DE102008028908B3

DE102008028908B3 - Nachweis eines Analyten in einem wässrigen Medium

Info

Publication number: DE102008028908B3
Application number: DE102008028908A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. Weber
Original assignee: IFP Privates Institut fuer Produktqualitet GmbH
Current assignee: IFP Privates Institut fuer Produktqualitet GmbH
Priority date: 2008-06-18
Filing date: 2008-06-18
Publication date: 2009-12-31
Anticipated expiration: 2028-06-19
Also published as: WO2009153293A1; EP2304055B1; US8785210B2; US20110124126A1; WO2009153327A1; ES2607446T3; EP2304055A1

Abstract

Testbesteck für den Nachweis eines Analyten in einer wässrigen Probe, umfassend chromatographische Teststreifen auf einen Hapten-Antihapten-Komplex sowie erste und zweite standardisierte Gefäße für die Aufnahme und zum Aufstellen von Teststreifen, welche für den Aufbau des Hapten-Antihapten-Komplexes auf der Innenwand aufgetrocknet jeweils erste und zweite Hapten-gekoppelte Rezeptoren gegen den Analyten enthalten, wobei ein Teil der standardisierten Gefäße zudem jeweils eine bekannte Menge an Analyt enthalten, eingebettet in einer glasartigen Schicht von Trehalose, die so auf eine Innenwand des Kontrollgefäßes als Schicht aufgetrocknet ist, dass die Schicht bei der Umsetzung der Probe mit den Hapten-gekoppelten Rezeptoren in der wässrigen Probenlösung in Lösung geht. Durch diese Standardisierungen können sicher Analyten in unbekannten Proben über einen Hapten-Antihapten-Komplex immunchromatographisch innerhalb weniger Minuten nachgewiesen werden.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Testbesteck auf Basis eines Teststreifens für den chromatographischen Nachweis eines Immunkomplexes mit dem Analyten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Lateral-flow-Immunoassays verbinden in synergistischer Weise die Geschwindigkeit der Dünnschichtchromatographie mit der Selektivität, Spezifität und Sensitivität immunologischer Nachweisverfahren. Es gibt sie als Teststreifen für die verschiedensten Fragestellungen. Sie erlauben einen spezifischen Nachweis von antigenen Stoffen und Biomolekülen. Als Beispiele seien genannt Proteine, Peptide, Antikörper, Antigene, Immunogene, Autoimmunantigene, Carbohydrate, Pathogene und Keime (bakterielle, parasitäre, virale, fungale, mykotoxische, toxische), Nukleinsäuren, DNA, RNA, Oligo- und Polynukleotide. PCR-Produkte. Die Teststreifen gibt es mit verschiedenen sensitiven Nachweissystemen und integriert in Vorrichtungen, welche die Auswertung der Analyse erleichtern sollen (siehe EP 0291194 B2 und Verweise hierin). Die Teststreifen werden auch eingesetzt zur Charakterisierung und Identifizierung von Nahrungsmitteln, zum Beispiel zur Bestimmung der Art und der Herkunft von Fisch (siehe WO 2002/042416 A2 und Verweise hierin).
Eine besondere Gruppe bilden die Teststreifen für den Nachweis von Hapten-Antihapten-Komplexen siehe US 2002/0119497 A1 . Bei diesen Teststreifen ist auf der stationären Phase der Dünnschichtchromatographie in der sogenannten Nachweiszone ein Rezeptor gegen das erste Hapten immobilisiert. Oberhalb der stationären Trennschicht – einer dünnen Schicht aus sehr feinkörnigem Material wie Kieselgel, Kieselgur, Aluminiumoxid, Cellulose – ist in chromatographischer Laufrichtung zur Adsorption der mobilen Phase ein Saugkissen angeordnet und davor eine Kontrollzone mit einem Rezeptor gegen den Antihapten-Antikörper. Der Probenauftrag erfolgt in einem Bereich, der mit einem farbstoffmarkierten Antihapten-Antikörper vorbereitet ist. Die im Handel befindlichen Testgebinde enthalten dann neben dem Teststreifen noch Gefäße mit Antikörpern gegen den Analyten, welche mit den jeweiligen Reporterhaptenen konjugiert sind. Der Test erfolgt so, dass die Probe in einem Lyse- oder Elutionspuffer dispergiert und aufgenommen wird. Es folgt gegebenenfalls eine partielle Aufreinigung des Analyten. Dann werden zwei mit verschiedenen Reporterhaptenen gekoppelte Antikörper gegen den Analyten der Probe zugesetzt und ein mit zwei Haptenen markierter Sandwich-Immunkomplex hergestellt, natürlich nur, wenn Analyt in der Probe zugegen ist. Der doppelt haptenmarkierte Nachweiskomplex kann dann stets gleich innerhalb einer Minute auf dem Teststreifen nachgewiesen werden. Ein besonders gängiges Hapten-Antihapten-System verwendet Biotin und Digoxigenin als Reporterhaptene.

Bei der chromatographischen Auftrennung auf dem Teststreifen binden dann an den Nachweiskomplex in der vorbereiteten Markierungszone die dort imprägnierten mobilen Farbstoff-markierten Antihapten-Antikörper (z. B. monoklonale Goldpartikel-markierte Maus-anti-Digoxigenin-IgG) und dann wird der farbige Nachweiskomplex in Trennrichtung in der Nachweiszone von einem dort immobilisierten Antihapten-Rezeptor, zum Beispiel Avidin oder Streptavidin, der das Biotin im Nachweiskomplex bindet, in einer Farbbande konzentriert. Eine ablesbare Farbbande steht für die Anwesenheit von Analyt in der Probe. In der Kontrollzone wären in dem gegebenen Beispiel polyklonale Anti-Maus-Fcg-Antikörper (Ziege-IgG-Antikörper gegen die konstante Region des goldmarkierten Maus-IgG-Antikörpers) immobilisiert und in ihr werden die mobilen goldmarkierten Anti-Digoxigenin-Antikörper konzentriert. Die Bildung einer Farbbande in Trennrichtung oberhalb der Nachweiszone steht für eine erfolgreiche chromatographische Auftrennung. Die Auswertung des Teststreifens erfolgt dann im Wesentlichen gemäß nachstehender Tabelle I. TABELLE I

Markerzone	Nachweisbande	Kontrollbande	Ergebnis	Kommentar
+/–			Ohne Ergebnis	Falsche Handhabung des Teststreifens
–	XXX	XXX	Positiv	Hohe Konzentration an Analyt in der Probe
+/–	XX	XXX	Positiv	Probe enthält Analyt
+/–	X	XXX	schwach positiv	Geringe Menge Analyt/unspezifische Bildung von Nachweiskomplex
+/–	–	XXX	Negativ	kein Analyt bzw. keine Komplexbildung
+/–	–	XX	Negativ/unklar	kein Analyt bzw. keine Komplexbildung
+/–	–	X	Ohne Ergebnis	Bildung des Nachweiskomplexes und/oder Chromatographie inhibiert (pH; Inhibitoren oder chaotropische Substanzen); Probe enthält Maus-Immunglobulin
+/–	X	–	Ohne Ergebnis	Chromatographie inkomplett

Es bedeuten: XXX eine intensive Färbung; XX eine starke Färbung; X eine schwache Färbung; – keine Färbung und +/– keine oder unspezifische Verfärbungen.

Es ist nicht immer leicht, die Farbe und die Intensität von Banden richtig einzuschätzen, insbesondere wenn eine Erwartungshaltung für ein bestimmtes Ergebnis besteht. Der Ausschluss des menschlichen Faktors ist für die praktische Zuverlässigkeit eines Tests äußerst wichtig, da die technisch einfachen Teststreifen auch von nicht oder nur wenig geschulten Person vorgenommen werden sollen. Aber auch eine intensive Schulung kann menschliche Fehler nicht verhindern, insbesondere bei Reihenuntersuchungen, übergroßer Routine, unter Stress, bei Ablenkungen oder plötzlichen Störungen. Andererseits sind auch ökonomische Gesichtspunkte zu beachten und die Kosten sowie den Zeitaufwand für die Kontrolle.
Daher werden in Zusammenhang mit Teststreifen verschiedene kodierte Gehäuse vorgeschlagen, welche Fehler in der Interpretation der Banden vermeiden helfen sollen. Es wird weiterhin vorgeschlagen, die Farbbanden selbsterklärlich als lesbare Plus- und Minuszeichen (+/–) zu gestalten. Trotzdem verbleiben viele Fehlermöglichkeiten, insbesondere bei der Probenaufbereitung und der Herstellung des Nachweiskomplexes. Der Stand der Technik repräsentiert sich daher als Problem.
Es ist Aufgabe der Erfindung, einen Testkitt auf Basis des erörterten Teststreifens für einen Hapten-Antihapten-Nachweiskomplex zur Verfügung zu stellen, bei dem Fehler in der Handhabung und Auswertung ausgeschlossen sind. Insbesondere ist eine Aufgabe der Erfindung, einen Testkit zur Verfügung zu stellen, der prinzipielle Fehler in der Probenaufbereitung und in der Bildung des Nachweiskomplexes aufgedeckt. Weiterhin ist es eine Aufgabe der Erfindung, einen Testkit zur Verfügung zu stellen, der in Zweifelsfällen eine Nachanalyse erlaubt und der insbesondere geeignet ist für die rasche analytische Untersuchung von Nahrungsmitteln auf Hauptallergene und Keime gemäß den aktuellen EU-Richtlinien.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Testbesteck gemäß Anspruch 1 und das ihm zugrunde liegende Verfahren. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen beschrieben.
Der Testkit umfasst Chromatographieteststreifen mit einer Markierungszone, die mit mobilen markierten Antikörpern oder Rezeptoren gegen ein Reportermolekül getränkt ist, eine Nachweiszone, in der ein erster Rezeptor gegen ein Reportermolekül an der stationären Phase gebunden ist, und eine Kontrollzone, die auf der chromatographischen Trennstrecke nach der Nachweiszone liegt und in der ein zweiter Rezeptor gegen den mobilen markierten Antikörper oder Rezeptor an der stationären Phase gebunden ist, sowie erste und zweite Reportermolekül-gekoppelte Rezeptoren für den Aufbau eines Nachweiskomplexes. Der Testkit zeichnet sich weiterhin dadurch aus, dass er erste bezeichnete Gefäße umfasst für die Aufnahme und zum Aufstellen von jeweils eines chromatographischen Teststreifens sowie zweite bezeichnete Gefäße für die Aufnahme und zum Aufstellen von jeweils eines zweiten Teststreifens, wobei die ersten bezeichnete Gefäße jeweils eine bekannte trockene Menge an Analyt enthalten, eingebettet in einer wasserlöslichen Schicht von Trehalose, die so an einer Wand des ersten Gefäßes als dünne Schicht aufgetrocknet ist, dass sie bei der Umsetzung der Probe mit den Reportermolekül-gekoppelten Rezeptoren gegen den Analyten mit der wässrigen Probenlösung in Kontakt gelangt, die wasserlösliche Schicht mit der bekannten Menge an Analyt dann sofort in Lösung geht, und im ersten Gefäß ein Nachweiskomplex mit der bekannten Menge an Analyt hergestellt wird, der bei der chromatographischen Analyse des Nachweiskomplexes auf dem Teststreifen nachgewiesen wird und eine innere Kontrolle für die Probenaufbereitung, die Komplexbildung und die chromatographische Auftrennung darstellt, und wobei die zweiten bezeichneten Gefäße keine Menge an Analyt enthalten.
Die Reportermolekül-gekoppelten Rezeptoren gegen den Analyten sind bevorzugt Antikörper, bevorzugt polyklonale Antikörper oder unterschiedliche monoklonale Antikörper, die mit den jeweiligen Reportermolekülen gekoppelt sind. Für den Nachweis von Glycokonjugaten können als Rezeptoren auch Lektine eingesetzt werden. Die Reportermoleküle sind bevorzugt ausgewählt aus nicht-radioaktiven Markierungen und Haptenen wie Biotin, Digoxigenin, Digoxin, Streptavidin, Avidin, HRP (Meerrettichperoxidase), alkalische Phosphatase, para-Nitrophenol, Texasrot, Fluorochromen wie Fluorescein, Rhodamin, Coumarin, und so weiter.
Es sind unendliche viele Hapten-Antihapten-Systeme denkbar. Werden an Haptenen gekoppelte Primärantikörper (oder Lektine für die Detektion von Glycokonjugaten) eingesetzt, können sie mit Hapten-erkennenden markierten Reagenzien sichtbar gemacht werden. Beispiele für Markierungen sind AMCA, TRITC FITC, Cy2, Cy3 und Cy5, und insbesondere Goldpartikel. Besonders bevorzugt sind goldmarkierte Antikörper gegen das jeweilige Hapten beziehungsweise Reportermolekül. Auch in Betracht kommen Streptavidin- und anti-Biotin-Konjugate für die Darstellung biotinylierter Primärantikörper, während anti-Digoxin-Konjugate stark mit dem Aglycon Digoxigenin kreuzreagieren und sich somit eignen für die Detektion digoxigenierter Proteine (Härtig et al., J. Neurosci. Methods 1996, 67, 89–95). Hapten-Antihapten-Verfahren sind unter anderem dann von Vorteil, wenn der Einsatz von sekundären, gegen Maus gerichteten Antikörpern unerwünscht zur Detektion endogener Immunglobuline führen würde.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Farbstoff-markierte Antikörper oder Rezeptor im Auftragsfeld ein goldmarkierter monoklonaler Mausantikörper gegen Digoxigenin. Der in der Nachweiszone der Laufstrecke gebundene erste Rezeptor ist im Biotin-Digoxigenin-System dann Streptavidin oder Avidin. Der zweite auf der festen Phase in einer Kontrollzone gebundene Rezeptor wäre dann zum Beispiel ein polyklonaler Ziegen-Antikörper gegen den konstanten Bereich von Maus-Immunglobulin. Der Testkit enthält dann neben dem so vorbereiteten Teststreifen weiterhin digoxigenierte und biotinylierte Antikörper gegen den Analyten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthalten die ersten und zweiten Gefäße des Testkits weiterhin vorgegebene Mengen an Reportermolekül-gekoppelten Antikörpern und zwar eingebettet in einer Schicht Trehalose auf der Innenwand der Gefäße, die dann hierdurch zu Reaktionsgefäßen werden. Die beiden haptengekoppelten Antikörper sind bevorzugt getrennt, und auch getrennt von der definierten Menge Kontrollanalyt, in jeweils einer eigenen Trehaloselösung auf die Wand des Probengefäßes unter Ausbildung von glasartigen Schichten aufgetrocknet. Die jeweiligen Gefäße für die Aufnahme der wässrigen Probe mit dem Analyten enthalten dann auf der Wand, jeweils eingebettet in einer dünnen glasartigen Trehaloseschicht, definierte Mengen an haptengekoppelten Antikörper gegen den Analyten. Die haptengekoppelten Antikörper liegen bevorzugt in äquimolaren Mengen vor, wobei Unterschiede in der Avidität, Spezifität und Sensitivität der Antikörper gegebenenfalls durch Anpassung der Mengen beziehungsweise der Endkonzentrationen in der Probenlösung ausgeglichen werden können. Das erste Gefäß, das Kontrollgefäß enthält neben den haptengekoppelten Antikörpern weiterhin, eingebettet in einer Schicht Trehalose, eine definierte Menge an Kontrollanalyt.
Der Test erfolgt dann so, dass in einem Schritt die zu untersuchende Probe in einem Lyse- oder Elutionspuffer dispergiert und aufgenommen wird. Falls erforderlich folgt gegebenenfalls eine weitere Behandlung oder Aufbereitung des Probe beziehungsweise eine partielle Aufreinigung des Analyten. Es werden dann gleiche Mengen an Probenlösung in das erste und zweite Gefäß, das Kontrollgefäß und das Testgefäß gegeben, die beiden Reaktionsgefäße kurz geschüttelt, so dass die Trehaloseschichten mit den Antikörpern beziehungsweise mit dem Kontrollanalyt in Lösung gehen. Nach der vorgegebenen Inkubationszeit mit den Antikörpern werden die beiden Teststreifen in die Probenlösungen gestellt und nach Ende der Dünnschichtchromatographie die Banden abgelesen.
Alternativ können auch die haptengekoppelten beziehungsweise digoxigenierten und biotinylierten Antikörper gegen den Analyten den beiden Probenlösungen zugesetzt werden. Dies ist aber weniger bevorzugt, da das Zusetzen von zwei Lösungen zu zwei Reaktionsgefäßen unter dem Gesichtspunkt des Ausschaltens des menschlichen Faktors problematisch ist. Reihenuntersuchungen mit einer Vielzahl Proben nebeneinander bedürfen dann allerhöchster Konzentration, denn es passiert zu leicht, dass ein Reaktionsgefäß übersehen oder übersprungen wird, ein anderes zweimal das Gleiche erhält, ein Drittes doppelte Mengen von einem Reagens, aber nicht von anderem, und so weiter.
Bei dem erfindungsgemäßen Testkit mit den Sicherheits-Testgefäßen sind derartige Fehler ausgeschlossen, denn es kommt für ein richtiges Ergebnis nur noch darauf an, dass die Gefäße überhaupt eine wässrige Lösung mit der zu untersuchenden Probe erhalten. Ob eine Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß gefüllt wurde, sollte zu sehen sein und ein Fehlen von Flüssigkeit im Probengefäß wird im Übrigen bei der Chromatographie ohne Zutun angezeigt.
Es war bislang nicht bekannt, die Aufstell- und Chromatographiegefäße für Lateral-flow-Immunoassays intelligent auszustatten. Bislang wurden stets dem Gefäß mit der Probe die haptenmarkierten Antikörper für den Nachweiskomplex in flüssiger Form zugesetzt. Die Logik einer nachgeschalteten Analyse mittels Dünnschichtchromatographie ist nämlich, den Analyt, den Nachweiskomplex nachzuweisen und das Aufstellgefäß für die Dünnschichtchromatographie gehört gedanklich bereits zur Analyse. Im Übrigen waren auch Löslichkeits- und Stabilitätsprobleme mit aufgetrockneten haptengekoppelten Anti-Analyt-Antikörpern zu befürchten, und die Gefahr, dass sich der Nachweiskomplex nicht bilden kann. Die Auftrocknung der haptengekoppelten Antikörper in das Aufstellgefäß und deren Kombination mit einem Kontrollgefäß mit einer definierten Menge Kontrollanalyt stellen daher eine elegante Lösung der Probleme dar.
In der Dünnschichtchromatographie jedenfalls binden an einen Nachweiskomplex zunächst die markierten Antikörper gegen das erste Hapten (zum Beispiel, die goldmarkierten monoklonalen Maus-Anti-Digoxigenin-Antikörpern) aus der imprägnierten Markierungszone und dann wird der goldmarkierte Nachweiskomplex auf dem Teststreifen in chromatographischer Auftrennrichtung in der Nachweiszone von dem dort immobilisierten Rezeptor (zum Beispiel Streptavidin, welches das Biotin im Nachweiskomplex bindet) in einer typisch goldroten Farbbande konzentriert. Die Farbbande kann dann abgelesen werden. In der Kontrollzone sind in einer Bande polyklonale Anti-Maus-Fcg-Antikörper aufgetragen, zum Beispiel Ziegen-IgG-Antikörper gegen die konstante Region des Maus-IgG-Antikörpers, welche die goldmarkierten Anti-Digoxigenin-Antikörper der mobilen Phase binden. Die Bildung einer Farbbande in der Kontrollzone bestätigt, dass eine Auftrennung auf dem Teststreifen erfolgte und eine flüssige mobile Phase im Aufstellgefäß vorhanden war. Die Bande in der Kontrollzone bestätigt aber nur, dass die chromatographische Auftrennung prinzipiell geeignet war, einen haptenmarkierten Sandwichkomplexes nachzuweisen. Nur die Kontrolle im Kontrollgefäß und auf dem Kontrollstreifen deckt prinzipielle Fehler in der Probenaufbereitung und in der Bildung des Nachweiskomplexes auf. Gleichzeitig werden durch den Testkits Fehler in der Durchführung ausgeschlossen, denn der Test ist in allen Nachweisschritten so geführt, dass alle Schritte jeweils logisch sichtbar vorgenommen werden. Mit anderen Worten, alle Schritte erscheinen – trotz der Komplexität des Tests – auch dem ungeschulten Anwender als logisch und sind physisch sichtbar, was das Vertrauen in den Test stärkt.

Auch die Auswertung des Versuchs wird klarer. Die gemeinsame Auswertung eines Proben- und eines Kontrollstreifens lässt, anders als die bisherigen Einfachtests, keine Lücken in der Auswertung zu. Der Testkit mit Proben- und Kontrollgefäß und zwei Teststreifen offenbart jeden Fehler in der Bildung des Nachweiskomplexes und der Probenaufbereitung. Tabelle 2 zeigt die Auswertetabelle des beanspruchten Testkits. TABELLE 2

Teststreifen	Markierzone	Nachweisbande	Kontrollbande	Beurteilung/Kommentar
Testgefäß	+/–	–	–	Falsche Handhabung, keine flüssige Probe, Nachweisreaktion negativ
Kontrollgefäß	+/–	–	–

Testgefäß	–	XXX	XXX	Analyt in der Probe positiv Komplex- und Nachweisreaktion positiv
Kontrollgefäß	–	XXX	XXX

Testgefäß	+/–	XX	XXX	Analyt in der Probe positiv Komplex- und Nachweisreaktion positiv
Kontrollgefäß	+/–	XXX	XXX

Testgefäß	+/–	X	XXX	Analyt in der Probe schwach positiv Komplex- und Nachweisreaktion positiv
Kontrollgefäß	+/–	XXX	XXX

Testgefäß	+/–	–	XXX	Analyt in der Probe negativ Komplex- und Nachweisreaktion positiv
Kontrollgefäß	+/–	XXX	XXX

Testgefäß	+/–	–	XX	Fehlerhafte Probenaufbereitung oder Inhibitor zugegen, da Komplex- und Nachweisreaktion negativ
Kontrollgefäß	+/–	–	XXX

Testgefäß	+/–	X	–	Fehlerhafte Probenaufbereitung oder Nachweisreaktion, Nachweisreaktion negativ
Kontrollgefäß	+/–	X	–

XXX intensive Färbung
XX starke Färbung
X schwache Färbung
– keine Färbung
+/– keine oder unspezifische Verfärbungen

Erfindungsgemäß werden also die Immunchromatographie auf den Teststreifen mit der Probenvorbereitung in einem Test- und einem Kontrollgefäß funktionell und sichtbar verkoppelt. Das Mitführen innerer Kontrollen ist zwar in der analytischen Chemie bekannt, neu ist aber, die innere Kontrolle mit einem Gefäß zu verkoppeln, welches gemäß Gebrauchsanleitung und Gestaltung als mechanische Aufstellvorrichtung für einen chromatographischen Teststreifen verwendet werden wird. Indem weiterhin die Probengefäße beziehungsweise Aufstellvorrichtungen in den besonders bevorzugten Ausführungsformen die wesentlichen Nachweisreagenzien enthalten, einschließlich der inneren Kontrolle, sind Fehler durch Verwechseln und Auslassen der Zugabe von Nachweisreagenzien ausgeschlossen. Auch können das Proben- und das Kontrollgefäß als Gefäßpaare gestaltet werden, beziehungsweise die Standardteststreifen durch farb- oder mechanische Kodes so gestaltet sein, dass sie nur zusammen mit einem bestimmten Gefäß (Proben- oder Kontrollgefäß) verwendet werden.
Das Auftrocknen von Reportermolekül-konjugierten Antikörpern, Bindeproteinen oder Aptameren in stabiler Form als vitrifizierte Schicht auf die Wand von Probengefäßen ist bekannt. Wenngleich es vielerlei Möglichkeiten gibt, vitrifizierte Schichten auf die Wand von Probengefäßen aufzubringen (siehe z. B. US 5,098,893 von Franks et al., US 6,669,963 von Kampinga et al.) oder Biomoleküle in glasartigen Zuckermassen haltbar zu machen (siehe z. B. Rachamachandran et al, in 1st Transdisciplinary Conference an Distributed Diagnosis and Home Healthcare; IEEE Piscataway, NJ, USA, 20006; US 5,593,824 von Treml et al.), so sind derartige Verfahren in Verbindung mit einer Dünnschichtchromatographie von Immunkomplexen unbekannt.
Die bekannte Menge Analyt beziehungsweise die nötigen Mengen an Reportermolekül-konjugierten Rezeptoren (Antikörper, Antikörperfragmente, Bindeproteine, RNA, DNA, Aptameren) können aus wässriger Lösung, der zwischen 20 und 200 mM/L Trehalose zugesetzt wurde, in einem Fleck in einer glasartigen Schicht auf die Innenwand des Proben- oder Kontrollgefäßes aufgetrocknet werden. Das Auftrocknen der Analyt- beziehungsweise der Rezeptormenge in einer Trehaloselösung kann bei erhöhter Temperatur, bevorzugt bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 45°C, gegebenenfalls bei leichtem Unterdruck erfolgen, um die Trocknung und Vitrifizierung zu beschleunigen. Im Stand der Technik werden weiterhin verschiedene Zucker und Makromoleküle zugesetzt, um die Glasübergangstemperatur geeignet anzupassen (siehe Aksan et al, Isothermal Desication and Vitrification Kinetics of Trehalose-Dextran Solutions in Langmuir 2004, 5521–5529) oder um poröse, leicht lösliche, glasartige Reagenzperlen zu erhalten (siehe US 5,593,824 von Treml et al.)
Die bekannten Verfahren eignen sich nicht für alle Analyten und insbesondere nicht für temperaturempfindliche Bindemoleküle und Antikörper. Zudem führen sie oft zu Schichten, welche nur langsam in Lösung gehen oder worin die gesuchten Biomoleküle in veränderter Form vorliegen. Erfindungsgemäß werden Lösungen von Analyt und/oder Reportermolekül-konjugierten Rezeptoren, welche 20 bis 600 mM Trehalose, bevorzugt 20 bis 250 mM Trehalose enthalten, getrennt als Tropfen auf die Innenwand von Proben- und Kontrollgefäß aufgetragen, dann schockgefroren bei minus 40 Grad Celsius, bevorzugt bei minus 70 bis 100 Grad Celsius, so dass die Trehalose hierbei in der Lösung nicht auskristallisiert, und dann die Tropfen unter Erwärmen auf Raumtemperatur eingetrocknet, wobei in den Tropfen enthaltene Feuchtigkeit wegsublimiert wird. Man erhält so auf der Innenwand Schichten oder Flecken von glasartiger, aber poröser Struktur, welche an der Innenwand des Gefäßes fest anhaften und bei Transport oder Schütteln des Gefäßes bei Transport oder Lagerung sich nicht ablösen oder wandern. Die Trehalose verdrängt bei der Trocknung die Wassermoleküle in den Wasserstoffbrücken mit den Biomolekülen und macht diese auf der Gefäßwand über lange Zeiträume haltbar. Das Schockgefrieren der Lösung bewirkt, dass ohne großes Zutun stets eine glasartige, fest an der Wand des Gefäßes anhaftende Trehaloseschicht erhalten wird. Durch die nachfolgende Sublimation der Feuchtigkeit aus der festen vitrifizierten Schicht wird erreicht, dass sie zugleich porös ist und bei Zugabe von Wasser beziehungsweise wässriger Probenlösung auf der Stelle in Lösung geht.
Ist die Trehalose-Konzentration in der Ausgangslösung höher eingestellt, kann die Trehalose nicht mehr auskristallisieren und dann funktioniert die Trehalosetrocknung auch ohne Gefrierschritt. Ein einfaches Eintrocknen der trehalosehaltigen Reagenslösung bei Umgebungsdruck und 37°C liefert dann für Antikörperlösungen hinsichtlich der Langzeitstabilität und Wiederlöslichkeit beste Resultate. Die optimale Eintrocknungszeit liegt dann bei circa vier Stunden. Längere Trocknunszeiten haben sich als schlecht erwiesen
Wenngleich nicht bevorzugt, können die Antikörperlösung auf in mehrfach konzentrierten Salz- und Pufferlösungen eingetrocknet werden. Antikörper bleiben in der Regel auch bei Trocknung aus fünffacher PBS-Lösung, pH 7,4 stabil und avid (1 × PBS = 8 g NaCl; 0,2 g KCl; 1.44 g Na₂HPO₄, 0.24 g KH₂PO₄ in 1000 ml aqua dest, pH 7.4 mit HCl). Es muss dann aber sichergestellt sein, dass kein Wandern der Trockensubstanz auftreten kann und auch keine unlöslichen Phosphatkomplexe gebildet werden.
Es bietet sich auch an, die Reaktion zur Bildung des Nachweiskomplexes scheinbar sichtbar zu machen, beispielsweise durch eine parallele unabhängige Farbreaktion zweier Begleitkomponenten. Die beiden Komponenten der begleitenden Farbreaktion werden bevorzugt getrennt mit den jeweiligen haptengekoppelten Antikörpern auf die Wand des Reaktions- und Aufstellgefäßes aufgetrocknet. Beim Lösen der haptengekoppelten Antikörper für den Nachweiskomplex in der Probenlösung gehen dann auch die Komponenten für die begleitende Farbreaktion mit in Lösung und können miteinander reagieren. Die Komponenten für die begleitende Farbreaktion werden vorzugsweise so gewählt, dass der resultierende Farbstoff chromatographisch nicht aktiv ist. Wenn beispielsweise die chromatographische Trennschicht Stärke oder Amylose enthält, dann können die Komponenten für die begleitende Farbreaktion Iod-Pyrrolidon- Komplex und Amylose sein, welche eine typisch tiefblaue Inklusionsverbindung ergeben. Es können auch Zweikomponentenfarbstoffe beziehungsweise Entwicklerfarbstoffe als Begleitkomponenten verwendet werden. In vielen Fällen wird auch der Einbau einfacher farbintensiver Farbstoffe in die Trehaloseschicht genügen, bevorzugt solcher, die ein ganz anderes Laufverhalten in der chromatographischen Auftrennung besitzen, zum Beispiel Perylenfarbstoffe.
Indem erfindungsgemäß fertige Testgefäße allen Reagenzien und mit und ohne einer bekannten Menge Kontrollanalyt bereitgestellt werden, kann zudem selbst nach Durchführung des Tests und dem Vorliegen eines ersten Ergebnisses nochmals und zeitlichem Abstand eine Blind- und eine Positivkontrolle erfolgen. Dadurch kann man unklare Farbbanden aus dem Versuch mit den Banden der Blind- und der Positivkontrolle vergleichen und dieser Vergleich erlaubt sichere Nachbewertung des ersten Ergebnisses. Natürlich kann die Blind- und Positivkontrolle auch von vornherein erfolgen, was die Durchführung von Reihentests wesentlich erleichtert. Die positive und die negative Blindprobe sind auch wichtig für die Festlegung der Nachweisgrenzen. Letztere bestimmen auch definierte Menge an Kontrollanalyst auf der Wand des Kontrollgefäßes.
Bei Lebensmitteluntersuchungen genügt es vielfach nicht mehr, diese einfach auf die An- oder Abwesenheit eines Stoffes zu untersuchen, sondern die Analyse muss stets in einem Bezugssystem erfolgen, denn die Bedeutung des Verbraucherschutzes nimmt europaweit und weltweit zu. Auch die gesetzlichen Anforderungen an die Qualitätssicherung bei der Herstellung und Verwendung von Lebensmitteln sind in den letzten Jahren ständig gestiegen, und Lebensmittelhersteller und Lebensmittelhandel müssen die erweiterten Qualitätssicherungsmaßnahmen in ihre Betriebsprozesse integrieren. Dies umfasst sowohl analytische Untersuchungen als auch die Umsetzung von Hygiene- und Qualitätsmanagementsystemen.
Der erfindungsgemäße Testkit bietet schnelle und einfache Hilfe bei vielen analytisch- und hygienischrelevanten Fragestellungen rund um Lebensmittel, Futtermittel, Nahrungsergänzungsmittel und Produkte aus ökologischem Anbau, denn über die festgelegte innere Kontrolle und die Nachweisgrenze werden für den Teststreifenanwender die analytischen Grenzdefinitionen erfahrbar, so dass eine Beurteilung von Lebensmitteln und deren Verkehrsfähigkeit gemäß den gesetzlichen Vorgaben auch mit Teststreifensystemen erfolgen kann. Das erfindungsgemäße Testbestecksystem ist daher adaptierbar auf Verkehrsfähigkeitsuntersuchungen, chemische und mikrobiologische Untersuchungen, eine Überprüfung der gesetzlichen Deklarationspflicht (Vollmilch, Vollei, Haselnuss, Mandel, Kombination von Haselnuss und Mandel, Erdnuss, Pistazie, Kirsche, Kichererbsen, Bohnen, Macadamia, Walnuss, Cashewnuss, Senf, Sellerie, Soja, Fisch im Allgemeinen und deren Arten, Krustazeen und Mollusken, Getreide und Cerealien), Produktions- und Routinekontrollen, Freigabeanalytik, mikrobiologische Untersuchungen auf Verderbniserreger, pathogene beziehungsweise produktspezifische Mikroorganismen (Salmonellen, Helicobacter, Norovirus, Clostridium, und so weiter), molekularbiologische Untersuchungen (Allergene, Tierarten, Antibiotika, ZNS und BSE mittels Gensonden und PCR-Techniken), Mykotoxinanalytik (Bestimmung von Aflatoxinen, Ochratoxin A, DON, Patulin, Zearalenon).
Weitere Einsatzbereiche sind die unmittelbare Stuhldiagnostik (zum Beispiel auf Salmonellen, Clostridium difficile A/B Toxine, Norovirus, Helicobacter pylori, Clostridium, Zöliakie, und so weiter) oder die Urinanalytik (zum Beispiel Legionella Sertyp A lösliches Protein und andere). Neben dem sicheren Nachweis und das Vorliegen einer inneren Kontrolle sind offenkundige Vorteile des erfindungsgemäßen Testbestecksystems dessen lange Haltbarkeit. Insbesondere besteht keine Gefahr des Eintrocknens von Reagenzien. Ferner bietet das Testbestecksystem die Sicherheit, dass die Reagenzien immer in den richtigen Mengen und im richtigen Verhältnis bei der Probenuntersuchung vorliegen. Bei der Zugabe von Reagenzien durch Zutropfen bestand immer das Problem des Vergessens, Verzählens, Vertauschens und Verschüttens von Reagenzien.
Es wird nun die Erfindung und deren Ausführungsformen an Beispielen und mit Bezug auf die anliegenden Abbildungen beschrieben.
KURZBESCHREIBUNG DER
Es zeigt:
1 eine Photographie von drei Teststreifen, wobei mit Teststreifen A eine Probe mit einer Menge Kontrollanalyt von der Wand des Aufstell- und Probengefäß untersucht wurde, mit Teststreifen B die gleiche Probe ohne Kontrollanalyt und mit Teststreifen C eine Negativprobe (ohne Analyt);
2 eine Schemazeichnung des Nachweisprinzips;
3a eine Photographie von zwei Teststreifen mit positiver und negativer Blindprobe, wobei die positive Blindprobe (rechter Streifen) den unteren Grenzwert (Soll-Nachweisempfindlichkeit) darstellt und die negative Blindprobe (linker Streifen) keinen Analyt enthält;
3b eine Photographie von vier Teststreifen mit einem Vergleichspaar aus negativer Blindprobe und negativer Probe (linkes Streifenpaar) sowie einem Vergleichspaar aus positiver Probe und versetzter positiver Probe (rechtes Streifenpaar).
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Entwicklung des Sicherheitsschnelltests gemäß der Erfindung umfasst prinzipiell folgende Schritte: (i) Immunisieren von Tieren gegen den Analyten und Aufreinigen der Antikörper; (ii) Koppeln beziehungsweise Konjugieren der aufgereinigten Antikörper mit geeigneten Reportermolekülen wie Biotin und Digoxigenin; (iii) Testen der so hergestellten Antikörper auf Standardteststreifen, zum Beispiel Biotin-Digoxigenin-Teststreifen, und mit verschiedenen Proben; und (iv) Ermitteln der Nachweisgrenze.
Im Prinzip genügt die Etablierung eines Teststreifensystems, da die gleichen Reportermoleküle (z. B. Biotin und Digoxigenin) für den Nachweis von vielen verschiedenen Biomolekülen verwendet werden können. Darin liegt auch der Reiz des Hapten-Antihapten-Systems beziehungsweise eines Teststreifensystems auf der Basis von Reportermolekülen. Teststreifen für den Nachweis eines Sandwichkomplexes mit den Haptenen Biotin und Digoxigenin sind kommerziell erhältlich. Gleichermaßen stehen Gebinde zur Verfügung für eine Biotinylierung oder Digoxigenierung von Proteinen, insbesondere von Antikörpern, oder auch von Nukleotiden und Zuckern. Die beiden Haptene Biotin und Digoxigenin werden auch für den Nachweis von DNAs und RNAs verwendet. Prinzipiell kann der erfindungsgemäße Test nicht nur für den Nachweis eines doppelt haptenmarkierten Sandwichkomplexes verwendet werden, sondern auch für den Nachweis von doppelt haptenmarkierten PCR-Produkten. In diesem Fall sind die beiden Primer für die PCR-Reaktion mit jeweils einem Hapten markiert, zum Beispiel einmal mit Biotin und einmal mit Digoxigenin, so dass das PCR-Produkt beide Haptene trägt. Der Nukleinsäure-komplex mit den beiden Haptenen kann dann innerhalb weniger Sekunden in einer Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden. In diesem Fall ist der Analyt eine DNA oder RNA. Die Umsetzung mit den Reportermolekül-gekoppelten Rezeptoren entspricht dann einer DNA-Kettenpolymerasereaktion, bei der haptenmarkierte Primer in das PCR-Produkt eingebaut werden.
Selbstverständlich können auch auf kommerziell verfügbare Antikörper gegen die vielen verschiedenen Analyten verwendet werden. Es bleibt aber in allen Fällen eine Definition der Nachweisgrenzen und der Empfindlichkeiten beziehungsweise das Koppeln der Antikörper mit den Reportermolekülen.
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung sind den nachstehenden Beispielen zu entnehmen.
BEISPIELE
Beispiel 1 Testbesteck für den Nachweis von Vollei in Nahrungsmitteln
Die EU-Richtlinien 2003/89/EG und 2005/26/EG verpflichten die Lebensmittelhersteller, auf ihren Produkten alle Einzelzutaten anzugeben, die eine Lebensmittelallergie oder -intoleranz auslösen können, unabhängig von Ihrem Anteil im Lebensmittel. Als sogenannte Hauptallergene werden insbesondere genannt glutenhaltiges Getreide (Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Dinkel, Kamut und Hybridstämme davon), Krebstiere, Eier und Eierzeugnisse, Fisch, Erdnüsse, Soja, Milch, verschiedene Nussarten (Mandel (Amygdalus communis L.), Gemeine Hasel (Corylus avellana), Walnuss (Juglens regia), Kaschunuss (Anacardium occidentale), Pecannuss (Carya illinoiesis (Wangenh.) K. Koch), Paranuss (Bertholletia excelsa), Pistazie (Pistacia vera), Macadamianuss und Queenslandnuss (Macadamia ternifolia), Sellerie, Senf, Sesamsamen und deren Erzeugnisse sowie Schwefeldioxid. Zusätzlich sind alle Zutaten offen zu legen, die mehr als 2% des Lebensmittels ausmachen. Die Auswahl der zu kennzeichnenden Zutaten entspricht den in Europa am häufigsten vorkommenden Lebensmittelallergien und -intoleranzen. Lebensmittel-Allergene müssen grundsätzlich ohne Mengenbegrenzung gekennzeichnet werden, also selbst Spuren.
Es wurde stellvertretend ein Sicherheitsschnelltest für den Nachweis von Vollei (Eier und Eierzeugnissen) in Nahrungsmitteln entwickelt. Die Entwicklung umfasste die Schritte (i) Immunisierung von Tieren, Gewinnung eines spezifischen Antiserums und Aufreinigung der IgG-Fraktion des Antiserums mittels Affinitätschromatographie auf einer Protein-G-Säule; (ii) Kopplung und Markierung von aufgereinigten Antikörpern gegen den Analyt mit Biotin und Digoxigenin; (iii) Testen der so hergestellten Antikörper an vorbereiteten Standard-Biotin-Digoxigenin-Streifenschnelltests mit verschiedenen Proben; (iv) Anpassung und Kalibrierung des inneren Standards, der Analytmenge auf der Wand des Probengefäßes, an die Soll-Nachweisempfindlichkeit des Streifentests.

i) Herstellung des Antiserums. Industrielles Vollei (100 mg in 1 ml aqua dest) wurde jeweils mit 1 ml Freundschem Adjuvans emulgiert und Schafe dreimal in Abständen von 6 Wochen hiermit immunisiert. 6 Wochen nach der letzten Immunisierung wurde Rohserum abgenommen, Lipidbestandteile durch Delipidierung mit Aerosil (1,5%) entfernt, und die Immunglobuline mit Ammoniumsulfat (2 M) ausgefällt. Der gelöste Niederschlag wurde gegen 15 mM KPO₄, 50 mM NaCl pH 7.0 dialysiert, und es folgte eine Aufreinigung der IgG-Fraktion auf einer Nab-Säule (Säule und Vorschrift von der Fa. Pierce, Rockford, IL 61105, USA; Kat. Nr. 1940.1, „gravity-flow purification protocol”). Die sogenannten Nab-Säulen tragen immobilisierte Bakterienproteinen A, G, A/G und L, welche mit hoher Spezifität Immunglobuline von Säugetieren binden. Letztlich war jeweils empirisch auszutesten, welche Säule sich für den jeweiligen Typ Antikörper eignete. Im Einzelnen wurde die Antikörper in Bindepuffer (0.1 M Phosphat, 0.15 M NaCl, pH 7.2 – Protein-G-IgG-Einding Buffer, Pierce Kat. Nr. 21011) verdünnt, eine Affinitätschromatographiesäule (Nab Protein G Spin Column, Pierce Kat. Nr. 89957) mit Bindepuffer konditioniert, das Antiserum in Bindepuffer verdünnt und auf die Säule aufgetragen, dann die Säule mit Bindepuffer gewaschen, neutralisiert und die IgG-Fraktion mit Elutionspuffer (0.1 M Glycin, pH 2–3: Gentle Ag/Ab Elution Buffer, Kat. Nr. 21027) eluiert und fraktioniert. Die Fraktion mit dem höchsten IgG-Gehalt wurde photometrisch bei 280 nm ermittelt, die affinitätsgereinigten Antikörper gegen PBS dialysiert und anschließend die Lösung auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/mL eingestellt.
(ii) Kopplung der aufgereinigten Antikörper gegen Vollei mit Haptenen Digoxigenin und Biotin. Ein Teil der aufgereinigten polyklonalen Anti-Vollei-Antikörper wurde mit Digoxigenin und der andere mit Biotin markiert. Die Digoxigenierung erfolgte mit einem Digoxigenin-Markierungskit der Fa. Roche Diagnostik GmbH, Mannheim (DIG-Protein Labeling Kit Kat Nr. 11 367 200 001). Im Einzelnen wurde Digoxigenin-3-0-succinyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxy-succinimidester (DIG-NHS) in 50 μl DMSO gelöst und in einem Molverhältnis von 5:1 der Antikörperlösung (1 mL) beigemischt (1 Antikörpermolekül wurde mit 5 Molekülen DIG-NHS umgesetzt). Die Reaktion wurde durch Zugabe von L-Lysin gestoppt und die Antikörper durch Fraktionierung auf einer Sephadex-G-25 und Dialyse von überschüssigem Markierungsreagenz getrennt.

Die Biotinylierung erfolgte mit einem Biotin-Markierungskit der Fa. Roche Diagnostik GmbH, Mannheim (Biotin Protein Labeling Kit Kat Nr. 11 418 165 001). Im Einzelnen wurde D-Biotinyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxy-succinimidester (Biotin-7-NHS) in DMSO gelöst und in einem Molverhältnis von 5:1 der Antikörperlösung (1 mL) beigemischt (1 Antikörpermolekül wurde mit 5 Molekülen Biotin-7-NHS umgesetzt, 2 Stunden bei Raumtemperatur). Die Reaktion wurde durch Zugabe von L-Lysin gestoppt und die Antikörper durch Fraktionierung auf einer Sephadex-G-25, gefolgt von einer Dialyse, von überschüssigem Markierungsreagenz getrennt. Die digoxigenierten und biotinylierten Antikörper wurden dann auf 1 mg/mL in PBS, 0,2% Natriumazid eingestellt und eingefroren.

(iii) Dünnschicht-Teststreifen für die Immunchromatographie. Es wurden Anti-Biotin/Anti-Digoxigenin-Schnellteststreifen der Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, verwendet. Auf diesem Schnellteststreifen wird das Digoxigenin-Hapten mit goldmarkierten Anti-Digoxigenin-Antikörpern im so imprägnierten Eintragsfeld des Streifenschnelltests angefärbt. Der angefärbte Sandwichkomplex kann dann in der Immundünnschichtchromatographie durch seine Bindung an Streptavidin, wie oben beschrieben nachgewiesen werden (siehe 2).
(iii) Testen der biotinylierten und digoxigenierten Anti-Vollei-Antikörper auf Standard-Biotin-Dig-Schnellteststreifen. Hierzu wurden verschiedene zerkleinerte Nah rungsmittelproben (jeweils 0,5 g) mit und ohne Vollei in jeweils 40 ml PBS 10 Minuten bei 60°C homogenisiert, extrahiert und Festbestandteile abzentrifugiert. Es wurde jeweils 400 μl Überstand in ein Reaktionsgefäß überführt und je 2,5 μl biotinylierter und 2,5 μl digoxigenierter Anti-Vollei-Antikörper zugesetzt. Die Probe wurde vermischt und 10 Minuten für die Bildung des Sandwichkomplexes stehengelassen. Danach wurden die Schnellteststreifen in die Lösung gestellt und nach 4 Minuten das Ergebnis abgelesen. Die Empfindlichkeit lag unter 1 mg Vollei pro Kilogramm Probe (1 ppm) und war damit deutlich empfindlicher als ein herkömmlicher ELISA. Hauptallergene in Lebensmittel sind auch ab einem Teil pro Million in der Europäischen Union deklarationspflichtig (siehe 1).
(iv) Anpassung und Kalibrierung des inneren Standards an die Soll-Nachweisempfindlichkeit (1 mg Vollei/kg). Es wurden verschiedene Lebensmittelzusammensetzungen von unschiedlicher Matrix (Nuss-Nougat-Creme, Teig- und Backwaren, Panaden, Mehl- und Kartoffelklöße, Fertigsaucen, Cremespeisen, Gemüse-Fertiggerichte, Zwieback, Nudelgerichte, Speiseeis, Lebkuchen, Schokolade, Süß- und Zuckerware (Bonbons), Fertigsaucen, Tiefkühlfrikadellen) auf ihre Deklaration und den tatsächlichen Gehalt an Vollei untersucht. Hierzu wurden Vollei-Standards für die jeweilige Lebensmittelmatrix hergestellt, welche einem Gehalt von 1 mg Vollei pro Kilogramm Probe entsprechen, und an die jeweils empfohlene Probenextraktion angepasst. Es wurde im Kontrollgefäß ca. 10 bis 100 ng Vollei (entspricht 1 bis 10 mg in einem Kiologramm Nahrungsmittel) in 5 μl PBS vorgelegt, 45 μl wässrige Trehalose 100 mMol/L zugesetzt, die Lösungen vermischt und bei minus 60 Grad Celsius Schock gefroren und schließlich unter Erwärmen auf 40 Grad Celsius in einer glasartigen Schicht auf die Bodenwand des Kontrollgefäßes aufgetrocknet.

Dann wurden sowohl in den Kontroll- als auch in den Probengefäßen auf einer Seitenwand 2,5 μl biotinylierter beziehungsweise 2,5 μl digoxigenierter Antikörper, vermischt mit 22,5 μl Trehalose 100 mmol/l, durch Schockgefrieren bei minus 60 Grad Celsius und Erwärmen auf plus 40 Grad Celsius in einer weiteren Glasschicht aufgetrocknet. Weil die unterschiedlich markierten Antikörper miteinander unlösliche Komplexe bilden können, wurden sie getrennt auf der Seitenwand und auf der Deckelunterseite des Reaktionsgefäßes aufgetrocknet. Um die Antikörperreaktion sichtbar zu machen, wurde neben der Antikörperlösung auf der Deckelunterseite noch eine Spurenmenge wasserlöslicher Polyvinylpyrrolidon-Iod-Komplex aufgetrocknet und auf der Seitenwand des Gefäßes ein Trehalose/Amylose-Gemisch.

(v) Immunchromatographie. Es wurde dann jeweils 400 μl Vollei-Probenextrakt in die so vorbereiteten Proben- und Kontrollgefäße gegeben, diese verschlossen und dann mehrfach gewendet, um so die beiden, auf den Wänden befindlichen Antikörper, einschließlich des inneren Standards, in Lösung zu bringen. Die beim Wenden der Gefäße parallel entstehende charakteristische blaue Farbe der Iod-Amylose-Einschlussverbindung zeigte an, dass das Reaktionsgefäß mit der Probe gewendet wurde, beide Antikörper in Lösung gegangen waren und sich der Sandwichkomplex für den nachfolgenden Nachweis in der Dünnschichtchromatographie bilden konnte. Nach 10 Minuten Reaktionszeit beziehungsweise nach voller Entwicklung der blauen Farbe wurden die Reaktionsgefäße geöffnet und parallel jeweils ein Teststreifen in das Proben- und das Kontrollgefäß gestellt. Da das stationäre Trennmaterial des Schnellteststreifens neben Kieselgur auch Stärke enthält, nahm die blaue Iod-Amylose-Einschlussverbindung an der Dünnschichtchromatographie nicht teil und konnte das Ergebnis nicht stören. Die Gegenwart des Nachweiskomplexes konnte gemäß Ergebnistabelle II abgelesen werden.

Beispiel 2 Testbesteck für den Nachweis von Kichererbse
Haselnusspasten werden weltweit im großen Maßstab gehandelt und in den unterschiedlichsten Lebensmitteln eingesetzt. Haselnusspaste und andere Ölsaatprodukte wie Mandelmark und Pistazienmark werden aber gerne mit Kichererbsenpaste verschnitten oder verfälscht, denn Kichererbsen sind um ein Vielfaches billiger als die Ölsaaten. Ein einfacher Soforttest wäre für Importeure und die Lebensmittelhersteller von großem Interesse, um sich so vor Verschnitt und Verfälschung schützen zu können. Angestrebt war eine Empfindlichkeit von mindestens 0,1 Prozent (0,1 g Kichererbse in 100 g Ölsaatprodukt).

i) Herstellung des Antiserums. Feines Kichererbsenmehl (100 mg in 1 ml aqua dest) wurde mit 1 ml Freundschem Adjuvans emulgiert und Schafe dreimal in Abständen von 6 Wochen hiermit immunisiert. 6 Wochen nach der letzten Immunisierung wurde Rohserum abgenommen und die Antikörper wie in Beispiel 1 isoliert und über eine Säule chromatographisch aufgereinigt. Die Fraktion mit dem höchsten IgG-Gehalt wurde photometrisch ermittelt, die affinitätsgereinigten Antikörper gegen PBS dialysiert und die Lösung auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/mL eingestellt.
(ii) Kopplung der Antikörper gegen Kichererbse mit Digoxigenin und Biotin Ein Teil der aufgereinigten Anti-Kichererbse-Antikörper wurde mit Digoxigenin und der andere mit Biotin markiert. Die Digoxigenierung und die Biotinylierung erfolgten wie in Beispiel 1 mit dem Digoxigenin- und dem Biotin-Markierungskit der Fa. Roche Diagnostik GmbH, Mannheim (DIG-Protein Labeling Kit Kat Nr. 11 367 200 001; Biotin Protein Labeling Kit Kat Nr. 11 418 165 001). Die digoxigenierten und biotinylierten Antikörper wurden dann auf 1 mg/mL PBS, 0,2% Natriumazid eingestellt und eingefroren.
(iii) Dünnschicht-Teststreifen für die Immunchromatographie. Es wurden Anti-Biotin/Anti-Digoxigenin-Schnellteststreifen der Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, verwendet.
(iii) Testen der biotinylierten und digoxigenierten Anti-Kichererbsen-Antikörper auf Standard-Biotin-Dig-Schnellteststreifen. Hierzu wurden verschiedene Haselnusspasten (jeweils 0,5 g) mit und ohne Kichererbse jeweils 10 Minuten bei 60°C in 40 ml PBS homogenisiert, extrahiert und dann alle Festbestandteile abzentrifugiert. Es wurde 400 μl Überstand in ein Reaktionsgefäß überführt und je 5 μl biotinylierter und 5 μl digoxigenierter Antikörper zugesetzt. Die Probe wurde 10 Minuten für die Bildung des Nachweiskomplexes stehengelassen. Danach wurden die Schnellteststreifen in die Lösung gestellt und nach 4 Minuten das Ergebnis abgelesen. Die Empfindlichkeit lag bei unter 0,1 g Kichererbse pro 100 g Haselnusspaste (0,1%).
(iv) Kalibrierung des inneren Standards an die Soll-Nachweisempfindlichkeit (0,1 g Kichererbse/100 g). Es wurden verschiedene Haselnusspasten untersucht und Kichererbsenstandards hergestellt, welche einem Gehalt von 0,1 g Kichererbse pro 100 g Probe entsprachen, und an die empfohlene Probenextraktion angepasst. Es wurde im Kontrollgefäß 1 μg Kichererbse absolut (entsprechend 0,1 g Kichererbse in 100 g Haselnusspaste) in 5 μl PBS vorgelegt, 45 μl wässrige Trehalose 100 mMol/L zugesetzt, die Lösungen vermischt und bei minus 60 Grad Celsius Schock gefroren und schließlich unter Erwärmen auf 40 Grad Celsius in einer glasartigen Schicht auf die Bodenwand des Kontrollgefäßes aufgetrocknet.

Dann wurden sowohl in den Kontroll- als auch in den Probengefäßen auf einer Seitenwand und im Deckel 5 μl biotinylierter beziehungsweise 5 μl digoxigenierter Antikörper, vermischt mit 22,5 μl Trehalose 100 mmol/l, durch Schockgefrieren bei minus 60 Grad Celsius und Erwärmen auf plus 40 Grad Celsius in einer weiteren Glasschicht aufgetrocknet. Um die potentielle Bildung des Nachweiskomplexes zudem sichtbar zu machen, wurde weiterhin auf der Deckelunterseite eine Spurenmenge Polyvinylpyrrolidon-Iod-Komplex aufgetrocknet und auf der Seitenwand des Gefäßes Trehalose/Amylose.

(v) Immunchromatographie. Es wurde jeweils 400 μl Haselnusspastenextrakt in die vorbereiteten Proben- und Kontrollgefäße gegeben, diese verschlossen und dann mehrfach gewendet, um so die beiden markierten Antikörper und den Standard in Lösung zu bringen. Beim Wenden der Gefäße entstand parallel eine blaue Iod-Amylose-Einschlussverbindung. Nach 10 Minuten Reaktionszeit wurden die Reaktionsgefäße geöffnet und jeweils ein Teststreifen in das Proben- und das Kontrollgefäß mit dem Standard gestellt und nach 4 Minuten die Teststreifen gemäß Ergebnistabelle II abgelesen.

Beispiel 3 Nachweis von Clostridium difficile A-Toxin in Stuhlproben
Clostridium-Infektionen stellen eine große Gefahr dar. Die schnelle Diagnose erfordert einen direkten Nachweis im Stuhl.
Es wurde daher ein Streifentest für den Nachweis von Clostridium difficile A Toxin im Stuhl entwickelt. Die Entwicklung umfasste die Schritte (i) Aufreinigung eines kommerziellen Antiserums (Antikörper-online, polyclonal goat, 1 mg, ABIN113066) mittels Affinitätschromatographie auf einer Protein-G-Säule; (ii) Kopplung der Antikörper mit Biotin beziehungsweise Digoxigenin; (iii) Testen der markierten Antikörper an Standard-Biotin-Digoxigenin-Streifenschnelltests mit verschiedenen Stuhlproben; (iv) Anpassen des Standards auf der Wand an die Soll-Nachweisempfindlichkeit des Streifentests.

i) Aufreinigung des Antiserums. Das kommerzielle Antiserum wurde auf einer Nab-Säule (Säule und Vorschrift von der Fa. Pierce, Rockford, IL 61105, USA; Kat. Nr. 1940.1, „gravity-flow purification protocol”) aufgereinigt und die IgG-Fraktion wie in den vorgenannten Beispielen isoliert. Die affinitätsgereinigten Antikörper wurden gegen PBS dialysiert und auf 1 mg/ml eingestellt.
(ii) Kopplung der C. difficile A-Toxin-Antikörper mit Dig und Biotin. Ein Teil der aufgereinigten Anti-C. difficile A-Toxin-Antikörper wurde an Digoxigenin und der andere an Biotin gekoppelt. Die Digoxigenierung und die Biotinylierung erfolgten wie in Beispiel 1 und 2.
(iii) Dünnschicht-Teststreifen für die Immunchromatographie. Es wurden Anti-Biotin/Anti-Digoxigenin-Schnellteststreifen der Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, verwendet.
(iii) Testen der biotinylierten und digoxigenierten Anti-C. difficle A Toxin-Antikörper auf Standard-Biotin-Dig-Schnellteststreifen. Hierzu wurden Stuhlproben (jeweils 0,2 g) mit und ohne C. difficile A-Toxin jeweils 10 Minuten bei 60°C in 40 ml PBS dispergiert und extrahiert und dann alle Festbestandteile abzentrifugiert. 400 μl Überstand wurde in ein Reaktionsgefäß überführt und 5 μl biotinylierter sowie 5 μl digoxigenierter Anti-C. difficile A-Toxin-Antikörper zugesetzt. Die Probe wurde 10 Minuten für die Bildung des Nachweiskomplexes stehengelassen. Dann wurden Schnellteststreifen in die Lösungen gestellt und nach 4 Minuten das Ergebnis abgelesen.
(iv) Anpassung und Kalibrierung des Standards an die Soll-Nachweisempfindlichkeit (1–5 μg C. difficile A-Toxin/g Stuhl). Es wurde verschiedene Stuhlproben untersucht und C. difficile A-Toxin-Standards hergestellt. Angepasst an die empfohlene Probenextraktion entsprach diese Soll-Nachweisempfindlichkeit einer Menge von absolut 4 bis 20 ng C. difficile A-Toxin im Kontrollgefäß. Diese Menge (4–20 ng C. difficile A-Toxin) wurde in den Kontrollgefäßen in je 5 μl PBS vorgelegt, 45 μl wässrige Trehalose 100 mMol/L zugesetzt, die Lösungen vermischt, bei –60°C schockgefroren und unter Erwärmen auf 40°C als glasartige Schicht auf die Bodenwand aufgetrocknet.

Dann wurden in den Kontroll- und in den Probengefäßen auf der Seitenwand und im Deckel je 5 μl biotinylierter beziehungsweise digoxigenierter Antikörper, vermischt mit 22,5 μl Trehalose 100 mmol/l, durch Schockgefrieren bei –60°C und Erwärmen auf 40°C in weiteren Glasschichten aufgetrocknet.

(v) Immunchromatographie. Es wurde jeweils 400 μl Stuhlextrakt in die vorbereiteten Proben- und Kontrollgefäße gegeben und darin die Antikörper auf der Wand und im Deckel (mit und ohne Standard) gelöst, so dass sich der Nachweiskomplex für den Nachweis in der Dünnschichtchromatographie bilden konnte. Nach 10 Minuten Reaktionszeit wurden Teststreifen in das Proben- und das Kontrollgefäß gestellt. Die Gegenwart des Nachweiskomplexes wurde gemäß Ergebnistabelle II abgelesen.
(vi) Nachbestimmung und positive und negative Blindprobe: Durch die parallele Umsetzung der Probe im Kontrollgefäß stand eine Referenzbande zur Verfügung, die direkt mit der Bande auf dem Probenstreifen verglichen werden konnte. Daher war stets eine Deutung des Ergebnisses möglich. In Zweifelfällen konnte ferner ein Vergleich mit den Banden einer positiven und negativen Blindprobe vorgenommen werden. Die positive und negative Blindproben mit 1 × PBS anstelle von Stuhlextrakt können wegen der Standardisierung der Probengefäße und der chromatographischen Teststreifen auch noch in zeitlichem Abstand zur Untersuchung erfolgen, was ein erheblicher Vorteil darstellt (siehe 3a und 3b). 3a zeigt den Vergleich einer negativen und einer positiven Blindprobe, wobei die positive Blindprobe (rechter Streifen) Analyt entsprechend der Soll-Nachweisempfindlichkeit (4 ng C. difficile-Toxin) enthält. 3b zeigt Gegenüberstellungen von einer negativen Stuhlprobe mit einer negativen Blindprobe (linkes Vergleichspaar) und einer positive Probe mit einer versetzten positiven Probe (rechtes Vergleichspaar). In der versetzten positiven Probe trat keine weitere Bande außer der Kontrollbande und der Nachweisbande auf, was eine Identifikation der Nachweisbande darstellt. Durch diese Gegenüberstellungen beziehungsweise Nachbestimmung können problemlos chromatographische Geister- oder Schattenbanden als solche erkannt werden, und sie erlauben auch eine quantitative Bewertung der Ergebnisse.

Es standen somit stets Banden zum Vergleich zur Verfügung und zwar (i) von einer negativen Blindprobe (ohne Analyt in PBS). Die negative Blindprobe stellt sicher, dass die Substanz nicht gefunden wird, wenn sie nicht vorhanden ist. Bei der negativen Blindprobe werden nur die Reagenzien der Nachweisprozedur unterworfen, ohne die zu untersuchende Substanz hinzuzufügen. In diesem Fall muss die Reaktion negativ sein. Tritt die Reaktion doch ein, so sind die Reagenzien verunreinigt und für diesen Nachweis unbrauchbar oder es liegt ein systematischer Verfahrensfehler vor. (ii) von einer positiven Blindprobe (Analyt in PBS). Die positive Blindprobe stellt sicher, dass die gesuchte Substanz gefunden wird, wenn sie vorhanden ist. Die doppelte Blindprobe, also sowohl die positive als auch die negative zusammen, stellen die Zuver lässigkeit des angewandten Verfahrens sicher. (iii) Eine reale Probe zum Vergleich; und (iv) eine sogenannte versetzte Realprobe, bei der die Nachweisreaktion eintreten muss. Tritt die Nachweisreaktion nicht ein, ist der Test unzuverlässig, weil entweder die Reagenzien überaltert sind oder weil das zu analysierende Gemisch (der Stuhlprobenextrakt) die Nachweisreaktion hemmende Komponenten enthält. Nachdem Stuhlproben höchst unterschiedlich sein können, muss insbesondere bei Stuhlproben immer mit einer solchen Gefahr gerechnet werden.
Durch die Kombination der chromatographischen Teststreifen für Hapten-Antihapten-Komplexe mit adaptierten Testgefäßen, welche die Reagenzien als negative und positive Blindprobe für die Bildung des Hapten-Antihapten-Komplexes enthalten und zwar in einer Menge abgestimmt auf eine Nachweisgrenze, wird ein Testsatz zur Verfügung gestellt, der unmittelbar geeignet ist für den Nachweis von Inhaltsstoffen und Keimen in Nahrungs- und Futtermitteln gemäß den gesetzlichen Bestimmungen. Auch erlaubt ein derartiger Testkit die Untersuchung von stark heterogenen Proben wechselnder Konsistenz und insbesondere von Stuhlproben in der Diagnostik.

Claims

Testbesteck auf der Basis von chromatographischen Teststreifen für den Nachweis eines bekannten Hapten-Antihapten-Komplexes, umfassend einen streifenförmigen Träger, der mit einer dünnen Schicht eines chromatographischen Trennmaterials beschichtet ist; eine Markierungszone, die mit mobilen Reportermolekül-markierten Antikörpern oder Rezeptoren gegen ein erstes Hapten getränkt ist; einer Nachweiszone, in der ein Rezeptor gegen ein Hapten immobilisiert ist, und einer Kontrollzone, in der ein zweiter Rezeptor gegen den mobilen Reportermolekül-markierten Antikörper oder Rezeptor immobilisiert ist; sowie Gefäßen mit ersten und zweiten Hapten-gekoppelten Rezeptoren gegen den Analyten für den Aufbau eines Hapten-Antihapten-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, dass das Testbesteck ein oder mehrere erste und zweite Gefäße umfasst für die Aufnahme und zum Aufstellen von Teststreifen, wobei die ersten Gefäße jeweils eine bekannte Menge an Analyt enthalten, eingebettet in einer glasartigen Schicht von Trehalose, die so auf eine Innenwand des Kontrollgefäßes als Schicht aufgetrocknet ist, dass die Schicht bei der Umsetzung der Probe mit den Hapten-gekoppelten Rezeptoren in der wässrigen Probenlösung in Lösung geht, so dass im ersten Gefäß stets eine vorgegebene Menge an Nachweiskomplex erhalten wird, der bei der chromatographischen Analyse auf dem Teststreifen sichtbar wird und eine Kontrolle für die Probenaufbereitung, die Komplexbildung und die chromatographische Analyse bereitstellt, und die zweiten Gefäße keine bekannte Menge an Analyt enthalten.
Testbesteck nach Anspruch 1, wobei die bekannte Menge an Analyt im ersten Gefäß der Menge für eine gewünschte Nachweisgrenze entspricht, welche in dem Testsystem als Hapten-Antihapten-Komplex auf dem chromatographischen Teststreifen noch sichtbar ist.
Testbesteck nach Anspruch 1 oder 2, wobei die ersten und zweiten Gefäße vorgegebene Mengen von Hapten-gekoppelten Rezeptoren gegen den Analyten so aufgetrocknet enthalten, dass sie bei Zugabe der wässrigen Probe in Lösung gehen.
Testbesteck nach Anspruch 3, wobei vorgegebene Mengen von mindestens zwei Hapten-gekoppelten Rezeptoren und optional des Analyts, jeweils eingebettet in einer glasartigen Schicht Trehalose, an verschiedenen Orten auf der Innenwand der Gefäße aufgetrocknet sind.
Testbesteck nach Anspruch 3, wobei vorgegebene Mengen von mindestens zwei Hapten-gekoppelten Rezeptoren und optional des Analyts, jeweils eingebettet in einer glasartigen Schicht Trehalose, in getrennten Lagen auf der Innenwand der Gefäße aufgetrocknet sind.
Testbesteck nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei eine bekannte Menge Analyt oder Rezeptor auf die Gefäßwand aufgebracht ist, indem eine definierte Menge einer wässrigen Lösung mit dem Rezeptor oder dem Analyten, welche 20 bis 600 mM/L Trehalose enthält, durch Schockgefrieren und anschließender Sublimation des Wassers auf die Gefäßwand aufgetrocknet wird.
Testbesteck nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Zugeben von Hapten-gekoppelten Rezeptoren gegen den Analyten in dem Proben- und/oder dem Kontrollgefäß erfolgt durch Auftrocknen von deren wässrigen Lösungen, enthaltend zwischen 20 mM bis 600 mM/L Trehalose, auf die Innenwand der Proben- und Kontrollgefäße bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 45 Grad Celsius.
Testbesteck nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Rezeptoren ausgewählt sind aus Antikörpern, Antikörperfragmenten, Lektinen, Bindeproteinen, DNAs, RNA, oder Aptameren, welche mit Reportermolekülen gekoppelt sind.
Testbesteck nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Reportermoleküle ausgewählt sind aus Biotin, Digoxigenin, Digoxin, Streptavidin, Avidin, HRP (Meerrettichperoxidase), alkalische Phosphatase, para-Nitrophenol, Texasrot, Fluorochromen, Fluorescein, Rhodamin, Coumarin, AMCA, TRITC FITC, Cy2, Cy3 und Cy5
Testbesteck nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, basierend auf einem Hapten-Antihapten-System, welches Biotin oder Digoxigenin gekoppelte Primärantikörper aufweist.
Testbesteck nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die verschiedenen Lagen oder Flecken mit aufgetrockneten Reportermolekül-gekoppelten Rezeptoren weiterhin die Komponenten für eine begleitende Farbstoffreaktion in wässriger Lösung enthalten.
Testbesteck nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, umfassend Extraktionsreagenzien für den Nachweis von Hauptallergenen in Nahrungs- und Futtermitteln.
Testbesteck nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, umfassend Extraktionsmittel für die Extraktion eines Analyten aus Stuhl und Abstrichen.
Verfahren für den Nachweis eines Analyten in einer wässrigen Lösung, wobei ein Farbstoff-markierter Hapten-Antihapten-Komplex mit dem Analyten in einer Dünnschichtchromatographie auf einem Teststreifen nachgewiesen wird, gekennzeichnet durch Aliquotieren einer wässrigen Lösung mit der Probe auf mindestens ein erstes und ein zweites Gefäß, wobei das erste und das zweite Gefäß für die Aufnahme von Teststreifen ausgelegt sind, das erste Gefäß eine vorgegebene Menge an Analyt enthält sowie vorgegebene Mengen von mindestens zwei Hapten-gekoppelten Rezeptoren gegen den Analyten, alle jeweils eingebettet in auf der Innenwand des Gefäßes aufgetrockneten glasartigen Schichten von Trehalose, und das zweite Gefäß gleiche vorgegebene Mengen von mindestens zwei Hapten-gekoppelten Rezeptoren gegen den Analyten enthält, jeweils eingebettet in auf der Innenwand des Gefäßes aufgetrockneten glasartigen Schichten von Trehalose; Lösen im ersten und im zweiten Gefäß im jeweiligen Aliquot der Probenlösung der Schichten von Trehalose mit den vorgegebenen Mengen von mindestens zwei Hapten-gekoppelten Rezeptoren und Herstellen von Bedingungen für die Ausbildung eines Hapten-Antihapten-Komplexes mit dem Analyten, und Nachweisen des Hapten-Antihapten-Komplexes in der Probenlösung durch dessen Farbstoffmarkierung und eine Dünnschichtchromatographie mittels Teststreifen, die in die ersten und zweiten Gefäße mit den Probenlösung gestellt oder getaucht werden, indem die Farbbande in der Nachweiszone der Teststreifen des ersten und des zweiten Gefäßes miteinander vergleichen werden.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die wässrige Lösung keine Probe enthält und Farbbanden für eine positive und negative Blindprobe für einen Intensitätsvergleich bereitgestellt werden.