一方を底辺とし、底辺から１０ｍｍの位置を導入部とし、ガラス管のスポイトにてサンプル１を２μｌ付与した。サンプルは６０℃のホットプレート上で乾燥させた。ＴＬＣ用展開層（アズワン社製）の底部に２ｍｍ程度の深さとなるように展開液１を入れ、展開層に蓋をして１０分静置した。その後、展開層中にシリカゲルプレートの底辺が下になるように入れ、展開液が導入部から２０ｍｍ上に上がるまで静置した。シリカゲルプレートを取り出し、底辺と対になるもう一つの短辺から５ｍｍの所にガラス管のスポイトにてサンプル１を２μｌ付与した（リファレンス）。サンプル１展開液が上がった部分から底辺に向かって１０ｍｍの範囲を検出部とし、２５４ｎｍのＵＶ光源（アズワン社製　ハンディＵＶランプ）を照射して、デジタルカメラで撮影した。撮影した画像を上記検出部での８ＯＨｄＧ定量の方法に従い数値化した。
　（実施例２）
　展開液２を用いること以外は実施例１と同様の実験を行った。
　（実施例３）
　展開液３を用いること以外は実施例１と同様の実験を行った。
　サンプル２から７についてもサンプル１と同様に８ＯＨｄＧ量を定量した。リファレンスは全てサンプル１とした。図３横軸にサンプル調製時に含有させた８ＯＨｄＧ量を、縦軸に定量した８ＯＨｄＧ量をとり、サンプル１から７までをプロットした。調製時に含有させた８ＯＨｄＧとほぼ同等の量が定量できており、本手法により簡易に８ＯＨｄＧを定量できた。
　（実施例４）
　展開液４を用いること以外は実施例１と同様の実験を行った。
　（実施例５）
　展開液５を用いること以外は実施例１と同様の実験を行った。
　（比較例１）
　展開液６を用いること以外は実施例１と同様の実験を行った。
　（評価）
　各サンプルの８ＯＨｄＧ検出量と、サンプル調製時に仕込んだ８ＯＨｄＧ量が全てのサンプルで１０％以内の差であった場合はＡ（好ましいレベル）、１０％を超える差のサンプルが多数あった場合はＣ（許容できないレベル）、それ以外をＢとした。評価結果を表３に示す。
　展開液６のように水酸化カリウムが含まれない場合、８ＯＨｄＧを精度よく検出できないことがわかった。また、展開液中の水酸化カリウムを適切な範囲とすることで、８ＯＨｄＧの定量的な検出を精度よくできた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明に係るクロマトグラフィー用のキットによれば、従来に比べて尿中の８ＯＨｄＧを精度よく検出することができる。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０１７年６月３０日提出の日本国特許出願特願２０１７－１２９３５２を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。

Claims (30)

  1. 　８オキソ２’デオキシグアノシンと夾雑物を含む試料が導入される導入部と、
    　前記試料のうち、前記８オキソ２’デオキシグアノシンと前記夾雑物を展開するための展開液と、
    　前記試料が前記展開液によって展開されて得られる溶液に含まれる前記８オキソ２’デオキシグアノシンの量または濃度を検出するための検出部と、を有するクロマトグラフィー用のキットであって、
    　前記展開液による前記８オキソ２’デオキシグアノシンの展開速度が、前記展開液による前記夾雑物の展開速度よりも速いことを特徴とするキット。
  2. 　前記展開液に対する前記８オキソ２’デオキシグアノシンの溶解度が、前記展開液に対する前記夾雑物の溶解度よりも高いことを特徴とする請求項１に記載のキット。
  3. 　前記夾雑物に尿酸及びクレアチニンの少なくとも何れか一方が含まれることを特徴とする請求項１または２に記載のキット。
  4. 　前記展開液が、アルコール及びエーテルの少なくともいずれか一方と、無機電解質と、を含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のキット。
  5. 　前記展開液が、潮解性の無機電解質を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のキット。
  6. 　前記展開液が、水酸化カリウム及び水酸化ナトリウムの少なくともいずれか一方を含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のキット。
  7. 　前記展開液が、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールの少なくともいずれかを含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載のキット。
  8. 　検出対象物を含む試料が導入される導入部と、
    　前記試料のうち前記検出対象物を展開するための展開液と、
    　前記試料が前記展開液によって展開されて得られる溶液に含まれる前記検出対象物の量又は濃度を検出するための検出部と、を有するクロマトグラフィー用のキットであって、
    　前記展開液は、アルコール及びエーテルの少なくともいずれか一方と、水酸化カリウム及び水酸化ナトリウムの少なくともいずれか一方とを含むことを特徴とするキット。
  9. 　前記アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールのうち少なくともいずれか一種を含み、前記エーテルが、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジエチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコールモノブチルエーテルのうち少なくともいずれか一種を含むことを特徴とする請求項８に記載のキット。
  10. 　前記検出対象物が８オキソ２’デオキシグアノシンであることを特徴とする請求項９に記載のキット。
  11. 　前記展開液を保持する保持部を有することを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のキット。
  12. 　前記導入部と前記検出部との間に前記夾雑物を吸着させるための担体が設けられていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のキット。
  13. 　前記導入部と前記検出部との間に担体が設けられていることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載のキット。
  14. 　前記担体は、シリカゲル及びセルロースの少なくともいずれか一方を含み構成されることを特徴とする請求項１２または１３に記載のキット。
  15. 　前記担体は、オクタデシル基が結合したシリカを含み構成されることを特徴とする請求項１２または１３に記載のキット。
  16. 　前記担体は、互いに疎水性が異なる複数のシリカゲルを含み構成されていることを特徴とする請求項１２または１３に記載のキット。
  17. 　前記検出部には、紫外光を吸収する蛍光物質が設けられていることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載のキット。
  18. 　前記検出部には、前記８オキソ２’デオキシグアノシンと反応して蛍光あるいは燐光を発する物質、または発色物質が設けられていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のキット。
  19. 　前記検出部には、前記検出対象物と反応して蛍光あるいは燐光を発する物質、または発色物質が設けられていることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載のキット。
  20. 　アルコール及びエーテルの少なくともいずれか一方と、無機電解質と、を含むクロマトグラフィー用の展開液。
  21. 　前記無機電解質が潮解性である事を特徴とする請求項２０に記載のクロマトグラフィー用の展開液。
  22. 　前記アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールの少なくともいずれかである事を特徴とする請求項２０または２１に記載のクロマトグラフィー用の展開液。
  23. 　前記無機電解質が水酸化カリウム及び水酸化ナトリウムの少なくともいずれかであることを特徴とする請求項２０乃至２２のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用の展開液。
  24. 　前記展開液に含まれる水のモル濃度が、前記無機電解質のモル濃度の３．２倍以下であることを特徴とする請求項２０乃至２３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用の展開液。
  25. 　前記展開液に含まれる前記無機電解質の濃度が０．０９ｍｏｌ／ｌ以上であることを特徴とする請求項２０乃至２４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用の展開液。
  26. 　８オキソ２’デオキシグアノシンを検出するクロマトグラフィーであって、前記８オキソ２’デオキシグアノシンと夾雑物を含む試料を導入する工程と、前記試料に展開液を展開することによって、前記試料から８ＯＨｄＧを分離抽出する工程と、分離抽出された前記８オキソ２’デオキシグアノシンの量または濃度を検出する工程と、を有することを特徴とするクロマトグラフィー。
  27. 　前記夾雑物がクレアチニン及び尿酸の少なくともいずれか一方を含むことを特徴とする請求項２６に記載のクロマトグラフィー。
  28. 　前記試料を濃縮する工程をさらに有することを特徴とする請求項２６または２７に記載のクロマトグラフィー。
  29. 　検出対象物を含む試料が導入される導入部と、
    　前記試料のうち前記検出対象物を展開するための展開液と、
    　前記試料が前記展開液によって展開されて得られる溶液に含まれる前記検出対象物の量又は濃度を検出するための検出部と、を有するクロマトグラフィー用のキットであって、
    　前記展開液は、アルコール及びエーテルの少なくともいずれか一方を含むことを特徴とするキット。
  30. 　前記アルコールがイソプロパノールであることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
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