JPH08189929A - ヒドロキシ（・ｏｈ）ラジカルによるｄｎａの酸化的損傷の新測定法 - Google Patents
ヒドロキシ（・ｏｈ）ラジカルによるｄｎａの酸化的損傷の新測定法Info
- Publication number
- JPH08189929A JPH08189929A JP256395A JP256395A JPH08189929A JP H08189929 A JPH08189929 A JP H08189929A JP 256395 A JP256395 A JP 256395A JP 256395 A JP256395 A JP 256395A JP H08189929 A JPH08189929 A JP H08189929A
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- Japan
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- oxidative damage
- dna
- ohdg
- deoxyguanosine
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 この発明は、野菜、海藻、香辛料などいろい
ろな食品、または天然物から抗酸化物を夫々抽出し、そ
れが生体のＤＮＡの酸化的損傷に影響する度合いを、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ系で簡易に測定することを目的にしたも
のである。 【構成】 ・ＯＨラジカルによるＤＮＡの酸化的損傷の
度合の指標を、８−ＯＨｄＧ生成量とし、インビトロ
（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系で測定することを特徴とした・
ＯＨラジカルによるＤＮＡの酸化的損傷の新測定法。
ろな食品、または天然物から抗酸化物を夫々抽出し、そ
れが生体のＤＮＡの酸化的損傷に影響する度合いを、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ系で簡易に測定することを目的にしたも
のである。 【構成】 ・ＯＨラジカルによるＤＮＡの酸化的損傷の
度合の指標を、８−ＯＨｄＧ生成量とし、インビトロ
（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系で測定することを特徴とした・
ＯＨラジカルによるＤＮＡの酸化的損傷の新測定法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は・ＯＨラジカルによる
ＤＮＡの酸化的損傷の度合の指標を、８−ＯＨｄＧ生成
量とし、インビロト（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系で測定する
ことを目的としたヒドロキシ（・ＯＨ）ラジカルによる
ＤＮＡの酸化的損傷の新測定法に関するものである。
ＤＮＡの酸化的損傷の度合の指標を、８−ＯＨｄＧ生成
量とし、インビロト（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系で測定する
ことを目的としたヒドロキシ（・ＯＨ）ラジカルによる
ＤＮＡの酸化的損傷の新測定法に関するものである。
【０００２】
【従來の技術】従來ＤＮＡの酸化的損傷の指標として、
８−ＯＨｄＧ生成量がよく用いられてきたが、多くの実
験では、ラットやヒトの血清、尿中の８−ＯＨｄＧ生成
量を測定するなど、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）系で測
定が行われていた。
８−ＯＨｄＧ生成量がよく用いられてきたが、多くの実
験では、ラットやヒトの血清、尿中の８−ＯＨｄＧ生成
量を測定するなど、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）系で測
定が行われていた。
【０００３】
【発明により解決すべき課題】ＤＮＡの酸化的損傷は、
癌や糖尿病などの病気を引き起こしたり、老化の原因に
もなることが知られている。そこで従來は前記のような
ＤＮＡの酸化的損傷の度合を測定する方法が採用されて
いるが、この方法は幾多の利点がある反面、動物実験施
設の設置が必要であり、ヒトの血液を用いる場合には、
採血、分析の専門家を必要とするなどコストもかかり、
時間もかかるうえ、個体差なども考慮に入れねばなら
ず、数多くの試料のスクリーニングには不向きであっ
た。
癌や糖尿病などの病気を引き起こしたり、老化の原因に
もなることが知られている。そこで従來は前記のような
ＤＮＡの酸化的損傷の度合を測定する方法が採用されて
いるが、この方法は幾多の利点がある反面、動物実験施
設の設置が必要であり、ヒトの血液を用いる場合には、
採血、分析の専門家を必要とするなどコストもかかり、
時間もかかるうえ、個体差なども考慮に入れねばなら
ず、数多くの試料のスクリーニングには不向きであっ
た。
【０００４】
【課題を解決する為の手段】この発明では、ＤＮＡの酸
化的損傷モデルとして、２´−デオキシグアノシンの酸
化を誘導した。その反応は、試料溶液中に圧縮空気を１
時間送り込み、フェントン反応で・ＯＨラジカルを発生
させ、２´デオキシグアノシンの酸化を誘導させるとい
うもので、測定時間もかからず、装置も、空気を送り込
むボンベさえあればよいというものである。また、高速
液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣという）による
測定も、１つの試料溶液を測定するのに約５０分ででき
るのでサンプルが多かったり、繰り返し測定を行う場合
などには、オートサンプラーに試料をセットしておけば
よく、その後、人が不在でも測定の継続が可能となる。
化的損傷モデルとして、２´−デオキシグアノシンの酸
化を誘導した。その反応は、試料溶液中に圧縮空気を１
時間送り込み、フェントン反応で・ＯＨラジカルを発生
させ、２´デオキシグアノシンの酸化を誘導させるとい
うもので、測定時間もかからず、装置も、空気を送り込
むボンベさえあればよいというものである。また、高速
液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣという）による
測定も、１つの試料溶液を測定するのに約５０分ででき
るのでサンプルが多かったり、繰り返し測定を行う場合
などには、オートサンプラーに試料をセットしておけば
よく、その後、人が不在でも測定の継続が可能となる。
【０００５】即ちこの発明は・ＯＨラジカルによるＤＮ
Ａの酸化的損傷の度合の指標を、８−ＯＨｄＧ生成量と
し、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系で測定すること
を特徴としたヒドロキシ（・ＯＨ）ラジカルによるＤＮ
Ａの酸化的損傷の新測定法である。またＤＮＡ分子の構
造中、特に酸化的損傷を受けやすい部位とされる２´デ
オキシグアノシンを用いてその酸化を誘導し、これをＤ
ＮＡの酸化的損傷のモデルとしたものであり、８−ＯＨ
ｄＧ（８−ヒドロキシデオキシグアノシン）の生成量は
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定
することを特徴としたものである。
Ａの酸化的損傷の度合の指標を、８−ＯＨｄＧ生成量と
し、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系で測定すること
を特徴としたヒドロキシ（・ＯＨ）ラジカルによるＤＮ
Ａの酸化的損傷の新測定法である。またＤＮＡ分子の構
造中、特に酸化的損傷を受けやすい部位とされる２´デ
オキシグアノシンを用いてその酸化を誘導し、これをＤ
ＮＡの酸化的損傷のモデルとしたものであり、８−ＯＨ
ｄＧ（８−ヒドロキシデオキシグアノシン）の生成量は
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定
することを特徴としたものである。
【０００６】
（１）試料の調製 ごぼう２０ｇを水洗後、包丁で細切し、これに５００ｍ
l の水を加え、９５℃で１時間煮た後、３０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離し、その上澄液だけをとって、沈澱
物を除去する。ついで上澄液をロータリーエバポレータ
ーにかけて、４０℃でブリックス３０まで濃縮し、この
濃縮液を遠心濃縮機にかけ、４０℃で真空中で乾固し、
試料として供した。
l の水を加え、９５℃で１時間煮た後、３０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離し、その上澄液だけをとって、沈澱
物を除去する。ついで上澄液をロータリーエバポレータ
ーにかけて、４０℃でブリックス３０まで濃縮し、この
濃縮液を遠心濃縮機にかけ、４０℃で真空中で乾固し、
試料として供した。
【０００７】（２）試薬の調製 １）０．１Ｍ りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８） ２）１０ｍｇ／ｍL 試料溶液（りん酸ナトリウム緩衝
液中） ３）３．１９６ｍＭ ２´デオキシグアノシン（ｄＧ）
（９．１ｍｇ／１０ｍL りん酸ナトリウム緩衝液） ４）０．１Ｍ アスコルビン酸（０．１７６ｇ／１０ｍ
L りん酸ナトリウム緩衝液） ５）０．１Ｍ エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）
（０．３７２ｇ／１０ｍL りん酸ナトリウム緩衝液） ６）０．１Ｍ 硫酸鉄（II）７水和物（０．２７８ｇ／
１０ｍL りん酸ナトリウム緩衝液）
液中） ３）３．１９６ｍＭ ２´デオキシグアノシン（ｄＧ）
（９．１ｍｇ／１０ｍL りん酸ナトリウム緩衝液） ４）０．１Ｍ アスコルビン酸（０．１７６ｇ／１０ｍ
L りん酸ナトリウム緩衝液） ５）０．１Ｍ エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）
（０．３７２ｇ／１０ｍL りん酸ナトリウム緩衝液） ６）０．１Ｍ 硫酸鉄（II）７水和物（０．２７８ｇ／
１０ｍL りん酸ナトリウム緩衝液）
【０００８】（３）２´デオキシグアノシンの酸化およ
び８−ＯＨｄＧ生成量の測定 試験官内で１０ｍｇ／ｍL 試料溶液（５００μL ）、
３．１９６ｍＭ ２´デオキシグアノシン（７８０μL
）、０．１Ｍ アスコルビン酸（１４０μL ）、０．
１Ｍ ＥＤＴＡ（６５μL ）を混合し、５０℃で１時間
インキュベートする。これに、０．１Ｍ 硫酸鉄（II）
７水和物（１５μL ）を添加し、約２０ｍL ／ｍｉｎの
流量で圧縮空気を流し込み、２´デオキシグアノシンの
酸化を誘導する。反応液中に生成された８−ＯＨｄＧ生
成量を反応前と１時間反応後に高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定する。なお、コントロー
ルは試料溶液を添加せず、代わりにりん酸ナトリウム緩
衝液を５００μL 加えて、同様の実験を行った。
び８−ＯＨｄＧ生成量の測定 試験官内で１０ｍｇ／ｍL 試料溶液（５００μL ）、
３．１９６ｍＭ ２´デオキシグアノシン（７８０μL
）、０．１Ｍ アスコルビン酸（１４０μL ）、０．
１Ｍ ＥＤＴＡ（６５μL ）を混合し、５０℃で１時間
インキュベートする。これに、０．１Ｍ 硫酸鉄（II）
７水和物（１５μL ）を添加し、約２０ｍL ／ｍｉｎの
流量で圧縮空気を流し込み、２´デオキシグアノシンの
酸化を誘導する。反応液中に生成された８−ＯＨｄＧ生
成量を反応前と１時間反応後に高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定する。なお、コントロー
ルは試料溶液を添加せず、代わりにりん酸ナトリウム緩
衝液を５００μL 加えて、同様の実験を行った。
【０００９】（４）ＨＰＬＣの測定条件 カラム； Ｎａｋａｒａｉ ｔｅｓｑｕｅ ＣＯＳ
ＭＯＳＩＬ−５Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ） 溶媒； Ａ液 酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）、Ｂ液
５０％アセトニトリル／メタノール（７０／３０） 流量； ０．８ｍL ／ｍｉｎ カラム温度； ３０℃ 検出波長； ２５４ｎｍ
ＭＯＳＩＬ−５Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ） 溶媒； Ａ液 酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）、Ｂ液
５０％アセトニトリル／メタノール（７０／３０） 流量； ０．８ｍL ／ｍｉｎ カラム温度； ３０℃ 検出波長； ２５４ｎｍ
【００１０】以上のように実験を行った。ごぼうと同様
の処理により他の試料も処理し、同様の測定を行った結
果を表１に示した。また、コントロールのインキュベー
ト前と後のクロマトグラムを図１に示し、ごぼう、紫大
根葉、青しそ、じゃがいも、黒豆、コントロールのクロ
マトグラムを図２に示した。
の処理により他の試料も処理し、同様の測定を行った結
果を表１に示した。また、コントロールのインキュベー
ト前と後のクロマトグラムを図１に示し、ごぼう、紫大
根葉、青しそ、じゃがいも、黒豆、コントロールのクロ
マトグラムを図２に示した。
【００１１】
【表１】
【００１２】
【発明の効果】この発明によれば、簡易にｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ系での、食品によるＤＮＡの酸化損傷の抑制の度合
いが測定できる。また、食品だけでなく、薬品、化粧品
などにも応用が可能である。この発明を利用して、数多
くの試料のスクリーニングを行い、良い結果のでたもの
について、さらに動物実験またはヒトを被検者とした実
験を行い、効果を確認できるので、測定の無駄を最少限
に抑えることができる。またこの発明を利用することに
より、測定について大幅なコストの削減、時間の短縮及
び労力の激減ができるなどの諸効果がある。
ｒｏ系での、食品によるＤＮＡの酸化損傷の抑制の度合
いが測定できる。また、食品だけでなく、薬品、化粧品
などにも応用が可能である。この発明を利用して、数多
くの試料のスクリーニングを行い、良い結果のでたもの
について、さらに動物実験またはヒトを被検者とした実
験を行い、効果を確認できるので、測定の無駄を最少限
に抑えることができる。またこの発明を利用することに
より、測定について大幅なコストの削減、時間の短縮及
び労力の激減ができるなどの諸効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）ＨＰＬＣによるスタンダードの図。
（ｂ）同じく５０℃での・ＯＨラジカル生成系による酸
化反応前の図。（ｃ）同じく５０℃での・ＯＨラジカル
生成系による酸化反応１時間後の図。
（ｂ）同じく５０℃での・ＯＨラジカル生成系による酸
化反応前の図。（ｃ）同じく５０℃での・ＯＨラジカル
生成系による酸化反応１時間後の図。
【図２】（ａ）ＨＰＬＣによるごぼうエキスの図。
（ｂ）同じく紫大根葉エキスの図。（ｃ）同じく青しそ
エキスの図。（ｄ）同じくじゃがいもエキスの図。
（ｅ）同じく黒豆エキスの図。（ｆ）同じくコントロー
ルの図。
（ｂ）同じく紫大根葉エキスの図。（ｃ）同じく青しそ
エキスの図。（ｄ）同じくじゃがいもエキスの図。
（ｅ）同じく黒豆エキスの図。（ｆ）同じくコントロー
ルの図。
フロントページの続き (72)発明者 松木 和美 静岡県袋井市春岡723番地の１ 日研フー ド株式会社内
Claims (3)
- 【請求項１】 ・ＯＨラジカルによるＤＮＡの酸化的損
傷の度合の指標を、８−ＯＨｄＧ生成量とし、インビト
ロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系で測定することを特徴とした
ヒドロキシ（・ＯＨ）ラジカルによるＤＮＡの酸化的損
傷の新測定法。 - 【請求項２】 ＤＮＡ分子の構造中、特に酸化的損傷を
受けやすい部位とされる２´デオキシグアノシンを用い
てその酸化を誘導し、これをＤＮＡの酸化的損傷のモデ
ルとしたことを特徴とする請求項１記載のヒドロキシ
（・ＯＨ）ラジカルによるＤＮＡの酸化的損傷の新測定
法。 - 【請求項３】 ８−ＯＨｄＧ（８−ヒドロキシデオキシ
グアノシン）の生成量は高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を用いて測定することを特徴とした請求項
１記載のヒドロキシ（・ＯＨ）ラジカルによるＤＮＡの
酸化的損傷の新測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP256395A JPH08189929A (ja) | 1995-01-11 | 1995-01-11 | ヒドロキシ（・ｏｈ）ラジカルによるｄｎａの酸化的損傷の新測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP256395A JPH08189929A (ja) | 1995-01-11 | 1995-01-11 | ヒドロキシ（・ｏｈ）ラジカルによるｄｎａの酸化的損傷の新測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08189929A true JPH08189929A (ja) | 1996-07-23 |
Family
ID=11532848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP256395A Pending JPH08189929A (ja) | 1995-01-11 | 1995-01-11 | ヒドロキシ（・ｏｈ）ラジカルによるｄｎａの酸化的損傷の新測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08189929A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003076925A1 (fr) * | 2002-03-14 | 2003-09-18 | Hiroshi Kasai | Procede de purification de nucleocide guanine blesse par oxydation, procede de mesure d'un tel nucleocide et dispositif d'analyse destine a ce mode de realisation |
| WO2005050191A1 (ja) * | 2003-10-27 | 2005-06-02 | Hiroshi Kasai | 酸化的損傷グアニン化合物とこれの濃度補正物質の同時分析方法及びこの分析方法に用いる分析装置 |
| CN104181250A (zh) * | 2014-08-30 | 2014-12-03 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种细胞dna中8-羟基脱氧鸟苷和脱氧鸟苷的检测方法 |
-
1995
- 1995-01-11 JP JP256395A patent/JPH08189929A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003076925A1 (fr) * | 2002-03-14 | 2003-09-18 | Hiroshi Kasai | Procede de purification de nucleocide guanine blesse par oxydation, procede de mesure d'un tel nucleocide et dispositif d'analyse destine a ce mode de realisation |
| EP1484609A1 (en) * | 2002-03-14 | 2004-12-08 | Hiroshi Kasai | Method of purifying oxidatively injured guanine nucleoside, method of measuring the same and analyzer for the embodiment thereof |
| EP1484609A4 (en) * | 2002-03-14 | 2005-05-04 | Hiroshi Kasai | PROCESS FOR PURIFYING WOUND GUANINE NUCLEOCIDE BY OXIDATION, METHOD FOR MEASURING SUCH A NUCLEOCIDE AND ANALYSIS DEVICE FOR THIS EMBODIMENT |
| WO2005050191A1 (ja) * | 2003-10-27 | 2005-06-02 | Hiroshi Kasai | 酸化的損傷グアニン化合物とこれの濃度補正物質の同時分析方法及びこの分析方法に用いる分析装置 |
| CN104181250A (zh) * | 2014-08-30 | 2014-12-03 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种细胞dna中8-羟基脱氧鸟苷和脱氧鸟苷的检测方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040525 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050329 |