WO2005050191A1 - 酸化的損傷グアニン化合物とこれの濃度補正物質の同時分析方法及びこの分析方法に用いる分析装置 - Google Patents

酸化的損傷グアニン化合物とこれの濃度補正物質の同時分析方法及びこの分析方法に用いる分析装置 Download PDF

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oxidatively damaged
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oxidatively
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Hiroshi Kasai
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Hiroshi Kasai
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    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography

Definitions

  • the present invention relates to a method for simultaneous analysis of an oxidatively damaged guanine compound and a concentration-correcting substance of the oxidatively damaged guanine conjugate, and in particular, to 8-hydroxydeoxyguanosine (hereinafter referred to as "8-0 A method for simultaneous analysis of H- (10) and 7-methyldanine (hereinafter appropriately referred to as “7-MG”) or creatine (hereinafter appropriately referred to as "Cre”), and a method for carrying out the method.
  • 8-0 8-hydroxydeoxyguanosine
  • 7-MG 7-methyldanine
  • Cre creatine
  • 8-OH-dG can be analyzed by (1) a method in which a fraction purified by an affinity column to which an antibody against 8-OH-dG is bound is analyzed by HPLC-ECD, and (2) two methods: A method in which a carbon column is connected between reversed-phase columns, and finally 8-OH-dG is detected by HPLC-ECD by column switching (Non-Patent Document 1). (3) Sampling injector (constant fractionation) And after stirring, aliquots are applied to the column. A method of connecting a multifunction column (a reverse-phase column and a gel filtration column that combines the functions of a cation exchange column) and a reverse-phase column via an ECD (Non-patent Document 2), etc. Tepuru.
  • Non-Patent Document 1 Bogdanov, M., B., et. Al., Free-radical 'biology
  • Non-Patent Document 2 Kasai, H., et. Al. Japanese 'Journal' J. Cancer Res., 2001, Vol. 92, p . 9—15
  • Non-Patent Document 3 Top et al. (Topp, H., et.al.), Analytical 'Biochemistry (Anal.
  • the present invention has been made in view of a powerful situation, and a method capable of efficiently analyzing an oxidatively damaged guanine compound and a concentration correcting substance of the oxidatively damaged guanine conjugate. , And an analyzer for performing the method.
  • MG is an RNA degradation product related to the metabolic rate (MR), and is known to be excreted in urine at a constant ratio with pseudouridine, a degradation product of RNA (non-patented). Reference 3) It is also known that there is a strong correlation between the concentration of creatine and the concentration of 7-MG.
  • the value of 8-OH-dG corrected by 7-MG (8-OH-dG / 7-MG) is corrected to the value of 8-OH-dG by Creatune (8-OH-dGZ). It is an index of acid-induced DNA damage with the same reliability as the Cre) value.
  • RNA degradation products such as pseudouridine, N2, N2-dimethylguanosine, N6-threoninocarbadenosine and the like.
  • the first invention of the present invention provides anion-exchange of an oxidatively damaged guanine conjugate contained as a result of guanine damage in DNA or RNA or in a nucleotide contained in a sample.
  • a method for analyzing an oxidatively damaged guanine compound comprising: a step of purifying with a column (HPLC-1); and a step of measuring the oxidatively damaged guanine conjugate using a detector.
  • the oxidized damage guanine conjugate can be easily analyzed, so that the labor and time required for the analysis of the sample collection 'storage' analysis' data are reduced by almost half. It is possible to make it.
  • the present invention does not require a large amount of eluent or washing solution, and generates less toxic waste liquid, so that it is also environmentally friendly.
  • the oxidatively damaged guanine compound comprises 8-hydroxydoxyguanosine (8-OH-dG) and Z or 8-hydroxyguanine (8-OH-Gua). )).
  • the method for analyzing an oxidatively damaged guanine ligated product according to the first aspect of the present invention comprises 8-hydroxydoxyguanosine (8-OH-dG) and Z or 8-hydroxyguanine (8-OH-Gua).
  • the third invention of the present invention relates to an oxidatively damaged guanine conjugate produced as a result of guanine in DNA, RNA or nucleotide contained in a sample being damaged, by using an anion exchange column (HPLC -1), a step of measuring the concentration-correcting substance of the oxidatively damaged guanine compound contained in the sample with a detector, and measuring the oxidatively damaged guanine compound with a detector. And analyzing the oxidatively damaged guanine compound and the concentration corrector at once. [0010] According to this method, the oxidatively damaged guanine compound and the concentration correcting substance of the oxidatively damaged guanine compound can be analyzed at the same time. Effort ⁇ It is possible to reduce the time almost by half.
  • the oxidatively damaged guanine compound comprises 8-hydroxydoxyguanosine (8-OH-dG) and Z or 8-hydroxyguanine (8-OH-Gua).
  • the concentration correcting substance of the oxidatively damaged guanine compound is 7-methyldanine (7-MG) and Z or creatine (Cre). It is a method of analyzing objects.
  • the fifth invention of the present invention relates to an anion-exchange column (HPLC) for treating an oxidatively damaged guanine conjugate contained in a sample, which is a result of guanine damage in DNA or RNA or nucleotides.
  • HPLC anion-exchange column
  • the elution position of the marker previously added to the sample is sensed, and the concentration correcting substance of the oxidatively damaged guanine ligated substance contained in the sample is appropriately detected.
  • An oxidatively damaged guanine compound comprising: measuring the oxidatively damaged guanine compound with a detector; and temporarily analyzing the oxidatively damaged guanine compound and the concentration correction substance. This is a method for analyzing a damaged guanine compound.
  • a substance such as 8-hydroxyguanosine (ribonucleoside) (8-OH-rGuo) is previously added to the sample as an internal standard marker of 8-OH-dG. It is possible to more precisely define the elution position (time) of the column force and the eluate fractionation range of the damaged Gwanyi ligated product, and as a result, 8-OH-dG can be reproduced with high precision and accuracy. It can be measured easily.
  • the oxidatively damaged guanine compound is preferably 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OH-dG) and Z or 8-hydroxyguanine (8-OH-Gua).
  • the concentration correcting substance of the oxidatively damaged guanine compound is 7-methyldanine (7-MG) and / or creatine (Cre)
  • the marker is 8-hydroxyguanosine (ribonucleoside) (8 -OH-rGuo)
  • the seventh, eighth, and ninth inventions of the present invention are the analysis methods according to the first, third, or fifth invention, respectively, wherein the sample is urine.
  • the tenth, eleventh, and twelfth inventions of the present invention are the seventh, eighth, and ninth inventions, respectively, in which the urine is dropped on a piece of paper and dried to be re-extracted for analysis. 4.
  • the method for analyzing an oxidized and damaged guanine ligated product according to item 1.
  • a sample can be collected anywhere, and a large amount of sample can be efficiently collected at an analytical institution by mail or the like.
  • a thirteenth invention of the present invention provides a method for purifying an anion exchange column (HPLC-1) using a carboxylic acid type column and an eluate containing a carboxylic acid or a salt thereof. It is a method for analyzing an oxidatively damaged guanine ligated product according to any one of the inventions 1 to 12. With this method, the elution positions of 8-OH-dG and 8-OH-Gua in HPLC-1 can be overlapped, and simultaneous analysis of both is possible.
  • the fraction containing the oxidatively damaged guanine compound purified by the anion exchange column is further purified by a reverse phase column (HPLC-2).
  • HPLC-1 a reverse phase column
  • the measurement of the oxidatively damaged guanine conjugate (such as 8-hydroxydoxyguanosine (8-OH-dG)) purified by HPLC-1 is carried out by anion exchange chromatography using (1) Recognition of peaks for markers such as nucleoside 8-OH-rGuo, (2) —start of 8-OH-dG fractionation after a fixed time, (3) —end of 8-OH-dG fractionation after a fixed time, (4 ) Where appropriate, the mixing of the 8-OH-dG fraction can be performed in that order, followed by injection into a reversed-phase column.
  • the analyzer of the present invention does not require a large-scale mechanism, is inexpensive, and is excellent in economic efficiency.
  • the fifteenth invention of the present invention provides: 1) specifically adsorbing an oxidatively damaged guanine conjugate produced as a result of damage to guanine in DNA or RNA or nucleotide contained in a sample.
  • Anion exchange column HPLC-1
  • HPLC-1 Anion exchange column
  • HPLC-2 A reverse phase column for further purifying the fraction containing the oxidatively damaged guanine compound obtained by purification on the anion exchange column
  • HPLC-2 a detector used to obtain a fraction containing an oxidatively damaged guanine compound by the anion exchange column (HPLC-1); and the reverse-phase column
  • HPLC-1 a detector used to obtain a fraction containing an oxidatively damaged guanine compound by the anion exchange column (HPLC-1); and the reverse-phase column
  • An analyzer for analyzing an oxidized damaged guanidinium ligated product comprising: a detector for measuring the purified oxidized damaged guanidiani ligated product obtained by the purification in C-2).
  • a sixteenth invention of the present invention is directed to a detector comprising a cell having a short optical path, which is used to obtain a fraction containing an oxidatively damaged guanine compound by the anion exchange column (HPLC-1).
  • the analyzer according to the fifteenth invention which is a vessel.
  • a peak signal of a marker previously prepared in a sample is received from a detector, and a valve is opened at a predetermined time after elution of the oxidatively damaged guanine conjugate.
  • An open signal is output, fractionation is started, and after a certain period of time, a fractionation end signal is output.
  • the obtained fraction containing the oxidatively damaged guanine compound is subjected to reverse phase column chromatography (HPLC-HPLC). 2) to output a signal for injection, and purify and recover the oxidized damaged guanidine conjugate eluted from the reversed-phase column (HPLC-2).
  • HPLC-HPLC reverse phase column chromatography
  • guanine in DNA, RNA, or nucleotide is damaged in a method for analyzing an oxidatively damaged guanine compound generated in the course of DNA or RNA or nucleotide damage.
  • the resulting oxidatively damaged guanine compound and the concentration correcting substance of the oxidatively damaged guanine compound can be analyzed (at the same time).
  • the time required for the labor of analyzing the sample collection, preservation, and analysis data can be reduced by almost half, and more efficient analysis of the oxidized damaged guanine ligated product is possible.
  • the analysis method of the present invention can perform a large amount of processing by performing continuous operation with high accuracy and good reproducibility and short analysis time.
  • the analyzer of the present invention can provide an analysis method having the above effects, and is inexpensive and excellent in economic efficiency.
  • oxidatively damaged guanine includes “oxidatively damaged guanine conjugate”. Both “creosides” and “oxidatively damaged guanines” are included.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of an apparatus for analyzing 8-OH-dG (8-OH-Gua) and 7-MG or Cre at a time.
  • FIG. 2 is a schematic view showing another example of an apparatus for analyzing 8-OH-dG (8-OH-Gua) and 7-MG or Cre at one time.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of fractionation of 8-OH-dG based on the peak of 8-OH-rGuo as a marker and measurement of 7-MG or Cre (HPLC-1).
  • FIG. 4 is a view showing an example of measurement of 8-OH-dG according to the embodiment of the present invention (HPLC-2).
  • FIG. 5 is a diagram showing an example in which Cre, 7-MG, 8-OH-Gua, and 8-OH-dG were analyzed at once. Explanation of symbols
  • Oxidatively damaging compounds of DNA, RNA, or nucleotides, including 8-OH-dG are compounds that result from damage to DNA, RNA, or nucleotides by active oxygen (oxygen radicals) in the body, etc. Used as an indicator.
  • Other oxidative damage compounds other than 8-OH-dG include 2-hydroxydeoxyadenosine (2-OH-dA), 5-hydroxydoxycytidine (5-OH-dC), and 5-hydroxydeoxycytidine (5-OH-dC).
  • the oxidatively damaged guanine conjugates such as 8-OH-dG, 8-OH-rGuo, and 8-OH-Gua have a negative charge, and therefore have an anion exchange described later. It can be easily purified and recovered using a column. Among these, it is particularly preferable to use 8-OH-dG as an indicator of active oxygen.
  • the oxidatively damaged guanine compound in the present application (claims, specification, etc.) is defined as a product resulting from damage of guanine in DNA or RNA or nucleotide by active oxygen. 8-OH-dG, 8-OH-rGuo, 8-OH-Gua, etc., and oxidative damage indicates hydroxylation.
  • the sample used in the analysis method for analyzing (at one time) the oxidatively damaged guanine compound (including 8-OH-dG) of the present invention and the concentration correcting substance of the oxidatively damaged guanine compound is urine.
  • all biological samples such as serum, cerebrospinal fluid, saliva, culture medium after cell culture, and the like.
  • urine is particularly preferable because urine is easily collected and the oxidatively damaged guanine conjugate is stable in urine.
  • the analysis method of the present invention comprises the steps of purifying an oxidatively damaged guanine conjugate (e.g., 8-OH-dG) and appropriately adjusting the concentration of the oxidatively damaged guanine conjugate (for example, 8-OH-dG). , 7-MG or Cre), and the process capability of measuring this oxidatively damaged guanine conjugate.
  • the analyzer of the present invention is also a member for performing the above-mentioned purification and measurement.
  • 8-OH-dG will be described as an example of the oxidatively damaged guanine conjugate
  • 7-MG and Cre will be described as examples of the concentration correcting substance of the oxidatively damaged guanine compound.
  • An apparatus for analyzing 8-OH-dG includes: 1) an anion exchange column that specifically adsorbs 8-OH-dG (HPLC-1), and 2) a detector such as a UV detector that detects a marker such as 8-OH-rGuo, which is an indicator of the elution position of 8-OH-dG, and measures 7-MG or Cre. 3) a reversed phase column (HPLC-2) for further purifying the fraction containing 8-OH-dG obtained from the anion exchange column (HPLC-1); and4) a reverse phase column (HPLC-2). It is equipped with a detector for measuring the obtained purified 8-OH-dG.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an example of the analyzer of the present invention.
  • reference numeral 11 denotes an anion exchange power column (HPLC-1), which is connected to a reverse phase column (HPLC-2) 12 via a UV detector 14 and a column switching valve 16. Further, upstream of the anion exchange column (HPLC-1) 11, a column switching valve 15 to which an autosampler 17 for injecting a sample is connected is connected.
  • an eluent for eluting molecules adsorbed on the column (anion exchange column (HPLC -1)
  • the eluent used for 11 is solution A
  • the eluent used for reversed-phase column (HPLC-2) 12 is solution B
  • a guard column (anion exchange) connected to the column switching valve 15
  • Pumps 21, 22, and 23 are provided for pumping a washing solution (solution C) for washing the column (filled with the same anion exchange resin as in HPLC-1) 11 to each column.
  • the sampler 17 and the pump 22 are connected to the column switching valve 16 and the pump 23 is connected to the column switching valve 15, respectively.
  • a sampling injector (231XL", manufactured by Gilson) having a function of automatically operating the column switching valve 16 based on the 8-OH-rGuo peak detection is used. Can be used.
  • the oxidatively damaged guanine conjugate in HPLC-1 for example, 8-OH- dG
  • HPLC-1 for example, 8-OH- dG
  • the preparative start time and end time are determined, and the acid is purified by HPLC-1 using these conditions. It is necessary to inject a dangling damage guanyin dang.
  • the measurement can be performed by installing a new program in the 231XL instead of the above method.
  • This program consists of (1) peak recognition of markers such as ribonucleoside 8-OH-rGuo, (2) start of 8-OH-dG fractionation after a fixed time, and (3) 8-OH-rGuo after a fixed time.
  • the system waits for the set time (T2), then outputs a contact signal to the valve, and starts sorting in the loop.
  • a contact signal is output to the valve to terminate the fractionation and simultaneously inject the fraction in the loop into the HPLC-2.
  • the sampling range (time) of 8-OH-dG can be automatically determined based on the relative position with a marker such as 8-OH-rGuo. ) Is determined, so it is not necessary to set the preparative range (time) of 8-OH-dG in advance.
  • the anion exchange column (HPLC-1) 11 specifically adsorbs 8-OH-dG contained in the sample, so that the recovery rate is extremely high and most impurities can be removed. Therefore, a fraction with less impurities can be obtained. Further, as described above, according to the anion exchange column (HPLC-1) 11, the negatively charged 8-OH-rGuo, 8-OH-Gua, etc. oxidatively damaged guanine conjugates. Can also be easily purified and recovered.
  • the anion exchange column (HPLC-1) 11 is not particularly limited as long as the column is made of an anion exchange resin.
  • Specific fillers include those in which a quaternary ammonium group is bonded to a styrenedibutylbenzene polymer and those in which a quaternary ammonium group is bonded to a polyhydroxymetharylate-based polymer.
  • commercially available fillers include Aminex HPX-72S (manufactured by BioRad), Shodex column packing (manufactured by Showa Denko KK), MCI GEL CA08F (manufactured by Mitsubishi Iidai Corporation, Hamilton RCX-10) ) Etc.
  • the particle diameter of the anion exchange resin good results are obtained with a particle diameter of 7 m at present! / !, but a smaller particle diameter (3-5 m)
  • the inner diameter of the column filled with the anion exchange resin is not particularly limited, but is preferably about lmm-1.5 mm.
  • an 8-OH solution is prepared using a sampling injector 27 (“233XL”, Gilson, etc.) connected to the column switching valve 16.
  • 233XL sampling injector 27
  • Gilson Gilson, etc.
  • -It is preferable to automatically inject the fraction containing 8-OH-dG into the reversed-phase column (HPLC-2) 12 by peak recognition of a marker such as rGuo.
  • a new program was installed on the 233XL for measurement.
  • This program consists of (1) peak recognition of markers such as ribonucleoside 8-OH-rGuo, (2) start of 8-OH-dG fractionation after a fixed time, and (3) 8-OH-rGuo after a fixed time.
  • dG Completion of fractionation (4) Mixing of 8-OH-dG fraction, (5) Force to perform injection to HPLC-2. More specifically, the function is realized by the following flow.
  • the system waits for the set time (T2), and then starts dispensing in the 233XL vial tube.
  • the length of the column filled with the anion exchange resin is not particularly limited, but the column can be shortened depending on the particle size, exchange capacity, etc. of the anion exchange resin, and the analysis time is reduced. Can be shortened.
  • the UV detector 14 equipped with the cell having a short optical path monitors the fraction eluted from the anion exchange column (HPLC-1) 11, and determines the elution position of 8-OH-rGuo contained in the sample. Sense. In this way, by monitoring the elution position of 8-OH-rGuo with the UV detector 14, the exact elution time of 8-OH-dG can be ascertained, and by operating the column switching valve 16 accordingly, The fraction containing 8-OH-dG can be reliably collected.
  • HPLC-1 anion exchange column
  • the UV detector 14 having a cell with a short optical path can measure 7-MG or Cre in the sample by adjusting the UV wavelength of the detector.
  • the reverse phase column (HPLC-2) 12 is for further purifying a fraction containing 8-OH-dG obtained from the anion exchange column (HPLC-1) 11, There is no particular limitation as long as it has the following properties.
  • Commercially available products include YMC—Pack ODS—AM (S-5 m) (YMC), Shiseido Capcell Pak C18 MG (S-5 m) (manufactured by Shiseido Co., Ltd.), and the like.
  • the detector 13 measures purified 8-OH-dG from which a reverse phase column (HPLC-2) power has also been obtained. And is provided downstream of the reverse phase column (HPLC-2) 12.
  • an electrochemical detector (ECD) As the detector 13, an electrochemical detector (ECD), a liquid chromatography mass spectrometer (LCMS), or the like can be used.
  • the peak of 8-OH-dG appears at a specific ratio by selecting two types of set voltages (Fig. 4), so the peak is 8- It can be confirmed that it is OH-dG.
  • the analyzer for simultaneously analyzing 8-OH-dG and 7-MG or Cre can process a large amount of samples by performing continuous operation. is there .
  • the anion exchange column (HPLC-1) 11 Can specifically adsorb 8-OH-dG contained in the sample and remove most of the contaminants contained in the sample at once.
  • a method of reliably fractionating purified 8-OH-dG using the UV detector 14 based on the elution position of a marker such as 8-OH-rGuo has excellent recovery and reproducibility.
  • the UV detector 14 having a short optical path can simultaneously measure 7-MG or Cre, which is a concentration correction substance for 8-OH-dG. Therefore, the analyzer of this embodiment can simultaneously analyze 8-OH-dG and 7-MG or Cre.
  • the detection range (time) of 8-OH-dG is automatically determined based on the relative position with 8-OH-rGuo by peak detection. Since it is determined, there is no need to set the sorting range (time).
  • the method for purifying 8-OH-dG is characterized by having a first purification step of purifying a sample by anion exchange chromatography.
  • a first purification step of purifying a sample by anion exchange chromatography not only 8-OH-dG but also 8-OH-rGuo, 8-OH-Gua, and other negatively-charged oxidatively damaged guanine conjugates have negative effects. It can be easily purified and recovered by ion exchange chromatography.
  • the column temperature is preferably 50 to 65 ° C, and in the case of a column having an inner diameter of lmm, the flow rate is preferably 17 to 25 lZmin.
  • carboxylic acid for example, formic acid, acetic acid, propionic acid (or a salt thereof) was used as an eluate in the first purification step. Include the forces S can. Among them, those containing acetic acid are preferable.
  • the method for purifying 8-OH-dG of the present invention can perform purification by previously adding 8-OH-rGuo or the like to a sample as an internal standard marker of 8-OH-dG. is there. If 8-OH-rGuo is preliminarily added to the sample, 8-OH-rGuo elutes, and after a certain period of time, 8-OH-dG elutes. By monitoring the elution position of 8-OH-dG with the UV detector 14, the exact elution position (time) of 8-OH-dG can be ascertained, and the fraction containing 8-OH-dG can be reliably collected. it can.
  • the method for purifying 8-OH-dG of the present invention uses a method in which 8-OH-rGuo or the like is previously added to the sample as an internal standard marker of 8-OH-dG, and the sample is purified by anion exchange chromatography.
  • the purification step 1 is performed, and the fraction containing 8-OH-dG obtained in the first purification step is further purified (second purification step).
  • purification is preferably performed by reversed-phase chromatography.
  • the eluent (solution B), temperature conditions, and the like used for the reversed-phase chromatography differ depending on the used reversed-phase column (HPLC-2) 12, and thus are appropriately determined.
  • HPLC-2 reversed-phase column
  • reverse phase force When analyzing human urine using YMC—Pack ODS—AM (S—5 ⁇ m) (YMC) as a ram, the column temperature should be about 40 ° C and the flow rate should be about 0.9 mlZmin. preferable.
  • the method for measuring 8-OH-dG includes a measurement step for measuring the amount of purified 8-OH-dG obtained by the above-described purification method, and includes the above-described electrochemical detector (ECD). ),
  • the amount of purified 8-OH-dG can be measured using a liquid chromatography mass spectrometer (LCMS).
  • LCMS liquid chromatography mass spectrometer
  • the above-mentioned measurement method is applicable to the measurement of not only 8-OH-dG but also 8-OH-rGuo (when not applied as a force), 8-OH-Gua and other oxidatively damaged guanine ligated products. Is also applicable.
  • 8-OH-dG is periodically used in an apparatus equipped with an autosampler 17 as shown in FIG. 1 and an apparatus equipped with a sampling injector 27 as shown in FIG. It is preferable to check the elution position of.
  • 7-MG or Cre in the injected sample is measured by the UV detector 14.
  • the wavelength of the UV detector for 7-MG measurement may be 254 nm.
  • the wavelength of the UV detector is longer than 254 nm, preferably 300 to 310 nm, in order to distinguish 7-MG from impurities.
  • Cre measurement use a cell with a wavelength of 235-260 nm, preferably 245 nm, and a short optical path (preferably about 0.2 mm).
  • the optical path length of a cell having a short optical path can be in a range of about 0.1 to lmm.
  • urine is dropped on a piece of filter paper or the like, and the urine is dried. The urine is then re-extracted from the dried piece of filter paper and analyzed.
  • urine can be collected at any location and a large amount of sample can be analyzed efficiently by sending the dried filter paper pieces to an analytical institution by mail or the like.
  • the UV detector 14 By adjusting the UV wavelength of the sample, 7-MG or Cre in the sample can be measured, which allows simultaneous analysis of 8-OH-dG and this concentration-correcting substance, 7-MG or Cre. can do.
  • 8-OH-dG can be obtained with a high recovery rate. Furthermore, since the flow rate of the anion exchange column (HPLC-1) in the first purification step is very small, the consumption of eluent (solution A) and washing solution (solution C) is extremely small, and the amount of waste liquid after purification is low. Since only a small amount is required, it is preferable from the viewpoint of environmental protection. According to the method for purifying 8-OH-dG of the present invention, purified 8-0 H-dG can be reliably fractionated, and near the peak of 8-OH-dG! A fraction can be obtained.
  • the measurement method of the present invention measures a purified oxidatively damaged guan compound such as purified 8-OH-dG or 8-OH-Gua obtained by the above-described purification method, and therefore has extremely high accuracy. It has good reproducibility.
  • mass operation is possible by continuous operation.
  • 7-MG can be quantitatively measured. 7-MG is considered to be produced in DNA by carcinogens in cigarette smoke, and this analytical method may be applicable as a method for assessing carcinogenic risk. In the analysis method of the present invention, when 7-MG is used for concentration correction, it is preferable to accurately subtract the increase in 7-MG due to smoking.
  • the method for measuring an oxidative damage guanine conjugate according to the present invention may be performed, for example, by evaluating an individual's carcinogenic risk, predicting, diagnosing, or aging a variety of diseases related to active oxygen (such as diabetes). Can be used for health assessment.
  • an 8-OH-dG standard solution is optionally injected into an analyzer in addition to a urine sample, and the peak area is compared with the urine sample. Calculate the 8-OH-dG concentration in the sample calculated by the comparison as the value obtained by dividing by the concentration of 7-MG or Cre measured simultaneously by the UV detector.
  • Human urine was placed in two Eppendorf tubes in lml volumes and frozen at 20 ° C. After thawing the frozen urine to make a uniform solution, take 1001 of the solution and dilute 2-fold with a slightly acidic solution (composition: 96 ml of 0.6 mM sulfuric acid, 4 ml of acetonitrile) to give 8-OH-rGuo. g was added. Furthermore, 6.71 was added with 2M sodium acetate (pH 4.5) to lower the pH to 7 or less. This was stirred well, cooled at 5 ° C for 2-3 hours, centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was used as a urine sample. The centrifuged urine can be directly set on a sampling injector such as 231XL to automate dilution, mixing and injection.
  • a slightly acidic solution composition: 96 ml of 0.6 mM sulfuric acid, 4 ml of acetonitrile
  • 8.71 was added with 2
  • the 8-OH-dG and 8-OH-Gua fractions collected by 8-OH-rGuo peak recognition were automatically injected into HPLC-2.
  • the column used was Innertsil ODS-3, particle size 3 m, inner diameter 4.6 mm, length 25 cm (GL Sciences Inc.), the column temperature was 30 ° C, the flow rate was 0.7 ml / min, and the eluate was EDTA '.
  • a 10 mM sodium dihydrogen phosphate solution containing 3Na salt ⁇ trihydrate (50 mg / l) and 8% methanol was used.
  • the ECD used was ECD-300 manufactured by Acom (Kyoto) (set voltage, 550 mV).
  • the analysis method of the present invention can be used in the analysis industry of biological materials such as urine.
  • the analyzer of the present invention can be used in the field of analyzers.

Abstract

　本発明は、酸化的損傷グアニン化合物と、この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを効率よく分析することができる方法、及びこの方法を実施するための分析装置を提供することを目的とする。 　本発明は、試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を精製する工程と、前記試料中に含まれる、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質をＵＶ検出器で測定する工程と、前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有し、前記酸化的損傷グアニン化合物と前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを一時に分析することを特徴とする分析方法を提供する。

Description

明 細 書
酸化的損傷グァニン化合物とこれの濃度補正物質の同時分析方法及び この分析方法に用いる分析装置
技術分野
[0001] 本発明は、酸化的損傷グァニン化合物と、この酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の濃度 補正物質との同時分析方法、特に 8-ヒドロキシデォキシグアノシン (以下、適宜「8-0 H- (10」という。）と、 7—メチルダァニン（以下、適宜「7— MG」という）又はクレアチュン (以下、適宜「Cre」という。）との同時分析方法、及びこれを実施するための分析装置 に関する。
背景技術
[0002] 近年、生体内での活性酸素の作用につ 、て多くの研究がなされて 、る。通常、活 性酸素は生体内に異物が侵入した際、防御システムとして働いている。しかしながら 、食品添加物 (発ガン性物質)、大気汚染、喫煙、ストレス等によって過剰に活性酸素 が発生すると、それらは DNAの損傷を引き起こし、酸化的 DNA損傷産物の一種で ある 8-OH-dGを生成する。この 8-OH-dGは突然変異を誘発し、発癌過程で重要 な役割を演じていると考えられている。また、活性酸素は、発癌だけでなく様々な疾 患や老化の原因として注目されている。
そのため、生体内における活性酸素量を知ることにより、個人個人の発癌リスク評 価や、活性酸素関連の様々な疾患の予測，診断、老化度、あるいは一般健康の評価 を行うことができる。
し力しながら、生体内における活性酸素は不安定であり、それらを直接検出するの は困難である。そのため、活性酸素の指標として活性酸素によって生成される 8-OH -dGを測定することが提案されている。 8-OH-dGの分析方法としては、（1) 8-OH- dGに対する抗体を結合させたァフィ-ティ-カラムで精製した分画を HPLC-ECDで 分析する方法、 (2) 2本の逆相カラムの間にカーボンカラムを接続してカラムスィッチ ング法により、最終的に 8-OH- dGを HPLC-ECDにより検出する方法 (非特許文献 1)、 （3)サンプリングインジェクター（一定分画を分取し、攪拌後、一定量をカラムに 注入する装置)を介してマルチファンクションカラム (逆相カラム、陽イオン交換カラム の機能を併せ持つゲル濾過カラム）と、逆相カラムを接続し ECDにより検出する方法 (非特許文献 2)等が報告されて ヽる。
非特許文献 1 :ボグダノフら（Bogdanov, M., B., et. al.)、フリ^ ~·ラジカル 'バイオロジ
~ ·アンド、メディスン（Free Rad. Biol. Med. )、 1999年、第 27卷、 p.647- 666 非特許文献 2 :力サイら（Kasai, H., et. al.)ジャパニーズ 'ジャーナル'ォブ 'キャンサ 一.リサーチ（jpn. j. cancer Res. )、 2001年、第 92卷、 p.9— 15
非特許文献 3 :トップら (Topp, H., et. al.)、アナリティカル 'バイオケミストリー (Anal.
Biochem.)、 1987年、第 161卷、 p.49-56
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 生体中の 8-OH-dGの値は、多くの場合、時間により変化する。そこで、 8-OH-dG を正確に定量する場合、 24時間分の試料を用意する力、 8— OH— dGに対する濃度 補正物質を用いて 8— OH— dGの濃度補正をすることが必要になる。
上述の方法にぉ 、ては、濃度補正物質を用 、て濃度補正をすることにより 8- OH- dGを定量する場合、試料を最低 2本の容器にとり、 1本を 8-OH-dG自体の分析に 用い、もう 1本を濃度補正物質 (例えば、クレアチュン (Cre) )の分析に用い、両物質 の測定値力も算出される値 (例えば、（8-OH- dGZCre) )を酸ィ匕的 DNA損傷の指 標としていた。そのため、試料の採取'保存 '分析'データの解析において煩雑な手 続きが必要であった。
[0004] 本発明は、力かる状況に鑑みてなされたものであり、酸化的損傷グァニン化合物と 、この酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の濃度補正物質とを効率よく分析することができる 方法、及びこの方法を実施するための分析装置を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0005] このような事情に鑑みて、本発明者は鋭意検討の結果、 8-OH- dGの濃度補正物 質である 7—メチルダァニン、クレアチュンを 8-OH-dGと同時に分析する方法、及び これに用いる装置により、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完 成した。 7— MGは、代謝率（metabolic rate, MR)と関係する RNA分解物であり、 RNAの分 解産物であるプソィドウリジンと一定の比率で尿中に排せっされることが知られており (非特許文献 3)、また、クレアチュンの濃度と 7— MGの濃度には強い相関があること も分かっている。したがって、 7— MGによって 8— OH— dGの値を補正した（8— OH— d G/7-MG)値は、クレアチュンによって 8— OH— dGの値を補正した（8— OH— dGZ Cre)値と同等の信頼度を持つ酸ィ匕的 DNA損傷の指標となる。
[0006] 同様に、他の RNA分解物であるプソィドウリジン、 N2, N2—ジメチルグアノシン、 N 6—スレオニノカルボ-ルアデノシン等によっても補正は可能と考えられる。
[0007] 即ち、本発明の第 1の発明は、試料中に含まれる、 DNA又は RNA又はヌクレオチ ド中のグァニンが損傷を受けた結果生じる酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を陰イオン交 換カラム (HPLC-1)で精製する工程と、前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を検出器 で測定する工程とを有することを特徴とする酸化的損傷グァニン化合物の分析方法 である。
このような構成をとることにより、前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を、簡便に分析で きるので、試料の採取 '保存 '分析'データの解析にぉ 、て労力 ·時間をほぼ半減さ せることが可能となる。
また、本発明は、多量の溶離液や洗浄液を必要とせず、有毒の廃液の発生も少な いので、環境面でも優れている。
[0008] 本発明の第 2の発明は、前記酸ィ匕的損傷グァニン化合物が、 8—ヒドロキシデォキシ グアノシン（8—OH—dG)及び Z又は 8—ヒドロキシグァニン（8— OH— Gua)である第 1 の発明に記載の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の分析方法である。
[0009] 本発明の第 3の発明は、試料中に含まれる、 DNA又は RNA又はヌクレオチド中の グァニンが損傷を受けた結果生じる酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を陰イオン交換カラ ム (HPLC-1)で精製する工程と、前記試料中に含まれる、前記酸化的損傷グァニン 化合物の濃度補正物質を検出器で測定する工程と、前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合 物を検出器で測定する工程とを有し、前記酸化的損傷グァニン化合物と前記濃度補 正物質とを一時に分析することを特徴とする酸化的損傷グァニン化合物の分析方法 である。 [0010] この方法によれば、前記酸化的損傷グァニン化合物と、前記酸化的損傷グァニン 化合物の濃度補正物質とを、同時に分析できるので、試料の採取'保存 '分析'デー タの解析にぉ 、て労力 ·時間をほぼ半減させることが可能となる。
[0011] 本発明の第 4の発明は、前記酸ィ匕的損傷グァニン化合物が、 8—ヒドロキシデォキシ グアノシン（8—OH—dG)及び Z又は 8—ヒドロキシグァニン（8— OH— Gua)であり、前 記酸化的損傷グァニン化合物の濃度補正物質が、 7 -メチルダァニン（7 - MG)及び Z又はクレアチュン (Cre)である第 3の発明に記載の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の 分析方法である。
[0012] 本発明の第 5の発明は、試料中に含まれる、 DNA又は RNA又はヌクレオチド中の グァニンが損傷を受けた結果生じる酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を陰イオン交換カラ ム (HPLC- 1)で精製する工程と、予め前記試料中に加えておいたマーカの溶出位 置を感知し、適宜、前記試料中に含まれる前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の濃度 補正物質を検出器で測定する工程と、前記酸化的損傷グァニン化合物を検出器で 測定する工程とを有し、前記酸化的損傷グァニン化合物と前記濃度補正物質とを一 時に分析することを特徴とする酸化的損傷グァニン化合物の分析方法である。
[0013] この方法によれば、予め、試料に 8-ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド） (8-OH- rGuo)等の物質を、 8-OH-dGの内部標準マーカとして加えているので、酸化的損 傷グァニンィ匕合物の、カラム力 の溶出位置（時間）、溶出液の分取範囲をより正確 に規定することが可能になり、その結果、 8-OH-dGを高精度で、且つ再現性よく測 定できる。
[0014] 本発明の第 6の発明は、前記酸ィ匕的損傷グァニン化合物が、 8—ヒドロキシデォキシ グアノシン（8—OH—dG)及び Z又は 8—ヒドロキシグァニン（8— OH— Gua)であり、前 記酸化的損傷グァニン化合物の濃度補正物質が、 7 -メチルダァニン（7 - MG)及び /又はクレアチュン（Cre)であり、前記マーカが、 8-ヒドロキシグアノシン（リボヌクレ オシド） (8-OH-rGuo)である第 5の発明に記載の酸化的損傷グァニン化合物の分 析方法である。
[0015] 本発明の第 7、 8、及び 9の発明は、前記試料が尿であることを特徴とする、それぞ れ第 1、第 3、又は第 5の発明に記載の分析方法である。 [0016] 本発明の第 10、 11、及び 12の発明は、前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを 再抽出することにより分析する、それぞれ第 7、第 8、又は第 9の発明に記載の酸ィ匕的 損傷グァニンィ匕合物の分析方法である。
このような構成をとることにより、どこにいても試料を採取することができ、郵送等によ り分析機関に大量の試料を効率よく集めることが可能になる。
[0017] 本発明の第 13の発明は、前記陰イオン交換カラム (HPLC-1)で精製する工程に お!、て、カルボン酸型のカラムおよびカルボン酸又はその塩を含む溶出液を用いる 第 1乃至 12のいずれか一つの発明に記載の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の分析方 法である。この方法により HPLC- 1における 8- OH- dG、 8- OH- Guaの溶出位置を重ね ることができ両者の同時分析が可能となる。
[0018] 本発明の第 14の発明は、前記陰イオン交換カラム (HPLC-1)により精製された前 記酸化的損傷グァニン化合物を含む分画を、更に逆相カラム (HPLC-2)により精製 する工程;及び HPLC-2により精製された精製酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を検出器 で測定する工程;を更に有する第 1乃至 12の何れか一つの発明に記載の酸ィ匕的損 傷グァニンィ匕合物の分析方法である。
この場合、 HPLC-1で精製した酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物（8-ヒドロキシデォキシ グアノシン (8- OH-dG)等）の測定は、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、（1) リボヌクレオシド 8-OH-rGuo等のマーカのピーク認識、（2)—定時間後の 8-OH-d G分取開始、（3)—定時間後の 8-OH-dG分取終了、（4)適宜、 8-OH- dG分画のミ キシング、の順序で行い、ついで、逆相カラムへ注入して行うことができる。
本発明の分析装置は、大掛かりな機構を必要とせず、安価で経済性にも優れてい る。
[0019] 本発明の第 15の発明は、 1)試料中に含まれる、 DNA又は RNA又はヌクレオチド 中のグァニンが損傷を受けた結果生じる酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を特異的に吸 着する陰イオン交換カラム (HPLC- 1)； 2)前記陰イオン交換カラム (HPLC- 1)で精 製して得られた酸化的損傷グァニン化合物を含有する分画を、更に精製する逆相力 ラム (HPLC- 2)；及び 3)前記陰イオン交換カラム (HPLC- 1)により酸化的損傷グァ ニン化合物を含有する分画を得るために用いる検出器、及び前記逆相カラム (HPL C-2)で精製して得られた精製酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を測定する検出器;を備 えたことを特徴とする酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の分析装置である。
[0020] 本発明の第 16の発明は、前記陰イオン交換カラム (HPLC-1)により酸化的損傷グ ァニン化合物を含有する分画を得るために用いる検出器力 光路の短いセルを備え た検出器である、第 15の発明に記載の分析装置である。
[0021] 本発明の第 17の発明は、予め試料中にカ卩えておいたマーカのピークシグナルを検 出器より受け、一定時間後の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の溶出時にバルブを開くシ グナルを出力し、分取を開始し、更に一定時間後に分取終了シグナルを出力し、次 Vヽで、得られた酸化的損傷グァニン化合物を含有する分画を逆相カラム (HPLC-2) へ注入するためのシグナルを出力し、該逆相カラム (HPLC- 2)から溶出する前記酸 化的損傷グァニンィ匕合物を精製 ·回収する処理を行わせるための酸ィ匕的損傷グァ- ン化合物の分析機構 (制御プログラムを含む)である。
この分析機構 (制御プログラムを含む）は、本発明の分析装置において利用するこ とにより、酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の効率的且つ正確な分析を自動化することが 可會 になる。
発明の効果
[0022] 本発明の分析方法を用いれば、 DNA又は RN A又はヌクレオチドの損傷の過程で 生成される酸化的損傷グァニン化合物を分析する方法にぉ ヽて、 DNA又は RNA 又はヌクレオチド中のグァニンが損傷を受けた結果生じる酸ィ匕的損傷グァニン化合 物と、適宜この酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の濃度補正物質とを、（同時に)分析する ことができる。そのため、試料の採取'保存 '分析'データの解析において労力'時間 をほぼ半減させることができ、より効率的な酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の分析が可能 となる。
また、本発明の分析方法は、高精度で再現性が良ぐ分析時間も短ぐ連続運転を 行うことにより、大量処理が可能である。
本発明の分析装置は、上記の効果を奏する分析方法を提供することができ、また、 安価で経済性に優れて 、る。
尚、本願においては、「酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物」には、「酸化的損傷グァニンヌ クレオシド」及び「酸化的損傷グァニン」の双方が含まれる。
図面の簡単な説明
[0023] [図 l]8-OH-dG (8-OH-Gua)と 7— MG又は Creとを一時に分析するための装置の 一例を示す模式図である。
[図 2]8-OH-dG (8-OH-Gua)と 7— MG又は Creとを一時に分析するための装置の もう一つの例を示す模式図である。
[図 3]マーカである 8— OH— rGuoのピークに基づく 8— OH— dGの分取と 7— MG又は Creの測定の例を示す図である（HPLC— 1)。
[図 4]本発明の実施に係る 8— OH— dGの測定の例を示す図である（HPLC— 2)。
[図 5]Cre、 7-MG、 8-OH-Gua, 8-OH-dGを一時に分析した例を示す図である。 符号の説明
[0024] 11 · ·陰イオン交換カラム (HPLC- 1)、 12· ·逆相カラム (HPLC- 2)、 13 · ·電気化 学検出器、 14' 'UV検出器、 15 · ·スイッチングバルブ、 16 · ·スイッチングバルブ、 1 7· 'オートサンプラー、 27· 'サンプリングインジェクター
発明を実施するための最良の形態
[0025] (DNA、 RNA又はヌクレオチドの酸化的損傷化合物）
8-OH-dGをはじめ DNA、 RNA又はヌクレオチドの酸化的損傷化合物とは、生体 内の活性酸素（酸素ラジカル)等によって DNAや RNA又はヌクレオチドが損傷を受 けた結果生じるものであり、活性酸素の指標として用いられる。 8-OH-dG以外の酸 化的損傷ィ匕合物としては、 2-ヒドロキシデォキシアデノシン（2- OH-dA)、 5-ヒドロキ シデォキシシチジン（5- OH- dC)、 5-ホルミルデォキシゥリジン（5- CHO- dU)、 8- OH- rGuo、 8-ヒドロキシグァニン (8- OH- Gua)等が挙げられる。これら酸化的損傷 化合物は、不要物として尿により生体外へ排出される。また、これらのうち 8-OH- dG 、 8-OH-rGuo、 8-OH-Gua等の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物は負の電荷を帯びて いるため、後段で説明する陰イオン交換カラムにより容易に精製、回収することがで きる。これらの中でも活性酸素の指標として、特に 8-OH-dGを用いることが好ましい 。なお、本出願 (請求項、明細書、等）における酸ィ匕的損傷グァニン化合物とは、 DN A又は RNA又はヌクレオチド中のグァニンが活性酸素によって損傷を受けた結果生 じる 8- OH- dG、 8- OH- rGuo、 8- OH- Gua等であり、酸化的損傷とはヒドロキシル 化されることを示す。
[0026] (試料）
本発明の酸化的損傷グァニン化合物（8-OH-dGを含む）と、適宜この酸化的損傷 グァニン化合物の濃度補正物質とを、（一時に)分析する分析方法に使用される試料 としては、尿、血清、髄液、唾液、細胞培養後の培地等、全ての生体試料を挙げるこ とができる。これらの中でも、尿は採取し易ぐまた尿中で酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物 は安定であるため、特に尿が好ましい。
[0027] 本発明の分析方法、及びこれを実施するための分析装置について説明する。本発 明の分析方法は、酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物 (例えば、 8-OH- dG)を精製するェ 程と、適宜この酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の濃度補正物質 (例えば、 7— MG又は Cr e)を測定する工程と、この酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を測定する工程力も構成され る。また、本発明の分析装置は、上記の精製及び測定を行うための部材カもなる。 以下、酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物として 8-OH-dGを、またこの酸ィ匕的損傷グァ- ン化合物の濃度補正物質として、 7-MG及び Creを例にとって説明する。
[0028] (分析装置）
本発明の実施形態に係る 8-OH-dGと、適宜 7— MG及び/又は Creとを分析するた めの装置は、 1) 8-OH-dGを特異的に吸着する陰イオン交換カラム (HPLC-1)と、 2) 8- OH- dGの溶出位置の指標となる 8- OH- rGuo等のマーカを感知し、 7— MG又 は Creを測定する UV検出器等の検出器と、 3)陰イオン交換カラム (HPLC- 1)から 得られた 8-OH-dGを含有する画分を更に精製する逆相カラム (HPLC- 2)と、 4)逆 相カラム (HPLC- 2)力 得られた精製 8-OH- dGを測定する検出器を具備する。
[0029] 本発明の分析装置の一例の模式図を図 1に示す。図中符号 11は陰イオン交換力 ラム（HPLC- 1)であり、これは UV検出器 14、及びカラムスイッチングバルブ 16を介 して、逆相カラム (HPLC- 2) 12と接続している。また、陰イオン交換カラム (HPLC- 1) 11の上流には、試料を注入するオートサンプラー 17が接続されたカラムスィッチ ングバルブ 15が接続している。
また、カラムに吸着した分子を溶出するための溶離液 (陰イオン交換カラム (HPLC -1) 11に用いられる溶離液を A液、逆相カラム (HPLC- 2) 12に用いられる溶離液を B液とする）、上記カラムスイッチングバルブ 15に接続されたガードカラム（陰イオン交 換カラム (HPLC- 1) 11と同一の陰イオン交換榭脂を充填)を洗浄するための洗浄液 (C液）を各カラムに送り込むためのポンプ 21、 22、 23が設けられ、ポンプ 21はォー トサンプラー 17、ポンプ 22はカラムスイッチングバルブ 16、ポンプ 23はカラムスイツ チングバルブ 15に各々接続されている。
なお、この例において、オートサンプラー 17の代わりに、 8- OH- rGuoのピーク感 知により、カラムスイッチングバルブ 16を自動的に作動させる機能を持つサンプリン グインジェクター (「231XL」、ギルソン製)等を用いることができる。
本発明の方法の実施において、 HPLC-1及び HPLC- 2の二つのカラムをカラムス イッチング法により用いる場合には、通常、 HPLC-1における酸ィ匕的損傷グァニンィ匕 合物（例えば 8-OH-dG)の標準液を予め HPLC-1に注入し、分取開始時間と、終 了時間とを決定しておき、その条件を使用して HPLC-2へ、 HPLC-1で精製済みの 酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を注入することが必要である。
一方、本発明の方法を実施にあたっては上記のような方法に代えて、 231XLに新 たなプログラムを搭載して測定を行うこともできる。このプログラムは、（1)リボヌクレオ シド 8-OH-rGuo等のマーカのピーク認識、（2)—定時間後の 8-OH-dG分取開始 、 （3)—定時間後の 8- OH- dG分取終了、（4) HPLC- 2への注入を行うものであり（ 図 3を参照）、予め、 8-OH-dG等の酸ィ匕的損傷グァニン化合物の分取範囲（時間） を設定しておく必要がない。より詳しくは、以下のフローにより機能を実現している。 (D 231XLにより試料を HPLC— 1に注入する。
(2)設定時間 (T1)だけシステムを待機させる。
(3) 231XLが UV検出器シグナルのモニターを開始する。
(4)設定 UVレベルを超える（ピーク感知）まで、システムを待機させる。
(5)ピーク感知後、設定時間 (T2)だけシステムを待機させた後、バルブへ接点信号 を出力し、ループ内に分取を開始する。
(6)設定時間 (T3)後、バルブへ接点信号を出力し、分取を終了させると同時にルー プ内の分画を HPLC— 2に注入する。 後段でも説明するが、サンプリングインジェクター（「231XL」、ギルソン製）に使用 することにより、 8- OH- rGuo等のマーカとの相対的位置により自動的に 8- OH- dG の分取範囲（時間）が決定されるため、予め、 8- OH- dGの分取範囲（時間）を設定し ておく必要がない。
[0031] 上記陰イオン交換カラム (HPLC- 1) 11は、試料中に含まれる 8- OH- dGを特異的 に吸着するので回収率が非常に高ぐ且つほとんどの夾雑物を取り除くことができる ため、不純物の少ない画分を得ることができる。また、上述したように、陰イオン交換 カラム（HPLC- 1) 11によれば、負の電荷を帯びている 8- OH- rGuo、 8- OH- Gua 等の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物においても、容易に精製、回収することができる。陰 イオン交換カラム (HPLC- 1) 11としては、陰イオン交換榭脂を充填剤としたものであ れば、特に制限はない。具体的な充填剤としては、スチレンジビュルベンゼン系ポリ マーに 4級アンモ-ゥム基が結合したもの、ポリヒドロキシメタタリレート系ポリマーに 4 級アンモ-ゥム基が結合したもの等が挙げられる。また、市販品の充填剤としては、 アミネックス HPX- 72S (BioRad製）、 Shodexカラム充填剤（昭和電工 (株）製）、 M CI GEL CA08F (三菱ィ匕成 (株)製、ハミルトン RCX— 10)等を挙げることができる また、陰イオン交換樹脂の粒子径としては、現在 7 mのものにより良好な結果が 得られて!/ヽるが、更に小粒子径（ 3— 5 m)の陰イオン交換榭脂をカラムに用いるこ とにより、より分離能が高くなり、その結果、カラム長を短くできて、分析時間を短縮す ることち可會である。
[0032] 上記陰イオン交換榭脂を充填するカラムの内径は、特に制限はないが、約 lmm— 1. 5mm程度であることが好ましい。また、カラムの内径が 2. 0-4. 6mmの場合は、 図 2に示すように、カラムスイッチングバルブ 16に接続したサンプリングインジェクター 27 (「233XL」、ギルソン製等）を用いて、 8- OH- rGuo等のマーカのピーク認識によ り、 8-OH-dGを含有する画分を自動的に逆相カラム (HPLC- 2) 12に注入すること が好ましい。なお、この方法を実施するために、 233XLに新たなプログラムを搭載し て測定を行った。このプログラムは、（1)リボヌクレオシド 8-OH-rGuo等のマーカの ピーク認識、（2)—定時間後の 8-OH-dG分取開始、（3)—定時間後の 8-OH-dG 分取終了、（4) 8- OH- dG分画のミキシング、（5) HPLC- 2への注入を行うものであ る力 より詳しくは以下のフローにより機能を実現している。
(1) 233XLにより試料を HPLC—1に注入する。
(2)設定時間 (T1)だけシステムを待機させる。
(3) 233XLが UV検出器シグナルのモニターを開始する。
(4)設定 UVレベルを超える（ピーク感知）まで、システムを待機させる。
(5)ピーク感知後、設定時間 (T2)だけシステムを待機させた後、 233XLバイアルチ ユーブ内に分取を開始する。
(6)設定時間 (T3)後、分取を終了させる。
(7)得られた分画を吸引、吐出により撹拌する。
(8)分画の一部を HPLC— 2に注入する。
上記陰イオン交換榭脂を充填するカラムの長さは、特に制限はないが、陰イオン交 換榭脂の粒子径、交換容量等によって、カラムを短くすることが可能であり、分析時 間を短縮することができる。
[0033] 上記光路の短いセルを具備した UV検出器 14は、陰イオン交換カラム (HPLC- 1) 11から溶出される画分をモニターし、試料中に含まれる 8-OH-rGuoの溶出位置を 感知する。このように、 8-OH-rGuoの溶出位置を当該 UV検出器 14でモニターする ことによって、正確な 8-OH-dGの溶出時間が把握でき、それに合わせてカラムスィ ツチングバルブ 16を作動させることにより、確実に 8-OH-dGを含有する画分を分取 することができる。
これと同時に、光路の短いセルを具備した当該 UV検出器 14は、検出器の UV波 長を調整することにより、試料中の 7-MG又は Creを測定することができる。
[0034] 上記逆相カラム (HPLC- 2) 12は、陰イオン交換カラム (HPLC- 1) 11から得られた 8-OH-dGを含有する画分を更に精製するものであり、逆相カラムの性質を有するも のであれば、特に制限はない。市販品としては、 YMC— Pack ODS— AM (S-5 m) (YMC社）、 Shiseido Capcell Pak C18 MG (S- 5 m) ( (株）資生堂製） 等が挙げられる。
[0035] 上記検出器 13は、逆相カラム (HPLC- 2)力も得られた精製 8-OH- dGを測定する ものであり、逆相カラム（HPLC-2) 12の下流に設けられている。上記検出器 13とし ては、電気化学検出器 (ECD)、液体クロマトグラフィー質量分析装置 (LCMS)等を 用いることができる。また、上記電気化学検出器 (ECD)に関しては、 2種類の設定電 圧を選ぶことにより、 8-OH-dGのピークは固有の比率で表れるため（図 4)、そのピ ークが 8-OH-dGであることを確認できる。
[0036] また、本発明の実施形態に係る 8-OH-dGと 7— MG又は Creを同時に分析するた めの分析装置は、連続運転を行うことにより大量の試料を処理することが可能である 。その場合、ガードカラム 35の洗い洗浄液 (C液）は、 0. 5M硫酸アンモ-ゥム：ァセト 二トリル = 7： 3程度の組成であることが好まし 、。
[0037] 以上説明したように、本発明の実施形態に係る 8-OH-dGと 7— MG又は Creを同 時に分析するための分析装置によれば、陰イオン交換カラム (HPLC- 1) 11が試料 中に含まれる 8-OH- dGを特異的に吸着し、試料中に含まれる夾雑物の大半を一度 に取り除くことができる。
また、 UV検出器 14によって、 8-OH-rGuo等のマーカの溶出位置に基づき、確実 に精製 8-OH- dGを分取する方法は、回収率、再現性に優れているといえる。この光 路の短い UV検出器 14は、検出器の UV波長を調整することにより、同時に 8-OH-d Gの濃度補正物質である 7-MG又は Creをも測定することができる。このため、本実 施形態の分析装置は、 8-OH-dGと、 7— MG又は Creとを同時に分析することも可能 である。
また、連続運転を行うことにより大量の試料を処理することができる。また、上述した 分析装置は比較的安価なため経済性にも優れている。
[0038] (分析方法）
以下、図 1に示す分析装置を用いて 8-OH- dGと、 7— MG又は Creとの分析方法 につ 、て説明する。（分取範囲（時間）の決定） 8-OH- dGと 8-OH-rGuoと尿との混 合物を図 1示す分析装置に注入し、予め、 8-OH-dGの分取範囲を決定しておく。 分取範囲を予め決定しておくことにより、 8-OH- dGの正確な溶出時間が把握でき 、それに合わせてカラムスイッチングバルブ 16を作動させるように設定することで、確 実に 8-OH- dGを含有する画分を分取することができる。なお、上述したように、図 1 において、オートサンプラー 17の代わりに、サンプリングインジェクター（231XL)を 用いた場合は、ピーク感知により 8-OH-rGuoとの相対的位置により自動的に 8-OH - dGの分取範囲（時間）が決定されるため、分取範囲（時間）の設定をしておく必要が ない。
[0039] (精製方法）
本発明の実施形態に係る 8-OH-dGの精製方法は、試料を陰イオン交換クロマト グラフィ一によつて精製する第 1の精製工程を有することを特徴とする。また、上述し たように、 8- OH- dGのみならず、 8- OH- rGuo、 8- OH- Gua等の負の電荷を有す る酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物においても、陰イオン交換クロマトグラフィーによって容 易に精製、回収することができる。
第 1の精製工程における溶出条件としては、カラム温度は 50— 65°C、内径 lmmの カラムの場合、流速が 17— 25 lZminとすることが好ましい。また、 8-OH-dG、 8-OH-Guaの同時分析のためには、第 1の精製工程における溶出液としては、カル ボン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸 (又はそれらの塩)を含むものを挙げること 力 Sできる。中でも酢酸を含むものが好ましい。
[0040] また、本発明の 8-OH-dGの精製方法は、予め、試料に 8-OH-rGuo等を 8-OH- dGの内部標準マーカとしてカ卩えて、精製を行うことが可能である。 8-OH-rGuoを試 料中に予め添カ卩しておくと、 8-OH-rGuoが溶出された後、一定時間後に 8-OH-d Gが溶出されるため、 8-OH-rGuoの溶出位置を UV検出器 14でモニターすることに よって、正確な 8-OH- dGの溶出位置（時間）が把握でき、確実に 8-OH-dGを含有 する画分を分取することができる。
[0041] また、本発明の 8-OH-dGの精製方法は、予め、試料に 8-OH-rGuo等を 8-OH- dGの内部標準マーカとしてカ卩えて、陰イオン交換クロマトグラフィーによる第 1の精製 工程を行 ヽ、第 1の精製工程で得られた 8-OH-dGを含有する画分を更に精製する こと (第 2の精製工程)が好まし 、。
上記第 2の精製工程としては、逆相クロマトグラフィーにより精製することが好ましい 。逆相クロマトグラフィーに用いられる溶出液 (B液）、温度条件等は、使用する逆相 カラム (HPLC- 2) 12によって異なるため、それらは適宜決定される。例えば、逆相力 ラムとして、 YMC— Pack ODS— AM (S— 5 μ m) (YMC社）を用いてヒト尿を分析す る場合は、カラム温度が約 40°C、流速が 0. 9mlZmin程度とすることが好ましい。
[0042] (測定方法）
本発明の実施形態に係る 8-OH-dGの測定方法は、上述した精製方法によって得 られた精製 8-OH-dGの量を測定する測定工程を有し、上述した電気化学検出器（ ECD)、液体クロマトグラフィー質量分析装置 (LCMS)等を用いて精製 8-OH-dG 量を測定できる。なお、上記測定方法は、 8-OH-dGのみならず、 8-OH-rGuo (マ 一力として加えない場合）、 8-OH- Gua等の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の測定にも 適用できる。
また、連続運転を行う場合、図 1に示すようなオートサンプラー 17を具備した装置に おいても、図 2に示すようなサンプリングインジェクター 27を具備した装置においても 、定期的に 8-OH-dGの溶出位置をチェックすることが好ましい。
[0043] 本発明の実施形態に係る 7— MG又は Creの測定は、注入した試料中の 7— MG又 は Creを UV検出器 14によって測定する。
試料がマウスやラットの尿である場合は、 7— MG測定のための UV検出器の波長は 254nmとしてよい。試料がヒトの尿である場合は、夾雑物と 7— MGを区別するため、 UV検出器の波長は 254nmよりも長波長として、好ましくは、 300— 310nmとする。 Cre測定のためには、波長を 235— 260nm、好ましくは 245nmとし、光路の短い（好 ましくは 0. 2mm程度）セルを用いる。光路の短いセルの光路の長さとしては、 0. 1— lmm程度の範囲とすることができる。
[0044] 本発明の実施形態に係る分析方法においては、試料として尿を用いる場合、次の 様な禾 IJ点がある。
即ち、尿をろ紙片などに滴下し、尿を乾燥させる。ついで、この乾燥したろ紙片から 尿を再抽出し、尿を分析する。
このようにすれば、尿はいずれの場所においても採取でき、乾燥したろ紙片を分析 機関に郵送などの方法で送ることにより、大量の試料を効率よく分析することができる
[0045] 以上説明したように、本発明の実施形態に係る分析方法によれば、 UV検出器 14 の UV波長を調整することにより、試料中の 7-MG又は Creを測定することができ、こ れにより、 8— OH— dGと、この濃度補正物質である 7— MG又は Creとを同時に分析 することができる。
本発明の分析方法では、 8— OH— dGを回収率良く得られる。更に、第 1の精製ェ 程における陰イオン交換カラム (HPLC-1)の流速が微量であるため、溶離液 (A液） 、洗浄液 (C液)の消費が極めて少なぐ精製後の廃液量も少量で済むため、環境保 全の面からも好ましい。本発明の 8-OH-dGの精製方法によれば、確実に精製 8-0 H-dGを分取でき、 8-OH-dGのピーク付近にお!、て夾雑物がほとんどな!/、画分を 得ることができる。また、連続運転を行っても、 8-OH-rGuo等のマーカのピークを感 知させる方法を用いれば、サンプル毎の分取範囲のズレに対応して、確実に 8-OH- dGを含有する画分を分取することができる。また、本発明の測定方法は、上記精製 方法によって得られた精製 8-OH-dG又は 8-OH-Gua等の精製酸ィ匕的損傷グァ- ン化合物を測定するので、非常に精度が高ぐ再現性を有する。また、連続運転を行 うことにより大量処理が可能である。
[0046] なお、本発明の分析方法では、 7— MGを定量的に測定することができる。 7-MG は、タバコ煙中の発癌物質により DNA中に生じるとされ、本分析方法は発癌リスク評 価の方法としても応用できる可能性がある。本発明の分析方法においては、 7— MG を濃度補正に用いる場合、正確には喫煙による 7— MGの増加分を差し引くことが好 ましい。
[0047] なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなぐ本発明の 趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。例えば、溶 離液 (A液、 B液）、洗浄液 (C液)の組成等は、使用するカラム（充填剤）により適宜変 更可能である。
本発明の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の測定方法は、例えば、個人個人の発癌リス クの評価、活性酸素関連の様々な疾患 (糖尿病等)の予測，診断、老化度、あるいは 一般的健康の評価に用いることができる。
上記測定方法により得られた結果の評価方法として、例えば 8-OH- dGの場合、 8 - OH-dG標準溶液を随時、尿試料の他に分析装置に注入し、そのピーク面積との 比較により算出された試料中の 8-OH- dG濃度を、 UV検出器によって同時に測定 された 7-MG又は Creの濃度で割った値として算出する。
実施例
[0048] 以下、実施例により本発明を具体的に説明する力 本発明はこれに限定されるもの ではない。
(尿試料の調製）
ヒトの尿を lmlずつ 2本のエツペンドルフチューブに取り、 20°Cで凍結した。凍結 した尿を解凍して均一な液とした後、その 100 1を取り、微酸性溶液 (組成; 0. 6m M硫酸を 96ml、ァセトニトリル 4ml)で 2倍に希釈し、 8- OH- rGuoを g加えた。 更に 2M酢酸ナトリウム (pH4. 5)を 6. 7 1加え、 pHを 7以下にした。これをよく攪拌 し、 5°Cで 2— 3時間冷却後、 15000回転、 5分間遠心分離を行い、その上清を尿試 料とした。なお、遠心した尿を直接 231XL等のサンプリングインジェクターにセットし 、希釈、ミクシング、注入を自動化することも可能である。
[0049] (8— OH— dGの精製.分画と 7— MG又は Creの測定）
この尿試料 20 μ 1を陰イオン交換カラム（MCI GEL CA08F、粒径 7 μ m、 sulfa te型）内径 1. 5mm、ガードカラムの長さ 4cm、本カラムの長さ 12cm)によって精製し た。カラムの温度は 65度とし、流速は 50 1Z分とし、溶出液は 0. 3mMの硫酸（2% ァセトニトリルを含む）を用いた。
この分離により、 UV検出器（「UVZVIS—155」、ギルソン製）（吸光波長 305nm 及び 245nm)を用いて、それぞれ 7—MGと Creを検出した。この分析における 8—0 H— rGuoピーク認識は、 305nmにより行った。検出の結果を図 3に示す。
[0050] 図 3に示すように、 7— MGと Creのピークが検出され、本実施例により、 7— MGと Cr eが測定できることが分かった。また、 8-OH-dGは、 8-OH-rGuoの溶出から一定の 時間差を置いて溶出された。そのため、 8-OH-rGuoの溶出をモニターすることによ り、正確な 8-OH-dGの溶出位置を把握でき、確実に 8-OH-dGを有する画分を得 ることが可能であることが分力つた。
[0051] (8— OH— dGの精製と測定）
上記の、陰イオン交換クロマトグラフィーにより得た 8-OH-dGを含有する画分を自 動的に逆相クロマトグラフィーに注入した。なお、逆相カラムとして、 Shiseido Cape ell Pak C18 MG (S— 5 /z m) (250 x 4. 6mm)を用!ヽ、 lOmMリン酸緩衝液（p H6. 7 ;これは 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 7)を希釈して調製したものであり、 pHは 多少異なる）、 5%メタノール (MeOH)溶離液 (B液）を用い、カラム温度は 40°C、流 速 lmlZminとした。その分離パターンを図 4に示す。なお、この分離パターンは、電 気化学検出器（「ESA Coulochem Π」、 ESA社）（電圧：ガードセル 350mV;チヤ ンネル 1、 170mV;チャンネル 2、 300mV)を用いて検出した。
[0052] 図 4に示すように、 8— OH— dGのピークが検出され、本実施例により、 8— OH— dG が測定できることが分力つた。
上記図 3により得られた 7— MG又は Creのピークの面積と、図 4より得られた 8— OH —dGのピークの面積から、（8— OH— dGZ7— MG)又は（8— OH— dGZCre)の値を 算出し、これをもって、酸ィ匕的 DNA損傷の指標とすることができる。
[0053] (8- OH- dG及び 8- OH- Guaの同時分析）
遠心したヒト尿をサンプリングインジェクター 231XLにセットし 8-OH-rGuo ( 120mg/ml)を含む微酸性希釈液 (組成； 125 mM酢酸ナトリウム (pH4.5)溶液 99ml;ァ セトニトリル lml)で自動的に希釈 (1:1)、 ミクシング、 HPLC- 1への注入 (20 1)を行つ た。カラムは陰イオン交換カラム（MCI GEL CA08F、 粒径 7 m、 acetate型；内径 1.5mm, ガードカラムの長さ 4cm、 本カラムの長さ 12cm)を用い、カラム温度は 55 °Cとし、流速は 50 1/分とし、溶離液は 0.5%ァセトニトリルを含む 5mM酢酸を用いた 。 8- OH- rGuoのピーク認識により分取された 8- OH- dG、 8- OH- Gua分画は自動 的に HPLC- 2に注入された。カラムは Innertsil ODS-3、 粒径 3 m、内径 4.6mm、 長さ 25cm(GL Sciences Inc.)を用い、カラム温度は 30°Cとし、流速は 0.7ml/分とし、溶 離液は EDTA'3Na塩 · 3水和物 (50mg/l)および 8%メタノールを含む 10mMリン酸二水 素ナトリウム溶液を用いた。なおこの分析例にお!、ては ECDはエイコム社 (京都)製 ECD-300を用いた（設定電圧、 550mV)。
結果を図 5に示した。
産業上の利用可能性
[0054] 本発明の分析方法は、尿等の生体物質の分析業界において用いることができる。 本発明の分析装置は、分析機器の業界において用いることができる。

Claims

請求の範囲
[1] 試料中に含まれる、 DNA又は RNA又はヌクレオチド中のグァニンが損傷を受けた 結果生じる酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を陰イオン交換カラム (HPLC-1)で精製する 工程と、
前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を検出器で測定する工程とを有することを特徴と する酸化的損傷グァニン化合物の分析方法。
[2] 前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物が、 8—ヒドロキシデォキシグアノシン (8— OH— dG )及び Z又は 8—ヒドロキシグァニン（8— OH— Gua)である請求項 1記載の酸ィ匕的損 傷グァニン化合物の分析方法。
[3] 試料中に含まれる、 DNA又は RNA又はヌクレオチド中のグァニンが損傷を受けた 結果生じる酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を陰イオン交換カラム (HPLC-1)で精製する 工程と、
前記試料中に含まれる、前記酸ィ匕的損傷グァ-ンィ匕合物の濃度補正物質を検出 器で測定する工程と、
前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を検出器で測定する工程とを有し、
前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物と前記濃度補正物質とを一時に分析することを特 徴とする酸化的損傷グァニン化合物の分析方法。
[4] 前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物が、 8—ヒドロキシデォキシグアノシン (8— OH— dG )及び Z又は 8—ヒドロキシグァニン（8— OH— Gua)であり、
前記酸化的損傷グァニン化合物の濃度補正物質が、 7 -メチルダァニン（7 - MG) 及び Z又はクレアチュン (Cre)である請求項 3に記載の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物 の分析方法。
[5] 試料中に含まれる、 DNA又は RNA又はヌクレオチド中のグァニンが損傷を受けた 結果生じる酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を陰イオン交換カラム (HPLC-1)で精製する 工程と、
予め前記試料中に加えておいたマーカの溶出位置を感知し、適宜、前記試料中に 含まれる前記酸ィ匕的損傷グァ-ンィ匕合物の濃度補正物質を検出器で測定する工程 と、 前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を検出器で測定する工程とを有し、 前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物と前記濃度補正物質とを一時に分析することを特 徴とする酸化的損傷グァニン化合物の分析方法。
[6] 前記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物が、 8—ヒドロキシデォキシグアノシン (8— OH— dG
)及び Z又は 8—ヒドロキシグァニン（8— OH— Gua)であり、
前記酸化的損傷グァニン化合物の濃度補正物質が、 7 -メチルダァニン（7 - MG) 及び Z又はクレアチュン (Cre)であり、
前記マーカが、 8-ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（8-OH-rGuo)である請 求項 5に記載の酸化的損傷グァニン化合物の分析方法。
[7] 前記試料が尿である請求項 1に記載の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の分析方法。
[8] 前記試料が尿である請求項 3に記載の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の分析方法。
[9] 前記試料が尿である請求項 5に記載の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の分析方法。
[10] 前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを再抽出することにより分析する請求項 7 に記載の酸化的損傷グァニン化合物の分析方法。
[11] 前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを再抽出することにより分析する請求項 8 に記載の酸化的損傷グァニン化合物の分析方法。
[12] 前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを再抽出することにより分析する請求項 9 に記載の酸化的損傷グァニン化合物の分析方法。
[13] 前記陰イオン交換カラム (HPLC-1)で精製する工程において、カルボン酸型の力 ラムおよびカルボン酸又はその塩を含む溶出液を用いる請求項 1乃至 12のいずれ か一項に記載の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の分析方法。
[14] 前記陰イオン交換カラム (HPLC-1)により精製された前記酸化的損傷グァニンィ匕 合物を含む分画を、更に逆相カラム (HPLC-2)により精製する工程;及び
HPLC-2により精製された精製酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を検出器で測定するェ 程；
を更に有する請求項 1乃至 12の何れか一項に記載の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の 分析方法。
[15] 1)試料中に含まれる、 DNA又は RNA又はヌクレオチド中のグァニンが損傷を受け た結果生じる酸ィ匕的損傷グァニン化合物を特異的に吸着する陰イオン交換カラム（ HPLC-1)；
2)前記陰イオン交換カラム (HPLC-1)で精製して得られた酸化的損傷グァニン化 合物を含有する分画を、更に精製する逆相カラム (HPLC-2)；及び
3)前記陰イオン交換カラム (HPLC-1)により酸化的損傷グァニン化合物を含有す る分画を得るために用いる検出器、及び前記逆相カラム (HPLC- 2)で精製して得ら れた精製酸化的損傷グァニン化合物を測定する検出器；
を備えたことを特徴とする酸化的損傷グァニン化合物の分析装置。
[16] 前記陰イオン交換カラム (HPLC-1)により酸化的損傷グァニン化合物を含有する 分画を得るために用いる検出器が、光路の短いセルを備えた検出器である、請求項 15記載の分析装置。
[17] 予め試料中に加えておいたマーカのピークシグナルを検出器より受け、一定時間 後の酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物の溶出時にバルブを開くシグナルを出力し、分取を 開始し、
更に一定時間後に分取終了シグナルを出力し、
次 、で、得られた酸化的損傷グァニン化合物を含有する分画を逆相カラム (HPLC -2)へ注入するためのシグナルを出力し、該逆相カラム (HPLC- 2)から溶出する前 記酸ィ匕的損傷グァニンィ匕合物を精製 ·回収する処理を行わせるための酸ィ匕的損傷 グァニン化合物の分析機構 (制御プログラムを含む)。
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